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Cromatografia em Fase Gasosa e

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Aplicabilidade e Requisitos

Instrumentação Básica

Colunas e Detectores

COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S., Fundamentos da Cromatografia. Campinas, SP: Unicamp, 2006. capítulo 8.

Cromatografia em fase gasosa

Fase estacionária

Fase móvel Separação

Cromatografia

Detecção

Cromatografia em fase gasosa

Cromatografia

Coluna: contendo a fase estacionária está submetida à

temperaturas controladas

Fase móvel: gás inerte

Detector: submetido à temperatura controlada

Injetor: submetido à temperatura

controlada

Cromatografia em Fase Gasosa

Aplicabilidade

Quais misturas podem ser separadas por CG ?

Misturas cujos constituintes sejam VOLÁTEIS (=“evaporáveis”)

para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de um gás ela deve dissolver-se, pelo menos parcialmente, nesse gás.

DE FORMA GERAL: CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e que sejam termicamente estáveis.

Requisitos - Gás de arraste (FM)

INERTE: Não deve reagir com a amostra, nem com a fase estacionária ou superfícies do instrumento.

PURO: Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária.

Impurezas típicas em gases e seus efeitos

oxida / hidrolisa algumas FE

incompatíveis com DCE H2O, O2

hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC


Requisitos - Gás de arraste (FM)

CUSTO: Gases de altíssima pureza podem ser muito

caros.

COMPATÍVEL COM DETECTOR: Cada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento.

Seleção de Gases de Arraste em Função do Detector:

He , H2 DCT

DIC N2 , H2

DCE N2 (SS), Ar + 5% CH4

CUSTO

PUREZA

A B

C A = 99,995 %

B = 99,999 %

C = 99,9999 %


Injetor

Os dispositivos para injeção (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica

Injeção instantânea

Injeção lenta

t = 0

t = x

t = 0

t = x


Injetor “on column”

1

2

3

4

1 - Septo (silicone) 2 - Alimentação de gás de arraste) 3 - Bloco metálico aquecido 4 - Ponta da coluna cromatográfica


Injetor “on column”

1 2 3 1 - Ponta da agulha da microsseringa é introduzida no início da coluna.

2 - Amostra injetada e vaporizada instantaneamente no início da coluna.

3 - “Plug” de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela coluna.


Parâmetros de injeção


Temperatura do injetor: Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposição.

Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulição do

componente menos volátil.

Volume da injeção: Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra.

COLUNA Amostras Gasosas

Amostras Líquidas

empacotada = 3,2 mm (1/4”)

0,1 mL ... 50 mL 0,1 L ... 20 L

capilar = 0,25 mm 1 L ... 100 L 0,01 L ... 3 L

Sólidos:

convencionalmente

se dissolve em um

solvente adequado e

injeta-se a solução


Colunas

EMPACOTADA = 3 a 6 mm

L = 0,5 m a 5 m Recheada com sólido pulverizado

(FE sólida ou FE líquida depositada sobre as partículas do

recheio)

CAPILAR = 0,1 a 0,5 mm L = 5 m a 100 m

Paredes internas recobertas com um filme fino (fração de m) de

FE líquida ou sólida


Temperatura da coluna

Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0).

p0 = f Estrutura química do analito


Temperatura da

coluna

Pressão de

vapor

Velocidade de

migração

ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE (MENOR RETENÇÃO)



AU

ME

NT

O D

A

TE

MP

ER

AT

UR

A D

A C

OL

UN

A

CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA É ESSENCIAL

PARA OBTER BOA SEPARAÇÃO EM CG


Programação linear de temperatura

Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:

TCOL BAIXA:

Componentes mais voláteis são separados;

Componentes menos voláteis demoram a eluir, saindo como picos mal definidos.

TCOL ALTA:

Componentes mais voláteis não são separados;

Componentes menos voláteis eluem mais rapidamente.



A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação:

Consegue-se boa separação dos

componentes da amostra em menor

tempo

TEMPO

TEM

PERATURA

tINI tFIM

TINI

TFIM

R

TINI - Temperatura Inicial

TFIM - Temperatura Final

tINI - Tempo Isotérmico Inicial

tFIM - Tempo Final do Programa

R - Velocidade de Aquecimento



a) Isotérmico a 45 ºC; b) isotérmico a 145 °C; c) programado de 30 ºC a 180 ºC


Fase Estacionária REGRA GERAL: a FE deve ter características tanto quanto possível próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático ...)

FE SELETIVA (ideal): Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra.

FE Seletiva:

separação adequada dos constituintes da amostra

FE pouco Seletiva:

má resolução mesmo com coluna de boa eficiência


Fase estacionária sólida

O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE sólida é a ADSORÇÃO

A adsorção ocorre na interface entre o gás de

arraste e a FE sólida

• Sólidos com grandes áreas superficiais (partículas finas, poros)

• Solutos polares

• Sólidos com grande número de sítios ativos (hidroxilas, pares de elétrons...)

ADSORÇÃO


Fase estacionária líquida

O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE líquida é a ABSORÇÃO

A absorção ocorre no interior do filme de FE líquida

(fenômeno INTRAfacial)

• Filmes espessos de FE líquida

• Grande superfície líquida exposta ao gás de arraste

• Interação forte entre a FE líquida e o analito (grande solubilidade)

ABSORÇÃO


Fase estacionária quirais

As propriedades físico-químicas dos isômeros óticos são MUITO SIMILARES FE convencionais não interagem diferencialmente com os isômeros óticos.

FÁRMACOS - Em muitos fármacos apenas um dos isômeros óticos têm atividade farmacológica.

PRODUTOS BIOLÓGICOS - Distinção entre produtos de origem sintética e natural (natural = normalmente substâncias oticamente puras; sintético = muitas vezes são misturas racêmicas).


Detectores Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste.

Características ideais: 1. Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s. 2. Boa estabilidade e reprodutibilidade. 3. Resposta linear para solutos que se estenda por várias

ordens de grandeza. 4. Faixa de temperatura desde a ambiente até pelo menos

400 ºC. 5. Tempo de resposta curto e independente da vazão. 6. Alta confiabilidade e facilidade de uso. 7. Similaridade de resposta para todos os solutos. 8. Não destrutivo.


Detectores

Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma.

REGISTRO DE

SINAL

ANALÓGICO Registradores XY

DIGITAL Integradores Computadores


Detectores

UNIVERSAIS: Geram sinal para

qualquer substância eluída.

SELETIVOS: Detectam apenas

substâncias com determinada

propriedade físico-química.

ESPECÍFICOS: Detectam

substâncias que possuam

determinado elemento

ou grupo funcional em suas

estruturas

DCT (condutividade térmica)

DCE (captura eletrônica)

DNP

(nitrogênio e fósforo)

Detector por Ionização de Chama

O efluente da coluna é misturado com H2 e O2 e queimado. Como numa chama de H2 + O2 não existem íons, ela não conduz corrente elétrica.

Quando um composto orgânico elui, ele também é queimado. Como na sua queima são formados íons, a chama passa a conduzir corrente elétrica.

Quase todos os compostos orgânicos podem ser detectados pelo DIC (detector mais usado em CG)


Detectores – Espectrometria de massas CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico. Um dos

detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa é o espectrômetro de massas. Observa-se para qualquer substância eluída um sinal, mesmo que complexo, no espectrômetro de massa. É seletivo ou específico quando monitora-se um fragmento de determinada razão m/z.

Detecção TIC

(cromatograma íons totais)

Universal

Similar a DCT

SIM (cromatograma de íons selecionados)

Seletivo

Maior Sensibilidade


CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico.

TEMPO

CONTAGENS

MASSA / CARGA

CONTAGENS

Cromatograma de íons totais: TIM ou TIC

Em cada posição do cromatograma tem-se um espectro de massa.

Detectores – Espectrometria de massas


CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico.

TEMPO

CONTAGENS

Cromatograma de íons selecionados: SIM

Em cada posição do cromatograma tem-se o sinal somente da m/z selecionada.

MASSA / CARGA

CONTAGENS

Oferece a vantagem de registrar

somente o sinal do constituinte de interesse, sendo “cego” para os

demais.



CG-EM (GC-MS): Interface CG-EM.

CG EM

Vácuo

Separador Molecular O gás de arraste leve

(He) difunde mais rapidamente que o analito e tende a ser drenado

para o vácuo.

Câmara de Ionização

Coluna Capilar

Interface Capilar Direta Com colunas capilares a vazão baixa de gás de

arraste pode ser drenada pelo sistema de vácuo.


Cromatografia em Fase Líquida

30

SHIMADZU

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Aplicabilidade

Quais misturas podem ser separadas por CLAE ?

Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molar de 32 até 4000000.

para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um líquido ela deve dissolver-se nesse líquido.

DE FORMA GERAL: É aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes sejam solúveis na FM. Não há limitação de volatilidade ou de estabilidade térmica.


Tipos e

Aplicações da

Cromatografia

Líquida

Insolúvel em água Solúvel em água

Aumento de polaridade

Polar não iônico

Apolar Iônico

Mas

sa m

olecu

lar

102

103

104

105

106

Troca iônica

Partição

Partição em fase reversa

Partição em fase normal

Exclusão Permeação

em gel Filtração em gel

Adsorção

Componentes típicos - CLAE


Cromatografia em Fase Líquida Esquema de um equipamento para CLAE


Requisitos dos sistemas de bombeamento

1 – Geração de pressões até 6.000 psi

2 – Saída com ausência de pulsos

3- Velocidades de fluxo de 0,1 a 10 mL/min

4 – Controle e reprodutibilidade de fluxo de 0,5% ou melhor

5 – Componentes resistentes à corrosão

Bomba recíproca (também são chamadas de

bombas de pistão ou de diafragma)


Suportam pressões de até 7.000 psi

Volumes típicos: 5 a 500 L

Microamostragem: 0,5 a 5 L

Sistemas de injeção de amostras

Eluição isocrática: Quando a separação é feita utilizando um único solvente de composição constante;

Eluição com gradiente: São utilizados dois ou três sistemas

de solventes que diferem bastante entre si em polaridade; Depois que a eluição começa, a razão entre os solventes é

variada de modo programado, de forma contínua ou em passos.


A eluição com gradiente produz efeitos similares aos produzidos pela programação de temperatura na CG.

Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a polaridade requerida na separação.

Fase móvel para CLAE

Cromatografia em Fase Líquida Eluição com gradiente Coluna C18, 5 m, fase reversa

Detector fluorescência: excit. 334 nm – emis. 425 nm


Colunas para CLAE

As colunas geralmente são construídas de aço inox, embora

tubos de vidro com paredes resistentes sejam encontrados

ocasionalmente. No entanto, estes últimos são restritos a pressões

mais baixas do que 600 psi.

Existem comercialmente centenas de colunas empacotadas, diferindo entre sí no tamanho e na fase

estacionária. Preços variam de 200 a 500 dólares.


Colunas para CLAE

Pré-coluna

Remoção de material particulado

Contaminantes do solvente

Contaminantes da amostra

Saturar a FM com a FE

Aumenta a vida útil da coluna

COLUNAS TÍPICAS

Material: aço inox

Comprimento: 10 a 30 cm

Diâmetro: 4 a 10 mm

FE: Partículas de 5 a 10 m

Eficiência: 40 mil a 60 mil pratos/metro


Separação isocrática de alta velocidade

1– p-xileno

2- anisol

3- acetato de benzila

4- dioctil-ftalato

5- dipentil-ftalato

6- dibutil-ftalato

7- dipropil-ftalato

8- dietil-ftalato

- 4 cm de comprimento - 0,4 cm d.i. - FE: spherisorb 3 m

Coluna de alta velocidade e

alta eficiência

FM: 4,1% AcOEt em n-Hexano

100.000 pratos/metro

• Pelicular: Consiste de leitos de polímero ou vidro não-poroso,

esférico, com diâmetros típicos da ordem de 30 a 40 m, recoberto com uma camada fina e porosa de: Sílica Alumina Resina de poliestireno-divinil-benzeno Resina trocadora de íons

• Partícula porosa: Consiste de micropartículas porosas com diâmetros de

3 a 10 m. As partículas são constituídas dos mesmos materiais do recobrimento pelicular.


Basicamente são dois tipos de FE:

Fase estacionária para CLAE


Detectores As características desejáveis para os detectores para CLAE não são diferentes daquelas para CG. Existem dois tipos de detectores: Propriedades universais (índice de refração, densidade ou constante

dielétrica). Propriedades do soluto (absorbância, fluorescência, etc).

Características ideais: 1. Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s. 2. Boa estabilidade e reprodutibilidade. 3. Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de grandeza. 4. Tempo de resposta curto e independente da vazão. 5. Alta confiabilidade e facilidade de uso. 6. Similaridade de resposta para todos os solutos. 7. Não destrutivo. 8. Volume interno mínimo e compatível com a vazão e com a pressão.


Detectores

Absorbância - UV/Vis – S: 10-9g/mL

Fluorescência – S: 10-9 a 10-12g/mL;

Índice de refração (universal)–S: 10-7g/mL


Detectores

Eletroquímicos: existem vários tipos disponíveis atualmente. Embora não sejam tão explorados quanto os detectores ópticos, eles apresentam algumas vantagens como alta sensibilidade, simplicidade e ampla aplicabilidade.

• Amperométricos

• Coulométricos

• Condutométricos – S: 10-8 g/mL

• Polarográficos – S: 10-12 g/mL


Detectores Espectrometria de massas - universal

Assim como na CG-EM, o acoplamento de um espectrômetro de massa potencializa a técnica de separação e quantificação

Um grande problema é o descompasso entre os volumes relativamente grandes de solventes na CL e os requisitos de vácuo na EM.

Interface CL-EM


Detectores • Espectrometria de massas

TEMPO

CONTAGENS

MASSA / CARGA

CONTAGENS

TEMPO

CONTAGENS

MASSA / CARGA

CONTAGENS

TIC SIM


Tipos de CLAE

Ao contrário da CG, onde a FM se comporta como um gás ideal e não contribui para o processo de separação, a FM líquida da CLAE interage tanto quanto a FE com os componentes da amostra.

Isto torna o desenvolvimento dos métodos em CLAE um tanto mais complexo que na CG.


Tipos de CLAE

PARTIÇÃO: líquido-líquido e fase ligada. A diferença entre elas consiste em como a FE é mantida nas partículas do suporte do empacotamento Adsorção e ligação química. Dois tipos podem ser distinguidos: Fase normal e Fase reversa.

Fase normal: FE de natureza fortemente polar FM apolar O componente menos polar é eluído primeiro por ser o

mais solúvel na fase móvel. Fase reversa: FE de natureza apolar FM polar O componente mais polar aparece primeiro e o aumento da

polaridade da fase móvel aumenta o tempo de eluição.


Tipos de CLAE

• É provável que ¾ de toda a CLAE esteja baseada na fase reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses recobrimentos é uma cadeia C8 (n-octil) ou C18 (n-octadecil)


Tipos de CLAE

Campo Misturas típicas Farmacêutico Antibióticos, sedativos, esteróides,

analgésicos

Bioquímico Aminoácidos, proteínas, carboidratos, lipídios

Produtos alimentícios Adoçantes artificiais, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos

Produtos químicos Aromáticos condensados, surfactantes, propelentes, corantes industriais

Poluentes Pesticidas, herbicidas, fenóis, PCB (bifenilas policloradas)

Química forense Drogas tóxicas, venenos, álcool no sangue, narcóticos

Clínica médica Ácidos de bílis, metabólitos de drogas, extratos de urina, estrógenos

cromatografia em fase gasosa e cromatografia líquida de alta … · 2018. 11. 5. · variada de...

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