produção e purificação de enzimas quitosanolíticas produzidas … · 2019. 1. 30. ·...

RENORBIO

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia

Produção e purificação de enzimas quitosanolíticas produzidas

por microrganismo isolado no Nordeste Brasileiro

Nathália Kelly de Araújo

NATAL/RN

2015

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Biotecnologia - Renorbio, da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte,

como parte dos requisitos para obtenção do título

de Doutor em Biotecnologia.

NATHÁLIA KELLY DE ARAÚJO

Produção e purificação de enzimas quitosanolíticas produzidas

por microrganismo isolado no Nordeste Brasileiro

Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino

dos Santos

Co-Orientador: Profa. Dra. Gorete

Ribeiro de Macedo

NATAL/RN

2015

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências

Araújo, Nathália Kelly.

Produção e purificação de enzimas quitosanolíticas produzidas por microrganismo isolado no Nordeste brasileiro

/ Larissa Maria da Rocha Meira. – Natal, RN, 2015.

116 f.: il.

Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos.

Coorientadora: Profa. Dra. Gorete Ribeiro de Macedo.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-

Graduação em Biotecnologia.

1. Cromatografia em leito expandido – Tese. 2. Bacillus Cereus. – Tese. 3. Quitosanase. – Tese. I. Santos,

Everaldo Silvino dos. II. Macedo, Gorete Ribeiro de. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 543.54

iv

Aos meus pais, Maria Aurea de Araújo e Otávio de Barros Neto que me enchem de inspiração e

força para que eu nunca desista da batalha da formação profissional. Que vocês estejam ao lado

de espíritos de luz!

Eu amo vocês!

v

AGRADECIMENTOS

É com muita satisfação que escrevo meus agradecimentos a todas as pessoas de extrema

importância na minha vida pessoal e profissional que de alguma forma contribuíram para a

conclusão de mais essa importante etapa em minha vida.

Primeiramente agradeço a Deus e espiritualidade por clarear minha mente e dar tranquilidade

e confiança para execução desse trabalho;

A Tiago pelo amor, incentivo e confiança durante os momentos fáceis e difíceis;

A minha Tia Zélia Barros, pelos conselhos e carinhos tão valiosos;

Aos meus irmãos, Alex, Eugênia, Paulo e Sandra pelo suporte acadêmico e sentimental;

A todos os demais familiares, pelo apoio inegável na concretização dessa jornada;

Ao professor Dr. Everaldo Silvino dos Santos, do Departamento de Engenharia Química da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pela orientação e compreensão durante a

realização deste trabalho;

À professora Dra. Gorete Ribeiro de Macedo do Departamento de Engenharia Química pela co-

orientação, pela amizade, pelos conselhos, por estar sempre disposta a ensinar e esclarecer

dúvidas, e pelo crescimento profissional e pessoal proporcionados com o seu convívio. Muito

obrigada, professora, por também ter me acolhido como sua aluna de iniciação científica;

Aos professores, Sueli Rodrigues, Cristiane Assis e Matheus Pedrosa, componentes da banca de

qualificação, pela enorme contribuição para o aperfeiçoamento do trabalho;

Aos professores Eliana Kamimura, Michelle Vaz, Cristiane Assis e Matheus Pedrosa,

componentes da banca de defesa, por aceitarem participar da avaliação final desse projeto;

vi

Ao colega e técnico de laboratório Francisco Canindé de Sousa Júnior pela ajuda durante as

disciplinas e na realização de experimentos;

A Carlos Padilha, colega de laboratório, pela imensurável ajuda na elaboração de

experimentos, na interpretação de resultados e entendimento de todas as equações e números

próprios da engenharia;

Aos, também colegas e professores de laboratório, Michelle, Sérgio, Ruthinéia e Francinaldo,

pela alegria e determinação que passam as pessoas ao seu redor;

À Maria Luiza Xavier, aluna de iniciação científica que atuou nesse trabalho e tornou-se uma

grande amiga. Malu, com você aprendi mais que ensinei. Sua doçura, afeto e dedicação é algo

que não se encontra em qualquer lugar;

A todos os demais alunos de iniciação científica que dividiram e contribuíram enormemente com

esse trabalho. Em especial Humberto Arimatéia, Rafael Costa e Vanessa Pimentel;

Ao aluno de intercâmbio Jean Haury, pela troca de experiências e conhecimentos;

Aos demais colegas de laboratório pela boa convivência;

As minhas amigas e colegas de mestrado, Larissa Lira, Dayse Santos e Dayse Caroline, que me

ouviram e ajudaram durante os experimentos;

À Ana Katarina Andrade Silva pela colaboração nos experimentos de identificação dos

microrganismos;

Aos colegas de departamento e funcionários, sempre garantindo um ambiente adequado e

organizado necessários para o bem estar do nosso ambiente de trabalho;

vii

Às turmas de Farmácia e Engenharia Química pela paciência e pela oportunidade concedida

durante as aulas ministradas por mim no estágio a docência;

A coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior (CAPES), pelo incentivo

financeiro durante meu doutorado.

viii

“É preciso provocar

sistematicamente confusão. Isso promove a

criatividade. Tudo aquilo que é contraditório

gera vida”.

Salvador Dalí

ix

RESUMO

Uma cepa produtora de quitosanase foi isolada e identificada como Bacillus cereus C-01. A

partir de extratos enzimáticos obtidos em cultivos submersos, foi efetuada a purificação da

enzima e sua caracterização bioquímica. Para purificação foi utilizada a resina da linha

Streamline DEAE e coluna de vidro (2,6 cm x 30,0 cm) acoplada a uma bomba peristáltica, em

sistema de Adsorção em Leito Expandido (ALE). As condições para a purificação da quitosanase

foram otimizadas estatisticamente através de um Planejamento Composto Central. Investigou-se

as variáveis que influenciaram significativamente nos parâmetros fator de purificação (P) e

rendimento da enzima (Y). As análises estatísticas mostraram que as melhores condições para o

máximo P foram 150 cm.h-1

(velocidade de aplicação da amostra/carga), 6,0 cm de altura do

leito fixo e 7,36 cm de altura do distribuidor. Em condições otimizadas, a enzima mostrou ligar-

se a resina na mesma medida usando caldo clarificado e não clarificado (0,32 e 0,30 U/g

adsorvente, respectivamente). Em testes qualitativos do método empregado, a fração recuperada

após a eluição exibiu 31% de rendimento e um aumento de 3,6 vezes na atividade específica em

relação ao inicial. Considerando apenas a fração eluída com NaCl 0,3 M foi possível obter um

fator de purificação de 1,75. A enzima purificada apresentou massa molecular aparente de 33

kDa, estabilidade entre as faixas de temperaturas e pH de 30 – 55 ºC e 5,5 – 8,0,

respectivamente, e máxima atividade em pH 5,5 e temperatura de 55 ºC. Os íons de Cu2+

, Fe2+

e

Zn2+

foram inibitórios para a quitosanase. Em contraste, a enzima foi significativamente ativada

por Mn2+

. Os resultados demonstraram que é possível purificar múltiplas proteínas, a partir de

um extrato bruto sem qualquer pré-tratamento, com um processo de purificação econômico e de

um único passo.

Palavras chaves: B. cereus, cromatografia em leito expandido, quitosanase.

x

ABSTRACT

A chitosanase-producing strain was isolated and identified as Bacillus cereus C-01. From

enzyme extract obtained from submerged cultures, the purification of the enzyme and

biochemical characterization were studied. For purification was used Expanded Bed Adsorption

(EBA) system with a Streamline DEAE resin and a glass column (2.6 cm x 30.0 cm) coupled to

a peristaltic pump. The conditions for the purification of chitosanase were statistically

optimized using a Central Composite Design (CCD). The variables that significantly influenced

parameters of the purification factor (P) and enzyme yield (Y) were determined. Statistical

analyses showed that the optimum conditions for maximum P were 150 cm.h-1

(load flow

velocity), 6.0 cm of settled bed height and 7.36 cm distributor height. In the optimized

conditions, the enzyme bound to resin on the same extent using clarified and unclarified broth

(0.32 and 0.30 U/g adsorbent, respectively). The optimization of purification variables resulted

in an approximately 3.66-fold increase in P compared with that observed under not optimized

conditions. The fraction recovered after the elution exhibited 31% of the yield. If considered

only the eluted fraction with 0.3 M NaCl was possible to obtain a purification factor of 1.75.

The purified enzyme showed an apparent molecular mass of 33 kDa, pH and temperature

stability between ranges of 30 – 55 °C and 5.5 – 8.0 respectively, as well as maximal activity at

pH 5.5 and temperature 55 °C. The ions Cu+2

, Fe+2

and Zn+2

showed inhibitory effect for

chitosanse. In contrast, the enzyme was significantly activated by Mn+2

.The results

demonstrated that it is possible to purify multiple proteins from crude feedstock with an

economic process and single-step purification.

Keywords: B. cereus, expanded-bed chromatography, chitosanase.

xi

LISTA DE FIGURAS

Fundamentação Teórica

Figura 1: Estruturas químicas da quitina, quitosana e COS. Fonte: Lodhi et al., 2014. .............................. 5

Figura 2: Modo de ação de uma quitosanase (a) e uma exo-β-D-glicosaminidase. Fonte: (Thadathil &

Velappan, 2014). ........................................................................................................................................... 8

Figura 3: Ciclo básico de operação da ALE. As setas indicam a direção do escoamento. Fonte:

Amersham Pharmacia Biotech. ................................................................................................................... 18

Artigo: Recovery and Purification of Chitosanase produced by Bacillus cereus using Expanded Bed

Adsorption (EBA) and Central Composite Design (CCD)

Figure 1: Response surfaces for 23 central composite designs (a) X1 – X2 (purification factor); (b) X1 – X3

(purification factor); (c) X2 – X3 (purification factor); (d) X1 – X2 (Enzyme yield); (e) X1 – X3 (Enzyme

yield); (f) X2 – X3 (Enzyme yield). ............................................................................................................. 44

Figure 2: The experimental data versus the predicted data of normalized of purification factor (a) and

enzyme yield (b). ........................................................................................................................................ 45

Figure 3: Chromatographic profile of crude extract from Bacillus cereus in streamline DEAE ion

exchange column. The column was previously equilibrated with 50 mM Tris-HCl, pH 8.5 (Buffer A) and

the sample was eluted from column with 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.5 containing 0.3, 0.7 and 1.0M

NaCl (Step wise). ........................................................................................................................................ 46

Artigo: Single-step purification of chitosanase from Bacillus cereus using expanded bed

chromatography

Figure 1: Time-course of cell growth, chitosanase activity and protein content. C-01 was grown

aerobically in broth medium at 30 ºC for 72 hours: (■) Chitosanase activity, (○) total protein, (●) pH and

(□) DNA content. ........................................................................................................................................ 58

Figure 2: Bed expansion height in function of superficial velocity of fluid. Unclarified (□) and clarified

culture broth (■). ......................................................................................................................................... 59

Figure 3: Effect of the presence of cells on the breakthrough curve behaviour of chitosanase into the resin

Streamline DEAE. Unclarified (□) and clarified culture broth (■). ........................................................... 60

Figure 4: Effect of expansion degree on the breakthrough curve behaviour of chitosanase into the resin

Streamline DEAE by using unclarified broth. Expansion degree of 1.2 (■), 1.5 (●) and 2.0 (▲). ............ 61

Figure 5: The elution profile of chitosanase after adsorption of broth culture on Streamline DEAE.

Content of protein (○) and enzyme activity (■). ......................................................................................... 61

xii

Figure 6: SDS-PAGE analysis of the chitosanase from B. cereus C-01. Lanes: M- molecular markers; 1-

culture supernatant; 2- load; 3- washing; 4- fraction eluted with 0.3 M NaCl; 5- fraction eluted with 0.7 M

NaCl; 6- zymogram analysis for fraction eluted with 0.3 M NaCl; 7- zymogram analysis for fraction

eluted with 0.7 M NaCl. .............................................................................................................................. 62

Figure 7: Effects of pH on the activity (■) and stability of chitosanase (●). The pH stability profile to the

enzyme was determined by measuring the residual enzyme activity at pH 6 after 24 hours of incubation in

different pH values (3.0 – 10.0) at 4 ºC. ..................................................................................................... 64

Figure 8: Effects of temperature on the activity (■) and stability of chitosanase (●). The enzymatic

samples were incubated for 60 minutes at temperature ranging from of 30 ºC to 80 ºC. ........................... 65

Figure 9: Effect of ions on chitosanase activity. The enzymatic samples were incubated at 4 ºC for 2

hours in the presence of: Mg2+,

Cu2+

, Fe2+

, Ca2+

, Zn2+

, Mn2+

and Ba2+

. ..................................................... 66

xiii

LISTA DE TABELAS

Artigo: Recovery and Purification of Chitosanase produced by Bacillus cereus using Expanded Bed

Adsorption (EBA) and Central Composite Design (CCD)

Table 1: Matrix of CCD to coded and uncoded level of independent variables. ........................................ 39

Table 2. Central Composite design variables (coded factor and levels) and effect estimates for screening

of factors affecting purification factor (P) and enzyme yield (Y). .............................................................. 41

Table 3: Analysis of variance (ANOVA) for central composite design of purification factor and enzyme

yield. ........................................................................................................................................................... 42

Artigo: Single-step purification of chitosanase from Bacillus cereus using expanded bed

chromatography

Table 1: Purification of the chitosanase from B. cereus C-01 .................................................................... 62

xiv

LISTA DE ABREVIATURAS/ SIGLAS

AE Atividade enzimática

ANOVA Análise de Variância - Analysis of variance

BSA Soro Albumina Bovina - Bovine Serum Albumin

CCD Planejamento Composto Central - Central Composite Design

COS Quitooligossacarídeos - Chitooligoshcarides

DEAE Dietilaminoetil

Df Graus de Liberdade - Degrees of freedom

DP Desvio padrão

EBA Adsorção em Leito Expandido - Expanded Bed Adsorption

Eq. Equação - Equation

GH Glicosilhidrolases - Glicosil Hidrolases

GlcN Glucosamina

GlcNAc N-acetilglucosamina

GP Grau de polimerização

kDa Quilodalton - kilodaltons

MLEE Eletroforese de enzimas multilocos

P Fator de Purificação - Purification factor

xv

PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida - polyacrylamide gel

electrophoresis

PCR Reação em Cadeia da Polimerase - Polymerase Chain Reaction

PFGE Eletroforese em gel de campo pulsado

Y Redimento da Enzima - Enzyme yield

rpm Rotações por minuto

RSM Metodologia de Superfície de Resposta - Response Surface Methodology

SDS Dodecil Sulfato de Sódio - Sodium dodecyl sulfate

xvi

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................................ xi

LISTA DE TABELAS ............................................................................................................................. xiii

LISTA DE ABREVIATURAS/ SIGLAS ............................................................................................... xiv

1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................................................... 2

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ......................................................................................................... 5

2.1. Quitina e Quitosana ........................................................................................................................... 5

2.2. Hidrólise da Quitosana ....................................................................................................................... 7

2.3. Produção de Quitosanases ................................................................................................................. 9

2.4. Bactéria Bacillus cereus .................................................................................................................... 10

2.5. Quitooligossacarídeos ...................................................................................................................... 11

2.6. Purificação de proteínas .................................................................................................................. 13

2.7. Adsorção em Leito Expandido .......................................................................................................... 15

3. REFERÊNCIAS .................................................................................................................................... 19

4. OBJETIVOS .......................................................................................................................................... 32

4.1. Objetivo geral ................................................................................................................................... 32

4.2. Objetivos específicos ........................................................................................................................ 32

5. ARTIGOS DERIVADOS DA TESE ................................................................................................... 34

Recovery and Purification of Chitosanase produced by Bacillus cereus using Expanded Bed

Adsorption (EBA) and Central Composite Design (CCD) .................................................................... 35

Abstract ...................................................................................................................................................... 35

INTRODUCTION ..................................................................................................................................... 36

MATERIALS AND METHODS ............................................................................................................. 37

Materials .................................................................................................................................................... 37

Isolation and identification of chitosanolytic bacterium ....................................................................... 37

Chitosanase production ............................................................................................................................ 37

xvii

Analytical methods .................................................................................................................................... 38

Experimental Designs ............................................................................................................................... 38

Operation of EBA ..................................................................................................................................... 39

RESULTS AND DISCUSSION ............................................................................................................... 40

Identification of chitosanase-producing strain ....................................................................................... 40

CCD and Model fitting ............................................................................................................................. 40

Analysis of variance (ANOVA) ................................................................................................................ 42

Response surface methodology (RSM) .................................................................................................... 43

Test of the model ....................................................................................................................................... 45

CONCLUSION ......................................................................................................................................... 46

REFERENCES .......................................................................................................................................... 47

Single-step purification of chitosanase from Bacillus cereus using expanded bed chromatography 51

Abstract ...................................................................................................................................................... 51

INTRODUCTION ..................................................................................................................................... 52

MATERIALS AND METHODS ............................................................................................................. 53

Materials .................................................................................................................................................... 53

Isolation and identification of chitosanolytic bacterium ....................................................................... 53

Chitosanase production ............................................................................................................................ 53

Hydrodynamic of the bed ......................................................................................................................... 54

Operation of EBA ..................................................................................................................................... 54

Dynamic binding capacity ........................................................................................................................ 55

Effect of pH and temperature on the enzyme activity ........................................................................... 55

Effect of various chemicals and surfactants on the enzyme activity .................................................... 56

Analytical methods .................................................................................................................................... 56

Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and zymogram analysis 56

RESULTS AND DISCUSSION ............................................................................................................... 57

xviii

Identification of chitosanase-producing strain ....................................................................................... 57

Production of chitosanase from Bacillus cereus C-01 ............................................................................ 57

Hydrodynamic of the bed ......................................................................................................................... 58

Dynamic binding capacity ........................................................................................................................ 59

Purification of chitosanase ....................................................................................................................... 61

Effect of pH and temperature .................................................................................................................. 63

Effect of various ions on enzyme activity ................................................................................................ 65

CONCLUSION ......................................................................................................................................... 66

REFERENCES .......................................................................................................................................... 67

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................................... 74

7. APÊNDICE ............................................................................................................................................ 77

Introdução

Introdução 2

Nathália Kelly de Araújo Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia/RENORBIO

1. INTRODUÇÃO

A busca por moléculas com potencial terapêutico tem guiado a pesquisa em diversas

partes do mundo. Parte dessas pesquisas está orientada na busca de moléculas naturais de origem

vegetal, fúngica, bacteriana e animal.

O segundo polímero mais abundante na natureza é a quitina, perdendo em

biodispobilidade apenas para a celulose. A quitina é um polímero catiônico natural com estrutura

e propriedades únicas, encontrado como componente estrutural da parede celular de fungos

zigomicetos e algas clorofíceas, assim como no exoesqueleto de artrópodes (Thadathil &

Velappan, 2014).

A quitosana é a principal molécula desacetilada derivada da quitina, embora a

desacetilação não seja total. Atualmente a quitosana adquirida comercialmente é produzida de

quitina de crustáceos pela N-desacetilação usando soluções alcalinas e altas temperaturas

(Thadathil & Velappan, 2014).

Quitosana com grau de polimerização (GP) menor que 20 e massa molecular média de

3900 Da são chamados de oligômeros de quitosana, quitooligômeros ou quitooligossacarídeos

(COS) (Mourya et al., 2011). Os COS são gerados pela depolimerização da quitosana usando

hidrólise ácida, física ou degradação enzimática (Aam et al., 2010).

Recentemente, os COS têm sido objeto de interesse em termos farmacêuticos e

medicinais devido a sua não toxicidade, solubilidade, assim como os seus efeitos fisiológicos

positivos (Lodhi et al., 2014).

A hidrólise da quitosana, com o objetivo de produzir COS para uso biológico, envolve o

uso de enzimas. O método de hidrólise enzimático envolve o uso de quitosanases e outras

enzimas não específicas; este método é realizado em condições de operação brandas e permite

um controle do tamanho do produto (Lodhi et al., 2014).

Pouco tem sido descrito sobre o isolamento de microrganismos produtores de

quitosanases a partir de solos do litoral do Nordeste do Brasil, mesmo sendo esta região grande

produtora de crustáceos. Vale ressaltar que o principal componente do exoesqueleto dos

crustáceos é a quitina. A obtenção de enzimas de interesse econômico de forma mais eficiente e

com baixo custo de produção é uma das áreas de pesquisa em ascensão em biotecnologia.

Neste trabalho foram isoladas quinze cepas bacterianas. As duas que apresentaram maior

potencial para produção de quitosanases, foram identificadas por métododos moleculares:

Introdução 3


Bacillus cereus e Serratia marcescens. Entre essas duas, a maior produção de quitosanase foi

observada no cultivo do B. cereus, assim, amostras do cultivo dessa cepa foram utilizadas em

todas as etapas subsequentes dessa tese.

A presente tese de doutorado teve como objetivo geral isolar e selecionar novos

microrganismos produtores de quitosanases, com alto potencial de hidrólise da quitosana,

produzir enzimas com atividade quitosanolítica, caracterizar tais enzimas bem como purificá-las.

A tese está dividida da seguinte forma: após uma breve introdução, desenvolvida nesse

capítulo, na qual foi contextualizada a importância da mesma, segue-se uma revisão da literatura,

na qual são apresentados os fundamentos teóricos para os capítulos seguintes, seguida dos

objetivos gerais e específicos, assim como da lista de refêrencias consultadas nessa primeira

parte do trabalho. Destaca-se que, na presente tese, a metodologia bem como os resultados e as

discussões desenvolvidas na mesma serão apresentados na forma de artigos que foram

submetidos para periódicos. Os artigos são apresentados no formato que foram enviados para os

periódicos. Em seguida, apresentam-se as considerações finais sobre o trabalho. Por fim, na

forma de apêndice, apresenta-se um modelo matemático sobre o processo de purificação

empregado nesse trabalho de doutorado. Este estudo matemático foi concebido em parceria com

um aluno do Grupo de Engenharia de Bioprocessos do Programa de Pós-graduação em

Engenharia Química. Grupo esse no qual também foi desenvolvida a presente tese.

Fundamentação Teórica

Fundamentação Teórica 5


2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1. Quitina e Quitosana

Quitina é o segundo polímero mais abundante na natureza. É um polímero catiônico

natural linear de alta massa molecular composto de unidades de N-acetil-D-glicosamina unidas

por ligações β (1→4) (Aam et al., 2010), conforme estrutura apresentada na Figura 1. A quitina

apresenta propriedades únicas, sendo encontrada como componente estrutural da parede celular

de fungos zigomicetos e algas clorofíceas, assim como no exoesqueleto de artrópodes (Thadathil

& Velappan, 2014). Na sua forma natural é encontrada como microfibrilas cristalinas (Perrin et

al., 2014).

Figura 1: Estruturas químicas da quitina, quitosana e COS. Fonte: Lodhi et al., 2014.

Destaca-se que a imunogenicidade da quitina é excepcionalmente baixa, apesar da

presença de nitrogênio. Assim como a celulose, a quitina é um material altamente insolúvel e de



baixa reatividade química. Sua única diferença química com a celulose, polissacarídeo mais

abundante na natureza, é a substituição de um grupo hidroxila em C-2 por um grupo amino

acetilado. Tem coloração branca e é inelástica (Lodhi et al., 2014).

A quitina existe em duas formas cristalinas polimórficas, α e β. A α-quitina consiste de

folhas fortemente empacotadas alternando entre cadeias paralelas e antiparalelas. Esta forma da

quitina é encontrada no exoesqueleto de artrópodes, insetos e na parede celular de fungos e

leveduras. A β-quitina ocorre com menos frequência na natureza do que a α-quitina, mas pode

ser extraída de gladius de lula (Aam et al., 2010).

Além da sua aplicação como matéria-prima para obtenção da quitosana e COS, a quitina

tem sido o centro de várias aplicações terapêuticas e tem se mostrado um promissor biomaterial

para engenharia de tecidos e na tecnologia de células tronco (Lodhi et al., 2014).

A partir da desacetilação química da quitina, ou por bioconversão utilizando quitina

desacetilases, obtêm-se a quitosana (Pareek et al., 2013). A quitosana é um amino polissacarídeo

composto principalmente de unidades de 2-amino-2-deoxi-D-glicose, também conhecido por

glicosamina (GlcN), ligadas linearmente por ligações glicosídicas β-1,4 com grau de acetilação

variado (Khor, 2014). A quitosana possui similaridade estrutural com glicosaminoglicanos e tem

sido amplamente investigada como um biomaterial natural para diversas aplicações biomédicas

devido a sua biocompatibilidade, biodegradabilidade, propriedades antimicrobianas e

funcionalidade (Jiang et al., 2014).

As aplicações da quitina são limitadas quando comparadas com a da quitosana. A quitina

é quimicamente inerte e insolúvel tanto em água com em ácido, enquanto a quitosana é

relativamente reativa e pode ser produzida de várias formas. A quitosana é normalmente

insolúvel em pH neutro e básico, porém torna-se solúvel em pH ácido. A solubilidade da

quitosana depende da distribuição de grupos amino livres e N-acetil. Em ácidos diluídos (pH <

6,0), os grupos amino são protonados e a molécula torna-se solúvel (Lodhi et al., 2014).

Atualmente, a quitina e quitosana comercializadas são produzidas a partir do

exoesqueleto de caranguejos e camarões, assim como da concha interna de lulas (Jung & Park,

2014). A produção da quitosana envolve desproteinização, desmineralização e desacetilação. As

características desses biopolímeros dependem do processo e condições de produção.

Características como aparência do polímero, turbidez em solução, grau de desacetilação e massa

molecular são de grande importância para aplicações biológicas e industriais (Nwe et al., 2014).



2.2. Hidrólise da Quitosana

A hidrólise da quitosana é um processo similar ao que ocorre com outros polissacarídeos,

na qual a presença de determinados agentes (ácidos ou enzimas) rompe as ligações glicosídicas.

Os quitooligossacarídeos (COS), gerados a partir dessa hidrólise, apresentam variações tanto no

grau de polimerização (GP) como na sequência das unidades de glicosamina (GlcN) e N-

acetilglicosamina (GlcNAc) do oligômero gerado (Kim & Rajapakse, 2005).

Para produção em larga escala de COS, a hidrólise ácida é comumente usada para clivar

as ligações glicosídicas da quitosana. Entretanto, a hidrólise química resulta em baixa

produtividade de COS e uma grande quantidade de unidades monoméricas de D-glicosamina.

Normalmente a hidrólise química é realizada usando ácido clorídrico, nitroso, fosfórico, ou

hidrofluorídrico. Entretanto, devido à complexidade de controle do processo de reação, estes

tratamentos também resultam na formação de compostos secundários que são de difícil remoção

(Mourya et al., 2011; Lodhi et al., 2014).

Dessa forma, os COS preparados por método ácido são de difícil aplicação como material

bioativo devido à possibilidade de contaminação com componentes tóxicos. Por outro lado, a

hidrólise enzimática da quitosana tem sido proposta como método preferencial para produção de

COS bioativos (Kim & Rajapakse, 2005). Enzimas operam sob condições brandas e são

altamente específicas. Além disso, o uso de enzimas permite o controle da reação e da formação

do produto por meio do ajuste da concentração da enzima, do pH, temperatura e do tempo de

reação (Mourya et al., 2011).

A quitosana é usualmente susceptível a um grande número de enzimas, incluindo as

específicas (quitosanases) e não-específicas (carbohidrolases, proteases, lipases, entre outras)

(Kim & Rajapakse, 2005).

Pesquisas sobre quitosanases tem recebido grande atenção devido a sua ampla aplicação

em vários campos (Thadathil & Velappan, 2014). Entre essas aplicações, inclui-se a preparação

de COS bioativos (Wang et al., 2011a; de Araujo et al., 2013), de agentes de biocontrole para

aumentar a resistência de plantas contra patógenos fúngicos (Hsu et al., 2012), mediar a entrega

de gene (Almalik et al.,2013) e a bioconversão de resíduos quitinosos marinhos (Wang et al.,

2011b).

O comitê de nomenclatura de enzimas, em 2004, definiu quitosanase como enzima capaz

de realizar a endohidrólise de ligações β-1,4 entre resíduos de GlcN em uma molécula de



quitosana parcialmente acetilada, a partir da extremidade redutora (Figura 2a). Posteriormente,

em 2008, o comitê criou uma segunda classe de enzima, exo-β-D-glicosaminidase que ataca a

quitosana a partir de sua terminação não redutora (Figura 2b) (Thadathil & Velappan, 2014).

Figura 2: Modo de ação de uma quitosanase (a) e uma exo-β-D-glicosaminidase. Fonte: (Thadathil &

Velappan, 2014).

Enzimas que hidrolisam as ligações glicosídicas entre açúcares são chamadas de Glicosil

Hidrolases (GH). As GH são classificadas pelo banco de dados Carbohydrate-Active enZYmes

(CAZY) o qual constantemente mantêm atualizada a lista de GH, assim como de outras enzimas

que agem sobre carboidratos. A classificação do CAZY é puramente baseada na similaridade

entre sequências de aminoácidos. Assim, várias classes de GH contêm enzimas que agem em

diferentes substratos. Enzimas com atividade quitosanolítica têm sido encontradas nas famílias

de GH 5, 7, 8, 46, 75 e 80. A GH 7 é uma família de celulases e a atividade quitosanolítica

detectada está ligada a atividade inespecífica de algumas celulases. A família GH 5 possui uma

variedade enzimas, incluindo quitosanases, celulases, liqueninases, manases e xilanases. Na

família GH 8 tem sido relatada maior atividade quitosanolítica, em alguns casos, ligado às

celulases e xilanases, em outros, realmente a quitosanases. As famílias GH 46, GH 75 e GH 80

possuem exclusivamente quitosanases. As famílias GH 75 e GH 80 possuem poucos membros e



sua estrutura tridimensional ainda não foi determinada. As quitosanases mais estudadas são

aquelas pertencentes à família 46 (Aam et al., 2010).

Tem sido observado que a estrutura das pontes glicosídicas na quitosana afeta o processo

de hidrólise. Quitosanas diferencialmente desacetiladas possuem quatro diferentes tipos de

ligações glicosídicas distribuídas aleatoriamente na sua estrutura. Essas incluem ligações entre

duas unidades N-acetilglicosamina (A-A), entre uma unidade acetilada e outra desacetilada (A-

D), entre uma unidade desacetilada e outra acetilada (D-A) e entre duas unidades desacetiladas

(D-D). A especificidade da quitosanase com respeito aos quatro diferentes modos de clivar a

ligação glicosídica é determinada pela identidade das extremidades redutoras e não redutoras. A

distinção entre quitosanase e quitinase é mínima, já que ambas possuem a habilidade de degradar

uma variedade de quitosanas com diferentes graus de acetilação. Entretanto, quitinases atacam

preferencialmente polímeros com alto grau de acetilação, enquanto que, quitosanases são mais

efetivas em quitosanas com baixa N-acetilação (Mourya et al., 2011).

2.3. Produção de Quitosanases

Quitosanases são produzidas por microrganismos e plantas, onde possuem um importante

papel na nutrição e defesa.

Quitosanases extracelular de origem bacteriana já foram descridas em diversos gêneros:

Bacillus sp. (Almalik et al., 2013; Goo & Park, 2014; Liang et al., 2014), Serratia sp. (Wang et

al., 2010; Zhang et al., 2014b), Janthinobacterium sp. (Johnsen et al., 2010), Paenibacillus sp.

(de Araujo et al., 2013; Zitouni et al., 2013), Acinetobacter sp. (Wang et al., 2011b) e

Streptomyces sp.(Takasuka et al., 2014).

Com relação às quitosanases de origem fúngica, há um número menor de relatos. Cita-se,

por exemplo, a produção de quitosanases por Aspergillus sp. (Hirano et al., 2012; Beck et al.,

2014), Gongronella sp. (Zhang et al., 2013), Metarhizium anisopliae (de Assis et al., 2012) e

Trichoderma sp. (da Silva et al., 2012).

Pesquisas recentes revelam a produção de quitosanases por cianobactérias. Estas

compreendem um grupo extremamente diverso de procariontes fotossintetizantes com amplo

potencial biosintético e diversas atividades metabólicas. Em estudos utilizando Anabaena

fertilíssima foi observada a produção de uma quitosanase com potencial de uso como agente de

biocontrole (Gupta et al., 2010; Gupta et al., 2012).



Além dos microrganismos, algumas são produzidas por plantas (Thadathil & Velappan,

2014). Em estudo utilizando COS produzidos por hidrólise enzimática com quitosanase de broto

de bambu foi possível avaliar a atividade in vivo e in vitro desse composto (Chang et al., 2014).

Em outro estudo, também com broto de bambu, foi possível purificar e caracterizar duas

isoformas de quitosanase (Hsu et al., 2012).

2.4. Bactéria Bacillus cereus

De acordo com a taxonomia atual, o grupo Bacillus cereus inclui sete espécies

reconhecidas: Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus

weihenstephanensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides e Bacillus cytotoxicus, que

compartilham um parentesco genético e bioquímico (Gillis & Mahillon, 2014). Estas espécies

foram originalmente descritas como base nos seus habitats, sua patogenicidade para mamíferos e

insetos, e suas características morfológicas e fisiológicas (Ash et al., 1991). Este grupo consiste

de espécies estreitamente relacionadas de bactérias de interesse para pesquisa devido a sua

importância na indústria e na medicina. Entretanto, ainda há dificuldade de distinguir essas

bactérias a em nível intra e inter-espécie (Punina et al., 2013).

Bacillus cereus é um comum contaminante de alimentos enquanto Bacillus thuringiensis

é capaz de produzir um bioinseticida o qual é tóxico para larvas de insetos. Na classificação

tradicional, B. thuringiensis pode ser distinguido do B. cereus pela sua capacidade de produzir

um inseticida de inclusão cristal no interior da célula durante a esporulação. Como essa

característica é frequentemente localizada no plasmídeo, o qual é transferível, quando as cepas

perdem o plasmídeo elas tornam-se indistinguíveis (Chen & Tsen, 2002).

Devido ao fato relatado acima, recentes abordagens moleculares, com alvo em genes

cromossomais, têm sido usadas para identificação específica das cepas do grupo B. cereus. A

diversidade genética da bactéria B. thuringiensis e a possibilidade de distinguí-la da bactéria B.

cereus, vem sendo estudada por diferentes métodos (Punina et al., 2013).

Para diferenciação entre B. cereus e B. thuringiensis, sondas específicas de DNA

baseadas na região variável V1 da subunidade 16S do rRNA têm sido desenhadas. Entretanto,

vários trabalhos vêm analisando sequências da subunidade 16S do rRNA das espécies deste

grupo e demonstram que elas são praticamente idênticas e dentro da variação esperada para uma

única espécie. Comparações recentes de várias cepas de B. thuringiensis e B. cereus, por

eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE), polimorfismo de conformação de fita simples,



eletroforese de enzimas multilocos (MLEE) e a diversidade de seus elementos móveis, sugerem

que estes dois Bacillus spp. devem ser considerados uma espécie (Chen & Tsen, 2002).

Além disso, o uso de outras sequências de nucleotídeos de rRNA, tais como 23S e 16S-

23S, também não permitiram estabelecer a atual relação filogenética entre B. thuringiensis e B.

cereus (Punina et al., 2013).

Dessa forma, com base em amplos estudos genômicos realizados em cepas de B. cereus e

B. thuringiensis, tem-se indicado que pode ser mais apropriado considerá-los como pertencentes

a uma espécie genérica a partir do qual vários ecótipos e patótipos surgiram (Gillis & Mahillon,

2014).

Historicamente, diversos estudos relatam a produção de quitinases e quitosanases pela

bactéria Bacillus cereus (Kurakake et al., 2000; Chang et al., 2007; Liang et al., 2012; Liang et

al., 2013; Goo & Park, 2014; Liang et al., 2014; Seo et al., 2014).

2.5. Quitooligossacarídeos

A quitosana é suscetível de hidrólise (degradação hidrolítica) devido à presença de pontes

glicosídica na molécula; essas ligações são bastante instáveis quando tratadas com agentes

hidrolisantes, como por exemplo, soluções aquosas de ácidos. Quitosana com Grau de

Polimerização (GP) inferior a 20 e com massa molecular média menor do que 3900 Da são

chamados de oligômeros de quitosana, quitooligômeros ou quitooligosacarídeos (COS) (Mourya

et al., 2011). Os COS não são solúveis em acetona, butanol, etanol, acetato de etila, propanol e

piridina mas são totalmente solúveis em água e parcialmente solúvel em metanol e dimetil

sulfóxido. Oligômeros com GP entre 2-4 são solúveis em metanol, mas oligômeros com GP

maior que 5 são menos solúveis (Mourya et al., 2011).

Diferentemente da maioria dos polissacarídeos, a quitosana e os COS têm cargas

positivas, o que lhes permite se ligar fortemente a superfícies negativamente carregadas; esta

propriedade é responsável por muitas atividades biológicas já descritas para estas moléculas. No

entanto, é importante mencionar que COS com estruturas diferentes apresentam diferentes

atividades biológicas, e nem todas as atividades biológicas são encontradas em um dado COS.

Cada tipo especial de COS bioativo é desenvolvido através da modificação química e/ou

hidrólise enzimática para potencial aplicação farmacêutica e médica (Zhang et al., 2010).

Os COS têm sido objeto de crescente atenção em termos de aplicações medicinais e

farmacêuticas, devido a sua alta solubilidade e não toxicidade bem como aos seus efeitos



fisiológicos positivos. Recentes avanços têm lançado luz sobre os benefícios do COS à saúde,

incluindo a redução do colesterol no sangue e da pressão arterial elevada, efeitos de proteção

contra infecções, controle da artrite, melhora da absorção de cálcio e propriedades antitumorais

(Lodhi et al., 2014).

No início do ano 1970, foi relatada a primeira atividade biológica, antitumoral, dos COS.

Essa atividade foi inicialmente sugerida como induzida pela propriedade catiônica exercida por

grupos amino dos COS. Posteriormente, foi aceito que a massa molecular também possui papel

majoritário para a atividade antitumoral (Lodhi et al., 2014). Tem sido demonstrada a ação

antitumoral tanto com uso de células tumorais, por exemplo, HepG2, HeLa (de Assis et al.,

2012) e HL-60 (Kim et al., 2012), como com uso de modelos animais. Estudos in vivo com

portadores de câncer de pulmão constatou que a administração oral de COS pode regular a

função imune, reduzir os efeitos negativos da radioterapia sobre a imunidade e ter um bom efeito

antitumoral adjuvante (Ma et al., 2015). Também foi demonstrado que administração oral de

COS em ratos portadores de tumor de cólon suprime o crescimento do tumor, através da indução

de apoptose e a estimulação do sistema imunitário, o que sugere que os COS são potencialmente

um alimento funcional (Masuda et al., 2014).

Pesquisas também tem evidenciado diretamente a ação antioxidante dos COS. Destaca-se

que foi relatada a inibição do estresse oxidativo induzido por etanol (Luo et al., 2014b), o

sequestro de radicais DPPH (Eom et al., 2012; de Araujo et al., 2013) e superóxido (de Assis et

al., 2012; Li et al., 2013). A inibição da oxidação celular, em células sob estresse oxidativo,

também já foi descrita em diversos trabalhos, por exemplo, com macrófagos RAW264.7 (Ngo et

al., 2011), eritrócitos (Fernandes et al., 2010, Zhang et al., 2014a), células pancreáticas MIN6

(Lu et al., 2012) e de fígado (Trinh et al., 2014).

Também se destacam os efeitos: imunoestimulante (Zhang et al., 2014c), antibacteriana

(Wu et al., 2013; Younes et al., 2014), prebiótica (Kong et al., 2014), antidiabética (Katiyar et

al., 2011), supressão de metástase (Luo et al., 2014a), ativação da resistência de plantas contra

insetos e ataques de patógenos (Zhang et al., 2011), antifúngica (Suma & Podile, 2013; Younes

et al., 2014), anti-inflamatória (Azuma et al., 2015), antiviral (Artan et al., 2010), prevenção da

adesão bacteriana em células humanas (Rhoades et al., 2006) e uso como vetor para entrega de

genes (Issa et al., 2006; Csaba et al., 2009).



2.6. Purificação de proteínas

Após a produção de biomoléculas de interesse industrial, farmacêutico e/ou medicinal

utiliza-se operações unitárias (Downstream processing) que possam garantir o grau de pureza

desejado do material, que dependerá de sua aplicação.

Pesquisadores têm purificado e caracterizado com sucesso um grande número de

proteínas de uma variedade de microrganismos usando diferentes técnicas. A partir desses

passos são obtidas diferentes informações, tais como atividade específica, rendimento, ponto

isoelétrico, massa molecular, Km, Vmax, pH e temperatura ótimas. Várias estratégias envolvendo

passos individuais ou multi-passos normalmente são empregadas (Sooch et al., 2014).

A eficiência do Downstream processing é influenciada pela concentração de proteínas,

pela complexidade do extrato bruto e pelo grau de pureza requerido. Esse processo pode ser

dividido em duas fases: recuperação primária e purificação (Wilken & Nikolov, 2012).

O objetivo da recuperação primária é maximizar o título do produto e o rendimento no

extrato ou homogeneizado celular, reduzir o volume e preparar uma amostra clarificada para a

purificação. Processos downstream para sistemas baseados em biorreatores iniciam-se com a

coleta da biomassa por centrifugação, filtração com membranas, ou por bombeamento do meio

líquido para fora do biorreator. Para proteínas intracelulares é necessário o rompimento da

célula; enquanto que para proteínas extracelulares, o meio de cultura é tipicamente concentrado,

clarificado e condicionado antes de serem submetidas a processos cromatográficos. Algumas das

operações unitárias de recuperação primária, tais como a centrifugação, filtração de fluxo

cruzado e filtração frontal, são multifuncionais, e as suas estratégias de aplicações são definidas

pela composição e propriedades do extrato, tamanho das partículas e a estabilidade do produto

(Wilken & Nikolov, 2012).

Proteínas podem ser purificadas na sua forma ativa com base em características tais como

solubilidade, tamanho, carga e afinidade específica de ligação. A etapa de purificação

usualmente inicia-se com o passo de concentração de proteína (por exemplo, precipitação com

sulfato de amônio ou solventes ou polietileno glicol) e remoção de impurezas que poderão afetar

o rendimento, qualidade e/ou a eficiência da purificação (Thadathil & Velappan, 2014). Para

aplicações que exigem alto grau de pureza (uso em terapias e diagnóstico), etapas adicionais de

purificação são necessárias, principalmente para remover impurezas residuais e assegurar a

qualidade do produto (Wilken & Nikolov, 2012).



Para purificação de quitosanases e quitinases, aplicam-se diferentes técnicas

cromatográficas tais como filtração em gel (Oh et al., 2011), troca iônica (Jiang et al., 2012,

Nguyen et al., 2014), combinação das duas técnicas (Wang et al., 2008; Wang & Yeh, 2008) e

afinidade (Yang et al., 2007). Para quitosanases produzidas pelo Bacillus cereus tem-se

empregado principalmente combinação de gel filtração com troca iônica (Liang et al., 2012;

Liang et al., 2014) e somente gel filtração (Goo & Park, 2014).

A gel filtração é um tipo de cromatografia baseada no tamanho das partículas. A amostra

é aplicada no topo de uma coluna preenchida com um polímero poroso e insolúvel, mas

altamente hidratado, normalmente dextrana ou agarose ou poliacrilamida. Sephadex, Sepharose e

Bio-gel são as preparações comerciais mais usadas nessas resinas, as quais tipicamente possuem

grânulos com 100µm de diâmetro. Pequenas moléculas podem entrar nos poros dessa resina, mas

as grandes não. O resultado é que as moléculas pequenas são distribuídas na solução aquosa,

tanto no interior dos grânulos da resina como entre eles, enquanto que as moléculas grandes

estão localizadas apenas na solução entre os grânulos. As moléculas grandes fluem mais

rapidamente através da coluna e saem primeiro porque um volume menor é suficiente para eluí-

las. As moléculas que são de um tamanho médio, ocasionalmente entram no interior de um

grânulo e irão fluir em uma velocidade intermediária. Enquanto as moléculas pequenas, as quais

tomam um caminho tortuoso e mais longo, serão eluídas por último (Berg et al., 2002).

Na cromatografia de troca iônica, as proteínas são separadas de acordo com a carga

líquida que a mesma possui. Se uma proteína exibe carga positiva em pH 7,0, normalmente ela

irá se ligar a uma resina contendo contra-íons positivos, deslocando-os. Uma proteína

positivamente carregada ligada a uma resina pode então ser eluída aumentando-se a concentração

de cloreto de sódio ou outro sal no tampão de eluição, os íons sódio, agora com uma maior força

iônica, competem com a proteína deslocando-a. As proteínas que têm uma baixa densidade de

carga positiva líquida tenderão a ser eluídas em primeiro lugar, seguida daquelas que têm uma

densidade de carga mais elevada (Berg et al., 2002; Nelson & Cox, 2006).

Em um processo de purificação, diversas variáveis devem ser estudadas. Tratando-se de

bioprodutos, especificamente enzimas, o desempenho da técnica de purificação pode ser

evidenciado pelas variáveis redimento da atividade enzimática e fator de purificação (Padilha,

2013).



O redimento da atividade enzimática é a relação entre a atividade enzimática do material

purificado e a atividade do extrato bruto, a qual pode ser expressa em percentual (Padilha, 2013):

𝑹𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒆𝒏𝒕𝒐 (%) =𝑨𝒕𝒊𝒗𝒊𝒅𝒂𝒅𝒆 𝒆𝒏𝒛𝒊𝒎á𝒕𝒊𝒄𝒂 𝒅𝒐 𝒎𝒂𝒕𝒆𝒓𝒊𝒂𝒍 𝒑𝒖𝒓𝒊𝒇𝒊𝒄𝒂𝒅𝒐

𝑨𝒕𝒊𝒗𝒊𝒅𝒂𝒅𝒆 𝒆𝒏𝒛𝒊𝒎á𝒕𝒊𝒄𝒂 𝒏𝒐 𝒎𝒂𝒕𝒆𝒓𝒊𝒂𝒍 𝒃𝒓𝒖𝒕𝒐 𝒙 𝟏𝟎𝟎 Eq.1

O fator de purificação expressa o quão seletivo é o processo de purificação, relacionando

as atividades específicas do material purificado e do seu estado inicial (Padilha, 2013):

𝑭𝒂𝒕𝒐𝒓 𝒅𝒆 𝒑𝒖𝒓𝒊𝒇𝒊𝒄𝒂çã𝒐 = 𝑨𝒕𝒊𝒗𝒊𝒅𝒂𝒅𝒆 𝒆𝒔𝒑𝒆𝒄í𝒇𝒊𝒄𝒂 𝒏𝒐 𝒎𝒂𝒕𝒆𝒓𝒊𝒂𝒍 𝒑𝒖𝒓𝒊𝒇𝒊𝒄𝒂𝒅𝒐

𝑨𝒕𝒊𝒗𝒊𝒅𝒂𝒅𝒆 𝒆𝒔𝒑𝒆𝒄í𝒇𝒊𝒄𝒂 𝒏𝒐 𝒎𝒂𝒕𝒆𝒓𝒊𝒂𝒍 𝒃𝒓𝒖𝒕𝒐 Eq.2

2.7. Adsorção em Leito Expandido

A viabilidade econômica de um bioprocesso está diretamente ligada ao número e

eficiência das etapas necessárias durante a purificação, a fim de alcançar as especificações dos

produtos solicitados. Adsorção em Leito Expandido (ALE) é um processo integrado que

combina a separação sólido-líquido e a recuperação do produto numa única operação unitária.

Esta abordagem sugere um aumento do rendimento global, menor necessidade de investimentos

de capital e de consumo e, sobretudo, uma redução do tempo de processo. O sucesso de um

processo de integração é, no entanto, intimamente ligada a uma compreensão detalhada dos

princípios bioquímicos envolvidos e as limitações decorrentes da complexidade de matéria-prima

(Hubbuch et al., 2005).

A ALE permite que proteínas sejam recuperadas diretamente a partir de cultura de

microrganismos ou de células, sem a necessidade de remoção prévia de sólidos suspensos. O

desempenho geral da ALE é comparável à de um leito empacotado devido à redução da mistura

das partículas de adsorvente na coluna. No entanto, as condições ideais de operação são mais

restritas devido à dependência da expansão do leito e a densidade requerida das partículas de

adsorvente, bem como a viscosidade e a densidade da matéria-prima. A composição da matéria-

prima pode se tornar mais uma restrição limitante devido às interações das partículas adsorventes

com superfície das células, DNA e outras substâncias, levando a sua agregação e,

consequentemente, a instabilidades do leito e formação de canais preferenciais. Apesar destas

dificuldades, a ALE tem encontrado aplicações generalizadas na purificação em grande escala de

proteínas de células de mamíferos e microbianas (Anspach et al., 1999).

O estudo e uso de leito fluidizado como ferramenta cromatográfica passou a ser utilizado

com maior efetividade a partir da década de 90 (Draeger & Chase, 1990). A partir da introdução



de novos tipos de adsorventes destinados a operação em leito expandido, linha streamline

produzida pelo grupo Amersham Phamarcia Biotech atual G&E, foi possível uma maior

estabilidade do leito e um aumento na faixa de velocidade de operação (100-300 cm.h-1

)

(Padilha, 2013).

A matriz do adsorvente deve mostrar características de fluidização adequadas. Em

particular, o leito deve ter a capacidade de expansão requerida (cerca de duas a três vezes a altura

do leito fixo) quando aplicada uma velocidade de fluxo adequada. Existe uma estreita relação

entre a altura do leito expandido e a velocidade de fluxo, a qual depende criticamente das

propriedades físicas do adsorvente e da alimentação utilizada. Além disso, as partículas do

adsorvente devem possuir faixas de diâmetro que sejam adequadas para geração de uma

expansão estável (Chase, 1994).

O comportamento fluidinâmico do leito expandido engloba três características

primordiais, o regime de escoamento, o grau de mistura e a possibilidade de existência de

camada estagnada entre o fluido e o adsorvente. Pode-se ressaltar que a Adsorção em Leito

Expandido se baseia na manutenção da fluidização estável (mais semelhante ao escoamento

plug-flow), estabelecendo um balanço entre as propriedades fluidodinâmicas entre o leito

fluidizado e as propriedades cromatográficas do leito fixo (Padilha, 2013).

Durante a operação de uma coluna em leito expandido para purificação de bioprodutos é

essencial o conhecimento do comportamento leito em função das propriedades das partículas do

adsorvente e da solução de alimentação. Esta caracterização é baseada no mensuramento do grau

de expansão em função da velocidade e viscosidade do fluido, na presença de contaminantes

como células microbianas e na distribuição das partículas do adsorvente (Moraes et al., 2013).

Uma das formas de conhecer o comportamento de um leito expandido e o seu regime de

escoamento, em função das propriedades físicas das partículas e do fluido, é por meio da

equação de Richardson-Zaki (Richardson & Zaki, 1954). Pela teoria, a velocidade terminal de

uma partícula esférica (Ut) é influenciada pelo movimento das outras (interferência

populacional), conforme Equação 3 (Padilha, 2013):

𝒖 = 𝒖𝑻 . 𝜺𝒏 Eq.3

Sendo u a velocidade superficial, ε refere-se a porosidade do leito, uT é a velocidade terminal de

uma partícula única e n o índice de expansão do leito.



Esse modelo descreve a influência da população sobre a velocidade terminal individual,

sendo fundamental para avaliar a expansão do leito quando este alcança o equilíbrio (Padilha,

2013). Os parâmetros uT e n são determinados pela linearização da Equação 3:

𝑙𝑛 𝑢 = 𝑙𝑛 𝑢𝑇 + 𝑛 . 𝑙𝑛 𝜀 Eq.4

A porosidade do leito pode ser estimada em função da altura total de expansão do leito

(Moraes et al., 2013):

𝜺 = 𝟏 − (𝟏 − 𝜺𝟎).𝑯𝟎

𝑯 Eq. 5

Onde ε0 e H0 são a porosidade e altura do leito sedimentado, respectivamente. Admite-se que ε0

tem valor igual a 0,4 (Moraes et al., 2013).

Outra informação importante a ser aferida sobre o sistema é a capacidade dinâmica de

ligação. Esta normalmente é determinada quando a concentração de proteína ou a atividade

enzimática no efluente da coluna alcança 10% da concentração ou atividade inicial (C/C0=0,1 ou

U/U0=0,1), assim há redução de perda da molécula alvo no escoamento. A capacidade dinâmica

de ligação (QB), definida como concentração de proteína ou unidade de enzima adsorvida por

massa do adsorvente, pode ser calculada de acordo com a Equação 6:

𝑸𝑩 =𝑪𝟎(𝑽𝒇−𝑽𝒎) ∫ 𝑪𝒅𝑽

𝑽𝒇𝑽𝒎

𝒎𝒂𝒅𝒔 Eq. 6

Onde C0 é a concentração de proteína (mg.mL-1

) ou a atividade enzimática inicial (U.mL-1

), Vf é

o volume final de solução de alimentação, Vm é o volume a 10% de ruptura (mL) e mads refere-se

a massa de adsorvente (g).

O ciclo de operação básico da ALE é composto pelas etapas de equilíbrio, aplicação da

amostra, lavagem, eluição e posterior limpeza da resina (Figura 3). As estratégias de otimização

de cada etapa são, em geral, semelhantes às adotadas em um processo de leito convencional

(Chase, 1994).



Figura 3: Ciclo básico de operação da ALE. As setas indicam a direção do escoamento. Fonte: Amersham

Pharmacia Biotech.

O processo de ALE também é operado de forma muito semelhante ao processo

empacotado. A principal diferença é a direção do fluxo do líquido. Uma velocidade de fluxo

mais baixa pode ser usada se a viscosidade da matéria-prima for muito alta. Isto pode prevenir

uma expansão muito elevada (Hjorth, 1997).

No início do protocolo de purificação, o adsorvente sedimentado necessita ser convertido

em um leito expandido e estável antes da aplicação da alimentação contendo material

particulado. Para isso uma solução tampão é aplicada e esta flui através do leito, inicialmente sob

um baixo fluxo e sendo gradualmente elevado até que se atinja uma altura duas vezes maior que

a inicial. Feito isso a amostra pode ser aplicada no sistema. Entretanto, as propriedades físicas da

alimentação podem ser diferentes daquelas do tampão usado na expansão inicial do leito. Como

consequência, se o fluxo não for reduzido, a extensão da expansão do leito poderá aumentar.

Após aplicação da amostra, inicia-se a etapa de lavagem (Chase, 1994).

A etapa de lavagem de um processo de leito expandido tem a dupla função de remoção de

matéria-prima mantida dentro dos espaços vazios inter e intrapartícula do adsorvente e, em

alguns casos, remoção de material fracamente adsorvido (Chase, 1994).

Depois do material não ligado ter sido lavado da resina (etapa de lavagem), o fluxo é

interrompido e deixa-se a resina sedimentar. A etapa de eluição geralmente é realizada em modo

empacotado e a uma velocidade reduzida, normalmente 100 cm.h-1

para manter baixo o volume

da fração eluída. A eluição também pode ser realizada com o leito expandido, mas tem sido

descrito um aumento de 40% no volume da fração eluida (Hjorth, 1997).



Um importante estágio na operação de um leito expandido é o procedimento de limpeza e

regeneração da resina. Este procedimento é realizado para manter a funcionalidade do

adsorvente, garantir que todas as impurezas tenham sido removidas e evitar a passagem de

contaminante entre amostras de resina. A maioria dos procedimentos de limpeza inclui a

utilização de hidróxido de sódio em concentrações de 0,5 a 1M. Este tratamento deve ser

realizado durante um período controlado de tempo (3-4 horas), para permitir que os

contaminantes sejam removidos. O hidróxido de sódio é geralmente combinado com outras

soluções, tais como 10% de ácido acético ou solventes orgânicos como etanol 20% (Hjorth,

1997).

Nos últimos anos, a ALE tem sido empregada na purificação das mais diversas

biomoléculas, das quais pode-se citar a purificação de ácido salvinólico e alcalóides (Li et al.,

2014), lactoferrina e imunoglobulina G (Du et al., 2014), ficocianina C (Moraes et al., 2013),

antígeno recombinante da Hepatite B (Ng et al., 2012) e β-galactosidade (Boeris et al., 2012).

Conforme relatado anteriormente, é comum o uso de resinas de troca iônica em leito

empacotado para purificação de quitosanases, recentemente também foi relatado o uso de resinas

de troca iônica, linha Streamline, para purificação de duas quitosanases produzidas pelo fungo

Metarhizium anisopliae (de Santana et al., 2014).

Tendo em vista o exposto, no presente estudo foi adotada a estratégia de planejamento

experimental com a realização de um Planejamento Composto Central para o estudo de uma

estratégia de purificação de uma quitosanase utilizando ALE.

3. REFERÊNCIAS

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Objetivos

Objetivos 32


4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo geral

O objetivo geral do trabalho foi isolar e selecionar novos microrganismos produtores de

quitosanases com potencial de hidrólise da quitosana além de purificar e caracterizar as enzimas

obtidas, a fim de possibilitar a obtenção de quitosanases de forma mais rentável, e

consequentemente, de quitooligossacarídeos.

4.2. Objetivos específicos

Isolar, a partir de amostras de solo, microrganismos capazes de utilizar a

quitosana como principal fonte de carbono;

Selecionar os microrganismos isolados através da avaliação do potencial

hidrolítico das enzimas por eles produzidas;

Padronizar condições de cultivo dos microrganismos selecionados com o objetivo

de melhorar a produção das enzimas quitosanolíticas;

Determinar as condições ótimas de atividade das enzimas produzidas pelos

microrganismos previamente selecionados;

Recuperar e purificar a enzima com potencial quitosonalítico;

Caracterizar a quitosanase isolada quanto à (ao):

o Massa molecular;

o Efeito do pH sobre sua atividade enzimática;

o Efeito da temperatura sobre sua atividade enzimática;

o Dependência por íons bivalentes.

Artigos derivados

da tese

Artigos 34


5. ARTIGOS DERIVADOS DA TESE

A seguir serão apresentados dois artigos derivados da tese, submetidos para periódicos na

área.

O primeiro artigo intitulado “Recovery and Purification of Chitosanase produced by

Bacillus cereus using Expanded bed adsorption (EBA) and Central Composite Design (CCD)”

foi submetido ao periódico Separation Science and Technology, e o segundo “Single-step

purification of chitosanase from Bacillus cereus using expanded bed chromatography” foi

submetido ao Journal of Cromathography B.

Recovery and Purification of Chitosanase produced by Bacillus cereus using EBA and CCD 35


Recovery and Purification of Chitosanase produced by Bacillus cereus using Expanded

Bed Adsorption (EBA) and Central Composite Design (CCD)

Nathália Kelly de Araújo*, Maria Luiza Oliveira Xavier, Vanessa Carvalho Pimentel, Carlos

Eduardo de Araújo Padilha, Nayane Macedo Portela da Silva, Gorete Ribeiro de Macedo,

Everaldo Silvino dos Santos.

*Corresponding author at: Laboratório de Engenharia Bioquímica, Departamento de Engenharia Química, Universidade

Federal do Rio Grande do Norte – UFRN/Brazil. Phone: +55 84 3215 3769 R: 214. Fax: +55 84 3215 3770. E-mail

address: [email protected] (N. K.Araújo).

Abstract

This study presents a system for EBA to purification of chitosanase from broth extract in a

single step. A chitosanase-producing strain was isolated and identified as Bacillus cereus C-

01. Statistical analyses based showed that distributor height had strong influence on the

process affecting considerably both purification factor (P) and enzyme yield (Y). The

optimization of purification variables resulted in an approximately 3.66-fold increase in P

compared with that observed under not optimized conditions. This system is promising for

recovery of chitosanase from B. cereus C-01 and it is economically viability since it promotes

the reduction steps.

Keywords: Biocatalysis; Enzyme Activity; Chitosanase; Bioseparations; Chromatography;

Expanded bed adsorption.



INTRODUCTION

Derived from the hydrolysis of Chitosan, the Chitooligosaccharides (COS) have

several biofunctional properties, including anti-inflammatory [1], prebiotic [2], antimicrobial

[3], antitumor [4, 5], and immunopotentiating effects [6]. Thereby, the nutraceutical and

medical industries have been given special attention to production of chitooligosaccharides

from chitosan [7].

The depolymerization of chitosan is mainly conducted using acid hydrolysis and

enzymatic degradation. The acid hydrolysis is not usually employed due to the complexity of

control of the reaction. Moreover the use of acid promotes in the formation of secondary

compounds that are elimination difficult [8]. Enzymes exhibit high specificity and operate

under mild conditions. Additionally, the use of enzymes allows control of reaction and

product formation by adjusting the concentration of the enzyme, pH, temperature and

reaction time. Thus, enzyme technology probably is the most promising approach [9]. Several

enzymes can hydrolyze the chitosan; in this process are employed specific (chitosanases) and

non-specific enzymes (carbohydrases, proteases, lipases etc.) [10].

For applications requiring high purity (use in therapy and diagnosis), enzyme

purification may be necessary. The chromatography process conventional to remove product

and impurities are usually designed with steps of clarification, precipitation with salts and a

series of capture and polishing [11]. Expanded bed adsorption (EBA) is an integrated process

which combines solid-liquid separation, volume reduction by protein adsorption and

recovering the product in a single unit operation [11, 12]. This technique has been

successfully employed to biomolecules purification [13-16].

Optimization of the purification process can be performed using experimental design.

The estimate of the influential variables during the adsorption process can be determined by

correct selection of design and optimization models. The experimental design methodology

can be used to determine the effects of individual factors and their interactions [17]. Box and

Wilson developed a technique named is Central composite design (CCD) which use response

surface methodology. An advantage of CCD is the reduction of number of experiments in the

studies with a wide number of factors and levels [18]. Furthermore, by use of response

surface methodology (RSM), the main and interaction effects of variables can be explored

and optimal value of each variable can be definite [19].

The present study attempted to optimize the process of chitosanase purification by

EBA using a CCD with attention to both the purification factor (P) parameters as well as



enzyme yield (Y). A batch shake-flask culture of Bacillus cereus was used to enzyme

production.

MATERIALS AND METHODS

Materials

Chitosan (85 % deacetylated; molecular weight, 90–190 kDa) acquired from Sigma-

Aldrich Co. (St. Louis, Missouri, USA) was solubilized using 0.1 M HCl [20]. Streamline

DEAE resin was purchased from GE healthcare (Uppsala, Sweden). PC33 Siemens Kit was

provided by Maria Alice Hospital, Natal/Brazil. Buffer solutions and other chemicals were

reagent grade.

Isolation and identification of chitosanolytic bacterium

The microorganism was isolated from soil samples (Natal/Brazil, S 05º52’11’’, Wo

35º13’08.4’’). Serially diluted soil samples were inoculated on plates containing peptone (6.0

gL-1

), chitosan (2.0 gL-1

), Magnesium sulfate (0.5 gL-1

), Potassium dibasic phosphate (1.0 gL-

1) (basic medium) and agar (15 gL

-1) and incubated at 30 ºC for 2 days. A single colony

showing prominent chitosanolytic activity was selected and subjected to taxonomic analysis,

Gram-staining and pathogenicity test with PC33 Siemens Kit. To further identify the

bacterium, polymerase chain reaction (PCR) was performed to amplify part of the bacterial

16S rRNA gene. The forward and reverse primers were 27F (5’-AGA GTT TGA TCC TGG

CTC AG-3’) and 1525R (5’-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3’), respectively. The PCR

products were analyzed by electrophoresis on agarose gel and after they were purified,

quantified and used in sequencing reaction. Four sequencing reactions were performed for

each sample using the primers 518F (5’-CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG-3’), 800R

(5’-TAC CAG GGT ATC TAA TCC-3’) and 1492R (5’-TAC GGY TAC CTT GTTA

CGA CTT-3’). The nucleotide sequence of the 16S rRNA gene of C-01 was determined by

an ABI 3730 DNA Sequencer (Applied Biosystems, USA) and compared with published 16S

rRNA sequences in a NCBI BLAST search.

Chitosanase production

The cells from the stock cultures were transferred to 50 mL aliquots of pre-cultivation

medium dispensed into 250 mL Erlenmeyer flasks, then incubated at 120 rpm for 30 h at 30

ºC. The pre-cultivation medium consisted of (g.L−1

): peptone 6.0, chitosan 2.0, Magnesium

sulfate 0.5 and Potassium dibasic phosphate 1.0. This was then aseptically inoculated at a

level of 10% (v/v) into a 250 mL Erlenmeyer flask containing 50 mL of same medium. The



flasks were then placed on a rotary shaker at 120 rpm for 24 h at 30 ºC (Tecnal, TE421).

Samples of this cultivation were used for purification assay.

Analytical methods

The chitosanase activity of the crude enzyme and chromatography samples were

measured via the incubation of 250 μL of enzyme sample with 250 μL of 1% chitosan

solution (pH 6.0). The mixture was heated in a water bath for 30 minutes, at a temperature

adjusted to 55 ºC. The reaction was interrupted by boiling for 10 minutes [20]. The

formation of reducing sugars was analyzed in spectrophotometer (Thermo Spectronic) using

the 3,5-Dinitrosalicylic acid method, using D-glucosamine as standard [21]. A unit (U) of

chitosanase was defined as the amount of enzyme capable of generating 1 µmol of D-

glucosamine per minute under the conditions above described.

The protein content was determined using the Bicinchoninic Acid method with a BCA

Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL) and Bovine Serum Albumin (BSA) as standard.

Experimental Designs

The optimization strategy that was used is based on the concept of simultaneous

variation of possible influencing factors (independent variable) on the quality criteria

(dependent variable) of the system considered. This strategy was used to evaluate the

influence of three factors on the enzyme purification. Dependents variable were defined on

the quality criteria purification factor (P) and enzyme yield (Y) to optimize the

chromatographic process:

𝑃 =𝑆𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑐 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑦 𝑜𝑓 𝑡ℎ𝑒 𝑝𝑢𝑟𝑖𝑓𝑖𝑒𝑑 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒

𝑆𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑐 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑦 𝑜𝑓 𝑡ℎ𝑒 𝑐𝑟𝑢𝑑𝑒 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 Eq.1

𝑌(%) =𝐸𝑛𝑧𝑦𝑚𝑎𝑡𝑖𝑐 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑦 𝑜𝑓 𝑡ℎ𝑒 𝑝𝑢𝑟𝑖𝑓𝑖𝑒𝑑 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒

𝐸𝑛𝑧𝑦𝑚𝑎𝑡𝑖𝑐 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑦 𝑜𝑓 𝑡ℎ𝑒 𝑐𝑟𝑢𝑑𝑒 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 Eq.2

A CCD was employed to examine the combined and individual effect of three

independent variables for chitosanase purification. The CCD is usually characterized by three

operations: 2k axial runs, 2k factorial runs and central point runs [19]. The number of

experiments (N), represented by Equation 3, depends on how many factors (k) are in the

CCD:

N=2k + 2k + central points Eq. 3

The CCD in this study was designed based in 6 axial points, 8 factorial points and 3

replicates at the center. Initially, it was constructed the factorial and central parts, followed by

the axial one. The quantitative factors were load flow velocity (X1), settled bed height (X2)



and distributor height (X3) utilized as independent variables for the CCD. The experimental

design with coded and uncoded values is presented in Table 1.

Table 1: Matrix of CCD to coded and uncoded level of independent variables.

Variables

Levels

-α -1 0 +1 +α

Load flow velocity (cm/h) 66 100 150 200 234

Settled bed height (cm) 2.64 4.0 6.0 8.0 9.36

Distributor height (cm) 0.64 2.0 4.0 6.0 7.36

From a second-order polynomial equation is possible to explain the behavior of each

variable, their interactions, and statistical analysis and acquire predicted responses [7]. The

following second-order polynomial Equation was used:

Y = b0 + ∑ bixi + ∑bijxixj + ∑biix2

i Eq.4

Where Y is the predicted response, b0 is the model constant, bi is the linear

coefficients, bii are the quadratic coefficients and bij is the interaction coefficients. Xi

represents the independent variables (known for each run). The experimental design analysis

and their subsequent regression analysis were evaluated using STATISTICA 7.0 (StatSoft,

USA). The analysis of variance (ANOVA) was also carried out. The p-values less than 0.05

(p <0.05) were considered statistically significant.

The optimized conditions from statistical model were validated and the chitosanase

purification was evaluated. The validation assay was conducted with 150 cm.h-1

load flow

velocity, 6.0 cm settled bed height and 7.36 cm distributor height. The samples were

withdrawn at appropriate intervals, which were subjected to further analysis in terms of

chitosanase activity and protein concentration.

Operation of EBA

The ligand Diethylaminoethyl (DEAE) of the streamline ion exchanger (GE

Healthcare, Uppsala, Sweden) was applied to EBA chromatography. This resin is a weak

anionic exchanger. A homemade EBA glass column (2.6 cm x 30.0 cm) was used. A different

amount of glass microspheres was added to work as a distributor, i.e., to enhance fluid

distribution at the column inlet. The peristaltic pump was used to transport the fluid (model

Perimax 12, Spetec). The correct column vertical alignment was guaranteed in all assays. All

experiments were performed at the room temperature.

Runs were conducted without clarification. The column with different settled-bed

height of resins was equilibrated with a 50mM Tris-HCl pH 8.5 buffer (buffer A) to give a

stable height, where H/H0=1.5. The broth was then loaded (flow-through step) onto this



column at the superficial velocity required according to Table 1, following the washing with

buffer A (150 mL). The elution was performed by step-wise gradient mode with 50 mM Tris-

HCl pH 8.5 buffer containing 0.3 M (buffer B), 0.7 M (buffer C), and 1 M (buffer D) NaCl.

Both washing and elution were conducted at the superficial velocity of 100 cm.h−1

. In all

purification steps, several fractions were collected for protein quantification and enzyme

assay.

RESULTS AND DISCUSSION

Identification of chitosanase-producing strain

The microorganism was isolated from soil samples using procedure described in

section 2.2. Among over 15 strains were isolated in the laboratory and screened for

chitosanase activity, the Bacillus C-01 strain was selected for further study. This strain

showed the highest chitosanase activity. Strain C-01 is a gram-positive, which grows in both

aerobic and anaerobic environments. The culture showed colonies with rounded, irregular

border, average size of 4 mm and white coloring. According to the results of 16S rDNA

partial nucleotide sequence analysis, strain C-01 was identified as B. cereus.

CCD and Model fitting

As observed with EBA systems, several factors have to be considered for the

optimization of protein purification. Such as, load flow velocity, settled bed height and

distributor height [22, 23]. The chitosanase purification was optimized using statistical

experimental design involving three variables, namely load flow velocity (X1,) settled bed

height (X2) and distributor height (X3), at five levels. Table 2 presents the Central Composite

design variables (coded levels) and effect estimates for screening of factors affecting P and Y.

The best values of the P were obtained on the assay 17 and 14. In other assays, it can

be observed low values purification factor. This fact can be related to the strong interaction of

biomass with the resin. Similar results were also observed by [24], whereby the purification

factor varied in function of feedstock. The performance of many direct-contact methods for

downstream processing of bioproducts can be affected by biomass adhesion or interaction.

Biological feedstock can also severely affect this process by particles co-adhesion or

aggregation [25].



Table 2. Central Composite design variables (coded factor and levels) and effect estimates for screening of

factors affecting purification factor (P) and enzyme yield (Y).

Coded Variable levels

Run number. X1 X2 X3 P Y

1 -1 -1 -1 1.18 45.12

2 +1 -1 -1 0.51 17.03

3 -1 +1 -1 0.92 43.47

4 +1 +1 -1 0.90 39.67

5 -1 -1 +1 1.24 46.92

6 +1 -1 +1 1.27 47.27

7 -1 +1 +1 0.64 27.26

8 +1 +1 +1 0.74 29.99

9 (C) 0 0 0 0.54 22.44

10 (C) 0 0 0 0.53 21.35

11 (C) 0 0 0 0.59 23.26

12 -α 0 0 0.89 39.61

13 +α 0 0 1.01 22.61

14 0 -α 0 1.40 35.40

15 0 +α 0 0.85 28.63

16 0 0 -α 1.10 31.79

17 0 0 +α 1.43 34.79

Effect estimates I*

-0.05(L)

0.18(Q)

-0.28(L)

0.31(Q)

0.13(L)

0.39(Q)

Effect estimates II**

-8.40(L)

8.12(Q)

-4.00(L)

8.76(Q)

1.64(L)

9.67(Q)

X1, load flow velocity (cm.h-1); X2, settled bed height (cm); X3, distributor height (cm); P, purification factor; Y, enzyme yield (%); *Effect

estimates I, for purification factor; **Effect estimates II for enzyme yield. (C): center point.



As can be observed in Table 2, intermediary conditions do not improve either P or Y.

Even though all factors play role in both P and Y it can be seen that Distributor Height (X3)

and its interaction with other factors were the most important. The main effects of variables

on P and Y are also shown in Table 2. On the basis of statistical analysis for quadric model,

the variables evidencing the most significant effects on P and Y were settled bed height and

distributor height as well as their interactions.

Analysis of variance (ANOVA)

Table 3 presents the results of the analysis of variance (ANOVA). The variables with

confidence levels exceeding 95% (p < 0 .05) were considered to be significant. The goodness

of model fit was checked by the determination coefficient (R2). The ANOVA of regression

model demonstrated that the R2 to P and Y were 0.835 and 0.9147, respectively, thus

indicating that about 90% of the variability in the response could explained by the model. The

value of the adjusted determination coefficient (Adj. R2 = 0.623 for P and 0.805 for Y) is also

acceptable, which indicates a high significance of the model.

Table 3: Analysis of variance (ANOVA) for central composite design of purification factor and enzyme

yield.

Variable Adj R2 (%) R

2 (%) Fcal Ftab Fcal/Ftab

Purification Factor (P) 62.3 83.5 4.171 3.68 1.13

Enzyme Yield (Y) 80.5 91.4 48.02 3.68 13

By ANOVA and regression coefficients can be deduced that the quadratic model

showed high adequacy for the explanation of adsorption behavior. For purification factor, the

most influential variables were the X3 (Q) (p value 0.001977), X2 (L) (p value 0.003015) and

X2 (Q) (p value 0.003052). The interaction X2X3 also presents strong influence about P.

For Y, the most influential variables were the interaction X2X3 (p value 0.002195), X3

(Q) (p value 0.003483) and X1 (L) (p value 0.003805).

By regression analysis of CCD, it was possible to obtain the following Equation for P

and Y:

YP= 0.570 -0.027X1 +0.091X12 – 0.144X2 + 0.158X2

2 + 0.064X3 + 0.196X3

2 + 0.090X1X2 +

0.120X1X3 – 0.159X2X3 Eq.5

YR= 22.073 – 4.203X1 + 4.064X12 – 2.00X2 + 4.384X2

2 + 0.820X3 + 4.836X3

2 + 3.333X1X2 +

4.371X1X3 – 7.24X2X3 Eq. 6



Where YP is the response for purification factor and YR is the response for enzyme

yield. X1, X2 and X3 are the coded values of the test variables (load flow velocity, settled bed

height and distributor height, respectively).

By F test can be seen that the proposed models (Equations 5 and 6) are statistically

significant. As for P, Fcal value was 1.3 times greater than Ftab. Already for the Y, the

observed difference was much higher: 13 times larger than Ftab (Table 3).

Response surface methodology (RSM)

CCD, Box-Behnken design and three-level factorial design are classes of RSM and

have different characteristics. Among the most popular techniques, the CCD allows

optimization and estimation of the main and interaction of variables with least number of

experiments [19].

Figure 1 shows the response surface and contour plots for variation in P and Y versus

significant variables. The surface plots confirm that the interactions between the independent

variables have a strong effect on response variables. The combined decrease in load flow

velocity and settled bed height contribute to the increase of P (Figure 1a). The load flow

velocity and distributor height need to be at the same level to improve the purity. High values

of speed and distribution height combined increase the purity as well as low values of speed

combined with low values of distributor height also raise the purity (Figure 1b). While an

increase in distributor height of the combined with a decrease in settled bed height

contributes to the increase in purity (Figure 1c).

The decrease in load flow velocity leads to significant increase in Y (Figures 2d and

2e). Whereas that increase in distributor height and settled bed height lead to significant

increase in Y (Figures 1e and 1f).



Figure 1: Response surfaces for 23 central composite designs (a) X1 – X2 (purification factor); (b) X1 – X3

(purification factor); (c) X2 – X3 (purification factor); (d) X1 – X2 (Enzyme yield); (e) X1 – X3 (Enzyme yield);

(f) X2 – X3 (Enzyme yield). X1, load flow velocity; X2, settled bed height; X3, distributor height. Other

variables, except for two variables in each figure, were maintained at zero in coded units.

In this study the parameters settled bed height and distributor height show different

behaviors. We believe that biomass, resin and distributor interaction is so strong that

determine the effect on the response variable. The influence of biomass on the hydrodynamic

stability of expanded beds has been demonstrated by several researches [22, 24, 26]. The

distributor has a great action on the flow structure [23]. For responses Y the distributor height

has a positive effect. When the distributor height is increased, there is less back-mixing

effect. The flow is more homogeneous, and it promotes the adsorption. A smaller mixture

favors the plug-flow. Therefore, it can be conclude that the optimum conditions are far from

the central point, as can be seen in Figure 1.

To check the normality assumption in fitted model, It was plotted the predicted versus

the observed for P and Y (Figure 2). The figures exhibit linear relationship between predicted

and observed. The measured response was really close to the predicted.



Figure 2: The experimental data versus the predicted data of normalized of purification factor (a) and enzyme

yield (b).

Test of the model

Validation experiments were conducted to ensure the adjustment of the model for

chitosanase purification. This assay was carried out under following conditions: load flow

velocity 150 cm.h-1

, 6.0 cm of settled bed height and 7.36 cm distributor height. Figure 3

shows the chromatogram for chitosanse purification. The elution step was carried out with the

NaCl gradient. In the first increase in ionic strength, a peak of enzyme activity and protein

concentration was obtained.



Figure 3: Chromatographic profile of crude extract from Bacillus cereus in streamline DEAE ion exchange

column. The column was previously equilibrated with 50 mM Tris-HCl, pH 8.5 (Buffer A) and the sample was

eluted from column with 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.5 containing 0.3, 0.7 and 1.0M NaCl (Step wise).

The validation experiment with three replicates resulted in an average P of 1.46 (±

0.12), while the P predicted for this assay by the regression model was 1.23. Under not

optimized conditions (central point), the P mean was 0.55 (± 0.032) therefore the

optimization resulted in an approximately 2.65-fold increase. The average Y for validation

experiment was 34% (± 1.6), the predicted value of Y by the regression model was 37%. The

average Y in central point was 22.5 (± 0.96), what indicates 1.65-fold increase.

This study was generally consistent with the results to packed purification of another

chitosanases that were reported to a final yield of 23.6% [27], 30% [28] and 17.1% [29]. To

applications on unpacked bed purifications, these results are similar to those found in the

purification of a C-phycocyanin [14], an E. coli-Based therapeutics [18] and β-galactosidase

[30]. It is important to highlight that the procedure used here has just one-step, and can be

coupled to another EBA procedure such as cationic as well as hydrophobic interaction.

CONCLUSION

In the present study a CCD was used to optimize the application of the EBA, based on

anionic exchange, to recover as well as to purify a chitosanase from Bacillus cereus. This



statistical experimental approach confirmed to be effective for the optimization of

chitosanase purification. CCD analyses showed that the optimum conditions for maximum P

were 150 cm.h-1

(load flow velocity), 6.0 cm for the settled bed height and 7.36 cm for the

distributor height. The validation experiments proved that optimum conditions enhance the

purification factor and also evidenced a good applicability of model. This study provides

knowledge about hydrodynamics as well as biomass interaction in the purification protocol of

biomolecules by EBA. Furthermore, the system is promising for recovery of chitosanase from

B. cereus C-01 and it is economically viability since it promotes the reduction steps.

Acknowledgements

The authors thank the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior and

the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico for financial support.

Conflicts of Interest

The authors declare no conflict of interest.

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mode of a chitosanase from Streptomyces roseolus induced by chitin, Carbohydrate research,

355 (2012) 40-44.

[29] S.K. Hsu, Y.C. Chung, C.T. Chang, H.Y. Sung, Purification and characterization of two

chitosanase isoforms from the sheaths of bamboo shoots, Journal of agricultural and food

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[30] V. Boeris, I. Balce, R.R. Vennapusa, M. Arevalo Rodriguez, G. Pico, M.F. Lahore,

Production, recovery and purification of a recombinant beta-galactosidase by expanded bed

anion exchange adsorption, Journal of chromatography. B, Analytical technologies in the

biomedical and life sciences, 900 (2012) 32-37.



Single-step purification of chitosanase from Bacillus cereus using expanded bed

chromatography

Nathália Kelly de Araújoa,*

, Maria Giovana Binder Pagnoncellib, Vanessa Carvalho Pimentel

a, Maria Luiza Oliveira

Xaviera, Carlos Eduardo Araújo Padilha

a, Gorete Ribeiro de Macedo

a, Everaldo Silvino dos Santos

a

aLaboratório de Engenharia Bioquímica, Departamento de Engenharia Química, Universidade Federal do Rio Grande do Norte

– UFRN/Brazil

bLaboratório de Bromatologia, Departamento de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN/Brazil.

*Corresponding author at: Laboratório de Engenharia Bioquímica, Departamento de Engenharia Química, Universidade

Federal do Rio Grande do Norte – UFRN/Brazil. Phone: +55 84 3215 3769 R: 214. Fax: +55 84 3215 3770. E-mail address:

[email protected] (N. K.Araújo).

Abstract

A chitosanase-producing strain was isolated and identified as Bacillus cereus C-01.The

purification and characterization of the chitosanase were studied. An ion exchange expanded-bed

chromatography was used for the purification of the chitosanase. Experiments were carried out in

the presence and in the absence of cells through different expansion degree to evaluate the

process performance. The adsorption experiments demonstrated that the biomass does not affect

substantially the adsorption capacity of the matrix. The enzyme bound to the resin with the same

extent using clarified and unclarified broth (0.32 and 0.30 U/g adsorbent, respectively). The

fraction recovered after the elution exhibited 31% of the yield with a 3.6-fold increased specific

activity concerned to the initial broth. The fraction eluted with 0.3 M NaCl achieved a

purification factor of 1.75. The purified chitosanase showed stability at 30 - 60 ºC, pH 5.5 – 8.0

with the highest activity at 55 ºC, pH 5.5. The ions Cu+2

, Fe+2

and Zn+2

indicated inhibitory effect

for chitosanase. In contrast, the enzyme was significantly activated by Mn2+

.The methodology

applied in this study enables the partially purification of a stable chitosanase using a feedstock

without any pre-treatment in a single-step purification.

Keywords: Chitosan; Chitosanase; Bacillus cereus; Bioseparation; Ion exchange; Expanded Bed

Adsorption.



INTRODUCTION

Chitosan, a natural cationic polysaccharide, is produced by the deacetylation of chitin.

The chitosan molecule has shown various properties such as functional, renewable, nontoxic and

biodegradable biopolymer. In recent years, chitosan has been used as artificial skin, absorbable

surgical suture, wound healing accelerator and also as chitoligosaccharides (COS) source [1].

The oligosaccharides from chitosan have many biological properties such as: antitumor [2, 3],

immunoenhancing [1], antibacterial [4, 5], antidiabetic [6] and hypocholesterolemic [7]. These

functions are dependent of oligosaccharide chemical structure and molecular size [1, 8].

The COS are obtained mainly using chemical and/or enzymatic hydrolysis [8]. Enzymes

are highly specific and act under mild conditions. Moreover, the use of enzymes allows reaction

control and the product formation by adjusting concentration, pH, temperature and reaction time

[9]. Thus, the enzymatic hydrolysis method has been proposed as a preferred for producing

bioactive COS [10].

Chitosanases have previously been produced by a number of organisms, including fungi

[2, 11], plants [12], and bacteria [13, 14]. The chitosanases produced by Bacillus cereus are

currently investigated by several studies [15-20]. The process to purification of these enzymes

normally involves ammonium sulfate precipitation, gel filtration and packed ion exchange

chromatography [16, 21-23]. These traditional methods imply in a large number of steps,

extensive work time and scale up difficulties. Alternatively, the Expanded Bed Adsorption

(EBA) combines separation, concentration and capture of the target protein. This competitive

biotechnological process has been proposed as a single-unit operation [24]. EBA allows the

capture target proteins from feedstock without any pre-clarification steps, which is helpful to

industrial processes since it contributes to reduction of time and costs [25].

The aim of this present study was to evaluate chitosanase purification using an economic

and a fast chromatographic method. Initially, the adsorption behaviour of chitosanase onto

Streamline-DEAE as well as biomass influence were either determined. After, a purification

protocol was carried out in order to recover and purify the chitosanase.



MATERIALS AND METHODS

Materials

Chitosan (85% deacetylated; molecular weight: 90–190 kDa) acquired from Sigma-

Aldrich Co. (Saint Louis, USA) was solubilized using 0.1 M HCl [14]. Streamline DEAE resin

was purchased from GE healthcare (Uppsala, Sweden). BCA Protein Assay Kit was acquired

from Pierce (Rockford, USA).PC33 Siemens Kit was provided by Maria Alice Hospital,

Natal/Brazil. Buffer solutions and other chemicals were reagent grade and were used as supplied.

Isolation and identification of chitosanolytic bacterium

The microorganism was isolated from soil samples (Natal/Brazil S 05º52’11’’, Wo

35º13’08.4’’). Serially dilutions from soil samples were inoculated on plates containing peptone

(6.0 gL-1

), chitosan (2.0 gL-1

), magnesium sulfate (0.5 gL-1

), potassium dibasic phosphate (1.0

gL-1

) and agar (15 gL-1

) and incubated at 30 ºC for 2 days. A single colony showing prominent

chitosanolytic activity was selected and subjected to morphological analyses, Gram-staining and

pathogenicity test with PC33 Siemens Kit. Polymerase chain reaction (PCR) was performed to

amplify part of the bacterial 16S rRNA gene to additional microbial identification. The forward

and reverse primers were 27F (5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’) and 1525R (5’-AAG

GAG GTG ATC CAG CC-3’), respectively. The PCR products were analysed by electrophoresis

on agarose gel. Subsequently, they were purified, quantified and used in sequencing reaction.

Four sequencing reactions were run for each sample using the primers 518F (5’-CCA GCA

GCC GCG GTA ATA CG-3’), 800R (5’-TAC CAG GGT ATC TAA TCC-3’) and 1492R

(5’-TAC GGY TAC CTT GTTA CGA CTT-3’). The nucleotide sequence of the 16S rRNA gene

of C-1 was determined by an ABI 3730 DNA Sequencer (Applied Biosystems, USA) and

compared to16S rRNA sequences in a NCBI BLAST search.

Chitosanase production

Cells from the stock cultures were transferred to 50 mL aliquots of medium and

dispensed into 250 mL Erlenmeyer flasks for the investigation of chitosanase production.

Subsequently, they were incubated at 120 rpm for 72 h at 30 ºC. The cultivation medium

consisted of (g.L−1

): peptone 6.0, chitosan 2.0, magnesium sulfate 0.5 and potassium dibasic

phosphate 1.0. During cultivation, the culture broth was collected to measurement of chitosanase

activity and protein content. Cell growth was monitored by extraction and quantification of total

DNA content. The pellet of 3 mL of culture was used for DNA extraction using Sodium Dodecyl



Sulfate (SDS) and phenol/chloroform/isoamyl alcohol [26]. The culture broth was used for

further purification by using Expanded Bed Adsorption (EBA).

Hydrodynamic of the bed

The expansion characteristic of the bed was investigated with an initial settled bed height

of 6.0 cm at 25 ºC. The bed expansion height was visually checked as a function of incrementing

velocity ranging from 30 to 200 cm.h-1

. The expansion degree to each velocity was registered

and expressed as the ratio of the height of the expanded (H) to the settled (H0) bed adsorbent.

The flow rate was kept constant for 10 minutes in each step before the estimation of the bed

height to ensure bed stabilization. The experiments were carried out using culture broth with

cells and without cells. The cells were removed by centrifugation for 20 minutes (4 ºC, 3000

rpm).

The empirical correlation of Richardson-Zaki [27] was applied to define the bed

expansion characteristics:

𝑢 = 𝑢𝑇 . 𝜀𝑛 Eq.1

u is the superficial velocity, ε is the bed porosity, uT is the terminal velocity in infinite medium

and n is the exponent of Richardson-Zaki which expresses the flow regime. The settled bed

voidage was considered to have a value of 0.4 according to [28]. All experiments were carried

out in triplicate.

Operation of EBA

The purification assays were developed using EBA methodology. The streamline anionic

exchanger resin containing the ligand Diethylaminoethyl (DEAE) and a homemade EBA column

(2.6 cm x 30.0 cm) were used to EBA chromatography. Glass microspheres were added to

enhance fluid distribution at the column inlet. The fluid was transported using a peristaltic pump

(model Perimax 12, Spetec). The vertical alignment of the column was guaranteed in all assays.

All experiments were performed at room temperature.

The column with 6.0 cm settled-bed height of resin was equilibrated with 50 mM Tris-

HCl pH 8.5 buffer (buffer A) to give a stable expansion degree of H/H0=1.5. The culture broth

was then loaded (flow-through step) onto column at 150 cm.h-1

superficial velocity. After, the

bed was washed with buffer A (150mL). The elution was carried out by step-wise gradient mode

with 50mM Tris-HCl pH 8.5 buffer containing 0.3 M (buffer B), 0.7 M (buffer C), and 1 M

(buffer D) NaCl. The both steps, washing and elution, were conducted at the superficial velocity



of 100 cm.h−1

. In all purification steps, several fractions were collected for protein quantification,

enzyme assay and electrophoresis.

Dynamic binding capacity

The adsorption performance of the expanded bed was studied in an EBA column loaded

with streamline DEAE to a settled bed height of 6.0 cm. The effect of microbial cells on the

breakthrough curves behaviour was studied. The bed was expanded to an expansion degree of

2.0 with buffer A at a superficial velocity of 150 cm.h-1

. Subsequently, the unclarified and

clarified feedstock were loaded. For clarified feedstock, the centrifugation was conducted for 20

minutes (4 ºC, 3000 rpm). Then the protein fractions were collected and assayed for protein

concentration and chitosanase activity. The dynamic binding capacity of the bed was checked

when the enzymatic activity in the column effluent reached 10% of the initial activity (U/U0 =

0.1). This methodology was accomplished to avoid the loss of the target product in the flow-

through.

The dynamic binding capacity, QB (U of enzyme absorbed per gram of settled adsorbent)

was calculated as follows:

𝑄𝐵 =𝑈0 (𝑉𝑓 − 𝑉𝑚)− ∫ 𝐶𝑑𝑉

𝑉𝑓𝑉𝑚

𝑚𝑎𝑑𝑠 Eq.2

U0 is the initial enzymatic activity (U.mL-1

), Vf is the final volume of the feed solution (mL), Vm

is the volume at 10% breakthrough (mL) and mads is the adsorbent mass (g).

Three additional experiments at superficial velocity of 100, 150 and 200 cm.h-

1(expansion degree of 1.2, 1.5 and 2.0, respectively) were performed using unclarified broth to

estimate the effect of the expansion degree in the chitosanase breakthrough behaviour.

Effect of pH and temperature on the enzyme activity

The optimum pH for purified chitosanase was studied by using soluble chitosan as

substrate with different pH values (3.0 – 10.0). For pH stability profile, the samples were

dialyzed against a 50mM buffer solution at various pH values (3.0 – 10.0) for 24 hours at 4 ºC.

The buffer systems were glycine-HCl (pH 3), acetate (pH 4.0 – 5.0), phosphate (pH 6.0 – 8.0)

and bicarbonate-carbonate (pH 9.0 – 10.0). After dialysis, the enzyme activity was determined

by the measurement of the residual activity at pH 6.0. The optimum temperature for the purified

chitosanase was determined by the enzymatic activity in different temperatures (30 to 80 ºC).The



stability profile was determined after pre-incubation of the samples for 60 minutes at various

temperatures (30 to 80 ºC) and then the residual activity was measured.

Effect of various chemicals and surfactants on the enzyme activity

The action of various chemical agents on chitosanolytic activity of purified enzyme was

investigated. The enzymes samples were pre-incubated with 5mM ions (Mg2+

, Cu2+

, Fe2+

, Ca2+

,

Zn2+

, Mn2+

and Ba2+

) in phosphate buffer 50 mM (pH7.0) at 4 ºC during 2 hours followed by

measurement of residual chitosanolytic activity. The enzyme sample incubated with buffer was

used as control.

Analytical methods

The chitosanase activity of the crude enzyme and chromatography samples were

measured by using 250 μL of enzyme sample incubated with 250 μL of 1% soluble chitosan (pH

6.0). The mixture was heated in a water bath for 30 minutes and the temperature was adjusted to

55 ºC. The reaction was interrupted by boiling the samples for 10 minutes [14]. The reducing

sugars were assayed in spectrophotometer (Thermo Spectronic) by the 3,5-Dinitrosalicylic acid

method, using D-glucosamine as standard [29]. A unit (U) of chitosanase was defined as the

amount of enzyme capable of generating 1.0 µmol of D-glucosamine per minute under the

conditions described above.

The protein content was determined using the Bicinchoninic Acid method with a BCA

Protein Assay Kit and Bovine Serum Albumin (BSA) as standard.

Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and zymogram

analysis

After the ion-exchange adsorption, the selected samples were subjected to electrophoresis

on a 12% polyacrylamide gel in the presence of SDS in order to estimate the purity of protein.

This samples were heat treated at 100 ºC for 5 minutes in according to the methodology

described by Laemmli [30]. Twenty microliters of each sample and the protein standards were

applied to the gel. Different protein standards were used: phosphorylase b (97 kDa), BSA (66

kDa), ovalbumin (45 kDa), carbonic anhydrase (30 kDa), soybean trypsin inhibitor (20.1 kDa),

and α-lactalbumin (14.4 kDa) (Bio-Rad Co., Richmond, EUA). After electrophoresis, the protein

bands on the gel were visualized by silver staining.

The protein samples were mixed with loading buffer without reducing agent and heating

for the zymogram analysis of chitosanase. In this case, electrophoresis were performed in a 12%



SDS–PAGE containing 0.1% chitosan and then placed on ice. After electrophoresis, the gel was

incubated in 50 mM sodium acetate buffer, pH 5.5, at 50 ºC for 1 h. The chitosanase activity on

the gel was visualised by staining the gel with 0.1% Congo Red dye, followed by de-staining

with 1.0 M NaCl [31].

RESULTS AND DISCUSSION

Identification of chitosanase-producing strain

Bacillus cereus C-01, a chitosanase-producing strain, was isolated from soil samples in

Natal/Brazil (S 05º52’11’’, Wo 35º13’08.4’’). The Bacillus C-01 strain showed the highest

chitosanase activity from 15 another strains isolated. This strain did not show positivity for any

microorganisms identified by PC33 Siemens Kit. The C-01 was selected and then maintained on

nutrient agar. This material was used throughout the study.

Strain C-01 is a gram-positive and grows in both aerobic and anaerobic environments.

The culture showed colonies with rounded, irregular border, average size of 4 mm and white

colour. According to the results of 16S rDNA nucleotide sequence (approximately 1.5kbp), the

strain C-01 showed identity with two strains exhibiting 100% similarity (Bacillus cereus and

Bacillus thuringiensis). Several works have showed difficulties to distinguish strains of B. cereus

and B. thuringiensis and have suggested that the two strains are considered as a single species

[32-36]. Therefore, the isolate was identified as B. cereus.

Production of chitosanase from Bacillus cereus C-01

The chitosanase activity was measured in the supernatant of strain B. cereus C-01 during

various cultivation times. After 12 hours of adaptation phase, exponential increase of protein

content and enzymatic activity was observed (Figure 1). The B. cereus C-01 started to secrete

significant levels of extracellular chitosanase at 6 hours and the maximal production achieved up

to 0.8 U/mL at 36 hours of cultivation (Figure 1). Thereafter, the chitosanase activity decreased

remarkably. This behaviour can be possibly be explained by the presence of the protease activity

in the medium and by the decline in the growth of microorganism. The production of enzymes

was closely related to the cell growth (noted by the increase in DNA concentration), i.e., the

product is growth-associated that is typical of a primary metabolism product. From Figure 1, it

also can be notice that the microorganism is in exponential growth phase between 8 and 30 hours



of the experiment. Results show in Figure 1 indicates that the production of chitosanase is cell-

growth dependent and B. cereus C-01 is a promising chitosanase producer.

Figure 1: Time-course of cell growth, chitosanase activity and protein content. C-01 was grown aerobically in broth

medium at 30 ºC for 72 hours: (■) Chitosanase activity, (○) total protein, (●) pH and (□) DNA content.

Other studies using Bacillus cereus for the production of chitosanase and chitinase also

reported maximum yield of enzyme after the first day of cultivation. The relationship between

chitosanase activity and cell growth was verified as well [16, 22, 37].

Hydrodynamic of the bed

Clarified and unclarified culture broths were used in order to obtain the characteristics of

the bed expansion (Figure 2). The Richard-Zaki equation was applied to determine the

hydrodynamic stability of the adsorbent bed during expansion (fluidization). The expansion

indexes were 4.76 and 4.03. The terminal velocities were 893.36 cm.h-1

and 807.70 cm.h-1

for

clarified and unclarified culture broth, respectively. A decrease in the value of terminal settling

velocity was motivated by an increase in the viscosity of the mobile phase. These results are in

agreement with other studies reported in literature [38, 39].

Some variables have influence on the expansion degree of the bed: liquid superficial

velocity, density of adsorbent particles and viscosity of feedstock [40]. The bed expansion

increases linearly with the superficial velocity. At a constant superficial velocity of 200 cm.h-1

,

the adsorbent was expanded evenly at a degree of 2.2 and 2.0 by using the clarified and

unclarified broth, respectively.



Figure 2: Bed expansion height in function of superficial velocity of fluid. Unclarified (□) and clarified culture

broth (■).

It could be verified that expanded-bed height was higher in clarified culture broth. As

reported by Anspach (1999), the interactions of adsorbent particles with cell surfaces, DNA and

other substances may be the most limiting factors to a stable bed. These feedstock composition

leads aggregation and consequently bed instabilities and channeling [40]. Nevertheless, the small

differences between the expansion degrees indicate that the unclarified broth should be applied

directly to expand the bed. The use of unclarified culture has an important economic impact

because the biological sample can be used without any previous treatment.

Dynamic binding capacity

The adsorption experiments were conducted to evaluate the dynamic binding capacity of

chitosanase with clarified and unclarified broth. The breakthrough curve analysis is essential to

estimate the maximum loading amount of target protein. Usually, it is acceptable a loss of 10%

of target protein in the effluent [39]. Figure 3 presents the influence of culture broth on the shape

of breakthrough curves. The curves were similar for both systems, displaying little interaction

between biomass and bed. For unclarified broth, the equilibrium was achieved quickly.



Figure 3: Effect of the presence of cells on the breakthrough curve behaviour of chitosanase into the resin

Streamline DEAE. Unclarified (□) and clarified culture broth (■).

The results also showed that the binding capacity of unclarified culture broth (0.3 U/g

adsorbent) was slightly lower compared to the clarified one (0.32 U/g adsorbent). This slightly

difference could suggest that the adsorptive capacity of streamline-DEAE is not hampered by the

presence of the cell, at least until U/U0 = 0.1. This supports the behaviour of the breakthrough

curves. Other authors have also reported weak influence of biomass on the adsorption capacity

and on the rupture curve [38, 41].

Three experiments at expansion degree of 1.2, 1.5 and 2.0 were performed using

unclarified culture broth. Figure 4 presents the dynamic behaviour of the process. For an

expansion degree of 2.0 the adsorption of chitosanase into the resin was very fast. Sixty

millilitres of culture broth was enough to saturated 70% of resin. The saturation condition

(U/U0=1.0) was achieved after 80mL of culture broth. For an expansion degree of 1.2 and 1.5 the

saturation condition was not achieved. Under the industrial point of view, it is more interesting to

work with a breakthrough up to 10% because the losses are reduced. In addition, for an

expansion degree of 2.0 and 1.5, a breakthrough of 10% was found after 20 and 30mL of culture

broth, respectively. High yields can be obtained by reduction of the operation time,

consequently, increase the process productivity [38].



Figure 4: Effect of expansion degree on the breakthrough curve behaviour of chitosanase into the resin Streamline

DEAE by using unclarified broth. Expansion degree of 1.2 (■), 1.5 (●) and 2.0 (▲).

Purification of chitosanase

An extracellular chitosanase was partially purified from the culture supernatant of B.

cereus C-01. The EBA chromatogram profile is depicted in Figure 5.

Figure 5: The elution profile of chitosanase after adsorption of broth culture on Streamline DEAE. Content of

protein (○) and enzyme activity (■).

From these results, it can be notice a larger peak of enzyme activity at elution compared

to the protein. As shown in Table 1, the elution steps of EBA were combined to give an overall

purification of about 3.6-fold for chitosanase. The overall activity yield of purified chitosanase

was 31%. The final amount of protein obtained was about 29 mg.



Table 1: Purification of the chitosanase from B. cereus C-01

Step Total

protein (mg) Total activity (U)

Specific

activity (U/mg)

Purification

Factor Yield (%)

Culture broth 121 63 0.52 1.0 100

Load 31 17 0.55 1.0 27

Washing 60 24 0.4 0.77 48

Streamline DEAE (Eluate 0.3

M NaCl) 9.0 8.0 0.9 1.75 13


M NaCl) 12 8.8 0.7 1.35 14


M NaCl)

8.0 2.2 0.27 0.52 4.0

By the analysis of SDS-Page, it was possible to identify two protein bands that were

concentrated by chromatographic process (Figure 6). The first one was eluted with 0.3 M NaCl

and the second with 0.7 M. Chitosanase activity of purified enzymes were demonstrated by

zymogram (Figure 6, lanes 6 and 7). A purification factor of 1.75 was obtained considering the

fraction of 0.3 M NaCl. These analyses represent a good result if one considers that just a single

purification step has been used. A purification factor of 1.61 was obtained for purification of

amylase using EBA [42]. Purification factors between 1.2 and 2.3 were obtained during the

purification study of antigen of hepatitis B by EBA [43].

Figure 6: SDS-PAGE analysis of the chitosanase from B. cereus C-01. Lanes: M- molecular markers; 1- culture

supernatant; 2- load; 3- washing; 4- fraction eluted with 0.3 M NaCl; 5- fraction eluted with 0.7 M NaCl; 6-

zymogram analysis for fraction eluted with 0.3 M NaCl; 7- zymogram analysis for fraction eluted with 0.7 M NaCl.



The protein peak eluted with 0.3 M NaCl showed an apparent molecular mass of 33 kDa

while the other one eluted with 0.7 M NaCl showed approximately 44 kDa. The molecular mass

of these chitosanases were similar to another chitosanases produced by Bacillus strains, such as

B. cereus TKU030 (43 kDa) [16], B. cereus TKU022 (44 kDa) [17], B. cereus S1 (45 kDa) [44],

B. subtilis 168 (30 KDa) [31] and B. subtilis CH2 (29 kDa) [45]. The two distinct peaks of

chitosanases with different molecular mass can be related to the production of enzymes with

different mechanism of action (endo and exochitosanases). Other studies have also been reported

the production of two distinct forms of chitosanases [46, 47]. The use of single-step for enzyme

purification allowed the purification of a chitosanase with good qualitative results as well as

enzymatic activity.

Effect of pH and temperature

The fraction that exhibited higher purification factor (0.3 M NaCl) was used for the

characterization experiments. The effect of pH on the catalytic activity was studied by using

chitosan as substrate under the standard assay conditions. The pH activity profile of the purified

chitosanase exhibited maximum values at pH 5.5 (Figure 7). The optimum pH of the chitosanase

was similar to the others chitosanases already characterized; the most of them reported optimum

pH ranging from 4.0 to 6.0 [37, 48]. After 24 hours of incubation in different pH, it was observed

a plateau between pH 5.5 to 8.0.These results showed larger pH range stability compared to

others studies. For example, for this same period of incubation, it was found stability in a short

range of pH (6.0 to 7.0) for chitosanase purified from culture broth of Serratia sp. TKU016 [49].

Additionally, chitosanase produced by Janthinobacterium showed stability in a pH range from

5.0 to 7.0 [50]. Ultimately, it was verified that extreme pH reduces enzymatic activity over time.



Figure 7: Effects of pH on the activity (■) and stability of chitosanase (●). The pH stability profile to the enzyme

was determined by measuring the residual enzyme activity at pH 6 after 24 hours of incubation in different pH

values (3.0 – 10.0) at 4 ºC.

The effect of temperature on chitosanase activity was also studied. The optimum

temperature for B. cereus C-01 purified chitosanase was 55 ºC (Figure 8).The enzyme solution

was incubated for 60 minutes at various temperatures and the residual activity was then

measured to examine the thermal stability. The chitosanase maintained its initial activity at a

range of temperature between 30 and 60 ºC. It was possible to keep 91% of its activity at 55 ºC.

The enzyme stability under its optimum temperature is extremely important for industrial

applications of enzymes. Temperature above 60 °C promoted reduction of enzyme activity, i.e.,

the enzyme denaturation occurs after this temperature.



Figure 8: Effects of temperature on the activity (■) and stability of chitosanase (●). The enzymatic samples were

incubated for 60 minutes at temperature ranging from of 30 ºC to 80 ºC.

For two purified chitosanases synthesized by B. subtilis TKU007 [51] and B. cereus D-11

[37], it was retained only 60% of its original activity. This activity was obtained after 60 minutes

of exposure at temperatures near to the optimum of both enzymes. For recombinant chitosanase

from Penicillium sp. D-1, the exposition during 60 minutes at optimal temperature reduced 92%

of the enzyme activity compared to its initial activity [52]. Chitinase ChiA from Cellulomonas

uda showed maximum activity against colloidal chitin at 60 ºC, and higher temperatures resulted

in a significant loss of activity [53].

Effect of various ions on enzyme activity

The effects of some divalent ions on enzyme activity were examined for a further

characterization of the B. cereus C-01 chitosanase. The enzyme was pre-incubating with the

chemical compounds in 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) at 4 ºC for 2 hours. The results are

shown in Figure 9.



Figure 9: Effect of ions on chitosanase activity. The enzymatic samples were incubated at 4 ºC for 2 hours in the

presence of: Mg2+,

Cu2+

, Fe2+

, Ca2+

, Zn2+

, Mn2+

and Ba2+

.

The results show that the enzyme has been strongly activated by Mn2+

andthe activity was

increased 1.62-fold (Figure 9). It was also reported the activation of others chitosanases from B.

cereus strain by Mn2+

[19]. In studies with two chitosanases produced by Microbacterium sp., the

activity was increased 1.56-fold by the incubation with Mn2+

[47]. The activation by Mn2+

also

occurred for a chitosanase purified from fermentation broth of Gongronella sp. [54] and for an

endochitinase from Serratia plymuthica HRO-C48 [55]. It was also possible to observe a positive

influence of ions Ba+2

and Mg+2

. Nevertheless, the ions Cu+2

, Fe+2

and Zn+2

showed inhibitory

effect on chitosanase activity. This inhibitory effect was also reported by other authors [21, 56].

CONCLUSION

A study was carried out in order to evaluate the application of the EBA for enzyme

purification of a non-clarified broth. It was applied an anionic resin to purify a chitosanase from

B. cereus. A biochemical characterization of the enzyme was evaluated as well. The enzyme

binds to resin in the same extent using both clarified and unclarified culture broth (0.32 and 0.30

U/g adsorbent, respectively). The fraction recovered after the elution exhibited 31% of yield

increasing the specific activity 3.6-fold compared to initial one. Two protein fractions with

chitosanolytic activity eluted at different NaCl concentrations were recovered. A protein eluted

with 0.3 M NaCl and showed an apparent molecular mass of 33 kDa. Another eluted with 0.7 M

NaCl and had 44 kDa. This result suggests the existence of at least two different chitosanases.



The purified chitosanase was stable at 30-60 ºC, pH 5.5 – 8.0 and showed the highest activity at

55 ºC, pH 5.5. The ions Cu+2

, Fe+2

and Zn+2

showed inhibitory effect on chitosanase activity. In

contrast, the enzyme was significantly activated by Mn2+

. The use of Streamline DEAE ionic

exchanger to expanded bed adsorption can be considered a good system for the recovery of

chitosanases from B. cereus C-01 since it reduces the purification steps. Reduction in costs and

time are of great importance for industrial processes, therefore the procedure described here has

high potential for large scale applications.

Acknowledgements

The authors thank the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) and the

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) for the financial support.

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Considerações

Finais

Considerações Finais 74


6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Neste estudo foi descrita a purificação de uma quitosanase produzida pelo Bacilus cereus

utilizando a tecnologia de Adsorção em Leito Expandido. Inicialmente realizaram-se coletas de

solo para seleção de microrganismos produtores de quitosanases. Foram obtidas 15 cepas

bacterianas, as quais passaram por testes de patogenicidade e análises de produção de

quitosanases. Após a seleção e identificação do microrganismo escolhido – através de análises

morfológicas, teste de Gram e por métodos moleculares – um estudo para purificação da enzima

de interesse foi realizado. Foram estudadas as condições de operação da cromatografia em leito

expandido utilizando um Planejamento Composto Central. Além disso, foram avaliadas a

influência da biomassa no processo de purificação e a qualidade da amostra purificada.

Dentre as 15 cepas isoladas, aquela que apresentou maior potencial para hidrólise da

quitosana foi identificada como Bacillus cereus. Na otimização das condições de operação do

sistema cromatográfico para purificação da quitosanase produzida por esse microrganismo, foi

possível aumentar tanto o rendimento como o fator de purificação da molécula de interesse. Os

resultados do Planejamento Composto Central mostraram que o melhor rendimento global na

etapa de eluição foi de 47,27%. Enquanto que o melhor fator de purificação foi de 1,43. A

biomassa mostrou afetar minimamente o sistema: a enzima ligou-se a resina de forma

semelhante tanto com uso de caldo clarificado e como de não clarificado (0,32 e 0,30 U/g

adsorvente) e foi possível alcançar alturas de expansão semelhantes tanto pelo uso do caldo

clarificado como do não clarificado.

Nos estudos de purificação, foi possível observar duas bandas proteícas com atividade

quitosanolítica, eluidas com diferentes concentrações de NaCl. Aquela que apresentou maior

fator de purificação foi utilizada em testes qualitativos. As análises qualitativas do método

empregado mostraram uma considerável pureza da quitosanase tendo em vista que apenas uma

única operação foi empregada na purificação. Os íons Cu+2

, Fe+2

e Zn+2

mostraram efeito

inibitório para enzima. Em contraste, esta foi fortemente ativada por Mn2+

. A enzima purificada

apresentou massa molecular aparente de 33 kDa, temperatura e pH ótimos de hidrólise de 55 ºC

e 5,5, respectivamente. Adicionalmente, foi evidenciado estabilidade enzimática nas faixas de

pH 5,5 – 8,0 e temperatura 30 - 60 ºC. A estabilidade apresentada pelo extrato enzimático

mostrou que essa enzima tem uma promissora aplicação para produção de quitooligossacarídeos

Considerações Finais 75


bioativos. O uso da Adsorção em Leito Expandido também se mostrou eficaz como técnica de

purificação.

Estudos posteriores deverão ser realizados para avaliar a influência de diferentes

concentrações de biomassa sobre Adsorção em Leito Expandido e para otimizar a purificação da

segunda quitosanase.

Até o momento, com o desenvolvimento deste estudo foi possível gerar três produções

científicas, três trabalhos foram apresentados em congressos internacionais e 04 em congressos

regionais. Além disso, cinco alunos de graduação atuaram neste projeto contribuindo assim para

sua formação acadêmica.

Apêndice

Apêndice 77


7. APÊNDICE

A seguir será apresentado um estudo matemático sobre o processo de purificação

empregado nesse trabalho de doutorado. Este estudo matemático foi concebido em parceria com

um aluno de pós-graduação do Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química.

Apêndice 78


Modelagem e simulação da adsorção de quitosanases produzidas por Bacillus cereus em

uma coluna operada em leito expandido

Araújo, Nathália Kelly de1; Padilha, Carlos Eduardo de Araújo

1; Souza, Domingos Fabiano de Santana

1; Oliveira,

Jackson Araújo de1; Macedo, Gorete Ribeiro de

1; Santos, Everaldo Silvino dos

1

1Laboratório de Engenharia Bioquímica, Departamento de Engenharia Química,Universidade Federal do Rio Grande

do Norte (UFRN), Natal-RN, Brasil.

Abstract

Neste estudo um modelo matemático foi elaborado para descrever as etapas de carga, lavagem e

eluição de uma coluna de troca iônica operada em leito expandido durante a purificação de

quitosanases produzidas por Bacillus cereus. A estratégia de estimação híbrida composta pelos

métodos particle swarm optimization (PSO) e Gauss-Newton foi adotada para estimar os

parâmetros do modelo. A sensibilidade paramétrica foi aplicada para realizar a triagem dos

parâmetros relevantes ao modelo e reduzir o esforço do método Gauss-Newton. Através dos

testes 2 e das médias dos erros quadráticos foi observado que o desempenho do modelo com os

parâmetros re-estimados foi superior àquele obtido apenas com o método de Gauss-Newton. A

aplicação do modelo validado sob as condições operacionais ótimas permitiram que fosse

alcançado o máximo de 15.03 % de rendimento na eluição 700 mM de NaCl.

Keywords: Modeling, Expanded Bed Adsorption, Chitosanases, Particle Swarm Optimization,

Gauss-Newton, Optimization

1. Introdução

Pesquisas sobre quitosanases têm recebido grande atenção devido a sua ampla aplicação

em vários campos [1]. Entre essas aplicações, inclui-se a preparação de quitoligossacarídeos

bioativos [2-3], de agentes de biocontrole para aumentar a resistência de plantas contra

patógenos fúngicos [4], mediar a entrega de gene [5] e a bioconversão de resíduos quitinosos

marinhos [2]. Contudo o uso direto do caldo fermentado microbiano contendo atividade

quitosanolítica não é recomendável, uma vez que nele podem existir metabólitos secundários

indesejáveis e proteases. Por outro lado, a necessidade de etapas de purificação pode aumentar

substancialmente o custo total de produção. Assim incentivos têm sido feitos para intensificação

e integração das técnicas de downstream processing na ordem de assegurar a viabilidade

econômica do processo [6-9].

Apêndice 79


A adsorção em leito expandido (ALE) é uma técnica cromatográfica que combina

remoção de insolúveis, concentração e purificação em apenas um passo [10-12]. Nela, a

aplicação de um fluxo ascendente sobre um leito de partículas adsorventes permite não só a

passagem de material particulado bem como a adsorção da molécula-alvo [13-14]. A distribuição

de partículas ao longo da coluna cromatográfica ocorre pelas variações de tamanho e densidade

das partículas, o que torna a análise da cinética da ALE uma tarefa complexa [15].

Uma ferramenta útil para compreender os complexos mecanismos envolvidos na

operação da coluna de adsorção em leito expandido, bem como a otimização de condições

operacionais é a utilização da modelagem matemática [15,8]. A troca iônica (IEX) é a

modalidade do processo ALE com maior número de trabalhos de modelagem e eles abordam as

etapas carga, lavagem e eluição. Nesta última etapa faz-se necessário incorporar isotermas que

levem em consideração a atuação do sal na adsorção, das quais se destaca a Steric Mass Action

(SMA). A isoterma SMA tem mostrado resultados promissores na descrição do comportamento

da adsorção de uma única proteína [16-17] ou simples combinações de proteínas [18-19].

Contudo, para sistemas complexos como caldo fermentado com células e/ou quando não se pode

realizar ensaios prévios com a proteína-alvo pura, o seu uso é inviável. Para contornar estes

problemas uma alternativa simples seria a inclusão de um termo exponencial associado à

concentração de sal no modelo de isoterma de Langmuir como visto em Antia and Horváth

(1989) [20] e Chen and Sun (2003) [21].

Neste contexto, o presente trabalho propõe a modificação do modelo matemático de

sistemas cromatográficos para permitir a descrição das etapas carga, lavagem e eluição do

processo ALE durante a purificação de quitosanase a partir de extrato bruto com células. A

abordagem híbrida foi usada para estimar os parâmetros do modelo e a análise de medidas

estatísticas foi realizada para avaliar o desempenho do modelo. Com o modelo enfim validado,

uma rotina de otimização foi usada para maximizar a função rendimento pela manipulação das

condições operacionais do processo ALE.

2. Materiais e Métodos

2.1. Microrganismo

Apêndice 80


Uma bactéria identificada como Bacillus cereus foi isolada de amostras de solo em

Natal/Brasil (S 05º52’11’’, Wo 35º13’08.4’’). Diluições seriadas de amostras de solo foram

inoculadas em placas de petri contendo peptona (6,0 gL-1

), quitosana (2,0 gL-1

), sulfato de

magnésio (0,5 gL-1

), fosfato dibásico de potássio (1,0 gL-1

) e ágar (15 gL-1

), e incubadas a 30ºC

por dois dias. Colônias foram isoladas, testadas quanto a atividade quitosanolítica e selecionadas

para análises taxonômica, coloração por gram e teste de patogenicidade usando o Kit Siemens

PC33. Para uma identificação mais profunda, reação em cadeia da polimerase (PCR) foi

realizada para amplificação do gene codificador do rRNA 16S. Foram utilizados os iniciadores,

direto e reverso, 27F (5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’) e 1525R (5’-AAG GAG GTG

ATC CAG CC-3’), respectivamente. Os produtos do PCR foram analisados por eletroforese em

gel de agarose e, depois, purificados, quantificados e usados para sequenciamento. Quatro

reações de sequenciamento foram realizadas usando os primers 518F (5’-CCA GCA GCC

GCG GTA ATA CG-3’), 800R (5’-TAC CAG GGT ATC TAA TCC-3’) e 1492R (5’-TAC

GGY TAC CTT GTTA CGA CTT-3’). A sequência de nucleotídeos do 16S rRNA da amostra

foi determinada por ABI 3730 DNA Sequencer (Applied Biosystems, USA) e comparada com

sequências de 16S rRNA disponíveis no NCBI BLAST.

2.2. Produção das quitosanases

Alíquotas de células, estocadas em ágar nutriente, foram transferidas para 50 mL meio de

pré-cultivo dispensado em Erlenmeyer (250 mL), e então incubados a 30º C, 120 rpm, por 30

horas. O meio de pré-cultivo consistiu de: peptona (6,0 gL-1

), quitosana (2,0 gL-1

), sulfato de

magnésio (0,5 gL-1

) e fosfato dibásico de potássio (1,0 gL-1

). Este foi, em seguida, inoculado

assepticamente a um nível de 10% (v/v) em Erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL do mesmo

meio [3]. Os frascos foram então colocados num agitador rotativo a 120 rpm durante 24 horas,

30° C (Tecnal, TE421). Amostras deste cultivo foram usadas para o ensaio de purificação.

2.3. Ensaios de adsorção em leito expandido

O adsorvente de troca aniônica Streamline DEAE (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) foi

usado nos experimentos. Microesferas de vidro foram utilizadas na base da coluna para

acomodar o leito adsorvente e permitir a passagem dos sólidos particulados. O fluído foi injetado

na coluna usando bomba peristáltica (Perimax 12, Spetec). Foram realizados 5 ensaios de acordo

Apêndice 81


com a Tabela 1. O correto alinhamento vertical da coluna foi assegurado em todos os

experimentos e todos os experimentos foram realizados à temperatura ambiente.

A coluna, com diferente alturas de leito sedimentado, foi equilibrada com tampão Tris-

HCl, 50 mM, pH 8,5 (tampão A) para que fosse alcançada a altura uma estável, onde H/H0=1,5.

O caldo fermentado com células foi então aplicado (etapa de carga) a uma velocidade superficial

variável (de acordo com a tabela 1), seguido de lavagem com tampão A (150 mL). A eluição foi

realizada por gradiente salino passo a passo com tampão Tris-HCl, pH 8,5 contendo 0,3 M

(tampão B), 0,7 M (tampão C) e 1,0 M (tampão D) de NaCl. As etapas de lavagem e eluição

conduzidas a uma velocidade superficial de 100 cm.h-1

. Em todas as etapas de purificação, várias

frações foram coletadas para realização de ensaio enzimático.

Tabela 1. Condições operacionais dos ensaios de ALE para recuperação de quitosanase

Ensaio Altura do

leito fixo (cm)

Altura do leito

distribuidor

(cm)

Velocidade

superficial

(cm.h-1

)

Atividade enzimática do

extrato bruto (U.mL-1

)

1 8.00 2.00 100.00 0.440

2 4.00 2.00 200.00 0.430

3 8.00 6.00 100.00 0.210

4 8.00 6.00 200.00 0.298

5*

6.00 4.00 150.00 0.298

* - O ensaio 5 foi usado como validação do modelo matemático

2.4. Determinação da atividade enzimática

A atividade enzimática do caldo bruto e de amostras cromatográficas foram mensuradas

pela incubação de 250 μL da amostra enzimática com 250 μL de quitosana 1% (pH 6,0). A

mistura foi incubada em banho-maria por 30 minutos e a temperatura ajustada para 55ºC. A

reação foi interrompida por fervura durante 10 minutos (De Araújo et al., 2013). A formação de

açúcares redutores foi analisada pelo método do ácido dinitro salicilico, usando D-glucosamina

Apêndice 82


como padrão [22]. Uma unidade (U) de quitosanase foi definida como a quantidade de enzima

capaz de gerar 1 µmol de D-glucosamina por minuto nas condições descritas acima.

3. Formulação do Modelo

A elaboração do modelo matemático que descreve todo o ciclo de operação de uma

coluna de ALE voltada para purificação da quitosanase em uma resina de troca iônica foi

baseada nas seguintes hipóteses:

i. As partículas adsorventes foram consideradas como esferas de densidade uniforme e

grupos funcionais igualmente distribuídos na superfície. Variações axiais do raio das

partículas adsorventes (Rp) e da porosidade do leito (ε) foram assumidas conforme Li et

al. (2005) [23].

ii. O comportamento hidrodinâmico da fase fluida pode ser descrito pelo modelo de

dispersão axial [24-25].

iii. A adsorção do componente quitosanase (1) ocorreu apenas na superfície do adsorvente,

logo não foi considerada a difusão interna.

iv. A interação entre biomassa e leito adsorvente foi negligenciada.

v. O comportamento reológico da fase fluida é diferente em cada etapa do processo de ALE.

Para descrever todo o ciclo de operação ALE foi necessário incluir o componente sal (2)

para a etapa de eluição e foi assumido que ele não interage com o adsorvente.

vi. A isoterma de Langmuir modificada foi usada para descrever o equilíbrio de adsorção da

quitosanase nas três etapas do processo de ALE.

O balanço de massa do componente i na fase fluida pode ser expresso como

2, ,

, 2

3 1p

f i i i r Ri i i

ax ip

k z C CC C CUD

t z z z R zz

(1)

onde Dax,i é o coeficiente de dispersão axial do componente i (cm2.s

-1), kf,i é o coeficiente de

transferência de massa no filme líquido do componente i (cm.s-1

), U é a velocidade superficial

(cm.s-1

), t é o tempo (s), iC e ,p

i r RC é a concentração do componente i na fase fluida e na

superfície da partícula adsorvente, respectivamente.

Apêndice 83


As condições iniciais e condições de contorno da etapa carga são:

CI : 0, ,0 0it C z (1a)

0CC : 0, 0,

, 0

i i

i

t z C C

Cz H

z

(1b)

Assumindo que todas as resistências à transferência de massa se resumem a razão entre a

constante de adsorção (b1) e a constante de dessorção (b2), o balanço de massa da quitosanase na

fase sólida pode ser simplificado como é visto a seguir:

1 1 max 2

qb C q q b q

t

(2)

onde q é a concentração de quitosanase adsorvida pela resina e qmax é a capacidade máxima de

adsorção de quitosanase na resina. A condição inicial da etapa carga é dada por:

CI : 0, ,0 0t q z (2a)

De maneira a promover a recuperação de quitosanases na etapa eluição, o termo qmax foi

considerado como inversamente proporcional à concentração de sal na fase fluida em um dado

estágio da coluna, conforme a Equação 3.

'max max 1 2expq q k C (3)

Assumindo que a taxa de adsorção na resina é equivalente ao decréscimo de sua concentração na

fase fluida, o termo ,p

i r RC pode ser fornecido através de manipulações matemáticas entre as

Equações 1 e 2, resultando na Equação 4. Como o componente sal não possui equação de

balanço no sólido teremos 2, 2p

r RC C , de modo que o terceiro termo da Equação 1 torna-se

nulo.

Apêndice 84


21

, 11,

1max

, 1

1

3

11

3

p

p

fr R

p

f

zR z b qC

k zC

zb R zq q

k z

(4)

As Equações 1-4 também podem ser usadas para descrever as etapas lavagem ( 10 0C ,

20 0C ) e eluição ( 10 0C , 20 0C ), exceto nas duas condições iniciais dadas pelas Equações

1a e 2a, que devem corresponder ao término das etapas carga e lavagem, respectivamente. Cada

etapa possui um conjunto próprio de parâmetros para a quitosanase, porém os valores de qmax, b1

e b2 foram fixados, o que totaliza 11 parâmetros. Os subscritos l, w e e foram usados para

informar sobre os parâmetros que pertencem às etapas carga, lavagem e eluição,

respectivamente.

Para a integração numérica do modelo contemplando todas as etapas, foi aplicado o

Método das Linhas [26]. Neste modelo a altura da coluna cromatográfica (coordenada espacial z)

foi discretizada em n elementos utilizando o método de diferenças finitas centrais. Em cada

elemento, a derivada parcial no tempo, foi aproximada por uma derivada ordinária. O sistema de

equações diferenciais ordinárias discretizados nos n elementos foram resolvidos utilizando a

subrotina numérica DASSL [27].

3.5. Estimação de parâmetros do modelo

O enxame de partículas (PSO) é um algoritmo de busca heurística baseado na

movimentação gregária de animais. Nele, a estimação é realizada por uma população de

partículas que se movimenta no espaço multidimensional trocando entre si informações sobre a

função objetivo [28-30]. A função objetivo (FO) a ser minimizada é do tipo mínimos quadrados

ponderados, que estabelece a diferença entre os valores experimentais ( expiC ) e calculados ( calc

iC

) associada ao erro de medição ( i ).

2

exp calc

21

N ii

i i

C CFO

(5)

Apêndice 85


Neste trabalho foram usados 20 partículas e 20 iterações com valores dos parâmetros

inicial, cognitivo e social fixados em 0.7, 1.0 e 1.0, respectivamente. Os intervalos de busca dos

parâmetros do modelo foram: Dax,1l, Dax,1w, Dax,2 [5 x 10-3

,0.75] cm2.s

-1, kf,1l, kf,1w [5 x 10

-

3,0.75] cm.s

-1, qmax[0.25,1] U.g

-1, b1[10

-2,0.5] g.U

-1.s

-1, b2[5 x 10

-4,5 x 10

-2] s

-1, Dax,1e[5

x 10-5

,2.5 x 10-3

] cm2.s

-1, kf,1e[5 x 10

-5,5 x 10

-2] cm.s

-1, k1[5 x 10

-3,0.75] L.mmol

-1. Como o

ciclo de operação ALE é formado por três etapas onde a seguinte depende da anterior, pensou-se

a princípio em estimar primeiramente os parâmetros referentes à carga seguidos dos parâmetros

da lavagem e da eluição. Entretanto, esta estratégia não obteve resultados satisfatórios

(resultados não mostrados neste trabalho), então a alternativa foi a estimação simultânea de todos

os parâmetros do modelo.

Com o conjunto de parâmetros já calibrado pelo algoritmo PSO e finalizada a

sensibilidade paramétrica, alguns parâmetros foram re-estimados pelo método Gauss-Newton. O

pacote computacional Estima desenvolvido na COPPE-UFRJ foi usado para este propósito,

buscando minimizar a função objetivo descrita na Equação 5. Através dele foi possível também

obter a matriz de covariância e desvios-padrão dos parâmetros do modelo.

3.7. Otimização do rendimento da adsorção em leito expandido

A principal vantagem da modelagem matemática é a possibilidade de simular o processo

em condições experimentais não testadas baseando-se no conjunto de parâmetros estimados [29].

Assim, nesta etapa foram avaliados os efeitos da concentração inicial da carga, altura do leito

fixo, altura do distribuidor e a velocidade superficial sobre a recuperação do adsorbato. A função

objetivo escolhida a ser maximizada foi o percentual de rendimento na eluição a 700 mM de

NaCl descrito a seguir:

2

1

1

10 carga

Yield (%) 100

e

e

t

t

C dt F

C V

(6)

Apêndice 86


Onde 2

1

1

e

e

t

t

C dt representa a quantidade de quitosanase recuperada a 700 mM de NaCl, F é a

vazão volumétrica e cargaV é o volume de extrato bruto contendo quitosanase aplicado na carga.

A rotina DBCONF, baseada no algoritmo quasi-Newton, foi usada para buscar o maximizador

dentro do espaço delimitado pelas condições empregadas na calibração dos parâmetros.

4. Resultados e Discussões

No caso de sistemas super parametrizados, como no atual trabalho, o modelo pode

carregar parâmetros praticamente não-identificáveis, o que dificulta o uso de um método baseado

em gradientes [31]. Dessa forma, partiu-se para uma estratégia de estimação de parâmetros

híbrida, tendo como chute inicial do método determinístico o conjunto de parâmetros estimados

pelo método heurístico. Por suas características vantajosas, o algoritmo PSO foi escolhido para

realizar a estimação dos 11 parâmetros do modelo com os dados experimentais provenientes dos

Ensaios 1, 2, 3 e 4. Os valores estimados pelo algoritmo PSO são mostrados na primeira coluna

da Tabela 2.

Tabela 2. Parâmetros do modelo estimados pelo algoritmo PSO e pelo pacote computacional

baseado no algoritmo Gauss-Newton.

Parameter

Estimated values

PSO Algorithm Gauss-Newton algorithm

Dax,1 l (cm2.s

-1) 1.065 x 10

-2 1.144 x 10

-2 ± 1.441 x 10

-3

kf, 1l (cm.s-1

) 0.430

0.430

qmax (U.g-1

) 0.756

0.645 ± 6.376 x 10-2

b1 (g.U-1

.s-1

) 3.134 x 10-2

3.345 x 10-2

± 4.637 x 10-3

b2 (s-1

) 1.000 x 10-3

4.091 x 10-4

± 1.749 x 10-4

Dax, 1w (cm2.s

-1) 3.953 x 10

-2 3.814 x 10

-2 ± 5.058 x 10

-3

Apêndice 87


kf, 1w (cm.s-1

) 0.474

0.474

Dax, 1e (cm2.s

-1) 1.710 x 10

-3 1.710 x 10

-3

kf, 1e (cm.s-1

) 3.995 x 10-3

3.995 x 10-3

Dax, 2 (cm2.s

-1) 6.291 x 10

-4 6.291 x 10

-4

k1 (L.mmol-1

) 0.488 0.488

Uma análise de sensibilidade paramétrica foi realizada sobre o conjunto calibrado pelo

algoritmo PSO seguindo a metodologia de Brun et al. (2001) [31] e Prunescu and Sin (2013)

[32]. A medida de sensibilidade paramétrica msqr foi obtida para cada etapa do processo como

loadingmsqr

, washingmsqr

, elutionmsqr

, representando as etapas carga, lavagem e eluição, respectivamente.

Também foi realizada uma avaliação global dada pelo indicador totalmsqr

e um threshold

selecionado. Os parâmetros estão posicionados de acordo as etapas do processo ALE e estão

mostrados na Figura 1.

Os resultados de sensibilidade paramétrica indicaram que o coeficiente de dispersão axial

,1ax lD a capacidade máxima de adsorção, maxq , e as constantes de adsorção 1b e

dessorção 2b da quitosanase na carga, bem como o coeficiente de dispersão axial da

quitosanase na lavagem ,1ax wD foram os parâmetros que causaram maior impacto na resposta

do modelo. As perturbações no coeficiente de dispersão axial da quitosanase na eluição ,1ax eD

, nos coeficientes de transferência de massa no filme líquido da quitosanase nas três etapas

,1 ,1 ,1, , f l f w f ek k k , no coeficiente de dispersão axial do sal ,2axD e no termo de

deslocamento da proteína pela presença de sal 1k pouco afetaram a medida totalmsqr

, sendo

considerados não-relevantes a nível de 0.15 e por isso foram fixados. Os parâmetros relevantes

podem ser expressos na forma vetorial como é visto a seguir:

Apêndice 88


,1 max 1 2 ,1 T

S ax l ax wD q b b D (7)

Os parâmetros s foram re-estimados sobre o mesmo conjunto de dados para se obter

melhor ajuste. A estratégia de estimação em um único passo também foi mantida. Os parâmetros

re-estimados e seus respectivos desvios padrões são mostrados na segunda coluna da Tabela 2.

A)

B)

Apêndice 89


C)

D)

Figura 1. Os três primeiros gráficos mostram msqr para a etapa carga ( loading

msqr ) (a), etapa

lavagem ( washingmsqr

) (b) e etapa eluição ( elutionmsqr

) (c). O gráfico de fundo mostra a medida de

sensibilidade total totalmsqr

com respeito aos parâmetros do modelo k e a threshold delimita os

parâmetros relevantes ao modelo (d).

Na Figura 5 estão dispostos os perfis simulados de concentração de quitosanase na saída

da coluna de ALE em diferentes condições operacionais com os parâmetros estimados do

Apêndice 90


algoritmo PSO e do algoritmo Gauss-Newton. A diferença de valores nos cinco termos de s

alterou significativamente o comportamento do modelo nas três etapas. As curvas de ruptura

geradas com os parâmetros do PSO estão posicionadas mais a direita e apresentaram o formato S

característico, enquanto que as curvas de ruptura com os parâmetros re-estimados saturaram

antecipadamente e atingiram maiores valores de concentração na saída. Na lavagem a queda da

concentração de quitosanase foi mais branda com os parâmetros do PSO do que com os

parâmetros re-estimados. A inclusão do termo exponencial na equação de Langmuir realmente

provocou a subida na concentração de quitosanase pela injeção da solução eluente, assim como

ocorreu experimentalmente. Na eluição os picos simulados com os parâmetros PSO surgiram tão

logo foi injetada a solução eluente a 700 mM de NaCl, enquanto que os picos com os parâmetros

re-estimados foram mais largos e surgiram posteriormente no cromatograma. Independente do

conjunto paramétrico usado, é de se destacar um grande desvio entre os resultados da simulação

e os dados experimentais na etapa de eluição a 300 mM de NaCl, onde foi registrado um

pequeno degrau de concentração de quitosanase na saída da coluna. Isto pode ser atribuído ao

efeito do decréscimo da porosidade do leito pela mudança do regime expandido na lavagem para

o regime compactado na eluição, causando o aumento da dessorção das quitosanases nas

simulações do que observado experimentalmente.

Apêndice 91


Apêndice 92


Figura 2. Perfis dos cromatogramas da adsorção de quitosanases em uma coluna operada em

leito expandido. A - Ensaio 1; B - Ensaio 2; C - Ensaio 3; D - Ensaio 4; E - Ensaio 5. (■) são os

dados experimentais. As linhas sólidas são as respostas da simulação com os parâmetros do PSO.

As linhas tracejadas são as respostas da simulação com os parâmetros re-estimados.

A qualidade do ajuste das curvas simuladas em relação aos dados experimentais foi

avaliada pelo teste 2 (Eq. 8) e pela medida estatística mean square error (MSE) (Eq. 9).

Apêndice 93


2

exp calc

2 1calc

N

iii

i

C C

C

(8)

2

exp calc

1

N

iii

C C

MSEN

(9)

A Tabela 3 mostra os valores de MSE e 2 obtidos nos ensaios de calibração e validação

para os conjuntos de paramétricos PSO e Gauss-Newton. Em relação aos ensaios responsáveis

pela calibração dos parâmetros foi observado que o conjunto de parâmetros PSO gerou valores

baixos de MSE e 2 , tendo a hipótese de igualdade aceita nos quatros ensaios a nível de 95 %

de confiança e grau de liberdade igual a 41 (2 56.94c ). A re-estimação dos parâmetros s

apenas permitiu aumentar a qualidade global de ajuste, muito embora tenha ocorrido o aumento

do valor de MSE na simulação da corrida 2. Ademais, bons resultados foram obtidos na

simulação do Ensaio 5, mesmo ele não participando da estimação dos parâmetros do modelo. A

re-estimação dos parâmetros por Gauss-Newton reduziu o valor de MSE de 9.634 x 10-4

para e

8.671 x 10-4

e o valor de 2 de 0.90 para 0.88, mostrando que a estimação híbrida é um caminho

interessante para estimação de parâmetros para modelos general rate.

Apêndice 94


Tabela 3. Valores das medidas estatísticas 2 e MSE obtidos da simulação do modelo com o

conjunto de parâmetros do algoritmo PSO e da re-estimação.

Parameter set Run 1 Run 2 Run 3 Run 4 Run 5

Without re-

estimation

2

3.98

(Significant)

9.77

(Significant)

0.97

(Significant)

4.19

(Significant)

0.90

(Significant)

MSE 2.560 x 10-3

8.364 x 10-4

9.215 x 10-4

3.258 x 10-3

9.634 x 10-4

With re-

estimation

2

1.49

(Significant)

3.68

(Significant)

0.33

(Significant)

0.59

(Significant)

0.88

(Significant)

MSE 1.800 x 10-3

1.699 x 10-3

2.327 x 10-4

9.497 x 10-4

8.671 x 10-4

Com o modelo já validado, ele foi usado para a otimização das condições operacionais da

ALE tendo como função objetivo o rendimento na eluição 700 mM de NaCl descrito na Equação

11. Neste procedimento foram preservados os volumes usados na carga, lavagem e eluição, o

fluxo volumétrico na eluição e as concentrações de sal nas soluções eluentes. A solução da

otimização revelou que as condições operacionais 0 8H cm, 2disH cm, 100u cm/h e

10 0.21C U/mL permitiram que o rendimento na eluição 700 mM de NaCl alcançasse o

máximo de 15.03 %. Este valor é superior ao rendimento obtido na mesma etapa no Ensaio 4,

12.41 %, o maior alcançado nos experimentos. A Figura 3 mostra o comportamento da

concentração de quitosanase na saída da coluna durante o processo ALE nas condições

operacionais ótimas.

Apêndice 95


Figura 3. Perfil simulado do cromatograma de adsorção de quitosanases em uma coluna operada

em leito expandido sob condições ótimas.

5. Conclusões

Neste trabalho buscou-se elaborar um modelo matemático que descreva o comportamento

da concentração do adsorbato durante as etapas carga, lavagem e eluição na purificação de

quitosanases por ALE. A abordagem híbrida, composta pelo algoritmo PSO e pelo algoritmo

Gauss-Newton, foi usada para a estimação dos parâmetros do modelo e a escolha dos parâmetros

relevantes foi feita através do método de sensibilidade paramétrica. O desempenho do modelo

matemático melhorou com a re-estimação dos parâmetros ,1ax lD , maxq , 1b , 2b e ,1ax wD ,

obtendo baixos valores de MSE e 2 mesmo para a corrida de validação. Dentro dos limites da

calibração, as condições ótimas foram 0 8H cm, 2disH cm, 100u cm/h e 10 0.21C

U/mL, que permitiram o rendimento máximo de 15.03 % na eluição 700 mM.

Apêndice 96


Agradecimentos

Os autores agradecem ao CNPq e Capes pelo suporte financeiro.

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