Purificao de EnzimasPrograma de Ps Graduao de Engenharia Qumica - PPGEQTpicos EspeciaisProfessora Marta LangoneAluna Barbara Costa dos Santos

IntroduoEnzimas so catalisadores biolgicos, elas podem aumenta a velocidade de reao em por um fator de 1014 do que uma no catalisada. Elas aumentam a velocidade de reao diminuindo a energia de ativao.

IntroduoO grau de pureza das enzimas comerciais varia de preparaes enzimticas brutas at altamente purificadas e depende da sua aplicao final. Alm disso, a escolha do procedimento de purificao depende de sua origem (animal, vegetal ou microbiana)

EtapasGarantia da estabilidade enzimtica;Obteno de um Extrato bruto;Enzima Extracelular;Enzima Intracelular;Purificao;Baseada na Solubilidade;Baseada na Carga;Baseada no Tamanho;Baseada na Afinidade;Concentrao;Acabamento;

ExtraoEmbora todas as enzimas sejam produzidas inicialmente no interior das clulas, algumas so excretadas atravs da parede celular e funcionam no ambiente em que est a clula. Com base no local de ao, so considerados dois tipos de enzimas: intracelular ou extracelular

Enzima ExtracelularRemoo de Partculas Geralmente,

Centrifugao

Filtrao

Enzima IntracelularRompimento celularMixers;Agitao com abrasivo;Extruso slida e liquida;Ultrasom;Congelamento e Descongelamento;Choque osmtico;Enzimas hidrolticas de parede;Tratamento Alcalino;Uso de detergentes e solvente.

Purificao - SolubilidadeMudana no pH Ponto Isoeltrico Prximo do pI Solubilidades Diminuem as foras repulsivas entre as molculas de protenas Agregados = PrecipitadosMudana na fora Inica Adio de sais (NaCl; (NH4)2SO4)

[sal] [sal] Interaes ons salinos e cargas de Competio de ons salinos e cargas protenas das protenas pela gua Salting in Salting out

Solventes Orgnicos Diminuio da constante dieltrica da soluo.

Metanol, etanol e acetona Competio pela gua, alterao do interior hidrofbico, [GUA] Precipitao

Purificao - CargaCromatografia de Troca Inica

Purificaco - TamanhoCromatografia de excluso em gel

Purificao -AfinidadeCromatografia de Afinidade

EletroforeseMigrao de ons em um campo eltrico; Especialmente til como mtodo analtico;Vantagem suas protenas podem ser visualizadas e separadas;

Avaliao do processo de separaoAtividadeNmero total de unidades presentes em uma soluo;

Atividade EspecficaO nmero de unidades enzimticas por miligrama de protenas totais;

Mtodos quantitativos de Protenas TotaisBiuretobaseia na reao do reativo do biureto (uma mistura de cobre e hidrxido de sdio com um complexante que estabiliza o cobre em soluo, sendo o tartarato de sdio );Absoro, uma em 270 nm e outra em 540 nm;

LowryMistura contendo molibdato, tungstato e cido fosfrico reduz na presena do catalisador cobre (II) ;Composto com absoro mxima em 750 nm ;

BradfordBaseado na interao entre o corante BG-250 e macromolculas de protenas;+ rpido e sensvel que o Lowry;variao da absortividade especfica para diferentes protenasIrreprodutibilidade dos resultados;Absorve fortemente em 595 nm.

ConcentraoA concentrao pode ser obtida por remoo de gua:Adio de um polmero, Sephadex G-25, cujos poros so muito pequenos para permitir a entrada de molculas grandes ;

Remoo de solvente atravs de uma membrana semipermevel que no permite a passagem da enzima de interesse (ultrafiltrao);* Oferece vrias vantagens sobre outros mtodos alternativos e dentre elas a de ser mais rpida e ter melhor recuperao.

Por remoo de gua sob vcuo (Liofilizao)* Concentrao dos sais presentes na soluo inicial;* Desvantagem: Perda de atividade enzimtica *Uma vez obtida a enzima ativa na forma de p, esta muito mais estvel que em soluo aquosa.

AcabamentoO produto final no pode apresentar baixa granulometria; A maioria das preparaes enzimticas industriais contm, alm da enzima ativa, outras protenas, estabilizantes, preservativos, sais e um diluente que permite a padronizao obtida de diversas bateladas com diferentes atividades especificam;

Manuteno da atividade enzimtica - Aditivos, modificao qumica controlada ou imobilizao enzimtica.

ExemplosPurificao e caracterizao bioqumica de lipase extracelular produzida por uma nova linhagem de Rhizopussp. Apenas 3 etapas de purificao foram necessrias para alcanar homogeneidade em eletroforese de protena desnaturada.

Adio de Sulfato de Amnio;Centrifugao 4C por 10 minutos;Dilise do precipitado resultante;

Uma nica banda com massa molecular de 37,5 KDa e atividade especfica de 1446U/mg foi obtida.

A frao purificada apresentou duas isoformas de lipase, ambas com temperatura tima de atividade igual a 50C, mantiveram-se estveis entre valores de pH entre 6,5 e 7,5 e a temperaturas inferiores a 50C.

Mantiveram sua atividade na presena de hexano.

A frao lipoltica foi inativada por Hg+ e por n-bromosuccinimida e ativada por Na+.

A Determinao de Protena foi feita pelo Mtodo de Lowry.

Fim!

Obrigada