JOANA MONA E PINTO

Avaliação de Parâmetros Imunológicos Inatos e Morfologia Intestinal de Trutas Arco-íris (Oncorhynchus mykiss, Walbaum 1792),

Alimentadas com Ácido Ascórbico e Flavonoides Após Aplicação de Glicocorticoide Exógeno

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Tecidual do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Doutor em Ciências.

São Paulo 2014

JOANA MONA E PINTO

Avaliação de Parâmetros Imunológicos Inatos e Morfologia Intestinal de Trutas Arco-íris (Oncorhynchus mykiss, Walbaum 1792),

Alimentadas com Ácido Ascórbico e Flavonoides Após Aplicação de Glicocorticoide Exógeno

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Tecidual do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Doutor em Ciências. Área de concentração: Biologia Celular e Tecidual Orientador: Prof. Dr. José Roberto Machado Cunha da Silva Versão corrigida. A versão original eletrônica encontra-se disponível tanto na Biblioteca do ICB quanto na Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP (BDTD);

São Paulo 2014

DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)

Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo

© reprodução total

Pinto, Joana Mona e. Avaliação de parâmetros imunológicos inatos e morfologia intestinal de trutas arco-íris (Oncorhynchus mykiss, Walbaum 1792), alimentadas com ácido ascórbico e flavonoides após aplicação de glicocorticoide exógeno / Joana Mona e Pinto. -- São Paulo, 2014. Orientador: Prof. Dr. José Roberto Machado Cunha da Silva. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento. Área de concentração: Biologia Celular e Tecidual. Linha de pesquisa: Nutrição e Imunologia. Versão do título para o inglês: Evaluation of innate immune parameters and intestinal morphology of fed ascorbic acid and flavonoids rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum 1972), after exogenous glucocorticoids application. 1. Aditivos dietários 2. Nutracêutica 3. Estresse 4. Imunoestimulantes 5. Polifenóis 6. Fagocitose I. Silva,Prof. Dr. José Roberto Machado Cunha da II. Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Tecidual III. Título.

ICB/SBIB0168/2014

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS

______________________________________________________________________________________________________________

Candidato(a): Joana Mona e Pinto.

Título da Tese: Avaliação de parâmetros imunológicos inatos e morfologia intestinal de trutas arco-íris (Oncorhynchus mykiss, Walbaum 1792), alimentadas com ácido ascórbico e flavonoides após

aplicação de glicocorticoide exógeno.

Orientador(a): Prof. Dr. José Roberto Machado Cunha da Silva.

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Doutorado, em sessão

pública realizada a ................./................./................., considerou

( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)

Examinador(a): Assinatura: ............................................................................................... Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................

Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................

Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................

Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................

Presidente: Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................

A Diogo Nader Palermo, meu

marido e melhor amigo, com quem

amo compartilhar a vida. Por seu

apoio incondicional, e por acreditar

em mim... mais do que eu mesma.

Dedico!

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador Professor José Roberto Machado Cunha da Silva, que me

recebeu em seu laboratório e colaborou para o meu crescimento profissional, mas

principalmente agradeço por ter colaborado com o meu crescimento pessoal durante

este processo.

Ao Professor Francisco Javier Hernandez Blazquez que cedeu seu laboratório para

realização dos experimentos, e também me auxiliou com suas orientações durante o

doutorado.

Ao Marcos Rigolino (in memorian) e a Yara Aiko Tabata que me receberam também

em sua casa, ofereceram seu tempo, atenção e por fim sua amizade. Obrigada

pelas longas conversas na hora do cafezinho e pelo clima de felicidade, que fizeram

o trabalho ser também lazer.

Aos colaboradores do projeto, Andrews Krupinski Emerenciano, Karina Fernandes

Oliveira Rezende, Douglas Amaral dos Santos, Willian Reina Joviano, Beatriz

Moreira Calixto da Cruz e Miriam Zibordi, por todo o auxílio nas coletas em Campos

do Jordão, ajuda com os experimentos, e também pela amizade e bons momentos

proporcionados no desenvolvimento do projeto.

À Emilia Ribeiro, que auxiliou com o projeto, nas coletas em Campos do Jordão, que

sempre me ajudou no laboratório, que sempre esteve disposta a colaborar em tudo,

mas principalmente que se tornou uma grande amiga.

Aos Profs. Francisco Javier Hernandez Blazquez, Patrícia Gama e Renata

Guimarães Moreira, por sua atenção e sugestões no exame de qualificação.

Ao Professor Salvador Arijo da Universidade de Málaga, que me recebeu em seu

laboratório e proporcionou o treinamento de técnicas para o aprimoramento do

trabalho.

Ao Kenio de Gouvêa Cabral e a Quinabra, que forneceram o Biocitro Aqua® para a

realização dos experimentos, colaborando também com o desenvolvimento do

estudo.

A Rosana, Pulga e Lé, que também nos receberam tão bem na estação, que

estavam sempre prontos para nos ajudar, e por sua importante colaboração no

desenvolvimento do projeto, que saibam que sem seu auxílio não seria possível

realizar este projeto.

Ao meu marido Diogo, que contribuiu comigo em todos os sentidos, no

desenvolvimento de meu projeto de doutorado, também no meu próprio

desenvolvimento como pessoa, e que sempre me apoia perante qualquer

dificuldade.

Aos meus pais Ellen Mona e Rogério Franceschelli, por todo seu exemplo, apoio e

inspiração durante minha vida, por contribuírem com minha formação em todos os

sentidos, e por acreditarem em mim.

Aos meus pais José Francisco e Sandra Sanches, por me apoiarem, possibilitarem

minha vinda à São Paulo, onde pude dar início a minha vida acadêmica, e descobrir

que fazer ciência é a minha vida.

Aos meus irmãos, Luiza, Gabriel e Breno, que amo tanto e que me motivam a ser

uma pessoa melhor a cada dia.

A minha família, sou muito grata por ter tantos familiares, por ter tanto amor em

minha vida, sem minha família para me apoiar as vitórias não fariam sentido.

A minha segunda família, a de meu marido, que me acolheu sempre e que já

considero como minha, sem o apoio de vocês nada seria possível.

Aos meus grandes amigos Andrews, Karina, Emília, e Luciana, que merecem

destaque nos agradecimentos, pois foram meus amigos para toda hora, trabalhar

com vocês é o melhor trabalho, fico feliz por ter conhecido pessoas com quem me

identifico tanto.

Aos alunos de iniciação científica Willian, Beatriz e Letícia, que contribuíram muito

para meu crescimento pessoal, e se tornaram meus amigos.

Aos meus colegas do Laboratório de Histofisiologia Evolutiva, pelo suporte e todos

os momentos juntos: Alfonso, Andrews, Camila, Débora, Douglas, Gabriel, João,

Karina, Leandro, Lígia, Luciana, Paola, Paula, Renan, Renata, Ricardo, Tânia e

Yoel, são todas amizades que levarei para vida toda.

Aos meus amigos da veterinária, Juliana, Renann, Fernanda, João, Simone,

Cristiane, Eduardo e Thierry.

Aos professores do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, por

seus ensinamentos em aulas, contribuições e auxílio durante o desenvolvimento do

doutorado.

Aos secretários do Departamento Celiana, Paulo, Eloize e Ana Lúcia, por toda a

ajuda. Em especial à Regina Valbom, por sua atenção, por estar sempre disposta a

ajudar e pelo apoio sempre.

A todos os alunos do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento.

Aos funcionários da biblioteca e a todos os funcionários do ICB.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa

concedida (2010/19284-0).

Enfim, à todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram com o presente

trabalho, MUITO OBRIGADA!

RESUMO

PINTO, J. M. Avaliação de parâmetros imunológicos inatos e morfologia intestinal de trutas arco-íris (Oncorhynchus mykiss, Walbaum 1792), alimentadas com ácido ascórbico e flavonoides após aplicação de glicocorticoide exógeno. 2014. 97 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2014. A criação intensiva dos peixes possui diversos fatores que ocasionam estresse, desde o manejo envolvido nos métodos zootécnicos até alteração de parâmetros de qualidade da água. Os teleósteos submetidos ao estresse apresentam rápido aumento dos níveis de glicocorticoides circulantes, esse desencadeia uma reorganização metabólica, resultando muitas vezes na imunossupressão dos animais. Desta maneira, o estresse deixa os animais suscetíveis a potenciais organismos patogênicos e ao surgimento de doenças. Em pisciculturas os antibióticos são comumente utilizados no controle das enfermidades bacterianas, porém, o seu uso indiscriminado pode provocar a seleção de cepas patogênicas resistentes, criando um ciclo de doenças, que afeta a produtividade da piscicultura. Uma alternativa viável é atuar na prevenção, através do uso de aditivos com ação imunoestimulante. Os flavonoides e o ácido ascórbico (AA) são conhecidos por suas atividades anti-inflamatória, antioxidante e antiestresse; esses ainda foram descritos por atuar sinergicamente nestes processos e na absorção intestinal. Por esta razão, o estudo em questão visou avaliar a influência de um aditivo dietário contendo flavonoides e AA no desempenho, morfologia do intestino e parâmetros de imunidade inata de trutas arco-íris em condições ideais e após aplicação de glicocorticoide exógeno (dexametasona). Para tanto, foram realizados dois experimentos diferentes: 1 - Contendo dois grupos experimentais, o controle (GC) e o aditivo (GA), tratados por noventa dias; 2 - Contendo quatro grupos, controle (GC), aditivo (GA), dexametasona (GD) e aditivo + dexametasona (GAD), por trinta dias. No primeiro experimento o aditivo proporcionou o aumento da altura do epitélio no início do intestino, além da diminuição da densidade de células de muco nos cecos pilóricos, e o aumento no início do intestino. No segundo experimento, o glicocorticoide exógeno causou perda de massa dos animais, e o aditivo compensou este efeito. No intestino, o aditivo (GA) causou a diminuição da altura do epitélio nos cecos pilóricos e início do intestino, e não afetou a densidade de células de muco. O glicocorticoide exógeno causou diminuição da altura do epitélio em todas as porções intestinais, comparado aos grupos que não receberam a aplicação. O aditivo foi diferencial e compensou as alterações intestinais. A densidade de células de muco aumentou nos cecos pilóricos de GAD, e no inicio do intestino de GD. As análises da contagem diferencial de leucócitos mostraram que GAD, teve um aumento no número de neutrófilos. Após a aplicação intraperitoneal de glicogênio de ostra GAD teve um aumento no número de monócitos e neutrófilos, além de não ter tido diminuição do número de linfócitos, como os demais grupos, mantendo números similares aos dos animais que não receberam aplicação do glicogênio de ostra. Os resultados indicam que o uso de ácido ascórbico e flavonoides apresentam vantagens em situações de estresse. Palavras-chave: Aditivos dietários. Nutracêutica. Estresse. Imunoestimulantes. Polifenóis. Fagocitose.

ABSTRACT

PINTO, J. M. Evaluation of innate immune parameters and intestinal morphology of fed ascorbic acid and flavonoids rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum 1792), after exogenous glucocorticoids application. 2014. 97 p. Ph. D. thesis (Science) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2014. The intensive fish culture has several factors that lead to stress, from the handling involved in farming methods to water quality parameters alterations. Teleosts subjected to stress show rapid increase in circulating glucocorticoids levels, this triggers a metabolic reorganization, often resulting in the animal immunosuppression. Therefore, the stress let animals susceptible to potential pathogens and disease emergence. In fish culture, the antibiotics are commonly used to control bacterial diseases, but their indiscriminate use can lead to selection of resistant pathogenic strains, creating a cycle of disease that affects the fish farming productivity. A viable alternative is to work on prevention, through the use of additives with immunostimulant action. Flavonoids and ascorbic acid (AA) are known for their anti-inflammatory, antioxidant and anti-stress activity; also these were reported to act synergistically in these processes, and intestinal absorption. For this reason, the present study aimed to evaluate the influence of a dietary additive containing flavonoids and AA in growth performance, gut morphology and innate immunity parameters in rainbow trouts in ideal conditions and after an exogenous glucocorticoid application (dexamethasone). For assessing these parameters, two different experiments were performed: the first one with two groups control (GC) and the additive (GA), for ninety days, and the second one with four groups, control (GC), additive (GA), dexamethasone (GD) and additive + dexamethasone (GAD) lasting thirty ninety days. In the first experiment, the additive increased epithelial height at the initial intestine, in addition to decreased mucus cell density of the pyloric caeca, and the increase in the initial intestine. In the second experiment, the exogenous glucocorticoid caused animal weight loss, and the additive did compensate this effect. In the intestine, the additive (GA) decreased epithelial height in pyloric caeca and initial intestine, mucus cell density was not affected. The exogenous glucocorticoid caused epithelial height decrease in all intestinal portions compared to groups that did not receive the application. The additive was differential and to compensate intestinal disorders. The mucus cells density increased in GAD pyloric caeca and GD initial intestine. The analysis of the differential leukocyte counts showed that GAD had an increase in the number of neutrophil. After intraperitoneal application of glycogen oyster, GAD had an increase in the number of monocytes and neutrophil, and showed no decrease in the number of lymphocytes, like other groups, maintaining similar values of the animals that did not received glycogen oyster application. The results indicate that the use of ascorbic acid and flavonoids has advantages in stress situations. Keywords: Food Additives. Nutraceutical. Stress. Immunostimulant. Polyphenols. Phagocytosis.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Unidades produtivas de trutas no Brasil em 2008. Exibido

em verde as unidades produtivas de truta. As áreas claras

mostram os municípios onde não foi feito recenseamento.

Fonte: Censo Aquícola Nacional – 2008 (BRASIL, 2013)....... 26

Figura 2 – Órgãos endócrinos e reação ao estresse em peixes.

Hormônio Adrenocorticotrófico (ACTH); Hormônio

melanotrófico (MSH); Hormônio Concentrador de Melanina

(MCH). Modificado de Ross; Ross (2008)............................... 29

Figura 3 – O sistema imune dos teleósteos. A primeira barreira

imunológica é a física, representada pelo muco presente na

pele, que ainda possui componentes humorais,

complemento, lisozima e proteína C reativa. A segunda

barreira é representada pelas células fagocíticas,

monócitos/macrófagos e neutrófilos, que são produzidos no

rim cefálico e estão presentes no peritônio, sangue, baço e

rim. A comunicação entre sistema imune inato e adquirido

ocorre pelas células apresentadoras de antígenos (APC),

que possuem complexo principal de histocompatibilidade

(MHC), esses induzem a maturação dos linfócitos B e T em

células produtoras de antígenos, criando a memória

imunológica. Antígeno (Ag); Imunoglobulina M de superfície

(sIgM); Interleucina (IL); Linfócito T helper.............................. 33

Figura 4 – Núcleo básico dos flavonoides................................................ 36

Figura 5 – Anestesia e medidas de O. mykiss. A) O. mykiss sob efeito

do anestésico, animais apresentam diminuição de batimento

opercular e perda de equilíbrio. B) Medidas de comprimento

total; C) e comprimento padrão dos animais........................... 43

Figura 6 – Fluxograma dos experimentos................................................ 44

Figura 7 – Morfologia do trato intestinal de O. mykiss. A) Vista ventral

mostrando o trato gastrointestinal de O. mykiss, Estômago

(E), Intestino anterior (IA) e posterior (IP). Porções

coletadas para análises histológicas: Cecos pilóricos (CP);

porção inicial do intestino (seta); porção média do intestino

(cabeça de seta vazia); porção final do intestino (cabeça de

seta). B) Fotomicrografias de corte histológico da porção

média do intestino, moléculas de ferritina aparecem em

azul, coloração de Perls. C) Porção média do intestino,

Células caliciformes (cc); epitélio (e); Lamina própria (lp);

linfócito intraepitelial (li); vacúolos absortivos (va);

leucócitos associados ao intestino (seta vazia); medida de

altura do epitélio (em vermelho), coloração de HE. D)

Porção inicial do intestino mostrando células de muco,

histoquímica de PAS.............................................................

48

Figura 8 – Ensaios de fagocitose in vitro. A) Injeção intraperitoneal de

solução fisiológica contendo 1% de glicogênio de ostra. B)

Fotomicrografia de lamina de teste de fagocitose corada

com Rosenfeld, mostrando macrófagos em microscopia de

campo claro; C) Mesmo campo fotografado em microscopia

de fase. Levedura internalizada (cabeça de seta) e levedura

não fagocitada (seta). Barra equivale a 10µm......................... 51

Figura 9 – Esfregaços sanguíneos de O. mykiss. A) Eritrócitos

nucleados, seta mostra os linfócitos. B) Seta mostra

neutrófilo. C) Seta mostra monócito Coloração de HE............ 53

Figura 10 – Parâmetros de desempenho de O. mykiss durante os 90

dias de experimento. Barras mostram média ± DP. Não

houve diferença significativa entre os grupos (p>0,05)........... 56

Figura 11 – Análise comparativa da altura do epitélio intestinal das

diferentes porções do intestino de O. mykiss. A) Cecos

pilóricos; B) Porção inicial; C) Porção média; D) Porção final

do intestino; E) Altura do epitélio das quatro porções

intestinais, com linha de tendência (polinômio de três fases).

Cecos pilóricos (CP), porção inicial (Ii), porção média (IM),

porção final do intestino (IF). Barras mostram média ± DP,

valores expressos em µm. (*) = p<0,05...................................

58

Figura 12 – Análise comparativa da densidade de células de muco nas

diferentes porções intestinais de O. mykiss. A) Cecos

pilóricos; B) Porção inicial; C) Porção média; D) Porção final

do intestino; E) Densidade de células de muco das quatro

porções intestinais, com linha de tendência (polinômio de

três fases). Cecos pilóricos (CP), porção inicial (Ii), porção

média (IM), porção final do intestino (IF). Barras mostram

média ± DP, valores expressos em número de células por

mm2. (*) = p<0,05....................................................................

59

Figura 13 – Avaliação ultraestrutural do intestino de O. mykiss. Ambos

os grupos mostraram morfologia similar. A) GC 4000x. B)

GC 15000x. C) GA 7500x. D) GA 20000x. E) GA 7500x. F)

GA 20000x. A, C) Os enterócitos apresentam a cutícula

estriada característica deste epitélio, abundância de

mitocôndrias, uma faixa bem definida, com ausência de

organelas logo abaixo à projeção das microvilosidades. B,

D) Presença de junções celulares bem definidas. E)

Granulócitos da submucosa apresentam características

típicas. F) Mitocôndrias com cristas evidentes comprovam a

integridade da fixação do material examinado........................ 60

Figura 14 – Análises comparativa da atividade fagocítica de macrófagos,

de O. mykiss dos dois grupos, aos 90 dias de experimento.

A) Índice fagocítico; B) Capacidade fagocítica; C)

Capacidade fagocítica X índice fagocítico (CF X IF). Barras

mostram média ± DP. Não houve diferença significativa

entre os grupos (p>0,05)......................................................... 61

Figura 15 – Contagem diferencial de leucócitos em extensões

sanguíneas de O. mykiss. Barras mostram média ± DP,

valores expressos em unidades. Letras mostram diferença

entre os grupos (p<0,05)......................................................... 62

Figura 16 – Parâmetros de desempenho de O. mykiss, dos quatro

grupos experimentais, aos 30 dias de experimento. Barras

mostram média ± DP. Letras mostram diferença entre os

grupos (p<0,05).......................................................................

64

Figura 17 – Comparação do ganho de massa dos grupos GD e GAD. A)

Ganho de massa aos 24 dias de experimento; B) Massa

durante os sete dias de aplicação de dexametasona C)

Ganho de massa durante os sete dias de aplicação de

dexametasona. Barras mostram média ± DP. (*)= p<0,05...... 65

Figura 18 – Análise comparativa da altura do epitélio intestinal das

diferentes porções do intestino de O. mykiss. A) Cecos

pilóricos; B) Porção inicial; C) Porção média; D) Porção final

do intestino; E) Altura do epitélio das quatro porções

intestinais, com linha de tendência (polinômio de três fases).

Cecos pilóricos (CP), porção inicial (Ii), porção média (IM),

porção final do intestino (IF). Barras mostram média ± DP,

valores expressos em µm. Letras mostram diferença entre

os grupos (p<0,05)..................................................................

66

Figura 19 – Análise comparativa da densidade de células de muco nas

diferentes porções intestinais de O. mykiss. A) Cecos

pilóricos; B) Porção inicial; C) Porção média; D) Porção final

do intestino; E) Densidade de células de muco das quatro

porções intestinais, com linha de tendência (polinômio de

três fases). Cecos pilóricos (CP), porção inicial (Ii), porção

média (IM), porção final do intestino (IF). Barras mostram

média ± DP, valores expressos em células por mm2. Letras

mostram diferença entre os grupos (p<0,05).......................... 68

Figura 20 – Avaliação ultraestrutural do intestino de O. mykiss. Os

grupos mostraram morfologia intestinal similar, os

enterócitos apresentam a cutícula estriada característica,

abundância de mitocôndrias, uma faixa bem definida, com

ausência de organelas logo abaixo à projeção das

microvilosidades, presença de junções celulares (C) bem

definidas. A) GAD, 1000x. B) GC, 1000x. C) GD, 10000x.

D) Fibras colágenas do estrato compacto, 15000x. E)

Granulócitos eosinófilos da submucosa do GC, 2000x. F)

Granulócitos eosinófilos da submucosa do GD com

morfologia indicativa de degranulação, 2500x........................

69

Figura 21 – Análises comparativa da atividade fagocítica de O. mykiss.

A) Índice fagocítico; B) Capacidade fagocítica; C)

Capacidade fagocítica X índice fagocítico. (CF X IF). Barras

mostram média ± DP. Não houve diferença significativa

entre os grupos (p>0,05)......................................................... 70

Figura 22 – Contagem diferencial de leucócitos em extensões

sanguíneas de O. mykiss. Barras mostram média ± DP,

valores expressos em unidades. Letras mostram diferença

entre grupos (p<0,05).............................................................. 71

Figura 23 – Atividade de lisozima das amostras de soro sanguíneo dos

quatro grupos experimentais. Diluição ¼, leitura em 570nm.

Linhas mostram média ± DP, valores expressos em U. Não

houve diferença significativa entre os grupos

(p>0,05)...................................................................................

72

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Massa corpórea e medidas de O. mykiss, durante os 90

dias de experimento. Valores expressos em média ± DP.

Massa em gramas (M); Comprimento total em cm (CT);

comprimento padrão em cm (CP)............................................ 55

Tabela 2 – Ferritina presente no tecido intestinal. Valores referentes à

porcentagem de ferritina presente na área do tecido, em

relação ao total de área de tecido fotografados...................... 57

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

µm – Micrômetros

ºC – Graus centígrados

AA – Ácido ascórbico

ACTH – Hormônio Adrenocorticotrófico

Ag – Antígeno

APC – Células apresentadoras de antígenos

cc – Células caliciformes

CDL – Contagem diferencial de leucócitos

CEUA – Comissão de ética no uso de animais

CF – Capacidade fagocítica

CO2 – Dióxido de carbono

CP – Cecos pilóricos

CP – Comprimento padrão

CT – Comprimento total

D – Dias de experimento

DP – Desvio padrão

e – Epitélio

ec – Estrato compacto

E – Estômago

FAO – Food and Agriculture Organization of the United Nations

FBS – Soro fetal bovino

FGF – Fator de crescimento de fibroblastos

G – Força gravitacional

g – Grama

GA – Grupo Aditivo

GAD – Grupo Aditivo Dexametasona

GALT – Tecido linfoide associados ao intestino

GC – Grupo Controle

GD – Grupo Dexametasona

GP – Ganho de peso

HE – Hematoxilina & Eosina

HHI – Hipotálamo-hipófise-interrenal

IA – Intestino anterior

If – Índice fagocítico

IF – Intestino final

IgM – Imunoglobulina de classe M

IHS – Índice hepatossomático

IL - Interleucina

IM – Intestino médio

IP – Intestino posterior

K – Fator de condição

Kg – Kilograma

li – Linfócito intraepitelial

lp – Lâmina própria

M – Molar

M(g) – Massa

Mɸ - Macrófago

MCH – Hormônio Concentrador de Melanina

MET – Microscopia eletrônica de transmissão

mg – Miligramas

mg/L – Miligrama por litro

MHC – Complexo principal de histocompatibilidade

min – Minutos

mL – Mililitro

mm3 – Milímetros cúbicos

MSH – Hormônio melanotrófico

NK – Linfócito natural killer

nm – Nanômetro

OsO4 – Tetróxido de ósmio

PAS – Periodic acid shiff

PBS – Tampão fosfato-salino

pH – Potencial Hidrogeniônico

ppm – Partes por milhão

qsp – Quantidade suficiente para

RC – Rendimento de carcaça

S – Sobrevivência

SBCAL – Sociedade Brasileira de Ciências de Animais de Laboratório

sIgM – Imunoglobulina M de superfície

t – Tonelada

Tc-cell – Linfócito T citotóxico

TCE – Taxa de crescimento específico

Th-cell – Linfócito T helper

U – Unidade de lisozima

va – Vacúolos absortivos

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 22

2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................................... 25

2.1 O modelo experimental................................................................................. 25

2.2 Efeitos do estresse no desempenho animal............................................... 27

2.3 O sistema imune inespecífico dos teleósteos............................................ 30

2.4 O trato intestinal dos salmonídeos............................................................. 34

2.5 Porque usar imunoestimulantes em pisciculturas..................................... 34

2.6 Os flavonoides e suas ações....................................................................... 35

2.7 O acido ascórbico e suas ações.................................................................. 37

2.8 Sinergismo entre flavonoides e acido ascórbico....................................... 38

3 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................... 39

3.1 Manutenção.................................................................................................... 39

3.2 Experimento 1................................................................................................ 40

3.3 Experimento 2................................................................................................ 41

3.4 Avaliação dos parâmetros zootécnicos....................................................... 42

3.5 Avaliação do trato digestório........................................................................ 45

3.5.1 Microscopia de luz...................................................................................... 45

3.5.2 Microscopia eletrônica de transmissão (MET)......................................... 45

3.5.3 Absorção de macromoléculas................................................................... 46

3.5.4 Altura do epitélio absortivo........................................................................ 46

3.5.5 Densidade de células de muco.................................................................. 47

3.6 Avaliação do sistema imune inespecífico................................................... 49

3.6.1 Avaliação de fagocitose in vitro................................................................ 49

3.6.2 Contagem diferencial de leucócitos.......................................................... 52

3.6.3 Atividade de lisozima.................................................................................. 54

3.7 Análises estatísticas....................................................................................... 54

4 RESULTADOS.................................................................................................... 55

4.1 Experimento 1................................................................................................ 55

4.1.1 Avaliação dos parâmetros zootécnicos.................................................... 55

4.1.2 Avaliação do trato digestório..................................................................... 57

4.1.2.1 Absorção de macromoléculas.................................................................... 57

4.1.2.2 Altura do epitélio absortivo......................................................................... 58

4.1.2.3 Densidade de células de muco.................................................................. 59

4.1.2.4 Avaliação ultraestrutural............................................................................. 60

4.1.3 Avaliação do sistema imune inespecífico................................................ 61

4.1.3.1 Avaliação de fagocitose in vitro.................................................................. 61

4.1.3.2 Contagem diferencial de leucócitos........................................................... 62

4.2 Experimento 2................................................................................................ 63

4.2.1 Avaliação dos parâmetros zootécnicos.................................................... 63

4.2.2 Avaliação do trato digestório..................................................................... 65

4.2.2.1 Altura do epitélio absortivo......................................................................... 65

4.2.2.2 Densidade de células de muco.................................................................. 67

4.2.2.3 Avaliação ultraestrutural............................................................................. 69

4.2.3 Avaliação do sistema imune inespecífico................................................ 70

4.2.3.1 Avaliação de fagocitose in vitro.................................................................. 70

4.2.3.2 Contagem diferencial de leucócitos........................................................... 70

4.2.3.3 Atividade de lisozima................................................................................. 72

5 DISCUSSÃO....................................................................................................... 73

6 CONCLUSÃO..................................................................................................... 83

REFERENCIAS...................................................................................................... 84

P á g i n a | 22

1 INTRODUÇÃO

A ocorrência de doenças em piscicultura é consequência de diversos fatores

envolvidos nos métodos zootécnicos da criação e de variações nas condições

ambientais, como por exemplo, as mudanças das condições adequadas de

concentração de oxigênio dissolvido, pH, temperatura, salinidade, ainda pode

ocorrer o aumento de concentrações de amônia, ou de CO2, bem como a presença

de poluentes na água e o próprio manejo zootécnico empregado, que

frequentemente envolve a captura e transporte dos animais, adicionalmente pode

haver elevada densidade populacional. Essas são algumas das características

zootécnicas que fazem parte da ampla variedade de situações capazes de induzir o

estresse em peixes (ALKAHEM, 1994; ALMAZÁN-RUEDA; SCHARMA; VERRETH,

2004; KRASNOV et al., 2005; PETRELL; ANG, 2001; SMART, 1981;

WEDEMEYER,1969; YADAV; AKELA, 1993). A severidade do estresse varia com o

tipo, intensidade e o tempo de duração do fator estressante e ainda da espécie de

peixe considerada (STOSKOPF, 1993; WOO; BRUNO, 1998).

Os peixes teleósteos submetidos ao estresse apresentam aumento dos níveis

sanguíneos de corticosteroides, seguido pela redução do número de linfócitos

circulantes, e de reorganização metabólica, que acarretam prejuízos em algumas

funções, em especial, as imunológicas, o que resulta na imunossupressão dos

animais (TORT, 2011; WENDELAAR BONGA, 1997). Os corticosteroides participam

na regulação do equilíbrio hidromineral, metabolismo energético, imunidade e

capacidade reprodutiva dos animais. Em termos de respostas imunológicas e

inflamatórias, traços característicos do estresse são: a redução do tamanho do timo,

do baço e de outras estruturas linfáticas, mudanças no número e distribuição dos

leucócitos, assim como de suas atividades no organismo, além do aparecimento de

hemorragias e de úlceras no canal alimentar (TORT, 2011; WENDELAAR BONGA,

1997). Desta forma, a criação intensiva de peixes pode, através do estresse, afetar a

homeostase tornando-os mais suscetíveis à potenciais organismos patogênicos

(PAVANELLI; EIRAS; TAKEMOTO, 1998). A dexametasona é um glicocorticoide

sintético, que apresenta uma potente ação anti-inflamatória, podendo ser utilizada

para mimetizar o efeito do estresse nos animais, sem alterar outros parâmetros,

como os de qualidade de água e/ou densidade populacional (KHOR; SOGA;

PARHAR, 2013; LE et al., 2005; POTTINGER, 1990).

P á g i n a | 23

Para o controle das enfermidades bacterianas, os antibióticos são comumente

utilizados, porém, o uso inapropriado desses quimioterápicos pode provocar a

seleção de algumas cepas patogênicas resistentes, além de ser fonte de poluição

ambiental. Na Europa, desde 2006, baniu-se completamente o uso de antibióticos,

como aditivos dietários em pecuária, devido aos riscos de gerar uma microbiota

resistente aos antibióticos utilizados em terapias humanas e animais. Visando

mitigar o uso de antibióticos no tratamento de doenças, temos a implementação da

ração com aditivos fitogênicos, incluindo-se aqui os flavonoides e

imunoestimulantes, como o acido ascórbico (BOYD; MASSAUT, 1999; PLANAS;

CUNHAS; MUNILLA, 1995; CLARKE, 2006; WINDISCH et al., 2008).

Os flavonoides são pigmentos biológicos naturais, responsáveis pelas

atrativas cores presentes nas frutas, flores e folhas dos vegetais, estão presentes

também nas sementes, cascas de árvores, raízes, talos, e em seus subprodutos,

tais como chás e vinhos. Os flavonoides representam um dos grupos fenólicos mais

importantes e diversificados entre os produtos de origem natural, e mais de cinco mil

já foram identificados e classificados (BEECHER, 2003; HAVSTEEN, 2002;

NARAYANA et al., 2001; NIJVELDT et al., 2001; SIMÕES et al., 2004). Suas

atividades estão principalmente relacionadas aos efeitos antioxidantes, anti-

inflamatórios e antitumorais (CAZAROLLI et al., 2008; HAVSTEEN, 2002). Em

humanos são tratados como nutracêuticos, e na aquicultura, vêm sendo aplicados

para incrementar a imunidade e aumentar a resistência às doenças (TRICHET,

2010). Outra atividade conhecida é a inibição de inflamações crônicas em diferentes

modelos animais, alguns dos mecanismos responsáveis por suas ações estão

ligados à atividade antioxidante e de eliminação de radicais livres (KIM et al., 2004).

Diversos flavonoides afetam especificamente a função de enzimas envolvidas em

processos inflamatórios (HUNTER, 1995), tornou-se evidente que estas enzimas

estão intimamente envolvidas na transdução de sinais e processos de ativação

celular envolvendo células do sistema imune (MIDDLETON; KANDASWAMI;

THEOHARIDES, 2000).

O ácido ascórbico (AA) é essencial para a síntese de colágeno, formação

óssea, hematopoiese, maturação de eritrócitos, manutenção da hemoglobina no

sangue, utilização do ferro, detoxificação de compostos, bem como para uma série

de funções metabólicas, incluindo-se aqui atuações como parte do sistema

antioxidante e imunoestimulante em peixes (HURST; BARRETTE, 1989; LALL,

P á g i n a | 24

2000; NAVARRE; HALVER, 1989).

O AA também tem sido apresentado como capaz de amenizar os impactos

negativos em peixes, causado pela contaminação da água e por estresse induzido

por manejo em peixes saudáveis, modulando a resistência dos mesmos às doenças.

A associação do AA com flavonoides, apresenta uma atuação sinérgica,

amplificando a imunidade entérica, tanto pelo aumento da fagocitose por células

imunes, como pela eficiência dos capilares intestinais, envolvidos no processo de

absorção de nutrientes (BATISTA, 2005; LALL, 2000).

Devido aos conhecidos efeitos benéficos dos flavonoides e AA, hipotetizou-se

que estes, administrados oralmente, poderiam auxiliar a resposta imune intestinal e

ainda influenciar parâmetros de desempenho e imunidade inata das trutas arco-íris

(Oncorhynchus mykiss). Para tanto, o estudo em questão visou avaliar o efeito da

administração oral destes no desempenho zootécnico, parâmetros do sistema imune

inespecífico e trato digestório de juvenis de trutas arco-íris, a curto (30 dias) e longo

(90 dias) prazo; sob condições de manutenção adequadas e após aplicação de

glicocorticoide exógeno. Sendo assim, esses dados são de extrema relevância para

a melhor compreensão do efeito do uso destes agentes como aditivos dietários em

pisciculturas.

P á g i n a | 25

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 O modelo experimental

A truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) é um peixe teleósteo, da família

Salmonídae, sua carne possui excelentes qualidades nutricionais, é fonte de

vitaminas, sais minerais e Ômega 3 (AGREN et al, 1988; CHEN et al., 2006). A truta

arco-íris foi incorporada a técnica da piscicultura, sendo uma das espécies mais

antigas a ser cultivada na indústria aquícola mundial. Sua distribuição natural se

estende do sul do Alasca até o norte do México e devido as suas boas

características, tanto para aquicultura quanto para a pesca esportiva, encontra-se

amplamente distribuída em todas as águas frias do mundo, exceto no continente

Antártico (FAO, 1988; SCHMIDT, 2000).

Segundo dados do documento “The state of world fisheries and aquaculture

2012”, produzido pela Food and Agriculture Organization of the United Nations

(FAO), as trutas arco-íris são a terceira espécie de peixe diádromos – que ao longo

do ciclo de vida migram entre água doce e salgada – mais produzidos no mundo,

estando atrás apenas do salmão do Atlântico (Salmo salar) e do peixe-leite (Chano

chanos) (FAO, 2012). Estes dados demonstram a relevância de estudos com a

espécie, que visem contribuir com o melhoramento da produtividade das

pisciculturas.

No Brasil, a espécie foi introduzida por volta de 1949, por iniciativa do

Ministério da Agricultura, com objetivo de povoar os rios das regiões serranas do

Sudeste brasileiro, pobres em fauna aquática nativa. No entanto, somente em 1974

que a truticultura comercial começou no Brasil, por iniciativa do empresário Evaristo

Comolatti e participação do técnico Kiyoshi Koike, em Campos de Jordão (DIAS,

1996; FARIA, 19711 apud SATO, 2011). No último Censo Aquícola Nacional

realizado em 2008, foram recenseadas 91 unidades produtivas de truta, sendo

destas, 53% na região Sul e 47% na Sudeste (Figura 1). Em relação à produção

nacional, segundo o último Boletim estatístico da pesca e aquicultura, 3.277,2 t de

pescado de truta foram produzidas em 2011 (BRASIL, 2011).

1 FARIA, A. Aclimatação da truta arco-íris no Brasil. Revista Nacional da Pesca, v. 13, n. 106, p. 14-15, jul,

1971.

P á g i n a | 26

Figura 1 – Unidades produtivas de trutas no Brasil em 2008.

Exibido em verde as unidades produtivas de truta. As áreas claras mostram os municípios onde não foi feito recenseamento. Fonte: Censo Aquícola Nacional – 2008 (BRASIL, 2013).

Segundo a FAO (2012), 60% dos peixes consumidos no mundo ainda são

provenientes da pesca. Considerando-se que a pesca é um recurso natural limitado,

os estudos que beneficiem o desenvolvimento da piscicultura, particularmente, da

truticultura, são relevantes não somente do aspecto econômico, mas também para a

sustentabilidade ambiental. Ainda levando em consideração à importância científica,

a truta arco-íris é considerada um bom modelo alternativo para estudos (BAILEY;

WILLIAMS; HENDRICKS, 1996). A truta arco-íris surge como importante espécie

para estudos, pois há ampla informação disponível na literatura especializada,

iniciando na década de 40 (WALD, 1941), sendo assim sua fisiologia é

extensivamente conhecida (DEMERS; BAYNE, 1997).

P á g i n a | 27

2.2 Efeitos do estresse no desempenho animal

A ocorrência de doenças em piscicultura é consequência direta de diversos

fatores envolvidos nos métodos zootécnicos de criação e/ou de variações nas

condições ambientais. Mudanças nas condições adequadas da água como

concentração de oxigênio dissolvido, pH, temperatura, salinidade, concentrações de

amônia e de CO2, presença de poluentes, bem como no manejo zootécnico,

principalmente em relação à densidade populacional, captura e transporte, fazem

parte da ampla variedade de situações capazes de induzir estresse em peixes

(ALKAHEM, 1994; ALMAZÁN-RUEDA; SCHARMA; VERRETH, 2004; KRASNOV et

al., 2005; PETRELL; ANG, 2001; SMART, 1981; WEDEMEYER, 1969; YADAV;

AKELA, 1993). Na presença de um estressor, uma reorganização metabólica é

induzida na tentativa de retornar a homeostase. A resposta de luta ou fuga,

associada à ativação do sistema nervoso simpático, envolve alteração de vários

sistemas e órgãos sensoriais: aumento da percepção, mudança das funções

cardiovasculares e o status dos sistemas efetores de imunidade inata. Estresses

agudos, mas suficientes para provocar a resposta de luta ou fuga, nem sempre têm

consequências fisiológicas negativas (DEMERS; BAYNE, 1997; KIECOLT-GLASER

et al., 1992). O problema ocorre quando os estressores são diversos ou crônicos,

fazendo com que o organismo estafe sua reservas metabólicas, impedindo assim

que este retorne a homeostase, isso afeta a eficiência de diversas funções,

retardando o crescimento, alterando a osmorregulação, afetando o processo

reprodutivo, e principalmente impactando o sistema imune. Assim, o estresse agudo

pode melhorar componentes imune inatos e humorais, enquanto que o estresse

crônico geralmente causa a imunossupressão (DEMERS; BAYNE, 1997). Desta

forma, o estresse crônico ocasiona comprometimento da defesa imunológica e

consequentemente, resulta em uma menor resistência a patógenos (SCHRECK,

2010; TAKAHASHI; SAKAMOTO, 2013; TORT, 2011).

Os peixes respondem ao estresse através do aumento de catelcolaminas e

dos níveis de cortisol, que é o principal corticosteroide em peixes e humanos. O

cortisol regula diversos sistemas, como o metabolismo de glicose, função

osmorregulatória, comportamento e ainda parâmetros de imunidade. Em teleósteos,

o cortisol é sintetizado e secretado pelas células esteroidogênicas, presentes no

tecido inter-renal, que são intercaladas por células cromafins, que sintetizam

P á g i n a | 28

adrenalina. Desta forma, o tecido interrenal é análogo ao córtex adrenal de

mamíferos. Aa resposta ao estresse em peixes ocorre pelo eixo hipotálamo-hipófise-

interrenal (HHI) (ALSOP; VIJAYAN, 2009a,b, 2008; GRASSI-MILANO; BASARI;

CHIMENTI, 1997; RAMSAY et al., 2009; WENDELAAR BONGA, 1997). A figura 2A

mostra os órgãos e tecidos endócrinos envolvidos na resposta ao estresse. Na figura

2B é apresentado um esquema da sequência da resposta ao estresse em peixes,

com suas vias alternativas de controle.

Em termos de respostas imunitárias e inflamatórias, traços característicos do

estresse são a retração do timo, do baço ou outras estruturas linfáticas no corpo;

mudanças no número e distribuição dos leucócitos no organismo; ou aparecimento

de hemorragias ou úlceras no canal alimentar (TORT, 2011). Outros efeitos também

encontrados em animais sob estresse são alterações intestinais como: função dos

enterócitos prejudicada; dano dos complexos juncionais devido à dissociação de

desmossomos e nexus (RINGØ et al., 2014), que são estruturas responsáveis pela

coesão e comunicação das células do tecido (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2010).

Uma vez que o intestino esteja comprometido, o processo digestório e a

absorção de nutrientes serão afetados. Além disso, já que o intestino constitui uma

das maiores portas de entrada para patógenos, alterações deste tipo poderiam

facilitar a entrada de patógenos oportunistas na circulação, o que, associado aos

efeitos imunossupressores ocasionados pelo estresse, facilita em muito o

estabelecimento de doenças. Estes fatores, em conjunto, acarretam perdas

significativas para a produção em pisciculturas, deixando clara a importância dos

estudos voltados para o uso de imunoestimulantes e aditivos dietários, que podem

auxiliar a diminuir os impactos ocasionados pelo estresse.

A dexametasona é um glicocorticoide sintético, que apresenta uma potente

ação anti-inflamatória, esta pode ser utilizada para mimetizar o efeito do estresse

nos animais, sem alterar outros parâmetros de qualidade de água e/ou densidade

populacional (KHOR; SOGA; PARHAR, 2013; LEATHERLAND, 1987; LE et al.,

2005; POTTINGER, 1990). Ainda, a aplicação de glicocorticoide exógeno

(dexametasona) permite uma padronização do estudo, já que em peixes a resposta

ao estresse apresenta variações individuais (POTTINGER; MORAN; MORGAN,

1994; POTTINGER; PICKERING; HURLEY, 1992; POTTINGER; CARRICK, 1999;

WEIL; BARRY; MALISON, 2001).

P á g i n a | 29

Figura 2 – Órgãos endócrinos e reação ao estresse em peixes.

Hormônio Adrenocorticotrófico (ACTH); Hormônio melanotrófico (MSH); Hormônio Concentrador de Melanina (MCH). Modificado de Ross; Ross (2008).

Tireoide

Hormônio do Crescimento

Tecido Interrenal Cortisol

Cortisona Aldosterona

Tecido Cromafim Adrenalina

Noradrenalina

Hipotálamo – Hipófise

ACTH

Prolactina

Hormônio do Crescimento

Hormônio Tireotrófico

Hormônio Gonadotrófico

MSH e MCH

Gônadas Hormônios Sexuais

Sistema Nervoso Central

Resposta Motora Nervo-

Mediada

Liberação de Outros

Hormônios

Estressor Externo Atuando Sobre

Receptores Primários

Células Inter-renais Liberam Hormônios

Esteróides

Tecido Cromafim Liberam

Catecolaminas

Hipotálamo-Hipófise

Liberam ACTH

Resposta do Animal

Distribuição Via Circulação Sanguínea

A

B

P á g i n a | 30

2.3 O sistema imune inespecífico dos teleósteos

Existem em torno de 28 mil espécies diferentes de peixes, fazendo deste o

maior grupo em número e diversidade dentre os vertebrados. Os peixes são

tradicionalmente divididos nos grupos Osteichthyes, que compreende os peixes

ósseos; Chondrichthyes, que são os peixes cartilaginosos como tubarões e raias; e

grupos Agnatha e Cyclostomata de peixes sem maxilas, como as lampreias

(NELSON, 2006).

A imunologia apresenta variações especificas inerente a cada classe, no

entanto similaridades existem. Diversas características imunológicas dos peixes

foram preservadas até aos grupos mais recentes, como por exemplo os mamíferos

(ZAPATA; CHIBA; VARAS, 1996). Por esta razão, a descrição referente a

imunologia será abordada com enfoque na infraclasse teleostei, neste grupo,

integram-se a maioria dos peixes comuns e formas mais derivadas, incluindo-se aqui

a família das trutas e salmonídeos e utilizaremos a comparação com os mamíferos

para melhor elucidar a imunologia dos peixes.

O sistema imune pode ser classificado do ponto de vista funcional em duas

classes: o sistema imune inato, inespecífico ou natural; e o sistema imune

adaptativo, específico ou adquirido. Como nos mamíferos, os peixes possuem

mecanismos de defesa inespecíficos e os específicos. Este último requer longo

período de tempo para a síntese de anticorpos e ativação de células específicas,

principalmente devido a natureza ectotérmica dos peixes. Assim, em peixes, o

sistema imune inespecífico é de principal importância para combater as infecções

(ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2010; ANDERSON; JENEY, 1992; MAGNADÓTTIR,

2006).

O sistema inato atua como primeira linha de defesa do organismo contra a

presença de um agente patógeno e no controle de muitas infecções sem recorrer ao

sistema específico, ou seja, ele não tem memória imunológica. Os mecanismos de

defesa inespecíficos são representados basicamente pela inflamação local, cuja

principal característica é o acúmulo de leucócitos no tecido invadido. Desta forma, o

organismo tenta eliminar o agente agressor via fagocitose e/ou secreção de enzimas

líticas, ou isola-lo por meio de uma barreira de leucócitos e tecido conjuntivo

(ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2010; GARCIA-LEME, 1989; LEVRAUD; BOUDINOT,

2009; MAGNADÓTTIR, 2006).

P á g i n a | 31

O sistema imune inespecífico é constituído por parâmetros físicos, humorais e

celulares. Os parâmetros físicos são as escamas, e a superfície mucosa que recobre

a pele, brânquias e epitélio gastrointestinal. O muco além de constituir uma barreira

física, ainda apresenta uma série de fatores, que possibilitam o combate de

substâncias estranhas de maneira inespecífica.

Os parâmetros humorais existentes nos peixes são proteínas solúveis como

lisozima, interferons e complemento. A lisozima é uma enzima hidrolítica encontrada

em secreções mucosas, que é capaz de clivar a camada de peptidoglicano da

parede celular bacteriana. Os interferons são um grupo de proteínas produzidas por

células infectadas por vírus, que têm a capacidade de se ligar as células vizinhas e

induzir um estado antiviral generalizado. Complemento é um grupo de proteínas

séricas que circulam num estado inativo. Uma variedade de mecanismos

imunológicos específicos e não específicos pode converter as formas inativas de

proteínas de complemento para um estado ativo, com a capacidade de danificar as

membranas dos organismos patogénicos, ou destruí-los ou de facilitar a sua ruptura

(MAGNADÓTTIR, 2006). Adicionalmente os peixes possuem parâmetros humorais

como a transferrina, que é um inibidor do crescimento bacteriano, atua como

quelante de ferro disponível, essencial para a manutenção bacteriana; Inibidores de

protease, realizam a defesa contra patógenos, que secretam enzimas proteolíticas;

Enzimas líticas, agindo individualmente ou em uma cascata, são elementos

importantes de defesa especialmente contra bactérias; Aglutininas como pentraxinas

e lectinas também estão presentes no soro e muco, possuem especificidade de

ligação para diferentes carboidratos como manose, N-acetil glucosamina ou fucose

(MAGNADÓTTIR, 2006). A interação destas proteínas com os carboidratos conduz a

opsonização, fagocitose e ativação do sistema complemento. Uma variedade de

tipos de leucócitos está envolvida nas defesas celulares não específicas do peixe,

incluindo monócitos/macrófagos, granulócitos e células citotóxicas não específicas e

ainda, células dendríticas e epiteliais (MAGNADÓTTIR, 2006; SECOMBES, 1996).

A classificação dos leucócitos e demais células sanguíneas dos peixes foi

baseada na sua semelhança morfológica com as células dos mamíferos, por esta

razão seus nomes são os mesmos, mas algumas funções são diferenciadas

(AINSWORTH, 1992). As células sanguíneas dos peixes incluem os eritrócitos,

leucócitos e células hemostáticas. Existem algumas diferenças consideráveis entre

elas: assim como na maioria dos vertebrados não mamíferos, os eritrócitos dos

P á g i n a | 32

peixes são nucleados e ovais; ao invés de plaquetas, os peixes possuem

trombócitos nucleados (CLAVER; QUAGLIA, 2009).

Os leucócitos de forma geral podem ser classificados como granulócitos ou

polimorfonucleares e os agranulócitos. Os granulócitos possuem um núcleo irregular

e grânulos envoltos por membrana, estes distinguem-se em três tipos: neutrófilos,

eosinófilos e basófilos. Os agranulócitos possuem uma forma mais regular e seu

citoplasma não possui granulações específicas, distinguem-se em dois tipos: os

linfócitos e os monócitos (CLAVER; QUAGLIA, 2009; JUNQUEIRA; CARNEIRO,

2010).

Em relação aos peixes os leucócitos presentes são: linfócitos B, T e natural

killer (NK), neutrófilos, eosinófilos, além de monócitos/macrófagos e

melanomacrófagos (AFONSO; ELLIS; SILVA, 1997; CLAVER; QUAGLIA, 2009;

HINE, 1992). Os neutrófilos dos peixes possuem uma variedade de formas, estes

podem apresentar um núcleo em forma de rim ou dividido em lóbulos, assim como

dos mamíferos. No entanto podem ser classificados também como heterófilos, isso,

de acordo com o tamanho dos grânulos presentes, alguns autores no entanto

sugerem o uso do termo neutrófilo apenas para mamíferos (CLAVER; QUAGLIA,

2009; HINE, 1992; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2010). Os eosinófilos foram descritos

para algumas espécies de peixes, e estes são morfologicamente similares aos

eosinófilos de humanos, mas sua função ainda não está completamente esclarecida,

parecendo desempenhar papel similar a dos mastócitos. Estes estão presentes

principalmente no trato digestório e brânquias, e foram associados com estimulação

antigênica e infestação por parasitas; Enquanto os basófilos estão ausentes na

maioria das espécies de peixes (CLAVER; QUAGLIA, 2009; HINE, 1992).

A diferenciação morfológica entre alguns leucócitos não é tão simples como

em mamíferos, sendo muitas vezes necessário empregar técnicas histoquímicas ou

imuno-histoquímicas, associadas às colorações, ou mesmo utilizar microscopia

eletrônica de transmissão para diferencia-los, isso porque os peixes apresentam

linfócitos grandes, que podem ser confundidos com monócitos. Os neutrófilos e os

monócitos também podem ser confundidos, pois apresentam tamanho similar e a

morfologia do núcleo de ambos pode variar durante a fase de maturação celular

(AFONSO; ELLIS; SILVA, 1997; CLAVER; QUAGLIA, 2009; HINE, 1992;

SECOMBES, 1996).

Os peixes antecedem os mamíferos filogeneticamente, por isso apresentam

P á g i n a | 33

em um mesmo órgão a função dos tecidos mieloides e linfoides associados, isso é,

desempenham a hematopoiese, filtram a linfa e produzem anticorpos no rim cefálico,

baço e tecidos associados com o intestino. Já os mamíferos tem estas funções

realizadas em distintos órgãos, como a medula óssea e os linfonodos, órgãos

ausentes nos peixes (ELLIS, 1976; ZAPATA, 1979; ZAPATA et al., 2006; ZAPATA;

COOPER, 1990). Estudos ontogênicos em salmão do Atlântico e truta arco-íris

mostram que o rim cefálico é o principal órgão responsável pela hematopoiese

desde o estágio larval, enquanto o baço demonstra ser um órgão muito rudimentar,

comparado ao baço dos mamíferos. Desta maneira, em peixes, este órgão não é

essencial para a maturação imunológica (ESTEBAN et al., 1989; FORERO, 1995;

PADRÓS; CRESPO, 1996; RAZQUIN et al., 1990). A figura 3 sintetiza o sistema

imune dos peixes, mostrando seus principais componentes inatos e adquiridos, além

da comunicação que ocorre entre os dois sistemas.

Figura 3 – O sistema imune dos teleósteos.

A primeira barreira imunológica é a física, representada pelo muco presente na pele, que ainda possui componentes humorais, complemento, lisozima e proteína C reativa. A segunda barreira é representada pelas células fagocíticas, monócitos/macrófagos e neutrófilos, que são produzidos no rim cefálico e estão presentes no peritônio, sangue, baço e rim. A comunicação entre sistema imune inato e adquirido ocorre pelas células apresentadoras de antígenos (APC), que possuem complexo principal de histocompatibilidade (MHC), esses induzem a maturação dos linfócitos B e T em células produtoras de antígenos, criando a memória imunológica. Antígeno (Ag); Imunoglobulina M de superfície (sIgM); Interleucina (IL); Linfócito T helper (Th-cell); Linfócito T citotóxico (Tc-cell); Macrófago (Mɸ). Modificado de Köllner et al. (2002).

P á g i n a | 34

2.4 O trato intestinal dos salmonídeos

O trato intestinal é um complexo ecossistema que combina o epitélio

gastrointestinal, células imunes e a microbiota residente (MCCRACKEN; LORENZ,

2001). O intestino apresenta camadas distintas, sendo que a mais interna é a

camada mucosa, formada por projeções alongadas chamadas dobras intestinais,

constituídas de epitélio e lamina própria. O epitélio é do tipo colunar simples,

apresentando núcleos alongados e a cutícula estriada, característico de epitélio

intestinal, assim como células caliciformes produtoras de muco; a submucosa

constituída de conjuntivo frouxo possui um estrato compacto bem definido, formado

de fibras colágenas e corado de maneira acidófila; finalmente as camadas

musculares, circular interna e longitudinal externa.

Peixes não apresentam tecido linfoide associado ao intestino (GALT) de

forma organizada como observados em mamíferos, placas de Peyer ou linfonodos

mesentéricos, assim como local de residência especifica de linfócitos na mucosa

(ROMBOUT et al., 2010). No entanto os teleósteos apresentam um acumulo difuso

de tecido linfoide ao longo do intestino, contendo muitas células linfoides, como

macrófagos, eosinófilos e neutrófilos (DOGGETT; HARRIS, 1991; ROMBOUT et al.,

2010).

O intestino de teleósteos possui três segmentos distintos, baseados na

anatomia microscópica da mucosa: no primeiro segmento, os enterócitos podem ser

consideradas células absortivas; no segundo segmento, os enterócitos estão

caracterizados por apresentarem diversos vacúolos supranucleares, ocorre alta

atividade pinocítica na porção apical e é onde ocorre a maior absorção de

macromoléculas (KHOJASTEH et al., 2009); já o terceiro segmento é o menos

estudado, mas acredita-se que seus enterócitos possuem função osmorregulatóriae,

por apresentarem menor número de microvilos, acredita-se não ter função

nutricional (STROBAND; MEER; TIMMERMANS, 1979).

2.5 Porque usar imunoestimulantes em pisciculturas

O uso de antibióticos como promotores de crescimento está banido na Europa

desde 2006, devido aos riscos de gerar cepas de microorganismos resistentes a

antibióticos utilizados em terapias humanas e animais. Assim, os aditivos fitogênicos

P á g i n a | 35

tem atraído interesse como uma estratégia alimentar alternativa, para substituir os

antibióticos promotores de crescimento (WINDISCH et al., 2008).

Na piscicultura, a utilização de antibióticos em rações com o objetivo de

diminuir a carga de microrganismos patogênicos, é uma prática usual. Esta prática é

realizada com o objetivo de evitar infecções, geralmente nas fases iniciais da

criação, em razão da baixa resistência dos peixes a agentes agressores nestas

fases. Entretanto, essa prática aumenta a resistência bacteriana contra os

antibióticos, levando ao aparecimento de bactérias cada vez mais difíceis de serem

controladas (CABELLO, 2006). Adicionalmente, como a água das pisciculturas

retorna ao ambiente, os antibióticos também constituem uma fonte de poluição

ambiental (CYRINO et al., 2010).

Sabe-se que a nutrição e a imunidade estão intimamente relacionadas

(FERNANDES, 2008; GRAJEK; OLEJNIK; SIP, 2005; PLAT; MENSINK, 2005;

TRICHET, 2010), por isso bastante atenção tem sido dada ao desenvolvimento de

componentes dietários, que atuem como aditivos e/ou imunoestimulantes em

pisciculturas (DOÑATE et al., 2010; LALL, 2000).

O uso de aditivos fitogênicos (Flavonoides) e de imunoestimulantes (ácido

ascórbico) para a manutenção do desempenho animal e para a prevenção de

doenças vêm se tornando uma prática comum na aquicultura; de fato, e como

relatados têm o potencial de aumentar os mecanismos de defesa inatos dos peixes

frente a patógenos com reflexos positivos na produção de pisciculturas

(BRICKNELL; DALMO, 2005).

2.6 Os flavonoides e suas ações

Os flavonoides representam um dos grupos fenólicos mais importantes e

diversificados entre os produtos de origem natural. Essa classe de metabólitos

secundários são pigmentos biológicos naturais (substâncias polifenólicas), que estão

amplamente distribuídas no reino vegetal (SIMÕES et al., 2004). São encontrados

em frutas, vegetais, sementes, cascas de árvores, raízes, talos e flores. Mais de

cinco mil flavonoides já foram identificados e classificados, sendo muitos deles

responsáveis pelas atrativas cores presentes nas frutas, flores e folhas das plantas.

Ainda estes são responsáveis pelos efeitos benéficos relatados para uma série de

produtos, tais como os chás, vinhos e própolis, onde os flavonoides estão presentes

P á g i n a | 36

em grande quantidade (BEECHER, 2003; HAVSTEEN, 2002; NARAYANA et al.,

2001; NIJVELDT et al., 2001).

A estrutura dos flavonoides é caracterizada pelo seu núcleo básico (C6-C3-

C6), formado de dois anéis benzênicos (A e B), interligados por um anel pirano (C)

(Figura 4). As diferentes classes de flavonoides se dão devido ao nível de oxidação

do anel central, originando assim: chalconas, flavanonas, flavanonóis, flavonas,

flavonóis, isoflavonas, flavan-3-ols, catequinas e antocianidinas (BOOTS; HAENEN;

BAST, 2008; CAZAROLLI et al., 2008; NIJVELDT et al., 2001; ROTELLI et al., 2003;

VEITCH; GRAYER, 2008). A diversidade estrutural dos flavonoides pode ser

atribuída ao nível de oxidação e às variações no esqueleto carbônico básico,

promovidas por reações de alquilação, glicosilação ou oligomerização (TAHARA,

2007). Sendo assim, estes podem ser encontrados como agliconas ou sob a forma

de glicosídeos e/ou derivados metilados e/ou acilados (HAVSTEEN, 2002; SIMÕES

et al., 2004; VEITCH; GRAYER, 2008), e sua forma influencia a sua taxa de

absorção pelo intestino (NIJVELDT et al., 2001).

Figura 4 – Núcleo básico dos flavonoides.

Os flavonoides são conhecidos principalmente por seus efeitos antioxidantes,

anti-inflamatórios e antitumorais. No entanto uma série de atividades já foi descrita

para essas substâncias, como: atividade antiviral, captação de radicais livres,

atividade bactericida, hepatoprotetora, além de atuarem como inibidores de atividade

enzimática, influenciar beneficamente casos de diabetes mellitus, asma, alergias,

doenças coronárias e estresse (CAZAROLLI et al., 2008; GEORGIEV; ANANGA;

TSOLOVA, 2014; HAVSTEEN, 2002; KIM et al., 2004). Em humanos são tratados

como nutracêuticos, e na aquicultura vêm sendo aplicados para incrementar a

imunidade e aumentar a resistência a doenças (GEORGIEV; ANANGA; TSOLOVA,

2014; LIN; WENG, 2006; TRICHET, 2010).

P á g i n a | 37

Os flavonoides foram escolhidos para o presente estudo, por apresentarem

diversas funções benéficas relacionadas a imunidade e ao estresse. Adicionalmente,

o trato digestório é também sensível à atuação dos flavonoides. Em relação à

imunidade, existem diversos relatos de flavonoides que apresentam ações anti-

inflamatórias (BIESALSKI, 2007; CAZAROLLI et al., 2008; KIM et al., 2004;

MIDDLETON; KANDASWAMI; THEOHARIDES, 2000; YOON; BAEK, 2005),

afetando especificamente a função de enzimas envolvidas nesses processos

(HUNTER, 1995), e tornou-se evidente que estas estão intimamente envolvidas na

transdução de sinais e processos de ativação celular, envolvendo células do sistema

imune (MIDDLETON; KANDASWAMI; THEOHARIDES, 2000).

2.7 O acido ascórbico e suas ações

O ácido ascórbico (AA) é o nome comum dado ao ácido 2,3-enediol-L-

gulônico que é uma vitamina hidrossolúvel, essencial para a síntese de colágeno e

reparação de tecidos, atua no organismo como agente redutor no transporte de

hidrogênio no interior das células, está envolvido à síntese de hormônios esteroides

e participa de vários sistemas enzimáticos de hidroxilação, entre os quais a

transformação de prolina em hidroxiprolina (um dos componentes do colágeno e da

matriz extracelular) (NAVARRO, 2008; ROTTA, 2003).

Além disso, o AA é um nutriente essencial para a maior parte das espécies de

peixes e participa como cofator de uma grande variedade de reações químicas

fundamentais para a manutenção da saúde. Além de fazer parte da síntese e do

metabolismo de neurotransmissores, está envolvido na formação dos glóbulos

vermelhos do sangue, produção de corticosteroides, absorção e utilização do ferro e

na manutenção e integridade das paredes capilares. No plasma pode doar

prontamente elétrons para várias espécies reativas, retornando facilmente a seu

estado reduzido, eliminando-as antes que reajam com as membranas e

lipoproteínas biológicas (CHURCH; POND, 1996; KLASING, 1998; WHITEHEAD;

KELLER, 2003).

A atuação do AA no sistema imune dos peixes ocorre em nível celular e está

relacionado à hematopoiese, maturação de eritrócitos, manutenção da hemoglobina

no sangue, proliferação de neutrófilos e aumento na migração de macrófagos

(COMBS, 1998; LIM et al., 2000; NATIONAL RESEARCH COUNCIL, 1993). O AA

P á g i n a | 38

também participa da detoxificação de compostos, bem como do sistema antioxidante

em peixes, atuando assim como um imunoestimulante (HURST; BARRETTE, 1989;

LALL, 2000; NAVARRE; HALVER, 1989). Ainda, o AA também ameniza os impactos

negativos da contaminação ambiental e do estresse induzido por manejo em peixes

saudáveis, e consequentemente na resistência às doenças (BATISTA, 2005; LALL,

2000). Em virtude dos benefícios aqui apresentados, o AA não é apenas um aditivo

nutricional de fundamental importância, mas também uma ferramenta para melhorar

parâmetros zootécnicos na piscicultura.

2.8 Sinergismo entre flavonoides e acido ascórbico

Estudos in vitro indicaram que os flavonoides possuem a propriedade de

retardar a conversão de ascorbato em dehidroascorbato. Um dos mecanismos para

esta proteção envolve a quelação, do cobre e outros traços de metais, pelos

flavonoides, impedindo a oxidação do ácido ascórbico (HAVSTEEN, 2002).

Complementarmente, já foi visto que a auto-oxidação in vitro do flavonoide

quercetina pode ser prevenida utilizando-se baixas concentrações de AA, sugerindo

que a vitamina C da dieta pode prevenir a oxidação dos flavonoides, possibilitando

que essas moléculas estejam biologicamente ativas no organismo, mesmo após o

processo digestivo (DEGÁSPARI; WASZCYNSKYJ, 2004).

Por motivo do seu mútuo poder antioxidante, os flavonoides e o AA

apresentam efeitos sinérgicos em algumas atividades, como por exemplo: na

redução do dano oxidativo na superfície dos fibroblastos, cuja função está

relacionada aos flavonoides, mas que é potencializada na presença do AA; e na

melhora da imunidade entérica, proporcionando aumento da atividade fagocítica e

incrementando a eficiência dos capilares intestinais, durante os processos de

absorção de nutrientes (BATISTA, 2005).

Como antioxidantes, o AA e os flavonoides estão relacionados com o

aumento da imunidade mediada ou não por células, ação ocorrida, em parte, pela

manutenção da estrutura funcional e a integridade estrutural de células importantes

do sistema imunológico (Linfócitos T e B). Essa proteção resulta em uma maior

eficiência produtiva pela diminuição da susceptibilidade dos animais às doenças

causadas pelo estresse e, consequentemente, diminuição das taxas de morbidade e

mortalidade (PETERSON; DWYER, 1998).

P á g i n a | 39

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Manutenção

Todos os peixes utilizados foram fornecidos e mantidos durante os

experimentos, pela Estação Experimental de Salmonicultura “Dr. Ascânio Faria”, da

Apta Regional Vale do Paraíba da Secretaria de Agricultura e Abastecimento do

Estado de São Paulo, localizada dentro do Parque Estadual de Campos do Jordão,

SP, Brasil.

Os grupos experimentais foram mantidos em tanques circulares de fibra de

vidro com 1800 litros de capacidade, contendo cerca de 1500 litros de água em

circulação, abastecimento e escoamento independentes e sob condições naturais de

fotoperíodo. A renovação da água dos tanques foi de aproximadamente duas vezes

o volume total por hora, de modo a suprir a demanda de oxigênio dissolvido. Todos

os grupos foram alimentados três vezes ao dia, com ração comercial padrão

(Laguna Carnívoros Crescimento 45, Socil), contendo 45% de proteína, 10% extrato

etéreo, 4% fibra bruta, 20% matéria mineral, 10% de umidade e 0,06% de vitamina

C. A quantidade de alimento foi corrigida semanalmente, para suprir as

necessidades diárias dos animais de acordo com sua massa e idade.

Todos os animais manipulados experimentalmente foram previamente

anestesiados por imersão em solução de benzocaína a 100 ppm, dissolvida

previamente em álcool etílico (qsp) (SILVA et al., 1997). A manipulação dos peixes

só ocorreu após apresentarem diminuição dos reflexos de batimento opercular,

seguido por perda de equilíbrio (Figura 5A). Os animais foram eutanasiados por

imersão em superdose de anestésico – 150 ppm (COYLE; DURBOROW; TIDWELL,

2004). O protocolo experimental está de acordo com os princípios éticos de

experimentação animal adotado pela Sociedade Brasileira de Ciências de Animais

de Laboratório (SBCAL) e foi aprovado pela comissão de ética no uso de animais

(CEUA) do ICB-USP (nº 93 na fls.90 do livro 02).

O estudo foi conduzido em duas etapas distintas, o Experimento 1 teve

duração de 90 dias, e os animais foram mantidos em condições padrões de

manutenção, como descritas acima. Após os resultados observados neste

experimento optamos por empregar um desafio ao sistema imune dos animais,

organizamos o Experimento 2, que teve duração de 30 dias, com quatro grupos

P á g i n a | 40

experimentais: dois em condições descritas anteriormente e em dois,

adicionalmente, com aplicação de glicocorticoide exógeno (dexametasona).

3.2 Experimento 1

Realizado no período de Fevereiro a Maio de 2011, foram utilizadas 120

fêmeas jovens de trutas arco-íris (Oncorhynchus mykiss, Walbaum, 1792), pesando

entre 75,27±4,09 g e tratadas por 90 dias como descrito a seguir:

Grupo Controle (GC): 60 animais que receberam apenas ração;

Grupo Aditivo (GA): 60 animais que receberam ração misturada ao aditivo.

O aditivo (Biocitro®- Aqua, Quinabra, São José dos Campos, SP, Brasil)

contendo 7% AA, 35% extrato de frutas cítricas (5000mg/kg de flavonoides -

naringina, quercetina e rutina) e 5% de ácido lático, foi inicialmente diluído em água.

Em seguida, a solução foi misturada a ração do GA na concentração de 1000 ppm,

segundo indicação do fabricante. Para o GC foi misturada à ração o mesmo volume

de água livre de aditivo.

No primeiro dia (D0) os 120 peixes foram inicialmente anestesiados, pesados

(balança sartorius BP 8100 (0,01)), mensurados e distribuídos aleatoriamente nos

dois tanques experimentais (Figura 5B,C). Para construção de uma curva de

crescimento os animais foram pesados e mensurados nos dias (D) D0, D30, D60 e

D90. Ao término do tratamento (D90), foram eutanasiados dez peixes de cada grupo

experimental, sendo cinco utilizados para os ensaios de fagocitose in vitro; e cinco

para coleta do intestino. O sangue dos dez animais foi coletado para contagem de

leucócitos. Os demais animais foram utilizados apenas para tomada de dados de

ganho de massa e comprimento, sendo devolvidos para os tanques da estação de

Salmonicultura, após o registro destas informações.

P á g i n a | 41

3.3 Experimento 2

Realizado no período de Abril a Maio de 2013, foram utilizadas 80 fêmeas

jovens de trutas arco-íris (Oncorhynchus mykiss, Walbaum, 1792), pesando

146±19,54 g e tratadas por 30 dias como descrito a seguir:

Grupo Controle (GC): 20 animais que receberam apenas ração;

Grupo Aditivo (GA): 20 animais que receberam ração misturada ao aditivo;

Grupo Dexametasona (GD): 20 animais que receberam apenas ração +

aplicação de dexametasona por 7 dias (D24 – D30);

Grupo Aditivo Dexametasona (GAD): 20 animais que receberam ração

misturada ao aditivo + aplicação de dexametasona por 7 dias (D24 – D30).

Devido ao tempo de meia-vida da dexametasona ser de 72 horas, a mesma

foi aplicada a cada 72 horas durante os últimos 7 dias do protocolo experimental. A

administração da dexametasona a 0,2% (Azium - Intervet Schering/Plough, São

Paulo, SP, Brasil) foi via intramuscular, na região dorso-lateral direita, com seringa

de insulina e agulha de 8 mm, na dose de 2mg/kg de peixe vivo, seguindo indicação

do fabricante.

No primeiro dia (D0) os 80 peixes foram anestesiados, pesados (balança

(0,01) BP 8100 - Sartorius, Goettingen, Germany), mensurados e distribuídos

aleatoriamente nos quatro tanques experimentais (Figura 5B,C). Aos 30 dias de

tratamento, foram eutanasiados dez peixes de cada grupo experimental, sendo cinco

utilizados para os ensaios de fagocitose in vitro; e cinco para coleta do intestino e

soro sanguíneo. Adicionalmente coletou-se sangue dos dez animais para contagem

de leucócitos. Os demais animais foram utilizados apenas para tomada de dados de

ganho de massa e comprimento, sendo devolvidos para os tanques da estação de

Salmonicultura, após o registro destas informações.

A figura 6 sintetiza os dois experimentos realizados, assim como suas

respectivas análises.

P á g i n a | 42

3.4 Avaliação dos parâmetros zootécnicos

Os parâmetros avaliados foram: ganho de peso (GP), taxa de crescimento

específico (TCE), fator de condição (K), rendimento de carcaça (RC), índice

hepatossomático (IHS) e sobrevivência (S) dos animais. Para tanto foram utilizadas

as seguintes fórmulas:

GP = massa final – massa inicial TCE = massa final – massa inicial x 100 dias de experimento

K = massa do peixe x 100 comprimento total

3

RC = massa eviscerado x 100 massa total

IHS= massa (g) do fígado x 100 massa (g) do peixe

S = total de animais final x 100 total de animais inicial

Após a remoção das vísceras para determinação do rendimento de carcaça

inteira, foram obtidos a massa das mesmas e do fígado separadamente.

P á g i n a | 43

Figura 5 – Anestesia e medidas de O. mykiss.

A) O. mykiss sob efeito do anestésico, animais apresentam diminuição de batimento opercular e perda de equilíbrio. B) Medidas de comprimento total; C) e comprimento padrão dos animais.

P á g i n a | 44

Figura 6 – Fluxograma dos experimentos.

Experimento 1 Experimento 2

GC

Ração

GA

Ração +

Aditivo

GAD

Ração +

Aditivo e

Dexametasona

GD

Ração e

Dexametasona

a

GC

Ração

n= 60

GA

Ração +

Aditivo

n=60

n=20 n=20

n=20 n=20

3

0

d

i

a

s

9

0

d

i

a

s

Parâmetros de

Desempenho(n=20);

Morfologia do Intestino (n=5);

Parâmetros Imunes Inatos (n=5):

Contagem Diferencial de

Leucócitos;

Avaliação de Fagocitose in vitro;

Atividade de Lisozima.

Parâmetros de Desempenho

(n=60);

Morfologia do Intestino (n=5);

Parâmetros Imunes Inatos

(n=5):

Contagem Diferencial de

Leucócitos;

Avaliação de Fagocitose in vitro.

P á g i n a | 45

3.5 Avaliação do trato digestório

Para a avaliação histológica do intestino, foram coletadas amostras de tecido

de diferentes regiões: cecos pilóricos, segmento inicial, médio e final do intestino

(Figura 7), e processados de acordo com protocolo específico para microscopia de

luz e transmissão conforme descrito posteriormente. As diferentes secções do

intestino foram avaliadas da seguinte forma: análises de absorção de

macromoléculas de ferritina; mensuração da altura do epitélio absortivo e

quantificação da densidade de células de muco.

3.5.1 Microscopia de luz

A fixação das amostras de tecido do trato digestório foi feita em solução de

Methacarn (60% metanol, 30% clorofórmio e 10% acido acético glacial). Em seguida

desidratou-se o tecido em gradiente crescente de etanol, de 70% ao absoluto, com

subsequente diafanização em xilol e inclusão em parafina (Paraplast® - Sigma-

Aldrich, Munich, Germany).

3.5.2 Microscopia eletrônica de transmissão (MET)

Para o processamento das amostras de intestino foi utilizado o protocolo

padrão para MET. Os fragmentos de tecido (1 a 3 mm3) foram fixados em solução de

glutaraldeído 2,5%, em tampão fosfato 0,1M (pH 7,4), pós-fixados em tetróxido de

ósmio (OsO4) 2% em solução tampão de fosfato de sódio. Em seguida foi realizada

a desidratação alcoólica gradual, embebição em solução de óxido de propileno e

posterior inclusão em resina (Araldite® - Sigma-Aldrich). Foram realizados cortes

espessos de 3µm em ultramicrótomo, utilizando navalha de vidro e corados em azul

de toluidina, para avaliação em microscópio de luz e localização de áreas de

interesse. Os cortes ultrafinos de 90nm de espessura foram obtidos com navalha de

diamante e coletados em telas de 200 “mesh”. Em seguida, as telas foram

contrastadas com solução de acetato de uranila a 4% e examinadas no microscópio

eletrônico de transmissão JEOL.

P á g i n a | 46

3.5.3 Absorção de macromoléculas

Para avaliar o efeito do ácido ascórbico e flavonoides na absorção de

nutrientes, os animais receberam diretamente no estômago, por via oral, com auxilio

de agulha para gavagem, 1 mL de solução contendo ferritina de baço de cavalo

(Ferritin Type I, 108 mg/L - Sigma-Aldrich, Munich, Germany), diluída em solução

salina (0,9%), na proporção de 1:1. Após 24 horas, os animais foram eutanasiados e

as amostras de tecidos foram processadas com protocolo padrão para microscopia

de luz.

Para detectar a ferritina do tecido, foi utilizada a técnica histoquímica de Perls,

com contracoloração em solução de safranina O 1%, (Figura 7B) (BANCROFT;

STEVENS, 1982). O segmento médio - por apresentar uma maior absorção – em

relação aos outros segmentos, foi utilizado para quantificar a absorção da ferritina. A

quantificação foi feita utilizando cinco cortes aleatórios e não sequenciais de 5µm de

espessura para cada animal. As lâminas foram observadas na objetiva de 40x

(Olympus, UPlanFl, 40x/0.75 Ph2 ∞/0.17), sob o microscópio (Olympus BX60), sendo

que, para cada lâmina, dez campos aleatórios para cada corte foram fotografados

(Axio Cam HRc – Zeiss, Germany). A quantificação da ferritina foi feita por

identificação de cor, utilizando a mensuração automática do programa Axio Vision

(Axio Vision 4.8 – Zeiss).

3.5.4 Altura do epitélio absortivo

Para mensuração da altura do epitélio, cinco cortes aleatórios e não

sequenciais de 5µm de espessura, para cada porção intestinal, foram corados com

Hematoxilina & Eosina (HE) (Figura 7C). Posteriormente, cinco campos aleatórios

foram fotografados (Axio Cam HRc - Zeiss), na objetiva de 100x (Olympus, UPlanFl,

100x/1.30 Oil Ph3 ∞/0.17) sob microscópio (Olympus BX60). Foram feitas cinco

mensurações de altura do epitélio intestinal para cada campo fotografado,

totalizando cento e vinte e cinco medidas por porção intestinal para cada animal. As

mensurações foram feitas manualmente no programa Axio Vision (Axio Vision 4.8 –

Zeiss). Os dados foram analisados utilizando a média das cinco mensurações, de

cada campo fotografado.

P á g i n a | 47

3.5.5 Densidade de células de muco

Para visualização das células de muco, cinco cortes aleatórios e não

sequenciais de 5µm de espessura, para cada porção intestinal, foram corados com

Periodic Acid Shiff (PAS) (Figura 7D), em seguida foram fotografados (Axio Cam

HRc - Zeiss) na objetiva de 100X do microscópio (Olympus BX60) para

quantificação. Todos os campos fotografados respeitaram os seguintes critérios: 1- a

imagem capturada apresentava apenas o epitélio absortivo; não podendo haver

espaços entre as dobras intestinais, ou espaços vazios (luz do órgão); 2- o campo

também não poderia evidenciar o conjuntivo da camada submucosa. Sendo assim,

os cortes foram percorridos de forma “zig-zag”, e dez campos aleatórios para cada

corte, respeitando as condições descritas, eram fotografados, e todas as células de

muco do campo contadas manualmente, no programa Axio Vision (Axio Vision 4.8 –

Zeiss). Posteriormente, foi feita a relação de células de muco por área, dividindo-se

o total de células contadas nos dez campos, pela área total das dez fotomicrografias.

P á g i n a | 48

Figura 7 – Morfologia do trato intestinal de O. mykiss.

A) Vista ventral mostrando o trato gastrointestinal de O. mykiss, Estômago (E), Intestino anterior (IA) e posterior (IP). Porções coletadas para análises histológicas: Cecos pilóricos (CP); porção inicial do intestino (seta); porção média do intestino (cabeça de seta vazia); porção final do intestino (cabeça de seta). B) Fotomicrografias de corte histológico da porção média do intestino, moléculas de ferritina aparecem em azul, coloração de Perls. C) Porção média do intestino, Células caliciformes (cc); epitélio (e); Estrato compacto (ec); Lamina própria (lp); linfócito intraepitelial (li); vacúolos absortivos (va); leucócitos associados ao intestino (seta vazia); medida de altura do epitélio (em vermelho), coloração de HE. D) Porção inicial do intestino mostrando células de muco, histoquímica de PAS.

e lp

cc

va

li

ec

50 µm 50 µm

P á g i n a | 49

3.6 Avaliação do sistema imune inespecífico

3.6.1 Avaliação de fagocitose in vitro

Foram utilizados seis espécimes por grupo, sendo feitos ensaios em triplicata

para cada espécime. Os ensaios de fagocitose in vitro foram realizados segundo

técnica adaptada de Afonso, Ellis e Silva (1997). Para obtenção de células

fagocíticas, os animais receberam injeção intraperitoneal (Figura 8A) de 20 mL de

solução de glicogênio de ostra (Glycogen from oyster, Type II – Sigma-Aldrich) 1%.

Após 24 horas os animais foram eutanasiados e submetidos a sangria cortando-se a

cauda, para retirar o máximo de sangue possível, evitando assim contaminação do

lavado peritoneal por eritrócitos.

Após a sangria, foram injetados na cavidade peritoneal 20 mL de solução

tampão PBS gelado (0,01 M) e 10 mL de ar, para a formação de bolhas que auxiliam

a suspender as células que migraram para o peritônio. Posteriormente a região

abdominal foi massageada, para promover a suspensão das células presentes nos

tecidos. Em seguida a cavidade abdominal foi aberta e o lavado peritoneal drenado,

com auxílio de pipeta plástica descartável de 3 mL. O lavado peritoneal foi

depositado em tubo falcon de 15 mL, em seguida centrifugado a 600G por 15

minutos em temperatura ambiente. A camada leucocitária coletada foi

ressuspendida em tubo, contendo meio de cultura RPMI 1640 (Sigma-Aldrich), com

gentamicina 50 mg/L, sem soro fetal bovino (FBS). Alíquotas de 200µl de solução de

células foram colocadas sobre lamínulas de vidro redondas, em placa de cultura de

12 poços, e completados com meio de cultura para 1 mL de volume final. Após 2

horas em câmara úmida os poços foram lavados com tampão PBS, para o

isolamento das células aderidas (macrófagos). A mesma solução de células foi

previamente contada em câmara de Neubauer, para cálculo da concentração

celular.

Posteriormente, cada poço recebeu solução de meio de cultura contendo,

Saccharomyces cerevisiae (Meyen, 1883) em suspensão, na concentração de 10

leveduras por macrófago. Após o prazo de 2 horas de incubação em câmara úmida

à temperatura ambiente de 12,0 ± 2,0ºC, o meio de cultura foi retirado e descartado,

os poços foram lavados com PBS e as lamínulas então fixadas com metanol,

coradas com Rosenfeld (ROSENFELD, 1947) e montadas com resina Entelan®.

P á g i n a | 50

As lâminas coradas com Rosenfeld foram observadas sob microscopia de

contraste de fase. Desta maneira, as leveduras aparecem em cor alaranjada e os

macrófagos em rosa ou roxo (Figura 8B, C). As fagocitoses foram posteriormente

quantificadas em aumento de 1000X. Foram contadas 100 células por lâmina e

calculados os seguintes índices de atividade fagocítica: Capacidade Fagocítica (CF),

Índice Fagocítico (If), Capacidade Fagocítica x Índice Fagocítico (CF x If), conforme

as fórmulas abaixo.

CF = nº de macrófagos fagocitando If = nº total de leveduras no interior dos macrófagos nº total de macrófagos contados nº de macrófagos fagocitando CF x If = nº de macrófagos fagocitando x nº total de leveduras no interior dos macrófagos nº total de macrófagos contados nº de macrófagos fagocitando CF If

Então: CF x If = nº total de leveduras no interior dos macrófagos nº total de macrófagos contados

P á g i n a | 51

Figura 8 – Ensaios de fagocitose in vitro.

A) Injeção intraperitoneal de solução fisiológica contendo 1% de glicogênio de ostra. B) Fotomicrografia de lamina de teste de fagocitose corada com Rosenfeld, mostrando macrófagos em microscopia de campo claro; C) Mesmo campo fotografado em microscopia de fase. Levedura internalizada (cabeça de seta) e levedura não fagocitada (seta). Barra equivale a 10µm.

P á g i n a | 52

3.6.2 Contagem diferencial de leucócitos

Para a Contagem Diferencial de Leucócitos (CDL) sanguíneos, foram

coletadas, com seringas heparinizadas, amostras de sangue da veia caudal dos

animais e em seguida feitos esfregaços sanguíneos, posteriormente corados com

HE. Os esfregaços foram feitos em triplicata por animal.

A CDL consiste em determinar a proporção existente entre as distintas

variedades de leucócitos: neutrófilos, linfócitos e monócitos (Figura 9). Em

microscópio de luz comum, com objetiva de imersão (100X), foram contadas 1000

células no corpo da extensão (englobando eritrócitos e leucócitos), percorrendo-se a

lâmina em “zig-zag”.

Amostras de sangue da veia caudal, das trutas arco íris utilizadas nos ensaios

de fagocitose, também foram coletadas para a confecção de esfregaços sanguíneos.

Estes animais, por terem recebido previamente injeção intraperitoneal de glicogênio

de ostra (agente quimiotático), foram avaliados para proporção de leucócitos

sanguíneos, e analisados separadamente.

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Figura 9 - Esfregaços sanguíneos de O. mykiss.

. A) Eritrócitos nucleados, seta mostra os linfócitos. B) Seta mostra neutrófilo. C) Seta mostra monócito Coloração de HE.

P á g i n a | 54

3.6.3 Atividade de lisozima

A atividade de lisozima foi avaliada apenas nos animais do segundo

experimento. Para tanto, alíquotas de sangue foram retiradas da veia dorsal das

trutas, utilizando seringas de 1 mL não heparinizadas. Em seguida o sangue foi

transferido para eppendorfs estéreis de 1,5 mL. Após 4 horas, as amostras foram

centrifugadas, o coágulo sanguíneo removido, com auxílio de pipeta estéril

descartável e o soro sanguíneo resultante foi congelado em nitrogênio líquido para

posterior análise.

A atividade de lisozima contra células liofilizadas de Micrococcus lysodeikticus

(M3770, Sigma-Aldrich) foi medida em soro puro e em diluições seriadas de ½, ¼, e

⅛, em espectrofotômetro usando 570nm de absorbância, no tempo 0, 6, 16, 31, 61 e

91 minutos. Como controle negativo, o soro foi substituído por tampão PBS 0,05M

pH 6,2 (mesmo tampão em que foram diluídas as amostras de soro). Como controle

positivo, foi utilizado lisozima de clara de ovo (Sigma, Ref. L-7651) ao invés do soro.

A partir das leituras foram então estabelecidos os valores de U (unidade de

lisozima), que corresponde à quantidade de amostra que causa diminuição de

absorbância de 0,001/min.

3.7 Análises estatísticas

Os dados foram analisados através das médias e desvio-padrão dos grupos

pelo software GraphPad InStat versão 3.05 (GraphPad Software, San Diego,

California, USA). Para a escolha do teste estatístico adequado, os dados foram

verificados quanto à sua normalidade por meio do teste Kolmogorov-Smirnov (para

dados com padrão de normalidade, foram utilizados testes paramétricos; quando um

ou mais grupos não apresentaram padrão de normalidade, foram utilizados testes

não-paramétricos). Os testes paramétricos utilizados foram o teste ¨t¨ de Student

(para comparar dois grupos) ou Anova de uma via (para mais de dois grupos) com

pós-teste de Tukey. Os testes não-paramétricos utilizados foram o de Mann-Whitney

(para dois grupos) ou de Kruskal-Wallis (para mais de dois grupos) com pós-teste de

Dunn. Os grupos foram considerados diferentes quando p≤0,05.

P á g i n a | 55

4 RESULTADOS

4.1 Experimento 1

4.1.1 Avaliação dos parâmetros zootécnicos

O ganho de massa e o crescimento dos grupos foram verificados mês a mês

(Tabela 1, Figura 10) e os parâmetros foram todos similares entre GA e GC, durante

os 90 dias de tratamento. O ganho de massa mensal é apresentado na figura 10A, o

ganho total após os 90 dias na figura 10B, a taxa de crescimento específico mensal

pode ser verificada na figura 10C, e na figura 10D o total aos 90 dias. O fator de

condição, rendimento de carcaça e índice hepatossomático, são apresentados na

figura 10E, F e G, respectivamente, os valores para o GC e o GA foram similares

para os três índices. Em ambos os grupos de tratamento não ocorreram mortes dos

animais, sendo assim a taxa de sobrevivência foi de 100% para ambos.

Tabela 1 – Massa corpórea e medidas de comprimento de O. mykiss, durante os 90 dias de experimento.

Mês Grupo Controle Grupo Aditivo

M(g) CT (cm) CP (cm) M(g) CT (cm) CP (cm)

Fevereiro 78,17±16,42 18,06±1,20 15,94±1,08 72,38±9,90 17,80±0,83 15,68±0,77

Março 155,42±28,87 22,03±1,35 19,45±1,24 150,33±23,70 21,82±1,11 19,30±1,01

Abril 236,74±39,96 25,41±1,37 22,50±1,24 232,37±32,55 25,46±1,15 22,59±1,07

Maio 329,88±52,51 28,33±1,48 25,26±1,39 317,86±45,55 28,09±1,25 25,13±1,25

Valores expressos em média ± DP. Massa em gramas (M(g)); Comprimento total em cm (CT); comprimento padrão em cm (CP).

P á g i n a | 56

Figura 10 – Parâmetros de desempenho de O. mykiss durante os 90 dias de experimento.

Barras mostram média ± DP. Não houve diferença significativa entre os grupos (p>0,05).

P á g i n a | 57

4.1.2 Avaliação do trato digestório

4.1.2.1 Absorção de macromoléculas

Na avaliação de absorção de macronutrientes proteicos (ferritina) foi

observada uma grande variação na porcentagem de ferritina presente no tecido,

entre os animais pertencentes ao mesmo grupo (Tabela 2), assim não se observou

diferença entre GC e GA.

Tabela 2 – Ferritina presente no tecido intestinal.

Peixe GC GA

1 0,23 2,17

2 0,33 1,41

3 1,60 2,14

4 3,02 1,81

Média 1,29 1,88

DP 1,31 0,35

Valores referentes à porcentagem de ferritina presente na área do tecido, em relação ao total de área de tecido fotografados.

P á g i n a | 58

4.1.2.2 Altura do epitélio absortivo

Em relação à altura do epitélio intestinal comparamos as quatro porções de

intestino coletadas, entre GA e GC (Figura 11).

Nos cecos pilóricos o epitélio intestinal não apresentou diferença significativa

entre os grupos (P>0,05), a porção inicial do intestino mostrou um aumento na altura

do epitélio extremamente significativo (P<0,0001), a porção média apresentou

tendência ao aumento (P=0,0581) da altura do epitélio no GA em relação ao GC,

enquanto na porção final do intestino os valores foram similares entre os grupos

(P>0,05).

Figura 11 – Análise comparativa da altura do epitélio intestinal das diferentes porções do intestino de O. mykiss.

A) Cecos pilóricos; B) Porção inicial; C) Porção média; D) Porção final do intestino; E) Altura do epitélio das quatro porções intestinais, com linha de tendência (polinômio de três fases). Cecos pilóricos (CP), porção inicial (Ii), porção média (IM), porção final do intestino (IF). Barras mostram média ± DP, valores expressos em µm. (*) = p<0,05.

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4.1.2.3 Densidade de células de muco

Na análise densidade de células de muco observou-se uma diminuição nos

cecos pilóricos do GA em comparação ao GC com p=0,045 (Figura 12 A). Já na

porção inicial do intestino o número de células de muco aumentou nos animais do

GA em relação ao GC, com p=0,051 (Figura 12 B). Para os demais segmentos

intestinais não foram observadas diferença na concentração de células de muco

entre GA e GC (Figura 12 C e D).

Figura 12 – Análise comparativa da densidade de células de muco nas diferentes porções intestinais de O. mykiss.

A) Cecos pilóricos; B) Porção inicial; C) Porção média; D) Porção final do intestino; E) Densidade de células de muco das quatro porções intestinais, com linha de tendência (polinômio de três fases). Cecos pilóricos (CP), porção inicial (Ii), porção média (IM), porção final do intestino (IF). Barras mostram média ± DP, valores expressos em número de células por mm

2. (*) = p<0,05.

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4.1.2.4 Avaliação ultraestrutural

Figura 13 – Avaliação ultraestrutural do intestino de O. mykiss.

Ambos os grupos mostraram morfologia similar. A) GC 4000x. B) GC 15000x. C) GA 7500x. D) GA 20000x. E) GA 7500x. F) GA 20000x. A, C) Os enterócitos apresentam a cutícula estriada característica deste epitélio, abundância de mitocôndrias, uma faixa bem definida, com ausência de organelas logo abaixo à projeção das microvilosidades. B, D) presença de junções celulares bem definidas. E) Granulócitos da submucosa apresentam características típicas. F) Mitocôndrias com cristas evidentes comprovam a integridade da fixação do material examinado.

P á g i n a | 61

4.1.3 Avaliação do sistema imune inespecífico

4.1.3.1 Avaliação de fagocitose in vitro

O índice fagocítico, a capacidade fagocítica e o índice fagocítico X

capacidade fagocítica, podem ser observados na figura 14. O GA e o GC

apresentaram valores similares para os três índices.

Figura 14 – Análises comparativa da atividade fagocítica de macrófagos, de O. mykiss dos dois grupos, aos 90 dias de experimento.

A) Índice fagocítico; B) Capacidade fagocítica; C) Capacidade fagocítica X índice fagocítico (CF X IF). Barras mostram média ± DP. Não houve diferença significativa entre os grupos (p>0,05).

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4.1.3.2 Contagem diferencial de leucócitos

A contagem de leucócitos, ilustrada na figura 15, revelou uma diminuição no

número de linfócitos dos animais que receberam aplicação intraperitoneal de

glicogênio, comparados aos que não receberam, com p=0,025. Entretanto,

considerando os grupos GC e GA, não foi observada diferença significativa entre os

animais que receberam glicogênio.

Por sua vez, a contagem de neutrófilos não revelou diferença significativa

entre os animais que receberam ou não glicogênio de ostra, bem como entre os

animais que receberam glicogênio de ostra, considerando os grupos GC e GA.

Entretanto, entre os animais que não receberam glicogênio de ostra, a

contagem de monócitos foi significativamente maior nos animais do grupo GA em

relação ao grupo GC, com p=0,043. Nas demais comparações não foram

observadas diferenças relevantes, com p>0,05.

Figura 15 – Contagem diferencial de leucócitos em extensões sanguíneas de O. mykiss.

Barras mostram média ± DP, valores expressos em unidades. Letras mostram diferença entre os grupos (p<0,05).

Neutrófilos

P á g i n a | 63

4.2 Experimento 2

4.2.1 Avaliação dos parâmetros zootécnicos

Como pode ser observado na figura 16, o GD teve menor ganho de massa e

taxa de crescimento específico que o GC (p<0,001) e o GA (p<0,001), e não diferiu

do GAD. Considerando os mesmos parâmetros, o GAD foi inferior ao GC, com

p<0,01.

O fator de condição do GD foi menor que do GC (p<0,05), e não diferiu entre

GA e GAD (p>0,05). Na comparação entre os grupos GC, GA e GAD não foram

observadas diferenças, com p>0,05.

O rendimento de carcaça foi similar em todos os grupos experimentais (p>0,05).

Por outro lado o índice hepatossomático do GAD foi maior que do GA (p<0,01) e

do GD (p<0,05), mas não diferiu do GC. Entre os demais grupos, GC, GA e GD, o

índice foi similar.

P á g i n a | 64

Figura 16 – Parâmetros de desempenho de O. mykiss, dos quatro grupos experimentais, aos 30 dias de experimento.

Barras mostram média ± DP. Letras mostram diferença entre os grupos (p<0,05).

Em relação à sobrevivência, o GD teve uma taxa de sobrevivência de 80% dos

animais, enquanto os demais grupos apresentaram 100% de sobrevivência.

a

a a,b

b

P á g i n a | 65

Os gráficos apresentados na figura 17 correspondem a tomada de massados

animais para aplicação da dexametasona. Aos 24 dias de experimento (Figura17A)

o GAD havia ganhado mais massa que o GD (p<0,05). Durante os 7 dias de

aplicação os dois grupos apresentaram perda de massa (Figura 17B), e

consequente diminuição do ganho de massa (Figura 17C).

Figura 17 – Comparação do ganho de massa dos grupos GD e GAD.

A) Ganho de massa aos 24 dias de experimento; B) Massa durante os 7 dias de aplicação de dexametasona C) Ganho de massa durante os 7 dias de aplicação de dexametasona. Barras mostram média ± DP. (*)= p<0,05.

4.2.2 Avaliação do trato digestório

4.2.2.1 Altura do epitélio absortivo

A altura do epitélio absortivo dos cecos pilóricos (Figura 18) não diferiu entre

GC e GA, enquanto que no GD ocorreu uma diminuição na altura epitelial, em

relação ao GC (p<0,001) e ao GA (p<0,001). O GAD também apresentou uma

diminuição na altura epitelial em relação ao GC (p<0,001) de GA (p<0,001), no

entanto foi maior que o GD (p<0,01).

No início do intestino ocorreu uma diminuição na altura do GA em relação ao

GC (p<0,01), enquanto que GD e GAD não diferiram entre si, mas foram menores

P á g i n a | 66

que GC (p<0,001) e GA (p<0,001).

Na porção intestinal média ocorreu uma diminuição na altura do epitélio do

GA em relação ao GC (p<0,05), enquanto que no GD ocorreu uma diminuição na

altura epitelial, em relação ao GC (p<0,001) e ao GA (p<0,001). O GAD também

apresentou uma diminuição na altura epitelial em relação ao GC (p<0,001) e ao GD

(p<0,001), no entanto não diferiu do GA.

Na porção intestinal final a altura epitelial foi similar entre GC e GA. Assim

como no GD comparado ao GAD. No entanto ocorreu uma diminuição na altura do

epitélio do GD em relação ao GC (p<0,001), e ao GA (p<0,001), e também no GAD

comparado ao GC (p<0,001) e ao GA (p<0,001).

Figura 18 – Análise comparativa da altura do epitélio intestinal das diferentes porções do intestino de O. mykiss.

A) Cecos pilóricos; B) Porção inicial; C) Porção média; D) Porção final do intestino; E) Altura do epitélio das quatro porções intestinais, com linha de tendência (polinômio de três fases). Cecos pilóricos (CP), porção inicial (Ii), porção média (IM), porção final do intestino (IF). Barras mostram média ± DP, valores expressos em µm. Letras mostram diferença entre os grupos (p<0,05).

P á g i n a | 67

4.2.2.2 Densidade de células de muco

Em relação a densidade de células de muco (Figura 19) nos cecos pilóricos

não houve diferença entre GC, GA e GD, enquanto que o GAD apresentou um

aumento (p<0,001) em relação a todos os demais.

No início do intestino GA, GD e GAD não diferiram do GC. No entanto, o GA

foi menor que o GD e o GAD (p<0,05).

Já na porção média do intestino GA, GD e GAD não diferiram do GC, com

p>0,05, enquanto que GD apresentou um aumento na densidade de células de

muco em relação ao GAD (p<0,05).

A porção final do intestino apresentou densidade de células de muco similar

entre GC, GA e GAD (p>0,05), já o GD apresentou uma maior densidade em relação

ao GC (p<0,01) e ao GA (p<0,01).

P á g i n a | 68

Figura 19 – Análise comparativa da densidade de células de muco nas diferentes porções intestinais de O.mykiss.

A) Cecos pilóricos; B) Porção inicial; C) Porção média; D) Porção final do intestino; E) Densidade de células de muco das quatro porções intestinais, com linha de tendência (polinômio de três fases). Cecos pilóricos (CP), porção inicial (Ii), porção média (IM), porção final do intestino (IF). Barras mostram média ± DP, valores expressos em células por mm

2. Letras mostram diferença entre os

grupos (p<0,05).

P á g i n a | 69

4.2.2.3 Avaliação ultraestrutural

Figura 20 – Avaliação ultraestrutural do intestino de O. mykiss.

Os grupos mostraram morfologia intestinal similar, os enterócitos apresentam a cutícula estriada característica, abundância de mitocôndrias, uma faixa bem definida, com ausência de organelas logo abaixo à projeção das microvilosidades, presença de junções celulares (C) bem definidas. A) GAD, 1000x. B) GC, 1000x. C) GD, 10000x. D) Fibras colágenas do estrato compacto, 15000x. E) Granulócitos eosinófilos da submucosa do GC, 2000x. F) Granulócitos eosinófilos da submucosa do GD com morfologia indicativa de degranulação, 2500x.

P á g i n a | 70

4.2.3 Avaliação do sistema imune inespecífico

4.2.3.1 Avaliação de fagocitose in vitro

O índice fagocítico, a capacidade fagocítica e o índice fagocítico X

capacidade fagocítica, podem ser observados na figura 21, os quatro grupos

experimentais apresentaram valores similares para os três índices.

Figura 21 – Análises comparativa da atividade fagocítica de O. mykiss.

A) Índice fagocítico; B) Capacidade fagocítica; C) Capacidade fagocítica X índice fagocítico. (CF X IF). Barras mostram média ± DP. Não houve diferença significativa entre os grupos (p>0,05).

4.2.3.2 Contagem diferencial de leucócitos

Pode-se observar que a proporção de células brancas sanguíneas (Figura 22)

foi similar entre monócitos e linfócitos, entre os 4 grupos experimentais que não

receberam glicogênio. No entanto em relação aos neutrófilos, ocorreu um aumento

significativo no GAD comparado ao GC (p<0,01) e ao GA (p<0,01).

Em relação aos grupos que receberam glicogênio, o GAD apresentou

aumento significativo de monócitos comparado ao GC (p<0,01), ao GA (p<0,01) e ao

GD (p<0,001). Em relação aos linfócitos, o GAD apresentou um aumento comparado

ao GC (p<0,001), ao GA (p<0,001) e ao GD (p<0,001). O número de neutrófilos do

P á g i n a | 71

GAD também foi maior que no GC (p<0,01), no GA (p<0,01) e no GD (p<0,01).

Ao comparar os grupos que receberam a aplicação de glicogênio, com os que

não receberam pode-se observar que a contagem de monócitos, do GAD+glicogênio

foi maior que todos os demais grupos avaliados (p<0,001). Pode-se também

observar a diminuição dos linfócitos sanguíneos do GC+glicogênio, do

GA+glicogênio e do GD+glicogênio, comparados ao GC (p<0,001), ao GA (p<0,05),

ao GD (p<0,001) e ao GAD (p<0,001). O GAD+glicogênio foi o grupo menos afetado,

mostrando valores similares aos grupos que não receberam glicogênio. Em relação

ao número de neutrófilo, ocorreu aumento no GAD+glicogênio comparado ao GC

(p<0,001) e ao GA (p<0,001), no entanto se igualou ao GD e GAD (Figura 22).

Figura 22 – Contagem diferencial de leucócitos em extensões sanguíneas de O. mykiss.

Barras mostram média ± DP, valores expressos em unidades. Letras mostram diferença entre grupos (p<0,05).

Neutrófilos

P á g i n a | 72

4.2.3.3 Atividade de lisozima

O pico da atividade da lisozima (Figura 23) foi maior aos 6 minutos, esta foi

diminuindo gradativamente durante as leituras nos quatro grupos experimentais. A

partir dos 61 aos 91 minutos esta atingiu um platô e não se alterou mais, por esta

razão no gráfico apresentamos a atividade lisozima até os 61 minutos. Não houve

diferença significativa entre os grupos.

Figura 23 – Atividade da lisozima das amostras de soro sanguíneo dos quatro

grupos experimentais.

Diluição ¼, leitura em 570nm. Linhas mostram média ± DP, valores expressos em U. Não houve diferença significativa entre os grupos (p>0,05).

P á g i n a | 73

5 DISCUSSÃO

No presente experimento, os animais foram mantidos em uma ambiência

ideal, com qualidade da água controlada, bem como qualidade e quantidade de

ração ajustada às necessidades da truta. Adicionalmente as trutas arco-íris

utilizadas no experimento eram todas juvenis, portanto ainda não haviam entrado em

fase reprodutiva, quando o ganho de massa diminui devido ao gasto energético com

a gametogênese. A idade dos animais utilizados é considerada ideal para estudos

de imunidade (KÖLLNER et al., 2002).

No primeiro experimento, todos os parâmetros zootécnicos analisados foram

similares entre os dois grupos experimentais (GC e GA), tanto mês a mês, como ao

final dos 90 dias de experimento. Isso indica que, do ponto de vista zootécnico, a

utilização de aditivo a base de AA e flavonoides, para ganho de massa apenas, seria

irrelevante nos prazos analisados.

Enquanto o segundo experimento demonstrou que sob condições ideais (GC

e GA), o uso do aditivo não apresenta vantagens em ganho de massa em 30 dias, já

que este não alterou os parâmetros zootécnicos dos animais, como visto também no

primeiro experimento mais longo. No entanto, ao observarmos o ganho de massa

dos grupos GD e GAD aos 24 dias de experimento, quando se iniciou a aplicação de

glicocorticoide, o GAD havia ganhado mais massa que GD indicando que o uso de

AA e flavonoides como aditivo em períodos mais curtos proporciona o aumento do

ganho de massa.

A absorção da vitamina C ocorre na membrana apical do enterócito e é

realizada através de transportadores específicos dependentes de íons sódio, que

são substrato-dependentes, de maneira que quanto maior a suplementação desta

vitamina, mais eficiente será sua absorção (DABROWSKI; MATUSIEWICZB; BLOM,

1994). Como os animais são alimentados com ração contendo quantidades

suficientes de AA (600 mg/Kg), o ácido ascórbico do aditivo foi apenas uma

suplementação desta vitamina, já que a maioria das espécies de peixes não é capaz

de produzir ácido ascórbico a partir de outros elementos da dieta. A ausência ou

quantidade insuficiente da vitamina C interfere no ganho de massa e em parâmetros

relacionados a imunidade. No entanto, diversos autores apontam que a

suplementação de ácido ascórbico, geralmente não ocasiona alteração no ganho de

P á g i n a | 74

massa em peixes (AKSOY et al., 2008; AZAD et al., 2007; CHAGAS; VAL, 2003;

EO; LEE, 2008; HARDIE; FLETCHER; SECOMBES, 1991; LI; WISE; ROBINSON,

1998; LIU et al., 2008; LYGREN et al., 1999). Contudo estudos com pré e probióticos

demonstram que estes aditivos podem auxiliar no crescimento dos animais

(ANADÓN; MARTÍNEZ-LARRAÑAGA; MATÍNEZ; 2006; FULLER, 1989; SCOTT-

WEESE; SHARIF; RODRIGUEZ-PALACIOS, 2008). Como os flavonoides já foram

descritos por exercer influencia na microbiota intestinal (MOCO; MARTIN; REZZI,

2012; SAURA-CALIXTO, 2011) e os ácidos orgânicos que compões o aditivo em

questão podem favorecer a microbiota residente, agindo como prebióticos (HEO et

al., 2013), este aumento de massa em 24 dias possivelmente esta relacionado não

somente com a atividade deste componentes per se, mas também com sua ação de

coadjuvante na microbiota residente.

Após a aplicação do glicocorticoide exógeno, os animais do grupo GD e GAD

perderam massa. Apesar da perda de massa ter sido similar entre os dois grupos, a

massa média dos animais que ao dia 24 eram equivalentes, passaram a se

distanciar, assim aos 27 e 30 dias o GD tinha uma massa média significativamente

menor que GAD. Com isso pode-se constatar que, devido esta perda de massa, o

GD teve um menor ganho de massa total em relação ao GC e GA, enquanto o GAD

teve um ganho de massa similar ao GA. Estes dados evidenciam que o aditivo pode

compensar a perda de massa proporcionada por glicocorticoide.

Contrastando os resultados do presente estudo com outros disponíveis na

literatura especializada, pode-se ver que a suplementação com AA em salmão do

Atlântico não altera o ganho de massa após estresse de manejo (THOMPSON et al.,

1993). Por outro lado, em trutas desafiadas com Vibro anguillarum o AA foi

diferencial no ganho de massa, a partir da décima semana de tratamento

(NAVARRE; HALVER, 1989). No entanto, os animais utilizados no estudo eram mais

jovens que do presente estudo, com massa inicial de apenas 1g. Similarmente aos

resultados obtidos no presente estudo, Deng e colaboradores (2009) observaram

que a dieta com polifenóis de chá por sete dias, aliviou a perda de massa em leitões

sob estresse oxidativo e ainda promoveram a proliferação e ativação de linfócitos T.

É sabido que uma das ações dos glicocorticoides é a mobilização das

reservas energéticas, induzindo a lipólise e gliconeogênese a partir de aminoácidos,

disponibilizando assim energia para as funções necessárias no momento do

estresse. Desta forma, causa a perda de massa dos animais, o que geralmente

P á g i n a | 75

ocorre em situações de estresse crônico (PICKERING, 1981; VIJAYAN;

BALLANTYNE; LEATHERLAND, 1991; WENDELAAR BONGA, 1997). Visto que, no

presente estudo, o grupo que consumiu aditivo compensou a perda de massa após

a aplicação da dexametasona, uma possível explicação para este ocorrido é que os

flavonoides aturam de forma similar a insulina. Em modelos animais e humanos com

diabetes tipo 2, os flavonoides auxiliam na diminuição da glicose sanguínea, tanto

através do aumento da captação da glicose pelas células, como também induzindo

seu armazenamento, estimulando a síntese de glicogênio, quanto a glicose está em

altos níveis sanguíneos (CAZAROLLI et al., 2008). Desta maneira, os flavonoides

podem ter agido de maneira compensatória, em relação a atuação do glicocorticoide

no presente estudo. Ainda, os flavonoides podem ter tido uma atuação inibitória

direta, pois estes também foram descritos por atuar diretamente nos receptores

glicocorticoides in vitro (NISHIZAKI et al., 2009).

O fator de condição reflete a proporção entre a massa e o comprimento dos

animais, é bem específico e possui uma variação mínima (MORGAN et al., 2008) No

entanto, a perda de massa do GD foi significativa para os animais, de forma que

refletiu no fator de condição. Assim, o GD apresentou valores menores comparado

ao GA. Contudo, o rendimento de carcaça dos animais não foi afetado, indicando

que as alterações no ganho de massa total não afetaram a porção muscular, que é

de fato o que será consumido. Este resultado apresentou-se oposto ao esperado,

uma vez que a atuação de glicocorticoides, em geral, induz a gliconeogênese do

tecido muscular. Assim, supõe-se que a variação do ganho de massa ocorreu no

conteúdo visceral dos animais. Corroborando com isso, é sabido que o aumento dos

níveis de corticoide, induzem também a atividade aminotransferase hepática, assim

como a lipólise de tecido adiposo (DAVIS et al., 1985; JENTOFT et al., 2005;

MOMMSEN; VIJAYAN; MOON, 1999; PICKERING, 1981; VAN DER BOON; VAN

DEN THILLART; ADDINK, 1991; VIJAYAN et al., 1994). No presente estudo, o índice

hepatossomático realmente apresentou alterações entre os grupos GA, GD e o

GAD, entretanto todos foram similares ao do GC que é o controle do experimento.

Outro dado importante foi a mortalidade dos animais. As trutas do GD

apresentaram maior sensibilidade ao manuseio, quando os animais eram retirados

dos tanques, para pesagem observou-se perda de equilíbrio e aumento dos

batimentos operculares, indicando taquipnéia. Nos dias que se seguiram as

aplicações de glicocorticoide, houve então morte dos animais do GD após o

P á g i n a | 76

manuseio dos mesmos. Este fato não foi observado nos animais do GAD, que

aparentavam não sentir influência da aplicação do glicocorticoide, durante o

manuseio. Barton e Iwama (1991) obtiveram resultados similares, e observaram que

após o estresse, os peixes apresentam o aumento da captação de oxigênio e taxa

metabólica quando comparados aos animais não estressados. Assim, é possível que

as trutas tenham utilizado grande parte de suas reservas metabólicas, e ao serem

manuseadas, não tinham mais reservas energéticas para enfrentar o estresse do

manejo. Estes dados mostram que o uso do aditivo é vantajoso diante de situações

desfavoráveis as trutas arco-íris, como por exemplo, o aumento dos níveis de

corticoide ocasionados em situações de estresse.

Ao comparar o resultados referentes à altura do epitélio intestinal, entre os

dois experimentos realizados, podemos inferir que no experimento 1 o aditivo

causou o aumento da altura do epitélio intestinal da porção inicial do intestino.

Enquanto, no experimento 2, ocorreu justamente o oposto, a altura do epitélio, no

inicio do intestino do GA diminuiu em relação ao GC. Ainda, no experimento 1, foi

somente esta porção intestinal que diferiu entre os grupos, as outras três porções

intestinais avaliadas apresentaram a altura do epitélio intestinal similar entre GC e

GA . Ao passo que, no experimento 2, além da porção inicial do intestino, o aditivo

também causou a diminuição da altura do epitélio na porção média do intestino

comparado ao GC. Estes dados sugerem que é provável que ocorra um pico de

atividade do aditivo, nos primeiros 30 dias de tratamento, e que o tratamento mais

longo (90 dias) induz um acondicionamento dos animais. Assim, a morfologia

intestinal retornaria aos parâmetros similares aos dos animais do grupo controle.

Em relação à aplicação do glicocorticoide, esta em geral causou a diminuição

da altura do epitélio intestinal em todas as porções analisadas do GD, comparado

aos GC e GA. O aditivo pareceu ser diferencial nestes resultados, pois nos cecos

pilóricos e no intestino médio o GAD apresentou altura epitelial maior que o GD.

Adicionalmente, o GAD chegou a se equiparar ao GA no intestino médio. No inicio

do intestino o aditivo por si já havia causado a diminuição da altura do epitélio (GA),

possivelmente por esta razão a altura do epitélio do GAD se equiparou a do GD

nesta porção intestinal. Fabregat (2006) também observaram que o aditivo

Flavofeed®, causou uma diminuição na altura do epitélio absortivo da porção média

do intestino tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus) não desafiadas, e sugeriram que

a diminuição da altura do epitélio poderia ser devido ao aumento da altura das

P á g i n a | 77

vilosidades também ocorridas em seu experimento. Isto também pode ter ocorrido

no presente experimento, no entanto a altura das dobras intestinais não foi

verificada. Mas o aumento da altura de dobras intestinais proporcionaria uma maior

área de absorção ao intestino, o que seria vantajoso para a nutrição dos animais.

Assim como discutido em relação a perda de massa, novamente o aditivo pareceu

ter uma ação compensatória em relação a ações do glicocorticoide, minimizando a

atuação deste nos segmentos iniciais intestino.

Na porção final do intestino o aditivo não teve influência local, pois a altura do

epitélio dos grupo aditivo e controle foram similares entre si, assim como do grupo

GD comparado ao grupo GAD. Alguns autores mencionam que a porção final do

intestino não têm função absortiva, como as demais porções do intestino, estando

mais relacionada com função osmorregulatória (STROBAND; MEER;

TIMMERMANS, 1979). Isso poderia explicar os resultados observados nesta porção

intestinal. Também existe a possibilidade do aditivo ter sido absorvido quase

completamente nas porções anteriores, pois é sabido que 70-80% da absorção

intestinal ocorre nos cecos pilóricos e início do intestino (BUDDINGTON; DIAMOND,

1986), por esta razão podemos supor que sua ação local seja mesmo menor no final

do intestino.

Avaliando a densidade de células de muco no primeiro experimento, o aditivo

causou a diminuição da densidade nos cecos pilóricos, e o aumento na porção inicial

do intestino. No experimento 2, o aditivo não causou alteração na densidade de

células de muco. Assim, GA e GC foram similares para todas as porções intestinais.

Entretanto, a associação do aditivo com a aplicação de glicocorticoide causou o

aumento na densidade de células de muco nos cecos pilóricos. Por outro lado, no

inicio do intestino a aplicação de glicocorticoide ocasionou o aumento da densidade

de células de muco, e o aditivo não influenciou, tanto no GA, como no GAD. Na

porção média do intestino, o GD apresentou uma densidade de células de muco

maior que GAD, mas ambos não diferiram significativamente de GC e GA. Alguns

estudos demonstram que os flavonoides afetam a progressão do ciclo celular por

meio de diferentes mecanismos, dentre eles a inibição de enzimas de replicação e

reparo (MACHADO, 2006). Sua ação ocorre através de diferentes mecanismos,

dentre eles a inibição da produção de interleucinas, fator de necrose tumoral e

fatores de crescimento (BRUNETTI; COLASANTE; MASCETRA, 1998). Algumas

classes de fatores de crescimento tais como o fator de crescimento de fibroblasto

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(FGF), são capazes de induzir a proliferação de células epiteliais ao longo do trato

gastrointestinal e influenciar na diferenciação de células de muco (HAN et al., 2000) .

Desta maneira, as alterações morfológicas apresentadas no presente estudo podem

estar associadas à utilização de dexametasona como agente de ação inibitória sobre

alguns tipos de fatores sinalizadores do crescimento e diferenciação epitelial. Além

disso, tanto os glicocorticoides, como os flavonoides, atuam no metabolismo de

homeostase da glicose e insulina (CAZAROLLI et al., 2008), e sabe-se que estas

vias estão envolvidas no equilíbrio da proliferação celular. Desta maneira, poderiam

induzir a proliferação das células intestinais.

Corroborando com os resultados encontrados para altura epitelial no final do

intestino, o aditivo não influenciou esta porção, como influenciou as demais, já que a

densidade de células de muco do GA foi similar a GC, e o GAD se igualou aos

outros segmentos intestinais. A aplicação de glicocorticoide, no entanto, agiu nesta

porção intestinal, como pode ser observado pelo aumento de células de muco no

GD comparado ao GC e GA. A ação do glicocorticoide no intestino ocorre devido a

presença de receptores para glicocorticoide, que estão presentes no intestino dos

teleósteos (CHAKRABORTI; WEISBART, 1987; SANDOR; DIBATTISTA; MEHDI,

1984). Estes receptores de glicocorticoide possuem alta afinidade com

dexametasona (LEE et al., 1992). Novamente, o aditivo parece compensar a ação

do glicocorticoide de forma sistêmica, pois no final do intestino o GAD apresentou a

densidade de células de muco em uma concentração intermediária entre a

concentração dos GC, GA e GD, não diferindo de nenhum dos três grupos. As

alterações na concentração de células de muco podem ser ocasionadas por

diversos fatores. A camada de muco age como meio de proteção, lubrificação e

transporte entre o conteúdo luminal e o epitélio, podendo ser influenciada por uma

série de fatores bioativos, incluindo hormônios, neuropeptídios e mediadores

inflamatórios (BLASER et al., 1995; LABOISSE et al., 1996; VILLALOBO, 1998).

Na literatura esta caracterizado que a diminuição de células de muco ocorre

em inflamações agudas e o aumento em inflamações crônicas. Porém muitos

estudos tem mostrado que fatores dietários também afetam o número de células de

muco (GANESSUNKER et al., 1999; MCCRACKEN et al., 1995; SHARMA et al.,

1995; SHARMA; SCHUMACHER, 1995 a,b), sem ocasionar lesões teciduais ou

sistêmicas. Durante as avaliações histológicas em microscopia óptica, não foram

encontradas lesões teciduais aparentes no intestino em nenhum experimento ou

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grupo. Na microscopia eletrônica, a ultraestrutura das células encontrava-se

conservada, entre todos os grupos experimentais. A presença de células

eosinofílicas/eosinófilos foi constatada tanto na microscopia óptica, como na

eletrônica. Estas células estão normalmente associadas aos intestinos em peixes

(AINSWORTH, 1992; ELLIS, 1985) e desempenham função similar a dos mastócitos

de mamíferos (CLAVER; QUAGLIA, 2009; REITE, 1997). Entretanto, os eosinófilos

do GD observados em MET aparentavam morfologia alterada, comparado aos dos

demais grupos, estes apresentavam menos grânulos e consequentemente um maior

espaçamento entre estes. Este aspecto pode indicar que a degranulação tenha

ocorrido (ELLIS, 1985). De fato, os corticosteroides causam degranulação de

mastócitos em mamíferos (KING et al., 1985), ainda a hidrocortisona já demonstrou

induzir a degranulação de células eosinofílicas em truta marrom, sendo os possíveis

motivos além de alterações em parâmetros imunes, perturbação de processos

osmorregulatórios (REITE, 1997).

Assim vemos diferentes resultados em relação às alterações morfológicas do

tecido nos cecos pilóricos e porções inicial, média e final do intestino, acreditamos

que a alteração mostrada no presente estudo possa estar relacionada com

alterações na absorção intestinal destas porções. Existem algumas hipóteses

possíveis para justificar as alterações encontradas: 1 – Como o aditivo composto por

ácidos orgânicos e flavonoides possui um pH baixo, ao entrar na porção inicial do

intestino poderia causar algum tipo de irritação local devido a sua acidez e

desencadear uma resposta protetora do tecido, ou ainda, os flavonoides do

composto poderiam estar exercendo toxicidade as células ou organismo. No

entanto, nos grupos avaliados, a barreira epitelial não foi afetada pelo tratamento e

não apresentou sinais de inflamação ou dano, com ausência de infiltrados

inflamatórios nas laminas analisadas, bem como contagem de leucócitos

sanguíneos em proporções normais. Ainda, os componentes da formula do aditivo

não apresentaram toxidade em outros estudos (PLAKAS et al., 1985); 2 – É possível

que alterações nas dobras intestinais tenham causado alterações de altura do

epitélio, similar ao estudo de Fabregat e colaboradores (2008). Adicionalmente, em

tilápia, a administração de imunoestimulantes dietários, como Ergosan, aumentou a

altura das vilosidades, assim como dos enterócito, e da área de superfície da

mucosa do intestino (MERRIFIELD et al., 2011); 3 – É sabido que alimentos com

diferentes componentes vegetais também influenciam nos processos de

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diferenciação e maturação dos enterócitos em regiões intestinais afetadas

(JOHNSON et al., 1989; PUSZTAI, 1991). Sendo assim, é possível que devido a

alterações na dinâmica das populações celulares do intestino, um aumento

populacional ou uma maior taxa de renovação tenham colaborado com as alterações

epiteliais; 4 – Alguns estudos demonstram que as bactérias influenciam na absorção

e biodisponibilidade dos flavonoides no trato gastrointestinal, e que flavonoides,

como quercetina, podem exercer ação bactericida em bactérias patológicas de

peixes (PETERSON; DWYER, 1998; RATTANACHAIKUNSOPON;

PHUMKHACHORN, 2007). Assim, devido a íntima relação entre microbiota e epitélio

intestinal, esses dados podem indicar também possíveis influências do aditivo na

microbiota residente, que é responsável diretamente ou indiretamente, pelas

modificações ocorridas no microambiente onde esta microbiota está inserida.

A avaliação dos parâmetros de imunidade inata mostrou que a atividade

fagocítica dos macrófagos in vitro não foi alterada em nenhum dos grupos

experimentais. Assim como a atividade de lisozima do experimento 2, que não

diferiu entre os grupos. Com relação ao AA, estes resultados são contraditórios, pois

este já foi descrito por estimular parâmetros imunes, como proliferação de

leucócitos, aumento da fagocitose e ainda a atividade hemolítica do complemento

(VERLHAC; GABAUDAN, 1997). Contudo, a ação do AA em relação a parâmetros

de respostas imunológicas em salmonídeos, nem sempre são consistentes, isso

varia de acordo com as espécies e métodos empregados (LALL, 2000). Hardie e

colaboradores (1991) também não obtiveram alteração em parâmetros de imunidade

inata, como eritrofagocitose e atividade hemolítica do complemento, em trutas com

ração suplementada com acido ascórbico, por 20 semanas de experimento. No

entanto, ao desafiarem os animais com Aeromonas salmonicida, os animais

deficientes em AA tiveram uma maior mortalidade, que aqueles com níveis ideais ou

suplementação de AA. Por sua vez, Lygren e colaboradores (1999) concluíram que

o AA não influencia o status imunológico inato de salmão, pois não encontraram

diferenças, na atividade de lisozima, fagocitose ou atividade hemolítica do

complemento em salmão do Atlântico alimentados por 19 dias, com dieta de 150 ou

1000 mg de ácido ascórbico. Ainda, ao desafiarem os animais com A. salmonicida

(furunculose) ou com o vírus de anemia infecciosa de salmão, o nível de AA na dieta

não influenciou a taxa de mortalidade dos peixes. Contudo, os animais receberam a

dieta com suplementação de AA apenas antes do desafio empregado. Assim, é

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possível que os resultados observados sejam devido a falta do AA durante o período

de desafio sanitário, já que a reserva tecidual de AA é dependente de seu consumo

e seus níveis diminuem nos tecidos quando o AA é eliminado da dieta (VERLHAC et

al., 1998).

Quando os peixes teleósteos apresentam aumento dos níveis sanguíneos de

corticosteroides devido ao estresse, há redução do número de linfócitos circulantes,

(TORT, 2011; WENDELAAR BONGA, 1997). No entanto, a aplicação exógena de

glicocorticoide no presente estudo, não apresentou o mesmo resultado, já que

proporção de linfócitos, monócitos e neutrófilo sanguíneos de GD permaneceu

similar a do GC e GA. Por outro lado, os valores de neutrófilos aumentaram

significativamente, no GAD. Sendo assim, o glicocorticoide exógeno pode não

ocasionar alteração no número de leucócitos circulantes. No entanto, nos animais

que consumiram ração com aditivo, após a aplicação do glicocorticoide, estes

responderam com aumento de neutrófilos, demonstrando que o aditivo pode ter

ação sobre o status imunológico inato em situações de aumento dos corticoides. O

estresse crônico geralmente resulta na imunossupressão (TORT, 2011;

WENDELAAR BONGA, 1997). Considerando que os neutrófilos são células de alta

atividade fagocítica, seu aumento proporcionado pelo aditivo poderia favorecer o

combate aos patógenos oportunistas, que são favorecidos pela imunossupressão

dos peixes.

Dentre os animais que receberam aplicação intraperitoneal de glicogênio de

ostra, para os ensaios de fagocitose, os do GAD apresentaram aumento significativo

na proporção de todos os leucócitos sanguíneos, em relação aos outros três grupos

experimentais (GC, GA e GD). Similarmente, a aplicação intraperitoneal de diquat

(herbicida), como modelo de estresse oxidativo em leitões, demonstrou que, em

animais com dieta de polifenóis de chá, ocorre proliferação e ativação de linfócitos T

(DENG et al., 2009). Ainda, o AA também pode aumentar a proliferação de

leucócitos de trutas arco-íris como visto em ensaios in vitro de proliferação induzida,

agindo de maneira dose dependente na proliferação (HARDIE et al., 1993).

A aplicação do glicogênio causa o recrutamento de leucócitos sanguíneos,

atraindo-os para a cavidade celomática. Os resultados observados demonstram, que

os animais que consumiram o aditivo tiveram uma resposta maior ao estímulo do

glicogênio de ostra, caracterizando-o como imunoestimulante, comprovando a

hipótese de que a resposta dos animais alimentados com aditivo, frente a patógenos

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oportunistas, seria maior que a dos animais que não consumiram aditivo.

De fato, o uso de aditivos fitogênicos (Flavonoides) e de imunoestimulantes

(ácido ascórbico) para a manutenção do desempenho animal e para a prevenção de

doenças vem se tornando prática comum na aquicultura; e como relatados estes têm

o potencial de aumentar os mecanismos de defesa inatos dos peixes frente a

patógenos com reflexos positivos na produção de pisciculturas (BRICKNELL;

DALMO, 2005).

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6 CONCLUSÃO

A utilização dos flavonoides associados a ácidos orgânicos, como aditivos

dietários, promove o incremento de massa em trutas arco-íris saudáveis, quanto

utilizados a curto prazo (até 24 dias); Sua administração oral a curto (30 dias) e

longo prazo (90 dias), influenciam beneficamente o intestino de trutas; A

administração constante de ácido ascórbico e flavonoides, desempenha atividades

compensatórias em relação a danos ocasionados por glicocorticoide exógeno,

amenizando a perda de massa e alterações intestinais, indicando vantagens

zootécnicas e imunológicas no uso destes diante de situações que possam

ocasionar estresse.

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