Profa. Dra. Ana Elizabete Silva

Departamento de Biologia

IBILCE-UNESP

Investigação de Marcadores Moleculares em Lesões Benignas e Neoplasias do

Trato Digestório

NEOPLASIAS TRATO DIGESTÓRIO

CÂNCER DE ESÔFAGO:3º tipo (mundo) 6º tipo Brasil (10.590 casos)~85% carcinomas

CÂNCER GÁSTRICO:2º tipo (mundo)3º tipo Brasil (23.200 casos)~95% adenocarcinomas

FATORES DERISCO

Ambiental e genéticos

ÁLCOOL E FUMO

Megaesôfago chagásicoEsôfago de BarrettLesões cáusticas

Agentes infecciosos(HPV)

História familial

AneuploidiasMutação genes supressores: TP53, P16, P17, FHIT Ativação de oncogenes: CCND1, HER-2/neu

CARCINOGÊNESE DO ESÔFAGO

Doença de Chagas - Fase crônica

Brasil: 50-60% chagásicos na fase crônica sem manifestações clínicas

2-4% fase crônica sintomática Intestino grosso

(megacólon)

Esôfago(megaesôfago)

Coração

80%

Complicação tardia mais séria do megaesôfago

5% dos pacientes com MC em idade mais jovem em relação àqueles sem a doença

Contato prolongado de agentes carcinógenos alimentares com a mucosa estase alimentar aumento do crescimento bacteriano e irritação química esofagite crônica

Megaesôfago chagásico

Carcinoma de células escamosas do esôfago

Risco de 3-8%

C ARCINOMA DE ESÔFAGO

FISH:

aneuploidias 7, 11, 17

deleção TP53 amplificação CCND1

Megaesôfago chagásico (MC)

Chagásicos crônicos: com e sem megaesôfago

Esofagites crônicas

Molecular:

Mutações TP53, MTS-1 e FHIT (PCR-SSCP, sequenciamento)

T. cruzi: polimorfismos do kDNA (sangue e mucosa)

CGH

Imuno:

Expressão proteínas: p53, p16 e fhit

Apoptose: caspase-3 ativada

Proliferação celular: antígeno Ki-67

MC: 60% aneuploidias

(-7,+7, -17, +17)

54,5% deleção TP53CE: 100% tri e tetrassomias 100% deleção TP53 70% CCND1

CARCINOGÊNESE GÁSTRICA

•Incidência elevada: Japão, China, Costa Rica, Chile e Portugal

•Brasil: Estimativas para 2006 (INCA)

•23.200 casos novos

•Homens: 2x mais afetados

CÂNCER GÁSTRICO

TIPOS HISTOLÓGICOS DO ADENOCARCINOMA GÁSTRICO

• ADENOCARCINOMA TIPO INTESTINAL OU BEM DIFERENCIADO:

• Presença de lesões pré-neoplásicas• Predominante em homens e idosos

• ADENOCARCINOMA TIPO DIFUSO OU POUCO DIFERENCIADO:

• Prognóstico pior• Não associado a lesões pré-cancerosas• Mais frequente em mulheres e jovens

Lesões do DNALesões do DNA

Lesões pré-Lesões pré-cancerosascancerosas

Predisposição Predisposição GenéticaGenética

ÁlcoolÁlcool

TabacoTabaco

Gastrectomia Gastrectomia AnteriorAnterior

Helicobacter Helicobacter pyloripylori

Alimentos salgados , Alimentos salgados , enlatados e defumadosenlatados e defumados

CARCINOGÊNESE GÁSTRICA

Colonização da mucosa gástrica pela Colonização da mucosa gástrica pela Helicobacter pyloriHelicobacter pylori (modificado Yoshiyama e Nakazawa, 2000) (modificado Yoshiyama e Nakazawa, 2000)

Lúmen

Camada de muco

H. pylori

aminoácidos

bicarbonato

uréia

pH 1 - 2

urease

2NH3 + CO2

pH 7

uréia

fígadosangue

• Prevalência da Hp: 40 a 50% na população

9 vezes risco de câncer gástrico

• Geração de radicais livres (espécies de oxigênio e nitrogênio reativos) → danos no DNA

• Alterações na secreção de fatores de crescimento e citocinas

• Desregulação do ciclo celular do epitélio gástrico → proliferação celular ↑ x apoptose ↑

Apoptose reguladaApoptose regulada

Proliferação Proliferação reguladaregulada

Homeostase Homeostase (renovação celular (renovação celular

normal)normal)

Homeostase Homeostase (( da proliferação da proliferação

celular)celular)

DesequilíbrioDesequilíbrio(perda de células)(perda de células)

Proliferação Proliferação

Proliferação Proliferação

Apoptose Apoptose Apoptose Apoptose

Gastrite Gastrite H.pyloriH.pylori

InflamaçãoInflamaçãoTNF TNF CD95CD95NONO

++

InflamaçãoInflamaçãoTNF TNF CD95CD95NONO

++

EstômagoEstômagoNormalNormal

ÚlceraÚlceraGastrite atróficaGastrite atrófica

HOMEOSTASE E DESEQUILÍBRIO DA MUCOSA GÁSTRICA HOMEOSTASE E DESEQUILÍBRIO DA MUCOSA GÁSTRICA (modificado Wagner (modificado Wagner et al.et al., 1997), 1997)

CARCINOGÊNESE DO ESTÔMAGO

• Alterações genéticas e epigenéticas• Oncogenes• Genes supressores de tumor• Reguladores do ciclo celular• Moléculas de adesão celular (caderinas)• Genes de reparo do DNA• Instabilidade genética• Ativação de telomerases

PERDAS E GANHOS CROMOSSÔMICOSCromossomos Regiões Cromossômicas Genes

1 1p (1p36) ; 1q22-q31 p732 2pter-p23; 2q; 2q3 3p14; 3q (3q12-qter) FHIT4 4q325 5q21 APC7 7pq; 7q22; 7q31 ERBB; EGFR, HGF;

c-MET8 8pq; 8q (8q23-24) c-MYC9 9p (9p21) CDKN2A (p21)12 12q (12q24) EPS8; DOC-113 13q (13q21-22) receptor de serotonina14 14q (14q24)15 15q (15q11-q15)16 16pq, 16q22 E-Caderina17 17p (17p13); 17q; 17q (17q12-q21) TP53, c-ERBB2, gastrina18 18q21; 18q DCC19 19p(19p13); 19q(19q13)20 20pq; 20q11-q1222 22q

CARCINOGÊNESE DO ESTÔMAGO (modificado Tahara, 2004)

MUCOSANORMAL

METAPLASIAINTESTINAL ADENOMA

CÂNCERINICIAL

DIFERENCIADO

CÂNCERAVANÇADO

INVASÃOMETÁSTASES

D1S191

HIPERMETLAÇÃOTP53

APC

TP53

p27

C-ERBB2

C-MET

CICLINA E

H. pylori

MUCOSANORMAL

CÂNCER INICIAL

DIFERENCIADO

CÂNCERAVANÇADO

INVASÃOMETÁSTASES

TELÔMEROS

INSTABILIDADE

GENÉTICA

TELOMERASE

hTERT

CD44 ALTERADO

CICLINA E

LOH 7q

p27

CD44 ALTERADO

LOH 1p36 (p73)

LOH 17q21MUTAÇÃO/LOH

TP53

MUTAÇÃO/PERDA

E CADERINAAMPLIFICAÇÃO

K-SAM

c-MET

DIFUSO

INTESTINAL

Comparar os resultados obtidos em lesões benignas com aqueles Comparar os resultados obtidos em lesões benignas com aqueles de adenocarcinomas gástricos de adenocarcinomas gástricos ressaltar alterações genéticas ressaltar alterações genéticas que possam estar relacionadas com a progressão das lesões que possam estar relacionadas com a progressão das lesões benignas, e maior risco de malignização benignas, e maior risco de malignização utilizadas no utilizadas no diagnóstico precoce e prognósticodiagnóstico precoce e prognóstico

Escasses de estudos genéticos em lesões gástricas precursoras com potencial pré-neoplásico indicar marcadores

cromossômicos associados com a carcinogênese gástrica

FISHFISH

-aneuploidias (3, 7, 8, 9 e 17) -aneuploidias (3, 7, 8, 9 e 17) -deleções no gene -deleções no gene TP53TP53, ,

-amplificação CCND1 e -amplificação CCND1 e

Her-2/neu (c-erbb-2)Her-2/neu (c-erbb-2)

lesões gástricas benignas e lesões gástricas benignas e adenocarcinoma gástricoadenocarcinoma gástrico

IMUNO-HISTOQUÍMICA

expressão das proteínas: expressão das proteínas:

-p53-p53

-ciclina D1 e p185 -ciclina D1 e p185 (Her-2/neu)(Her-2/neu)

MOLECULARAvaliação da Avaliação da H. pyloriH. pylori

Polimorfismos: Polimorfismos: CYP, CYP, GSTGST, , XRCC1, XRCC3,XRCC1, XRCC3, COX2, NOS2COX2, NOS2

Expressão gênica: Expressão gênica: PCR Real TimePCR Real Time

RaSH (hibridação RaSH (hibridação subtrativa rápida)subtrativa rápida)

MetilaçãoMetilação

MATERIALMATERIAL

Controle: 10 biópsias mucosas gástricas Controle: 10 biópsias mucosas gástricas histologicamente normais e histologicamente normais e H. pylori negativasH. pylori negativas

Lesões gástricas: 113 (biópsias/frag. cirúrgico)Lesões gástricas: 113 (biópsias/frag. cirúrgico)

• 38 gastrites crônicas38 gastrites crônicas

• 13 gastrites atróficas crônicas13 gastrites atróficas crônicas

• 21 úlceras gástricas21 úlceras gástricas

• 21 metaplasias intestinais21 metaplasias intestinais

• 20 adenocarcinomas gástricos20 adenocarcinomas gástricos

•Gastrite crônica e gastrite atrófica associada com H. pylori precede a formação do câncer gástrico

•Úlcera péptica maior risco de câncer gástrico

•Objetivos: avaliar a ocorrência de aneuploidias (3, 7, 8, 9 e 17); deleção e expressão do gene TP53.

Amostras: 38 gastrite crônica

13 gastrite atrófica

21 úlcera gástrica

Aneuploidias: frequência crescente de GC (21%) para GAC (31%) e para UG (62%)Gastrite crônica: 8/38 casos -7, +7 75% Hp+Gastrite atrófica crônica: 4/13 casos +7, +8 100% Hp+

Deleção TP53: não observada

Expressão aumentada da p53: Gastrite crônica: 5/11 (45%)

Úlcera gástrica: 13/21 casos (62%) +7,+8; +17 69% Hp+

Expressão aumentada da p53: 2/17 (12%)

GC: +7 GC: -7

UG: +8

↑p53 em GC e UG: super expressão da proteína selvagem → resposta fisiológica ao processo inflamatório do epitélio gástrico (H. pylori)

Metaplasia intestinal: (substituição do epitélio gástrico por células colunares intestinal)

•Alguns estudos: mutação do TP53 e superexpressão da proteína p53 em metaplasia adjacente ao tumor.

•Objetivo:

•Investigar ocorrência de aneuploidias (3, 7, 8, 9 e 17), deleção e expressão do gene TP53, em metaplasia intestinal de pacientes sem câncer gástrico.

•71% (15/21) casos MI: aneuploidias +7, +8, +9

•Associação: aneuploidias x H. pylori

•60% (3/5) casos: deleção TP53

•12% (2/17) casos: expressão p53

•100% casos: aneuploidias (tri/tetra)

•30% (6/20 ): trissomias múltiplas

•3/3 casos: deleção TP53

•80% (12/15): expressão p53

Metaplasia: +7

Adenocarcinoma +9; +17

Mucosa normal:

TP53 (vermelho)

17 (verde)

adenocarcinoma

Deleção TP53

1 sinal vermelho

0

20

40

60

80

100

GC GAC UG MI CG

3

7

8

9

17

0

20

40

60

80

100

GC GAC UG MI CG

3

7

8

9

17

AUMENTO PROGRESSIVO NA FREQÜÊNCIA E AUMENTO PROGRESSIVO NA FREQÜÊNCIA E COMPLEXIDADE DE CASOS COM ANEUPLOIDIASCOMPLEXIDADE DE CASOS COM ANEUPLOIDIAS

monossomias trissomias

IMUNO-HISTOQUÍMICA – p53

Mucosa normal

p53-

Metaplasia

p53+ (fraca)

Adenocarcinoma

p53+ (forte)

•Cromossomos 7, 8, 9 e 17 carregam genes importantes que atuam no controle da proliferação celular

•7q31: MET

•8q24: MYC

•9p21: CDKN2A

•17p13: TP53

•17q21: ERBB-2 (HER-2/NEU)

•Primeira evidência de alterações numéricas em MI de pacientes sem câncer gástrico alterações presentes em frequências adenocarcinoma conecção cronológica entre essas lesões expansão monoclonal

•Ocorrência de instabilidade cromossômica em lesões benignas (GC e UG) que podem ter função importante na carcinogênese do estômago

Dosagem anormal e expressão gênica vantagem proliferativa

APOPTOSIS IN DIFFERENT GASTRIC LESIONS AND ASSOCIATION WITH H. pylori AND

EXPRESSIONS OF p53

• Apoptose: homeostase do tecido equilíbrio entre proliferação e morte celular programada

• Desequilibrio: taxa proliferativa excessiva potencializa o efeito de carcinógenos risco de câncer

• Associação: H. pylori x Apoptose lesões gástricas ???

• H. pylori: risco de 2,7 a 12 vezes de câncer gástrico

OBJETIVO: avaliar os IA em diferentes lesões gástricas e

comparar com adenocarcinoma gástrico técnicas que detectam apoptose em fases diferentes:

•Caspase-3 ativada (CPP32) mais precoce

•TUNEL fragmentação do DNA

•Associar com H. pylori, aneuploidias e expressão da p53

•AM0STRAS: 8 mucosa normal Hp-

34 gastrite crônica

11 gastrite atrófica

17 úlcera gástrica

12 adenocarcinomas

Índice Apoptótico (IA)

Técnica

Amostra

s

N x DP Mínimo Mediana Máximo

Casos

TUNEL TUNEL positivos

MN 08 1,820,47 0,0 2,0 3,6 0/8

GC 34 2,600,32 0,0 2,3 7,4 3/34 (26,5%)

GAC 11 3,930,63* 0,0 4,4 7,0 6/11 (54,5%)

UG 17 2,030,39 0,0 2,0 7,0 2/17 (11,8%)

MI 15 2,360,41 0,0 2,4 5,2 2/15 (13,3%)

AG 12 1,970,42 0,4 1,6 6,0 1/12 (8,3%)

CPP32 CPP32 positivos

MN 08 3,201,31 0,0 2,7 11,0 0/8

GC 34 13,822,58

*

0,0 8,4 52,0 15/34 (44,1%)

GAC 11 6,201,57 0,0 5,0 13,4 3/11 (27,3%)

UG 17 9,472,92 0,0 3,4 34,8 4/17 (23,5%)

MI 15 6,721,47 0,8 6,8 24,4 1/15 (6,7%)

AG 12 8,072,75 0,0 4,7 30,8 4/12 (33,3%)

IA aumentados:

TUNEL: GAC

CPP32: GC

Adenocarcinomas: IA baixos, sem diferença entre intestinal e difuso

A B

C D

E F

G H

G-H: adenocarcinoma gástrico

TUNEL CPP32

A-B:gastrite crônica

C-D: úlcera gástrica

E-F: metaplasia

intestinal

CONCLUSÕES• Não houve associação entre apoptose aumentada e

infecção pela H. pylori, aneuploidias e super expressão da proteína p53

• não houve correlação entre os IA encontrados por ambas as técnicas,

• aumento de apoptose em GC e GAC, não relacionado com infecção pela H. pylori reforçando a participação de lesões gástricas com potencial pré-canceroso na tumorigênese do estômago enfatiza a importância do emprego de métodos diferentes para detecção de apoptose.

aumento do número de cópias: dezenas a aumento do número de cópias: dezenas a centenas de vezes (erros de replicação)centenas de vezes (erros de replicação)

Aumento da expressão gênicaAumento da expressão gênica→proteína→proteína

Double minutes (DM)

Regiões homogeneamente coradas (HSR)

Carcinogênese: Genes Amplificados

-CCND1

-c-MET

-c-MYC

-c-ERBB-2 (HER-2/NEU)

Avaliar a relação entre amplificação e polissomia de CCND1 e Her-2/neu com expressão aumentada das proteínas e aspectos clinicopatológicos→prognóstico

-40 carcinoma esôfago

-12 mucosa normal

-40 adenocarcinoma gástrico

-14 mucosa normal

FISHCyclin D1 (vermelho)

Her-2 (vermelho)

Centrômeros (verde)

IMUNO

Anticorpos:

ciclina D1(nuclear)

Her-2 (membrana)

AMPLIFICAÇÃO:

CCND1: carcinoma esôfago 45% (18/40)

câncer gástrico 10% (4/40)

HER-2/NEU: carcinoma esôfago 7,5% (3/40) câncer gástrico 5% (2/40)

IMUNO:Cyclin D1+: câncer esôfago 37,5% (15/40) câncer gástrico 35% (14/40)

Her-2/neu+: câncer esôfago 12,5% (5/40) câncer gástrico 7,5% (3/40)

FISH:

(A-B) Amplificação CCND1( vermelho) – câncer de esôfago e gástrico

(E-F) Polissomia 11 (verde) gene CCND1 (vermelho)

FISH:

(C-D) Amplificação Her-2 ( vermelho) – câncer de esôfago e gástrico

(E-F) Polissomia 17 (verde) gene Her-2 (vermelho)

IMUNO: (A-B) proteína Cyclin D1+ câncer esôfago e gástrico

(C-D) proteína Her-2+ câncer esôfago e gástrico

CONCLUSÕES:

-CCND1: mais frequentemente amplificado e proteína super-expressada (ambas

neoplasias) → função na progressão de infiltração e metástases → marcador

molecular → prognóstico pior e comportamento mais agressivo → invasão, metástases, recorrência e sobrevida reduzida,

-Baixa associação entre amplificação x super-expressão → outras vias de expressão

alteração na síntese ou estabilidade da proteína

alterações na regulação de transcrição gênica

EQUIPEEQUIPE• COORDENADORA:COORDENADORA:• Profa. Dra Ana Elizabete Silva – UNESP• COLABORADORES:COLABORADORES:• Profa. Dra. Marileila Varella-Garcia – Cancer Center-USA • Prof. Dr. Aldenis Albaneze Borim – FAMERP• Profa. Dra. Patrícia Maluf Cury – FAMERP• Dr. Alaor Caetano – FAMERP• Profa. Dra. Kátia Ramos Lopes – Hospital Sírio Libânes - SP

• PÓS-GRADUANDOS:PÓS-GRADUANDOS:• Ana Cristina Gobbo César• Lucimari Bizari • Fernanda da Silva Manoel Caetano• Marilanda Ferreira Bellini• Márcia Cristina Duarte• Juliana Garcia de Oliveira• Aline Cristina Targa• Aparecida Perpétuo Fedossi• Héctor Matiolli• INICIAÇÃO CIENTÍFICA:• Isabella Katz Migliori• Yvana Cristina Jorge

• Auxílio e Bolsa: FAPESP, CAPES e CNPqAuxílio e Bolsa: FAPESP, CAPES e CNPq