profa. dra. ana elizabete silva departamento de biologia ibilce-unesp avanÇos da citogenÉtica...

Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia

IBILCE-UNESP

AVANÇOS DA CITOGENÉTICA MOLECULAR NO

DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS

Décadas 70-80: estudo citogenético identificação de cromossomos e regiões cromossômicas diferentes

alterações

•Perda: deleção monossomia

•Ganho: duplicação,

amplificação trissomia, poliploidia•Relocação:

translocação inversãoinserção

CULTURA CELULAR E BANDA G

500 bandas

Resolução:

~6milhões pb

~50genes/banda

>4 Mb

CITOGENÉTICA MOLECULAR

Pinkel et al. (1986): Aplicações de técnicas de biologia molecular em preparações citogenéticas: sondas marcadas com fluorocromosIdentificação de rearranjos cromossômicos de novo e cromossomos marcadoresDetecção de alterações cromossômicas em núcleos interfásicosEstudo da estrutura e função de regiões cromossômicas específicas

TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA MOLECULAR

FISH: Hibridação in situ fluorescente (aneuploidias, rearranjos, amplificação)SKY: Cariotipagem espectral (alterações estruturais - translocações)M-BAND: Bandamento colorido (inversão, deleção/duplicação) CGH: Hibridação Genômica Comparativa (perdas ou ganhos cromossômicos)Array-CGH: maior resolução (desbalanços genômicos)

HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE

FISH

http://www.hmds.org.uk/presentations/pdf/if_tutorial.pdf


HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE

FISH: técnica de mapeamento físico de DNA em que uma sonda de DNA marcada com fluorocromo é hibridizada ao cromossomo ou núcleo interfásico e visualizado em microscópio de fluorescência

Resolução: ~0,3 Kb (300 pb)



FISH - Fluorescent “in situ” hybridization

FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”

Blue Acqua Green Yellow Orange Red

Cláudio C. SilvaUCG/LaGene

DNA Alvo: cromossomo ou região cromossômica

Sonda: segmento de DNA específico

http://www.fisiologia.kit.net/main/anime.htm - ANIMAÇÃO

http://www.fisiologia.kit.net/main/anime.htm

http://www.fisiologia.kit.net/main/anime.htm

ETAPASPreparação da lâmina (DNA alvo)

Denaturação: DNA alvo e sonda formamida a 70oC ou estufa temperatura de ~80oC

Pré-tratamento:Ácido acéticoRNase e pepsinaDesidratação Etanol

Hibridização sonda/DNA (estufa a 37oC – câmara úmida - overnight)

Lavagem pós-hibridização: tampão 2xSSC (citrato de sódio)

Detecção da sonda e contracoloração: iodeto de propídeo (PI) ou DAPI

Fluorocromos: SondasFITC-fluoresceína (verde)Espectrum green ( verde)Rodamina (vermelho)Texas red (vermelho)

• Método para obtenção de núcleosinterfásicos a partir de tecido fresco

Desagregação dosnúcleos

Fixação dos núcleos

ETAPAS

Material:

-núcleos interfásicos: tecido fresco, congelado, cortes histológicos, esfregaços

-cromossomos metafásicos: cultura celular

4. Hibridação in situ Fluorescente - FISH

Pré-tratamento Aplicação da sonda(Ácido acético, RNase, pepsina)

ETAPAS

Co-denaturação Lavagem pós-hibridação

Contra-coloração Análise ao microscópio

Hibridização

(câmera úmida à 37oc)

ETAPAS

Tempo de vida limitado das lâminas:perda da fluorescência

TIPOS DE SONDASSondas que hibridizam estruturas cromossômicas específicas:-sonda alfa-satélite (centromérica)-sonda beta-satélite (satélite dos acrocêntricos D e G)-sonda satélite clássica (heterocromatina 1, 9, 16 e Y)-sonda telomérica (telômeros)Sondas de cópia única ou locus específicaSondas de cromossomo inteiro – Whole-chromosome painting

TIPOS DE SONDAS

SONDAS CENTROMÉRICAS

Enumeração dos cromossomos e aneuploidias

APLICAÇÃO:

aneuploidias em núcleos interfásicos

Carcinoma de esôfago: tetrassomia 11 (verde)

gastrite:+7 gastrite: -7

úlcera: +8

SONDAS CENTROMÉRICAS

SONDAS LOCUS ESPECÍFICA

del (21q11.2)

Diagnóstico de doenças com microdeleção

Deficiência da esterase sulfatase (Xp22.3)


Mucosa normal:

TP53 (vermelho)

17 (verde)

Adenocarcinoma gástrico:

Deleção TP53

1 sinal vermelho

Deleção do gene TP53 em câncer gástrico


SONDAS WCP – Cromossomo Total

Detecção de Translocação recíproca balanceada


A- Criança com anomalias congênitas: sonda do cromossomo 4 (material extra, braço curto de um dos cromossomos 4 (seta), B- Metáfase da mesma criança: sonda do cromossomo 9. Dois cromossomos 9 normais; a parte extra do cromossomo 4 identificada como tendo origem no cromossomo 9 (seta).


SONDAS TELOMÉRICAS

SONDAS TELOMÉRICAS

Aplicação:

-Deleções terminais

-perdas teloméricas

SONDAS TELOMÉRICAS

(cromossomo 5)

APLICAÇÕES DA TÉCNICA FISH

Mapeamento de genes e sequências gênicas

Estrutura e organização dos cromossomos

Identificação de rearranjos cromossômicos/ pequenas deleções

Monitoramento de indivíduos/populações expostas à mutagênicos

Identificação de alterações cromossômicas em esperma

Diagnóstico Pré-Natal e Pré-Implantação

Diagnóstico de neoplasias

Monitoramento de pacientes leucêmicos/transplante de medula óssea (doador de sexo oposto)

DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL E PRÉ-IMPLANTAÇÃO

APLICAÇÕES DA TÉCNICA FISH

DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH

Trissomias 13, 18 e 21 e monossomia X: aneuploidias mais comuns relacionadas com idade materna avançada e malformações fetais Citogenética convencional: diagnóstico em 8-15 diasFISH: resultado rápido (2-3 dias) em células do líquido amniótico não cultivadas

Trissomia do 21 Triplo XNormal


DIAGNÓSTICO GENÉTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃO

3 sinais vermelho: blastômero com trissomia do 21

DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS

AMPLIFICAÇÃO GÊNICA

CCND1, c-MYC, HER2/Neu

TRANSLOCAÇÕES

t(9,22); t(8;14)

DELEÇÕES

TP53 (17p13), RB (13q13)

DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIASAmplificação Gênica

(C-D) Amplificação Her-2 ( vermelho) – câncer de esôfago e gástrico

(E-F) Polissomia 17 (verde) gene Her-2 (vermelho)

DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIASAmplificação Gênica

DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS TRANSLOCAÇÃO

CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY

CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKYSchrock et al., Science 273:494-497, 1996

Identificação precisa e simultânea de todos os cromossomos humanos: diferentes cores

Princípio: medição simultânea de todos os pontos do espectro emitidos pela amostra na faixa espectral visível e próxima a infra-vermelha: uso de múltiplas sondas sobrepondo-se espectralmente

Sondas: com 5 diferentes fluorocromos : Cy2, Spectrum green, Cy3, Texas red e Cy5 e suas combinações

Sondas dos 24 cromossomos humanos marcadas com 5 fluorocromos em combinação resultando em uma cor diferente para cada cromossomo.


Cor capturadaClassificação das cores pseudo-coloridas



Cariótipo normal

Cromossomos marcadores

Inverted-DAPI (A) and SKY classified (B) karyotypes of the previous lung SCC cell.

-6-8

-6-8

A

B

t(1;16)

t(5;9;13)

t(6;8;15)

t(6;7)

t(6;15)

t(11;19)


Limitação:

-Cultivo celular – metáfases

-Não detecta deleções/duplicações e inversão

Evolução cariotípica: células de gibão hibridizadas com sondas humanas várias homologias cromossômicas


BANDAMENTO COLORIDOCROSS-SPECIES COLOR

BANDING

Permite a coloração sub-regional dos cromossomos para análise do cariótipo humanoSondas: derivadas de primatas (gibões) do genêro Hylobates concolor e Hylobates syndactilus: cariótipos com extensa reorganização cromossômica quando comparado ao homemIdentificação de rearranjos cromossômicos: inversões, deleções, duplicações, inserções, translocações

BANDAMENTO COLORIDO

mBAND do cromossomo 5:

25 bandas coloridas: corresponde a uma resolução de 550 bandas (complemento haplóide)

BANDAMENTO COLORIDO

Cromossomo 5 humano mostrando a imagem direta (a) e a imagem re-processada (b), ambas esteroscópicas. Qualquer alteração pode ser detectada por este sistema.

BANDAMENTO COLORIDO

HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH

Método para detectar simultaneamente ganhos e perdas de regiões genômicas sem precisar de células em divisãoExtração do DNA: células teste (tumor) e referência (normal)DNA digerido com enzimas de restrição e marcados com fluorocromos diferentes (vermelho e verde)Hibridação simultânea com ambos DNA (teste e referência) sobre lâmina com cromossomos metafásicos normaisComparação intensidade relativa dos dois fluorocromos ao longo do comprimento de cada cromossomo



http://www.empiregenomics.com/site/technology_overview.php


Amplificação/ganho: excesso do DNA teste (verde)

Deleção/perda: excesso do DNA normal (vermelho)


http://www.sanger.ac.uk/HGP/Cytogenetics/

Hibridização Genômica Comparativa (CGH) em Hibridização Genômica Comparativa (CGH) em câncer gástrico câncer gástrico (Guan et al., 2000)(Guan et al., 2000)

Resolução: 0,5 Mb

array - CGH

-cromossomos metafásicos substituídos por sondas de DNA ou oligonucleotídeos chips DNA

Análise dos sinais fluorescentes: analisador de imagem, scanner confocal ou câmera CCD

http://www.dkfz.de/en/genetics/pages/projects/array_cgh.html

array - CGH

array - CGH

AVANÇOS TECNOLÓGICOS

1o. Microscópio -Leeuwenhoek

AVANÇOS TECNOLÓGICOS

http://www.empiregenomics.com/site/technology_overview.php

Array-CGH continua transformando a Citogenética:

-fornecendo alta-resolução

-tecnologia avançada para mapeamento preciso e detecção de aberrações cromossômicas.

profa. dra. ana elizabete silva departamento de biologia ibilce-unesp avanÇos da citogenÉtica...

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