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Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPALaboratório Nacional Agropecuário - LANAGRO/MGDivisão Técnica Laboratorial - DLAB / Laboratório de Controle de Qualidade e Segurança Alimentar - LACQSA/BHMétodo de Ensaio – MET

Código: MET/LACQSA/BH/003 - V.4Fase: VigenteAprovado em: 04/06/2018

Determinação de aflatoxina B1 e ocratoxina A em fígado de ave e suíno e aflatoxinas BG e ocratoxina A em amêndoa de cacau por cromatografia líquida de alta eficiência e cromatografia líquida de ultra

eficiência

Aprovado por: Eugênia Azevedo VargasNilson César Castanheira Guimarães

Verificado por: Wagner de Souza

Elaborado/Revisado por: Leila Rodrigues Caldeira

1.0 Objetivos e alcanceO MET/LACQSA/BH/003 objetiva descrever os procedimentos analíticos a serem seguidos na determinação de

AFB1 e OTA, em fígado de aves e suíno, e AFBG e OTA, em amêndoa de cacau, e no registro dos dados

relacionados às análises, para que estes possam ser corretamente seguidos.

1.1 AbreviaçõesAs abreviações relativas às micotoxinas são conforme DS/LACQSA/BH/024.

CLAE = cromatografia líquida de alta eficiência

CV = DPR = desvio padrão relativo

FL = fluorescência

IAC = coluna de imunoafinidade

LMP = Limite máximo permitido

LD = limite de detecção

LQ = limite de quantificação

MC = material crítico

NQ = não quantificável

p.a. = para análise

p.a.r. = para análise de resíduos

PBS = solução tampão fosfato salina 0,1%

R = recuperação

tR = tempo de retenção

r2 = coeficiente de correlação

TP = solução trabalho “pool”

U = incerteza expandida

UHPLC = ultra high performance liquid chromatography

2.0 FundamentosEsta metodologia fundamenta-se na extração de AFB1 e OTA (para a matriz fígado) e AFBG e OTA (para a

matriz amêndoa de cacau), com solução de metanol: água (80:20, v/v), cloreto de sódio e bicarbonato de sódio,

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eficiência




filtração do extrato e diluição com PBS seguido de purificação por coluna de imunoafinidade contendo anticorpos

específicos para AFBG e OTA e separação, detecção e quantificação por CLAE/fluorescência. AFB1 e AFG1 são

derivatizadas em reação pós-coluna utilizando solução de tribrometo de piridínio ou utilizando célula

elotroqúimica (Kobra-cell). A reação resultante utilizando célula eletroquímica permite que as aflatoxinas B1, B2,

G1 e G2; possam ser derivatizadas in situ em seu derivado bromado, o que resulta em aumento da fluorescência

e consequente aumento da sensibilidade

2.1 Características do método

Este método foi desenvolvido, validado e otimizado pelo LAQCSA, conforme procedimento descrito no plano de

estudo PE 074 e seu respectivo relatório de validação. Os parâmetros de desempenho do método obtidos no

processo de validação encontram-se na Tabela 1.

A transferência de metodologia de quantificação de CLAE para UHPLC foi validada segundo

PE/LACQSA/BH/009 cujos resultados encontram-se no RE/VAL/LACQSA/BH/002.

O método sofreu uma ampliação de escopo para incorporar a matriz amêndoa de cacau e contemplar os

analitos aflatoxinas B2, G1 e G2. Tal procedimento foi realizado de acordo com o PE/LACQSA/BH/017 v.2 e os

resultados da validação estão registrados no REL/VAL/LACQSA/004 v.2. A Tabela 2 apresenta os parâmetros

de desempenho dessa ampliação de escopo.

Tabela 1: Parâmetros de desempenho do método obtidos no processo de validação da análise de AFB1 e OTA em

fígado suíno e de aves.

Parâmetros de Desempenho Critérios Valor determinado Aprovação

Seletividade/ Efeito matriz

Ausência de interferentes no tempo de retenção de AFB1 e OTA – uso de IAC

Ausência de interferentes no tempo de retenção Sim

Recuperação (%)

Segundo DE/LACQSA/BH/029:

Concentração ≤ 1 µg/kg - 50 % a 120%

Concentração de 1 µg/kg a10 µg/kg - 70 % a 110%

AFB1- 97, 87 e 93%

OTA - 86, 81, e 85%Sim

RepetitividadeConcentração ≤ 1 µg/kg - 23,3%

1 µg/kg (ppb) < Concentração < 10 µg/kg- 20%

CV AFB1 – 1 a 8%

CV OTA – 3 a 14% Sim

Precisão Intermediária

Concentração ≤ 1 µg/kg – 35%

1 µg/kg (ppb) < Concentração < 10 µg/kg- 30%

CV AFB1 – 10 a 14%

CV OTA – 6 a 15%Sim





eficiência





LD

(µg/kg)- LD = 0,25 µg/kg Sim

LQ (µg/kg)

Concentração ≤ 1 µg/kg - 50 % a 120%

Concentração de 1 µg/kg a10 µg/kg - 70 % a 110%

Foram utilizados controles artificialmente contaminados

0,50 ± 0,20 µg/kg

CV repetibilidade. AFB1 5,33%

CV repetibilidade. OTA 14%

CV precisão intermediária AFB1 14%

CV precisão intermediária OTA 15%

Recuperação AFB1 = 82 a 112%

Recuperação OTA = 78 a 91%

Sim

Limite de decisão (CCα)

Estima-se como LMP – 0,50 µg/kg

AFB1 – 0,50 µg/kg OTA – 0,50 µg/kg

AFB1 – 0,62µg/kg

OTA – 0,65 µg/kg Sim

Capacidade Detecção (CCβ)

Estima-se como LMP– 0,50 (µg/kg)

AFB1 – 0,50 µg/kg OTA – 0,50 µg/kg

AFB1 – 0,75 µg/kg

OTA – 0,71 µg/kgSim

Incerteza de medição (k=2) - 0,50 ± 0,20 µg/kg (~30%) Sim

Avaliação do tempo de estabilidade da solução derivatizante pyridinium hidrobromide perbromide e

Pyiridinium Tribromide r2 > 0,95 - após ~ 26 h de análise Sim

Avaliação do comportamento da AFB1 e OTA com relação à temperatura do forno da coluna Confirmação pelo teste F(95%) Sim

Avaliação do uso de diferentes derivatizantes derivatizante pyridinium hidrobromide perbromide e Pyiridínium

Tribromide

Confirmação pelo teste F(95%)Sim

Robustez

Avaliação da mudança no método de detecção e quantificação

Recuperação (%) e RSD (%) Sim

Faixa de Trabalho Faixa da validação 0,5 a 1,5 µg/kg

Faixa da curva de calibração

Amostra que exceda uma concentração maior que a faixa da curva deverá ser diluída de forma que a concentração

esteja dentro da faixa de trabalho.

Concentração entre 0,00200 a 0,00020 µg/mL de AFB1 e OTA

Correspondente a ~3,2 a 0,32 µg/kg de AFB1 e OTA na amostra

Sim





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Tabela 2: Parâmetros de desempenho do método obtidos no processo de validação da análise de aflatoxinas B1, B2,

G1 e G2 e ocratoxina A em amêndoa de cacau e fígado suíno e de aves.

Parâmetros de Desempenho Critério Valor determinado Aprovação

Repetibilidade

Equação de HorwitzRSDHorwitz = 2(1-0,5.log C)

c = Cµg/kg x 10-9

(Critérios de aceitabilidade segundo DE/LACQSA/BH/029)

Aflatoxinas: Concentração 1µg/kg → CV 30%

1µg/kg ≤ concentração ≤ 10µg/kg → CV 24%

Concentração> 10µg/kg → CV 21%OTA:

Concentração 1µg/kg → CV 40%Concentração ≥ 1µg/kg → CV 20%

AFB1 = 0,49% CV 7,66%AFB2 = 0,21% CV 16%

AFG1 = 0,50% CV 9,79%AFG2 = 0,21% CV 14,99%AFBG = 0,21% CV 8,26%OTA = 0,11% CV 16,62%

Sim

Precisão intermediária

(Critérios de aceitabilidade segundo DE/LACQSA/BH/029)

Aflatoxinas: concentração 1µg/kg → CV 45%

1µg/kg ≤ concentração ≤ 10µg/kg → CV 36%

Concentração > 10µg/kg CV → 32%OTA:

Concentração 1µg/kg → CV 60%Concentração ≥ 1µg/kg → CV 30%

AFB1 = 7,36% CV 11,53%AFB2 = 5,88% CV 13,93%AFG1 = 8,76% CV 13,16%

AFG2 = 12,73% CV 18,54%AFBG = 7,96% CV 11,34%OTA = 4,40% CV 17,63%

Sim

Veracidade

Ensaios de recuperação (critérios segundo DE/LACQSA/BH/029)

Aflatoxinas: Concentração < 1 µg/kg → 50 a 120%

1µg/kg ≤ Concentração ≤ 10µg/kg → 70 a 110 % e

Concentração >10 µg/kg →80 a 110OTA:

Concentração 1µg/kg → 50 a 120%Concenração ≥ 1µg/kg → 70 a 110%

AFB1 = 67% - 99%AFB2 = 65% - 106%AFG1 = 70% - 108%AFG2 = 52% – 103%AFBG = 68% - 99%OTA = 59% - 108%

Sim

LD (µg/kg) -

AFB1 = 0,25 µg/kgAFB2 = 0,050 µg/kgAFG1 = 0,25 µg/kg

AFG2 = 0,050 µg/kgAFBG = 0,60 µg/kgOTA = 0,25 µg/kg

Sim

LQ e sua incerteza com - AFB1 = 0,50 ± 0,20 µg/kg Sim





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95% de confiança e k=2 AFB2 = 0,100 ± 0,067 µg/kgAFG1 = 0,50 ± 0,21 µg/kg

AFG2 = 0,100 ± 0,067 µg/kgAFBG = 1,20 ± 0,31 µg/kgOTA = 0,50 ± 0,20 µg/kg


Seletividade / especificidade - Ausência de interferente no tR de OTA e

das AFBG - uso IAC Sim

Faixa da curva de calibração -

AFB1 = 0,14 – 25,42 µg/kgAFB2 = 0,03 – 8,86 µg/kg

AFG1 = 0,14 – 24,47 µg/kgAFG2 = 0,03 – 8,90 µg/kgOTA = 0,56 – 47,27 µg/kg

Sim

Limite de Decisão (CCα) -

AFB1 = 0,55AFB2 = 0,13AFG1 = 0,56AFG2 = 0,14AFBG = 1,38OTA = 0,64

Sim

Capacidade de Detecção (CCβ)

AFB1 = 0,61AFB2 = 0,16AFG1 = 0,62AFG2 = 0,17AFBG = 1,55OTA = 0,77

Sim

2.2 Aplicabilidade

O método validado utilizando CLAE/FL é aplicável à determinação de AFB1 e OTA para os grupos de matrizes

descritos no DS/LACQSA/BH/004.

3.0 Reagentes, padrões, materiais e insumosVidrarias e outros materiais de uso na rotina necessário à análise deverão ser solicitados à Unidade de Preparo

de Material pelo preenchimento do formulário FOR/LACQSA/BH/025.

Quando for identificada a necessidade da aquisição de materiais indisponíveis em estoque, seguir

procedimentos descritos na IS/LACQSA/BH/005.

3.1 Vidraria em geral

Nota 1: As vidrarias identificadas como MC deverão ser calibradas e/ou terem desempenho satisfatório na verificação

de desempenho segundo procedimento específico do LACQSA.





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- aparato para filtração a vácuo com reservatório de 300 mL e base do funil de 47 mm com rolha para conexão

ao kitasato;

- balões volumétricos âmbar ou provetas graduadas de 100 mL;

- balões volumétricos de 1000 e 2000 mL;

- béqueres de 100 e 600 mL ou equivalentes;

- erlenmeyer, com tampa, capacidade de 125 ou 250 mL;

- frasco de vidro borossilicato, para padrão, transparente, reutilizável, com fundo duplo, fundo interno cônico

capacidade de 5, 10 e 20 mL ou;

- frasco para padrão, de vidro silanizado, âmbar com tampa sólida de rosca revestida com PTFE capacidade de

2, 4, 7, 15 e 30 mL;

- frascos de vidro borossilicato, âmbar ou transparente, capacidade de 1000, 2000 e 4000 mL, com tampas, para

armazenamento das fases móveis dos cromatógrafos;

- frascos de vidro com capacidade para aproximadamente 1 L, tipo Mason ou equivalente;

- funil de haste curta com 07 cm de diâmetro;

- kitasatos de 300 ou 500 e 1000 mL ou equivalente;

- pipetas de Pasteur;

- pipetas volumétrica de 10 mL, com erro máximo permitido de ± 0,02 (MC);

- provetas graduadas de 10 mL;


- provetas graduadas de 250 mL (MC);



- seringas de polipropileno de 60 mL ou reservatório, tipo luer ou equivalente;

- seringas de vidro de 10 mL, tipo luer ou equivalente;

- tubos de ensaio de 5-10 mL ou tubo de vidro, 5 mL, 12 x 75mm.





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3.2 Colunas e unidades filtrantes

- colunas de imunoafinidade tipo AflaOchra ou equivalente (MC).

- filtro descartável para seringa com membrana PTFE hifrofóbica, com tamanho de poro de 0,2 micrometro (MC);

- membrana de fibra de vidro com 55 mm de diâmetro, 1 µm, tipo Whatman GF/B ou equivalente (MC)

- membrana filtrante HA em éster de celulose, de 0,45 µm de poro, 47 mm de diâmetro, branca, lisa, para

filtração de água;

- membrana filtrante de poliamida; Porosidade: 0,45 µm de poro, 47 mm de diâmetro, branca, lisa para filtração

de solventes orgânicos;

- papel de filtro qualitativo pregueado com 24 cm de diâmetro, ou equivalente, para filtração rápida.

3.3 Padrões e materiais de referência

- materiais de referência certificados (MRC) e padrões analíticos de AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 e OTA (MC).

3.4 Materiais de suporte

- adaptadores para tubos de 1, 3 e 6 mL, tipo Bond – elut, Varian ou equivalente;

- barra magnética;

- bastão, em vidro borossilicato;

- bulbos conta-gotas;

- cuba para recolher materiais limpos e utilizados;

- dispensete (dispensador);

- dispositivo para medição de aproximadamente 5 g de cloreto de sódio

- espátulas;

- gás nitrogênio, industrial ou ar comprimido seco;

- garra com 3 hastes;

- garra para conexão das partes do aparato de filtração;

- grades para tubos;

- hélice de aço inoxidável;





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- papel toalha ou guardanapo;

- parafilme;

- pêra de borracha ou pipetador automático ou equivalente;

- papel alumínio;

- pissetas;

- ponteiras para micropipetas automáticas para as faixas de volumes de 20 a 100, 50 a 250, 100 a 1000 e 200 a

1000, 500 a 5000, 500 a 2500 e 1000 a 10000 µL;

- torneiras de polipropileno ou teflon, tipo bond-elut, Varian ou equivalente.

3.5 Material para quantificação

3.5.1 Material para quantificação por CLAE

- coluna C18, 250 x 4,6 mm, partículas de 5 µm, Shimadzu que apresente perfil cromatográfico característico

para o sinal de OTA, AFB1, AFB2, AFG1 e AFG2, previsto neste método (MC);

- frascos para injetor automático para cromatógrafo líquido de 1 ou 2 mL com tampa snap-cap ou equivalente;

- pré-coluna de C18 com partículas de 5 µm ou equivalente, compatível com a coluna (MC);

- membrana eletroquímica (kobra cell) para derivatização pós-coluna das aflatoxinas B1 (MC).

3.5.2 Material para quantificação por UHPLC

- coluna C18, 150 x 2 mm, partículas de 2,2 µm, Shimadzu que apresente perfil cromatográfico característico

para o sinal de OTA, AFB1, AFB2, AFG1 e AFG2, previsto neste método (MC);

- frascos para injetor automático para cromatógrafo líquido de 1 ou 2 mL com tampa snap-cap ou equivalente;

- pré-coluna de C18 com partículas de 4,6 µm ou equivalente, compatível com a coluna (MC);

- membrana eletroquímica (kobra cell) para derivatização pós-coluna das aflatoxinas B1 (MC).

3.6 Reagentes, solventes e soluções

3.6.1 Reagentes e solventes





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- acetonitrila;

- ácido acético;

- ácido nítrico 4 M;

- água tipo I é recomendada (em caso da não disponibilidade de água tipo I, usar tipo II ou água deionizada

filtrada em membrana de 0,45 m);

- bicarbonato de sódio;

- cloreto de potássio;

- cloreto de sódio;

- diiidrogenofosfato de potássio;

- hidrogenofosfato dissódico anidro;

- tribrometo de piridínio (MC);

- metanol (MC);

- metanol;

- tolueno;

- tween 20.

3.6.2 Soluções

- água deionizada: ácido acético (29:1, v/v), filtrada em membrana de 0,45 m.

- solução tampão PBS;

- soluções padrão trabalho de AFB1/OTA em tolueno: ácido acético (99:1, v/v) (MC);

- soluções padrão trabalho de AFBG em tolueno: acetonitrila (9:1, v/v) (MC);

- soluções padrão trabalho de OTA em tolueno: ácido acético (99:1, v/v) (MC);

- metanol: água (2:3, v/v).

- solução padrão estoque de AFB1 (MC);

- solução padrão estoque de AFB2 (MC);

- solução padrão estoque de AFG1 (MC);





eficiência




- solução padrão estoque de AFG2 (MC);

- solução padrão estoque de OTA (MC);

- solução tampão PBS tween 0,01%;

- tolueno: acetonitrila (9:1, v/v);

- tolueno: ácido acético (99:1, v/v);

- água: ácido acético (29:1, v/v)

- ácido nítrico 4 M

3.6.3 Soluções para cromatografia líquida

- metanol: acetonitrila: ácido acético 1% (22:22:56 v/v/v);

- metanol: acetonitrila: ácido acético 1% (30:30:40 v/v/v);

- metanol: acetonitrila: água: ácido acético (35:35:29:1 v/v/v/v);

- solução padrão de AFB1 e OTA para curva de calibração em metanol: água (3:1 v/v);

- solução padrão de AFBG para curva de calibração em metanol: água (2:3 v/v);

- solução padrão de OTA para curva de calibração em metanol: acetonitrila: água: ácido acético (35:35:29:1,

v/v/v/v);

- solução de tribrometo de piridínio 50 mg/mL;

- água: acetonitrila: metanol (6:2:2, v/v/v) + KBr + ácido nítrico 4M

4.0 Equipamentos

Utilizar os equipamentos conforme os procedimentos descritos nas suas respectivas instruções de trabalho (IT),

na PLN/LACQSA/BH/001, no DS/LACQSA/BH/003 e no POP/LACQSA/BH/002, considerando a adequação dos

instrumentos aos requisitos e especificações necessárias à adequada execução deste MET.

4.1 Equipamentos críticos

- cromatógrafo líquido de alta eficiência com detector de fluorescência;

- cromatógrafo líquido de ultra alta eficiência com detector de fluorescência;





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- balança de 4 casas decimais, com resolução 0,0001g, calibrada;

- balança de 2 casas decimais, com resolução 0,01g, calibrada;

- micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 100 a 1000µL ou 200 a 1000µL, com menor

divisão de escala de 2 µL ou menor;

- micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 50 a 250µL ou 20 a 100µL ou 10 a 100µL ou

20 a 200µL com menor divisão de escala de 0,2 µL ou menor;

- micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 500 a 2500µL com menor divisão de escala

de 2 µL;

- micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 500 a 5000µL com menor divisão de escala

de 2 µL;

- micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 1000 a 10000µL com menor divisão de

escala de 20 µL ou menor;

- célula eletroquímica Kobra Cell para derivatização pós-coluna;

- termômetro ou termopar calibrados;

- sistema de purificação com controle individual de vácuo, com capacidade de manter um fluxo de 2 mL/min.

4.2 Equipamentos de suporte

- agitador de tubos;

- agitador magnético;

- aparelho de ultrassom;

- banho de aquecimento com agitação com controle da temperatura 40° C ±10%;

- capelas de exaustão;

- cronômetro temporizador digital;

- homogeneizador de amostras com capacidade de atingir 800 rpm;

- freezer – capacidade de atingir temperaturas ≤ -15° C;

- geladeira – capacidade de atingir temperaturas de 2 a 8 °C;





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- sistema de filtração a vácuo.

5.0 Precauções analíticasAs aflatoxinas possuem efeitos hepatogênicos, teratogênicos e mutagênicos. A ocratoxina A é hepatóxica,

imunossupressora, teratogênica, nefratóxica e nefrocarcinogênica (Kőszegi & Poór, 2016; IARC, 1993). Padrões

de aflatoxinas e ocratoxina A, sólidos e suas respectivas soluções, devem ser manipulados como substâncias

tóxicas. Os padrões sólidos devem ser manipulados com extremo cuidado, devido à sua natureza eletrostática e

à sua tendência de se dispersar no ambiente.

Para os procedimentos relacionados às condições ambientais e segurança, consultar o POP/LACQSA/BH/003.

Todo o procedimento analítico deve ser realizado em local apropriado, com precauções particulares como

utilização de equipamentos de proteção individual (luvas, guarda-pó, máscara, sempre que necessário, e

sapatos fechados), evitando qualquer contato de padrões com a pele e/ou os olhos. Em caso de contato com a

pele, lavar com solução de hipoclorito de sódio 1%, sabão e água em abundância e procurar assistência médica.

Utilizar vidraria limpa, livre de detergente e resíduos e descontaminar o material utilizado ao final da análise,

conforme o IP/LACQSA/BH/001.

Toda vidraria utilizada para acondicionamento/armazenamento dos extratos finais das amostras, assim como

das soluções padrões, incluindo “vials” novos utilizados nos cromatógrafos, deve ser tratada com ácido sulfúrico

2mol/L, de acordo com os procedimentos descritos na IP/LACQSA/BH/001. Os frascos utilizados para

armazenamento de padrões e suas respectivas soluções devem ser âmbares ou envoltos em papel alumínio

para proteção contra a luz.

Em casos de derrames acidentais de soluções padrões, descontaminar a área com solução de hipoclorito de

sódio a 1%, deixar em contato por 5 minutos e adicionar solução de acetona a 5%. Resíduos de soluções

padrões a serem descartados devem ser descontaminados com solução de hipoclorito de sódio a 1%. Após

contato de 2 horas, adicionar quantidade de acetona correspondente a 5% do volume. Após contato de 30

minutos, enxaguar completamente em água corrente e deionizada.





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A manipulação de solventes e/ou reagentes, bem como de resíduos, das análises deve ser realizada com

cuidado, considerando a natureza de cada um, a ficha de informação de segurança de produtos químicos

(FISPQ) e o POP/LACQSA/BH/004.

A instalação de colunas cromatográficas deve ser feita utilizando um fluxo de 0,01 mL/min da fase móvel, para

evitar a entrada de bolhas de ar nos detectores. Observa-se a saída de bolhas na saída da coluna e somente ao

cessar a saída das bolhas e que a coluna pode ser conectada ao detector.

Visando aumentar a vida útil das colunas cromatográficas de fase reversa (C18), pode-se usar pré-colunas de

C18. Ao término das análises, lavar e armazenar a coluna em solventes orgânicos como metanol ou acetonitrila.

Quando se observar anomalias referentes à simetria do sinal cromatográfico, separação e alteração de pressão,

avaliar a possibilidade da troca inicial da pré-coluna. Se não, avaliar outros parâmetros cromatográficos. Se

necessário, trocar a coluna. A manutenção do desempenho da coluna deve ser observada levando-se em

consideração os parâmetros de resolução de pico, número de pratos teóricos e tempo de retenção.

O FOR/LACQSA/BH/054 referente ao controle de colunas cromatográficas deverá ser preenchido a cada análise

e deverá ser arquivado na pasta do cromatógrafo no qual a coluna foi instalada.

6.0 ProcedimentosO analista deve verificar quais amostras deverão ser analisadas, inclusive aquelas para fins de controle de

qualidade intralaboratorial conforme o POP/LACQSA/BH/009, em acordo com o Responsável.

As amostras devem ser solicitadas à URPA pelo preenchimento do FOR/LACQSA/BH/024. Estas serão

entregues acompanhadas dos respectivos formulários de acompanhamento de amostras FOR/LACQSA/BH/012

e FOR/LACQSA/BH/114.

O FOR/LACQSA/BH/010 deverá ser preenchido com os dados pertinentes. Caso sejam anexados registros da

técnica de detecção ou folhas adicionais, estas deverão ser rubricadas e numeradas ao final da análise de forma

que cada folha seja identificada com o número total de folhas e número da folha.

No caso de realização de controle de reagente, seguir os procedimentos constantes na IS/LACQSA/BH/002.

6.1 Preparo de soluções

Os volumes e massas propostos para preparo das soluções reagentes podem ser ajustados para atender as





eficiência




necessidades das análises respeitando as devidas proporções.

As soluções utilizadas como fases móveis nos cromatógrafos podem ter as proporções preparadas utilizando as

bombas ou linhas dos equipamentos.

Antes de serem transferidas para os cromatógrafos, as fases móveis devem ser desgaseificadas em ultrassom

por 10 a 15 minutos para retiradas de bolhas de ar adsorvidas nas soluções.

- Água: ácido acético 1%

Adicionar 10 mL ácido acético à 990 mL de água deionizada, homogeneizar. Se a água utilizada não for tipo I ou

tipo II a solução deve ser filtrada em membrana de 0,45 m.

- Solução tampão PBS com tween 20 a 0,01%

Dissolver individualmente 0,20 g de diidrogenofosfato de potássio; 1,20 g de hidrogenofosfato dissódico anidro;

8,0 g de cloreto de sódio e 0,2 g de cloreto de potássio em água deionizada e transferir para um balão

volumétrico de 1000 mL. Acrescentar 0,1 mL de tween 20 completar o volume e homogeneizar.

- Metanol: acetonitrila: ácido acético 1% (22:22:56 v/v/v) – Fase móvel

Adicionar 220 mL de metanol e 220 mL de acetonitrila a 560 mL da solução água: ácido acético 1% e

homogeneizar.

- Metanol: acetonitrila: ácido acético 1% (30:30:40 v/v/v) – Fase móvel

Adicionar 300 mL de metanol e 300 mL de acetonitrila a 400 mL da solução água: ácido acético 1% e

homogeneizar.

- Água: ácido acético (29:1 v/v)

Adicionar 10 mL ácido acético a 290 mL de água e homogeneizar. Se a água utilizada não for tipo I ou tipo II a

solução deve ser filtrada em membrana de 0,45 µm.

- Metanol: acetonitrila: água: ácido acético (35:35:29:1 v/v/v/v)

Adicionar 300 mL da solução água: ácido acético (29:1 v/v) à mistura de 350 mL de metanol e 350 mL de

acetonitrila e homogeneizar.





eficiência




- Ácido nítrico 4 M

Preparar a solução de ácido nítrico 4 M considerando a porcentagem e a densidade do ácido nos cálculos. Por

exemplo: Para preparo de 100 mL da solução 4M, partindo de um ácido nítrico: d=1,4 g/mL, MM = 63,01 e 65%:

Medir 28 mL (27,7 mL) do ácido e adicionar a 72 mL de água.

- Água: acetonitrila: metanol (6:2:2 v/v/v) + KBr + ácido nítrico 4M

Adicionar 400 mL de metanol e 400 mL de acetonitrila em 1200 mL de água.

Adicionar 240 mg de KBr e 700 µL de ácido nítrico 4M à 2000 mL da fase móvel água: acetonitrila: metanol

(6:2:2 v/v/v), filtrar e homogeneizar.

- Metanol: água (8:2 v/v)

Adicionar 20 mL de água em 80 ml de metanol.

- Solução de tribrometo de piridínio 50 mg/mL – Derivatizante

Dissolver 50 mg de tribrometo de piridínio em 1000 mL de água deionizada filtrada ou água tipo I ou tipo II,

homogeneizar em ultrassom até completa dissolução.

- Tolueno: acetonitrila (9:1 v/v)

Adicionar 10 mL de acetonitrila em 90 mL de tolueno e homogeneizar.

- Tolueno: ácido acético (99:1 v/v)

Adicionar 1 mL de ácido acético a 99 mL de tolueno e homogeneizar.

6.1.1 Preparo da solução padrão de AFB1 e OTA

As soluções padrão de AFB1/OTA (estoque, intermediária e trabalho) devem ser preparadas conforme

procedimentos descritos na IP/LACQSA/BH/003. Durante a manipulação das soluções padrões:

- Retirar os frascos do freezer para ambientação da temperatura, e colocá-los em suportes adequados e em

ambiente protegidos da luz.

- Homogeneizar a solução padrão antes da retirada da alíquota desejada.





eficiência




- Ao abrir o frasco de solução padrão para retirada da alíquota desejada, fazê-lo sempre em capela, com a

guilhotina abaixada, porém com a exaustão desligada.

- Após a retirada da alíquota desejada da solução padrão, selar imediatamente o frasco e retorná-lo para

armazenamento no freezer.

Os cálculos utilizados no preparo deverão ser realizados utilizando a PLN/LACQSA/BH/013, a qual deve ser

impressa para que registros e informações, referentes aos procedimentos de preparo das soluções padrão,

sejam inseridos nos campos apropriados.

Quando for utilizar as soluções padrões de AFBG e OTA seguir as recomendações presentes nos métodos

MET/LACQSA/BH/001 e MET/LACQSA/BH/005.

6.1.2 Solução trabalho “Pool” de AFB1/OTA

- Retirar uma alíquota apropriada da solução estoque, ou da intermediária de OTA e de AFB1, utilizando

vidraria ou micropipeta automática devidamente calibrada.

- Transferir para um balão volumétrico calibrado e diluir para obter a concentração de aproximadamente 0,2 a

0,5 μg/mL para AFB1 e OTA pela adição de tolueno: acetonitrila (9:1 v/v) e homogeneizar. O volume ou

concentração desejada pode ser obtido por adição do volume necessário de tolueno: acetonitrila (9:1 v/v)

utilizando micropipetas ou pipetas automáticas calibradas, dispensando o uso de balão volumétrico calibrado.

Agitar por, no mínimo, 1 minuto em agitador de tubos, em alta velocidade.

- Os cálculos utilizados no preparo deverão ser realizados utilizando a PLN/LACQSA/BH/013, a qual deve ser

impressa para que registros e informações, referentes aos procedimentos de preparo das soluções padrão

sejam inseridos nos campos apropriados.

Quando for utilizar as soluções de trabalho de AFBG e OTA seguir as recomendações presentes nos métodos

MET/LACQSA/BH/001 e MET/LACQSA/BH/005.

6.1.3 Soluções padrão para curva de calibração

Os cálculos utilizados no preparo das soluções para a curva de calibração devem ser realizados utilizando a

PLN/LACQSA/BH/018, a qual deve ser impressa para que registros e informações, referentes aos

procedimentos de preparo das soluções padrão, sejam inseridos nos campos apropriados.





eficiência




A partir da solução trabalho AFB1/OTA, com concentração de aproximadamente 0,2 a 0,5 µg/mL em solução de

tolueno: acetonitrila (9:1 v/v), preparar uma curva padrão de calibração de AFB1/OTA em metanol: água (3:1

v/v), com no mínimo cinco níveis de concentração, aproximadamente iguais àqueles apresentados na Tabela 3.

Tabela 3: Faixas de concentrações aproximadas para o preparo da curva de calibração de AFB1/OTA

Concentração da solução preparada (μg/mL) Concentração na amostra (µg/kg)Código da solução preparada AFB1 OTA AFB1 OTA

P1 0,00200 0,00200 3,2 3,2

P2 0,00150 0,00150 2,4 2,4

P3 0,00100 0,00100 1,6 1,6

P4 0,00050 0,00050 0,8 0,8

P5 0,00025 0,00025 0,4 0,4

P6 0,00020 0,00020 0,32 0,32

Tabela 4: Concentração das soluções padrão da curva de calibração e respectiva faixa de contaminação equivalente

na amostra, considerando 20 gramas de amostras de amêndoa de cacau extraída com 230 mL do solvente de

extração utilizando os métodos MET/LACQSA/BH/001 e MET/LACQSA/BH/005 para a quantificação.

Concentração da solução preparada (µg/mL) Contaminação aproximada na amostra (µg/kg)Código da solução

preparada AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 OTA AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 OTA

P1 0,00995 0,00202 0,01004 0,00212 0,01956 22,88 4,64 23,08 4,88 44,99

P2 0,00497 0,00101 0,00502 0,00106 0,00978 11,44 2,32 11,54 2,44 22,49

P3 0,00250 0,00051 0,00252 0,00053 0,00489 5,74 1,17 5,79 1,22 11,25

P4 0,00122 0,00025 0,00123 0,00026 0,00240 2,81 0,57 2,83 0,60 5,52

P5 0,00059 0,00012 0,00059 0,00012 0,00119 1,35 0,27 1,36 0,29 2,75

P6 0,00029 0,00006 0,00029 0,00006 0,00062 0,66 0,13 0,67 0,14 1,42

P7 0,00015 0,00003 0,00015 0,00003 0,00034 0,34 0,07 0,34 0,07 0,77

P8 0,00006 0,00001 0,00006 0,00001 0,00024 0,14 0,03 0,14 0,03 0,56Nota 2: A faixa de contaminação de AFB1/OTA e de AFBG/OTA apresentada nas Tabelas 3 e 4 é atendida se as

amostras forem processadas exatamente como descrito no método.

- Para o preparo do primeiro nível da curva de calibração (P1), pipetar, utilizando micropipeta calibrada, um

volume conhecido da solução trabalho “Pool” (~0,2 a 0,5 µg/mL) e transferi-lo para um frasco apropriado.





eficiência




- Evaporar o padrão, à temperatura ambiente, sob fluxo de N2 ou ar comprimido seco, cuidando para que o

solvente não seque completamente.

- Retomar o resíduo resultante da evaporação da TP com solução de metanol: água (3:1 v/v).

- Agitar por no mínimo 1 minuto em agitador de tubos, seguido de um minuto no ultrassom e mais um minuto no

agitador.

Quando for utilizar as soluções padrão para curva de calibração de AFBG e OTA seguir as recomendações

presentes nos métodos MET/LACQSA/BH/001 e MET/LACQSA/BH/005.

6.1.4 Aprovação da primeira solução (P1) da curva de calibração

Antes da injeção dos padrões proceder à avaliação da adequação das condições instrumentais. A aprovação de

P1 é feita conforme instruções contidas na IT/LACQSA/BH/001 para o preenchimento e avaliação da

PLN/LACQSA/BH/061.

Os demais padrões da curva de calibração (no mínimo 5 concentrações diferentes) serão preparados

preferencialmente após aprovação de P1 pela diluição do mesmo (Tabelas 3 e 4). Todas as soluções preparadas

devem ser cuidadosamente homogeneizadas. Fazer a injeção em triplicata ou duplicata de todas as soluções

preparadas de forma aleatória e avaliar a aceitabilidade da curva conforme a IT/LACQSA/BH/001.

A curva de calibração aprovada (as soluções) tem o prazo de validade de um mês para uso nas análises da

rotina. Se no período de um mês houver necessidade de preparar uma nova solução padrão trabalho deve-se

preparar também uma nova curva de calibração.

Durante o prazo de validade de 1 mês, caso não se prepare nova curva analítica, a curva já preparada pode ser

usada e deve ser avaliada a cada análise, segundo os critérios descritos na IT/LACQSA/BH/001, à exceção da

aprovação de P1, a qual é feito quando de seu preparo.

As curvas de calibração de micotoxinas feitas a partir de Materiais de Referência Certificados não serão

descartadas mensalmente, desde que sejam avaliadas para demonstração de que as mesmas se mantém

estáveis. O procedimento de avaliação das curvas está descrito na IT/LACQSA/BH/001.

6.2 Determinação de AFB1 e OTA





eficiência




As etapas para a análise de AFB1/OTA ou AFBG/OTA estão descritas de forma resumida nos dois fluxogramas

(de acordo com o método de quantificação – CLAE ou UHPLC) contidos no item 6.2.6.

6.2.1 Extração

Pesar 25 g da amostra de fígado à temperatura de resfriado antes que haja dessorção – etapa crítica.

Pesar 50 g de amostra de amêndoa de cacau em pasta*.

Adicionar 200 mL da solução de metanol: água (80:20 v/v).

Acrescentar aproximadamente 5 g de cloreto de sódio e 1 g de bicarbonato de sódio.

Homogeneizar a mistura por 6 minutos à velocidade alta (aproximadamente 800 rpm).

Filtrar o extrato através de papel de filtro qualitativo pregueado e em seguida filtrar através de membrana de

fibra de vidro Whatman GF/B 1 µm ou equivalente.

Recolher o filtrado.

* O REL/VAL/LACQSA/BH/004 apresenta os resultados que indicam melhor desempenho para o preparo de

cacau.

6.2.2 Diluição

Pipetar 10 mL do filtrado e transferir para um balão volumétrico ou proveta graduada de 100 mL.

Adicionar 60 mL com solução tampão PBS 0,01% tween 20 e homogeneizar.

6.2.3 Purificação e eluíção

Adaptar uma seringa de polipropileno de 60 mL à coluna de imunoafinidade, utilizando um adaptador, e conectá-

la ao sistema de filtração a vácuo.

Condicionar a coluna com aproximadamente 10 mL de tampão PBS 0,01% tween 20, mantendo um fluxo

aproximado de 2 mL/min, não deixando a coluna secar. Ver Nota 3.

Transferir o extrato diluído para seringa, deixar passar através da coluna com um fluxo aproximado de 2 mL/min

(etapa crítica – não deixar a coluna secar). Ver Nota 3.

Nota 3: O fluxo aproximado de 2 mL/min é obtido por controle individual e depende do manifold utilizado e do analista.

O fluxo aproximado de 2 mL/min pode ser obtido pela contagem de gotas por tempo e está devidamente identificado





eficiência




nos manifolds: 1 gota por segundo ou 1 gota a cada 2 segundos, conforme determinado nos Testes: 15 (18/06/13) 16

(28/06/13) e 17 (10/07/13).

Lavar a coluna com 10 mL de solução tampão PBS 0,01% tween 20, mantendo o fluxo (etapa crítica – não

deixar a coluna secar).

Lavar a coluna com 10 mL de água mantendo o fluxo.

Secar a coluna (passar ar pela coluna).

6.2.3.2 Eluição (processo manual)

Desconectar a coluna do sistema de vácuo, conectá-la a uma seringa de vidro e aplicar pressão positiva.

Transferir 1,5 mL de metanol grau CLAE para a coluna de imunoafinidade e deixar em contato por 3 minutos.

Eluir a AFBG/OTA utilizando pressão positiva e controlando o fluxo de aproximadamente de 2 mL/min por meio

do êmbolo da seringa. (Etapa crítica)

Adicionar 0,5 mL de água tipo I ou tipo II ou destilada filtrada ao eluato.

Agitar por aproximadamente 1 minuto em agitador de tubos.

6.2.4 Separação, detecção e quantificação

Injetar no CLAE ou UHPLC, segundo condições especificadas respectivamente em 6.2.4.1 e 6.2.4.2, soluções

padrão e amostras.

Fazer integrações das soluções padrão da curva de calibração e das amostras positivas conforme

procedimentos descritos nas instruções dos cromatógrafos utilizados.

Armazenar os extratos brutos (quando necessário) e os purificados, em freezer até finalização dos resultados da

análise

Calcular as concentrações de AFBG e OTA presentes nas amostras.

Caso a leitura das amostras não esteja inserida na curva, diluir quantitativamente o extrato e reinjetar.

6.2.4.1 Quantificação utilizando CLAE

Injetar no CLAE soluções padrão e amostras nas condições cromatográficas especificadas para determinação

de: AFB1/OTA, no caso de fígado suíno e de aves; ou AFBG/OTA, no caso de amêndoa de cacau.





eficiência




As condições citadas abaixo são utilizadas apenas para a quantificação de AFB1/OTA em fígado.

O equipamento deve ser operado seguindo as instruções da IT/LACQSA/BH/013.

- coluna C18, 25 cm de comprimento com partículas de 5 µm e 4,6 µm de diâmetro interno;

- pré-coluna C18 com partículas de 5 µm;

- detector de fluorescência com excitação em 364 nm e emissão em 440 nm para AFB1 e excitação em 333 nm e

emissão em 477 nm para OTA;

- fase móvel A – metanol:acetonitrila: ácido acético 1% (22:22:56, v/v/v);

- fase móvel B – metanol:acetonitrila: ácido acético 1% (30:30:40, v/v/v);

- fluxo da fase-móvel de 1,0 mL/min;

- volume de injeção de 50 µL, apenas quando for injetar OTA em amêndoa de cacau e sua respectiva curva o

volume será de 20 µL;

- tempo de retenção de aproximadamente de 11 e 27 minutos para AFB1 e OTA, respectivamente.

- gradiente das fases móveis:

0,01 – 10’ – concentração fase móvel B 0%

15 – 31’ – concentração da fase móvel B 100%

33 – 50’ – concentração da fase móvel B 0%

- mudança no comprimento de onda de excitação e emissão:

17’ – excitação 333 e emissão 477

40’ – excitação 364 e emissão 477

- derivatização pós-coluna:

Por reação química com pyridinium tribromide:

- solução derivatizante de pyridinium tribromide 50 mg/L;

- fluxo da solução derivatizante de 0,3 mL/min.

A etapa de quantificação de aflatoxina BG e OTA pode ser realizada individualmente com injeção do extrato e

dos padrões utilizando a fase móvel cromatográfica dos métodos MET/LACQSA/BH/001 e





eficiência




MET/LACQSA/BH/005. Esse caso se aplica tanto para determinação de AFB1/OTA em fígado suíno e de aves,

quanto para AFBG/OTA em amêndoa de cacau

Nota 5: No caso de injeções individuais utilizando os métodos MET/LACQSA/BH/001 e MET/LACQSA/BH/005 o

tempo de retenção de aflatoxina BG e ocratoxina A sofrerão alterações, com tR de aproximadamente: 10 minutos para

AFG2; 13 minutos para AFG1; 14 minutos para AFB2; 18 minutos para AFB1; e 10 minutos para OTA.

6.2.4.2 Quantificação utilizando UHPLC

Obs: O equipamento deve ser utilizado de acordo com as instruções presentes na IT/LACQSA/BH/011.

6.2.4.2.1 Para AFBG

Injetar no CLAE soluções padrão e amostras nas condições cromatográficas especificadas para determinação

de: AFB1/OTA (no caso de fígado suíno e de aves) ou AFBG/OTA (no caso de amêndoa de cacau):

- coluna C18, 150 mm de comprimento com partículas de 2,2 µm e 2 mm de diâmetro interno;

- pré-coluna C18 com partículas de 4,6 µm;

- detector de fluorescência com excitação em 360 nm e emissão em 420 nm;

- fase móvel – água: acetonitrila: metanol (6:2:2, v/v/v) + KBr + HNO3 4 mol/L


- volume de injeção de 20 µL;

- Tempo de retenção aproximado: 5 minutos para AFG2; 6 minutos para AFG1; 7 minutos para AFB2; 9 minutos para

AFB1;

6.2.4.2.1 Para OTA

Injetar no UHPLC soluções padrão e amostras nas condições cromatográficas especificadas para determinação

de AFBG/OTA:

- coluna C18, 150 mm de comprimento com partículas de 2,2 µm e 2 mm de diâmetro interno;

- pré-coluna C18 com partículas de 4,6 µm;

- detector de fluorescência com excitação em 360 nm e emissão em 420 nm;

- fase móvel – metanol: acetonitrila: água: ácido acético (35:35:29:1, v/v/v/v)





eficiência





- volume de injeção de 5 µL;

- Tempo de retenção aproximado: 5 min;

6.2.5 CromatogramasCom o objetivo de verificar a manutenção da qualidade analítica do método, pode-se monitorar por inspeção

visual os parâmetros instrumentais retenção relativa, resolução, fator de simetria e número de pratos teóricos,

conforme REL/VAL/LACQSA/004. A seguir encontram-se cromatogramas típicos obtidos nesse método de

análise.

Figura 1: Cromatograma da solução padrão de AFB1 e OTA por CLAE.

Figura 2: Cromatograma de amostra fígado de frango contaminada com padrão de AFB1 e OTA por CLAE.





eficiência




Figura 3: Cromatograma de amostra fígado de suíno contaminada com padrão de AFB1 e de OTA por CLAE.

Figura 4: Cromatograma da solução padrão de OTA por UHPLC

Figura 5: Cromatograma da amostra de fígado de aves contaminado artificialmente com padrão de OTA por UHPLC





eficiência




Figura 6: Cromatograma da amostra de fígado suíno contaminado artificialmente com padrão de OTA por UHPLC

Figura 7: Cromatograma da solução padrão de AFBG por UHPLC





eficiência




Figura 8: Cromatograma da amostra de fígado de aves contaminado artificialmente com padrão de AFB1 por UHPLC

Figura 9: Cromatograma da amostra de fígado suíno contaminado artificialmente com padrão de AFB1 por UHPLC

Figura 10: Cromatograma da amostra de amêndoa de cacau artificialmente fortificada no LMT C3_18 para a Ocratoxina A injetadas no CLAE.





eficiência




Figura 11: Cromatograma da amostra de amêndoa de cacau artificialmente fortificada no LMT C3_16 para as AFBG injetadas no CLAE.

Figura 12: Cromatograma da amostra de amêndoa de cacau artificialmente fortificada no LMT 14AC003BR para OTA injetada no UHPLC.

Figura 13: Cromatograma da amostra de amêndoa de cacau artificialmente fortificada no LMT 14AC003BR para AFBG injetada no UHPLC.





eficiência




Figura 14: Cromatograma da solução padrão de AFBG por CLAE.

6.2.6 Fluxogramas

Fluxograma 1: Análise de AFBG e OTA por imunoafinidade e quantificação por cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE)

Agitar 6 min

Filtrar em papel de filtro e microfibra 1,5 µm

200 mL metanol: água (80:20, v/v)

25 g de amostra de fígado + 5 g NaCl + 1 g NaHCO3 ou 50 g de amostra de amêndoa de cacau em pasta + 5 g NaCl + 1 g NaHCO3





eficiência




Fluxograma 2: Análise de AFBG e OTA por imunoafinidade e quantificação por cromatografia líquida de ultra alta

eficiência (UHPLC)

Pipetar 10 mL

60 mL PBS (tween 20 0,01%)

IAC condicionada com 10 mL PBS (tween 20 0,01%) - Etapa critica

Lavar coluna com 10 mL PBS 0,01% tween 20 e 10 mL água bidestilada

Eluir 1,5 mL de metanol

Adicionar 0,5 mL de água bidestilada

Agitar 1 min

Injetar 50 µL CLAE

Coluna C18 (5µm x 250mm x 4,6mm de Ø interno – Etapa críticaLinha A: metanol: acetonitrila: ácido acético 1% (22:22:56)Linha B: metanol: acetonitrila: ácido acético 1% (30:30:40)

0,01-10,00’: B conc. 0%15,00-31,00’: B conc. 100%

33,00-50,00: B conc. 0%

Derivatização AFB1 e AFG1 pós-coluna Sol. Pyridinium tribromide 50 mg/L – Etapa crítica

Detecção Fluorescência: 17,00’: Excitação 333 nm e Emissão 447 nm;40,00’: Excitação 364 nm e Emissão 440 nm.

Agitar 6 min

Filtrar em papel de filtro e microfibra 1,5 µm

Pipetar 10 mL

Lavar coluna com 10 mL PBS 0,01% tween 20 e 10 mL água bidestilada

200 mL metanol: água (80:20, v/v)

25 g de amostra de fígado +5 g NaCl + 1 g NaHCO3 ou50 g de amostra de amêndoa de cacau em pasta + 5 g NaCl + 1 g NaHCO3





eficiência




7.0 Resultados7.1 Cálculos

Os níveis de contaminação das amostras deverão ser expressos em µg/kg. Os cálculos da contaminação de

OTA e aflatoxina nas amostras de fígado e amêndoa de cacau deverão ser realizados utilizando a planilha

PLN/LACQSA/BH/029, a qual considerou a Equação 1:

Alterações nos procedimentos descritos neste método poderão ser efetuadas, desde que não comprometam o

resultado da análise, devidamente autorizadas pelo Responsável e registradas na ficha de acompanhamento de

análise.

60 mL PBS (tween 20 0,01%)

IAC condicionada com 10 mL PBS (tween 20 0,01%) - Etapa critica

Eluir 1,5 mL de metanol

Adicionar 0,5 mL de água bidestilada

Agitar 1 min

Injetar 5 µL UHPLC para OTA e 20 µL para AFB1

Para OTA: Fase Móvel: metanol: acetonitrila: água: ácido acético (35:35:29:1)Para AFBG: Fase Móvel: água: metanol: acetonitrila (6:2:2) + KBr + ácido nítrico 4 M

Derivatização AFB1 e AFG1 pós-coluna Kobra Cell – Etapa crítica

Detecção Fluorescência: Para OTA: Excitação 332 nm e Emissão 476 nm;Para AFBG: Excitação 360 nm e Emissão 420 nm.

Coluna C18 (2,2µm x 150mm x 2,0mm de Ø interno – Etapa crítica





eficiência




Equação 1

diluiçãos

otaafbgota FVVMVVM

gMµgM

42

31

1

/µg/kgAFBG ou OTA

Sendo:

MOTA/AFBG = massa de OTA ou AFBG na alíquota do extrato injetado no CLAE

M1 = massa da amostra (g)

V1 = volume da solução de extração (mL)

V2 = volume do filtrado retirado para diluição com PBS (mL)

V3 = volume de dissolução do resíduo final – extrato final (µL)

V4 = volume do extrato final injetado no CLAE ou UHPLC (µL).

7.2 Reportagem de resultados

Registrar diariamente os dados referentes ao controle intralaboratorial com amostras artificialmente

contaminadas, naturalmente contaminadas ou com material de referência na PLN/LACQSA/BH/014 e na

PLN/LACQSA/BH/015.

Os resultados determinados para as amostras brancas e fortificadas deverão ser registrados no formulário

FOR/LACQSA/BH/114 e devolvidos à URPA juntamente com os resultados das amostras analisadas. Em caso

de amostras cegas, preencher a PLN/LACQSA/BH/011.

Os resultados das amostras analisadas somente poderão ser liberados se os resultados do controle

intralaboratorial atenderem aos critérios de aceitabilidade em termos de recuperação e/ou desvio padrão

conforme determinado nas Tabelas 1 e 2.

A reportagem de resultados deve seguir as instruções contidas no DS/LACQSA/BH/022. Os casos em que há

necessidade de reanálise também estão previstos nesse documento de suporte.

Considerar como NQ (não quantificado) os resultados inferiores ao limite de quantificação do método, conforme

apresentado nas Tabelas 1 e 2.

A reportagem de incerteza das amostras pertencentes ao Plano Nacional de Controle de Resíduos e





eficiência




Contaminantes Animal (PNCRC Animal) deverá seguir orientações contidas no DS/LACQSA/BH/022.

Após a verificação e liberação dos resultados das amostras analisadas, os mesmos deverão ser registrados no

FOR/LACQSA/BH/012, que deverá ter todos os campos não utilizados fechados e após verificação deverão ser

encaminhadas à URPA.

8.0 ResponsabilidadesAs funções, atribuições e responsabilidades estão definidas na PLN/LACQSA/BH/020 e no

DS/LACQSA/BH/005.

9.0 ReferênciasCHAN D., MACDONALD S. J., BOUGHTFLOWER V. Simultaneous determination of aflatoxins and ochratoxin A

in food using a fully automated immunoaffinity column clean-up and liquid chromatography-fluorescence detection. Journal of Chromatography A 1059, p. 23-16, 2004.

CHIAVARO E., CACCHIOLI C., BERNI E., SPOTTI E. Immunoaffinity clean-up and direct fluorescence measurement of aflatoxins B1 e M1 in pig liver: Comparison with high-performance liquid chromatography determination. Food Additives and Contaminants, 22(11), p. 1154 – 1161, 2005.

CHIAVARO E., LEPIANI A., COLLA F., BETTONI P, PARI E., SPOTTI E. Ochratoxin A determination in ham by immunoaffinity clean-up and a quick fluorimetric method. Food Additives and Contaminants v. 19, n. 6, p. 575-581, 2002.

HERZALLAH S.M. Determination of aflatoxins in eggs, milk, meat and meat products using HPLC fluorescent and UV detectors. Food Chemistry no 114, p. 1141-1146, 2009.

IARC (1993) IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans, v. 56, Some naturally occurring substances: food items and constituents, heterocyclic aromatic amines and mycotoxins, Lyon, pp. 145-156.

KŐSZEGI, T; POÓR, M. Ochratoxin A: Molecular Interactions, Mechanisms of Toxicity and Prevention at the Molecular Level. Toxins (Basel), v. 8(4), p.111, 2016.

MONACI L., PALMISANO F., MATRELLA R., TANTILLO G. Determination of ochratoxin A at part-per-trillion level in Italian salami by immunoaffinity clean-up and high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Journal of Chromatography A. v.1090, n. 1-2, p. 184-187, oct. 2005.

WHO FOOD ADDITIVES SERIES 47. 2001- Safety evaluation of certain mycotoxins in food. IPCS International Programme on Chemical Safety – World Health Organization – Geneve. FAO Food and Nutrition, paper 74.

10.0 Documentos referenciadosDE/LACQSA/BH/029-Regulamento Nº 401 da Comissão Europeia, de 23 de fevereiro de 2006IP/LACQSA/BH/001-Descontaminação e preparo de materialIP/LACQSA/BH/003-Preparo e padronização de soluções padrões de micotoxinasIS/LACQSA/BH/002-Preparo e controle de lotes de insumos (reagentes, solventes e soluções)





eficiência




IS/LACQSA/BH/005- Aquisição de Serviços e SuprimentosIT/LACQSA/BH/001-Uso das planilhas de rotina para emissão de resultados de análiseIT/LACQSA/BH/011-Cromatógrafo líquido de alta eficiência UHPLC Shimadzu - Nexera com derivatização pós coluna usando Kobra Cell e forno de reação pós colunaIT/LACQSA/BH/013-Cromatógrafo líquido de alta eficiência CLAE-Shimadzu com derivatização pós coluna usando Kobra cell MET/LACQSA/BH/001-Determinação de aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 por imunoafinidade e cromatografia líquida com detecção por fluorescência. MET/LACQSA/BH/005-Determinação de ocratoxina A por cromatografia líquida de ultra eficiência e camada delgadaPE/LACQSA/BH/009-Transferência da etapa de quantificação dos métodos para análise de micotoxinas do sistema de cromatografia convencional (HPLC) para cromatografia de rápida (UPLC), utilizando o NexeraPE/LACQSA/BH/017-Determinação de aflatoxina BG e ocratoxina A em cacau por cromatografia líquida de alta eficiência e detector de fluorescênciaPOP/LACQSA/BH/002-Controle de equipamentosPOP/LACQSA/BH/003-Acomodações e condições ambientaisPOP/LACQSA/BH/004-Gerenciamento de resíduos no laboratórioPOP/LACQSA/BH/009-Garantia da Validade dos Resultados

11.0 Anexos referenciadosDS/LACQSA/BH/003-Requisitos para calibração, qualificação e verificação de equipamentosDS/LACQSA/BH/004-Escopo representativo do LACQSA - Laboratório de Controle de Qualidade e Segurança AlimentarDS/LACQSA/BH/005-Descrição de FunçãoDS/LACQSA/BH/022-Reportagem de resultadosDS/LACQSA/BH/024-Abreviação de analitos e parâmetrosFOR/LACQSA/BH/010-Acompanhamento de análises de micotoxinasFOR/LACQSA/BH/012-Reportagem de resultados analíticos de micotoxinasFOR/LACQSA/BH/024-Comunicado de recebimento e solicitação de amostrasFOR/LACQSA/BH/025-Solicitação de material ao preparoFOR/LACQSA/BH/054-Controle de sistemas cromatográficos e colunasFOR/LACQSA/BH/114-Reportagem de resultados analíticos - Amostra controlePLN/LACQSA/BH/001-Plano de equipamentosPLN/LACQSA/BH/011- Controle Intralaboratorial - Amostra cegoPLN/LACQSA/BH/013-Preparo de Solução Padrão Trabalho de MicotoxinasPLN/LACQSA/BH/014-Carta de Controle - Amostras naturalmente contaminadasPLN/LACQSA/BH/015-Carta de Controle - Amostras fortificadasPLN/LACQSA/BH/018-Curvas de Calibração para Micotoxinas - ModelosPLN/LACQSA/BH/020-Matriz de competênciaPLN/LACQSA/BH/029-Resultado analítico AFB1 / OTA- fígado e AFBG / OTA - amêndoa cacau por CLAEPLN/LACQSA/BH/061-Avaliação da Curva de Calibração para Micotoxinas





eficiência




REL/VAL/LACQSA/002-Determinação de ocratoxina A utilizando CLUE/D-FL (revalidação e transferência do MET/LACQSA/BH/005).REL/VAL/LACQSA/004-Determinação de aflatoxina B1, B2, G1 e G2 e ocratoxina A em amêndoa de cacau por cromatografia líquida de alta eficiência e cromatografia líquida de ultra eficiência (ampliação de escopo do método MET/LACQSA/BH/003)

12.0 Informações de registro Determinação de aflatoxina B1, B2, G1 e G2 e ocratoxina A em amêndoa de cacau por cromatografia líquida de alta eficiência e cromatografia líquida de ultra eficiência (ampliação de escopo do método MET/LACQSA/BH/003) (REL/VAL/LACQSA/004)Acompanhamento de análises de micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/010)Avaliação da Curva de Calibração (PLN/LACQSA/BH/061)Carta de controle - amostras fortificadas (PLN/LACQSA/BH/015)Carta de controle - amostras naturalmente contaminadas (PLN/LACQSA/BH/014)Comunicado de recebimento e solicitação de amostras (FOR/LACQSA/BH/024)Controle de colunas cromatográficas - CLAE (FOR/LACQSA/BH/054)Curvas de Calibração para Micotoxinas - Modelos (PLN/LACQSA/BH/018)Determinação de ocratoxina A utilizando CLUE/D-FL (revalidação e transferência do MET/LACQSA/BH/005) (REL/VAL/LACQSA/002)Matriz de competência (PLN/LACQSA/BH/020)Plano de equipamentos (PLN/LACQSA/BH/001)Preparo de Solução Padrão Trabalho de Micotoxinas (PLN/LACQSA/BH/013)Reportagem de resultados analíticos - Amostra controle (FOR/LACQSA/BH/114)Reportagem de resultados analíticos de micotoxinas (FOR/LACQSA/BH/012)Resultado analítico de AFB1 e OTA - Incerteza de medição (PLN/LACQSA/BH/029)Solicitação de material ao preparo (FOR/LACQSA/BH/025)

13.0 Arquivos anexadosLACQSA/BH - Plano de Estudo PE 074 – “Determinação de aflatoxina B1 (AFB1) e ocratoxina A (OTA) em fígado de suíno e ave por cromatografia líquida de alta eficiência e detector de fluorescência”.

LACQSA/BH – Relatório do Plano de Estudo 074 – Determinação de aflatoxina B1 (AFB1) e ocratoxina A (OTA) em fígado de suíno e ave por cromatografia líquida de alta eficiência e detector de fluorescência

14.0 Controle de alterações

Item Descrição

1.1 - Inserção das abreviações “p.a.” e “p.a.r”.





eficiência




2.1

- Inserido: “A transferência de metodologia de quantificação de CLAE para UHPLC foi validada segundo

PE/LACQSA/BH/009 cujos resultados encontram-se no RE/VAL/LACQSA/BH/002”.

Substituído referência de EU 401, 2006 por DE/LACQSA/BH/029.

Atualização das incertezas no LQ.

2.2 - Inserida menção ao DS/LACQSA/BH/004.

3.0 - Retirada menção à PLN/DLAB/PL/007.

3.6- Retirado: Os reagentes, solventes e materiais devem ser avaliados e validados segundo a

IS/LACQSA/BH/002.

4.0 - Inserida menção à PLN/LACQSA/BH/001.

7.2 - Substituída a referência ao FOR/LACQSA/BH/032 pela PLN/LACQSA/BH/011.

8.0 - Substituída a referência ao DS/LACQSA/BH/001 pela PLN/LACQSA/BH/020.

9.0 - Atualização das referências.

10.0 - Incluído PE/LACQSA/BH/009.

11.0- Incluídos: PLN/LACQSA/BH/001, PLN/LACQSA/BH/011, PLN/LACQSA/BH/020, DS/LACQSA/BH/004.

- Retirados: PLN/DLAB/PL/007, FOR/LACQSA/BH/032, DS/LACQSA/BH/001, FOR/LACQSA/BH/036.

12.0

- Incluídos: PLN/LACQSA/BH/001, PLN/LACQSA/BH/011, PLN/LACQSA/BH/020, DS/LACQSA/BH/004,

REL/VAL/LACQSA/004.

- Retirados: PLN/DLAB/PL/007, FOR/LACQSA/BH/032, DS/LACQSA/BH/001, FOR/LACQSA/BH/036.

13.0 - Incluídas as referências aos arquivos anexados.


ministério da agricultura, pecuária e abastecimento - mapa ... · a em amêndoa de cacau por...

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