programa de pÓs-graduaÇÃo em alimentos … · prognÓstico de pacientes com carcinoma...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
INSTITUTO DE NUTRIÇÃO JOSUÉ DE CASTRO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO
ESTADO NUTRICIONAL, PARÂMETROS INFLAMATÓRIOS E,
INFILTRAÇÃO TUMORAL DE LINFÓCITOS T CD4+ E T CD8+ NO
PROGNÓSTICO DE PACIENTES COM CARCINOMA
ESPINOCELULAR DE LARINGE
LUANA DALBEM MURAD
RIO DE JANEIRO
2019
ESTADO NUTRICIONAL, PARÂMETROS INFLAMATÓRIOS E,
INFILTRAÇÃO TUMORAL DE LINFÓCITOS T CD4+ E T CD8+ NO
PROGNÓSTICO DE PACIENTES COM CARCINOMA
ESPINOCELULAR DE LARINGE
Luana Dalbem Murad
Orientadores: Drª. Eliane Fialho de Oliveira
Drª. Mariana Costa Monteiro
Dr. Leonardo Borges Murad
Rio de Janeiro
Dezembro/2019
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Nutrição do Instituto de Nutrição Josué de Castro da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte
dos requisitos necessários à obtenção do Título de
Doutor em Ciências Nutricionais.
ESTADO NUTRICIONAL, PARÂMETROS INFLAMATÓRIOS E, INFILTRAÇÃO
TUMORAL DE LINFÓCITOS T CD4+ E T CD8+ NO PROGNÓSTICO DE
PACIENTES COM CARCINOMA ESPINOCELULAR DE LARINGE
Luana Dalbem Murad
TESE SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO DO INSTITUTO DE NUTRIÇÃO JOSUÉ DE CASTRO DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PARTE DOS REQUISITOS NECESSÁRIOS PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR EM CIÊNCIAS NUTRICIONAIS.
Examinada por:
_________________________________________________________ Professora Dra. Renata Brum Martucci
Instituto de Nutrição-UERJ /Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva Examinadora / Revisora
_________________________________________________________ Professora Dra. Wilza Arantes Ferreira Peres
Instituto de Nutrição Josué de Castro / Universidade Federal do Rio de Janeiro Examinadora
_________________________________________________________ Professora Dra. Tatiana El-Bacha
Instituto de Nutrição Josué de Castro / Universidade Federal do Rio de Janeiro Examinadora
_________________________________________________________ Dra. Livia Costa de Oliveira
Nutricionista / Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva Examinadora
_________________________________________________________ Professor Dr. Fabianno Ferreira Dutra
Instituto de Microbiologia Paulo de Góes / Universidade Federal do Rio de Janeiro Examinador
_________________________________________________________
Professora Dra. Eliane Fialho de Oliveira Instituto de Nutrição Josué de Castro / Universidade Federal do Rio de Janeiro
Orientadora e Presidente da Banca
RIO DE JANEIRO, RJ – BRASIL DEZEMBRO/2019
Ficha Catalográfica
Murad, Luana Dalbem.
Estado nutricional, parâmetros inflamatórios e, infiltração tumoral de
linfócitos T CD4+ e T CD8+ no prognóstico de pacientes com carcinoma
espinocelular de laringe. / Luana Dalbem Murad. – Rio de Janeiro: UFRJ /
Centro de Ciências da Saúde, Instituto de Nutrição Josué de Castro, 2019.
134 f.: il.; 31 cm.
Orientadores: Eliane Fialho de Oliveira; Mariana Costa Monteiro; Leonardo
Borges Murad. Tese (doutorado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro / Instituto de
Nutrição Josué de Castro, Programa de Pós-Graduação em Nutrição, 2019.
Referências: f. 110-119.
1. Estado Nutricional. 2. Carcinoma de Células Escamosas de Cabeça e
Pescoço. 3. Linfócitos do Interstício Tumoral. 4. Sobrevida. 5. Ciências
Nutricionais- Tese. I. Oliveira, Eliane Fialho de. II. Monteiro, Mariana Costa.
III. Murad, Leonardo Borges. IV. Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Instituto de Nutrição Josué de Castro, Pós Programa de Pós-Graduação
em Nutrição. V. Título.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao amor da
minha vida, o meu marido Leonardo, companheiro de todas as horas, que contribuiu
decisivamente para que esta tese pudesse ser desenvolvida e concluída. Sem você nada
disso seria possível e, nenhuma conquista valeria a pena.
Dedico, também, a minha filha
Carolina, a qual deu um sentido especial a minha existência, me fazendo ter forças para
sempre seguir em frente.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter me concedido a oportunidade de aprendizado e evolução.
Aos meus pais, Emídio e Carmelita, pelo amor incondicional, por me ensinarem
o valor do trabalho, da honestidade e a importância da perseverança.
A meu marido e, orientador, Leonardo Murad, por compartilhar comigo todo seu
conhecimento, por me orientar e, compreender e, por me dar estímulo, força e apoio
incondicional.
A minha amada filha, Carolina, que me impulsiona todos os dias a seguir em frente, rumo
ao melhor.
A Prof. Eliane Fialho, meus sinceros agradecimentos por ter me aceito como orientanda.
Obrigada pela oportunidade.
A Prof. Mariana Costa Monteiro pela doçura, paciência e orientações.
Aos meus amigos e, em especial as amigas Rachel S. Menezes da Cunha e Danúbia da
Cunha A. Saraiva, por sempre me ouvirem, me incentivarem e, acreditarem no meu
potencial.
A aluna Thays Silva, pelo apoio e auxílio durante a pesquisa.
Ao estatístico Arthur Schilitz por sua valiosa contribuição nas análises.
A Priscila Valverde, pelos conhecimentos, parceria e, prontidão em auxiliar.
Aos funcionários da Setor de Arquivo Médico do Instituto Nacional de Câncer, Unidade
HCI, pelo auxílio na busca incansável aos prontuários.
As funcionárias da Coordenação da Pós-Graduação, Renata e Darlene, por sempre me
socorrem e, auxiliarem com suas orientações.
Resumo da tese apresentada ao PPGN/UFRJ como parte dos requisitos necessários para a
obtenção do grau de doutor em Ciências Nutricionais.
ESTADO NUTRICIONAL, PARÂMETROS INFLAMATÓRIOS E, INFILTRAÇÃO
TUMORAL DE LINFÓCITOS T CD4+ E T CD8+ NO PROGNÓSTICO DE
PACIENTES COM CARCINOMA ESPINOCELULAR DE LARINGE.
Luana Dalbem Murad
Dezembro/2019
Orientador(es): Eliane Fialho de Oliveira
Mariana Costa Monteiro
Leonardo Borges Murad
RESUMO
Introdução: Dentre os tumores de cabeça e pescoço (CP), o carcinoma espinocelular
(CEC) de laringe é o tipo histológico mais frequente. Este apresenta importante impacto
sobre o estado nutricional (EN), sendo a desnutrição reconhecida como indicador de mau
prognóstico. O aumento da inflamação pode representar um fator prognóstico desfavorável.
Uma vez que inflamação e EN estão intrinsecamente relacionados, eles podem refletir a
resposta imune ao câncer. Estudos demonstraram disfunção de linfócitos T nas áreas
infiltradas por tumor em pacientes com CEC de CP. A alta densidade de linfócitos
infiltrados no tumor (TILs) tem sido reconhecida como um bom marcador de prognóstico.
Contudo, trabalhos recentes não exploram a relação entre EN, parâmetros inflamatórios e
TILs em pacientes com CEC de laringe. Objetivo: Avaliar a relação do EN com os
parâmetros inflamatórios e, infiltrado tumoral de linfócitos TDC4+ e TCD8+ em pacientes
com CEC de laringe. Métodos: Estudo de coorte retrospectivo com pacientes com CEC de
laringe, matriculados no Instituto Nacional de Câncer, entre Janeiro/2006 a
Dezembro/2011. O Índice de massa corporal (IMC) pré-tratamento foi utilizado para
avaliação do EN. A curva ROC (Receiver Operating Characteristic) foi utilizada para
determinar o ponto de corte ideal para a razão neutrófilo/linfócito (NLR), razão
plaqueta/linfócito (PLR) e, razão linfócito/ monócito (LMR). A sobrevida global (SG) foi
avaliada pelo método Kaplan-Meier, seguida do teste log-rank. A infiltração tumoral de
linfócitos TCD4+ e TCD8+ foi avaliada por análises imuno-histoquímicas. Tabelas de
contingência e o teste Qui-quadrado de Pearson (χ2) foram utilizados para identificar
relações entre IMC, fatores clínicos, parâmetros inflamatórios e TILs. Associação entre
TILs e as variáveis independentes foi verificada pelo cálculo do odds ratio (OR). O modelo
de risco proporcional de Cox foi utilizado para análises univariadas e multivariadas. Foram
considerados significativos valores p<0.05. Resultados: 1. NLR foi identificado como um
fator prognóstico independente para SG. Valores pré-tratamento elevados de NLR e PLR e,
reduzidos de LMR foram associados a pior SG. Valores reduzidos de IMC não afetaram
significativamente a SG. No entanto, não foi observada diferença significativa na SG entre
os níveis alto e baixo de PLR e LMR nos pacientes com magreza/baixo peso. 2. Pacientes
cirúrgicos e, com magreza/baixo peso apresentaram menor densidade intratumoral de
linfócitos T CD4+ comparados a pacientes com IMC normal/elevado. Além disso, pacientes
com NRL ≥ 1,55 apresentaram pior SG comparados a pacientes com NLR < 1,55.
Conclusões: NLR, PLR e LMR estão associadas ao prognóstico de CEC de laringe, sendo
NLR um fator de prognóstico independente para SG. Valores reduzidos de IMC podem
ajustar o valor prognóstico da PLR e LMR. A depleção do estado nutricional pode
prejudicar a infiltração intratumoral de linfócitos T CD4+, podendo contribuir para um mau
prognóstico.
Palavras-chave: Estado Nutricional, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço,
linfócitos do interstício tumoral, sobrevida, ciências nutricionais.
NUTRITIONAL STATUS, INFLAMMATORY PARAMETERS AND TUMORAL
CD4+ AND CD8+ T LYMPHOCYTE INFILTRATION IN THE PROGNOSIS OF
LARYNGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA PATIENTS.
Luana Dalbem Murad
December/2019
Advisors: Eliane Fialho de Oliveira
Mariana Costa Monteiro
Leonardo Borges Murad
ABSTRACT
Background: Among head and neck cancer (HN), laryngeal squamous cell carcinoma
(LSCC) is the most frequent histological type, presenting significant impact on nutritional
status. Malnutrition has been recognized as an indicator of poor prognosis, related to
worsening immunity. Increased systemic inflammation may represent an unfavorable
prognostic factor. Since inflammation and nutritional status are intrinsically related, they
may reflect the immune response to cancer. Studies have shown T lymphocyte dysfunction
in areas infiltrated by tumors in patients with head and neck LSCC. The high density of
tumor infiltrating lymphocytes (TILs) has been recognized as a good prognostic marker.
However, recent studies do not explore the relationship between nutritional status,
inflammatory parameters and TILs in LSCC patients. Objective: Evaluate the relationship
between nutritional status and inflammatory parameters and CD4+ and CD8+ T lymphocyte
tumor infiltrate in LSCC patients. Methods: Retrospective cohort study with LSCC
patients, enrolled at National Cancer Institute, from January 2006 to December 2011.
Pretreatment body mass index (BMI) was used to assess nutritional status. Characteristic
(ROC) curves was used to determine the optimal cutoff point for neutrophil-to-lymphocyte
ratio (NLR), platelet-to-lymphocyte ratio (PLR) and lymphocyte-to-monocyte ratio (LMR).
Overall survival (OS) was assessed by the Kaplan-Meier method and the log-rank test.
Tumoral CD4+ and CD8+ T lymphocyte infiltration was assessed by immunohistochemical
analysis. Contingency tables and Pearson's Chi-square test (χ2) were used to identify
relationships between BMI, clinical factors, inflammatory parameters and TILs. The
Receiver Operating The association between TILs and the independent variables was
verified using the odds ratio (OR) calculation. Cox proportional hazards model was used
for univariate and multivariate analyses. The p value <0.05 was considered significant.
Results: 1. NLR was identified as an independent prognostic factor for OS. High NLR and
PLR values and low pretreatment LMR value were associated with poorer OS. Low BMI
values did not significantly affect OS. However, no significant difference in overall
survival was observed between high and low PLR and LMR levels in patients with thinness
/ low weight. 2. LSCC surgical patients with low BMI had significantly lower intratumoral
density of CD4+ T lymphocytes when compared with patients with normal / high BMI. In
addition, patients with NRL ≥ 1.55 had poor survival when compared to patients with NLR
< 1.55. Conclusion: NLR, PLR and LMR are associated with the prognostic of LSCC and
NLR is an independent prognostic factor for OS. Reduced BMI values could adjust PLR
and LMR prognostic value. Nutritional status depletion may impairs the intratumoral CD4+
T lymphocytes infiltration and may contribute to a poor prognosis.
Keywords: nutritional status, head and neck squamous cell carcinoma, tumor lymphocytes
infiltrating, survival, nutritional sciences.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 16
1.1. Câncer 16
1.2. Câncer de cabeça e pescoço 16
1.3. Fatores de risco 17
1.4. Câncer de laringe 18
1.4.1. Diagnóstico e estadiamento do CEC de laringe 19
1.4.2. Tratamento do CEC de laringe 20
1.5. CEC de laringe e estado nutricional 21
1.6. CEC de laringe e imunidade 23
1.7. CEC de laringe e marcadores inflamatórios 26
2. HIPÓTESE 30
3. JUSTIFICATIVA
4. OBJETIVOS
31
4.1 OBJETIVO GERAL 32
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 32
5. MATERIAL E MÉTODOS 33
5.1. Desenho do estudo 33
5.2. Critérios de inclusão 33
5.3. Critérios de exclusão 33
5.4. Amostra e coleta de dados
5.4.1 Dados sócio-econômicos
33
36
5.4.2 Dados clínicos 36
5.4.3 Parâmetros hematológicos 37
5.4.4 Avaliação do estado nutricional 38
5.4.5 Análise imuno-histoquímica
5.4.6 Parâmetros inflamatórios e indicadores de prognóstico
38
41
5.4.7 Análise de sobrevida global
5.5 Aspectos éticos
5.6 Análise estatística
42
42
42
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1. Manuscrito 1
6.1.1 Abstract
6.1.2 Introduction
6.1.3 Material and Methods
6.1.4 Results
6.1.5 Discussion
6.1.6 References
6.2. Manuscrito 2
6.2.1 Abstract
6.2.2 Introduction
6.2.3 Methods
6.2.4 Results
6.2.5 Discussion
6.2.6 References
45
46
47
48
49
51
53
57
73
74
75
76
79
82
85
7. CONCLUSÕES GERAIS
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
9. ANEXOS
Anexo I Formulário para coleta de dados
Anexo II Parecer consubstanciado do CEP
Anexo III Justificativa da Ausência do Termo de Consentimento
Livre e Esclarecido (TCLE)
Anexo IV Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)
109
110
120
121
125
128
130
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais
incidentes estimados para 2018 por sexo, exceto pele não
melanoma
18
Figura 2 Estadiamento CEC de laringe 19
Figura 3
Figura 4
Estádios para o carcinoma de laringe
Diagrama de fluxo de seleção de pacientes
20
35
LISTA DE NOMENCLATURA
APC = células apresentadoras de antígenos
CEC = carcinoma espinocelular
DAB = cromógeno associado a peróxido de hidrogênio
DIPAT = Divisão de Patologia do Instituto Nacional de Câncer
HR = do inglês, hazard ratios
IHQ = imunohistoquímica
IL-2 = interleucina-2
IL-4 = interleucina-4
IL-5 = interleucina-5
IL-6 = interleucina-6
IL-8 = interleucina-8
IL-10 = interleucina-10
IL-12 = interleucina-12
IL-13 = interleucina-13
IL-33 = interleucina-33
INCA = Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva
IMC = Índice de massa corporal
LMR = razão linfócito/monócito
MHC = complexo principal de histocompatibilidade
NK = células natural killers
NRL = razão neutrófilo/linfócito
OPAS = Organização Pan Americana de Saúde
OR = do inglês, odds ratio
OS = do inglês, overall survival
PBMC = células mononucleares do sangue periférico
PCR = proteína C reativa
PRL = razão plaqueta/linfócito
PS = do inglês, performance status
ROC = do inglês, Receiver operating characteristic curve
RTX = radioterapia
RTX/QT = radio-quimioterapia
SG = sobrevida global
T CD3+ = linfócitos T CD3+
T CD4+ = linfócitos T CD4+
T CD8+ = linfócitos T CD8+
TILs = linfócitos infiltrados no tumor
TNF = fator de necrose tumoral
TNM = sistema de estadiamento tumor-nódulo-metástase
WHO = do inglês, World Health Organization
16
1. INTRODUÇÃO
1.1. Câncer
O câncer é uma doença caracterizada pelo envolvimento de alterações dinâmicas no
genoma. Várias linhas de evidência indicam que, em seres humanos, a tumorigênese
envolve um processo de várias etapas, as quais são reflexos de alterações genéticas
promotoras da transformação das células humanas normais em derivados altamente
malignos (HANAHAN e WEINBERG, 2000). Essas alterações na expressão ou na função
de genes essenciais para a manutenção da homeostasia celular provocam a perda da
capacidade da célula em responder aos sinais de proliferação, diferenciação e morte,
adquirindo autonomia de crescimento e tornando-se independentes de controles externos
(FREITAS et al., 2010).
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (WHO, 2008), o câncer é uma das
principais causas de mortalidade no mundo. São estimados 27 milhões de novos casos de
câncer para o ano de 2030 em todo o mundo, e 17 milhões de mortes pela doença. Os países
em desenvolvimento serão os mais afetados, entre eles o Brasil. Estima-se, para o Brasil, no
biênio 2018-2019, a ocorrência de 600 mil novos casos de câncer ao ano. Excetuando-se o
câncer de pele não melanoma (cerca de 170 mil casos novos), ocorrerão 420 mil casos
novos de câncer. O cálculo global corrigido para o sub-registro aponta a ocorrência de 640
mil novos casos (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2017).
1.2. Câncer de cabeça e pescoço
O câncer de cabeça e pescoço (CP) é representado na sua imensa maioria por
neoplasias epiteliais do tipo carcinoma espinocelular (CEC) que acometem as vias
aerodigestivas superiores (DEDIVITIS et al., 2004). O mesmo ocupa a quinta posição na
lista das neoplasias mais frequentes, com uma incidência mundial estimada de 780.000
novos casos por ano (COLOMBO e RAHAL, 2009; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2017).
De maneira semelhante às demais neoplasias, a incidência deste tipo de câncer
aumenta com a idade, acometendo, predominantemente, indivíduos com idade superior a 40
17
anos. Entretanto, cabe ressaltar que a maioria dos casos, é identificada em indivíduos com
idade superior a 50 anos (MEHROTA et al., 2003; BERNARDI et al., 2005). O câncer de
CP é frequente nos indivíduos do sexo masculino com uma relação de 10:4 em relação ao
sexo feminino (DE MELO NETO et al., 2018). Contudo, foi observado o declínio desta
proporção nos últimos anos, possivelmente, devido ao fato de que as mulheres adquiriram
os hábitos antes considerados masculinos, como o tabagismo e a ingestão de bebidas
alcoólicas (CURADO & HASHIBE, 2009).
Setenta e cinco por cento dos pacientes diagnosticados com a doença apresenta-se em
estádios avançados (III ou IV). Estima-se sobrevida de 65% em cinco anos para os casos de
doentes diagnosticados em estádios iniciais (I e II) e, menor que 30% para aqueles com
tumores em estádios mais avançados (III e IV) (CARVALHO, 2012).
1.3. Fatores de risco
É bastante conhecido que os aspectos ambientais são de grande importância para o
desenvolvimento do câncer. Os principais fatores de risco identificados para o câncer de
cabeça e pescoço incluem o consumo de bebida alcoólica, tabagismo, exposição ao
papiloma vírus humano (HPV) e o baixo consumo de frutas e hortaliças (SANTOS et al.,
2012; CHUANG et al., 2012; GALBIATTI et al., 2013).
Foi descrito que usuários de tabaco tem 5 a 25 vezes mais chance de desenvolver
CEC, quando comparados aos não fumantes, e o consumo associado de álcool ao fumo
aumenta este risco para 40 vezes (GOLDENBERG et al., 2004; KFOURI et al., 2018).
O padrão da dieta também parece contribuir para a ocorrência da doença, sendo o
risco de CEC inversamente proporcional à ingestão de frutas e hortaliças frescas. Além
disso, o alto consumo de carnes cozidas a elevadas temperaturas e, consequentemente, com
elevados teores de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos considerados carcinógenos
também está associado ao aumento do risco de desenvolvimento tumoral (BRENNAN et
al., 2004; RIGHINI et al., 2013).
18
1.4. Câncer de laringe
Entre os tumores de cabeça e pescoço, o câncer de laringe ocupa a primeira posição e,
representa o segundo tipo de câncer mais comum no mundo, atrás apenas do câncer de
pulmão. O total de casos novos estimados para essa doença, em 2012, no mundo,
representou 138.102 novos casos. Para o Brasil, estimam-se 6.390 novos casos de câncer de
laringe em homens e 1.280 em mulheres para cada ano do biênio 2018-2019 (Figura 1). O
risco estimado será de 6,17 casos a cada 100 mil homens, ocupando a oitava posição, e a
16ª mais frequente com 1,20 casos a cada 100 mil mulheres (MINISTÉRIO DA SAÚDE,
2017).
Figura 1. Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes
estimados para 2018 por sexo, exceto pele não melanoma. (Fonte: Ministério da Saúde,
2017).
O CEC de laringe é o tipo histológico mais frequente e presente em 90% dos casos,
apresentando comportamento bastante agressivo e importante impacto sobre o estado
nutricional e a qualidade de vida (DEDIVITIS et al., 2004).
A laringe possui características funcionais que são extremamente relevantes na
tomada de decisão terapêutica, isto é, fonação, respiração e deglutição, contribuindo
também para paladar e olfato. Anatomicamente, este órgão é dividido em supraglote, glote
e subglote. Esta divisão apresenta relevância para o tratamento, tendo em vista que o
comportamento clínico dos tumores de cada subsítio é diferente, assim como suas vias de
disseminação local, regional e sistêmica. A região supraglótica (40 % dos casos) é rica em
19
vasos linfáticos, o que resulta em altas taxas de metástases cervicais (variando entre 25 e 75
% para todos os estadiamentos). Diferentemente, a região glótica (59 % dos casos) é pobre
em vasos linfáticos, sendo a disseminação tumoral principalmente por invasibilidade local.
Os tumores de subglote são muito raros (1 %) e seu tratamento é habitualmente cirúrgico
(SBOC, 2011).
1.4.1. Diagnóstico e estadiamento do CEC de laringe
Para diagnóstico e estadiamento do CEC de laringe é indicado o exame clínico e
endoscópico da área. O diagnóstico definitivo é estabelecido pelo estudo histológico de
material de biópsia obtido por nasofaringolaringoscopia ou laringoscopia direta. O
estadiamento, por sua vez, é baseado no sistema TNM, o qual considera a extensão de
acometimento local do tumor (T), a identificação da presença ou da ausência de metástases
para linfonodos (N) e regiões à distância (M) (Figura 2) (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004;
EDGE et al., 2010).
Figura 2. Estadiamento CEC de laringe. (Fonte: Ministério da Saúde, 2004).
T -Tumor Primário TX O tumor primário não pode ser avaliado T0 Não há evidência de tumor primário Tis Carcinoma in situ
N- Linfonodos Regionais NX Os linfonodos regionais não podem ser avaliados N0 Ausência de metástase em linfonodos regionais N1 Metástase em um único linfonodo homolateral, com 3 cm ou menos N2 Metástase em um único linfonodo homolateral, com mais de 3 cm até 6 cm; ou em
linfonodos homolaterais múltiplos, nenhum deles com mais de 6 cm; ou em linfonodos bilaterais ou
contralaterais, nenhum deles com mais de 6 cm N2a Metástase em um único linfonodo homolateral, com mais de 3 cm até 6 cm N2b Metástase em linfonodos homolaterais múltiplos, nenhum deles com mais de 6 cm N2c Metástase em linfonodos bilaterais ou contralaterais, nenhum deles com mais de 6 cm N3 Metástase em linfonodo com mais de 6 cm em sua maior dimensão
M - Metástase à distância MX A presença de metástase à distância não pode ser avaliada M0 Ausência de metástase à distância M1 Metástase à distância
20
Cinco grupos de pacientes podem ser identificados por este sistema (estádios 0, I, II,
III e IV), sendo que as maiores probabilidades de sobrevivência são observadas naqueles
com doença localizada, sem comprometimento de linfonodos e/ou metástases (Figura 3)
(SBOC, 2011).
Figura 3. Estádios para o carcinoma de laringe. (Fonte: Ministério da Saúde, 2004).
1.4.2. Tratamento CEC de laringe
O objetivo primário do tratamento é a cura do paciente. O estadiamento e o subsítio,
assim como o estado geral (performance status) e a idade do paciente são variáveis a serem
consideradas na escolha da modalidade de tratamento (SBOC, 2011).
A utilização de cirurgia, quimioterapia e/ou radioterapia dependem da possibilidade
de ressecção, da localização do tumor e da viabilidade de abordagens, tendo em vista a
preservação dos órgãos. A cirurgia é apontada como a principal opção de tratamento para
doença primária, secundária e recorrente (BOEHM et al., 2010). Em pacientes com o
diagnóstico precoce, o tratamento cirúrgico radical ou a radioterapia com ou sem
quimioterapia oferecerem sobrevida de 60-80 % aos pacientes em cinco anos após o
tratamento (LANG et al., 2004; YUKAKO et al., 2005).
O CEC de laringe no estádio inicial (T0) é, em geral, formado de tumores glóticos,
que acometem as cordas vocais. Normalmente, são diagnosticados mais precocemente
devido a alterações na voz e, são quase sempre curáveis com a retirada das cordas vocais,
Estádio 0 Tis N0 M0 Estádio I T1 N0 M0 Estádio II T2 N0 M0 Estádio III T1, T2 N1 M0
T3 N0, N1 M0 Estádio IVA T1, T2, T3 N2 M0
T4a N0, N1, N2 M0 Estádio IVB T4b Qualquer N M0
Qualquer T N3 M0 Estádio IVC Qualquer T Qualquer N M1
21
por cirurgia endoscópica ou radioterapia, sem necessidade de uma cirurgia extensa
(AGRAWAL & HA, 2008; PONTES et al., 2011).
Com relação aos estádios I e II, quase a maioria dos pacientes podem ser tratados
com sucesso, sem a retirada total da laringe. Na maioria dos casos pode ser administrada
apenas a radioterapia ou realizada a laringectomia parcial. Os resultados em relação à voz
tendem a ser melhores com a radioterapia do que com a laringectomia parcial, e a taxa de
complicação tende a ser menor para o tratamento radioterápico (GALBIATTI et al., 2013).
Os estádios mais avançados (III e IV), muitas vezes necessitam de um tratamento
combinando a cirurgia, radioterapia e/ou quimioterapia. A cirurgia para estes tumores é
quase sempre a laringectomia total. Devido ao maior risco de disseminação do tumor para
os gânglios linfáticos, normalmente o esvaziamento cervical é realizado concomitantemente
a cirurgia. Frequentemente, é ainda administrada a radioterapia adjuvante pós-cirúrgica
(DEDIVITIS et al., 2011).
Os tumores maiores ou metastáticos, que não podem ser removidos cirurgicamente,
são tratados com radioterapia, geralmente, combinada com quimioterapia ou com
imunoterapia (COOPER et al., 2004; KONG et al., 2010).
1.5. CEC de laringe e estado nutricional
Estudos tem demonstrado que o estado nutricional está associado à sobrevida em
diversos tipos de câncer de cabeça e pescoço, incluindo o CEC de laringe (GAUDET et al.,
2010; LI et al.,2015). A desnutrição tem sido reconhecida como indicador de mau
prognóstico, relacionando-se ao aumento da morbi-mortalidade, do risco de complicações
pós-operatórias e da redução da tolerância ao tratamento quimioterápico e radioterápico
(SILVA, 2006).
Estima-se que 57 % dos indivíduos com câncer de cabeça e pescoço apresentem
perda ponderal importante antes do início do tratamento (TAKARA et al., 2012). Os
tratamentos a que são submetidos os pacientes com câncer de cabeça e pescoço, seja a
cirurgia, a quimioterapia ou a radioterapia, podem dificultar ou impossibilitar a ingestão
alimentar por via oral (PAULA & SAWADA, 2015). Adicionalmente, a cirurgia,
dependendo da sua extensão, pode acarretar distúrbios da deglutição, fonação e respiração,
22
impossibilitando temporariamente a adequada ingestão alimentar por via oral. Da mesma
forma, a quimioterapia e a radioterapia produzem graus variados de mucosite e xerostomia
que podem causar quadros severos de disfagia e odinofagia, além de náuseas e vômitos
(TAKARA et al., 2012). Todo este quadro contribui para a depleção nutricional, o que
consequentemente influencia desfavoravelmente na sobrevida dos pacientes (CORRÊA &
SHIBUYA, 2007; JUIZ & BORGES, 2019).
Silva et al. (2018) demonstraram que a perda de peso no paciente com câncer de
cabeça e pescoço está diretamente relacionada ao estadiamento da doença e aos efeitos
recorrentes no tratamento radioterápico. Foi apontado que os pacientes desnutridos
cursavam com uma taxa de sobrevida, em dois anos, de 35 %, enquanto em pacientes bem
nutridos, a taxa de sobrevida, no mesmo período, foi de 64% (HAMMERLID et al., 2001).
O índice de massa corporal (IMC) é amplamente utilizado para avaliar o estado
nutricional, tendo sido identificado como um possível fator de risco para vários tipos de
câncer, incluindo os de cabeça e pescoço (NGUYEN & YUEH, 2002; LIU et al., 2006;
TAKENAKA et al.,2015).
Em uma revisão sobre o impacto do IMC na sobrevida de pacientes com câncer de
cabeça e pescoço, o IMC foi inversamente correlacionado com a sobrevida (DEN
HOLLANDER et al., 2015). Maasland et al. (2015) também demonstraram que o IMC, na
linha de base, foi inversamente associado ao risco de câncer de cabeça e pescoço, com uma
taxa de incidência multivariada (RR) de 3,31 (IC 95% 1,40–7,82) para indivíduos com IMC
< 18,5 kg / m2 quando comparados a indivíduos com IMC entre 18,5 – 25 kg / m2. Da
mesma forma, Li et al. (2015) apontaram que o IMC pré-tratamento < 18,5 Kg / m2 foi,
significativamente, associado a pior sobrevida em pacientes com CEC de laringe. Os
autores concluíram que o IMC provou ser um fator de prognóstico independente para estes
pacientes.
Embora o IMC seja um biomarcador antropométrico que não leve em consideração a
razão de tecido adiposo / massa magra, a distribuição de gordura corporal ou outros fatores
que afetem os riscos à saúde dos pacientes, o mesmo é, ainda, amplamente utilizado em
estudos epidemiológicos, devido à sua facilidade e precisão de medição (GAMA et al.,
2017). Corroborando com esses dados, Saroul et al. (2018) ao analisarem o valor preditivo
de vários métodos de diagnóstico do estado nutricional em pacientes com câncer de cabeça
23
e pescoço reportaram que o IMC possui uma especificidade de 98% e, um valor
prognóstico positivo de 92%, sendo, portanto, as informações fornecidas por este parâmetro
confiáveis e, úteis.
Adicionalmente, a desnutrição energético-protéica está associada com a piora da
imunidade tanto celular quanto humoral (CHANG et al., 2013). Foi observado, em
pacientes desnutridos, uma perda da diferenciação corticomedular, resultando em uma
redução das células linfóides. Além disto, a desnutrição altera a habilidade dos linfócitos T
em responder apropriadamente as citocinas (ENWONWU & SANDERS, 2001).
Dentro desse contexto, a diminuição do número total de linfócitos, do equilíbrio dos
subtipos de linfócitos T e, dos mecanismos inespecíficos de defesa pode ser consequência
direta de deficiências nutricionais (BRUNETTO et al., 2007).
1.6. CEC de laringe e imunidade
A resposta imune é dependente de replicação celular e da síntese protéica, sendo,
consequentemente, afetada pelo estado nutricional (ALWARAWRAH et al., 2018).
Respostas imunes antitumorais podem ser inata (natural) ou adquirida (adaptativa). A
imunidade inata é mediada por células, sendo macrófagos, neutrófilos, células dendríticas e
células Natural Killers – NK as principais células efetoras da imunidade inata. Fagocitose,
liberação de mediadores inflamatórios, ativação de proteínas do sistema complemento, bem
como síntese de proteínas de fase aguda, citocinas e quimiocinas são os principais
mecanismos na imunidade inata (CRUVINEL et al., 2010).
A resposta imune adaptativa a tumores, por sua vez, é mediada por receptor de
células T que reconhece peptídeos tumorais ligados a moléculas do complexo principal de
histocompatibilidade (MHC) expressas por células apresentadoras de antígenos (APC). As
próprias células tumorais também podem servir como APCs, embora tenham baixos níveis
da expressão de moléculas de MHC de classe I e MHC de classe II na superfície das
mesmas, gerando um processo ineficiente (FERRONE & WHITESIDE, 2007).
Evidências demonstram que a resposta antitumoral de pacientes com carcinoma
epidermóide ou espinocelular de cabeça e pescoço está comprometida. Foi demonstrada
uma disfunção e apoptose dos linfócitos T nas áreas infiltradas por tumor nestes pacientes.
24
Ao que parece, o CEC de cabeça e pescoço efetivamente escapa do sistema imune do
hospedeiro e corrompe a sua resposta por meio de diferentes mecanismos (WHITESIDE,
2005; CURRY et al., 2014).
O CEC de laringe apresenta particularidades quanto ao seu microambiente específico:
presença regional de múltiplas células imunes e a proximidade dos linfonodos cervicais.
Porém, o papel das células e do sistema imune em geral, no desenvolvimento desse câncer,
não está claro. Enquanto a origem do processo tumoral está claramente associada ao
contato de carcinógenos (tabaco e álcool) na mucosa do trato aero digestivo alto e a sua
progressão a uma série de alterações genéticas, a sobrevivência da célula alterada depende
da sua capacidade de resistir às células imunes efetoras (WHITESIDE, 2010).
A presença do tumor parece exercer um efeito supressor local e sistêmico na
atividade antitumoral. Não apenas disfunção, mas a morte de células imunes efetoras é
observada em pacientes com câncer de cabeça e pescoço avançado (WHITESIDE, 2005).
A perda da expressão de moléculas de histocompatibilidade de classe I (MHC) e de
componentes da maquinaria processadora de antígenos nas células tumorais, também é
considerada uma deficiência comum em carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, o
que torna possível que ela possa progredir evadindo do sistema imune do hospedeiro
(CAMPOLI et al., 2002; ZANCOPE et al., 2010). A taxa de perda de MHC classe I em
carcinomas de laringe é de cerca de 70 % (CABRERA et al., 2000).
As alterações da resposta imune celular destes pacientes certamente ultrapassam o
micro-ambiente tumoral (HOFFMANN et al., 2002; KUSS et al., 2003). Foi demonstrado
que uma proporção substancial de células T CD3+ se liga a um marcador de apoptose
precoce (anexina V) e apresenta atividade de caspase-3 aumentada, o que indicaria que
estas células T estão predestinadas a entrar em apoptose. O fato do tumor não só desarmar o
sistema imune, mas eliminar o CD3+ através de apoptose precoce, sugere que haja um
rápido turnover de linfócitos e talvez linfopenia em pacientes com câncer de cabeça e
pescoço. Células T CD8+ específicas tumorais são particularmente sensíveis a apoptose em
pacientes com câncer (WHITESIDE, 2005). Foi observado que pacientes com recorrência
ou segundo primário possuem maior nível de células T CD8+ que se ligam a anexina e,
portanto, a contagem de células T fica muito diminuída (KUSS et al., 2004).
25
A alta densidade de linfócitos infiltrados no tumor (TILs) tem sido reconhecida como
um bom marcador prognóstico (RUFFINI et al., 2009; LEFFERS et al., 2009;
BALERMPAS et al., 2014). Neste sentido, a estimativa do número de linfócitos no sítio
tumoral pode, portanto, ter um importante significado prognóstico (HENDRY et al., 2017;
CHEN et al., 2017; FANG et al., 2017).
A identificação imunohistoquímica de linfócitos infiltrados no tumor (TIL’s) tem sido
correlacionada com melhores prognósticos em pacientes com câncer e a razão de células T
CD4+/CD8+ tem sido descrita como um parâmetro para avaliação apropriada dessa
infiltração linfocitária (FARIAS et al., 2007; SHAH et al., 2011).
Estudos sugerem que o tipo, e não a quantidade de células que infiltram o tumor pode
ser determinante para o prognóstico (CURIEL et al., 2004; ZANCOPE et al., 2010). Um
aumento da densidade de células T no infiltrado com uma alta proporção de células T CD8+
foi associado com uma proteção significativa contra a recidiva tumoral em pacientes com
adenocarcinoma primário colorretal (PAGES et al., 2005). Karpathiou et al. (2017)
demonstraram que a maior densidade de células T CD8+ no infiltrado tumoral foi um fator
prognóstico positivo em pacientes com carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço. Da
mesma forma, uma recente revisão sistemática e metanálise confirmaram o papel favorável
e prognóstico da infiltração de células T CD8+ em pacientes com CEC de cabeça e pescoço
(RUITER et al., 2017).
O papel das células T CD4+ no microambiente tumoral ainda é controverso. Existe
uma vasta gama de subconjuntos de células T CD4+ com diferentes funções, desde as
células Th1 estimulantes da resposta celular citotóxica, até às células T reguladoras
supressoras da imunidade (SAKAGUCHI et al., 2008; KIM & CANTOR, 2014). Hoesli et
al. (2018) demonstraram que, níveis elevados de linfócitos TCD4+ e TCD8+ infiltrados no
tumor foram associados com melhor sobrevida, bem como, com a sobrevida livre de
doença em pacientes com carcinoma de laringe persistente/recorrente.
Em relação a razão de células T CD4+/CD8+, Wolf et al. (2015) relataram, em
pacientes com carcinoma de células escamosas de cavidade oral, que a razão de células T
CD4+/CD8+ tendeu a ser mais elevada no infiltrado tumoral de pacientes que apresentaram
melhor sobrevida e melhor sobrevida livre de doença. Fluxá et al. (2018) também
26
demonstraram, em pacientes com câncer de vesícula biliar, que uma razão de células T
CD4+/CD8+ <1 no infiltrado tumoral foi associada com aumento da sobrevida.
Embora estudos relacionem a intensidade e o teor do infiltrado linfocitário tumoral a
um melhor prognóstico, esse assunto ainda é bastante controverso.
1.7. CEC de laringe e marcadores inflamatórios
Os marcadores inflamatórios comumente utilizados na prática clínica têm se
mostrado prognósticos sensíveis em várias populações de estudo com câncer. A dosagem
de proteína C reativa (PCR) já é bem descrita na literatura como marcador de inflamação
sistêmica (YUAN-CHANG & YA-FEN, 2003; XU et al., 2015). As razões
neutrófilo/linfócito (NLR), plaqueta/linfócito (PLR) e, mais recentemente,
linfócito/monócito (LMR) foram introduzidas como potenciais marcadores inflamatórios,
utilizados como fatores de prognóstico em várias doenças, incluindo diversas neoplasias
(DURMUS et al., 2015; RACHIDI et al., 2015; TAN et al., 2015; URAL et al., 2015;
SHUBUTANI et al., 2015; KOH et al., 2016; ZHOU et al., 2017).
Os estudos têm buscado avaliar a utilização destes marcadores como ferramenta
prognóstica em pacientes com câncer de cabeça e pescoço (MOON et al., 2016; KANO et
al., 2017). No entanto, poucos trabalhos têm sido conduzidos em pacientes com CEC de
laringe (HSUEH et al., 2017; DU et al., 2018). No que tange a investigação da relação
entre estes marcadores inflamatórios e, o estado nutricional, em pacientes com CEC de
laringe, não são encontrados trabalhos disponíveis na literatura atual.
Neste sentido, a utilização dos mesmos como indicadores de prognósticos e a análise
da combinação destes com o estado nutricional pode auxiliar na predição de resultados
desfavoráveis em pacientes oncológicos.
A proteína C reativa (PCR) é uma proteína de fase aguda sintetizada no fígado e
regulada por citocinas pró-inflamatórias, como interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8) e
fator de necrose tumoral (TNF). Em condições inflamatórias, o nível sérico de PCR pode
aumentar em pelo menos 25 % (AGUIAR et al., 2013). Estudos relatam que valores séricos
elevados de PCR estão associados a menores taxas de sobrevida em pacientes com câncer
(YUAN-CHANG & YA-FEN, 2003; STEFFENS et al., 2013). Khandavilli et al. (2009)
27
demonstraram que valores pré-operatórios de PCR elevados foram associados a pior
sobrevida global em pacientes com carcinoma epidermóide oral. Os valores séricos de PCR
e albumina podem predizer, também, desnutrição e mortalidade (HONDA et al., 2006).
Os linfócitos constituem aproximadamente um terço de todos os glóbulos brancos
humanos. Eles desempenham um papel crítico na resposta imune ao câncer (MELLMAN et
al., 2011). A imunossupressão, expressa como linfopenia, tem sido associada à menor
sobrevida em diversos tipos de câncer, além do câncer de cabeça e pescoço, como câncer
de mama, sarcoma, linfoma, câncer de pâncreas e câncer de pulmão (SUZUKI et al., 2018).
A infiltração de neutrófilos no tumor pode produzir e secretar fatores de crescimento
reguladores da angiogênese, citocinas e proteases que promovem o crescimento tumoral e,
levam a uma menor taxa de sobrevida. Além disso, os neutrófilos têm demonstrado
capacidade de suprimir a atividade citotóxica dos linfócitos e das células natural killer
(NK), bem como, inibir a ativação dos linfócitos T através da produção de espécies reativas
de oxigênio, arginase e óxido nítrico (HSUEH et al., 2017).
A razão neutrófilo/linfócito (NLR), no momento do diagnóstico, é um marcador
validado de inflamação sistêmica e um indicador prognóstico de malignidade. O desbalanço
nesta razão está associado ao crescimento tumoral e metástases (XUE et al., 2015; KOH et
al., 2016). Dados publicados sugerem que uma elevação da NLR pré-operatória pode estar
correlacionada com um aumento do risco de recorrência, agressividade tumoral, pior
prognóstico, propensão para metástases e morte em vários tipos de tumor (KUM et al.,
2014; URIBE-QUEROL & ROSALES, 2015; MOONA et al., 2016; FARIA, 2016).
Sato et al. (2017), ao avaliarem a relação entre NLR, inflamação e resultados de
quimioterapia em pacientes com CEC esofágico localmente avançado e metastático,
demonstraram que os níveis de proteína C reativa (PCR) foram significativamente
correlacionados com NLR, e os índices de estimulação e marcadores de reações imunes
foram inversamente correlacionados com NLR em pacientes submetidos a
quimioradioterapia e quimioterapia exclusiva. Em ambos os tratamentos, uma resposta
parcial foi significativamente maior em pacientes com NLR baixa e com doença
progressiva em comparação com aqueles com NLR alto. A sobrevivência global de
pacientes submetidos a quimioradioterapia ou quimioterapia exclusiva foi
significativamente pior em pacientes com NLR alto em comparação com aqueles com NLR
28
baixo. Os autores sugerem, portanto, que NLR poderia servir como um marcador útil da
resposta do tumor, imunossupressão, e prognóstico.
DU et al. (2018), ao avaliarem a associação entre NRL e sobrevida em pacientes com
CEC de laringe, demonstraram que a NLR foi identificada como um fator de prognóstico
independente para sobrevida global e sobrevida livre de progressão de doença. Os autores
demonstraram, ainda, que níveis elevados de citocinas nos tecidos tumorais, incluindo
interleucina-6 (IL-6) e interleucina-8 (IL-8) foram associadas aos valores de NLR.
Desta forma, a razão neutrófilo/linfócito tem sido proposta como um biomarcador
para a estratificação de risco de pacientes oncológicos e, também para orientar as decisões
terapêuticas (COFFLET et al., 2016).
Da mesma forma, as plaquetas fornecem moléculas bioativas necessárias a progressão
tumoral e, podem interagir com as células cancerígenas, facilitando o processo de
metástase, através do contato direto célula-a-célula e, mediante a secreção de fatores de
crescimento angiogênico, epitelial e estromal, bem como, de enzimas de remodelamento da
matriz óssea (DU et al., 2018).
A razão plaqueta/linfócito (PRL), quando elevada, pode estar relacionada a mau
prognóstico, principalmente em pacientes com indicação cirúrgica (XIE et al., 2014) que já
apresentem diagnóstico de desnutrição (XIE et al., 2014; ONG et al., 2017;
JAGADESHAM et al., 2017). Mao et al. (2018) demonstraram que pacientes com CEC de
laringe com alta PLR tiveram desfechos de sobrevida significativamente piores em 5 anos.
Os autores demonstraram ainda que os níveis de albumina e hemoglobina foram menores
no subgrupo PLR-alto, o que indicou que o status elevado de PLR é geralmente
acompanhado de desnutrição.
O aumento da contagem de monócitos, por sua vez, tem sido associado com menor
taxa de sobrevida (KANO et al., 2017). Durante a progressão tumoral, monócitos
circulantes e macrófagos são ativamente recrutados para os tumores, onde alteram o
microambiente tumoral e aceleram sua progressão (ONUCHIC e CHAMMAS, 2010). Os
monócitos produzem um grande número de fatores pró-angiogênicos, linfangiogênicos,
citocinas e proteases, os quais são mediadores que potencializam a progressão neoplásica,
através da secreção de metaloproteases, remodelamento tecidual, sobrevivência ectópica de
29
células malignas e desenvolvimento de microambientes imunossupressores que atenuam a
atividade citotóxica dos linfócitos TCD8+ (CHANMEE et al., 2014).
A diminuição da razão linfócito/monócito (LMR) tem sido associada com pior
prognóstico e menores taxas de sobrevida (KANO et al., 2017). Hsueh et al. (2017)
demonstraram que LMR era um fator de prognóstico independente para sobrevida livre de
doença e sobrevida doença-específica em pacientes com CEC de laringe.
Tham et al. (2018) em uma revisão sistemática e meta-análise que investigou a
relação entre LMR pré-tratamento e prognóstico em pacientes com câncer de cabeça e
pescoço, demonstraram que LMR elevada estava associada com um aumento significativo
da sobrevida global e, com sobrevida livre de doença.
Dessa forma, o presente trabalho objetivou investigar a relação da associação do
estado nutricional com os parâmetros inflamatórios e, com o perfil do infiltrado linfocitário
tumoral em pacientes com diagnóstico de carcinoma espinocelular de laringe.
30
2. HIPÓTESE
Avaliar se a inclusão da classificação do índice de massa corporal junto aos
marcadores inflamatórios utilizados como indicadores de prognósticos promove ajuste do
valor preditivo dos mesmos e, analisar se a densidade da infiltração tumoral de linfócitos T
CD4+ e T CD8+, bem a razão entre estas, tanto na área estromal quanto intra-tumoral
sofrem alteração de acordo com o índice de massa corporal nos pacientes com carcinoma
espinocelular de laringe.
31
3. JUSTIFICATIVA
A desnutrição é bastante prevalente em pacientes com neoplasias de cabeça e
pescoço, sendo reconhecida como indicador de mau prognóstico e, relacionando-se ao
aumento da morbi-mortalidade.
Pacientes com câncer desnutridos geralmente apresentam um estágio de inflamação
crônica. Evidências sugerem que o aumento da inflamação sistêmica pode representar um
fator prognóstico desfavorável para estes pacientes. Ademais, pacientes desnutridos podem
ter um arrefecimento do sistema imune, desempenhado pelas células de defesa,
principalmente linfócitos T, e esse evento pode estar relacionado a piores desfechos
clínicos.
A presença da infiltração de linfócitos no tumor tem sido correlacionada com
melhores prognósticos em diversos tipos de câncer e, cada subgrupo de linfócito T possui
um papel específico na resposta anti-tumoral.
Dessa forma, investigar e entender os efeitos da desnutrição nos pacientes
oncológicos reforçam os objetivos dos cuidados nutricionais peri-terapêuticos. Sendo
assim, o estudo da avaliação do perfil da infiltração de linfócitos TCD4+ e TCD8+ e, a razão
de células TCD4+/TCD8+ em relação ao estado nutricional, assim como, a relação entre
estado nutricional, parâmetros inflamatórios e, infiltrado linfocitário tumoral no
prognóstico e sobrevida global de pacientes com CEC de laringe torna-se relevante. Os
resultados obtidos nesta tese poderão gerar indicadores que permitirão melhores decisões
terapêuticas, proporcionando maiores benefícios clínicos.
32
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo Geral:
Avaliar a relação do estado nutricional com os parâmetros inflamatórios e, com o infiltrado
linfocitário tumoral em pacientes com diagnóstico de carcinoma espinocelular de laringe.
4.2. Objetivos Específicos:
a) Traçar o perfil clínico, nutricional, hematológico e imunológico dos pacientes com
diagnóstico de carcinoma espinocelular de laringe;
b) Calcular os valores ótimos de ponte de corte para os indicadores inflamatórios de
prognósticos utilizados, com base na amostra estudada;
c) Investigar a relação do índice de massa corporal com os parâmetros hematológicos e
inflamatórios;
d) Observar os fatores prognósticos de sobrevida associados às variáveis estudadas;
e) Avaliar a sobrevida global de acordo com o índice de massa corporal, parâmetros
inflamatórios e, infiltração tumoral de linfócitos TCD4+ e TCD8+;
f) Avaliar a densidade e, o comportamento da infiltração de linfócitos TCD4+ e
TCD8+, bem como, da razão de células TCD4+/TCD8+, segundo a área tumoral
(estromal e intratumoral);
g) Avaliar se as características clinicopatológicas dos pacientes, índice de massa
corporal e marcadores inflamatórios de prognóstico alteram o perfil do infiltrado
tumoral de linfócitos TCD4+ e TCD8+, bem como a razão TCD4+/TCD8+, tanto na
área estromal quanto na intratumoral;
33
5. MATERIAL E MÉTODOS
5.1. Desenho do estudo
O estudo consistiu em uma coorte retrospectiva.
5.2. Critérios de inclusão
Foram incluídos todos os pacientes com diagnóstico de carcinoma espinocelular de
laringe (estágio I a IV), a partir de 20 anos de idade, de ambos os sexos, com diagnóstico
confirmado pela análise histopatológica, matriculados no Instituto Nacional de Câncer José
Alencar Gomes da Silva (INCA) entre janeiro de 2006 até dezembro de 2011, que
possuíam ao menos exames laboratoriais pré-tratamento disponíveis e uma avaliação
nutricional inicial (antes do início do tratamento).
5.3. Critérios de exclusão
Foram excluídas mulheres grávidas ou que estivessem amamentando; pacientes
submetidos à quimioterapia e/ou radioterapia antes da realização da cirurgia; pacientes com
presença de metástases ao diagnóstico; pacientes com diagnóstico de doença infecciosa em
atividade, doença hematológica, doença crônica inflamatória ou auto-imune, doença renal
e/ou hepática, patologia respiratória descompensada (doença pulmonar obstrutiva crônica –
DPOC), insuficiência cardíaca aguda ou crônica descompensada ou infarto agudo do
miocárdio há menos de seis meses. Foram excluídos, ainda, os pacientes que não deram
seguimento ao tratamento.
5.4. Amostra e coleta de dados
Com base nos critérios de inclusão e exclusão, foi identificado um total de 1.427
pacientes elegíveis para o estudo. Para coleta de dados, todos os 1427 prontuários físicos e
eletrônicos (Intranet – INCA) dos pacientes matriculados no período do estudo foram
analisados, de forma retrospectiva. Foram levantadas informações sócio-demográficas,
34
clínicas e patológicas destes pacientes, tendo sido os dados pré-tratamento coletados,
conforme formulário previamente elaborado (Anexo 1).
A coleta de dados foi realizada por pesquisadores previamente treinados, sendo
seguida da verificação da consistência dos dados obtidos e digitados por um segundo
pesquisador.
Foram excluídos do estudo casos onde o diagnóstico de CEC de laringe não foi
confirmado (n=108); aqueles que não possuíam exames bioquímicos pré-tratamento
disponíveis (n=504); os que não possuíam avaliação nutricional inicial/pré-tratamneto
(n=188); aqueles sem avaliação nutricional e sem exames bioquímicos iniciais disponíveis
(n=402); os que possuíam metástase ao diagnóstico (n=2); os que não deram continuidade
ao tratamento (n=9); aqueles que não foram submetidos a tratamento oncológico (n=19) e,
aqueles que realizaram tratamento fora da Instituição (n=25). Foram, ainda, excluídos do
estudo, os pacientes submetidos à quimioterapia e/ou radioterapia antes da cirurgia (n=2),
obtendo-se, portanto, um total de 168 pacientes com diagnóstico de CEC de laringe
elegíveis para o estudo.
Para realização das análises imuno-histoquímicas, foi utilizado somente o material
proveniente das peças cirúrgicas dos pacientes, por ser mais representativo do
microambiente tumoral na avaliação do infiltrado inflamatório. Desta forma, foram
excluídos os pacientes não tratados cirurgicamente (69) e, aqueles cujo material biológico
estava indisponível ou considerado inadequado ou insuficiente (8), obtendo-se, assim, 91
casos (Figura 4).
35
*CEC = carcinoma espinocelular de laringe; RXT = radioterapia; QT = quimioterapia.
Figura 4. Diagrama de fluxo de seleção dos pacientes.
Pacientes com CEC de laringe (n=1427)
Excluídas neoplasias
malignas de outras
histologias (n=108)
CEC laringe (n=1319)
Excluídos 1151 casos:
- Sem exame bioquímico pré-tratamento (n=504)
- Sem avaliação nutricional inicial (n=188)
- Sem avaliação nutricional e exames bioquímicos
iniciais disponíveis (n=402)
- Com metástase ao diagnóstico (n=2)
- Não deram continuidade ao tratamento (n=9)
- Não submetidos a tratamento (n=19)
- Tratamento fora da Instituição (n=25)
- RTX ou RTX/QT antes da cirurgia (n=2)
168 casos de CEC de laringe
(Amostra do manuscrito 1)
Excluídos 77 casos:
- Pacientes não submetidos à
cirurgia (n=69);
- Bloco cirúrgico indisponível
ou inviável (n=8)
91 casos de CEC de laringe tratados
cirurgicamente e, analisados com
marcadores imuno-histoquímicos
(Amostra do manuscrito 2)
36
5.4.1. Dados sócio-econômicos
Os seguintes dados foram coletados dos prontuários:
a) sexo: feminino e masculino;
b) idade: < 60 ou ≥ 60 anos;
c) grau de escolaridade: analfabeto ou alfabetizado, fundamental (completo ou
incompleto), médio (completo ou incompleto), superior (completo ou incompleto), pós-
graduação (completa ou incompleta) ou não declarada;
d) presença de etilismo: considerados como i) usuários de bebidas alcoólicas
aqueles que ingeriam algum tipo de bebida alcoólica, pelo menos uma vez na semana de
forma regular; ii) não usuários de bebidas alcoólicas, os demais e, iii) ex-etilistas, aqueles
que deixaram de ingerir bebidas alcóolicas antes do diagnóstico da doença, de acordo com
critério estabelecido por Huang et al. (2003). Foi estabelecida que a quantidade de uma
dose é o equivalente a 355 mL de cerveja ou 148 mL de vinho ou ainda 44 mL de bebida
destilada de acordo com padrão estabelecido pelo National Institute of Alcohol Abuse and
Alcoholism (NIAAA, 2004).
e) presença de tabagismo: considerados tabagistas os pacientes que mantiverem o
hábito de fumar até o momento do diagnóstico; não tabagistas aqueles que nunca fumaram
e, ex-tabagistas aqueles que mantiveram o hábito de fumar até, no máximo, cinco anos
antes do diagnóstico da doença, de acordo com o proposto por Freedman et al. (1996).
5.4.2. Dados clínicos
a) data do diagnóstico: definida como a data do exame histopatológico;
b) data de início e término do tratamento: coletadas através dos registros médicos
realizados nos prontuários;
c) tipo de tratamento: cirurgia, quimioterapia e/ou radioterapia associados ou
exclusivos;
d) localização do CEC: i) supraglótico; ii) glótico; iii) subglótico; iv) transglótico
e, v) lesão invasiva da laringe não-especificada, quando não foi possível definir
exatamente a área de acometimento do tumor na laringe;
37
e) grau de diferenciação do tumor: i) bem diferenciado; ii) moderadamente
diferenciado e, iii) pouco diferenciado;
f) estadiamento da doença: classificado com bases no sistema TNM e agrupados
segundo estádio da doença, em TI / T II x T III / T IV;
g) capacidade funcional / performance status (PS): avaliada segundo a escala do
Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) como PS 0 (atividade normal),
PS 1 (sintomas da doença, mas deambula e leva seu dia a dia normal), PS 2 (fora
do leito mais de 50% do tempo), PS 3 (no leito mais de 50% do tempo, carente
de cuidados mais intensivos) e, PS 4 (preso ao leito) (WEST & JIN, 2015);
h) presença de doença residual: corresponde ao número de células neoplásicas
detectáveis durante ou após o tratamento e, definido com sim ou não;
i) ocorrência de recidiva: retorno ou da recorrência da doença, após o tratamento.
A recidiva foi definida como sim ou não e, classificada em: 1) locorregional
(quando o tumor acometeu o mesmo local de origem ou envolveu linfonodos ou
tecidos próximos do tumor original); 2) metastática (houve disseminação para
órgãos ou tecidos distantes do tumor original);
j) aparecimento de um segundo tumor primário pós-tratamento: surgimento de
novo tumor, com características histopatológicas diferentes do tumor inicial;
k) ocorrência de óbito: definido como sim ou não;
l) controle: definido como sem evidência de doença locorregional;
m) presença de metástase ao longo do acompanhamento e/ou
invasão/comprometimento de linfonodos: definido como presença ou ausência;
n) Presença de invasão de estruturas adjacentes ao tumor: informação obtida
através do laudo histopatológico do paciente.
5.4.3. Parâmetros hematológicos
Os parâmetros hematológicos dos pacientes foram coletados do prontuário físico e/ou
eletrônico. Os mesmos foram coletados a partir do momento do diagnóstico, porém sempre
antes do início do tratamento oncológico.
38
a) Hemograma:
Leucograma:
Neutrófilos (por µL) - Valores de referência: 1600 - 7500 / µL
Linfócitos (por µL) - Valores de referência: 800 - 4500/ µL
Monócitos (por µL) - Valores de referência: 800 - 1000 / µL
Contagem de Plaquetas (k/ µL) - Valores de referência: 150 - 400 k/µL
Bioquímica sérica:
Proteína C reativa (mg/dL) - Valores de referência: abaixo de 0,5 mg/dL
5.4.4. Avaliação do estado nutricional
Para fins de diagnóstico corporal foram coletados dos prontuários dos pacientes o
peso corporal (Kg) e a estatura (m), ambos aferidos, antes do início do tratamento
oncológico, na primeira consulta do mesmo com o nutricionista no ambulatório de Cabeça
e Pescoço do referido Instituto e, calculados os valores de IMC, em kg / m2.
Os pacientes tiveram o estado nutricional classificado de acordo com a faixa de
IMC, segundo a World Health Organization (WHO, 1997) em: magreza (<18,5 kg / m²);
eutrófico (18,5 - 24,9 kg / m²); sobrepeso (25 - 29,9 kg / m²); obesidade grau I (30 - 34,9 kg
/ m²); obesidade grau II (35 - 39,9 kg / m²); obesidade grau III (≥ 40 kg / m²) para adultos e,
baixo peso (≤ 22 kg / m²); eutrófico (22 - 27 kg / m²); sobrepeso (≥ 27 kg / m²), para idosos,
segundo a Organização Pan Americana de Saúde (OPAS, 2002).
5.4.5. Análises imuno-histoquímicas
As amostras das peças cirúrgicas, provenientes de laringectomias dos pacientes com
CEC de laringe, foram coletadas e, o estudo imuno-histoquímico (IHQ) dos casos foi
realizado por patologista experiente, na Seção de Anatomia Patológica do INCA. Todos os
casos foram revisados por dois membros dessa Seção, sem o conhecimento prévio da
39
resposta ao tratamento desses pacientes. Somente foram analisadas as amostras dos
pacientes que não tinham sido submetidos à quimioterapia e/ou radioterapia antes da
realização da coleta da amostra.
Foi avaliada a infiltração de linfócitos no tumor e no estroma tumoral (T CD4+, T
CD8+) e a razão de linfócitos T CD4+/CD8+ em ambas localizações.
Para as análises imuno-histoquímicas foram utilizados os anticorpos anti-CD4 (Cell
Marque®, Rocklin, CA) e anti-CD8 (Cell Marque®, Rocklin, CA), num valor de diluição
efetivo em todos os blocos selecionados, contendo tumor. As reações de
imunohistoquímica foram realizadas de acordo com protocolo estabelecido após a
padronização dos anticorpos testados, respectivamente anticorpo primário monoclonal de
coelho, anti-CD4, (Cell Marque®, Rocklin, CA) clone SP35, à diluição de 1:300; anticorpo
monoclonal de coelho, anti-CD8 (Cell Marque®, Rocklin, CA) clone SP16, à diluição de
1:1.000
Inicialmente, para a realização da técnica de IHQ, utilizamos um micrótomo (Leica
Biosystems®, Nussloch, Germany) e foram seccionadas amostras de tecido tumoral
armazenadas em blocos de parafina com espessura de 3 μm em número suficiente para o
estudo dos três anticorpos. Foram separadas 5 secções para a avaliação das proteínas
correspondentes aos genes de interesse.
Os cortes foram fixados nas lâminas previamente tratadas com carga (ImmunoSlide
- Easy Path®), a partir de uma incubação de 12 horas em estufa a 60°C.
Em seguida, os cortes foram desparafinizados por imersão em quatro banhos de
xilol à temperatura ambiente. Logo após, foram desidratadas em quatro banhos de solução
alcoólica a 100 %, 90 %, 80 % e 70 %, e então, foram submersos em água destilada por 5
minutos, para reidratação.
Foi realizada a recuperação antigênica para imunomarcação dos anticorpos à
temperatura de 98°C, utilizando-se o processo a vapor (Steamer) por 30 minutos. As
lâminas incubadas no Steamer ficaram submersas em solução de recuperação antigênica
Trilogy (Cell Marque®, Rocklin, CA).
Em seguida, as lâminas foram colocadas sobre as bandejas, o excesso de água foi
retirado, as secções foram circundadas com caneta Dako Pen (Dako®) visando fixar o
40
reagente no corte do tecido e, então, as lâminas foram incubadas em três banhos de 5
minutos de tampão de lavagem (TBS 1X + 0,1 % deTween 20).
O excesso de TBS foi, posteriormente, retirado e os cortes foram incubados em
solução inibidora de peroxidase endógena (Peroxidase Block–NovoLink Max Polymer
Detection®, Novolink Leica Biosystems®, Nussloch, Germany®) por 5 minutos. As
lâminas foram, então, lavadas com água destilada e incubadas em mais três banhos de 5
minutos de tampão de lavagem. Os cortes foram secos e incubados em solução inibidora de
ligações inespecíficas (Protein Block–Novolink Polymer Detection Systems, Leica
Biosystems®, Nussloch, Germany®) por 5 minutos. Em seguida, o excesso de Protein
Block foi retirado.
Os anticorpos primários monoclonais específicos para os genes, anti-CD4 e anti-
CD8 foram aplicados (100 µL), um em cada lâmina. O controle negativo de cada caso
recebeu apenas a solução diluidora (Cell Marque®, Rocklin, CA, USA). As lâminas foram
incubadas “overnight”, com respectivos anticorpos a 4°C (geladeira) por 12 horas.
No dia seguinte da técnica, as lâminas foram lavadas com água destilada e
incubadas em 3 banhos por 5 minutos de tampão de lavagem e em seguida incubadas com o
anticorpo pós-primário, a solução Post Primary Block (Novolink Polymer Detection
Systems, Leica Biosystems®, Nussloch, Germany®) durante 30 minutos. O pós-primário é
um anticorpo secundário que se liga ao primário, permitindo a amplificação da marcação.
As secções foram, novamente, lavadas com água destilada e incubadas por mais três
vezes durante 5 minutos em tampão de lavagem para, em seguida, serem incubadas por 30
minutos na solução de polímero (Polymer-Novolink Polymer Detection Systems, Leica
Biosystems®, Nussloch, Germany®). Logo após foram lavadas com água destilada e mais
uma vez incubadas em 3 banhos de 5 minutos em tampão de lavagem.
Posteriormente, o processo de revelação foi realizado por meio de coloração por
DAB (Novolink Polymer Detection Systems, Leica Biosystems®, Nussloch, Germany®).
Para esta revelação, foi utilizado 50µL de DAB para cada 1 mL de solução tampão (Liquid
DAB+ Substrate Chromogen System, Dako®) sendo essas lâminas incubadas por 5 minutos
a seguir da aplicação do cromógeno. Essa solução permite revelar apenas as proteínas
necessárias na visualização da reação com o anticorpo. A contra coloração das lâminas foi
realizada com a Hematoxilina de Harris, por 30 segundos.
41
Por fim, após a retirada de hematoxilina em água corrente, foi realizada a
desidratação dos cortes em seis banhos subsequentes com álcool a 70 %, 80 %, 90 % e 100
% (cinco minutos cada); seguida por seis banhos de Xilol® por cinco minutos cada, para
clarificação. As lamínulas foram montadas com bálsamo e avaliadas ao microscópio óptico,
observando-se a marcação nuclear.
A infiltração de linfócitos T CD4+ e TCD 8+ foi avaliada de modo semiquantitativo,
segundo a área de infiltração (estromal ou intra-tumoral), em ampliações de x100 e x400 e,
pontuada como 1+ (baixo, < 30%), 2+ (moderado, ≥30% e <60%) ou 3+ (intenso, ≥60%).
A infiltração estromal foi definida como linfócitos localizados no estroma peritumoral
adjacente, sem contato direto com as células de carcinoma. Por sua vez, a infiltração intra-
tumoral foi definida como linfócitos localizados nos ninhos das células tumorais ou em
contato direto com o epitélio celular. Áreas de adenoma, ulceração, necrose e, periferia
tumoral foram excluídas das análises. Os pacientes foram, então, categorizados segundo
uma densidade total de linfócitos em “alto” (2+ ou 3+) ou “baixo” (0 ou 1+) (CROSS,
2001; WANG et al., 2016; XU et al., 2017).
A avaliação da razão de linfócitos T CD 4+/T CD8+ foi obtida dividindo-se a
contagem absoluta de linfócitos T CD4+ pela contagem absoluta de linfócitos T CD8+,
segundo a área de infiltração (estromal ou intra-tumoral) e, os pacientes foram também
categorizados em “alto” (≥1) ou “baixo (<1), segundo Fluxá et al. (2018) e Manzano et al.
(2010).
5.4.6. Parâmetros inflamatórios e indicadores de prognósticos
Foram utilizados como parâmetros inflamatórios e indicadores de prognósticos a
razão neutrófilo/linfócito (NLR), a razão plaqueta/linfócito (PLR), a razão
linfócito/monócito (LMR) e, a dosagem de proteína C reativa (PCR).
A NLR foi definida como a contagem absoluta de neutrófilos (μL) dividida pela
contagem de linfócitos (μL); PLR foi definida como a contagem de plaquetas (μL) dividido
pela contagem de linfócitos (μL) e, LMR foi definida como a contagem absoluta de
linfócitos (μL) dividida pela contagem de monócitos (μL).
42
5.4.7. Análise de sobrevida global
A sobrevida global foi definida como o tempo decorrido da data do diagnóstico
histopatológico da doença até a data do óbito ou censura (5 anos).
5.5. Aspectos éticos
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa/INCA (CEP/INCA) sob o
número 1.946.793 (Anexo II).
Carta explicativa contendo a justificativa de dispensa do uso do Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), bem como, a utilização do mesmo para
realização das análises imuno-histoquímicas nas amostras provenientes de cirurgias de
laringectomias, armazenadas em blocos de parafina, na Divisão de Patologia (DIPAT) do
Instituto foi previamente submetida e, aprovada pelo CEP/INCA (Anexos III e IV).
A dispensa do TCLE se fundamenta por se tratar de um estudo retrospectivo onde não
há risco para o paciente e todas as informações serão coletadas por meio de consulta ao
prontuário físico e eletrônico disponíveis nas dependências da instituição proponente.
A todos os pacientes em que foi realizada análise-imunohistoquímica em um
fragmento do bloco cirúrgico foi efetivada, previamente, a leitura explicativa do TCLE,
sendo prestados todos os esclarecimentos adicionais solicitados. Após devidamente
esclarecidos, os pacientes que aceitaram participar assinaram o termo, sendo então
incluídos no estudo. A ausência do TCLE para participantes falecidos e/ou sem
possibilidades de contato foi justificado em carta explicativa submetida ao Comitê de Ética.
A confidencialidade e a privacidade dos pacientes foram preservadas.
5.6. Análise Estatística
Os resultados foram obtidos a partir dos dados coletados dos prontuários médicos e
inseridos em uma base de dados com suas devidas críticas e avaliações ao longo da coleta.
As respostas foram extraídas em seu formato original e posteriormente categorizadas de
acordo com o objetivo do estudo.
43
Para fins de análise, o consumo de bebida alcoólica foi categorizado como "sim"
(indivíduos que consumiam algum tipo de bebida alcoólica >1x / semana), "não" (não
usuários de álcool) e "ex-etilistas" (cessou o consumo de bebida alcoólica antes do
diagnóstico da doença) (HUANG et al., 2003). Da mesma forma, o tabagismo foi
categorizado como “sim” (pacientes que mantiveram o hábito de fumar até a data do
diagnóstico), “não” (não fumantes) e “ex-tabagista” (aqueles que cessaram o hábito de
fumar até cinco anos antes do diagnóstico da doença) (FREEDMAN et al., 1996). Para fins
de avaliação e análise da relação do estado nutricional dos pacientes com as demais
variáveis, após a classificação do IMC (WHO, 1997; OPAS, 2002), as variáveis referentes
ao estado nutricional foram agrupadas em IMC baixo e IMC normal/elevado. A variável
“tipo de tratamento” foi também agrupada em cirurgia e QT e/ou RXT pós-cirurgia.
As variáveis categóricas foram expressas como frequências absolutas ou relativas e
variáveis contínuas, como média e desvio padrão ou mediana, amplitude mínima e máxima,
conforme apropriado. O teste de Kolmogorov-Smirnov foi realizado para avaliar a
distribuição das variáveis, utilizando o teste t de Student para variáveis com distribuição
normal e o teste de Mann- Whitney para comparação de distribuições não-gaussianas.
Visando identificar as possíveis relações entre o estado nutricional, fatores clínicos,
hábitos de vida dos pacientes, parâmetros inflamatórios e, infiltração de linfócitos TCD4+ e
TCD8+ no tumor foram utilizadas as tabelas de contingência e o teste Qui-quadrado de
Pearson (χ2).
Para os marcadores inflamatórios utilizados como indicadores de prognósticos
(NLR, PLR e, LMR) foram calculados os melhores pontos de corte, segundo o óbito em 5
anos, com base nas características da população estudada, através da utilização da curva
ROC (Receiver Operating Characteristic Curve) para sobrevida em conjunto com o Índice
de Youden (YOUDEN, 1950).
As curvas de sobrevida, por sua vez, foram calculadas usando-se o método de
Kaplan-Meier e as diferenças foram avaliadas através do teste de Log-Rank, visando a
comparação dos diferentes estratos de cada variável.
A associação entre marcadores inflamatórios, infiltração de linfócitos TCD4+ e
TCD8+ no tumor, segundo a área de infiltração (estromal e intra-tumoral) e, cada uma das
variáveis independentes consideradas no estudo foi verificada utilizando-se o cálculo do
44
odds ratio (OR), intervalo de confiança (IC) 95 % e o valor de p. As análises de sobrevida
univariada e multivariada foram realizadas utilizando-se o modelo de risco proporcional de
Cox para identificar o subconjunto mais importante de variáveis independentes associadas a
fatores prognósticos, gerando hazard ratios (HR) e seus respectivos IC (95 %). As análises
multivariadas foram realizadas, por meio do método stepwise, para avaliar as possíveis
associações ajustadas por fatores cujo p-valor foi <0,250 na análise univariada (HOSMER,
LEMESHOW & MAY, 2011).
A análise estatística foi processada utilizando o Statistical Package for the Social
Sciences (SPSS) 22.0 e o software Excel for Windows. Foi considerado o nível de
significância de 5 % no final das análises, tendo seus parâmetros apresentados com seus
respectivos IC de 95 %.
45
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A seção de resultados e discussão está dividida em dois manuscritos elaborados para esta
tese de doutorado.
Manuscrito 1: Body mass index adjusts the predictive value of inflammatory markers in
laryngeal squamous cell carcinoma patients.
(Índice de massa corporal ajusta o valor preditivo de marcadores inflamatórios em
pacientes com carcinoma espinocelular da laringe)
Manuscrito 2: Low body mass index reduces intratumoral infiltration of CD4+ T cells in
laryngeal squamous cell carcinoma patients
(Baixo índice de massa corporal reduz a infiltração intratumoral de linfócitos TCD4+ em
pacientes com carcinoma espinocelular de laringe)
46
6. 1 MANUSCRITO 1
Luana Dalbem Murad. Body mass index adjusts the predictive value of inflammatory
markers in laryngeal squamous cell carcinoma patients.
(Índice de massa corporal ajusta o valor preditivo de marcadores inflamatórios em
pacientes com carcinoma espinocelular da laringe)
47
6.1.1 Abstract
Background: Elevated inflammatory markers as neutrophil-to-lymphocyte ratio (NLR) and
platelet-to-lymphocyte ratio (PLR) and a reduced lymphocyte-to-monocyte ratio (LMR)
has been associated with poorer prognostic outcomes in cancer patients. However, little
attention has been given to the interaction between nutritional status and NLR, PLR, LMR
values in the cancer prognosis. Objective: To investigate the association between pre-
treatment body mass index (BMI) and NLR, PLR and LMR values on overall survival (OS)
in laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC) patients. Methods: A retrospective cohort of
168 LSCC patients, diagnosed and treated, between January 2006 to December 2011 were
followed until December 2016. We collected data about nutritional status, clinical factors,
patients' life habits, neutrophil-to-lymphocyte ratio (NLR), platelet-to-lymphocyte ratio
(PLR), and lymphocyte-to-monocyte ratio (LMR). The overall survival was analyzed by
Kaplan-Meier curves and the log-rank test. Cox proportional hazards model was used for
univariate and multivariate analyses. The p-value <0.05 was considered significant.
Results: In our cohort, only NLR was an independent prognostic value for survival. Our
results also demonstrated that high NLR (≥ 2.02) and PLR (≥ 135.5) values, and low pre-
treatment LMR (< 2.5) value were associated with poorer OS and increased mortality. Low
BMI did not significantly affect overall survival. However, no significant difference in
overall survival was observed between high and low PLR and LMR levels in the cohort of
patients diagnosed with thinness / low weight. Conclusion: Our data support the evidence
that NLR, PLR, and LMR are associated with the prognostic of LSCC. Moreover, our
results demonstrated for the first time that reduced BMI values could adjust PLR and LMR
prognostic value.
Keywords: Body mass index, laryngeal squamous cell carcinoma, neutrophil-to-
lymphocyte ratio, lymphocyte-to-monocyte ratio, prognosis, survival.
48
6.1.2 Introduction
Laryngeal squamous cell carcinomas (LSCC) are the most frequent cancers among
head and neck squamous cell carcinomas (HNSCCs) and, it is present in 90% of cases [1].
Studies have shown that LSCC 5-year survival is about 60 % regardless of stage, treatment
strategy, and tumor location [2, 3].
LSSC presents a very aggressive behavior and an important impact on nutritional
status [4, 5]. Malnutrition has been recognized as a marker of poor prognosis [6-8]. Some
studies have demonstrated that low body mass index (BMI) can be associated with poor
prognosis for head and neck cancer, including LSCC patients [9, 10]. Malnourished cancer
patients commonly have a chronic inflammation stage and it has been associated with poor
outcomes [11, 12]. Cumulating evidences suggests that increased systemic inflammation
might represent a stage-independent unfavorable prognostic factor in different types of
cancer [13-16]. In this sense, studies have evaluated the relationship of inflammatory
markers as a prognostic tool in LSCC patients [17-19].
The peripheral blood neutrophil-to-lymphocyte ratio (NLR), platelet-to-lymphocyte
ratio (PLR), and lymphocyte-to-monocyte ratio (LMR) have been investigated as useful
predictors of prognosis for head and neck cancers, including laryngeal cancer [20-25].
These parameters are readily available, reflects the systemic inflammation and is an
effective predictor of poor survival [26, 27]. NLR and PLR ratios higher during pre-
treatment have been associated with poorer prognosis in head and neck squamous cell
carcinoma [28, 29]. On the other hand, low pre-treatment LMR indicate significant worst
prognosis and poor survival [30].
Nevertheless, there is a lack of studies evaluating the relationship of nutritional
status with these inflammatory markers, and its possible influence in prognostic value.
Thus, the present study aimed to evaluate the prognostic significance of the association
between pre-treatment body mass index with NLR, PLR, and LMR values on the overall
survival (OS) of LSCC patients.
49
6.1.3 Material and Methods
Study population
This study was conducted using a cohort of LSCC patients (stage I-IV), both sexes,
of age > 20-years, who were regularly enrolled in a national referral hospital for cancer
treatment in Brazil between January 1th, 2006 to December 31th, 2011. Eligibility criteria
for inclusion in the study were presence of pathologically confirmed LSCC, available
pretherapeutic laboratory tests and data on height and weight, prior to any kind of therapy.
The exclusion criteria were as follows: (1) cancer of other origins or with metastasis at the
diagnosis; (2) no laboratory tests and no nutritional assessment before starting treatment;
(3) preoperative treatments such as radiotherapy or chemotherapy; (4) patient who did not
follow cancer treatment or who did not was submitted to oncologic treatment and (5) who
had treatment outside the Institution. All patients were follow-up for 5 years. Ethic
approval was obtained by National Cancer Institute Research Ethics Committee (CAAE:
64416817.7.0000.5274).
Variables
Characteristics as age, sex, clinical tumor-node-metastasis (TNM) staging, tumor
location, differentiation degree, alcohol consumption, smoking habit, treatment type,
performance status (PS), death occurrence, pre-treatment body weight and height, and pre-
treatment body mass index (BMI) were evaluated. BMI was calculated from weight (in
kilograms), height (in meters), and expressed in kg/m². Pre-treatment lymphocytes,
neutrophils, platelets, and monocytes concentrations also were used. Alcohol consumption
was categorized as "yes" (individuals who drink some type of alcoholic beverage > 1x /
week, regularly), "no" (non-alcohol users), and "ex-alcoholics"(stopped consuming before
the diagnosis disease) [31]. Similarly, cigarette smoking was categorized as “yes” (smoked
until diagnosis), “no” (non-smokers), and “ex-smoker” (smoked up to five years before the
disease was diagnosed) [32].
50
BMI was used to classify patients’ nutritional status. After BMI classification [33],
variables were also grouped into low BMI and normal/high BMI for analyses. Serum
lymphocytes, neutrophils, platelets, and monocytes concentrations were used to calculate
NLR, PLR, and LMR.
Overall survival (OS)
The beginning of follow-up for OS was defined as the time, in years, from the
disease histopathological diagnosis date until the death date. Patients were followed up for
5 years from the diagnosis date.
Statistical Analysis
Categorical variables were expressed as absolute or relative frequencies and
continuous variables as mean and standard deviation or median, minimum, and maximum
amplitude as appropriate. Kolmogorov-Smirnov test was performed to evaluate the
distribution of variables, using the Student's t-test for variables with normal distribution and
the Mann-Whitney test for comparison of non-gaussian distributions. To determine the best
cutoff point according to death in 5 years for NLR, PLR, and, LMR, the Receiver
Operating Characteristic (ROC) curve in conjunction with Youden’s Index was used [34].
To verify the possible associations between NLR, PLR, LMR, clinical factors, and
patient’s life habits we used contingency tables and the Pearson Chi-square test (χ2).
Overall survival curves were calculated using Kaplan-Meier method and differences
were assessed by the Log-Rank test. The association between inflammatory parameters and
each of the independent variables considered in the study was verified using the odds ratio
(OR) calculation, interval (95 % CI) and the p value. Univariate and multivariate survival
analysis were performed using the Cox proportional hazards model to identify the most
important subset of independent variables associated with prognostic factors, generating
hazard ratios (HR) and their respective 95% CI. Multivariate survival analysis was
performed to assess the associations adjusted by factors whose p-value was < 0.250 in the
univariate analysis [35].
51
Statistical analysis was processed using the Statistical Package for Social Sciences
(SPSS) 22.0. The p value < 0.05 was considered statistically significant, with 95 % CI. We
also assessed the quality of this study in reference to the STROBE Statement [36].
6.1.4 Results
Patient demographics and clinical characteristics
A total of 1427 patient’s medical records were identified. The final data of 168
patients were obtained and analyzed in this study (Figure 1). Patients consisted of 146
males (86.9 %) and 22 females (13.1 %). Their ages ranged from 41 to 88 years (median,
61.2 years). The majority of patients were current or ex-smokers (n=153, 91.1 %), and 130
patients (77.4 %) had a history of alcohol intake. The primary tumor site was largely
distributed between transglottic (30.1 %) and glottis (27.4 %) and only three patients (1.8
%) had subglottic cancer. One hundred and forty patients (83.3 %) were in T3 - T4 stages
while the minority (n = 28; 16.7 %), were in T1 - T2 stages. Nevertheless, most of LSCC
patients (86.3%) had a preserved functional capacity (performance status - PS 0-1).
Regarding nutritional status, 49 patients (29.2 %) presented thinness or low weight (Table
1).
Optimal cutoff value of the continuous NLR, PLR, and LMR
The optimal cutoff value for NLR, PLR, and LMR was 2.02, 135.5, and 2.5,
respectively. Based on this value, patients were divided into 2 groups for further analysis.
NLR < 2.02 (AUC: 0.66, 95 % CI: 0.58 - 0.74), PLR < 135.5 (AUC: 0.66, 95 % CI: 0.58 -
0.73), and LMR ≥ 2.5 (AUC: 0.65, 95 % CI: 0.56 - 0.73) was related to better prognosis
(Fig. 2).
52
Relationship between LSCC clinicopathological parameters, NLR, PLR, LMR and body
mass index
Our results demonstrated that stage T, lymph node involvement and BMI below
normal values increased the chance of higher NLR and PLR (Table 2). In univariate
analysis, patients with more advanced stages and with lymph node involvement had about
3.7 and 2.3 times more chance of higher NLR, respectively (OR: 3.674, 95 % CI: 1.648 -
8.190, p = 0.001; OR: 2.285, 95 % CI: 1.087 - 4.805, p = 0.029). Similarly, patients with
BMI below normal values had 2.9 times more chance to have higher NLR (OR: 2.901, 95
% CI: 1.289 - 6.529, p = 0.010).
As shown in Table 2, TIII/ TIV stage, lymph node involvement and low BMI also
increased the chance of LSCC patients having higher PLR (p<0.05). There was no
significant relationship between LMR and variables analyzed in our cohort (Table 3).
However, when adjusted in multivariate model, only T stage (OR: 3.117, 95 % CI:
1.302 - 7.464, p = 0.011) and low BMI values (OR: 2.681, 95 % CI: 1.117 - 6.436, p =
0.027) significantly increased the chance of having high pre-treatment NLR in LSCC
patients.
Overall survival outcome
The Kaplan-Meyer analysis indicated that BMI below normal values did not
significantly affect overall survival in our sample (p = 0.106) (Fig. S1). However, LSCC
patients with higher NLR ≥ 2.02, higher PLR ≥ 135.5 and lower LMR < 2.5 had a
significant poor survival. This finding demonstrated prognostic ability of these
inflammatory markers to predict cancer patient overall survival (Fig. 3A, 3D, 3G).
Interestingly, the PLR and LMR prognostic ability was modified when the survival
analysis was stratified according body mass index. Patients with normal/high BMI did not
presented changes in the prognosis provided by the PLR and NLR markers (Fig. 3E, 3H).
Patients with normal/high BMI and with PLR ≥ 135.5 or LMR < 2.5 had worse survival
when compared to patients with the same nutritional status but with PLR < 135.5 or
LMR≥2.5.
53
However, when PLR and LMR prognostic ability was assessed in patients
diagnosed with low BMI, we demonstrated that even patients with PLR <135.5 or LMR ≥
2.5 had a reduction in their overall survival. No significant difference was observed in
overall survival between high and low PLR and LMR levels in patients with BMI below
normal values (Fig. 3F, 3I). In other words, patients with a better prognosis (PLR < 135.5
and LMR ≥ 2.5) may not have better clinical outcomes if nutritional status is depleted.
Univariate and multivariate analysis of prognostic factors
Tumor staging, lymph node involvement, and NLR were significant predicts of
survival. Patients in T III/IV stages (HR: 2.11, 95 % CI: 1.01 - 4.41, p = 0.047) and with
lymph node involvement (HR: 1.7, 95 % CI: 1.06 - 2.71, p = 0.026) had higher relative risk
of dying when compared to patients in TI/TII stages and without lymph node involvement.
Similarly, LSCC patients with NLR ≥ 2.02 had 2.8 times more relative risk of dying than
those with NLR < 2.02 (HR: 2.80, 95 % CI: 1.54 – 5.11, p = 0.001) (Table 4).
In relation to nutritional status, patients with low BMI values had higher relative
risk of dying when compared to LSCC patients with normal/high BMI, however, this
difference were not statistically significant (HR: 1.48, 95 % CI: 0.92 - 2.40, p = 0.109).
When adjusted in multivariate Cox’s models, our results demonstrated that only
NLR was an independent prognostic factor for overall survival (p = 0.012).
6.1.5 Discussion
Studies have suggested that pre-treatment peripheral inflammatory cells were
associated with prognosis in different types of cancer [37-39]. Here, we demonstrated that
high pre-treatment NLR and PLR values and low pre-treatment LMR value were associated
with poorer OS and increased mortality. However, our results suggested that low BMI
values could adjust the prognostic value of PLR and LMR. BMI below normal values also
was independently associated with high pre-treatment NLR values.
54
In our cohort, only higher NLR value was identified as an independent prognostic
factor when adjusted in multivariable Cox’s models. Hence, the pre-treatment NLR may be
useful parameter to predict survival in LSCC patients.
The presence of an elevated preoperative NLR has been validated as a marker of
inflammation and shown have prognostic significance for head and neck squamous cell
carcinoma [40, 41]. Yılmaz et al. [42] showed a significant correlation between poor
survival and increased NLR prior to treatment in the patients underwent radiotherapy or
chemoradiotherapy due to nasopharyngeal carcinoma. Similarly, Marchi et al. [43]
demonstrated that NLR was significantly increased in LSCC patients.
Although the association between elevated NLR and poor prognosis has been
confirmed previously, the underlying mechanisms have not yet been fully elucidated. One
possible explanation is that a relatively increased number of circulating neutrophils
produced and secreted angiogenesis-regulating growth factors, chemokines, proteases like
vascular endothelial growth factor (VEGF) and interleukin-8 (IL-8), which may promote
tumor growth and metastasis resulting in poor prognosis [44, 45].
An increased number of platelets are also associated with poor prognosis in
laryngeal cancer [46]. A previous study showed that platelet aggregation and degranulation
is usually accompanied by the release of platelet-derived pro-angiogenic factors that could
promote tumor growth and tumor invasion [29]. Zhang et al. [47] confirmed the key role of
activated platelet in laryngeal cancer, demonstrating that increased platelets are correlated
with decrease in overall survival and poorer prognosis.
In the same way, we found that reduced LMR (< 2.5) value was associated with
poor survival. Kano et al. [24] also demonstrated that low pre-treatment LMR was
significantly associated with shorter OS in patients with head and neck cancer. Likewise,
Hsueh et al. [18] demonstrated that LMR in the lowest tertile (< 3.50) were associated with
poorer disease-free-survival in patients with laryngeal squamous cell cancer. The biological
role of lymphocytes and monocytes seems plausible. Lymphocytes, components of host
immunity, are important to destruct residual tumor cells and micrometastases [48, 49].
Monocytes, in its turn, could secrete proinflammatory cytokines, such as interleukin (IL)
IL-1, IL-6, IL-10, and TNF-alpha, which have been associated with shorter survival and
worse prognosis [50]. In this sense, monocytes seem to promote tumor progression, acting
55
in an opposite role as lymphocytes. Taken together, LMR expanded the predictive value for
LSCC survival.
BMI has been identified as a possible risk factor for several cancers. Regarding the
effects of pre-treatment BMI on the prognosis of head and neck cancer, several groups have
investigated the association between pre-treatment nutritional status and survival outcomes
in patients with LSCC. Takenaka et al. [51] revealed that BMI was a prognostic factor for
survival, independent of the primary tumor site or tumor stage. Others authors also
demonstrated that low pre-treatment BMI (< 18.5 kg / m2) independently predicted high
cancer-specific, and overall mortality in head and neck squamous cell carcinoma and,
predicted a poor prognosis in patients with LSCC [52, 53].
In our sample, low BMI values did not significantly affect overall survival and was
not identified as an independent prognostic factor for survival in LSCC patients. One
hypothesis that could justify the fact that low BMI values does not influence overall
survival in our cohort would be that LSCC patients, regardless of nutritional status, have a
preserved functional capacity, thus enabling cancer treatment. Approximately 82 % of
patients with low BMI had a good functional capacity evaluated by performance status.
On the other hand, low BMI values associated with PLR and LMR adjusted the
predictive prognostic value of these markers. In fact, no significant difference in overall
survival was observed between high and low PLR and LMR levels in patients with BMI
below normal values. In this sense, patients with a better prognosis (PLR < 135.5 and LMR
≥ 2.5) may not have better clinical outcomes if nutritional status is depleted.
Thus, our results reinforce the importance of monitoring nutritional status and the
association of both markers (BMI and inflammatory markers) in the evaluation of LSCC
patient’s prognosis.
Our data, however, should be interpreted with some degree of caution due to the
limitations. It is a retrospective design, where there is a difficult to control for potential
confounding factors. The small sample size, the BMI limitations in the diagnosis of
nutritional status in cancer patients, the heterogeneity of LSCC location and, the several
types of treatment included in this study are other factors which must be taken into account.
Independent validation of our cut-offs in prospective studies, including clinical trials, are
necessary prior to their implementation.
56
In conclusion, the results of the present study reinforce the prognostic ability of
NLR, PLR, and LMR to predict LSCC patients overall survival. Moreover, we highlight the
importance of the association of nutritional status with these inflammatory markers in
predicting the prognosis of these patients. These measures are simple, essentially low-cost
and, can support the therapeutic decision.
57
6.1.6 References
[1] Tu XP, Qiu QH, Chen LS, et al. Preoperative neutrophil-to-lymphocyte ratio is an
independent prognostic marker in patients with laryngeal squamous cell carcinoma. BMC
Cancer 2015; 15(743):1-7. https://doi.org/10.1186/s12885-015-1727-1726.
[2] Steuer CE, El‐Deiry M, Parks JR, et al. An update on larynx cancer. CA Cancer J Clin.
2017; 67(1):31-50. https://doi.org/10.3322/caac.21386.
[3] Fong PY, Tan SH, Lim DWT, et al. Association of clinical factors with survival
outcomes in laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC). PLoS ONE 2019; 14(11):
e0224665. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0224665.
[4] Wang Y, Zhang D, Yu1 C, et al. MicroRNA-708-5p contributes to the malignant
behavior of laryngeal squamous cell carcinoma by directly targeting metastasis suppressor-
1. Int J Clin Exp Med 2019;12(1):597-603.
[5] Li Z, Zou L, Liu T, Yang A. Prognostic value of BMI for laryngeal squamous cell
carcinoma. Cancer Biol Med 2015; 12:394-400. https://doi.org/10.7497/j.issn.2095-
3941.2015.0043.
[6] Arends J, Bachmann P, Baracos V, et al. ESPEN guidelines on nutrition in cancer
patients. Clin Nutr. 2017; 36(1):11-48. https://doi: 10.1016/j.clnu.2016.07.015
[7] Te Riele RJLM, Dronkers EAC, Wieringa MH, et al. Influence of anemia and BMI on
prognosis of laryngeal squamous cell carcinoma: Development of an updated prognostic
model. Oral Oncol. 2018; 78:25-30. https://doi.org/10.1016/j.oraloncology.2018.01.001.
[8] Büntzel J, Micke O, Kisters K., et al. Malnutrition and Survival - Bioimpedance Data in
Head Neck Cancer Patients. In Vivo 2019; 33(3):979-982. https://doi.org/
10.21873/invivo.11567.
[9] Gama RR, Song Y, Zhang Q, et al. Body mass index and prognosis in patients with
head and neck cancer. Head Neck 2017; 39(6):1226-1233. https://doi.org/
10.1002/hed.24760.
[10] Tan CSY, Read JA, Phan VH, Beale PJ, Peat JK, Clarke SJ. The relationship between
nutritional status, inflammatory markers and survival in patients with advanced cancer: a
prospective cohort study. Support Care Cancer 2015; 23:385-391.
[11] Chen Q, Dai Z, Yin D, et al. Negative impact of preoperative platelet-lymphocyte ratio
on outcome after hepatic resection for intrahepatic cholangiocarcinoma. Medicine 2015;
94(13):1-7. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000000574.
58
[12] Shibutani M, Maeda K, Nagahara H, et al. The prognostic significance of a
postoperative systemic inflammatory response in patients with colorectal cancer. World
Journal of Surgical Oncology 2015; 13(194):1-8. https://doi.org/10.1186/s12957-015-0609-
3.
[13] Krenn-Pilko S, Langsenlehner U, Thurner EM, et al. The elevated preoperative
platelet-to-lymphocyte ratio predicts poor prognosis in breast cancer patients. Br J Cancer
2014; 110:2524–2530. https:// doi.org/ 10.1038/bjc.2014.163.
[14] Fu Y, Liu W, Ouyang D, Yang A, Zhang Q. Preoperative neutrophil-to-lymphocyte
ratio predicts long-term survival in patients undergoing total laryngectomy with advanced
laryngeal squamous cell carcinoma: a single-center retrospective study. Medicine 2016;
95(6):1-6.
[15] Bruixola G, Caballero J, Papaccio F, et al. Prognostic Nutritional Index as an
independent prognostic factor in locoregionally advanced squamous cell head and neck
cancer. ESMO Open 2018; 3:e000425. https://doi.org/10.1136/esmoopen-2018-000425.
[16] Silva TH, Schilithz AOC, Peres WAF, et al. Neutrophil-lymphocyte ratio and
nutritional status are clinically useful in predicting prognosis in colorectal cancer patients.
Nutrition and Cancer 2019; 1-10. https://doi.org/10.1080/01635581.2019.1679198.
[17] Wang J, Wang S, Song X, et al. The prognostic value of systemic and local
inflammation in patients with laryngeal squamous cell carcinoma. OncoTargets and
Therapy 2016; 9:7177–7185. https://doi.org/10.2147/OTT.S113307.
[18] Hsueh C, Tao L, Zhang M, et al. The prognostic value of preoperative neutrophils,
platelets, lymphocytes, monocytes and calculated ratios in patients with laryngeal
squamous cell cancer. Oncotarget 2017; 8(36):60514–60527.
https://doi.org/10.18632/oncotarget.16234.
[19] Sato Y, Gonda K, Harada M, et al. Increased neutrophil-to-lymphocyte ratio is a novel
marker for nutrition, inflammation and chemotherapy outcome in patients with locally
advanced and metastatic esophageal squamous cell carcinoma. Biomedical Reports 2017;
7:79-84. https://doi.org/10.3892/br.2017.924.
[20] Haddad CR, Guo L, Clarke S, Guminski A, Back M, Eade T.
Neutrophil‐to‐lymphocyte ratio in head and neck cancer. J Med Imaging Radiat Oncol
2015; 59: 514– 519.
[21] Rachidi S, Wallace K, Wrangle JM, Day TA, Alberg AJ, Li Z.
Neutrophil‐to‐lymphocyte ratio and overall survival in all sites of head and neck squamous
cell carcinoma. Head Neck 2016; 38 Suppl 1: E1068– E1074.
59
[22] Rassouli A, Saliba J, Castano R, Hier M, Zeitouni AG. Systemic inflammatory
markers as independent prognosticators of head and neck squamous cell carcinoma. Head
Neck 2015; 37: 103– 110.
[23] Jiang R, Cai XY, Yang ZH, et al. Elevated peripheral blood lymphocyte‐to‐monocyte
ratio predicts a favorable prognosis in the patients with metastatic nasopharyngeal
carcinoma. Chin J Cancer 2015; 34: 237– 246.
[24] Kano S, Homma A, Hatakeyama H, et al. Pre-treatment lymphocyte-to-monocyte ratio
as an independent prognostic factor for head and neck cancer. Head and Neck Cancer 2017;
39:247-253. https://doi.org/10.1002/hed.24576.
[25] Tham T, Olson C, Khaymovich J, Herman SW, Costantino PD. The lymphocyte-to-
monocyte ratio as a prognostic indicator in head and neck cancer: a systematic review and
meta-analysis. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology 2018; 275(7):1663–1670.
https://doi.org/10.1007/s00405-018-4972-x.
[26] Ozturk K, Akyildiz NS, Uslu M, Gode S, Uluoz U. The effect of preoperative
neutrophil, platelet and lymphocyte counts on local recurrence and survival in early-stage
tongue cancer. Eur Arch Oto-Rhino-Laryngology 2016; 273(12):4425–4429.
https://doi.org/10.1007/s00405-016-4098-y.
[27] Risch Z, Bellile E, Townsend R, et al. Association of low neutrophil-to-lymphocyte
ratios (NLR) and high lymphocyte-to-monocyte ratios (LMR) with overall survival and
response to induction chemotherapy (IC) when used to select patients (pts) with locally
advanced squamous cell of the larynx (LSCC) for combined chemoradiation (CRT).
Journal of Clinical Oncology 2019; 37(15).
https://doi.org/10.1200/JCO.2019.37.15_suppl.e17539.
[28] Moon H, Roh J, Lee S et al. Prognostic value of nutritional and hematologic markers
in head and neck squamous cell carcinoma treated by chemoradiotherapy. Radiotherapy
and Oncology 2016;118:330-334. https://doi.org/10.1016/j.radonc.2015.10.029.
[29] Kara M, Uysal S, Altinisik U, Cevizci S, Guçlu O, Derekoy FS. The pre-treatment
neutrophil-to-lymphocyte ratio, platelet-to-lymphocyte ratio and red cell distribution with
predict prognosis in patients with laryngeal carcinoma. Eu Arch Othorhinolaryngol 2017;
274:535-542.
[30] Risch Z, Bellile E, Townsend R, et al. Association of low neutrophil-to-lymphocyte
ratios (NLR) and high lymphocyte-to-monocyte ratios (LMR) with overall survival and
response to induction chemotherapy (IC) when used to select patients (pts) with locally
advanced squamous cell of the larynx (LSCC) for combined chemoradiation (CRT).
Journal of Clinical Oncology 2019; 37(15)_suppl, e17539-
e17539.https://doi.org/10.1200/JCO.2019.37.15_suppl.e17539.
60
[31] Huang CD (2003) Econometric models of alcohol demand in the United Kingdom.
Government Economic Service Working Paper 140:1-52.
[32] Freedman DS, Flanders WD, Barboriak JJ, Malarcher AM, Gates L. Cigarette smoking
and leukocyte subpopulations in men. Ann Epidemiol. 1996; 6(4):299-306.
[33] World Health Organization. Obesity – Presenting and managing the global epidemic
(1998) Report of a WHO consultation. Geneva, Switzerland: World Health Organization.
[34] Youden WJ. Index for rating diagnostic tests. Cancer 1950; 3:32–35.
[35] Hosmer Jr DW, Lemeshow S, May S (2011) Applied Survival Analysis: Regression
Modeling of Time-to-Event Dat. 2nd ed. ISBN 978-0-471-75499-2.
[36] Elm EV, Altman DG, Egger M, Pocock S, Gotzsche P, Vandenbroucke JP. The
strengthening the reporting of observational studies in epidemiology (strobe) statement:
guidelines for reporting observational studies. The Lancet 2007; 370:1453-1457.
[37] Schmidt H, Bastholt L, Geertsen P, et al. Elevated neutrophil and monocyte counts in
peripheral blood are associated with poor survival in patients with metastatic melanoma: a
prognostic model. Br J Cancer 2005; 93:273-278.
[38] Li J, Jiang R, Liu W, et al. A large cohort study reveals the association of elevated
peripheral blood lymphocyte-to-monocyte ratio with favorable prognosis in nasopharyngeal
carcionoma. Plos ONE 2013; 8(12):1-10. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0083069.
[39] Ong HS, Gokavarapu S, Wang LZ, Tian Z, Zhang, CP. Low pre-treatment
lymphocyte-monocyte ratio and high platelet-lymphocyte ratio indicate poor cancer
outcome in early tongue cancer. J Oral Maxillofac Surg. 2017; 75:1762-1774.
https://doi.org/10.1016/j.joms.2016.12.023.
[40] Chandrasekara S, Davis S, Thomson P, Haydon A. High neutrophil‐to‐lymphocyte
ratio predicts poor prognosis in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck
treated with definitive chemoradiotherapy . Asia-Pacific Journal of Clinical Oncology
2018; 14(5): e442-e447.
[41] Kuo C, Hsueh W, Wu Y, Yang M, Cheng Y, Pao T, et al. The Role of Pre-treatment
Serum Neutrophil-to-Lymphocyte Ratio in Hypopharyngeal Cancer Treated with Definitive
Chemoradiotherapy: A Pilot Study. Scientific Reports 2019; 9(1618):1-9.
[42] Yılmaz B, Şengül E, Gül A, Alabalık U, Özkurt FE, Akdağ M, Topçu I . Neutrophil–
Lymphocyte Ratio as a Prognostic Factor in Laryngeal Carcinoma. Indian Journal of
Otolaryngology and Head & Neck Surgery 2018; 70(2):175–179.
61
[43] Marchi F, Missale F, Incandela F, Filauro M, Mazzola F, Mora F. Prognostic
Significance of Peripheral T‐Cell Subsets in Laryngeal Squamous Cell Carcinoma. Head
and Neck, and Tumor Biology 2019; 4(5):513-519.
[44] Fondevila C, Metges JP, Fuster J, Grau JJ, Palacín A, Castells A, et al. p53 and VEGF
expression are independent predictors of tumour recurrence and survival following curative
resection of gastric cancer. Br J Cancer. 2004; 90(1):206–15.
[45] Schaider H, Oka M, Bogenrieder T, Nesbit M, Satyamoorthy K, Berking C, et al.
Differential response of primary and metastatic melanomas to neutrophils attracted by IL-8.
Int J Cancer. 2003; 103(3):335–43.
[46] Mao Y, Fu Y, Gao Y, YangA, Zhang Q. Platelet-to-lymphocyte ratio predicts long-
term survival in laryngeal cancer. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology 2018;
275(2):553–559.
[47] Zhang H, Liu L, Fu S, Liu Y, Wang C, Liu T, et al. Higher platelet distribution width
predicts poor prognosis in laryngeal cancer. Oncotarget 2017; 8(29): 48138-48144.
[48] Fogar P, Sperti C, Basso D, et al. Decreased total lymphocyte counts in pancreatic
cancer: an index of adverse outcome. Pancreas 2006; 32:22–28.
[49] Sarraf KM, Belcher E, Raevsky E, Nicholson AG, Goldstraw P, Lim E.
Neutrophil/lymphocyte ratio and its association with survival after complete resection in
non-small cell lung cancer. J Thorac Cardiovasc Surg 2009; 137:425–428.
https://doi.org/10.1016/j.jtcvs.2008.05.046.
[50] Torisu-Itakura H, Lee JH, Huynh Y, Ye X, Essner R., Morton DL. Monocytederived
IL-10 expression predicts prognosis of stage IV melanoma patients. J Immunother 2007;
30:831–838.
[51] Takenaka Y, Takemoto N, Nakahara S, et al. Prognostic significance of body mass
index before treatment for head and neck cancer. Head Neck 2015; 37:1518-1523.
https://doi.org/10.1002/hed.23785.
[52] Nguyen TV, Yueh B. Weight loss predicts mortality after recurrent oral cavity and
oropharyngeal carcionomas. Cancer 2002; 95:553-562. https://doi.org/10.1002/cncr.10711.
[53] Moon H, Roh J, Lee S, et al. Prognostic value of nutritional and hematologic markers
in head and neck squamous cell carcinoma treated by chemoradiotherapy. Radiotherapy
and Oncology 2016; 118:330-334. https://doi.org/10.1016/j.radonc.2015.10.029.
62
LSCC = laryngeal squamous cell carcinoma; n = number of patients.
Fig. 1 Patient Selection Flow Diagram
LSCC patients
(n=1427)
Excluded malignant neoplasms of
other histologies (n=108)
LSCC patients (n=1319)
Patients excluded:
- No pre-treatment biochemical tests available
(n=504);
- No initial nutritional assessment (n=188);
- No nutritional assessment and no initial
biochemical tests available (n= 402);
- With metastasis at diagnosis (n=2);
- Did not continue treatment (n = 9);
- Not submitted to oncologic treatment (n= 19);
- Treatment outside the Institution (n=25);
- Radiotherapy or chemoradiotherapy before
surgery (n=2).
LSCC patients (n=168)
63
Table 1 Clinical characteristics of the laryngeal squamous cell carcinomas patients (n= 168).
Variables Categories N %
Age (years)a 61.2 41-88a
Sex
Female 22 13.1
Male 146 86.9
Alcohol consumption Yes 88 52.4
No 38 22.6
Ex-alcoholist 42 25
Smoking Yes 109 64.8
No 15 8.9
Ex-smoker 44 26.2
LSCC location Supraglottic 23 13.7
Glottic 46 27.4
Subglottic 3 1.8
Transglottic 52 30.1
Unspecified larynx invasive lesion 44 26.2
Differentiation degree
Well differentiated 19 11.3
Moderately differentiated 127 75.6
Poorly differentiated 16 9.5
T stage I / II 28 16.7
III / IV 140 83.3
Only surgery
27
16.1
Treatment type Surgery + chemotherapy 1 0.6
Surgery + radiotherapy 65 38.7
Sugery + chemoradiotherapy 8 4.7
Only radiotherapy 52 31
Only chemotherapy 15 8.9
Limph node involvement
Yes 55 32.7
No 113 67.3
Death in five years Yes 73 43.5
No 95 56.6
64
Table 1 (Continued)
Variables Categories N %
PS 0-1 145 86.3
2-3 13 7.7
4 1 0.6
Uninformed 9 5.4
BMI classification
Thinness/Low weight 49 29.2
Eutrophy 70 41.6
Overweight/Obesity 49 29.2
N= number of observations; %= frequency; PS = performance status; BMI= Body mass index; aMedian/minimum and maximum.
65
Table 2 Relationship between NLR, PLR, socio-demographic and clinicopathological parameters.
Univariate analysis Multivariate analysis Univariate analysis Multivariate analysis
HIGH NLR HIGH NLR HIGH PLR HIGH PLR
Variables Categories N OR 95% CI p-
value OR 95%CI
p-
value N OR 95% CI
p-
value OR 95% CI
p-
value
Age (years) < 60 82 1
82 1
≥ 60 86 0.867 0.456 1.648 0.663
86 1.050 0.573 1.923 0.874
Sex Female 22 1
22 1
Male 146 1.456 0.582 3.652 0.421
146 1.485 0.598 3.687 0.395
Alcohol
consumption No 38 1
38 1
Yes 88 1.555 0.702 3.446 0.277
88 0.887 0.413 1.904 0.758
Ex-alcoholist 42 1.174 0.474 2.906 0.729
42 0.498 0.204 1.216 0.126
Smoking No 15 1
15 1
Yes 109 1.410 0.465 4.271 0.544
109 1.906 0.635 5.727 0.250
Ex-smoker 44 1.289 0.386 4.307 0.680
44 0.857 0.258 2.851 0.802
Differentiation
degree
Well
differentiated 19 1
19 1
1
Moderately
differentiated 127 0.935 0.244 3.584 0.922
127 2.786 0.699 11.10 0.146b 2.527 0.563 11.34 0.226
Poorly
differentiated 16 1.641 0.612 4.397 0.325
16 2.133 0.763 5.962 0.149b 2.580 0.712 6.072 0.180
T stage TI/TII 32 1
1
32 1
1
TIII/TIV 130 3.674 1.648 8.190 0.001a 3.117 1.302 7.464 0.011 130 2.340 1.028 5.327 0.043b 2.301 0.938 5.648 0.069
Limph node
involvement No 113 1
113 1
1
1
Yes 55 2.285 1.087 4.805 0.029a 1.328 0.585 3.013 0.498 55 2.370 1.220 4.604 0.011b 1.660 0.769 3.586 0.197
BMI Normal/high 119 1
1
119 1
Low 49 2.901 1.289 6.529 0.010a 2.681 1.117 6.436 0.027 49 2.219 1.119 4.400 0.022b 1.966 0.920 4.204 0.081
NLR = neutrophil-to-lymphocyte ratio; PLR = platelet-to-lymphocyte ratio; N= number of observations; OR= odds ratio; 95% CI = 95% Confidence Interval; BMI = body mass index. aOR for multivariate analyses adjusted by T stage, limph node involvement and malnutrition. bOR for multivariate analyses adjusted by differentiation degree, T stage, limph node involvement
and malnutrition.
66
Table 3 Relationship between LMR, socio-demographic and clinicopathological parameters.
LMR = lymphocyte-to-monocyte ratio; N= number of observations; OR= odds ratio; 95% CI = 95% Confidence Interval; BMI = body mass index. aOR for multivariate analyses adjusted by smoking and T stage.
Univariate analysis
Multivariate analysis
HIGH LMR HIGH LMR
Variables Categories N OR 95% CI p-value OR 95%CI p-value
Age (years) < 60 82 1
≥ 60 86 1.196 0.629 2.272 0.585
Sex Female 22 1
Male 146 0.548 0.191 1.571 0.263
Alcohol
consumption No 38 1
Yes 88 0.910 0.409 2.022 0.817
Ex-alcoholist 42 1.465 0.561 3.829 0.435
Smoking No 15 1 1
Yes 109 1.023 0.340 3.080 0.967 1.099 0.360 3.353 0.868
Ex-smoker 44 3.524 0.949 13.08 0.060a 3.562 0.952 13.33 0.059
Differentiationd
egree Well differentiated 19 1
Moderately differentiated 127 2.000 0.410 9.757 0.391
Poorly differentiated 16 0.841 0.299 2.364 0.743
T stage TI/TII 32 1 1
TIII/TIV 130 0.529 0.212 1.317 0.171a 0.521 0.206 1.320 0.170
Limph node
involvement No 113 1
Yes 55 0.726 0.370 1.426 0.353
BMI Normal/high 119 1
Low 49 0.712 0.356 1.425 0.338
67
Table 4 Predictive factors associated with OS in univariate and multivariate analysis.
Variables Categories Univariate analysis Multivariate analysis
HR 95% CI p-value HR 95% CI p-value
Age (years) < 60 1.000
≥ 60 0.830 0.525 1.313 0.426
Sex Female 1.000
Male 0.969 0.482 1.945 0.929
Alcohol consumption No 1.000 1.000
Yes 1.430 0.766 2.669 0.261 1.199 0.617 2.329 0.593
Ex-alcholist 1.522 0.757 3.059 0.239a 1.452 0.665 3.173 0.349
Smoking No 1.000
Yes 2.063 0.746 5.706 0.163a 1.730 0.606 4.940 0.306
Ex-smoker 1.792 0.607 5.297 0.291 1.497 0.481 4.662 0.486
Differentiation degree Well differentiated 1.000
Moderately differentiated 0.717 0.235 2.192 0.717
Poorly differentiated 1.068 0.510 2.237 0.861
T stage TI/TII 1.000 1.000
TIII/TIV 2.112 1.011 4.413 0.047a 1.496 0.694 3.224 0.304
Limph node involvement No 1.000 1.000
Yes 1.700 1.066 2.713 0.026a 1.496 0.870 2.403 0.155
BMI Normal/high 1.000 1.000
Low 1.484 0.916 2.403 0.109a 1.202 0.711 2.029 0.492
NLR <2.02 1.000 1.000
≥2.02 2.801 1.537 5.106 0.001a 2.189 1.192 4.018 0.012
68
Table 4 (Continued).
Variables Categories Univariate analysis Multivariate analysis
HR 95% CI p-value HR 95% CI p-value
PLR <135.5 1.000
≥135.5 2.287 1.418 3.688 0.001a,b
LMR ≥2.5 1.000
<2.5 2.049 1.296 3.241 0.002a,b
HR= hazard ratio, derived from Cox proportional hazard model; 95% CI = 95% Confidence Interval; BMI = body mass index. aHR for multivariate analyses adjusted by
alcohol consumption, smoking, T stage, limph node involvement, malnutrition and NLR. bPLR and LMR were excluded in the adjustment of multivariate analysis due to
its collinearity with other inflammatory parameters.
69
Area under the receiver operating characteristics curves (AUC): NLR = 0.66 (sensitivity: 0.83, specificity: 0.55); PLR = 0.66
(sensitivity:0.67, specificity: 0.37); LMR = 0.65 (sensitivity:0.78, specificity: 0.53).
Fig. 2 Optimal cutoff values for continuous NLR (A), PLR (B), and LMR(C) according to death in 5 years.
70
71
Fig. 3 Kaplan-Meier overall survival (OS) curves plus log-rank p-values for LSCC patients. (A) OS curves stratified according NLR cutoff
values. (B) OS curves stratified according to normal/high BMI and NLR cutoff values. (C) OS curves stratified according to low BMI and
NLR cutoff values. (D) OS curves stratified according PLR cutoff values. (E) OS curves stratified according to normal/high BMI and PLR
cutoff values. (F) OS curves stratified according to low BMI and PLR cutoff values. (G) OS curves stratified according LMR cutoff values.
(H) OS curves stratified according to normal/high BMI and LMR cutoff values. (I) OS curves stratified according to low BMI and LMR
cutoff values.
72
Fig. S1 Kaplan-Meier overall survival (OS) curve plus log-rank p-value for LSCC patients stratified according to BMI classification.
73
6.2 MANUSCRITO 2
Luana Dalbem Murad. Low body mass index reduces intratumoral infiltration of CD4+
T cells in laryngeal squamous cell carcinoma patients
(Baixo índice de massa corporal reduz a infiltração intratumoral de linfócitos TCD4+ em
pacientes com carcinoma espinocelular de laringe)
74
6.2.1 Abstract
Background: Inflammation and nutritional status are intrinsically related and may
reflect the immune response to cancer. Malnutrition has been associated with worsening
cellular and humoral immunity. The present study aimed to evaluate the relation
between nutritional status, systemic inflammation and local immune response, as well
as, investigate the use of these variables as prognostic markers in laryngeal squamous
cell carcinoma (LSCC) patients. Methods: A retrospective cohort of 91 surgical LSCC
patients, treated at the National Cancer Institute (INCA), between January 2006 to
December 2011 were followed until December 2016. We collected data about dody
mass index (BMI), clinical factors, patients' lifestyle, C-reactive protein (CRP),
neutrophil-to-lymphocyte ratio (NLR), platelet-to-lymphocyte ratio (PLR), and
lymphocyte-to-monocyte ratio (LMR). The stromal and intratumoral CD4+ / CD8+ T
cells infiltration (TILs) were obtained by immunohistochemistry. The overall survival
(OS) was analyzed by Kaplan-Meier curves and the log-rank test. Cox proportional
hazards model was used for univariate and multivariate analyses. The p-value <0.05
was considered significant. Results: LSCC surgical patients with low BMI had
significantly lower density of intratumoral CD4+ T lymphocytes infiltrated when
compared with normal/high BMI patients (OR: 0.287, 95 % CI: 0.082-1; p=0.05). NLR
≥ 1.55 was significantly associated with worse survival and considered an independent
prognostic factor for OS (HR: 9.85, 95 % CI: 1.33-73.09, p=0.025). Conclusion: Our
results suggest that low BMI impairs the intratumoral CD4+ T lymphocytes infiltration
and may contribute to tumor immune evasion and poor prognosis in LSCC patients.
Keywords: body mass index, squamous cell carcinoma, inflammation, tumor
lymphocytes infiltrating, survival.
75
6.2.2 Introduction
Laryngeal cancer is one of the most common head and neck cancers that remains
as a significant cause of mortality. The predominant histological type is laryngeal
squamous cell carcinoma (LSCC) [1]. Several factors are associated with the prognosis
of LSCC including smoking, alcohol consumption, heredity, and nutritional status [2,3].
Nutritional status has a substantial relevance for prognosis in cancer patients.
Nutritional impairment is correlated with poor performance status, shorter survival, and
increased mortality [4]. Studies have suggested that low body mass index (BMI) is
associated with significant poor prognosis and lower overall survival (OS) in cancer
patients, including LSCC patients [5-8].
In addition, cancer patients may have a constant state of chronic inflammation
and this can be identified as a risk factor [9-13]. Cancer-associated inflammation plays a
significant role in the proliferation, angiogenesis, invasion, and migration of cancer
cells [14] and cumulating evidence suggests that increased systemic inflammation might
represent a stage-independent unfavorable prognostic factor [15-17]. The neutrophil-to-
lymphocyte ratio (NLR), platelet-to-lymphocyte ratio (PLR), and lymphocyte-to-
monocyte ratio (LMR) may reflect the systemic inflammation and have been described
as effective predictors of poor survival outcome in several types of cancer, including
LSCC [18-20].
Inflammation and nutritional status are intrinsically related and may reflect the
immune response to cancer [21]. Authors have reported that high density of tumor
infiltrating lymphocytes (TILs) has been recognized as a good prognostic marker in
multiple malignancies [22-25]. Each T-lymphocyte subset has a unique role in the
antitumor response. Cytotoxic T lymphocytes (CD8) kill tumor cells by stable contacts
with them, through wich they deliver them cytotoxic perforin and granzyme-contaning
granules [26]. The role of CD4+ T cells is more controversial and is often considered to
be a double-edged immunologic sword because CD4+ T cells play a central role in
initiating and maintaining anticancer immune responses. CD4+ T-cell help is needed
during the primary antigen-specific response to imprint CD8+ T cells with the ability to
develop into long-lived functional memory cells [27, 28].
In this sense, some studies suggested that cytotoxic T cells (CD8) are important
whereas others suggest that helper T lymphocytes (CD4) are associated with favorable
76
prognosis [29-31]. However, current studies only associate malnutrition to immune cell
concentration. There is a lack of studies demonstrating the immune behavior of the
tumor lymphocyte infiltrate in malnourished patients.
Therefore, the present study aims to evaluate the TILs profile according to
nutritional status, the relationship between these parameters, as well as, to investigate
the use of these variables as prognostic markers in laryngeal squamous cell carcinoma
patients.
6.2.3 Methods
Patients and follow-up
A retrospective study was conducted using a cohort of LSCC patients who
underwent to surgical resection at Brazilian National Cancer Institute (INCA) between
January 1th, 2006 to December 31th, 2011. Inclusion criteria were the following: both
sex, age > 20-years, histopathologically proven LSCC, nutritional assessment and
laboratory test available prior treatment, surgical treatment with curative intent, and
minimum follow up of 5 years or to death. We excluded patients with any another
primary tumor, with distant metastasis at the diagnosis, that did not were submitted to
oncologic treatment or did not continue treatment, those who had treatment outside the
Institution, that undergoing treatment before surgery and those not submitted to surgery.
A total of 99 subjects were included in the study. However, only ninety-one patients had
surgical tissue blocks available with enough tissue for immunohistochemical analysis
(Figure 1). Ethic approval was obtained by National Cancer Institute Research Ethics
Committee (CAAE: 64416817.7.0000.5274).
Variables
Body mass index (BMI, Kg / m2) was used to classify patients’ nutritional status.
After BMI classification (WHO, 1998), variables were grouped into low BMI and
normal/high BMI for analyses. Alcohol consumption was categorized as "yes"
(individuals who drink some type of alcoholic beverage > 1 x / week, regularly), "no"
(non-alcohol users), and "ex-alcoholics" (stopped consuming before the diagnosis
77
disease) [32]. Cigarette smoking was also categorized as “yes” (smoked until
diagnosis), “no” (non-smokers), and “ex-smoker” (smoked up to five years before the
disease was diagnosed) [33]. Similarly, the variable “treatment type” was also grouped
into surgery and treatment after surgery when applicable.
Systemic inflammation assessment
Pretreatment serum neutrophils, platelets, lymphocytes, and monocytes counts,
and C-reactive protein (CRP) serum levels were obtained in the medical records. NLR
was calculated as the absolute neutrophil count divided by the absolute lymphocyte
count (total neutrophil / total lymphocyte). PLR was calculated as the absolute platelet
count divided by the absolute lymphocyte count (total platelet / total lymphocyte),
whereas LMR was calculated as the absolute lymphocyte count divided by the absolute
monocyte count (total lymphocyte / total monocyte).
Immunohistochemical analysis
Samples of patient’s surgical parts were collected and the immunohistochemical
study was performed in INCA Pathological Anatomy Section. Commercially load-
treated (Star Frost Slides, Knittel Glass, Braunschweig, Germany) slides containing 3-
micron sections were immersed in 3 xylol 5-minute baths, followed by 100 %, 90 %, 80
% and 70 % alcohol quick-baths. Alcohol excess was removed under running water for
3 minutes.
The antigen retrieval was in Trilogy Buffer (Cell Marque®, Rocklin, CA, USA)
at 98 °C using a Steamer for 30 minutes. Peroxidase blockade and protein blockade
were performed using the NovoLink Max Polymer Detection Kit (Leica Biosystems®,
Nussloch, Germany) for 5 minutes each. Incubation with rabbit monoclonal primary
antibody, anti-CD4 (Cell Marque®, Rocklin, CA, USA) clone SP35 (1 : 300, dilution)
and rabbit monoclonal antibody, anti-CD8 (Cell Marque®, Rocklin, CA, USA) clone
SP16 (1 : 1000, dilution) was performed overnight in the refrigerator.
On the second day of the technique, slides were incubated with post-primary
antibody and polymer (Novolink, Leica Biosystems®, Nussloch, Germany) both for 30
minutes. To reveal the reaction, the DAB chromogen (Diaminobenzidine) was used for
78
3 minutes (Novolink, Leica Biosystems®, Nussloch, Germany). Counterstaining was
done with Harris hematoxylin solution for 30 seconds. After removing excess
hematoxylin in running water, the slides were immersed in 70 %, 80 %, 90 %, 100 %
and xylol baths. The balm was used for the slides assembly, which were analyzed under
the optical microscope, observing the membrane marking. Lymph node was used as
positive control for reaction validation.
CD4+ and CD8+ T lymphocyte infiltration was semi-quantitatively assessed by
an expert pathologist. The infiltration area (stromal and intratumoral) at x100 and x400
magnifications was measured and scored 1+ (low, < 30%), 2 + (moderate, ≥ 30% and <
60%) or 3+ (intense, ≥ 60%). Stromal infiltration was defined as lymphocytes located in
the adjacent peritumoral stroma without direct contact with carcinoma cells.
Intratumoral infiltration was defined as lymphocytes located in the tumor cell nests or in
direct contact with the cellular epithelium. Areas of adenoma, ulceration, necrosis and
tumor periphery were excluded from the analyzes. Patients were then categorized
according to total lymphocyte infiltrating (TILs) density as “high” (2+ or 3+) or “low”
(1+) [34-36].
CD4+ / CD8+ T-lymphocyte ratio evaluation was obtained by dividing the
absolute CD4+ T-lymphocyte count by the absolute CD8+ T-lymphocyte count
according to the infiltration area (stromal or intratumoral). The result was also
categorized as “high” (≥ 1) or “low (< 1) [37, 38].
Overall survival
The beginning of follow-up for OS was defined as the time, in years, from the
disease histopathological diagnosis date until the death date. Patients were followed up
for 5 years from the diagnosis date.
Statistical Analysis
Categorical variables were expressed as absolute or relative frequencies and
continuous variables as mean and standard deviation or median, minimum and
maximum amplitude as appropriate. Kolmogorov-Smirnov test was performed to
79
evaluate the distribution of variables. Student's t-test was used for variables with normal
distribution and the Mann-Whitney test for comparison of non-gaussian distributions.
To determine the best cutoff point according to death in 5 years for NLR, PLR,
and, LMR based on the characteristics of the population studied, the Receiver Operating
Characteristic (ROC) curve was used in conjunction with Youden Index [39].
In order to identify possible relationships among nutritional status, clinical
factors, patients' lifestyle, inflammatory parameters and CD4+ and CD8+ T lymphocyte
infiltration, we used the contingency tables and Pearson's Chi-square test (χ2).
The overall survival curves were calculated using the Kaplan-Meier method and
the differences were evaluated by the Log-Rank test, in order to compare the different
strata of each variable.
The association between stromal and intratumoral CD4+ and CD8+ T
lymphocyte infiltration and each of the independent variables considered in the study
was verified using the odds ratio (OR) calculation, interval (95 % CI) and the p value.
Univariate and multivariate survival analyzes were performed using the Cox
proportional hazards model to identify the most important subset of independent
variables associated with prognostic factors, generating hazard ratios (HR) and their
respective confidence intervals (95 %). Multivariate analyzes were performed using the
stepwise method to evaluate possible associations adjusted for factors whose p-value
was < 0.250 in the univariate analysis [40].
Statistical analysis was performed using Statistical Package for Social Sciences
(SPSS) (IBM SPSS Statistics for Windows. Version 22.0, Armonk, NY, USA) and Excel for
Windows software (Microsoft, Tigard, OR, USA). The p value < 0.05 was considered
statistically significant, with 95 % CI. We also assessed the quality of this study in
reference to the STROBE Statement [41].
6.2.4 Results
Patient demographics and clinical-hematological characteristics
A total of 91 surgical patients were eligible for the study (Figure 1). Distribution
by sex showed that men represented the major part of the sample (87.9 %). The patients'
ages ranged from 44 to 88 years (median, 59 years). Most of patients were current or ex-
80
smokers (n = 70, 76.9 %), and 83 patients (91.2 %) had a history of alcohol intake.
Among the 91 study patients, 78 % had moderately differentiated tumor and 82.4 % had
an advanced stage (TIII/TIV). In our cohort, 89% of surgical LSCC patients had a
performance status (PS) between 0-1, thus demonstrating that the patients' functional
capacity was generally preserved. In relation to nutritional status, at diagnosis, 31.9 %
of the patients were overweight or obese, 46.2 % were normal weight and 22 % were
thinness or underweight (Table 1).
Hematological and inflammatory parameters related to BMI
We assessed the hematological profile of our cohort in relation to BMI. As
shown in Table 2, both groups (low BMI and normal/high BMI LSCC patients)
presented higher levels of CRP, when compared to the reference value (<0.5 mg/ dL).
Nevertheless, no significant differences (p > 0.05) were observed in lymphocytes,
platelets, neutrophils, and monocytes counts and, CRP serum levels, between patients
with low BMI and normal/high BMI patients. Similarly, no statistical difference was
observed between NLR, PLR, LMR, and BMI.
Optimal cutoff values for inflammatory parameters
The optimal cutoff value for NLR, PLR, and LMR was 1.55, 135.5, and 4.2,
respectively. NLR ≥ 1.55 (AUC: 0.64, 95 % CI: 0.52 - 0.77), PLR ≥ 135.5 (AUC: 0.63,
95 % CI: 0.51 - 0.73) and LMR < 4.2 (AUC: 0.63, 95% CI: 0.52 - 0.75) was related to a
worse prognosis (Figure 2). Based on this value, patients were divided into two groups
for further analysis.
Relationship between LSCC socio-demographic, clinicopathological parameters and
densities of tumoral CD4+ and CD8+ T lymphocyte infiltration
Representative immunohistochemistry images for CD4+ and CD8+ TILS
according to the infiltration area are shown in Figures 3, 4. All patients’ samples
showed immune cell infiltration in the stromal and intratumoral compartments. As
shown in Table 3, we observed that 80 % of low BMI patients presented low level of
81
intratumoral CD4+ T lymphocytes infiltrated, while 50.7 % patients with of normal/high
BMI presented high level of these T subtype in the same compartment (p = 0.015).
When analyzed the independence between the variables by logistic binomial regression
(odds ratio) our results demonstrated that low BMI LSCC patients had about 3.4 times
more chance to have low intratumoral density of CD4+ T lymphocyte infiltrated (OR:
0.287, 95 % CI: 0.082 - 1; p = 0.05) (Table 4).
There was no significant relationship between other variables analyzed and
stromal and intratumoral CD4+ and CD8+ T lymphocyte infiltration as well as to stromal
and intratumoral CD4+ / CD8+ ratio (Tables S1, S2).
Overall survival outcome
Median survival time of LSCC patients was 3.77 ± 1.79 years. The estimated 5-
year OS for the cohort was 61.5 %. The Kaplan-Meyer analysis indicated that low BMI,
CD4+ and CD8+ T lymphocyte infiltration and PLR did not significantly affect overall
survival. Although, LSCC patients with NLR ≥ 1.55 (p = 0.05) and LMR < 4.20 (p =
0.015) had poor overall survival. This finding demonstrated NLR and LMR prognostic
ability to predict cancer patient survival (Figure 5).
Predictive factors associated with OS in univariate and multivariate analysis
Treatment type, LMR, NLR, and adjacent tissue invasion were significant
predictors of poor survival in our cohort. LSCC patients undergoing chemotherapy and /
or radiotherapy after surgery had higher relative risk of dying when compared to
patients only undergo surgery (HR: 3.43, 95 % CI: 1.20 - 9,77, p = 0.021). Similarly,
patients with NLR ≥ 1.55 had ten times more relative risk of dying than those with NLR
< 1.55 (HR: 10.0, 95% CI: 1.37 - 73.10, p = 0.023). Patients with LMR ≥ 4.20 and with
no adjacent tissue invasion demonstrated lower risk of dying than those with LMR <
4.20 and with adjacent tissue invasion, respectively (HR: 0.08, 95 % CI: 0.84 - 0.024, p
= 0.024; HR: 0.40, 95 % CI: 0.17 - 0.92, p = 0.030).
BMI, tumoral lymphocytes infiltration and, other variables analyzed in our study
showed no significant influence on survival. When adjusted in multivariate Cox’s
82
models, our results demonstrated that only NLR was an independent prognostic factor
for overall survival (p = 0.025).
6.2.5 Discussion
The key finding from the current study is that low BMI LSCC surgical patients
had significantly lower density of intratumoral CD4+ T lymphocytes infiltrated when
compared with normal/high BMI patients.
The immune system plays a role in the control of tumor growth and progression.
Tumor infiltrating lymphocytes have been described as a prognostic factor in various
types of cancer, including head and neck squamous cell carcinoma [42, 43]. The
presence of TILs indicates a favorable prognosis and high density of T-cell infiltrates is
associated with favorable clinical outcome [44, 45]. Some studies also demonstrated
that higher CD4+ TIL levels predicted improved OS in head and neck cancer patients
[46, 47]. Similarly, Karpathiou et al. [30] pointed that head and neck cancer patients
with tumors densely infiltrated by T cells had better prognosis when compared with
patients whose tumors were poorly infiltrated. Additionally, Nedergaard et al. [48]
mentioned that a low density of CD4+ cells could be associated with an increased risk of
relapse in squamous cell cervical cancer.
On the other hand, other authors also reported no association between overall
survival and CD4+ T lymphocyte infiltration [49, 50]. Shah et al. [51] demonstrated that
the number of CD4+ T cells was significantly lower in patients who died as compared
with those who survived, however, CD4+ TILs was not associated with the overall 5-
year survival rate in cervical carcinoma patients. These authors concluded that
decreased proportions of tumor infiltrating CD4+ T cells was significantly associated
with the clinical outcome, although, did not affect overall survival. Hoesli et al. [52]
also evidenced that CD8+ or CD4+ TILs levels were not associated with overall survival
and any clinical variables in laryngeal squamous cell carcinoma patients. Similarly, our
results also showed no significant association between stromal and intratumoral CD8+
and CD4+ T lymphocyte infiltration and overall survival.
In our cohort no significant difference was observed in serum lymphocyte,
neutrophil, platelet and monocyte levels between low BMI and normal/high BMI
patients. Both groups had high CRP serum levels, although CRP values showed no
83
significant difference between low BMI and normal/high BMI patients. Likewise, other
inflammatory markers showed no significant difference between these two groups of
patients. These CRP high levels may be due to high frequency of patients with advanced
cancer (T III / T IV stages) in our cohort [53, 54]. Tas et al. [55] also found significantly
elevated serum levels of CRP in patients with advanced non-small cell lung carcinoma.
Other hypothesis for high levels of CRP can be due to host reactions to nonspecific
infection or local tissue injury or tumor necrosis [56, 57]. Besides that, it important to
point out that tumor cells are always in a state of chronic inflammation, which may
result in an increase in CRP values regardless of nutritional status [58].
In addition, multivariate analyzes showed no relationship between inflammatory
markers NLR, PLR, LMR, stromal, and intratumoral CD8+ and CD4+ T lymphocyte
infiltration. Interestingly, only low BMI values was independently associated with low
CD4+ T lymphocyte infiltration.
Nevertheless, NLR and LMR presented property to estimate prognosis in our
sample. NLR ≥ 1.55 was statistically associated with worse survival being considered
an independent factor prognostic. In Kaplan Meyer analysis, NLR≥1.55 and LMR<4.20
were predictors of poor survival in LSCC patients. Authors also demonstrated that
elevated preoperative NLR is an independent predictor of poor prognosis for patients
with LSCC [59, 60]. Similarly, studies showed that high LMR level was a significantly
independent predictor for favorable prognostic measures, including OS [61, 62].
In the present study, inflammation does not appear to have affected stromal and
intratumoral CD8+ and CD4+ T lymphocyte infiltration. Possibly, other mechanisms
involved with nutritional status depletion may have triggered a reduction in CD4+ T
cells infiltration.
Studies have showed that malnutrition is linked to immune dysfunction and may
influence survival and proliferation of T-cell [63, 64]. Both innate and acquired
immunity are affected in malnourished patients [65]. Takele et al. [66] demonstrated
that cytokine production can be significantly altered as a result of malnutrition. These
authors found no significant differences in neutrophils, lymphocytes, platelet counts,
CRP, IL-8 and in the ratio of CD4+ and CD8+ T cells in peripheral blood mononuclear
cells (PBMC) between individuals with normal BMI (> 18.5), moderately malnourished
(16.5 - 18.4) and severely malnourished (< 16.5). However, it was found a negative
84
correlation between BMI and the plasma levels of interferon (IFN)- γ, interleukin (IL)-
12, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, and IL-33.
Moreover, accumulating evidence has demonstrated that myeloid-derived
suppressor cells (MDSCs), a population of cells with suppressive activity, contribute to
the negative regulation of immune responses that occurs in cancer [67, 68].
Surprisingly, Gonda et al. [69] related that malnutrition was correlated negatively with
myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) levels. The authors demonstrated increased
MSDC levels in malnutrition preoperative patients. This scenario may lead to inhibition
of lymphocyte activation, including CD4+ T cells. It was also observed that the MDSC
levels were significantly positively correlated with IL-6 production. IL-6 is produced by
tumor cells and high levels of this pro-inflammatory cytokine may, in addition to
malnutrition, block the intratumoral lymphocyte infiltration [70, 71].
However, our study has some limitations. It is a retrospective design, where it is
difficult to control for potential confounding factors. The small sample size, the BMI
limitations in the nutritional status diagnosis and the heterogeneity of LSCC location are
other important limiting factors. Furthermore, the evaluation of cytokine production,
inflammatory mediators as well as the identification of myeloid-derived suppressor cells
in tumor stroma are also important tools.
Taken together, our results suggest that low BMI impairs the intratumoral CD4+
T lymphocytes infiltration and may contribute to tumor immune evasion and poor
prognosis in LSCC patients.
85
6.2.6 References
[1] Chen W, Zheng R, Baade PD, Zhang S, Zeng H, Bray F et al. Cancer statistics in
China, 2015. CA Cancer J Clin. 2016; 66:115-32. https://doi.org./10.3322/caac.21338.
[2] Beynon RA, Lang S, Schimansky S, et al. Tobacco smoking and alcohol drinking at
diagnosis of head and neck cancer and all‐cause mortality: Results from head and neck
5000, a prospective observational cohort of people with head and neck cancer. Int J
Cancer. 2018; 143(5): 1114–1127. https://doi.org/10.1002/ijc.31416.
[3] Bozkurt G, Elhassan HA, Mahmutoğlu AS, et al. Neck Muscle Mass Index as a
Predictor of Post-Laryngectomy Wound Complications. Annals of Otology, Rhinology
& Laryngology 2018; 127(11):841–847.
[4] Fu Y, Chen S, Chen S, Ou-Yang D, Liu W, Song, M, et al. A Preoperative
Nutritional index for predicting cancer-specific and overall survival in chinese patients
with laryngeal cancer: a retrospective study. Medicine 2016; 95(11): e2962. https://doi:
10.1097/MD.0000000000002962.
[5] Wu YY, Chang KP, Lin CY, et al. Prognostic significance of combined pretreatment
lymphocyte counts and body mass index in patients with head and neck cancer treated
with radiation therapy. Cancer Med. 2018; 7(7): 2808–2815. https://doi.org/
doi/10.1002/cam4.1489.
[6] Tan CSY, Read JA, Phan VH, Beale PJ, Peat JK, Clarke SJ. The relationship
between nutritional status, inflammatory markers and survival in patients with advanced
cancer: a prospective cohort study. Support Care Cancer 2015; 23:385-91.
https://doi/10.1007/s00520-014-2385y.
[7] Moon H, Roh J, Lee S, Kim S, Choi S, Nam SY, et al. Prognostic value of
nutritional and hematologic markers in head and neck squamous cell carcinoma treated
by chemoradiotherapy. Radiotherapy and Oncology 2016; 118:330-34.
https://doi.org/10.1016/j.radonc.2015.10.029.
[8] Riele RJLM, Dronkers EAC, Wieringa MH, De Herdt MJ, Sewnaik A, Hardillo JA,
et al. Influence of anemia and BMI on prognosis of laryngeal squamous cell carcinoma:
Development of an updated prognostic model. Oral Oncology 2018;
78:25-30. https://doi.org/10.1016/j.oraloncology.2018.01.001.
[9] Lee SM, Russell A, Hellawell G. Predictive value of pretreatment inflammation-
based prognostic scores (neutrophil-to-lymphocyte ratio, platelet-to-lymphocyte ratio,
and lymphocyte-to-monocyte ratio) for invasive bladder carcinoma. Korean Journal of
urology. 2015; 56(11):749–55. Epub 2015/11/17. https://doi:
10.4111/kju.2015.56.11.749.
[10] Jia WJ, Wu JN, Jia HX, Yang YP, Zhang XL, Chen K, et al. The peripheral blood
neutrophil-to-lymphocyte ratio is superiorto the lymphocyte-to-monocyte ratio for
predicting the long-term survival of triple-negative breast cancer patients. PloS one.
2015; 10(11).ARTN e0143061 https://doi: 10.1371/journal.pone.0143061.
86
[11] Kaynar M, Goktas S. Neutrophil-to-lymphocyte ratio predicts progression and
recurrence of non-muscle-invasive bladder cancer. Urol Oncol-Semin Ori. 2015;
33(11):497. https://doi: 10.1016/j.urolonc.2015.05.
[12] Nakamura K, Smyth MJ. Targeting cancer‐related inflammation in the era of
immunotherapy. Immunology and Cell Biology 2017; 95(4):325-332.
[13] Gupta SC, Kunnumakkara AB, Aggarwal S, et al. Inflammation, a Double-Edge
Sword for Cancer and Other Age-Related Diseases. Front Immunol. 2018; 27(9):2160.
https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.02160.
[14] Bindea G, Mlecnik B, Fridman W, Galon J. The prognostic impact of anti-cancer
immune response: a novel classification of cancer patients. Semin Immunopathol 2011;
33:335–340. https://doi:10.1007/s00281-011-0264-x
[15] Murata M. Inflammation and cancer. Environ Health Prev Med. 2018; 2(50):2-8.
https://doi.org/10.1186/s12199-018-0740-1.
[16] Suarez‐Carmona M, Lesage J, Cataldo D, et al. EMT and inflammation:
inseparable actors of cancer progression. Mol Oncol. 2017; 11(7):805–823.
https://doi.org/10.1002/1878-0261.12095.
[17] Munn L. Cancer and Inflammation. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2017;
9(2): 1-19. https://doi.org/10.1002/wsbm.1370.
[18] Kara M, Uysal S, Altinişik U, Cevizci S, Güçlü O, Dereköy FS. The pre-treatment
neutrophil-to-lymphocyte ratio, platelet-to-lymphocyte ratio, and red cell distribution
width predict prognosis in patients with laryngeal carcinoma. European Archives of
Oto-Rhino-Laryngology 2017; 274(1):535–542.
[19] Chen S, Guo J, Feng C, Ke Z, Chen L, Pan Y. The preoperative platelet–
lymphocyte ratio versus neutrophil–lymphocyte ratio: which is better as a prognostic
factor in oral squamous cell carcinoma? Ther Adv Med Oncol 2016; 8:160–167.
https://doi: 10.1177/1758834016638019.
[20] Kano S, Homma A, Hatakeyama H, Mizumachi T, Sakashita T, Kakizaki T, et al.
Pretreatment lymphocyte-to-monocyte ratio as an independent prognostic factor for
head and neck cancer. Head and Neck 2017; 39(2):247-253. https://doi:
10.1002/hed.24576.
[21] Alwarawrah Y, Kiernan K, MacIver NJ. Changes in Nutritional Status impact
immune Cell Metabolism and Function. Front Immunol. 2018; 9(1055):1-14.
https://doi: 10.3389/fimmu.2018.01055.
[22] Salgado R, Denkert C, Demaria S, Sirtaine N, Klauschen F, Pruneri G, et al. The
evaluation of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) in breast cancer: recommendations
by an International TILs Working Group 2014. Ann Oncol. 2015; 26:259–271.
[23] Turner N, Wong HL, Templeton A, Tripathy S, Whiti R, Croxford M, et al.
Analysis of local chronic inflammatory cell infiltrate combined with systemic
87
inflammation improves prognostication in stage II colon cancer independent of standard
clinicopathologic criteria. Int J Cancer. 2016; 138:671–678.
[24] Kang BW, Seo AN, Yoon S, Bae HI, Jeon SW, Kwon OK, et al. Prognostic value
of tumor-infiltrating lymphocytes in Epstein-Barr virus-associated gastric cancer. Ann
Oncol. 2016; 27:494–501.
[25] Balermpas P, Michel Y, Wagenblast J, Seitz O, Weiss C, Rodel F, et al. Tumor-
infiltrating lymphocytes predict response to definitive chemoradiotherapy in head and
neck cancer. Br J Cancer. 2014; 110:501–509.
[26] Zal T, Chodaczek G. Intravital imaging of anti-tumor immune response and the
tumor microenvironment. Seminars in Immunopathology 2010; 32(3):305–317.
https://doi: 10.1007/s00281-010-0217-9.
[27] de Ruiter EJ, Ooft ML, Devriese LA, et al. The prognostic role of tumor infiltrating
T-lymphocytes in squamous cell carcinoma of the head and neck: A systematic review
and meta-analysis. Oncoimmunology 2017; 6(11): e1356148.
https://doi.org/10.1080/2162402X.2017.1356148.
[28] Borst J, Ahrends T, Bąbała N, et al. CD4+ T cell help in cancer immunology and
immunotherapy. Nat Rev Immunol 2018; 18:635–647. https://doi.org/10.1038/s41577-
018-0044-0.
[29] Nguyen N, Bellile E, Thomas D, McHugh J, Rozek L, Virani S, et al. Tumor
infiltrating lymphocytes and survival in patients with head and neck squamous cell
carcinoma. Head Neck. 2016; 38(7):1074–1084. https://doi:10.1002/hed.24406.
[30] Karpathiou G, Casteillo F, Giroult J, Forest F, Fournel P, Monaya A, et al.
Prognostic impact of immune microenvironment in laryngeal and pharyngeal squamous
cell carcinoma: Immune cell subtypes, immune-suppressive pathways and
clinicopathologic characteristics. Oncotarget 2017; 8(12):19310-322.
[31] De Meulenaere A, Vermassen T, Aspeslagh S, Deron P, Duprez F, Laukens D, et
al. Tumor PD-L1 status and CD-8+ tumor-infiltrating T cells: markers of improved
prognosis in oropharyngeal cancer. Oncotarget 2017; 8(46):80433-452.
[32] Huang CD. Econometric models of alcohol demand in the United Kingdom.
Government Economic Service Working Paper 2003; 140:1-52.
[33] Freedman DS, Flanders WD, Barboriak JJ, et al. Cigarette smoking and leukocyte
subpopulations in men. Ann Epidemiol. 1996; 6(4):299-306.
[34] Cross SS. Observer accuracy in estimating proportions in images: implications for
the semiquantitative assessment of staining reactions and a proposal for a new system. J
Clin Pathol. 2001; 54:385–390.
[35] Wang J, Wang S, Song X, Zeng W, Wang S, Chen F, et al. The prognostic value of
systemic and local inflammation in patients with laryngeal squamous cell carcinoma.
OncoTargets and Therapy 2016; 9:7177-7185.
88
[36] Xu Q, Wang C, Yuan X, Feng Z, Han Z. Prognostic value of tumor-infiltrating
lymphocytes for patients with head and neck squamous cell carcinoma. Translational
Oncology 2017; 10(1):10-16.
[37] Fluxá P, Rojas-Sepúlveda D, Gleisner MA, Tittarelli A, Villegas P, Tapia L, et al.
High CD8+ and absence of Foxp3+ T lymphocytes infiltration in gallbladder tumors
correlate with prolonged patients survival. BMC Cancer 2018; 18(243):2-11.
[38] Manzano AC, Altemani A, Martins AS, Negro AD, Tincani AJ.
Immunohistochemical characterization of lymphocyte infiltrate in tongue and oral floor
squamous cell carcinoma biopsy and its prognostic implication. Rev. Bras. Cir. Cabeça
Pescoço 2010; 39(4):270-276.
[39] Youden WJ. Index for rating diagnostic tests. Cancer 1950; 3:32–35.
[40] Hosmer Jr DW, Lemeshow S, May S. Applied Survival Analysis: Regression
Modeling of Time-to-Event Dat. 2nd ed. ISBN 978-0-471-75499-2, 2011.
[41] Elm EV, Altman DG, Egger M, Pocock S, Gotzsche P, Vandenbroucke JP. The
strengthening the reporting of observational studies in epidemiology (STROBE)
statement: guidelines for reporting observational studies. The Lancet 2007; 370:1453-
1457.
[42] Stasikowska-Kanicka O, Wągrowska-Danilewicz1 M, Danilewicz M.
Immunohistochemical Analysis of Foxp3+, CD4+, CD8+ Cell Infiltrates and PD-L1 in
Oral Squamous Cell Carcinoma. Pathol. Oncol. Res. 2018; 24:497–505.
[43] Jiang D, Liu Y, Wang H, Wang H, Song Q, Sujie A, et al. Tumour infiltrating
lymphocytes correlate with improved survival in patients with esophageal squamous
cell carcinoma. Scientific Reports 2017; 7(44823):1-10.
[44] Shimizu S, Hiratsuka H, Koike K, Tsuchihashi K, Sonoda T, Ogi K, et al. Tumor-
infiltrating CD8+ T-cell density is an independent prognostic marker for oral squamous
cell carcinoma. Cancer Medicine 2019; 8:80-93.
[45] Fridman WH, Pagès F, Sautès-Fridman C, Galon J. The immune contexture in
human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 2012; 12:298-306.
[46] Badoual C, Hans S, Rodriguez J, Peyrand S, Klein C, Nel HA, et al. Prognostic
value of tumor-infiltrating CD4+ T-cell subpopulations in head and neck cancers. Clin
Cancer Res. 2006; 12(2):465-472.
[47] Balermpas P, Rödel F, Rödel C, Krause M,, Linge A, Lohaus F, et al. CD8+
tumour-infiltrating lymphocytes in relation to HPV status and clinical outcome in
patients with head and neck cancer after postoperative chemoradiotherapy: A
multicentre study of the German cancer consortium radiation oncology group (DKTK-
ROG) Intl J Cancer 2015; 138(1):171-181.
89
[48] Nedergaard BS, Ladekarl M, Thomsen HF, Nyengaard JR, Nielsen K. Low density
of CD3+, CD4+ and CD8+ cells is associated with increased risk of relapse in squamous
cell cervical cancer. Br J Cancer 2007; 97:1135-1138.
[49] Fang J, Li X, Ma D, Liu X, Chen Y, Wang Y, et al. Prognostic significance of
tumor infiltrating immune cells in oral squamous cell carcinoma. BMC Cancer 2017;
17(375):1-9.
[50] Zheng X, Song X, Shao Y, Xu B, Hu W, Zhou Q et al. Prognostic role of tumor-
infiltrating lymphocytes in esophagus cancer: a meta-analysis. Cell Physiol Biochem
2018; 45:720-732.
[51] Shah W, Yan X, Jing L, Zhou Y, Chen H, Wang Y. A reversed CD4/CD8 ratio of
tumor-infiltrating lymphocytes and a high percentage of CD4+FOXP3+ regulatory T
cells are significantly associated with clinical outcome in squamous cell carcinoma of
the cervix. Cellular and Molecular Immunology 2011; 8:59–66.
[52] Hoesli R, Birkelanda AC, Roskoa AJ, Issaa M, Chowa KL, Michmerhuizen NL, et
al. Proportion of CD4 and CD8 tumor infiltrating lymphocytes predicts survival in
persistent/recurrent laryngeal squamous cell carcinoma. Oral Oncology 2018; 77:83-89.
https://doi.org/10.1016/j.oraloncology.2017.12.003.
[53] Lumachi F, Basso SMM, Santeufemia DA, Ermani M, Re GL, Chiara GB.
Preoperative Serum C-Reactive Protein and its Prognostic Significance in Patients with
Stage III-IV Colorectal Cancer. Anticancer Research 2014; 34(12):7263-7266.
[54] de Raaf PJ, Sleijfer S, Lamers CHJ, Jager A, Gratama JW, Van der Rijt, CCD.
Inflammation and fatigue dimensions in advanced cancer patients and cancer survivors.
Cancer 2012; 6005-6011.
[55] Tas F, Duranyildiz D, Argon A, Og˘uz H, Camlica H, Yasasever V, et al. Serum
levels of leptin and proinflammatory cytokines in advanced-stage non-small cell lung
cancer. Medical Oncology 2005; 22(4):353–358.
[56] Wong VK, Malik HZ, Hamady ZZ, et al. C-reactive protein as a predictor of
prognosis following curative resection for colorectal liver metastases. Br J Cancer 2007;
96:222–225.
[57] McCarthy N. Inflammation: an innate response. Nat Rev Cancer 2015;15:197.
[58] Fang Y, Xu C, Wu P, Zhang L, Li D, Sun J, et al. Prognostic role of C-reactive
protein in patients with nasopharyngeal carcinoma: a meta-analysis and literature
review. Medicine (Baltimore) 2017; 96(45): e8463.
[59] Du J, Liu J, Zhang X, Chen X, Yu R, Gu D, et al. Pre-treatment neutrophil-to-
lymphocyte ratio predicts survival in patients with laryngeal cancer. Oncology Letters
2018; 15:1664-1672.
90
[60] Hsueh C, Tao L, Zhang M, Cao W, Gong H, Zhoy J, et al. The prognostic value of
preoperative neutrophils, platelets, lymphocytes, monocytes and calculated ratios in
patients with laryngeal squamous cell cancer. Oncotarget 2017; 8(36): 60514-60527.
[61] Li J, Jiang R, Liu W, Liu Q, Xu M, Feng Q, et al. A large cohort study reveals the
association of elevated peripheral blood lymphocyte-to-monocyte ratio with favorable
prognosis in nasopharyngeal carcinoma. PlosOne 2013; 8(12):1-10.
[62] Tham T, Olson C, Khaymovich J, Herman SW, Costantino PD. The lymphocyte-
to-monocyte ratio as a prognostic indicator in head and neck cancer: a systematic
review and meta-analysis. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology 2018;
275:1663-1670.
[63] Schlaudecker EP, Steinhoff MC, Moore SR. Interactions of diarrhea, pneumonia,
and malnutrition in childhood: recent evidence from developing countries. Curr Opin
Infect Dis. 2011; 24:496–502.
[64] Saucillo DC, Gerriets VA, Sheng J, Rathmell JC, Maciver NJ. Leptin metabolically
licenses T cells for activation to link nutrition and immunity. J Immunol. 2014;
192:136–144.
[65] Schaible UE, Kaufmann SH. Malnutrition and infection: complex mechanisms and
global impacts. PLOS Med. 2007; 4(5):e115 10.1371/journal.pmed.0040115.
[66] Takele Y, Adem E, Getahun M, Tajebe F, Kiflie A, Hailu A, Raynes J, et al.
Malnutrition in healthy individuals results in increased mixed cytokine profiles, altered
neutrophil subsets and function. PLoS One. 2016; 11(8):e0157919. https://doi:
10.1371/journal.pone.0157919.
[67] Kusmartsev S, Nefedova Y, Yoder D,Gabrilovich DI. Antigen-specific inhibition
of CD8+ T cell response by immature myeloid cells in cancer is mediated by reactive
oxygen species. J Immunol. 2004; 172:989–999.
[68] Solito S, Falisi E, Diaz-Montero CM, Doni A, Pinton L, Rosato A, et al. A human
promyelocytic-like population is responsible for the immune suppression mediated by
myeloid-derived suppressor cells. Blood. 2011; 118:2254–2265.
[69] Gonda K, Shibata M, Ohtake T, Matsumoto Y, Tachibana K, Abe N, et al.
Myeloid-derived suppressor cells are increased and correlated with type 2 immune
responses, malnutrition, inflammation, and poor prognosis in patients with breast
cancer. Oncology Letters 2017; 14:1766-1774.
[70] Oka M, Yamamoto K, Takahashi M, Hakozaki M, Abe T, Iizuka N, et al.
Relationship between serum levels of interleukin 6, various disease parameters, and
malnutrition in patients with esphageal squamous cell carcinoma. Cancer Research
1996; 56:2776-2780.
[71] Onuchic AC , Chammas R. Cancer and the tumor microenvironment. Rev Med.
2010; 89(1):21-31.
91
LSCC = laryngeal squamous cell carcinoma; n = number of patients.
Figure 1 Patient Selection Flow Diagram.
Surgically treated LSCC patients
and analyzed by
immunohistochemistry (n= 91)
77 cases excluded:
- Patients not submitted to surgery
(n = 69);
- Surgical blocks not available or
insufficient material for analysis
(n=8);
LSCC patients
(n=1427)
Excluded malignant neoplasms
of other histologies (n=108)
LSCC patients (n=1319)
Patients excluded:
- No pre-treatment biochemical tests available
(n=504);
- No initial nutritional assessment (n=188);
- No nutritional assessment and no initial
biochemical tests available (n= 402);
- With metastasis at diagnosis (n=2);
- Did not continue treatment (n = 9);
- Not submitted to oncologic treatment (n= 19);
- Treatment outside the Institution (n=25);
- Radiotherapy or chemoradiotherapy before
surgery (n=2).
LSCC patients (n=168)
92
Table 1 Clinical characteristics of the patients with laryngeal squamous cell carcinomas
patients (n=91).
Variables Categories N %
Age (years)a 59 41-88
Sex
Female 11 12.1
Male 80 87.9
Alcohol consumption Yes 47 51.6
No 21 23.1
Ex-alcoholist 23 25.3
Smoking Yes 58 63.7
No 8 8.8
Ex-smoker 25 27.5
LSCC location Supraglottic 8 8.8
Glottic 28 30.8
Subglottic - -
Transglottic 43 47.3
Unspecified larynx invasive lesion 12 13.2
Differentiation degree
Well differentiated 7 7.7
Moderately differentiated 71 78.0
Poorly differentiated 11 12.1
T stage I / II 16 17.6
III / IV 75 82.4
Surgery 23 25.3
Treatment type Surgery + chemotherapy 1 1.1
Surgery + radiotherapy 60 65.9
Surgery + chemoradiotherapy 7 7.7
Limph node involvement
Yes 23 25.3
No 68 74.7
93
Table 1 (Continued)
Variables Categories N %
PS 0-1 81 89.0
2-3 2 2.2
4 1 1.1
Uninformed 7 7.7
Death Yes 35 38.5
No 56 61.5
BMI classification
Thinness /Underweight 20 22.0
Eutrophy 42 46.2
Overweight/Obesity 29 31.9
Hematological parametersb
Limphocytes (/µ)
Plateletes (/µl)
Neutropils (/µ)
Monocytes (/µ)
2097
257.000
5529
673
497-4493
286-584.000
1542-21640
243-2583
Serum inflammatory
parameterc
C-reactive protein (mg/dl) 12.2 0.59-36.91
N= number of observations; %= frequency; PS = performance status; BMI= Body mass
index; a,bMedian/minimum and maximum.
94
Table 2 Hematological and inflammatory parameters of LSCC patients according to
body mass index.
IQ= Interquartile range; CRP= C-Reactive Protein; NLR = neutrophil-to-lymphocyte
ratio; PLR = platelet-to-lymphocyte ratio; LMR = lymphocyte-to-monocyte ratio; BMI
= body mass index. Mann-Whitney test (median and IQ).
BMI
LOW NORMAL/HIGH
Variables Median IQ Median IQ
p-value
Lymphocytes (/µ) 2047 1558.50-2413 2138 1522-2554
0.687
Plateletes (/µ) 301000 231500-356750 249000 209000-322000
0.060
Neutropils (/µ) 7320.50 3798.25-8510 4991 4034-7600
0.181
Monocytes (/µ) 723.50 555.75-886.25 666 586-804
0.524
CRP (mg/dl) 12.03 8.45-18.11 12.27 7.83-17.79 0.903
NLR 2.89 2.19-5.67 2.39 1.67-4.75 0.162
PLR 162.14 103-63-197.30 125.66 94.45-175.15 0.107
LMR 2.83 2.30-3.54 3.09 1.92-4.50 0.287
95
Area under the receiver operating characteristics curves (AUC): NLR = 0.64 (sensitivity: 0.97, specificity: 0.71); PLR = 0.63 (sensitivity: 0.83, specificity: 0.61); LMR = 0.63
(sensitivity: 0.34, specificity: 0.09).
Figure 2 Optimal cutoff values for continuous NLR (A), PLR (B), and LMR(C) according to death in 5 years.
96
Figure 3 Intratumoral and stromal CD4+ T lymphocyte infiltration in LSCC. (A) Intratumoral CD4+ T lymphocyte infiltration in normal/high
BMI patients. (B) Intratumoral CD4+ T lymphocyte infiltration in low BMI patients. (C) Stromal CD4+ T lymphocyte infiltration in normal/high
BMI patients. (D) Stromal CD4+ T lymphocyte infiltration in low BMI patients. Bar scale: 100μm. Magnification: 200x (20x objective lens).
97
Figure 4 Intratumoral and stromal CD8+ T lymphocyte infiltration in LSCC. (A) Intratumoral CD8+ T lymphocyte infiltration in normal/high
BMI patients. (B) Intratumoral CD8+ T lymphocyte infiltration in low BMI patients. (C) Stromal CD8+ T lymphocyte infiltration in normal/high
BMI patients. (D) Stromal CD8+ T lymphocyte infiltration in low BMI patients. Bar scale: 100μm. Magnification: 200x (20x objective lens).
98
Table 3 Stromal and intratumoral densities of CD4+ and CD8+ T lymphocyte infiltration according to socio-demographic and clinical
characteristics of LSCC patients (n=91).
CD4+ T Stromal
Intensity
CD8+ T Stromal
Intensity
CD4+ T Intratumoral
Intensity
CD8+ T Intratumoral
Intensity
Variables Categories Low High Low High
Low High Low
High
N % N % p-value N % N % p-value N % N % p-value N % N % p-value
Age (years) < 60 5 10.6 42 89.4 0.304
9 19.1 38 80.9 0.685
23 48.9 24 51.1 0.158
10 21.3 37 78.7 0.711
≥ 60 8 18.2 36 81.8 7 15.9 37 84.1 28 63.6 16 36.4 8 18.2 36 81.8
Sex Male 12 15.0 68 85.0 0.599
15 18.8 65 81.3 0.430
6 54.5 5 45.5 0.915
4 36.4 7 63.6 0.141
Female 1 9.1 10 90.9 1 9.1 10 90.9 45 56.3 35 43.8 14 17.5 66 82.5
Alcohol
consumption
No 3 14.3 18 85.7
0.460
3 14.3 18 85.7
0.802
12 57.1 9 42.9
0.826
4 19.0 17 81.0
0.667 Yes 5 10.6 42 89.4 8 17.0 39 83.0 25 53.2 22 46.8 8 17.0 39 83.0
Ex-alcoholist 5 21.7 18 78.3 5 21.7 18 78.3 14 60.9 9 39.1 6 26.1 17 73.9
Smoking
No 1 12.5 7 87.5
0.905
0 0.0 8 100.0
0.344
6 75.0 2 25.0
0.247
3 37.5 5 62.5
0.400 Yes 9 15.5 49 84.5 12 20.7 46 79.3 34 58.6 24 41.4 11 19.0 47 81.0
Ex-smoker 3 12.0 22 88.0 4 16.0 21 84.0 11 44.0 14 56.0 4 16.0 21 84.0
Differentiation
degree
Poorly
differentiated 1 14.3 6 85.7
0.901
3 42.3 4 57.1
0.051
4 57.1 3 42.9
0.489
1 14.3 6 85.7
0.938 Moderately
differentiated 10 14.1 61 85.9 11 15.5 60 84.5 38 53.5 33 46.5 14 19.7 57 80.3
Well
differentiated 1 9.1 10 90.9 0 0.0 11 100.0 8 72.7 3 27.3 2 18.2 9 81.8
T stage I/II 1 6.3 15 93.8 0.317
2 12.5 14 87.5 0.556
9 56.3 7 43.8 0.985
2 12.5 14 87.5 0.421
TIII/TIV 12 16.0 63 84.0 14 18.7 61 81.3 42 56.0 33 44.0 16 21.3 59 78.7
99
Table 3 (Continued)
N= number of observations; %= frequency; NLR = neutrophil-to-lymphocyte ratio; PLR = platelet-to-lymphocyte ratio; LMR = lymphocyte-to-monocyte ratio; BMI = body
mass index. Pearson's Chi-square test (χ2).
CD4+ T Stromal
Intensity
CD8+ T Stromal
Intensity
CD4+ T Intratumoral
Intensity
CD8+ T Intratumoral
Intensity
Variables Categories Low High Low High
Low High Low
High
N % N % p-value N % N % p-value N % N % p-value N % N % p-value
Limph node
involvement
Yes 5 21.7 18 78.3 0.237 4 17.41 19 82.6 0.978 14 60.9 9 39.1 0.590 3 13.0 20 87.0 0.348
No 8 11.8 60 88.2 12 17.6 56 82.4 37 54.4 31 45.6 15 22.1 53 77.9
BMI Normal/high 9 12.7 62 87.3 0.408
12 16.9 59 83.1 0.748
35 49.3 36 50.7 0.015
15 21.1 56 78.9 0.543
Low 4 20.0 16 80.0 4 20.0 16 80.0 16 80.0 4 20.0 3 15.0 17 85.0
NLR < 1.55 2 11.8 15 88.2 0.742
3 17.6 14 82.4 0.994
7 41.2 10 58.8 0.171
3 17.6 14 82.4 0.807
≥ 1.55 11 14.9 63 85.1 13 17.6 61 82.4 44 59.5 30 40.5 15 20.3 59 79.7
PLR < 135.5 4 13.8 25 86.2 0.927
4 13.8 25 86.2 0.516
15 51.7 14 48.3 0.570
4 13.8 25 86.2 0.327
≥135.5 9 14.5 53 85.5 12 19.4 50 80.6 36 58.1 26 41.9 14 22.6 48 77.4
LMR < 4.20 12 17.1 58 82.9 0.155
14 20.0 56 80.0 0.269
43 61.4 27 38.6 0.059
14 20.0 56 80.0 0.923
≥4.20 1 14.3 20 95.2 2 9.5 19 90.5 8 38.1 13 61.9 4 19.0 17 81.0
Death No 8 14.3 48 85.7 1.0
8 14.3 48 85.7 0.296
33 58.9 23 41.1 0.483
10 17.9 46 82.1 0.560
Yes 5 14.3 30 85.7 8 22.9 27 77.1 18 51.4 17 48.6 8 22.9 27 77.1
Adjacent Tissue
Invasion No 6 18.7 26 81.3
0.370 4 12.5 28 87.5
0.348 16
50.0
16
50.
0.392 3
9.4
29
90.6
0.066
Yes 7 11.9 52 88.1 12 20.3 47 79.7 35 59.3 24 40.7 15 25.4 44 74.6
100
Table 4 Relationship between intratumoral CD4+ and CD8+ T lymphocyte infiltration, socio-demographic and clinicopathological parameters. Univariate analysis
Multivariate analysis Univariate analysis Multivariate analysis
HIGH CD4+ T
INTRATUMORAL
INTENSITY
HIGH CD4+ T
INTRATUMORAL
INTENSITY
HIGH CD8+ T
INTRATUMORAL
INTENSITY
HIGH CD8+ T
INTRATUMORAL
INTENSITY Variables Categories N OR 95% CI p-value OR 95%CI p-value N OR 95% CI p-value OR 95% CI p-
value
Age (years) < 60 47 1 1 47 1
≥ 60 44 0.548 0.237 1.268 0.160a 0.657 0.258 1.67 0.378 44 1.216 0.431 3.430 0.711
Sex Female 11 1 11 1 1
Male 80 0.933 0.263 3.311 0.915 80 2.694 0.693 10.466 0.152b 2.324 0.561 9.629 0.245
Alcohol
consumption No 21 1 21 1
Yes 47 1.173 0.416 3.310 0.762 47 1.147 0.304 4.332 0.840
Ex-alcoholist 23 0.857 0.257 2.856 0.802 23 0.667 0.159 2.794 0.578
Smoking No 8 1 1 8 1 1
Yes 58 2.118 0.393 11.41 0.374 2.361 0.419 13.293 0.330 58 2.564 0.531 12.39 0.229b 2.007 0.383 10.505 0.410
Ex-smoker 25 3.818 0.641 22.75 0.127a 4.339 0.7 26.883 0.115 25 3.150 0.528 18.81 0.195b 2.56 0.405 16.203 0.318
Differentiation
degree
Poorly
differentiated 7 1
7 1
Moderately
differentiated 71 1.158 0.241 5.556 0.855
71 0.679 0.075 6.104 0.728
Well
differentiated 11 0.500 0.068 3.698 0.494
11 0.750 0.055 10.24 0.829
T stage TI/TII 16 1 16 1
TIII/TIV 75 1.010 0.340 2.998 0.985 75 0.527 0.108 2.561 0.427
Limph node
involvement Yes 23 1
23 1
No 68 1.303 0.497 3.417 0.590 68 0.530 0.138 2.028 0.354
101
Table 4 (Continued)
N= number of observations; OR= odds ratio; 95% CI = 95% Confidence Interval; NLR = neutrophil-to-lymphocyte ratio; PLR = platelet-to-lymphocyte ratio; LMR =
lymphocyte-to-monocyte ratio; BMI = body mass index. aOR for multivariate analyses adjusted by age, smoking, malnutrition and NLR. bOR for multivariate analyses
adjusted by sex and smoking.
Univariate analysis
Multivariate analysis Univariate analysis Multivariate analysis
HIGH CD4+ T
INTRATUMORAL
INTENSITY
HIGH CD4+ T
INTRATUMORAL
INTENSITY
HIGH CD8+ T
INTRATUMORAL
INTENSITY
HIGH CD8+ T
INTRATUMORAL
INTENSITY Variables Categories N OR 95%CI p-value OR 95%CI p-
value
N OR 95% CI p-
value
OR 95%
CI
p-value
BMI Normal/high 71 1 1 71 1
Low 20 0.243 0.074 0.799 0.020a 0.287 0.082 1 0.05 20 1.518 0.392 5.874 0.546
NLR < 1.55 17 1 1 17 1
≥ 1.55 74 0.477 0.163 1.394 0.176a 0.44 0.138 1.402 0.165 74 0.843 0.214 3.316 0.807
PLR < 135.5 29 1 29 1
≥135.5 62 0.774 0.319 1.877 0.571 62 0.549 0.163 1.843 0.331
LMR < 4.20 70 1 70 1
≥4.20 21 2.588 0.949 7.060 0.063 21 1.063 0.309 3659,000 0.923
Death No 56 1 56 1
Yes 35 1.355 0.579 3.171 0.484 35 0.734 0.258 2.084 0.561
Adjacent
Tissue
Invasion
Yes 59 1
59 1
No 32 1.458 0.613 3.467 0.393 32 1.106 0.372 3.293 0.856
102
Table 5 Predictive factors associated with OS in univariate and multivariate analysis.
Variables Categories Univariate analysis Multivariate analysis
HR 95% CI p-value HR 95% CI p-value
Age (years) < 60 1.0
≥ 60 1.34 0.69 2.6 0.393
Sex Female 1.0
Male 1.64 0.50 5.37 0.410
Alcohol consumption No 1.0 1.00
Yes 2.82 1.00 8.00 0.051a 2.69 0.93 7.74 0.067
Smoking No 1.0 1.00
Yes 3.97 0.54 29.02 0.174a 4.03 0.55 29.62 0.170
Differentiation degree Poorly differentiated 1.00
Moderately differentiated 0.75 0.23 2.47 0.636
Well differentiated 0.75 0.17 3.37 0.710
T stage TI/TII 1.00
TIII/TIV 1.81 0.64 5.12 0.265
Treatment type Surgery 1.00 1.00
Treatment after surgery 3.43 1.20 9.77 0.021a 2.06 0.66 6.39 0.211
Limph node involvement Yes 1.00 1.00
No 0.59 0.29 1.20 0.145a 0.63 0.30 1.32 0.221
BMI Normal/high 1.00
Low 0.87 0.38 1.99 0.743
103
Table 5 (Continued)
Variables Categories Univariate analysis Multivariate analysis
HR (IC 95%) p-value HR (IC 95%) p-value
NLR < 1,55 1.00 1.00
≥ 1,55 10.00 1.37 73.10 0.023a 9.85 1.33 73.09 0.025
PLR < 135,5 1.00
≥135,5 2.04 0.89 4.68 0.091b
LMR < 4,20 1.00
≥4,20 0.08 0.024 0.84 0.024b
Stromal CD4+ T intensity Low 1.00
High 0.72 0.30 1.74 0.466
Stromal CD8+ T intensity Low 1.00
High 0.72 0.36 1.42 0.343
Intratumoral CD4+ T intensity Low 1.00 1.00
High 2.58 0.79 8.42 0.117a 1.36 0.68 2.71 0.381
Intratumoral CD8+ T intensity Low 1.00
High 0.98 0.43 2.24 0.957
Intratumoral CD4+/CD8+ ratio Low 1.00
High 0.72 0.31 1.65 0.434
Stromal CD4+/CD8+ ratio Low 1.00
High 0.89 0.45 1.76 0.728
Adjacent tissue invasion Yes 1.00 1.00
No 0.40 0.17 0.92 0.030a 0.56 0.23 1.34 0.189
HR= hazard ratio; 95% CI = 95% Confidence Interval; BMI = body mass index.. aHR for multivariate analyses adjusted by alcohol consumption, smoking, treatment type, lymph node
involvement, NLR, intratumoral CD4+T intensity and adjacent tissue invasion. bPLR and LMR was excluded in the adjustment of multivariate analysis due to its collinearity with other
inflammatory parameters.
104
Figure 5 Kaplan-Meier overall survival (OS) curves plus log-rank p-values for LSCC patients. (A) OS curves stratified according to BMI. (B)
OS curves stratified according to intratumoral density of CD8+ T lymphocytes infiltration. (C) OS curves stratified according to intratumoral
density of CD4+ T lymphocytes infiltration. (D) OS curves stratified according to NLR cutoff value. (E) OS curves stratified according to PLR
cutoff value. (F) OS curves stratified according to LMR cutoff value.
105
Table S1 Relationship between stromal CD4+ and CD8+ T lymphocyte infiltration, socio-demographic and clinicopathological parameters. Univariate analysis
Multivariate analysis Univariate analysis Multivariate analysis
HIGH CD4+ T STROMAL INTENSITY HIGH CD4+ T STROMAL
INTENSITY
HIGH CD8+ T STROMAL
INTENSITY
HIGH CD8+ T STROMAL
INTENSITY Variables Categories N OR 95% CI p-value OR 95%CI p-value N OR 95% CI p-value OR 95% CI p-
value
Age (years) < 60 47 1 47 1
≥ 60 44 0.536 0.161 1.784 0.309 44 1.252 0.422 3.710 0.685
Sex Female 11 1 11 1
Male 80 0.567 0.066 4.842 0.604 80 0.433 0.051 3.650 0.442
Alcohol
consumption No 21 1 21 1
Yes 47 1.400 0.302 6.495 0.666 47 0.812 0.193 3.423 0.777
Ex-alcoholist 23 0.600 0.124 2.895 0.522 23 0.600 0.124 2.895 0.522
Smoking No 8 1 8 1
Yes 58 0.778 0.085 7.112 0.823 58 0.218 0.012 4.059 0.155 - - - -
Ex-smoker 25 1.048 0.933 11.76 0.970 25 0.281 0.014 5.808 0.228 - - - -
Differentiation
degree
Poorly
differentiated 7 1
7 1
Moderately
differentiated 71 1.017 0.110 9.367 0.988
71 4.091 0.802 20.87 0.072
- - - -
Well
differentiated 11 1.667 0.087 31.89 0.732
11 17.89 0.761 420.8 0.018
- - - -
T stage TI/TII 16 1 16 1
TIII/TIV 75 0.350 0.42 2.905 0.331 75 0.622 0.127 3.057 0.559
Limph node
involvement Yes 23 1
1 23 1
No 68 2.083 0.606 7.165 0.244a 1.853 0.53 6.477 0.334 68 0.982 0.283 3.414 0.978
106
Table S1 (Continued)
N= number of observations; OR= odds ratio; 95% CI = 95% Confidence Interval; NLR = neutrophil-to-lymphocyte ratio; PLR = platelet-to-lymphocyte ratio; LMR =
lymphocyte-to-monocyte ratio; BMI = body mass index. aOR for multivariate analyses adjusted by limph node involvement and LMR.
Univariate analysis
Multivariate analysis Univariate analysis Multivariate analysis
HIGH CD4+ T
STROMAL
INTENSITY
HIGH CD4+ T
STROMAL
INTENSITY
HIGH CD8+ T
STROMAL
INTENSITY
HIGH CD8+ T
STROMAL
INTENSITY Variables Categories N OR 95%CI p-value OR 95%CI p-
value
N OR 95% CI p-
value
OR 95%
CI
p-value
BMI Normal/high 71 1 71 1
Low 20 0.581 0.158 2.130 0.412 20 0.814 0.231 2.886 0.748
NLR < 1.55 17 1 17 1
≥ 1.55 74 0.764 0.153 3.814 0.742 74 1.005 0.252 4.010 0.994
PLR < 135.5 29 1 29 1
≥135.5 62 0.942 0.265 3.356 0.927 62 0.667 0.195 2.279 0.518
LMR < 4.20 70 1 1 70 1
≥4.20 21 4.138 0.506 33.871 0.186a 3.78 0.456 31.319 0.218 21 2.375 0.494 11.419 0.280
Death No 56 1 56 1
Yes 35 1 0.299 3.343 1.000 35 0.563 0.190 1.669 0.300
Adjacent
Tissue
Invasion
Yes 59
1
59 1
No 32 0.583 0.178 1.913 0.374 32 1.787 0.525 6.081 0.353
107
Table S2 Stromal and intratumoral CD4+ and CD8+ T lymphocyte infiltration ratios according to socio-demographic and clinical characteristics of LSCC
patients (n=91).
Univariate analysis
Multivariate analysis
Univariate analysis
Multivariate analysis
HIGH STROMAL CD4+/CD8+ T
ratio
HIGH STROMAL CD4+/CD8+ T
ratio
HIGH INTRATUMORAL CD4+/CD8+ T
ratio
HIGH INTRATUMORAL
CD4/+CD8+ T ratio
Variables Categories N OR
95% CI
p-
value OR 95% CI
p-
value N OR 95% CI p-value OR 95% CI
p-
value
Age (years) < 60 47 1.00 47 1
>= 60 44 1.084 0.357 3.289 0.886 44 1.115 0.481 2.586 0.799
Sex Female 11 1.00 11 1
Male 80 0.47 0.056 0.076 0.49 80 1.167 0.316 4.313 0.817
Alcohol consumption No 21 1.00 21 1
Yes 47 1.67 0.346 8.038 0.525 47 0.515 0.182 1.462 0.213
Ex-alcoholist 23 1.59 0.443 5.682 0.478 23 0.485 0.144 1.630 0.242
Smoking No 8 1.00 8 1
Yes 58 1.00 - - 0.999 58 0.657 0.149 2.894 0.579
Ex-smoker 25 0.81 0.232 0.285 0.748 25 0.563 0.113 2.810 0.483
Differentiation degree Poorly differentiated 7 1.00 7 1
Moderately differentiated 71 0.744 0.744 6.71 0.792 71 0.77 0.160 3.714 0.745
Well differentiated 11 1.667 0.087 31.87 0.734 11 1.111 0.164 7.506 0.914
T stage TI/TII 16 1.00 16 1
TIII/TIV 75 1.21 0.30 4.91 0.788 75 1.111 0.365 3.38 0.853
Limph node
involvement Yes 23 1.00 23 1
No 68 1.61 0.487 5.331 0.435 68 0.805 0.309 2.099 0.657
BMI Normal/high 71 1.00 1 20 1
Low 20 4.67 0.575 37.89 0.149a 0.251 0.052 1.214 0.086 71 1.333 0.489 3.635 0.574
108
Table S2 (Continued)
Univariate analysis
Multivariate analysis
Univariate analysis
Multivariate analysis
HIGH STROMAL CD4+/CD8+ T
ratio
HIGH STROMAL CD4+/CD8+ T
ratio
HIGH INTRATUMORAL CD4+/CD8+ T
ratio
HIGH INTRATUMORAL
CD4/+CD8+ T ratio
Variables Categories N OR
95% CI
p-
value OR 95% CI
p-
value N OR 95% CI p-value OR 95% CI
p-
value
NLR < 1.55 17 1.00 17 1
≥ 1.55 74 0.626 0.127 3.075 0.564 74 0.921 0.315 2.691 0.88
PLR < 135.5 29 1.00 1 29 1
≥135.5 62 0.279 0.059 1.330 0.109a 5.299 0.643 43.68 0.121 62 1.106 0.447 2.735 0.828
LMR < 4.20 70 1.00 70 1
≥4.20 21 1.24 0.315 4.891 0.757 21 0.923 0.339 2.515 0.876
Adjacent
Tissue
Invasion
No
32 1.00 32 1
Yes 58 0.56 0.18 1.72 0.311 58 0.712 0.291 1.741 0.457
N= number of observations; OR= odds ratio; 95% CI = 95% Confidence Interval; NLR = neutrophil-to-lymphocyte ratio; PLR = platelet-to-lymphocyte ratio; LMR = lymphocyte-to-
monocyte ratio; BMI = body mass index. aOR for multivariate analyses adjusted by malnutrition and PLR .
109
7. CONCLUSÕES GERAIS
Os resultados do presente estudo demonstraram que na nossa coorte houve maior
frequência de pacientes do sexo masculino, com presença e/ou histórico de tabagismo e
etilismo. Embora presente, foi evidenciada baixa prevalência de magreza/baixo peso.
Os parâmetros hematológicos (linfócitos, neutrófilos, plaquetas e monócitos) e, os
níveis séricos de proteína C reativa não apresentaram diferença significativa entre os
pacientes com valores reduzidos ou normal/elevado de IMC que compuseram a amostra. No
entanto, os marcadores inflamatórios reconhecidamente utilizados como indicadores de
prognósticos, NLR e LMR, demonstraram-se como ferramentas úteis na predição do
prognóstico relacionado à sobrevida em pacientes com CEC de laringe, sendo o NLR
considerado como um fator prognóstico independente para sobrevida global. Além disto, a
associação do índice de massa corporal aos indicadores PLR e LMR foi capaz de alterar o
valor preditivo destes marcadores em relação à sobrevida global, sendo permitido identificar
pacientes em situação de risco.
A simples percepção desses fatores pode alertar os profissionais de saúde sobre a
importância da associação do estado nutricional aos marcadores inflamatórios na avaliação do
prognóstico de pacientes com CEC de laringe.
Com relação ao comportamento da infiltração linfocitária, os dados apresentados
evidenciaram que valores reduzidos de IMC alteraram, de forma significativa, a infiltração
intratumoral de linfócitos TCD4+, reduzindo a densidade da mesma.
Contudo, devido à escassez de trabalhos científicos na temática, mais estudos são
necessários com o objetivo de complementar os resultados encontrados, inclusive com a
utilização de outras ferramentas de diagnóstico do estado nutricional e, mediante a condução
de estudos prospectivos.
110
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AGUIAR, F.J.B.; FERREIRA-JÚNIOR, M.; SALES, M.M. et al. C-reactive protein: clinical
applications and proposals for a rational use. Rev Assoc Med Bras., v.59, n.1, p.85-92, 2013.
AGRAWAL, N.; HA, P.K. Management of early-stage laryngeal cancer. Otolaryngol Clin
North Am., v.41, n.4, p.757-769, 2008.
ALWARAWRAH, Y.; KIERNAN, K.; MACIVER, N.J. Changes in Nutritional Status Impact
Immune Cell Metabolism and Function. Front Immunol., v.9, n.1055, p.1-14, 2018.
BALERMPAS, P.; MICHEL, Y.; WAGENBLAST, J. et al. Tumour‐infiltrating lymphocytes
predict response to definitive chemoradiotherapy in head and neck cancer. Br J Cancer, n.110,
p.501– 509, 2014.
BERNARDI, D.; BARZAN, L.; FRANCHIN, G. et al. Treatment of head and neck cancer in
elderly patients: state of the art and guidelines. Crit Rev Oncol Hematol., v.53, n.1, p.71-80,
2005.
BOEHM, A.; WICHMANN, G.; MOZET, C. et al. Current therapy options in recurrent head and
neck cancer. HNO, v.58, n.8, p.762-769, 2010.
BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE. Secretaria de Atenção à Saúde. Instituto Nacional de
Câncer. TNM: classificação de tumores malignos. 6. ed. - Rio de Janeiro: INCA, 2004. 254p.
BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE. Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva
(INCA). Estimativa 2018: incidência de câncer no Brasil / Instituto Nacional de Câncer José
Alencar Gomes da Silva. Coordenação de Prevenção e Vigilância. – Rio de Janeiro: INCA, 2017.
128 p.
BRENNAN, P.; LEWIS, S.; HASHIBE, M. et al. Pooled analysis of alcohol dehydrogenase
genotypes and head and neck cancer: a Huge review. Am J Epidemiol., v.159, n.1, p.1-16, 2004.
BRUNETTO, M. A.; GOMES, M.O.S.; JEREMIAS, J.T. et al. Imunonutrição: o papel da dieta
no restabelecimento das defesas naturais. Acta Scientiae Veterinariae, v.35, p.230-232, 2007.
CABRERA, T.; SALINERO, J.; FERNÁNDES, M.A. High frequency of altered HLA calss I
phenotypes in laryngeal carcinomas. Hum Immunol., v.61, p.499-506, 2000.
CAMPOLI, M.; CHANG, C.; FERRONE, S. HLA class I antigen loss, tumor immune escape and
immune selection. Vaccine, v.20, n.4, p.A40-A45, 2002.
CARVALHO, T.M.R. Avaliação da composição corporal, citocinas inflamatórias e gasto
energético basal em pacientes com câncer de cabeça e pescoço antes e após o tratamento
padrão. Dissertação de Mestrado. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências
Médicas, 2012, 109p.
111
CHANG, P.H.; YEH, K.Y.; HUANG, J.S. et al. Pretreatment performance status and nutrition
are associated with early mortality of locally advanced head and neck cancer patients undergoing
concurrent chemoradiation. Eur Arch Otorhinolaryngol., v.270, n.6, p.1909-1915, 2013.
CHANMEE, T. P.; KONNO, K.; ITANO, N. Tumor-associated macrophages as major players in
the tumor microenvironment. Cancers (Basel), v.6, n.3, p.1670-1690, 2014.
CHEN, A.; ZHU, Z.; ZHANG, N. et al. Tumor-Infiltrating CD4+ Lymphocytes Predict
a Favorable Survival in Patients with Operable Esophageal Squamous Cell Carcinoma. Med Sci
Monit, v.23, p.4619-4632, 2017.
CHUANG, S.C.; JENAB, M.; HECK, J.E. et al. Diet and the risk of head and neck câncer: a
pooled analysis in the INHANCE consortium. Cancer Causes Control, v.23, n.1, p.69-88, 2012.
COFFELT, S.B.; WELLENSTEIN, M.D.; VISSER, K.E. Neutrophils in cancer: neutral no more.
Nature Reviews – Cancer, v.16, p.431-446, 2016.
COLOMBO, J.; RAHAL, P. Alterações genéticas no câncer de cabeça e pescoço. Revista
Brasileira de Cancerologia, v.55, n.2, p.165-174, 2009.
COOPER, J.S.; PAJAK, T.F.; FORASTIERE, A.A. et al. Postoperative concurrent radiotherapy
and chemotherapy for high-risk squamous-cell carcinoma of the head and neck. N Engl J Med.,
v.350, p.1937-1944, 2004.
CORRÊA, P. H.; SHIBUYA, E. Administração da Terapia Nutricional em Cuidados Paliativos.
Revista Brasileira de Cancerologia, v.53, n.3, p. 317-323, 2007.
CROSS, S.S. Observer accuracy in estimating proportions in images: implications for the
semiquantitative assessment of staining reactions and a proposal for a new system. J Clin
Pathol., v.54, p.385–390, 2001.
CRUVINEL, W.M.; JÚNIOR, D.M.; ARAÚJO, J.A.P. et al. Sistema Imunitário – Parte I.
Fundamentos da imunidade inata com ênfase nos mecanismos moleculares e celulares da resposta
inflamatória. Rev Bras Reumatol., v.50, n.4. p.434-461, 2010.
CURADO, M.P.; HASHIBE, M. Recent changes in the epidemiology of head and neck cancer.
Curr Opin Oncol, v.21, p.194-200, 2009.
CURIEL, T. J.; COUKOS, G.; ZOU, L. et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian
carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nature Medicine, v.10, p.
942-949, 2004.
CURRY, J.M.; SPRANDIO, J.; COGNETTI, D. et al. Tumor Microenvironment in Head and
Neck Squamous Cell Carcinoma. Seminars in Oncology, v.41, n.2, p.217-234, 2014.
112
DEDIVITIS, R. A.; FRANÇA, C. M.; MAFRA, A.C.B. et al. Características clínico-
epidemiológicas no carcinoma espinocelular de boca e orofaringe. Rev Bras Otorrinolaringol.,
v.70, n.1, p.35-40, 2004.
DE MELO NETO, L.R.B.; GONÇALVES, F.L.; GOMES, I.C. et al. Perfil dos pacientes com
câncer de cabeça e pescoço e avaliação da qualidade dos prontuários em um hospital público.
Rev Med Minas Gerais, v.28: e-1965, 2018.
DU, J.; LIU, J.; ZHANG, X. et al. Pre-treatment neutrophil-to-lymphocyte ratio predicts survival
in patients with laryngeal cancer. Oncoloy Letters, v. 15, p.1664-1672, 2018.
DURMUS, E.; KIVRAK, T.; GERIN, F. et al. Relações Neutrófilo-Linfócito e Plaqueta-
Linfócito como preditores de insuficiência cardíaca. Arq Bras Cardiol., v.105, n.6. p.606-613,
2015.
EDGE, S.B.; BYRD, D.R.; COMPTON, C.C. et al. AJCC cancer staging manual. 7a ed. New
York: Springer; 2010.
ENWONWU, C.O.; SANDERS, C. Nutrition: impact on oral and systemic health. Compend
Contin Educ Dent., v.22, n.3, 2001.
FANG, J.; LI, X.; MA, D. et al. Prognostic significance of tumor infiltrating
immune cells in oral squamous cell carcinoma. BMC Cancer, v.17, n.375, p.2-9, 2017.
FARIA, S. S. Relação neutrófilo/linfócito como ferramenta prognóstica em pacientes com
câncer de mama. Dissertação de mestrado. Universidade Federal de Uberlândia, 2016, 99f.
FARIAS, T.; DIAS, F.L.; FONSECA, T.C. et al. Analysis of clinical, histopathological and
molecular (P53, Ki-67, Bcl-2 and PCNA) factors predictive of the therapeutic response to
chemotherapy and radiotherapy in patients with laryngeal and oropharyngeal squamous cell
carcinoma. Rev. Bras. Cir. Cabeça Pescoço, v.36, n.3, p.131 -139, 2007.
FERRONE, S.; WHITESIDE, T. L. Tumor microenvironment and immune escape.
Surg Oncol Clin N Am, v. 16, n. 4, p. 755-774, 2007.
FLUXÁ, P.; ROJAS-SEPÚLVEDA, D.; GLEISNER, M.A. et al. High CD8+ and absence of
Foxp3+ T lymphocytes infiltration in gallbladder tumors correlate with prolonged patients
survival. BMC Cancer, v.18, n.243, p.2-11, 2018.
FREEDMAN, D.S.; FLANDERS, W.D.; BARBORIAK, J.J. et al. Cigarette smoking and
leukocyte subpopulations in men. Ann Epidemiol., v.6, n.4, p.299-306, 1996.
FREITAS, M. S.; COSTA, D. C. F.; CASANOVA, F. A. Principais mecanismos de
oncogênese. Em: ALVES, C. C. P.; DA POIAN, T. A.; ABRAHÃO, A. Bases moleculares em
clínica médica (Ed.). São Paulo: Editora Atheneu, 2010.
113
GALBIATTI, A.L.S.; PADOVANI-JUNIOR, J.A.; MANÍGLIA, J.V. et al. Câncer de cabeça e
pescoço: causas, prevenção e tratamento. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology, v.79, n.2,
2013.
GAMA, R.R.; MMATH, Y.S.; MMATH, Q.Z. et al. Body mass indez and prognosis in patients
with head and neck cancer. Head and Neck, v. 39, p. 1226-1233, 2017.
GAUDET, M.M.; OLSHAN, A.F.; CHUANG, S.C. et al. Body mass index and risk of head and
neck cancer in a pooled analysis of case-control studies in the International Head and Neck
Cancer Epidemiology (INHANCE) Consortium. Int J Epidemiol., v.39, p.1091-1102, 2010.
GOLDENBERG, D.; LEE, J.; KOCH, W.M. et al. Habitual risk factors for head and neck cancer.
Otolaryngol Head Neck Surg, v.131, p. 986-993, 2004.
HAMMERLID, E.; SILANDER, E.; HORNESTAM, L.Y. et al. Healthrelated quality of life
three years after diagnosis of head and neck cancer-a longitudinal study. Head& Neck, v.23,
p.113-125, 2001.
HANAHAN, D., WEINBERG, R.A. The Hallmarks of Cancer. Cell, v.100, p.57–70, 2000.
HENDRY, S.; SALGADO, R.; GEVAERT, T. et al. Assessing tumor infiltrating lymphocytes in
solid tumors: a practical review for pathologists and proposal for a standardized method from the
International Immuno-Oncology Biomarkers Working Group. Adv Anat Pathol., v.24, n.6,
p.311–335, 2017.
HOESLI, R.; BIRKELAND, A.C.; ROSKO, A. J. et al. Proportion of CD4 and CD8 tumor
infiltrating lymphocytes predicts survival in persistent/recurrent laryngeal squamous cell
carcinoma. Oral Oncology, v.77, p.83-89, 2018.
HOFFMANN, T.K.; DWORACKI, G.; MEIDENBAUER, N. et al. Spontaneous apoptosis of
circulating T lymphocytes in patients with head and neck cancer and its clinical importance. Clin
Cancer Res., v.8, p.2553-2562, 2002.
DEN HOLLANDER D, KAMPMAN E, VAN HERPEN CML. Pretreatment body mass index
and head and neck cancer outcome: a review of the literature. Critical Reviews in
Oncology/Hematology, v. 96, n.2, p.328-338, 2015.
HONDA, H.; QURESHI, A.R.; HEIMBÜRGER, O. et al. Serum Albumin, C-Reactive Protein,
Interleukin 6, and Fetuin A as Predictors of Malnutrition, Cardiovascular Disease, and Mortality
in Patients With ESRD. American Journal of Kidney Diseases, v.47, n.1, p. 139-148, 2006.
HOSMER JR, D.W.; LEMESHOW, S.; MAY, S. Applied Survival Analysis: Regression
Modeling of Time-to-Event Dat. 2nd ed. ISBN 978-0-471-75499-2, 2011.
HUANG, C.D. Econometric models of alcohol demand in the United Kingdom. Government
Economic Service Working Paper, v.140, p.1-52, 2003.
114
HSUEH, C.; TAO, L.; ZHANG, M. et al. The prognostic value of preoperative neutrophils,
platelets, lymphocytes, monocytes and calculated ratios in patients with laryngeal squamous cell
cancer. Oncotarget, v.8, n.36, p.60514-60527, 2017.
JAGADESHAM, V.P.; LAGARDE, S.M.; IMMANUEL, A. et al. Systemic inflammatory
markers and outcome in patients with locally advanced adenocarcinoma of the oesophagus and
gastro-oesophageal junction. Br J Surg., v.104, n.4, p.401-407, 2017.
JUIZ, C.C.P.; BORGES, E.M. estado nutricional em paciente com câncer de cabeça
e pescoço, em um hospital público de São José do Rio Preto – SP. Revista Científica, v.1, n.1,
p.1-8, 2019.
KFOURI, S.A.; NETO, J.E,; KOIFMAN, S. et al. Fração de câncer de cabeça e pescoço
atribuível ao tabaco e ao álcool em cidades de três regiões brasileiras. Rev Bras Epidemiol.,
v.21, p.1-12, 2018.
KANO, S.; HOMMA, A.; HATAKEYAMA, H. et al., Pretreatment lymphocyte-to-monocyte
ratio as an independent prognostic factor for head and neck cancer. Head and neck, v.39, n.2,
p.247-253, 2017.
KARPATHIOU, G.; CASTEILLO, F.; GIROULT, J. et al. Prognostic impact of immune
mocroenvironment in laryngeal and pharyngeal squamous cell carcinoma: Immune cell subtypes,
immune-suppressive pathways and clinicopathologic characteristics. Oncotarget, v.8, n.12,
p.19310-19322, 2017.
KHANDAVILLI, S.D.; CEALLAIGH, P.O.; LLOYD, C.J. et al. Serum C-reactive protein as a
prognostic indicator in patients with oral squamous cell carcinoma. Oral Oncol, v.45, p.912-914,
2009.
KIM, H.J.; CANTOR, H. CD4 T-cell subsets and tumor immunity: The helpful and the not-so-
helpful. Cancer Immunol Res., v.2, n.2, p.91-98, 2014.
KOH, Y.W.; CHOI, J.H.; AHN, M.S. et al. Baseline neutrophil-lymphocyte ratio is associated
with baseline and subsequent presence of brain metastases in advanced non-small-cell lung
cancer. Sci Rep., v.6, p. 38585, 2016.
KONG, L.; ZHANG, Y.W.; HU, C.S. et al. Neoadjuvant chemotherapy followed by concurrent
chemoradiation for locally advanced nasopharyngeal carcinoma. Chin J Cancer, v.29, n.5,
p.551-555, 2010.
KUM, R.O.; OZCAN, M.; BAKLACI, D. et al. Elevated Neutrophil-to-Lymphocyte Ratio in
Squamous Cell Carcinoma of Larynx Compared to Benign and Precancerous Laryngeal Lesions.
Asian Pac J Cancer Prev, v.15, n.17, p.7351-7355, 2014.
KUSS, I.; DONNENBERG, A.; GOODING, W. et al. Efector CD8+CD45RO-CD27-T cells have
signaling defects in patients with head and neck cancer. Br J Cancer, v.88, p.223-230, 2003.
115
KUSS, I.; HATHAWAY, B.; FERRIS, R.L. et al. Decreased absolute counts of T lymphocyte
subsets and their relation to disease in squamous cell carcinoma of the head and neck. Clin
Cancer Res., v.10, p.3755-3762, 2004.
LANG, K.; MENZIN, J.; EARLE, C.C. et al. The economic cost of squamous cell cancer of the
head and neck: findings from linked SEER-Medicare data. Arch Otolaryngol Head Neck Surg.,
v.130, n.11, p.1269-1275, 2004.
LEFFERS, N.; GOODEN, M.J.; DE JONG, R.A. et al. Prognostic significance of tumor-
infiltrating T-lymphocytes in primary and metastatic lesions of advanced stage ovarian cancer.
Cancer Immunol Immunother, n.58, p.449–459, 2009.
LI, Z. Q.; ZOU, L.; LIU, T. R. et al. Prognostic value of body mass index before treatment for
laryngeal squamous cell carcinoma. Cancer Biol Med. , v.12, n.4, p. 394–400, 2015.
LIU, S.A.; TSAI, W.C.; WONG, Y.K. et al. Nutritional factors and survival of patients with oral
cancer. Head Neck, v.28, p.998-1007, 2006.
MANZANO, A.C.; ALTEMANI, A.; MARTINS, A. S. et al. Caracterização imuno-histoquímica
do infiltrado linfocitário em biópsia de carcinoma espinocelular da língua e soalho oral e sua
implicação prognostica. Rev. Bras. Cir. Cabeça Pescoço, v.39, n. 4, p. 270-276, 2010.
MAO, Y.; FUN, Y.; GAO, Y. et al. Platelet-to-lymphocyte ratio predicts long-term survival
in laryngeal cancer. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology, v.275, p.553–559, 2018.
MAASLAND, D.H.E.; VAN DEN BRANDT, P.A.; KREMER, B. et al. Body mass index and
risk of subtypes of head-neck cancer: the Netherlands Cohort Study. Scientific Reports, v.5,
n.17744, p.1-11, 2015.
MEHROTA, R.S.M.; KUMAR, D.; PANDEY, A.N. et al. Age specific incidence rate and
pathological spectrum of oral cancer in Allahabad. Indian J Med Sci, v.57, n.9, p.4, 2003.
MELLMAN, I.; COUKOS, G.; DRANOFF, G. Cancer immunotherapy comes of age.
Nature, v.480, p.480–489, 2011.
MOON, H.; ROH, J.; LEE, S. et al. Prognostic value of nutritional and hematologic markers in
head and neck squamous cell carcinoma treated by chemoradiotherapy. Radiotherapy and
Oncology, v.118, p.330-334, 2016.
MOONA, H.; ROHA,J.; LEE S. et al. Prognostic value of nutritional and hematologic markers in
head and neck squamous cell carcinoma treated by chemoradiotherapy. Radiotherapy and
Oncology, v.118, n.2, p. 330–334, 2016.
NIAAA. National Institute of Alcohol Abuse and Alcoholism. NIAAA council approves
definition of binge drinking. Newsletter, v.3, n.3, 2004.
116
NGUYEN, T.V.; YUEH, B. Weight loss predicts mortality after recurrent oral cavity and
oropharyngeal carcinomas. Cancer, v.95, p.553-562, 2002.
ONG, H.S.; GOKAVARAPU, S.; WANG, L.Z. et al. Low Pretreatment Lymphocyte-Monocyte
Ratio and High Platelet-Lymphocyte Ratio Indicate Poor Cancer Outcome in Early Tongue
Cancer. J Oral Maxillofac Surg., v.75, n.8, p.1762-1774, 2017.
OPAS. Organización Panamericana de la Salud. División de Promoción y Protección de la Salud
(HPP). Encuesta Multicentrica salud beinestar y envejecimiento (SABE)
em América Latina el Caribe: Informe Preliminar [Internet]. In: XXXVI Reunión del Comité
asesor de investigaciones em Salud; 9-11 jun 2001; Kingston, Jamaica: OPAS, 2002. [acesso
em Junho de 2018].
ONUCHIC, A.C.; CHAMMAS, R. Câncer e o microambiente tumoral. Rev Med, v.89, n.1, p.21-
31, 2010.
PAGÈS, F.; BERGER, A.; CAMUS, M. et al. Effector Memory T Cells, Early Metastasis, and
Survival in Colorectal Cancer. N Engl J Med., v.353, p.2654-2666, 2005.
PAULA, J, M de; SAWADA, N, O. Qualidade de vida relacionada à saúde de pacientes com
câncer em tratamento radioterápico. Universidade de São Paulo. Ribeirão Preto. Revista Rene,
v.16, n.1, p.106-13, 2015.
PONTES, P.; BRASIL, O.O.; AMORIM, F.S. FILHO et al. Radiotherapy for early glottic cancer
and salvage surgery after recurrence. Braz J Otorhinolaryngol., v.77, n.3, p.299-302, 2011.
RACHIDI, S.; WALLACE, J.M.; DAY, D.A. et al. Neutrophil-to-lymphocyte ratio and overall
survival in all sites of head and neck squamous cell carcinoma. Head Neck., v.38, n.1, p.E1068-
1074, 2015.
RIGHINI, C.A.; TIMI, N.; JUNET, P.; et al. Assessment of nutritional status at the time of
diagnosis in patients treated for head and neck cancer. Eur Ann Otorhinolaryngol Head and
Neck Dis., v.130, n.1, p.8-14, 2013.
RUFFINI, E.; ASIOLI, S.; FILOSSO, P.L.; LYBERIS, P.; BRUNA, M.C. et al. Clinical
significance of tumor-infiltrating lymphocytes in lung neoplasms. Ann Thorac Surg, n.87,
p.365–371, 2009.
RUITER, E.J.; OOFT, M.L.; DEVRIESE, L.A. et al. The prognostic role of tumor infiltrating T-
lymphocytes in squamous cell carcinoma of the head and neck: A systematic review and meta-
analysis. OncoImmunology, v.6, n.11, 2017.
SAKAGUCHI, S.; YAMAGUCHI, T.; NOMURA, T. et al. Regulatory T cells and immune
tolerance. Cell, v.133, n.5, p.775-87, 2008.
117
SANTOS, R.A.; PORTUGAL, F.B.; FELIX, J. D. et al. Avaliação epidemiológica de pacientes
com câncer no trato aerodigestivo superior: relevância dos fatores de risco álcool e tabaco.
Revista Brasileira de Cancerologia, v.58, n.1, p.21-29, 2012.
SAROUL, N.; PASTOUREL, R.; MULLIEZ, A. et al. Which Assessment Method of
Malnutrition in Head and Neck Cancer? Otolaryngology–Head and Neck Surgery, v.158, n.6,
p.1065–1071, 2018.
SATO, Y.U.; GONDA, K.; HARADA, M. et al. Increased neutrophil-to-lymphocyte ratio is a
novel marker for nutrition, inflammation and chemotherapy outcome in patients with locally
advanced and metastatic esophageal squamous cell carcinoma. Biomedical Reports, v.7, p.79-
84, 2017.
SBOC. Sociedade Brasileira de Oncologia Clínica. Manual de Condutas. REVISTA DA
SOCIEDADE BRASILEIRA DE ONCOLOGIA CLINICA, 2011, 592p. ISSN 1806-6054.
SHAH, W.; YAN, X.; JING, L. et al. A reversed CD4/CD8 ratio of tumor-infiltrating
lymphocytes and a high percentage of CD41FOXP31 regulatory T cells are significantly
associated with clinical outcome in squamous cell carcinoma of the cervix. Cellular &
Molecular Immunology, v.8, p.59–66, 2011.
SHUBUTANI, M.; MAEDA, K.; NAGAHARA, H. et al. Prognostic significance of the
lymphocyte-to-monocyte ratio in patients with metastatic colorectal cancer. World J
Gastroenterol., v. 21, p. 9966-9973, 2015.
SILVA, H.P.; ZAMBERLAN, C.; BIRK, N. et al. Fatores que influenciam na alteração do estado
nutricional de pacientes oncológicos. Disciplinarum Scientia, v. 19, n. 2, p. 267-279, 2018.
SILVA, M.P.N. Síndrome anorexia-caquexia em portadores de câncer. Revista Brasileira de
Cancerologia, v.52, n.1, p.59-77, 2006.
STEFFENS, S.; AL GHAZAL, A.; STEINESTEL, J. et al. High CRP values predict poor
survival in patients with penile cancer. BMC Cancer, v.13, n.223, p.2-5, 2013.
SUZUKI, R.; LINA, S.H.; WE, X. et al. Prognostic significance of pretreatment total lymphocyte
count and neutrophil-to-lymphocyte ratio in extensive-stage small-cell lung cancer . Radiother
Oncol., v.126, n.3, p.499-505, 2018.
TAKARA, T.F.M.; MORIKAWA, W.; VIVACQUA, R.R et al. Avaliação nutricional em
pacientes com câncer de cabeça e pescoço. Rev. Bras. Cir. Cabeça Pescoço, v.41, n.2, p. 70-74,
2012.
TAKENAKA, Y.; TAKEMOTO, N.; NAKAHARA, S. et al. Prognostic significance of body
mass index before treatment for head and neck cancer. Head Neck, v.37, p.1518-1523, 2015.
TAN, C. S. Y.; READ, J.A.; PHAN, V.H. et al. The relationship between nutritional status,
inflammatory markers and survival in patients with advanced cancer: a prospective cohort study.
Supportive Care in Cancer, v.23, n.2,p. 385–391, 2015.
118
THAM, T.; OLSON, C.; KHAYMOVICH1, J. et al. The lymphocyte-to-monocyte ratio as a
prognostic indicator in head and neck cancer: a systematic review and meta-analysis. European
Archives of Oto-Rhino-Laryngology, v.275, p.1663–1670, 2018.
URAL, Ü.M.; ŞEHITOĞLU, İ.; TEKIN, Y.B. et al. Neutrophil-to-lymphocyte and
platelet-to-lymphocyte ratios in patients with endometrial hyperplasia and
endometrial cancer. J Obstet Gynaecol Res., v.41, n.3, p.445-448, 2015.
URIBE-QUEROL, E.; ROSALES, C. Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin.
Journal of Immunology Research, v.2015, p.1-21, 2015.
WANG, J.; WANG, S.; SONG, X. et al. The prognostic value of systemic and local inflammation
in patients with laryngeal squamous cell carcinoma. OncoTargets and Therapy, v.9, p.7177-
7185, 2016.
WEST, H.J.; JIN, J.O. Performance Status in Patients With Cancer. JAMA Oncol., v.1, n.7, p.
998, 2015.
WHITESIDE, T. L. Immune responses to malignancies. J Allergy Clin Immunol, v.125, n. 2
Suppl 2, p. S272-283, 2010.
WHITESIDE, T.L. Immunobiology of head and neck cancer. Cancer Metastasis Ver., v.24,
p.95-105, 2005.
WOLF, G.T.; CHEPEHA, D.B.; BELLILE, E. et al. Tumor infiltrating lymphocytes (TIL) and
prognosis in oral cavity squamous carcinoma: A preliminary study. Oral Oncology, v.51, n.1,
p.90-95, 2015.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Obesity. Preventing and Managing the Global
Epidemic. Report of a WHO Consultation on Obesity, Geneva: World Health Organization;
1997. p. 107-158.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. World cancer report. Geneva: WHO; 2008, 512p.
XIE, X.; LUO, K.J.; HU, Y. et al. Prognostic value of preoperative platelet-lymphocyte and
neutrophil-lymphocyte ratio in patients undergoing surgery for esophageal squamous cell cancer.
Dis Esophagus, v.29, n.1. p.79-85, 2014.
XU, X.; YU, H.; HU, W. et al. A Novel Inflammation-Based Prognostic Score, the C-Reactive
Protein/Albumin Ratio Predicts the Prognosis of Patients with Operable Esophageal Squamous
Cell Carcinoma. PLoS ONE, v.10, n.9, p.1-13, 2015.
XU, Q.; WANG, C.; YUAN, X. et al. Prognostic Value of tumor-infiltrating lymohocytes for
patients with head and neck squamous cell carcinoma. Translational Oncology, v.10, n.1, p.10-
16, 2017.
119
XUE, T.C.; JIA, Q.A.; GE, N.L. et al., Imbalance in systemic inflammation and immune
response following transarterial chemoembolization potentially increases metastatic risk in huge
hepatocellular carcinoma. Tumour Biol., v.36, n.11, p.8797-8803, 2015.
YUAN-CHANG, C.; YA-FEN, C. Serum C-reactive protein correlates with survival in colorectal
cancer patients but is not an independent prognostic indicator. European Journal of
Gastroenterology & Hepatology, v.15, n.4, p. 369-373, 2003.
YOUDEN, W.J. Index for rating diagnostic tests. Cancer, v,3, p.32–35, 1950.
YUKAKO, I.; NOBUKAZU, F.; MINORU, K. et al. Treatment results of stage I oral tongue
cancer with definitive radiotherapy. Oral Oncol., v.41, n.5, p.520-525, 2005.
ZANCOPE, E.; COSTA, N.L.; JUNQUEIRA-KIPNIS, A.P. et al. Differential infiltration of
CD8+ and NK cells in lip and oral cavity squamous cell carcinoma. J Oral Pathol Med, v. 39, n.
2, p. 162-7, 2010.
ZHOU, B.; ZHAN, C.; WU, J. et al. Prognostic significance of preoperative Neutrophil-to-
Lymphocyte ratio in surgically resectable pancreatic neuroendocrine tumors. Med Sci Monit.,
v.23, p. 5574-5588, 2017.
120
ANEXOS
121
ANEXO I
INSTITUTO DE NUTRIÇÃO JOSUÉ DE CASTRO – INJC/UFRJ
Pesquisa: Estado nutricional, parâmetros inflamatórios e, infiltração tumoral de linfócitos T
CD4+ e T CD8+ no prognóstico de pacientes com carcinoma espinocelular de laringe.
Formulário para coleta de dados
Código:|___|___|___| Sexo: ( 01 ) F ( 02 ) M
Data de nascimento: _____/_____/_____ Tels.: ______________________________
Nível de escolaridade: ( 03 ) Analfabeto ( 04 ) Fundamental incompleto
( 05) Fundamental completo ( 06 ) Médio incompleto
( 07 ) Médio completo ( 08 ) Superior incompleto
( 09 ) Superior completo ( 10 ) Pós-graduação incompleta
(11) Pós-graduação completa (12) Não declarada
( 140) Alfabetizado
Etilismo: ( 32 ) Não ( 33 ) Sim ( 34 ) Ex-etilista
Se sim, qual bebida: (35) cerveja (36) vinho (37) destilados (whisky, aguardente)
(38) Não declarada
Qual quantidade: (39) < 1 dose/dia (40) De 1 a 3 doses/dia (41) > 3 doses/dia ( 42)
Não declarada
Duração: (43) De 1 a 2 anos (44) De 2 a 3 anos (45) De 3 a 5 anos
(46) De 5 a 10 anos (47) De 10 a 20 anos (48) > 20 anos (49) Não declarada
Tabagismo: ( 50 ) Não ( 51 ) Sim
- Se sim, o que: (52) Cigarro (53) Charuto (54) Cachimbo (55) Não declarado
- Quantidade: (56) < 10 und/dia (57) 10-30und/dia (58) >30 und/dia (59) Não declarada
- Duração: (60) <10 anos (61) De 10-30 anos (62) > 30 anos (63) Não declarada
122
( 64) Ex-tabagista
Há quanto tempo parou: (65) 1 ano (66) 2-3 anos (67) 3-5 anos (68) >5 anos
(69) Não declarada
Data do diagnóstico (=data do histopatológico): _____/____/_____
Localização do CEC: (145) Supraglote (146) Glote (147) Subglote
(152) Transglote (148) Lesão invasiva da laringe não-especificada
Grau de diferenciação: (149) Pouco diferenciado (150) Moderadamente diferenciado (151) Bem
diferenciado (154) Não informado
Estadiamento: Estádio 0: ( 95 ) Tis N0 M0
Estádio I: ( 96 ) T1 N0 M0
Estádio II: ( 97 ) T2 N0 M0
(141) T2Nx
Estádio III: ( 98 )T1 N1 M0
( 99 )T2 N1 M0
( 100 )T3 N0 M0
( 101 )T3 N1 M0
Estádio Iva: ( 102 ) T1 N2 M0
( 103 ) T2 N2 M0
( 104 ) T3 N2 M0
( 105 )T4a N0 M0
( 106 )T4a N1 M0
( 107 )T4a N2 M0
Estádio Ivb: ( 108 ) T4b Qualquer N M0
( 109 ) Qualquer T N3 M0
Estádio Ivc: ( 110 ) Qualquer T Qualquer N M1
(153) TxNxMx
123
Invasão de Linfonodos? ( 113 ) Sim ( 114 ) Não
Capacidade funcional (PS): ( 115 ) 0 ( 116 ) 1 ( 117 ) 2 ( 118 ) 3 ( 119 ) 4
(142) Não informado
Data do início do tratamento: _____/____/_____
Tratamento: (22) RXT antes da cirurgia (23) QT antes da cirurgia
( 24 ) QT+RXT antes da cirurgia (25) Cirurgia (26) RXT pós-cirurgia
(27) QT pós-cirurgia (28) QT+RXT pós-cirurgia ( 29 ) RXT exclusiva
(30) QT exclusiva (31) RXT+QT exclusiva (sem cirurgia)
Data do término do tratamento: ____/ ______/ ______
Doença Residual: (70) NÃO (71) SIM Data: _____/______/_______
Recidiva Pós-tratamento: ( 72) NÃO ( 73 ) SIM
Se sim: ( 74) Recidiva locorregional (75) Recidiva metastática
Data recidiva: _____/____/____ Localização: ___________________
Segundo primário: (76) NÃO (77) SIM Data:___/___/__Localização: ___________
Óbito: ( 78 ) NÃO ( 79 ) SIM Data do óbito: _____/______/_______
( 143) Óbito não informado - Anotar data do último registro do paciente no prontuário:
____/_____/______
Controle (SED): (80) NÃO (81) SIM Data: _____/______/_______
Tratamento paliativo: (82) NÃO (83) SIM Data: _____/______/_______
Anatomia patológica:
Invasão tumoral de áreas adjacentes? (155) SIM (156) NÃO
124
Variáveis Ao diagnóstico
Idade (anos)
Data da avaliação nutricional
Peso atual (kg)
Altura (m)
IMC (kg/m2)
Diagnóstico Nutricional
Adultos: ( 84 ) Desnutrição severa
( 85 ) Desnutrição moderada
( 86 ) Desnutrição leve
( 87 ) Eutrófico
( 88 ) Sobrepeso
( 89 ) Obesidade leve
( 90 ) Obesidade moderada
( 91 ) Obesidade severa
Idosos: ( 92 ) Baixo Peso
( 93 ) Eutrófico
( 94 ) Sobrepeso
Linfócitos (/µL)
Valor: _____________ /µL
Neutrófilos (/µL)
Valor: _____________ /µL
Monócitos (/µL)
Valor: _____________ k/µL
Plaquetas (k/µL)
Valor: _____________ k/µL
PCR (mg/dL) Valor: _____________ mg/dL
125
ANEXO II
126
127
128
ANEXO III
Justificativa da Ausência do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)
Título do projeto Estado nutricional, parâmetros inflamatórios e infiltração tumoral de linfócitos
T CD4+ e T CD8+ no prognóstico de pacientes com carcinoma espinocelular de laringe.
Viemos, por meio deste documento, justificar por escrito a ausência do Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido do projeto intitulado “Estado nutricional, parâmetros
inflamatórios e infiltração tumoral de linfócitos T CD4+ e T CD8+ no prognóstico de pacientes
com carcinoma espinocelular de laringe”, proposto por Luana Dalbem Murad, para os
participantes falecidos e/ou sem possibilidades de contato (sem acompanhamento regular na
instituição, sem endereço residencial válido e/ou sem contato telefônico após pelo menos três
tentativas frustradas), com base na Res. CNS 466/12 item IV.8 que contempla a dispensa do
TCLE em situações de impossibilidade de obtenção do mesmo.
A dispensa do uso de TCLE se fundamenta por se tratar de um estudo retrospectivo onde
não há risco para o paciente e todas as informações serão coletadas por meio de consulta ao
prontuário físico e eletrônico disponíveis nas dependências da instituição proponente.
Ainda, a dispensa do uso de TCLE se fundamenta por ser um estudo observacional,
analítico ou descritivo retrospectivo que contempla o uso de materiais biológicos coletados e
armazenados como parte das rotinas institucionais, sem adição de riscos aos participantes de
pesquisas ou prejuízos ao bem-estar dos mesmos.
Todos os dados serão manuseados e analisados de forma confidencial, por meio de
codificação e anonimização, sem identificação e exposição dos participantes. Além disso, os
resultados decorrentes da coleta serão compilados e analisados de forma agregada, não sendo
possível o reconhecimento de características e identificações individuais.
O pesquisador principal e outros colaboradores do estudo se responsabilizam pela
discrição e privacidade dos dados coletados de todos os indivíduos participantes, e se
comprometem a utilizar os dados meramente para os fins propostos e a cumprir todas as diretrizes
e normas regulamentadoras descritas na Res. CNS Nº 466/12, e suas complementares, no que diz
respeito ao sigilo e a confidencialidade dos dados coletados.
129
__________________________________________
Luana Dalbem Murad
CRN 05100547
130
ANEXO IV
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Título do projeto: Estado nutricional, parâmetros inflamatórios e infiltração tumoral de
linfócitos T CD4+ e T CD8+ no prognóstico de pacientes com carcinoma espinocelular de laringe.
Você está sendo convidado (a) a participar de uma pesquisa porque foi atendido (a) ou
está sendo atendido (a) nesta instituição e teve diagnóstico ou suspeita de um tipo de câncer
chamado de carcinoma espinocelular de laringe. Para que você possa decidir se quer participar ou
não, precisa conhecer os benefícios, os riscos e as consequências pela sua participação.
Este documento é chamado de Termo de Consentimento Livre e Esclarecido e tem esse
nome porque você só deve aceitar participar desta pesquisa depois de ter lido e entendido este
documento. Leia as informações com atenção e converse com o pesquisador responsável e com a
equipe da pesquisa sobre quaisquer dúvidas que você tenha. Caso haja alguma palavra ou frase
que você não entenda, converse com a pessoa responsável por obter este consentimento, para
maiores esclarecimentos. Converse com os seus familiares, amigos e com a equipe médica antes
de tomar uma decisão. Se você tiver dúvidas depois de ler estas informações, entre em contato
com o pesquisador responsável.
Após receber todas as informações, e todas as dúvidas forem esclarecidas, você poderá
fornecer seu consentimento por escrito, caso queira participar.
PROPÓSITO DA PESQUISA
Avaliar se o estado nutricional e o estado inflamatório têm influência na progressão da doença, na
resposta ao tratamento e, na sobrevida de pacientes com câncer de laringe.
PROCEDIMENTOS DA PESQUISA
Para realizar o diagnóstico de câncer, um fragmento do tumor é retirado por cirurgia ou biópsia.
Este procedimento é necessário para um diagnóstico correto e para a escolha de um tratamento
adequado. Na ocasião desse procedimento, e só após a sua autorização, uma pequena amostra
excedente do seu tumor pode ter sido armazenado no Banco Nacional de Tumor (BNT) do INCA
131
para pesquisas futuras. Estes procedimentos não comprometeram o diagnóstico uma vez que
outra parte destes materiais foi encaminhada aos laboratórios que realizam os exames de rotina
para o diagnóstico de todos os pacientes matriculados nessa instituição.
Se você concordar, os pesquisadores responsáveis por esta pesquisa consultarão seus dados
clínicos e laboratoriais que se encontram no seu prontuário. Os pesquisadores poderão utilizar
também parte do material que foi armazenado no BNT do INCA assim como parte do material
restante armazenado nos laboratórios especializados que auxiliaram no diagnóstico da sua doença
(isto é, lâminas, blocos de parafina, material congelado, etc.).
Estes materiais serão utilizados para realizar exames laboratoriais complementares visando
avaliar se o estado nutricional e o estado inflamatório têm influência no status imunológico, na
progressão da doença, na resposta ao tratamento e, na sobrevida de pacientes com câncer de
laringe.
BENEFÍCIOS
Você não será remunerado por sua participação e esta pesquisa não poderá oferecer benefícios
diretos a você. Se você concordar com o uso de suas informações e/ou do material do modo
descrito acima, é necessário esclarecer que você não terá quaisquer benefícios ou direitos
financeiros sobre eventuais resultados decorrentes desta pesquisa.
O benefício principal da sua participação é possibilitar que no futuro, com os resultados
alcançados com esta pesquisa, o diagnóstico e o tratamento para esse tipo de câncer beneficiem
outros pacientes.
RISCOS
Não existem riscos físicos adicionais a você pela sua participação nesta pesquisa. É importante
que você entenda que nenhum procedimento médico adicional será realizado e nenhuma nova
amostra de sangue ou de tumor, será coletada. Apenas será analisada uma parte de seu tumor
armazenado que foi coletado no momento do diagnóstico, assim como os dados do seu
prontuário.
CUSTOS
132
Se você concordar com o uso da parte de seu tumor armazenado e/ou das informações do seu
prontuário como descrito acima, você não terá quaisquer custos ou despesas (gastos) pela sua
participação nessa pesquisa. Você não pagará por qualquer procedimento, medicação em estudo
ou teste exigido como parte desta pesquisa.
CONFIDENCIALIDADE
Se você optar por participar desta pesquisa, as informações sobre a sua saúde e seus dados
pessoais serão mantidas de maneira confidencial e sigilosa. Seus dados somente serão utilizados
depois de anonimizados (ou seja, sem sua identificação). Apenas os pesquisadores autorizados
terão acesso aos dados individuais, resultados de exames e testes bem como às informações do
seu registro médico. Mesmo que estes dados sejam utilizados para propósitos de divulgação e/ou
publicação científica, sua identidade permanecerá em segredo.
TRATAMENTO MÉDICO EM CASO DE DANOS
Seu tratamento e acompanhamento médico independem de sua participação nesta pesquisa.
BASES DA PARTICIPAÇÃO
A sua participação é voluntária e a recusa em autorizar a sua participação não acarretará
quaisquer penalidades ou perda de benefícios aos quais você tem direito, ou mudança no seu
tratamento e acompanhamento médico nesta instituição. Você poderá retirar seu consentimento a
qualquer momento sem qualquer prejuízo. Em caso de você decidir interromper sua participação
na pesquisa, a equipe de pesquisadores deve ser comunicada e o uso das amostras para os exames
relativos à pesquisa será imediatamente interrompida.
ACESSO AO RESULTADOS DE EXAMES
Você pode ter acesso a qualquer resultado relacionado à esta pesquisa. Estes resultados serão
enviados ao seu médico e ele os discutirá com você. Se você tiver interesse, você poderá receber
uma cópia dos mesmos.
GARANTIA DE ESCLARECIMENTOS
133
A pessoa responsável pela obtenção deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido lhe
explicou claramente o conteúdo destas informações e se colocou à disposição para responder às
suas perguntas sempre que tiver novas dúvidas. Você terá garantia de acesso, em qualquer etapa
da pesquisa, sobre qualquer esclarecimento de eventuais dúvidas e inclusive para tomar
conhecimento dos resultados desta pesquisa. Neste caso, por favor, ligue para Luana Dalbem
Murad, no telefone (021) 3207-1309, no horário de 08h às 18h. Esta pesquisa foi aprovada pelo
Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do INCA, que está formado por profissionais de diferentes
áreas, que revisam os projetos de pesquisa que envolvem seres humanos, para garantir os direitos,
a segurança e o bem-estar de todos as pessoas que se voluntariam à participar destes. Se tiver
perguntas sobre seus direitos como participante de pesquisa, você pode entrar em contato com o
CEP do INCA na Rua do Resende N°128, Sala 203, de segunda a sexta de 9:00 a 17:00 hs, nos
telefones (21) 3207-4550 ou 3207-4556, ou também pelo e-mail: [email protected]. Este termo
está sendo elaborado em duas vias, sendo que uma via ficará com você e outra será arquivada
com os pesquisadores responsáveis.
CONSENTIMENTO
Li as informações acima e entendi o propósito da solicitação de permissão para o uso das
informações contidas no meu registro médico e de parte de meu tumor e/ou meu sangue obtidos
durante o atendimento nesse hospital. Tive a oportunidade de fazer perguntas e todas foram
respondidas
Ficaram claros para mim quais são procedimentos a serem realizados, riscos e a garantia de
esclarecimentos permanentes.
Ficou claro também que a minha participação é isenta de despesas e que tenho garantia do acesso
aos dados e de esclarecer minhas dúvidas a qualquer tempo.
Entendo que meu nome não será publicado e toda tentativa será feita para assegurar o meu
anonimato.
Concordo voluntariamente em participar desta pesquisa e poderei retirar o meu consentimento a
qualquer momento, antes ou durante o mesmo, sem penalidade ou prejuízo ou perda de qualquer
benefício que eu possa ter adquirido.
Eu, por intermédio deste, dou livremente meu consentimento para participar nesta pesquisa.
134
/ /
Nome e Assinatura do participante Data
/ /
Nome e Assinatura do Responsável Legal/Testemunha Imparcial
(quando pertinente)
Data
Eu, abaixo assinado, expliquei completamente os detalhes relevantes desta pesquisa ao paciente
indicado acima e/ou pessoa autorizada para consentir pelo mesmo. Declaro que obtive de forma
apropriada e voluntária o Consentimento Livre e Esclarecido deste paciente para a participação
desta pesquisa.
/ /
Nome e Assinatura do Responsável pela obtenção do Termo Data