enzimas branco
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FCAV/UNESPJaboticabalDezembro de 1991
ENZIMAS
Enzimas
●Conceito■São biomoléculas de natureza
predomi- nantemente protéica, cuja função é cata- lisar reações termodinamicamente pos- síveis
●Exemplos■pepsina - hidrólise de proteínas no
estôma- go■tripsina - hidrólise de proteínas no
intesti- no delgado■Papaína - hidrólise de proteínas no
látex do mamoeiro
CONCEITO E EXEMPLOS
Enzimas
PROPRIEDADES GERAIS
●Catalizam reações que, em condições normais, seriam muito lentas
●Não alteram o ponto de equilíbrio●Não são consumidas na reação●Qualquer fator que altere sua
estrutura pode de- terminar perda da atividade (calor, pH, metais pesados)
●O peso molecular das enzimas varia de 12.000 a mais de 1.000.000
●Aumentam a velocidade de reação em 109 1012 vezes
Enzimas
CONSTITUIÇÃO●Apoenzima
■Porção protéica da molécula enzimática
●Grupo prostético■Porção não protéica da enzima
⋆Componente orgânico - coenzima⋆Componente inorgânico⋆Metal - Cu, Fe, Mn, Zn
● Sítio ativo■Porção da enzima onde se liga o
substrato●Sítio alostérico
■Porção das enzimas reguladoras onde se liga o efetor (agente regulador)
Enzimas
CONSTITUIÇÃO
apoenzima
sítio ativo
sítio alostérico
grupo prostético
holoenzima
CLASSIFICAÇÃO●Pelo tipo de reação que catalisa
■Amilase - hidrólise do amido■Protease - hidrólise de proteína■Celulase - hidrólise da celulose■Lipase - hidrólise de lipídeo●Enzyme Comission (EC)
■Classificou as enzimas em classes e subclasses
■Classes (6): oxidorredutase, transferase, hidro-lase, liase, isomerase, ligase
Enzimas
CLASSIFICAÇÃO - EC●Classe 1 - oxidorredutases
■São enzimas que catalisam reações de oxi- redução
■Nesta classe estão as desidrogenases, oxi- dases, oxigenases, peroxidases
■Sub-classes⋆1.1. atuam sobre =CH-OH⋆1.2. atuam sobre =C=O⋆1.3. atuam sobre =C-OH⋆1.4. atuam sobre =CH-NH2
⋆1.5. atuam sobre =CH-NH⋆1.6. atuam sobre NAD, NADP
Fermentação Lática
NADH+H+CH3
IC=O IC00Hac. pirúvico
desidrogenase lática
NAD+ CH3
I HO-C-H I C00Hac. L-lático
Glicólise
Enzimas
CLASSIFICAÇÃO - EC●Classe 2 - transferases
■Atuam na transferência de grupos funcionais
■Nesta classe estão as transaminases, quina- ses, transaldolases, transcetilases.
■Sub-classes⋆2.1. grupos de 1C⋆2.2. grupos aldeído ou cetona⋆2.3. grupos acila⋆2.4. grupos glicosila⋆2.5. grupos alquila or arila mas não
metila⋆2.6. grupos nitrogênio⋆2.7. grupos fosfato⋆2.8. grupos contendo S
Enzimas
H-C=OH-C-OH
H-C-OH
HO-C-H
H-C-OH
CH OH2
D(+)glicose
ATP
hexoquinase
ADPH-C=OH-C-OH
H-C-OH
HO-C-H
H-C-OH
CH OP2
D(+)glicose-6P
TRANSFERASE
Enzimas
CLASSIFICAÇÃO - EC
●Classe 3 - hidrolases■Atuam em reações de hidrólise■Nesta classe estão as lipases,
fosfatases, proteases, amilases■Sub-classes
⋆3.1. ligação éster⋆3.2. ligção glicosídica⋆3.3. ligação peptídica⋆3.4. ligação C-N⋆3.5. anidridos ácidos
O
CH OH2
O
CH OH2
OO
CH OH2
O
CH OH2
OOO...
celulose celulase
O
CH OH2
O
CH OH2
On celobiose
celobiase
O
CH OH2
n a -D(+)glicose
Enzimas
CLASSIFICAÇÃO - EC
●Classe 4 - liases■Atuam em reações de adição-remoção
reversí- vel a duplas ligações■Nesta classe estão aldolase,
fumarase, carbo- xilase■Não incluem a adiçãoremoção de
hidrogênio■Sub-classes
⋆4.1. adição a =C=C=⋆4.2. adição a C=O⋆4.3. adição a =C=N-
Enzimas
EXEMPLO DE LIASE
H-C-COOHII
HOOC-CHÁcido fumárico
+ H-OH
COOH IHO-CH I CH2 I COOH
Ácido L-málico
Fumarase
Enzimas
CLASSIFCAÇÃO - EC
●Classe 5 - isomerases
■Catalisam reações de isomerização■Nesta classe estão racemases,
epimerases, cis-trans isomerases, mutases
■Sub-classes⋆5.1. racemases
Enzimas
EXEMPLO DE ISOMERASE
H-C=O
H-C-OH
H-C-OH
HO-C-H
H-C-OH
CH OP2
D(+)glicose-6P
CH2OH
C=O
H-C-OH
HO-C-H
H-C-OH
CH OP2
D(-)frutose-6P
fosfoglicoisomerase
Enzimas
CLASSIFICAÇÃO●Classe 6 - ligases
■Catalisam reações com formação de ligção às custas da hidrólise do ATP
■Sub-classes⋆6.1. ligação C-O⋆6.2. ligação C-S⋆6.3. ligação C-N⋆6.4. ligação C-C
X + Y + ATP
X-Y + AMP + P-P
EXEMPLO DE LIGASE
FIM DA AULA 512/04/2011
Pintura com a boca
Simony da Rosa Garcia
Pintura com o péMoacir Ferraz
Enzimas
NOMENCLATURA
●Antes do EC
■Nomes sem qualquer vínculo⋆Exemplos: pepsina, tripsina
■Nomes em função da origem da enzima⋆Exemplos: papaína, bromelina
■Terminação ase adicionada ao nome do subs- trato em que a enzima atua
⋆Exemplos: amilase, celulase, celobiase
Enzimas
NOMENCLATURA
●De acordo com o EC
■nome indicativo do tipo de reação■até 4 algarismos, que indicam
⋆1o - classe da enzima⋆2o - sub-classe da enzima⋆3o grupos químicos que participam
da reação⋆4o nome recomendado para a
enzima
Enzimas
NOMENCLATURA - ECEXEMPLO
ATP + creatina
ADP + creatina-fosfato
1. Nome: ATP-creatina-transferase2. números: 2.7.3.2
3. Significado dos números2 - classe transferase7 - sub-classe transferência de P3 - sub-classe que tem grupo nitrogena- do como receptor
2 - nome recomendado: creatina quinase
Http://www.chem.qmui.uk/iubmb/enzyme
MAIS DETALHES NA PÁGINA
Enzimas
O COMPLEXO ENZIMA-SUBSTRATO
●O substrato liga-se ao sítio ativo da enzima, formando um complexo E-S
●O complexo E-S é instável, podendo desli- gar-se ou transformar o substrato S em um produto P, com regeneração da enzima
●A enzima livre formará outro complexo E-S, dando contiunidade à reação.
E + S E-S E + P
Enzimas
O COMPLEXO ENZIMA-SUBSTRATO
E
+
S E-S
E
+
P
Enzimas
O COMPLEXO ENZIMA-SUBSTRATO
Enzima (E)+
Substrato (S)
Complexo E-S
+
Enzimas
MODO DE AÇÃO DAS ENZIMAS
●Porque as enzimas aceleram a velocidade das reações?
●As enzimas aceleram a velocidade das rea- ções porque abaixam a energia necessária para ativação do substrato, atingindo com maior facilidade, a barreira energética da transformação.
Enzimas
MODO DE AÇÃO
/ / / / / / / / / / /
/ / / / / / / / / / // / / / / / / / / / /
/ / / / / / / / / / // / / / / / / / / / // / / / / / / / / / /
W.J.Melo
MODO DE AÇÃO DAS ENZIMAS
XEx
YEY
EAse
SEM
EN
ZIM
AEAce
CO
M E
NZ
IMA
AS ENZIMAS DIMINUEM A ENERGIA DE ATIVAÇÃO
W.J.Melo
W.J.Melo
Cinética Enzimática
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO●Realiza-se experimento com as
seguintes características:■A varios tubos de ensaio, colocam-se a
mesma concentração da enzima em estudo.
■Adiciona-se, a cada tubo, uma concentração di- ferente do substrato, partindo-se de um tubo em que não se coloca sub trato (testemunha ou branco).
■Incuba-se por um certo tempo em um pH e uma temperatura ideal.
■Mede-se a quantidade de produto formado ou a de substrato que sobrou.
■Com os resultados obtidos, elabora-se um grá- fico em sistema cartesiano.
CINÉTICA ENZIMÁTICAEFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO
T1 T2 T3 T4 T5
EnzimaTampão
adicionar substrato
H2O S1
S2
S3 S4
Substrato
incubarTemperatura
Tempo tMedir
Substratoou
Produto
GRÁFICO
CINÉTICA ENZIMÁTICAEFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO
SUBSTRATOVmax
Vmax 2
KMW.J.Melo
II I I
-
-
-
concentração do substrato
Velo
cid
ad
e
20
0
40
60
0 32 64 128
96
0
3
6
9
12
15
18
0 1 2 3 4 5
Atividade
Uréia (g L -1)
ATIVIDADE DA UREASE NO SOLOEFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO
SUBSTRATO
Longo & Melo (2005)
Cinética Enzimática
CINÉTICA ENZIMÁTICA - CONCEITOS
●Equação de Michaelis-Mentem■Equação que descreve a velocidade
de uma reação en-zimatica em função da concentraçao do substrato.
●Velocidade máxima■Qantidade máxima de produto
formado por unidade de tempo e por unidade de enzima nas mesmas con-dições experimentais.
●Constante de Michaelis (KM)
■Concentração de substrato que determina que a veloci-dade de uma ração enzimática ocorra com a metade da velocidade máxima.
Cinética Enzimática
CINÉTICA ENZIMÁTICA
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO■Equação de Michaelis-Menten
⋆A velocidade de reação das enzimas não alos-téricas segue a equação de Michaelis-Menten
⋆A velocidade da reação em um ponto qualquer é dada pela equação
V=Vmax S
KM + S
Cinética Enzimática
A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN
●V= velocidade da reação●Vmax= velocidade máxima da reação●S= concentração do substrato●KM= constante de Michael
■Indica a concentração do substrato que deter-mina que a velocidade da reção seja a metade da velocidade máxima.
■Reflete a afinidade entre a enzima e o substrato
⋆Quanto menor KM, maior afinidade.
V=Vmax*[S]KM + [S]
Cinética Enzimática
A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN
INTERPRETAÇÃO●Para baixas concentrações de
substrato, a velocidade da reação aumenta linearmente com o aumento da concentra-ção do substrato.■Esta é uma reação de primeira
ordem.●Para concentrações intermediárias
do substrato o aumento da velocidade não é linear com o aumento da concentra-ção do substrato.■Esta é uma reação de segunda
ordem.●Para altas concentrações do
substrato, a velocidade da reação não se altera com o aumento da concentração do substrato.
⋆Esta é uma reação de ordem zero⋆O sítio ativo está saturado pelo substrato
Cinética Enzimática
A EQUAÇÃO DE LINEWEAVER-BURK
●Lineweaver e Burk trabalharam com os inversos da velocidade e da concentração do substrato.
●Verificaram que, ao plotarem o inverso da concentra-ção do substrato (eixo x) com o inverso da velocida-de (eixo y), obtinha-se uma equação de reta.
Cinética Enzimática
A EQUAÇÃO DE LINEWEAVER-BURKE1 v
1
S
1
Vmax
1Km-
Y=aX + bb= 1/VmaxSe Y=0, X=-1/KM
LINEAWER-BURK
DEDUÇÃO
V=Vmax*[S]KM + [S]
Vmax*[S]
KM + [S]1
V=
Vmax
KM1V
=1
Vmax1
[S]X +
a b1V
=1
[S]a + b
Y= aX + b
b= 1/VmaxSe Y=0, X=-1/KM
Cinética Enzimática
EFEITO DA TEMPERATURA
●Efeitos da temperatura■Aumenta a velocidade da reação.■Causa desnaturação da proteína
enzimática.■A conjugação dos dois efeitos
determina o comporta-mento da velocidade em função da temperatura.
■No caso de enzimas do solo, o efeito é m pouco dife-rente, devido à proteção dos colóides do solo.
Temperatura
Velo
cid
ad
e
-
-
-
II I I I I
CINÉTICA ENZIMÁTICAEFEITO DA TEMPERATURA
Vmax
W.J.Melo
--
------
0
10
20
30
40
II I I II I I
10 20 30 40 50
60
70
80
0Temperatura (oC)
Velo
cid
ad
e
ATIVIDADE DA UREASE NO SOLO
EFEITO DA TEMPERATURA
LVd
LVef
60
oC
Longo & Melo (2005)
Cinética Enzimática
CINÉTICA ENZIMÁTICA
EFEITO DO pH●Desnaturação da proteína
enzimática■Em pH muito baixo ou muito alto,
tende a ocorrer a des-naturação da proteína enzimática, resultando em uma diminuição na atividade catalítica.
●A curva de resposta da velocidade da reação enzimáti-ca tende a assumir a forma de um sino, mas é variável em função do tipo de enzima.
●As enzimas do solo apresentam um comportamento dife-rente, em função da interação com os colóides do solo.
CINÉTICA ENZIMÁTICA
EFEITO DO pH
pH
Velo
cid
ad
e Vmax
--
--
--
-
II I I II
pH
02 -4
6
810
12
14
2,2 3,2 4,2
5,2
6,2 7,2 8,2
Velo
cid
ad
e
LVd
LVef
Longo & Melo (2005)
ATIVIDADE DA UREASE NO SOLO
EFEITO DO pH
Cinética Enzimática
CINÉTICA ENZIMÁTICA
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA●A velocidade de uma reação
enzimática aumenta com o aumento da concentração da enzima.
●Condição■Não haver falta de substrato■As demais condições são as ideais
para a atividade da enzima
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA
E
V
Cinética Enzimática
CINÉTICA ENZIMÁTICA
EFEITO DA LUZ●Algumas enzimas, caso da redutase
do nitrato, são sen-síveis à presença da luz.
●Quando isto ocorre, há necessdade de se traba-lhar na ausência da luz.
Enzimas
UNIDADES PARA EXPRESSAR A ATIVIDADE
ENZIMÁTICA●Quantidade do substrato ou da enzima■Pode ser expressa em miligrama,
micrograma, mol, milimol.■A unidade do SI é o mol.●Especificação da enzima
■Pode ser expressa em quantidade do material que contém a enzima (por exemplo g de solo), quantidade de proteí- na, quantidade de enzima, número de moléculas enzimáti-cas.
●Tempo de incubação■Pode ser expresso em horas,
minutos ou segundos.●Deve-se usar unidades do Sistema
Internacional (SI).
W.J.Melo
Enzimas
UNIDADES PARA EXPRESSAR A ATIVIDADE
ENZIMÁTICA●Katal (kat)
■Unidade definida pela EC (Enzyme Comission) em 1961.
■É derivada do SI para expressar a atividade catalítica das enzimas.
■Seu uso é recomendado pela Conferência Geral de Pesos e Medidas (outubro de 1999).
■1 kat equivale à uma atividade que produz a transforma-ção de 1 mol do substrato ou a formação de 1 mol do produto em 1 segundo.
Kat
mol/segundo
Enzimas
FORMAS DE EXPRESSAR A ATIVIDADE
ENZIMÁTICA●Unidade Internacional (IU ou U)
■Definida pela International Union of Biochemistry (1964)
■Atividade que catalisa a transformação de 1 micromol do substrato ou a produção de 1 micromol do produto em 1 minuto sob condições padrões.
■U - micromol/minuto
1 kat= 6x107 U
Enzimas
FORMAS DE EXPRESSAR A ATIVIDADE
ENZIMÁTICA●Atividade específica
■Atividade que representa a massa ou o número de mo-les de substrato transformado ou do produto formado por umidade de enzima ou do material que a contém e por unidade de tempo.
■Exemplo⋆Na hidrólise total do amido▸Atividade= mg de glicose/g de
folha * hora▸Atividade= kat/mg folha▸Atividade= kat/mg de proteína
Enzimas
FORMAS DE EXPRESSAR A ATIVIDADE
ENZIMÁTICA●Atividade molar ou molecular
■É o antigo turnover.■Expressa a quantidade de substrato
transformado ou de produto produzido por molécula de enzima ou por sítio ativo.
Planta de sorgoDeficiência de Mg
ATIVIDADE ENZIMÁTICA
Enzimas
ATIVAÇÃO E INIBIÇÃO ENZIMÁTICA
●Ativação enzimática■Algumas enzimas precisam sofrer um
proces-so de ativação para se tornarem ativas.
■A enzima antes de ser ativada recebe o nome de zimogênio.
■Exemplo■Todas as proteases do pâncreas são
produzi-das como zimogênio, como forma de proteção.
■Pancreatite - doença que pode ser letal, causa-da pela ativaçao prematura das proteases e lipases do pâncreas.
●Inibição enzimática
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA
Inibição Enzimática
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA
●Há substâncias que, ao se ligarem à molécula enzimática, alteram o efeito catalítico da enzima.
●A ligação pode ser no sítio ativo ou em outra parte da molécula, de forma reversível ou irre-versível. Pode ser, também, uma ligação com o complexo enzima-substrto.
●Muitas delas são usadas como remédio■Exemplo: aspirina■Inibe a reação da primeira etapa da
biossínte-se de prostaglandinas, algumas das quais es-tão envolvidas na geração de dor.
Enzimas
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA
●Porque estudar Inibição Enzimática
■Dar suporte ao conhecimento do mecanismo de reações químicas.
■Descobrir substâncias com potencial para uso far-macêutico.
■Contribuir no estudo das vias metabólicas.
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA -TIPOS
INIBIÇÃOENZIMÁTIC
A
REVERSÍVEL
IRREVERSÍVEL
COMPETITIVAINCOMPETITIVAMISTA
W.J.Melo
Enzimas
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA - TIPOS
●Inibição enzimática reversível
■O inibidor forma um complexo instável com a enzima ou com o complexo ES.
■O efeito do inibidor pode ser revertido
●Inibição enzimática irreversível
■O inibidor forma um complexo estável com a enzima
■O efeito inibidor não pode ser revertido
Enzimas
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA COMPETITIVA
●O inibidor é uma biomolécula muito parecida com o substrato, de modo que pode ocupar o sítio ati-vo da enzima, concorrendo com o substrato.■Exemplos
⋆Metanol e etanol⋆Ácidos málico e malônico
●O complexo E-I não forma produto, mas é rever-sível.
●Quando o complexo E-I se dissocia, o substra-to pode ocupar o sítio ativo da enzima e formar produto. Isto significa que, aumentando a con-centração do substrto, dimiui o efeito do inibidor.
Enzimas
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA COMPETITIVA
H IH-C-OH I Hmetanol
H IH-C-H IH-C-OH I Hetanol
Metanol e etanol competem pelo sítio ativo da desidrogenase
alcoólica no figado
Enzimas
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA COMPETITIVA COOH I H-C-H IHO-C-H I COOH
ácido L-málico
COOH IHO-C-H I COOH
ácido malônico
Ambos concorrem pelo sítio ativo da desidrognase málicaO ácido L-málico é oxidado a ácido oxaloacético.O ácido malônico não sofre alteração.
Enzimas
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA COMPETITIVA
COOH I H-C-H IHO-C-H I COOH
ácido L-málico
desidrogenase málica
NAD+
H H
NADH + H+
COOH I H-C-H I C=O I COOH
ácido oxaloacético
W.J.Melo
Inibição Enzimática
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA COMPETITIVA
●Características
■Substrato e inibidor competem pelo sítio ativo da enzima
■Mantendo-se constante a concentração do inibidor e aumentando-se a concentração do substrato, aumenta-se a velocidade da reação.
■A velocidade máxima da reação pode ser recuperada.
■O valor de KM aumenta.
Inibição Enzimática
+
S S+
P
II
+
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA COMPETITIVA
I
W.J.Melo
Enzimas
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA COMPETITIVA
1
S
1 v Io
1
Vmax
1Km-
I1I2
Vmax não se alteraKM aumenta
Inibição Enzimática
INIBIÇÃO ENIMÁTICA COMPETITIVA
●Aplicação terapêutica■O metanol é tóxico: no fígado a
desidro- genase alcoóica o transforma em formal- deído, que causa dano aos tecidos, in- cluindo cegueira.
■O etanol compete com o metanol e seu produto não é tóxico.
■No caso de envenenamento por metanol usa-se etanol como antídoto.
Enzimas
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA INCOMPETITIVA
●O inibidor liga-se a um local da enzima que não é o sítio ativo.
●O inibidor liga-se ao complexo E-S.●Quando o complexo E-I se desfaz,
não significa que o substrato virá a ocupar o sítio ativo da en-zima.
●O aumento da concentração do substrato, man-tendo-se a concentração do inibidor, poderá au-mentar a velocidade da reação, mas o Vmax não será regenerado.
●Tanto o Vmax como o KM diminuem.
Enzimas
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA INCOMPETITIVA
+ S S
+P
+ I S I
W.J.Melo
Enzimas
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA INCOMPETITIVA
1
S
1 v IoI1
I2
1
Vmax
1Km-
Vmax e KM diminuem
Inibiação Enzimática
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA MISTA
●O inibidor se liga à enzima em um local distinto do sítio ativo.
●O inibidor pode ligar-se tanto à enzima quanto ao complexo E-S.
●Tanto Vmax como KM são afetados (o Vmax dimi-nui e o KM aumenta).
●Há um caso especial, em que a inibição mista recebe a denominação de inibição não compe-titiva.
●Na inibição enzimática não competitiva, o Vmax diminui, mas o KM permanece constante.
Enzimas
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA MISTA1 v
1
S
IoI1I2
1
Vmax
1Km-
Vmax diminuiKM aumenta
1 v
1
S
IoI1
I2
1
Vmax
1Km-
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA NÃO COMPETITIVA
Vmax diminuiKM não se altera
Inibição Enzimática
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA IRREVERSÍVEL
●O inibidor liga-se ao sítio ativo ou a uma outra por-ção da enzima.
●O inibidor forma um complexo estável com a enzi-ma, inativando-a.
●Exemplos■Inibição da quimiotripsina pelo
DIFP (diisopro-pilfluorfosfato).■inibição do grupo sulfidrila pelo
iodo acetato.●Caso especial - inativadores suicidas
■O complexo E-S, ao invés de formar um produto normal, forma um produto altamente reativo, que se liga irreversivelmente à enzima, inativando-a.
Enzimas
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA IRREVERSÍVEL
+E-CH2-OH serin
a
O CH3 II I F-P-O-C-H I I O CH3 I H3C-C-CH3 I H
DIFP
F
H HF +
E-CH2-O
O CH3 II I -P-O-C-H I I O CH3 IH3C-C-CH3 I H
complexo estável