analise quantitativa cromatografia gasosa

7/31/2019 Analise Quantitativa Cromatografia Gasosa

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ANLISE QUANTITATIVA POR CROMATOGRAFIA

Antnio Luiz Pires Valente (in memoriam),Fabio Augusto e Cssio Ricardo Fares RiedoUniversidade Estadual de Campinas, Instituto de Qumica, CP 6154,13084-862 Campinas, So Paulo - Brasil

RESUMO

Este um texto de apoio ao aplicativo multimdia Anlise Quantitativa por Cromatografia (disponvel emAplicativos e Programas). A sua finalidade a de oferecer ao leitor material similar, na forma impressa, ao domultimdia. Este texto mais detalhado do que o apresentado no aplicativo, mas tem um nmero muito menorde figuras. tambm uma forma complementar para a apresentao das informaes e interpretaes, podendo

servir tanto como material de apoio como resumo do material original.

Palavras-chave: Cromatografia, Curva Analtica, Tratamento de Dados, Teste de Huber

Introduo

A anlise quantitativa em cromatografia baseada em

estabelecer o valor da rea da banda cromatogrfica. Na

cromatografia em coluna, isto , gasosa (CG) e em cromatografia

lquida (comumente de alta eficincia, CLAE) a banda registrada

como um pico (Figura 1) que, idealmente deve ter formatogaussiano.

0

50

100

150

200

250

300

0 2 4 6 8

O parmetroquantitativofundamental emcromatografia a rea da bandacromatrogrfica.

Figura 1. Esquema de um cromatgrafo gasoso e de um cromatogramaobtido por cromatografia gasosa.

1
mailto:[email protected]:[email protected]


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Em cromatografia gasosa de alta resoluo, onde so

usadas colunas capilares, no incomum que os picos tenham perfil

gaussiano, como demonstrado no detalhe da Figura 2, que o pico

destacado em azul da Figura 1.

0

50

100

150

3,9 3,95 4

Na prtica dacromatografia soobservados picos

gaussianos.

Figura 2. Detalhe do pico destacado em azul na Figura 1, mostrandoque ele tende ao perfil gaussiano.

Similarmente ao que ocorre na cromatografia em coluna, asmanchas observadas em cromatografia em camada delgada (CCD)

tambm tendem distribuio gaussiana. Isto mostrado na Figura

3, em que as quantidades de analito numa mancha foram obtidas

para seces verticais:

0

500

1000

1500

2000

1 4 710

13

16

19

22

As bandascromatogrficastendem ao perfil

gaussiano.

Figura 3. Distribuio das quantidades (figura inferior) de analito numamancha (figura superior) de CCD.

2


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Portanto, nos casos mostrados nas figuras anteriores, nas

correspondentes bandas cromatogrficas as quantidades dos

analitos tendem ao perfil gaussiano, isto , aumentam das bordas

para o centro da mancha e, simetricamente, diminuem do centro

para a outra borda.

Quando a banda cromatogrfica registrada na forma de

pico, a sua rea pode ser calculada, como mostrado abaixo, como a

rea do tringulo issceles que engloba o pico cromatogrfico

(Figura 4).

Wb

h

Clculo da rea de umpico cromatogrfico

por triangulao:

A = h Wb

Figura 4.A = hWb. Clculo da rea de um pico cromatogrficopor triangulao.

Na cromatografia em camada delgada a rea da mancha

estabelecida pordensitometria, cujo princpio est representado na

Figura 5.

A densitometriafaz a contagem do

nmero de pontos deuma imagem.

Figura 5. O princpio da densitometria: o nmero de pontos que define amancha (como vista por um densitmetro ou computador) proporcional rea da mancha.

3


4/18

O procedimento e princpio de obter reas em CCD a partir

de imagens digitalizadas e arquivadas em computador est

representado na Figura 6: as placas no caso com manchas visveis

de corantes so digitalizadas e com o arquivo gerado realiza-se a

contagem dos pontos (pixeis o termo usado na rea de

computao) que compem cada mancha. A contagem pode ser

feita manualmente com muita pacincia ou por meio de um

programa que conte os pixeis. O nmero de pontos proporcional

rea da correspondente mancha e, conseqentemente, proporcional

quantidade de analito nela existente. Esta metodologia representa

o princpio de estabelecimento de reas cromatogrficas.

1074 pontos

664 pontos

641 pontos

554 pontos

O nmero de pontosque compem umamancha escaneada

proporcional sua rea.

Escanear.

Figura 6. Princpio do estabelecimento de rea de uma mancha deCCD por meio de escaneamento da placa cromatogrfica.

Apesar do mtodo de determinar reas ser diferente para

CG e CLAE, o princpio o mesmo do usado em CCD.

O uso das reas cromatogrficas a curva analtica

medindo-se as reas cromatogrficas que se estabelecem

as quantidades de analitos em amostras analisadas e a melhor

forma de realizar quantificaes a baseada numa Curva Analtica1.

A Curva Analtica (Figura 7) a relao entre sinais no caso as

reas e quantidades do analito a ser quantificado.

4

1 Curva Analtica o nome sugerido pela IUPAC para substituir o termo Curva de Calibrao.


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rea

Toda anliseefetivamente

quantitativa exige ouso da curva analtica.

Quantidade

A = a + b Q

Figura 7. Esboo de uma Curva Analtica linear (representada pelaequao de uma reta).

Obtendo uma Curva Analtica

O primeiro passo para obter a curva analtica preparar um

conjunto de solues com um padro do analito que se deseja

quantificar em amostras. Portanto, necessrio conhecer a

identidade do analito e dispor dele na forma de padro (puro ou, se

isso no for possvel, com pureza exatamente conhecida e

determinada independentemente).

Cinco a seis solues costumam ser suficientes para este

trabalho. Estas solues so aplicadas lado a lado na placa

cromatogrfica e realizada a corrida cromatogrfica. Como no

incomum que numa anlise tenha-se que quantificar vrios analitos,

as solues podem conter todos eles, do que resultar uma

cromatoplaca como a mostrada nas Figuras 5 e 6. Ento as reas

das manchas so obtidas (Figura 6) e tabeladas, como mostrado na

Tabela 1.

Tabela 1. Concentraespreparadas e reas obtidas para

as correspondentes manchascromatogrficas o analito o

corante Vermelho 40 (V40).

C (g/L) rea

2,8 1175,7 1358,4 162

11,2 19414,1 207

Dispondo de dados como o da Tabela 1 aplica-se a eles uma

Regresso Linear para obter a equao da curva analtica, isto , a

relao funcional entre Sinais e Quantidades. Para o caso dos dados

da Tabela 1, a equao de reta que relaciona as reas com as

concentraes do V402 :

5

2 O V40 um corante artificial usado em alimentos.


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A = 91,7 + 8,5 C (Equao 1)

Note-se que a curva analtica definida como a relao

entre sinais e quantidades; no entanto, na Equao 1 as

quantidades so representadas pelas concentraes das solues.

Isto implica que os volumes de amostra aplicados na placa

cromatogrfica foram iguais, pois, C = Q / V (C= concentrao; Q =

quantidade; V =volume).

Usando a curva analtica

Dispondo da equao da curva analtica pode-se calcular as

quantidades do analito em amostras. As amostras so aplicadas em

outra placa (mesmo volume usado das solues-padro), a corrida

realizada sob as mesmas condies usadas para o conjunto de

padres e as reas do analito nas amostras so determinadas.Suponhamos que para uma amostra esta rea foi estabelecida como

de 184 pixeis. Este valor substituido na equao (1) da curva

analtica e obtm-se a quantidade do analito na amostra (no caso a

sua concentrao):

184 = 91,7 + 8,5 C;

C = (184 91,7) / 8,5;

C = 10,9 g L-1 Numa curva analticainterpolam-se

resultados.

As extrapolaes norefletem resultadosefetivamentequantitativos.

0

50

100

150

200250

0,0 5,0 10,0 15,0

A = 91,7 + 8,5 C

Concentrao (g/L)

rea

14,12,8

Figura 8. Grfico da curva analtica obtida para os dados da Tabela 1.

Nesta Figura 8 esto destacados os valores inferior (2,8 g L-1)

e superior (14,1 g L-1) das concentraes usadas para obter a curva

analtica. O valor acima calculado C = 10,9 g L-1 intermedirio entre

estes extremos. Portanto, ele foi interpolado usando-se a Equao

1. Como somente se conhece o comportamento da curva entre

6


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aqueles extremos, somente interpolaes so vlidas para fins

efetivamente quantitativos. Extrapolaes no so aceitveis. Isto

uma regra geral em Qumica Analtica.

A confiabilidade dos dados (e da Curva Analtica)

A curva analtica obtida com dados experimentais, que

sempre esto sujeitos a erros e desvios. Por isto, os dados

costumam oscilar e pode ser difcil ou impossvel obter uma equao

que os represente com confiabilidade. Um dos motivos a inevitvel

flutuao dos volumes aplicados na placa cromatogrfica. Um

recurso para contornar esta dificuldade alm do cuidado com

operaes experimentais tecnicamente corretas trabalhar com

dados em replicatas.Tabela 2. reas medidas em

triplicatas para as cincoconcentraes.

Em CCD isto corresponde a, por exemplo, preparar trsplacas cromatogrficas e aplicar em cada uma delas as solues de

concentraes variadas dos padres. A Tabela 2 mostra que, em

cada placa aplicam-se amostras com cinco concentraes: 0,3; 0,6;

0,9; 1,2 e 1,5 g L-1. Assim, por concentrao, dispe-se de triplicata

das reas cromatogrficas.

comum que aps obter as triplicatas calculem-se as

mdias das reas correspondentes a cada concentrao, para se

aplicar a regresso linear sobre estas mdias e concentraes. Sem

um critrio adequado isto pode levar a erros.Tomemos como exemplo a menor concentrao e suas

reas 462, 416 e 462, cuja mdia igual a 447. No entanto, uma

simples inspeo visual da Tabela 2, torna evidente que a rea 416

no deve ser usada no clculo da mdia; desprezando este valor

obtem-se uma mdia mais representativa, que igual a 462. O valor

416 claramente oriundo de algum erro, possivelmente devido ao

volume aplicado de amostra e, se usado no clculo, descaracteriza o

significado da mdia. Diz-se que ele um valoranmalo, o qual,

conseqentemente, no deve ser considerado. Ocorre que naTabela 2 existem outros anmalos, e como um conjunto de 15

dados fica difcil identificar todos eles por inspees visuais como a

acima referida. No entanto existe um conjunto de critrios bastante

seguro para identificar e desprezar anmalos, que baseado na

Curva de Linearidade.

22312305207923101,5

18391827184818431,2

14171340152513860,9

9269249249290,6

4474624164620,3

Mdirea3rea2reaC(g/L)

placa 3placa 2

so cinco reas por placa

placa 1

A representatividadede mdias sempredeve ser verificada.

7


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A Curva de Linearidade

A Curva de Linearidade origina-se de um princpio bastante

simples: admite-se que os dados ajustam-se a uma equao de reta

do tipo

y = a + b x (Equao 2),

a qual tem um coeficiente angular, b, constante. Experimentalmente

o que isto significa? Significa que idealmente os quocientes entre as

reas medidas e correspondentes concentraes seriam constantes,

como mostrado na Figura 9 (A / Q).

Com a curva delinearidade pode-se

identificar dadosanmalos.

QnQ2Q1 Q

A/Q

Q2Q1 Q

A

Figura 9. A Curva de Linearidade ( direita): razes A/Q (correspondentes)vs Q resultaria (idealmente) numa reta paralela com o eixo X.

Portanto, usando os dados da Tabela 3 calculam-se os valores A/C,

que so plotados em relao s correspondentes concentraes.

Disto resulta o grfico da Figura 10.

1,2(A/C) 1

0,9

Tabela 3. Valores deconcentrao e quocientes derea or Concentra o A/C .

(A/C))) 3(A /C) 2C (g/L)

1537

1522

1489

1540

1386

1540

1694

1540

1540

1536

1540

1549

13861540 1540

1,5

1,2

0,9

0,6

0,3

1386 1537

1520

1530

1540

1550

0,0 1,0 2,0

A/C

Concentrao

Figura 10. Curva de linearidade para os dados da Tabela 3. Os valores deA/C superiores a 1546 e inferiores a 1534 indicados com camposombreado na Tabela 3 foram rejeitados.

Nas consideraes da Tabela 3 e da Figura 10 no

indicamos porque os pontos superiores a 1546 e inferiores a 1534

foram rejeitados. Isto pormenorizado a seguir.

8


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A rejeio sistemtica de anmalos

Para rejeitar anmalos com base na curva de linearidade,

usando o procedimento chamado Teste de Huber, necessrio: (1)

estabelecer um valor central (linha preta na Figura 10) e, acima e

abaixo dela, intervalos de confiana (linhas vermelhas) que definem

quais os dados aceitveis isto , os que pertencem ao intervalo de

confiana. necessrio um critrio para estabelecer o valor central

de forma que ele no dependa dos dados anmalos. Isto feito

obtendo-se a mediana dos dados.

Para estabelecer o valor central a mediana (md) prefervel

mdia, porque o valor da mediana no afetado pelos anmalos.

Para obter a md ordenam-se os dados (rea/concentrao) e, no

presente exemplo, como so 15 dados, a md o oitavo deles, isto

1540. Portanto, o valor central deste conjunto de A/C md = 1540,como realado na Tabela 4. O prximo passo estabelecer os

intervalos de confiana. Antes, porm, uma observao: a mdia

deste conjunto 1525 (marcado em vermelho na Tabela 4), um valor

bastante menor do que o da md, e claramente inadequado para

representar o conjunto.

Tabela 4. Valores ordenados emquocientes de rea por

Concentrao (A/C).

1525

Estabelecendo os intervalos de confiana

O primeiro passo calcular as diferenas absolutas entre

cada valor de A/C e a md. Por exemplo, para o primeiro valor deA/C:

| A/C1 md| = |1522 1540| = 18 (Equao 3).

O intervalo deconfiana

representa a faixade variao que

voc deve esperarpara o seu

experimento.

A seguir obtido o chamado desvio absoluto da mediana (mad) dos

quinze valores |A/Ci md| e o intervalo de confiana (IC) calculado

como:

IC = k mad (Equao 4)

onde k um fator que pode variar de 2 a 8. Para os dados em

considerao mad = 3,1; usando-se k = 2 os valores do intervalo

superior e do inferior, que so os limites para desprezar resultados

anmalos, so obtidos por:

9


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ICs,i = md k mad = 1540 2 3,1 (Equao 5)

Tabela 5. Reproduo da Tabela 3indicando os dados rejeitados.ou seja,

1537138615401,5

1522154015361,2

1489169415400,9

1540154015490,6

1540138615400,3(A/C)2(A/C)1 (A/C)3

C (g/L)IC s = 1546; IC i = 1534;

de forma que os dados rejeitados so destacados pelos sombreados

mostrados na Tabela 5.

Naturalmente esta definio de intervalos de confiana - e do

critrio para rejeies de anmalos - deve ser comentada. Em

primeiro lugar, o critrio parece ser excessivamente subjetivo pois,

afinal, quem decide o valor de k e, portanto, da rigidez com que os

dados so desprezados o analista. Mas, de fato, com bom senso o

critrio deixa de ser absolutamente subjetivo. Este bom senso

implica, entre outras coisas, em adicionar mais um parmetro naavaliao do resultado final (que a equao da curva analtica).

Este outro parmetro chama-se resduo, rs.

Observe que, noteste de Huber,o estabelecimento

do valor docoeficiente k no

totalmentearbitrrio.

Quais so os dados rejeitados?

Antes de discutir os resduos necessrio estabelecer quais

os dados a serem rejeitados. Na Tabela 4 esto os dados A/C

rejeitados, mas no com estes que se constri a curva analtica.

No entanto, aos valores indicados na Tabela 5 correspondem a

reas que esto na Tabela 2, que so, respectivamente,(considerando colunas-linhas): 416, 929, 1525, 2079, 1340 e 1827.

Portanto, estas so as reas a serem rejeitadas.

O uso dos resduos

Aps eliminar os dados anmalos supe-se que os

remanescentes representem adequadamente a relao existente

entre rea e Concentrao com reas e concentraes que se

constri a curva analtica. Portanto, a regresso linear aplicada s

reas no rejeitadas da Tabela 5, obtendo-se a seguinte equao

para apossvelcurva analtica:

Os resduosrepresentam o

grau de confiabilidadede interpolao dedados com a sua

curva analtica.

A = 2,10 + 1537,7 C; r = 1,000 (Equao 6)

10


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Nesta equao (6) pode-se substituir os valores das

concentraes (0,3 g L-1 a 1,5 g L-1) para obter valores interpolados

de reas (Aint). Ento so calculadas as diferenas relativas (%)

entre estes Aint e as mdias das correspondentes reas

experimentais (exp

). Por exemplo, para a concentrao de 0,3 g L-1

a exp = 462 e a Aint = 463, de forma que:

rs = 100 (Aint - exp)/100 = + 0,3% (Equao 7).

Os valores rs (calculados para todas as concentraes) so

os resduos, isto , as medidas de quanto as reas interpoladas se

afastam das experimentais. Para o exemplo considerado os resduos

esto relacionados na Tabela 6.

Tabela 6. Valores de reasinterpoladas e resduos.

0,02308,6

- 0,11847,3

0,01386,0

- 0,1924,7

+ 0,3463,4

rs ( %)A int

Agora dispe-se de mais informaes para decidir se aescolha de k = 2 foi adequada para o critrio de rejeio.

Os resduos mostrados na Tabela 6 sugerem que o erro

mximo a ser cometido em interpolaes com a equao obtida para

a curva analtica estariam em torno de 0,3 %. Para cromatografia em

camada delgada pode-se considerar este como um resultado muito

bom. Por outro lado, considerando os sinais dos resduos existe

suficiente compensao entre resduos positivos e negativos.

Ademais, o coeficiente de correlao obtido r = 1,000 indicativo de

tima preciso da curva obtida. Portanto, pelo conjunto deargumentos acima pode-se concluir que a seleo de k = 2 foi um

critrio adequado para a rejeio de resultados. O contrrio ocorreria

se, por exemplo, dos 15 dados fossem rejeitados 7 ou 8; neste caso

seria necessrio repetir o procedimento com k = 3 e reanalisar os

resultados. Outra possibilidade seria dos resduos serem

excessivamente elevados e apresentarem uma distribuio

claramente no-aleatria entre valores positivos e negativos (caso

onde o modelo linear de calibrao no aplicvel). Estes casos

poderiam sugerir erros experimentais e, inevitavelmente, a repetiode todo o procedimento cromatogrfico.

11


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Um resumo do procedimento

Dispondo das reas cromatogrficas o que se faz (as

etapas de 1 a 6 constituem o chamado Teste de Huber, baseado em

medianas para rejeio de anmalos):

1. Dividir as reas pelas correspondentes concentraes, para

plotar um esboo de curva de linearidade: A/C vs C.

2. Calcular a md das razes A/C.

3. Calcular as diferenas absolutas entre as A/C e md.

4. Obter a mediana mad dessas diferenas absolutas.

5. Calcular os IC = k mad e estabelecer os limites superior e

inferior ICS,I = md k md.

6. Rejeitar as A/C de valor acima ou abaixo dos ICS,I e,

conseqentemente, as correspondentes reas.

7. Aplicar a regresso linear s mdias das reas no rejeitadas e

concentraes para obter uma equao para a curva analtica.

8. Substituir os valores das concentraes nesta equao para

obter reas interpoladas e calcular os resduos.

Uma generalizao da curva de linearidade e um critrio maisgenrico para a aplicao do teste de Huber

As discusses anteriores foram baseadas no fato de que se

a curva analtica obedece a uma equao do primeiro grau,

A = a + b C ou, como mostrado na equao 2, y = a + b x, ela

tem um coeficiente angular, ou a sua primeira derivada, constante.

Isto tambm aplica-se quando o coeficiente angular, b, diferente de

zero, pois: ento,

C

aAb

= (Equao 8).

A equao 8 permite generalizar o critrio de quais dados

aplicar o teste de Huber. Consideremos um segundo exemplo de

obteno de curva analtica.

12


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Obtendo a Curva Analtica quando o coeficiente linear muitodiferente de zero

Tabela 7. reas em triplicata obtidaspara as concentraes da coluna 1.Na Tabela 7 est outro conjunto de dados obtidos por

cromatografia em camada delgada. Ao calcular as razes A/C com

estes dados e plota-las na forma de uma curva de linearidadeobtem-se o grfico da Figura 11.

2714244827201,5

2232225822521,2

1737197617960,9

1334133413410,6

8727858720,3

rearea 2rea 1C

0

2000

4000

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Linearidade ?

C

A / C

A curva de linearidadetem um aspecto de

curva de segundo grauquando o coeficiente

linear da curva analtica

muito diferente de zero.

Figura 11. Grfico obtido com os dados de rea e concentrao da Tabela7.

visvel na Figura 11 que inexiste uma curva de

linearidade. Isto ocorre porque a correspondente curva analtica tem

(como se ver a seguir) um coeficiente linear bastante diferente de

zero.

Em outros termos, todas as reas obtidas experimentalmente tm

embutido o valor correspondente ao coeficiente linear. Isto cadarea experimental tem um componente Ai proporcional

correspondente concentrao, mais um valor constante a, de forma

que os quocientes A/C so sucessivamente menores,

n

n

2

ii

1

i

C

aA

C

aA

C

aA

o que faz com que o grfico de A/C vs C tenha o aspecto no linear

e decrescente mostrado na Figura 11.

A generalizao vista na equao 8:

C

aAb ,

auxilia no contorno a esta dificuldade.

13


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Se as quinze reas Ai, as concentraes Ci e o coeficiente

linear a so substitudos nesta equao obtm-se quinze valores

para o coeficiente lineara.

No entanto, qual o valor de a para tais clculos, j que ele est

embutido nas reas experimentais?

O fato que este valor pode ser estimado aplicando-se uma

regresso linear sobre os dados da Tabela 6. Esta regresso

exploratria resulta na equao:

A = 434,0 + 1493,4 C; r = 0,9981 (Equao 9)

de forma que o provisrio a = 434,0 pode ser substitudo na

Equao 9 para obterem-se valores bi correspondentes s

concentraes Ci.

Tabela 8. Valores do coeficientes

angulares (b) obtidos pelassubstituies de A e C (Tabela 7)

na Equao 9.Quando isto feito obtm-se os valores bi 1-3 listados na

Tabela 8. Os valores bi da Tabela 8 (que idealmente seriam

constantes), so submetidos ao teste de Huber (com k = 2)

resultando na rejeio de bi = 1169, 1713, 1343 e 1447 e

correspondentes valores de reas (785, 1976, 2448 e 1737) na

Tabela 7. Ento, s mdias das reas remanescentes e

correspondentes concentraes aplica-se a regresso linear,

obtendo-se a equao da curva analtica:1520134315241,5

1498152015151,2

1447171315130,9

1500150015120,6

1460116914600,3

bi 3bi 2bi 1C(g/L)

O critrio geral baseado no fato deque uma reta tem

coeficiente angular

constante.

A = 416,5 + 1533,8 C; r = 1,0000 (Equao 10).

Os resduos % calculados a partir desta Equao 9 so

(respectivamente da menor para a maior concentrao): + 0,5; 0,0; -

0,1; - 0,4 e 0,0, indicando que o critrio de aplicar o teste de Huber

aos valores bi (obtidos com a Equao 9 a partir de um valor

estimado de b conforme a Equao 10) adequado para obter uma

curva analtica com coeficiente linear diferente de zero. Este critrio

geral, de forma que tambm se aplica quando este coeficientelinear pode ser considerado como estatisticamente nulo.

14


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O uso do mtodo da padronizao interna

Os dois exemplos anteriores de obteno de curva analtica

foram baseados no Mtodo da Padronizao Externa (MPE), isto

, preparam-se vrias solues com concentraes diferentes do

analito e aplica-se na placa volumes iguais destas solues (Figura

12).

C = Q / V , de onde,

Q = V CV tem de ser constante

Figura 12. Representao esquemtica do princpio do Mtodo daPadronizao Externa (MPE).

O Mtodo da Padronizao Externa tem, dentre outras, uma

condio rgida: os volumes aplicados devem ser iguais, o que

dificilmente se consegue na prtica, de forma que as reas

cromatogrficas podem oscilar substancialmente, levando a

resultados como os apresentados na Tabela 9 e Figura 13.

Tabela 9. Conjunto de dados dereas e Concentraes. Os dados

com sombreado foram rejeitadosaps o teste de Huber. A

correspondente curva analtica mostrada na Figura 13.

0

400

800

0 0,5 1 1,5 2

A = 0,22 + 461,1 C ; r = 0,9999

6926246931,5

5485545531,2

3104574160,9

2583792770,6

1351801380,3

A3A2A1C(g/L)

Figura 13. Grfico e equao da curva analtica obtida para os dados daTabela 9.

A curva analtica acima s tem aparncia de boa qualidade,

pois ela foi obtida depois que oito dos quinze dados originais foram

rejeitados pelo teste de Huber. Isto certamente demasiado, pois

foram rejeitadas mais de 50 % da informao. Este problema, que

ocorreu por excessiva flutuao dos volumes de amostra aplicados,

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pode ser contornado com o Mtodo da Padronizao Interna

(MPI).

O mtodo da padronizao interna

O MPI consiste em adicionar s solues usadas para obter

a curva analtica um composto, de forma que sua concentrao seja

a mesma em todas as solues (Figura 14). Este composto

denominado de padro interno (PI).

Figura 14. MPI: cinco solues do analito com concentraes variadas, squais adicionado o PI em concentrao nica.

Depois de preparadas as solues do analito mais o PI elas

so aplicadas na placa, efetua-se a corrida cromatogrfica e medem-

se as reas. As reas do analito (variveis) so divididas pela rea

do PI (que deveria ser constante), obtendo-se as razes de rea, Rz(A). As concentraes do analito so divididas pela concentrao

(valor nico) do PI, obtendo-se as razes de concentrao Rz (C).

Para o exemplo em questo estes dados esto na Tabela 10.

Agora a curva analtica do tipo Rz (A) vs Rz (C),

supostamente uma reta. Portanto, o teste de Huber aplicado sobre

os quocientes Rz (A) / Rz (C) que correspondem inclinao da

curva Rz (A) vs Rz (C). Com isto so rejeitados os dados destacados

em sombreado na Tabela 11.

Aos dados no rejeitados aplica-se a regresso linearobtendo-se a seguinte equao de reta:

1,651,461,6015

1,261,301,3112

0,961,090,979

0,590,860,646

0,320,400,333

Rz(A3)Rz(A2)Rz(A1)Rz (C)

0,1100,0970,10615

0,1050,1090,10912

0,1070,1210,1089

0,0980,1440,1066

0,1070,1330,1103

Rz (A3)/ Rz(C)

Rz (A2)/ Rz(C)

Rz (A1)/ Rz(C)

Rz(C)

Tabela 11. Rz (C) e Rz (A)(triplicata) s quais aplicado o

teste de Huber. Os dadosdestacados foram rejeitados.

Tabela 10. Triplicatas dasRazes de Concentrao

e Razes de rea.

O mtodo dapadronizao

interna atenua osproblemas oriundos

da incerteza dovolume de amostra

aplicado.

C = 0,1

C = 1,2 1,50,90,60,3

Rz (A) = - 0,006 + 0,1083 Rz (C) (Equao 11)

r = 0,9999

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Esta equao permite interpolar razes de reas (a partir

das correspondentes razes de concentrao com os seguintes

resduos: -1,9; +0,6; +0,4; +0,3; -0,4.

Estes resultados so melhores do que os obtidos sem o

recurso do MPI, isto para os dados de reas e concentraes da

Tabela 6, quando oito de quinze dados foram rejeitados. Resta

Compreender o porque da melhora, o que simples: como o PI est

junto com o analito em todas as solues cromatografadas, a

oscilao de volume de uma aplicao para outra afeta, na mesma

proporo, as reas de ambos. Portanto, quando elas so divididas

o efeito da variao do volume aplicado atenuado.

Finalmente, para quantificar o analito na amostra, adiciona-

se a ela o PI na mesma concentrao usada anteriormente e, com a

razo de reas obtidas para a amostra interpola-se a correspondenterazo de concentraes e calcula-se a concentrao desconhecida

do analito.

Concluses

A anlise quantitativa implica na obteno de uma curva

analtica para o analito a ser quantificado. Dificilmente pode-se usar

outro composto para obter a curva, porque a sensibilidade de

resposta do detector (a inclinao da curva analtica) pode, alis

costuma, ser tpica do composto. Com a equao da curvainterpolam-se valores de quantidade (que pode ser concentrao

quando o volume aplicado constante) do analito em amostras

desconhecidas.

Extrapolaes no so vlidas, porque o comportamento

linear (s avaliamos curvas descritas por equaes do primeiro grau,

que so as mais comuns) s foi estabelecido na faixa estudada.

Para determinar a regio de linearidade usa-se o princpio da curva

de linearidade, apoiado num mtodo de identificao e rejeio de

dados anmalos os que desviam-se da linearidade por razesexperimentais. Caso a curva analtica tenha coeficiente linear igual

ou muito prximo de zero, a rejeio com o teste de Huber pode ser

realizada com sucesso diretamente sobre os quocientes de rea por

Concentrao (A/C - de fato, generalizando, Sinal/Quantidade).

Existindo coeficiente linear diferente de zero mais conveniente

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aplicar o teste sobre valores do coeficiente angular. Para tal

submete-se os pares rea, Concentrao a uma regresso linear

para obter uma equao tentativa, com a qual interpolam-se os

coeficientes angulares a serem inspecionados para rejeio como

este um mtodo geral, o mais conveniente seria tambm

aplic-lo para os casos de coeficiente linear igual ou muito

prximo de zero. A inspeo final da qualidade e confiabilidade da

curva analtica obtida envolve o clculo dos resduos, avaliando-se

seus valores e sinais (pois, por exemplo, excesso de resduos

negativos ou positivos sugere algum erro experimental e,

consequentemente, repetio do experimento); claro que o total de

dados rejeitados tambm um fator importante. Uma faixa de

resduos compatvel com os recursos qumico analticos disponveis

e um coeficiente de correlao prximo da unidade sugerem que oprocedimento para obteno da curva analtica foi adequado.

No processo acima descrito o teste de rejeio de anmalos

fundamental. Propomos o uso do teste de Huber, porque ele

baseado na rejeio em relao a medianas um mtodo robusto,

pois independente dos anmalos. O teste de Huber implica na

definio do valor do fatork pelo analista, o que no deixa de ser

subjetivo. Contudo, a subjetividade baseada em conhecimentos da

metodologia analtica e pode ser avaliada para vrios valores de k,

buscando-se coerncia entre incertezas conseguidas com a curvaanaltica e as esperadas para metodologia analtica. Alm deste

procedimento eliminar uma subjetividade absoluta, ele tem como

grande vantagem a interao do analista com seus dados, o que

certamente aumenta a sua viso da metodologia analtica que tem

em mos. Finalmente, curvas analticas tem de ser obtidas com

muitos dados, o que torna impraticvel rejeies por inspees

visuais, assim como torna muito tedioso aplicar o teste de Huber

com clculos manuais, o que sugere o uso de recursos como uma

planilha eletrnica que, quando adequadamente estruturada,recalcula todos os dados quando se altera o valor de k.

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analise quantitativa cromatografia gasosa

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