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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ - UNIVALI

CURSO DE FARMÁCIA/CCS

NÚCLEO DE INVESTIGAÇÕES QUÍMICO-FARMACÊUTICAS – NIQFAR

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS - PPGCF

VIII Simpósio Ibero-Americano de Plantas Medicinais III Simpósio Ibero-Americano de Investigação em Câncer

Itajaí – Out/2016

PRINCIPAIS ESTRATÉGIAS PARA A OBTENÇÃO DE PRINCÍPIOS ATIVOS NATURAIS

Prof. Dr. Rivaldo Niero e Dra Ângela Malheiros

Ementa:- Introdução da importância de se pesquisar plantas medicinais.

- Principais técnicas de extração, fracionamento e isolamento de substâncias bioativas.

- Estudo bio-direcionado.

- Métodos de identificação e caracterização de princípios bioativos.

Nat. Prod. Comm. 3 (12), 1947, 2008

Principais estratégias para a obtenção de princípios ativos naturais - Itajaí – SC – Out/2016

Cragg and Newman. J. Nat. Prod. 79(3):629-661,2016


Figure 1: All new approved drugs 1981−2014; n = 1562

Plants Natural Products:

400 AC: Hipócrates: folhas de salgueiro → doenças dos olhos e parto

1763 Efeito antipirético da casca do salgueiro, por Edward Stone

1828: J. Buchner isolou cristais de salicina

1853: Charles Gerhardt → estrutura química do ácido salicílico.

1860 H. Kolbe consegue síntese do ác. Salicílico (fenol)

1897 Felix Hoffmann sintetiza o AAS

1899 Bayer → patente do produto (Março).

1900 Lançamento!

Salicilina

Salix sp.

1993 TaxolPaclitaxel

1971: Taxus brevifolia

Quim. Nova, Vol. 29, No. 2, 326-337, 2006


Marine natural products


Nat. Prod. Rep., 2015, 32, 116–211

Planta Med 2016; 82: 775–789

ESTUDOS FARMACOGNÓSTICOS

COLETA, HERBORIZAÇÃO E CATALOGAÇÃO DE AMOSTRAS VEGETAIS

Coleta

Processo de retirada de uma ou mais plantas inteiras ou partes dela da natureza.

Considerações a saber antes da coleta:

• levantamentos etnobotânicos e etnofarmacológicos

• levantamentos fitoquímicos ou farmacognósticos – selecionam espécies vegetais (screenings) ou sãoorientadas pelo conhecimento quimiotaxonômico (por família, gênero...)

• Observar possibilidade de risco de extinção – a coleta indiscriminada pode acentuar o risco

• Identificação – é necessário pouco material, mas para obter extratos ou substâncias ativas precisa-se demuito material

Exemplos de risco de extinção:Pilocarpus ssp - nordeste – extração da pilocarpina

Tabebuia heptaphylla (vell.) Toledo (Ipe-roxo) – câncer (casca)

Maytenus ilicifolia (espinheira santa) – atividade antiulcerogênica


Gobbo-Neto e Lopes. Quim. Nova, Vol. 30, No. 2, 374-381, 2007

Variabilidade da % dos componentes com as condições ambientais


• Como Coletar??

• Deve-se evitar coleta de partes do vegetal afetadas por:

• Doenças e parasitas.

• Materiais estranhos (outras plantas ou partes da mesma planta sem utilidade)


Raízes e rizomas- Assim que a parte aérea tiver morrido (as raízes ficam esponjosasquando colhidas na fase de crescimento da planta)

Frutos - Quando estiverem perfeitamente desenvolvidos mas antes de amadureceremdemasiadamente

Sementes - Quando o fruto estiver totalmente maduro mas, se possível, antes de começara abrir

Cascas - Após um período de tempo húmido, ou na primavera antes de começar oprocesso vegetativo

Resinas - tempo seco

Folhas e flores - Não devem ser colhidos quando cobertos de orvalho oude chuva.

Registros de dados:

É importante etiquetar a planta com todos os dados. local, hora e data da coleta


Herborização

É o processo de preparação do material coletado para preservá-lo em uma coleção de plantas

denominadas HERBÁRIO. Eles se localizam em jardins botânicos, universidades e instituições de pesquisa.

Servirá como testemunho da espécie que foi trabalhada.

Exsicata: Planta acondicionada entre pastas ou folhas de papel. Deve-se coletar diferentes partes,incluindo flores e frutos, facilitando a identificação.

Plantas de pequeno porte: São retiradas por inteiro (até raiz)

Plantas entre 30-80cm: São divididas em porções menores.

Arbustos e árvores: Corta-se porções terminais dos ramos com flores e frutos

Identificação da espécie

• Comparação com amostras em herbários

• Revisão bibliográfica

• Botânicos especialistas


PREPARAÇÃO DO MATERIAL VEGETAL

Estabilização e secagem: O material vegetal seco possui maior estabilidade química

Estabilização: Inibição enzimática no vegetal pra evitar a alteração dos compostos químicos originais.

• Desnaturação protéica das enzimas celulares através de agentes desidratantes (etanol em ebulição)

• Pela secagem em altas temperaturas (> 60 °C) em curto espaço de tempo.

Secagem: É a retirada da água – impede reações de hidrólise e o crescimento microbiano. É realizadas

em temperaturas relativamente baixas e a longo tempo de contato (± 7 dias) boa divisão e

espalhamento – maior superfície de evaporação pode ser ao ar livre ou em estufas com ar circulante

Ar livre

Deve ser a sombra em local seco e protegido contra insetos ou contaminantes ambientais sobre papel

absorvente

Estufa

Manter temperatura constante (40º ) com ar deve ser circulante


Moagem: Tem por finalidade reduzir, mecanicamente o material vegetal a fragmentos epequenas dimensões, preparando para a extração.

• Há um aumento da área de contato com o líquido extrator

• As dimensões dependem da textura do órgão – quanto mais rígido menor o grau de divisão(granulometria) necessário

Pode ser Divisão grosseira por:

• Seccionamento (tesoura, podão ou faca)

• Impacto (choques em gral);

• Rasuração (raspadores ou processadores de alimentos)

• Pulverização (obtida através de moinhos)


EXTRAÇÃO: É a ação de se obter, a partir de matérias-primas e de drogas vegetais, frescas ou secas, oscompostos químicos responsáveis pela atividade terapêutica

• Deve se levar em conta as características do material vegetal, seu grau de divisão, o líquido extrator(solvente) e a metodologia.

• O solvente ou a mistura de solventes escolhido deve extrair apenas as substâncias desejadas(polaridade).

• Caso não saiba as características químicas do vegetal, faz-se sucessivas extrações com solventes empolaridade crescente

solvente tipos de substâncias extraíveis preferencialmente

éter de petróleo lipídeos, ceras

tolueno, diclorometano, clorofórmio alcalóides livres, antraquinonas

acetato de etila, n-butanol flavonóides cumarinas

etanol, metanol heterosideos

mistura álcool-água saponinas, taninos

água acidificada alcalóides

água alcalinizada saponinas

Simões et al., Da planta ao Medicamento, 2004, 2010


Extração com solventes: É uma preparação obtida de drogas vegetais frescas ou secas,

por meio de um dissolvente e um método apropriado.

Extrações a frio:Maceração: Extração realizada em recipiente fechado, em temperatura ambiente durante um períodoprolongado ( ~7 dias) sob agitação ocasional e sem renovação do líquido extrator (não há esgotamento damatéria-prima vegetal – saturação do líquido extrator ou equilíbrio difusional entre o meio extrator e ointerior da célula)

�PROCESSO ESTÁTICO�NÃO ESGOTA TOTALMENTE A DROGA VEGETAL

Equilíbrio

Digestão – maceração comaquecimento (40-60 °C)

Maceração dinâmica – sobagitação mecânica constante

Maceração estática – comagitação mecânica ocasional

Remaceração – com renovaçãodo líquido extrator


�PERCOLAÇÃO: Percolação: o material (seco ou úmido, partido ou triturado) écolocado em um percolador, através o qual se passa um fluxo contínuo dosolvente extrator, com um fluxo ideal que permita uma extração eficiente e que osolvente seja constantemente removido

�Processo dinâmico�Esgota totalmente a droga� Utilizado para substâncias que ocorrem em pequena quantidade�Utiliza grande quantidade de solvente


Turbo-extração (Turbolização):- Extração com simultânea redução do tamanho da partícula (força de cisalhamento).- O rompimento das células aumenta a dissolução das substâncias ativas.- Em poucos minutos tem-se quase um esgotamento da droga vegetal.

Inconvenientes: difícil filtração; aumento da temperatura


Extração em fluído super crítico: As propriedades físico-químicas de um fluido assumemvalores intermediários àqueles dos estados líquido e gasoso. A capacidade de solubilizaçãoaproximam-se daquelas típicas de um líquido e a viscosidade, alcançam valores típicos de umgás.

Nat. Prod. Rep., 25, 517–554, 2008.

Revista Analytica , 2, 30-37, 2002

Quím. Nova. 26(5), 687-693,2003.


Trends in Anal. Chem. 80, 66–82, 2016


Extração por micro-ondas:

Extração por ultrassom

Trends in Analytical Chemistry 80, 66–82, 2016

Extração sob refluxo: Extraçãocom um solvente em ebulição mascom um condensador para que osolvente evaporado retorne aoponto inicial.

Extrações a quente em sistemas fechados

Extração em aparelho de soxhlet:- Extração c/ solventes voláteis- Em cada ciclo de operação o vegetalentra em contato com o solventerenovado- Utiliza-se quantidade reduzida desolvente.

Rotaevaporador spray dryer

liofilizador


A extração com arraste de vapor: Permite a separação de componentes voláteis imiscíveis, sem

necessidade de temperaturas elevadas. Se um dos líquidos é a água, a destilação se processa a uma

temperatura inferior a 100ºC, por força da contribuição da pressão de vapor do(s) outro(s) líquidos e,

consequentemente são evaporados juntamente.


Clevenger

Extração líquido/líquido (ELL): é um processo de separação que se utiliza da propriedade demiscibilidade de líquidos.

É um processo de pré-purificação.

Cuidados:

Pressão internaFormação de emulsãoUso de agentes dessecantes Agitação suave

Dicas:(emulsões)Adicionar NaClGirar o funil pode ser suficienteFiltração da misturaHoras de espera

Vantagem:Permite selecionar determinadasclasses de compostos

Fracionamento e purificação


Cechinel Filho V. Química nova, 21(1),99-105, 1998.


Fracionamento a partir de um extrato alcoólico

EXTRATO METANÓLICO

MeOH/H2O 9:1MeOH/H2O 9:1

Fração hexanoFração hexano

Evaporação a pressão reduzida

MeOH/H2OMeOH/H2O

AQUOSOAQUOSO Fração diclorometanoFração diclorometano

Fração Acetato de etilaFração Acetato de etila

Fração butanolFração butanol

AquosaAquosa

Evaporar MeOH

Extração Liq/Liq.


Extração específica para alcalóides.


Curr Opin Biotechnol. 37:155-164, 2016.

Toxins 7, 2024-2050, 2015

Quim. Nova, Vol. 33, No. 2, 284-287, 2010

Extração direta com solventes de polaridade crescente


Revista Fitos, 2(3), 39-56, 2006


ESTUDOS BIODIRECIONADOS

Química nova, 21(1),99-105, 1998.

Planta Med. 78(8):747-54, 2012

Esquema geral


MeOH

Frações semi-purificadas

Métodos cromatográficos

A cromatografia: é um método físico-químico de separação dos componentes de umamistura, realizada através da distribuição destes componentes entre duas fases, queestão em contato íntimo.

FASE ESTACIONÁRIA – Camada de alta área superficial

FASE MÓVEL – Solvente ou Mistura que passa através, sobre ou ao longo da faseestacionária.

A SEPARAÇÃO É BASEADA EM:

Velocidades diferenciais de movimento na FM de diferentes espécies (macromoléculas ouíons)

1903 - Botânico russo, Mikhail Semyonovich Tswet- Separação de pigmentos de plantas em zonas de cores distintas.- Cromatografia não ficou limitada a compostos coloridos, mas o termo

original foi mantido

Mikhail Semyonovich Tswet


CLASSIFICAÇÃO DOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

Cromatografia

Planar Coluna

F.M. Líquida

C.CamadaDelgada

C.Papel

F.M. Gasosa F.M. Líquida

C. Gasosa CLAECCC.Centrifuga


CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)

TIPO – PlanarConsiste na separação de componentes de uma mistura através da migração diferencial sobre umacamada delgada de adsorvente retido sobre uma superfície plana.

O processo pode ocorrer por adsorção, partição, troca iônica ou exclusão molecular.


Seleção da Fase Móvel

O Solvente utilizado possui papel fundamental naseparação dos componentes. Existe uma competiçãoentre as moléculas da amostra e da fase móvel, pelasuperfície adsorvente, portanto considera-se anatureza química da amostra e a polaridade da fasemóvel.

Hex: Acetato7:3

Hex: Acetona7:3

Cortesia: Dr. Luiz Carlos Klein


APLICAÇÃO E EVOLUÇÃO DAS AMOSTRAS NAS CROMATOPLACAS.

REVELAÇÃOPode ser por métodos físicos ou químicos.

Compostos UV-ativos, que aparecem como manchas escuras em fundo fluorescente, se a placa for iluminada comlâmpada de luz ultravioleta (Método físico)

Quase todas as classes de substâncias orgânicas (exceto alcanos e haletos alifáticos) reagem com iodo formandocomplexos. A formação desses complexos é reversível.

As placas também podem ser borrifadas com outros reveladores (ácido sulfúrico/metanol, vanilina sulfúrica,tricloreto de antimônio, permanganato de potássio/ácido sulfúrico, etc.). (Método químico)


Reveladores Biológicos:Utiliza-se reações enzimáticas ou bacterianas para tornar a mancha visível.

• Placa de sílica, eluída com diclorometano:metanol (97:3). A placa é borrifada com solução esporosde fungos. Manchas brancas indicam que houve inibição dos fungos pelas substâncias contidasnos extratos de uma planta.


Análise QualitativaA análise qualitativa com CCD, consiste na determinação do Rf e sua comparação com padrões.

Análise QuantitativaA CCD pode ser utilizada para quantificação. Retira-se da cromatoplaca a área que contenha a substância desejada queé extraída e quantificada.

Freqüentemente, utiliza-se a densitometria, medidas de fluorescência e radioatividade.

HPTLC – High Performance Thin Layer chromatography

É uma técnica instrumental e de alta performance, onde aavaliação é feita através de equipamentos e software

Amostra: 10µl a 3mg/mLRevelador: anisaldeído sulfúrico.Padrão: Mirigalona GCortesia (IC): Paola Leoni

OH

O OH

O

CH3


ATS 4 – AUTOMATIC TLC SAMPLER 4: Aplicação totalmente automática em placasTLC/HPTLC, garantindo precisão e reprodutibilidade em análises quali e quantitativas.

TLC Scanner 3: Todas as funções são controladas pelo computador. A única operação manual é ainserção do objeto a ser escaneado

Reich E, and Widmer V. Planta Med .75: 711–718, 2009.Srinivas, et. al., J. Planar Chrom. 20 (1), 73–74, 2007.


CROMATOGRAFIA EM COLUNA ABERTA(CCA)

POR ADSORÇÃO (LÍQUIDO – SÓLIDO)Usa-se uma coluna recheada com um sólido (FE) e uma fase móvel líquida.FE – adsorventeFM – eluente

COLUNA – Tubo cilíndrico com estrangulamento numa das extremidades.Geralmente de vidro. O tamanho vai depender da quantidade de material a serseparado.

CARACTERÍSTICAS – Técnica simples, não exige instrumentação sofisticada, boapara fins preparativos.

USOS- Utilizada em laboratórios para separar e purificar reagentes e materiais obtidospor sínteses.- Em lab. de produtos naturais em escala preparativa e analítica

TÉCNICAS GERAIS1 – ESCOLHA DO ADSORVENTE (Depende da característica da amostra)2 – ESCOLHA DO ELUENTE (Através da CCD)3 – EMPACOTAMENTO DA COLUNA (FE na forma de solução com vibração)4 – ELUIÇÃO (por gotejamento pela força da gravidade)

Um químico na década de 1950

Sistemas pressurizadosLow-pressure LC (ca. 5 bar/75 psi/0.5 MPa);

Medium-pressure LC (ca. 5–20 bar/75–300 psi/0.2–2.0 MPa);

High-pressure HPLC (>20 bar/300 psi/2.0 MPa).


Res. J. Biol. Sci. 2(4), 462-467, 2007.

Low-pressure LC (ca. 5 bar/75 psi/0.5 MPa);


5010002500100050

30600160060040

2036090040030

1016040020020

54010010010

Volume da fração

coletada (mL)

Quantidade de amostra

(mg)∆∆∆∆ Rf ≥ 0.1

Quantidade de amostra (mg)

∆∆∆∆ Rf ≥ 0.2

Volume do eluente (mL)

Diâmetro da coluna

(mm)

Still, C. W. et al., J.Org.Chem. 4: (11), 2913-2925, 1978.

CROMATOGRAFIA FLASH: baixa pressão (30-75 psi)

É útil para uma separação preparativa rápida com boa resolução.Tradicionalmente era realizada com sílica gel mas atualmente, ouso de cartuchos de fase reversa tornou-se bastante comum.

Vantagens:Baixo custoFácil montagemFácil empacotamentoRapidez de eluiçãoBoa resolução

Altura fixa do leito de 15 cm


OOH

OH O

PinocembrinaCortesia: Dr. Luiz Carlos Klein

Cortesia: Priscila Tessele


Automated Flash Chromatography System

CROMATROTRON: Cromatografia Preparativa de Força Centrífuga. Consiste num sistema

de placa circular de CCD inclinada, o que permite a maior eficácia no escoamento e coleta

das substâncias.

Vantagens:Simples operaçãorápida separaçãoBaixo consumo de solventePlaca pode ser reutilizadaGradiente se Eluição

Desvantagens:Fase estacionária é restritaResolução limitadaPlacas comerciais não viáveis economicamente

Kolak, U. Turk J. Chem. 31,363 – 369, 2007. www.tsqtech.com


Cromatografia Líquida de Alta Eficiência(CLAE)

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

• É um tipo de cromatografia líquida que emprega pequenas colunas, recheadas de materiaisespecialmente preparados e uma fase móvel que é eluída sob altas pressões.•(>20 bar/300 psi/2.0 MPa).

•Requer que a amostra seja solúvel na fase móvel.

USOS:- Na separação de espécies iônicas ou macromoléculas de interesse biológico e produtos naturais.

- Imensa variedade de outros compostos de alta massa molecular e/ou baixa estabilidade térmica.

Ex.: aminoácidos, explosivos, lipídeos polares, metabólicos de animais e plantas, pigmentos de plantas,polímeros sintéticos polissacarídeos, produtos farmacêuticos, proteínas e tintas.

-Não existem competições entre a CLAE e a CG, são técnicas que se complementam e geralmente analisamdiferentes tipos de amostras.


Sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

Sistemas de solventes mais utilizados:MeOH/H2O ou ACN/H2O

Preparativas

Analíticas

Semi-preparativas

1. 10-deacetylbaccatin III2. Baccatin III3. 7-xylosyl-10-deacetyltaxol B4. Taxinine M5. 7-xylosyl-10-deacetyltaxol6. 7-xylosyl-10-deacetyltaxol C7. 10-deacetyltaxol8. 7-xylosyltaxol9. Cephalomannine (Taxol B)

10. 7-epi-10-deacetyltaxol11. Paclitaxel®

12. Taxol® C13. 7-epitaxol

Column: Alltima™ CN, 3µm*, 250 x 4.6mm (Part No. C-6000B)Mobile Phase: Methanol:Acetonitrile:Water (25:22:53) Flowrate:0.8mL/minDetector:UV at 227nm


Características das Fases Móveis Usadas em CLAE

• Ser de alto grau de pureza ou de fácil purificação (Grau HPLC).

• Dissolver a amostra sem decompor os seus componentes.

• Não decompor ou dissolver a fase estacionária.

• Ter baixa viscosidade e ser compatível com o tipo de detector utilizado.

• Ter polaridade adequada para permitir uma separação conveniente dos componentes da amostra.

Podem ser classificados de acordo com os seguintes aspectos:

Sólidos rígidos (à base de sílica), semi-rígidos (poliestirenoentrecruzado com divinilbenzeno) ou não rígidos (agarose oudextrose).

- Partículas porosas ou peliculares (superficialmente porosas).

- Partículas esféricas ou irregulares.

- Partículas com diferentes diâmetros.

Características das Fases Estacionárias Usadas em CLAE


FASES ESTACIONÁRIAS: Cromatografia líquido-líquido com fase ligada (CLFL)

A superfície da sílica é o suporte mais popular, que pode ser modificado por uma dessasreações: Fase Reversa


Detector por Arranjo de diodos (Diode Array)

• toda a luz da fonte passa pela cela da amostra

• a luz emergente é dispersada por uma grade holográfica (rede de difração)

• a radiação dispersada resultante (comprimentos de onda distintos) é focalizada sobre uma fila defotodiodos (256-512nm)

• todo o espectro da substância passando pelo detector é armazenado em um microcomputador

• é possível exibir um cromatograma para cada comprimento de onda selecionado

• é possível exibir o espectro em cada tempo determinado, ou seja, o espectro do pico cromatográfico

• alto custo e relativamente complexo

Outros tipos de detectores:Índice de refraçãoFluorescênciaInfra-vermelhoEletroquímicosEspalhamento de luz


Aplicações: Tanto preparativa como analítica

atenolol

Concentração

área

a = ∆∆∆∆y/ ∆∆∆∆x

Determinações quantitativas

- Curvas de calibração- Integral da área- Equação da reta –>>>> y = ax + b



Pérez-Victoria I et al. Combined LC/UV/MS and… Planta Med. 82: 857–871, 2016


CROMATOGRAFIA GASOSAAplicabilidade

Quais misturas podem ser separadas por CG?

Para que uma substância possa ser “arrastada” por um fluxo de gás,ela deve ser solúvel ou pelo menos parcialmente neste Gás.

Misturas cujos constituintes sejam VOLÁTEIS

(evaporáveis)

De forma geral: CG é aplicável para separação e análise demisturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO deaté 300oC e Termicamente estáveis

Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA

Idealmente: cada substância separada aparece

como um PICO no cromatograma.


Utilização de padrões para comparação• mesmas condições• uso de padrões internos

Determinações qualitativas:


Foucault and Chevolot . Journal of Chromatography A, 808, 3–22, 1998.Hostettmann and Marston . Phytochemistry Reviews. 1: 275–285, 2002.

Sticher, O. Nat. Prod. Rep., 25, 517–554, 2008.

A cromatografia contracorrente de gotas (DCCC: droplet countercurrent chromatography): Éuma forma de cromatografia de partição líquido-líquido sem o uso de adsorvente. Consiste nautilização de duas fases líquidas imiscíveis, onde uma é móvel e a outra estacionária. Adistribuição do soluto em cada uma das fases é determinada através de seus respectivoscoeficientes de partição.


Finalizando e Relembrando!!!!!

OH

HO

O OH

OO

12

34

5 6

7

8

9

10

12

16

17

20

21

23

24

37

27

28

32

33

29

34

38


Criatividade

PERCEPÇÃO Persistência



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Agradecimentos:


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