highperformance liquidchromatography cromatografia líquida

Bromatologia (FCNAUP) - HPLC 1josé fernandes

J. Oliveira Fernandes

Lab. de Bromatologia e Hidrologia

Faculdade de Farmácia U. Porto

HPLCHigh Performance Liquid Chromatography

Cromatografia líquida de alta eficiência


É uma técnica cromatográfica em coluna

A fase móvel é sempre um líquido

As amostras são analisadas em solução

O processo de separação pode ser de:

partilha, adsorção, troca iónica, exclusão

HPLC


• Colunas reutilizáveis de pequeno diâmetro interno (≤ 2-5 mm)

• Fases estacionárias constituídas por partículas muito pequenas (3-50 µm)

• Pressões relativamente elevadas à entrada da coluna e fluxo controlado da fase móvel

• Introdução precisa da amostra, sem a necessidade de se dispor de grandes quantidades

• Detectores contínuos capazes de lidar com pequenos fluxos da fase móvel e de detectar quantidades muito pequenas de substâncias

• Análises rápidas e com boa resolução (poder de separação)

A técnica de HPLC caracteriza-se por:


Representação esquemática de um sistema de HPLC


a- recipiente

b- tubo de aspiração

c-filtro

Reservatório da fase móvel - Eluente(s)

Nº de reservatórios (sistemas binários, ternários, etc.)

Grau de pureza dos solventes• reagentes HPLC-grade• água desionizada

Filtração dos solventes• solventes orgânicos – PTFE/teflon®

• água - celulose

Técnicas de desgasificação• borbulhamento de hélio• aplicação de vácuo• ultra-sons• aquecimento

Factores a considerar


Bombas

• Têm como função transferir para a coluna, sob pressão, uma determinada quantidade de solvente/eluente por unidade de tempo

• Devem gerar um fluxo constante e reprodutível: 0.01 to 5 ml/min (cromatografia preparativa > 10 mL/min)

• Têm de ser resistentes aos líquidos que compõem o eluente e a valores extremos de pH

• Devem funcionar entre gamas de pressão de 1 a 5000 psi

• A maior dificuldade consiste na imperiosa necessidade de evitar a introdução de bolhas de ar no seio do eluente

• Eluição isocrática – Uma só bomba é suficiente

• Eluição por gradiente – São necessárias tantas bombas quanto o número de eluentes a usar


Bombas


O sistema de injecção consiste numa válvula de

injecção com um anel de amostragem (sample

loop) de volume fixo, onde a amostra é

previamente colocada por intermédio de uma

micro-seringa.

A rotação da válvula desvia a corrente de eluente

(proveniente da bomba) para o anel,

encaminhando desta forma a amostra para o

início da coluna

Injector ou Camâra de Injecção


AUTOINJECTORES ou ANALISADORES AUTOMÁTICOS

Permitem o automatismo do processo

Contribuem para a repetibilidade e reprodutibilidade (>precisão)

Diminuem a possibilidade de contaminação


COLUNA:ONDE TODO O PROCESSO DE

SEPARAÇÃO OCORRE


COLUNASMaterial: aço inoxidável, vidro (ou plástico)

Diâmetro interno: 2-5 mm Trata-se de uma variável muito importante: para o mesmo comprimento, uma coluna com maior diâmetro interno possui uma maior capacidade de carga, permite maiores fluxos de eluente, mas conduz a uma maior diluição das bandas dos solutos

Diâmetro das partículas de enchimento da coluna: 10 µm, 5 µm ou inferiorOs enchimentos com partículas menores apresentam uma área superficial mais elevada e desta forma uma maior capacidade de resolução dos solutos

Diâmetro externo: em regra, 6,35 mm, independente do diâmetro interno. As colunas preparativas apresentam maior diâmetro

Comprimento: 10-30 cmO comprimento da coluna afecta a eficiência e a rapidez da separação: colunas mais longas possuem maior eficiência mas conduzem a um tempo de análise maior; colunas mais curtas permitem separações mais rápidas mas apresentam menor eficiência


Column Length and Mechanical Separating Power [Same Particle Size]

Particle Size and Mechanical Separating Power [Same Column Length]


FILTROS PRÉ-COLUNA e GUARD COLUMNS


FILTROS PRÉ-COLUNA e GUARD COLUMNS

COLUNA

Para reduzir a possibilidade de obstrução da coluna deve eliminar-se a presença de pequenas partículas:

Manter os reservatórios de solventes sempre limpos e fechados

Filtrar todas as amostras antes da injecção com filtros < 2 µm de porosidade

Substituir periodicamente todos os vedantes

Usar pré-filtros colocados entre o injector e a coluna (capazes de filtrar pequenas partículas provenientes da amostra e dos

materiais vedantes sem contribuir significativamente para a dispersão da amostra antes desta chegar à coluna). Estes

filtros não devem contribuir para aumentar significativamente o volume morto e, dessa forma, afectar negativamente a

performance cromatográfica


FILTROS PRÉ-COLUNAS e GUARD COLUMNS

A “guard column” deve conter o mesmo material que a coluna analítica (mesma fase estacionária)

pois a sua função é a de proteger a coluna de componentes da amostra que reajam negativamente

com a fase estacionária


Detector

• O detector analisa continuamente a fase móvel

• À medida que cada componente da mistura sai da coluna e atinge o detector, produz-se um sinal que é transmitido e registado

• A sequência de sinais obtidos durante a análise origina o cromatograma

Tem a função de converter em sinal eléctrico a concentração de cada componente eluído da coluna


Detectores mais comuns em HPLC

• Detector de Índice de Refracção

• Detector de Ultra-Violeta (UV-VIS)λ fixo (normalmente 254 nm)λ variávelDetector de díodos ou “diode array”

• Detector de Fluorescência

• Detectores Electroquímicos

• MS, NMR, NIR, LSD


A ELUIÇÃO em cromatografia em coluna

Uma típica separação cromatográfica em coluna:

-A amostra (mistura de A e B) é colocada no topo da coluna (um tubo estreito cheio com um sólido inerte - sob a forma de partículas muito pequenas

- que suporta a fase estacionária na sua superfície).

-A introdução de sucessivas porções de eluente“fresco” (fase móvel) vai provocar o deslocamento

dos componentes da amostra (eluição).

-O componente B tem maior afinidade para a fase estacionária do que o componente A, pelo que se “atrasa”, saindo da coluna (parte inferior) depois

dele.


CROMATOGRAMA

É um gráfico dado por um registador que

regista o sinal detectado em função do

tempo. É essencial à analise qualitativa e

quantitativa: a posição dos picos no eixo

do tempo (tempo de retenção) é usada

para identificar os componentes da

amostra; a área de cada pico é função da

quantidade do componente respectivo na

amostra

A ELUIÇÃO em cromatografia em coluna


HPLC vs TLC


TIPOS DE INTERACÇÃO ELUENTE-SOLUTONA COLUNA

ADSORÇÃO

PARTILHA

TROCA IÓNICA

TAMIZAÇÃO MOLECULAR


Caracteriza-se pelo facto da fase estacionária ser constituída por um material de suporte impregnado com um líquido

Cromatografia de Partilha

Os componentes da mistura a

separar (amostra), dissolvidos na

fase móvel, distribuem-se entre esta

e a fase estacionária (líquido a

revestir um suporte sólido) em

função da solubilidade em cada uma

dessas fases, até se atingir um

equilíbrio. Assim, a separação faz-

se com base na diferença nos

coeficientes de distribuição ou de

partição (K) entre as duas fases.


SEMELHANTE À EXTRACÇÃO LÍQUIDO/LÍQUIDO

OS COMPONENTES MAIS RETIDOS SÃO MAIS SOLÚVEIS NA FASE ESTACIONÁRIA DO QUE NA FASE MÓVEL

A SEPARAÇÃO OCORRE BASEADA NA DIFERENÇA DESOLUBILIDADE DOS VÁRIOS COMPONENTES DAAMOSTRA NA FASE ESTACIONÁRIA

PARA ALÉM DA SOLUBILIDADE (partilha) HÁ OUTROSFACTORES QUE CONDICIONAM A SEPARAÇÃO



Reacção de um grupo silanol superficial com um silano monofuncional

Reacção de grupos silanos superficiais com um silano bifuncional



Existem dois tipos de processos distintos:

“Normal Phase”: a fase estacionária é polar e a fase móvel é apolar

“Reversed Phase”: a fase estacionária é apolar e a fase móvel é polar

O trabalho em fase normal foi o primeiro a ser utilizado, mas hoje o trabalho em fase reversa (RP) é mais comum



Si – O – CH2 (CH2)x-CH2-Grupo Polar

Si – O – CH2 (CH2)16-CH3

HEXANO

MeOH/H20

NORMAL PHASE

REVERSED PHASE



REVERSED PHASE NORMAL PHASE

Fase reversa vs Fase normal


Fase reversa vs Fase normal

Restek® ULTRA C-18 and CN Columns (250mm x 4.6mm, 5µ), Mobile Phase: (1:1 Methanol:Water), 1.5 mL/min.


Normalmente não é possível trabalhar apenas com um solvente (líquido puro)

É necessário usar como eluente uma mistura de líquidos (2 ou +)

Cromatografia de Partilha - Eluentes


• Miscibilidade

• Inércia química

• Absorção no UV

• Viscosidade

• Toxicidade

• Inflamibilidade e volatilidade

• Força do solvente – medida da polaridade relativa do solvente

Factores que determinam a escolha dos solventes



MetanolAcetonitrilo

TetrahidrofuranoÁgua

Pouco viscososObtêm-se puros

MiscíveisTransparentes ao UV



HPLC em Fase reversa (C18)

Usa-se geralmente uma mistura de 2 solventes

Água+

Metanol ou Acetonitrilo

O solvente orgânico (menos polar) apresenta maior força de eluição, pelo que quanto maior for a sua % na mistura mais rapidamente os picos são

eluídos, ou seja, menores são os tempos de retenção


Metanol/água (90:10) Metanol/água (55:45)



A COMPOSIÇÃO DO ELUENTE É ALTERADADURANTE A ANÁLISE

HPLC – Eluição em Gradiente


O problema geral da eluição

• Considerar a Figura ao lado: mistura de seis componentes, constituindo 3 pares com características semelhantes (coeficientes de distribuição tempos de retenção)

• Em a) as condições estão bem ajustadas para a separação dos componentes 1 e 2, mas não para os restantes (tempo a mais, com alargamento dos picos).

• Ajustando as condições de eluição para os componentes 5 e 6, deixa de haver separação entre os componentes 1 e 2 e entre os componentes 2 e 3. É este o chamado problema geral da eluição.

• Como sair desta situação?

– LC: Alterando a composição do eluente ao longo do tempo (durante a separação…)

– GC: alterando a temperatura

Eluição em gradiente ou Programação do eluente

Programação da temperatura

Nota: este tipo de eluição opõe-se à chamada eluição isocrática, i.e., em que as condições se mantêm constantes durante toda a separação


Intervalo

(min)

Metanol (%) Água (%)

0-12 60 40

12-20 60 – 90 40 – 10

20-25 90 10

Em fase reversa, o gradiente consiste em aumentar, de forma gradual ou

por patamares, a quantidade relativa de solvente orgânico (metanol ou

aceonitrilo) à medida que o processo avança



Overlay of the four components trace analysis chromatograms. (A) is the

isocratic elution, (B) is the gradient elution, shadow line is the gradient

profile from 30% acetonitrile in water to 65% acetonitrile



HPLC – Importância do pH• O pH é de grande importância para a separação e para a detecção de compostos com

características acídicas e básicas

• As colunas normalmente usadas são muito sensíveis a meios básicos ou muito ácidos

• pH > 8 dissolução do gel de sílica

• pH < 2 hidrólise da ligação da sílica aos grupos C 18


HPLC – Importância da temperatura


HPLC – Exemplo de Cromatogramas


Figure 2: HPLC chromatogram of reference standards, rutin, quercitrin, quercetin, kaempferol and isorhamnetin with corresponding

retention times at λ = 350nm. Separation of the flavonols was achieved at 45°C on a minibore Phenomenex Luna 5µm C18 (2) column

with dimensions 250 x 2.00mm using a one step linear gradient and flow rate of 400µl/min. Mobile phase A (acetonitrile) and B (0.3%

formic acid) ratios where changed after 15 minutes from 15:85 to 25:75 and total run time was 33 minutes.



Chromatographic conditions: Analytical column: Hypersil GOLD C18 3µm 150x4.6mm

Guard column: Hypersil GOLD C18 3µm

Col. temperature: 40 °C Inj. volume: 10µL Flow: 2.0mL/min

Mobile phase: A: 40mM NaH2PO4/Na2HPO4 (1:1) buffer pH=7.8 B: AcN/MeOH/H2O (45/45/10 v/v/v)

Detection: UV absorbance @ λ=338nm



HPLC – Detector “Diode-array”


Métodos Cromatográficos – Quantificação

Métodos baseados na construção de uma Curva de Calibração

Método do padrão externo (o mais usual em HPLC)

Método do padrão interno (o mais usual em GC)

Método das Adições de Padrão

Normalização



Métodos baseados na construção de uma Curva de Calibração

Seja a quantificação feita pelo método do padrão externo ou pelo método do padrão interno, as curvas de calibração podem ser construídas a partir de:

1. Análise directa de soluções padrão com concentrações crescentes (feitas em solvente

adequado)

2. Análise de soluções padrão com concentrações crescentes (feitas em solvente adequado)

depois de sujeitas à totalidade do processo de extracção/clean-up a que é sujeita a

amostra

3. Análise de soluções padrão com concentrações crescentes (feitas em matrizes sintéticas

que constituam uma “imitação” das amostras), depois de sujeitas à totalidade do

processo de extracção/clean-up a que é sujeita a amostra



Método do Padrão Externo

Implica a construção de uma Curva de Calibração clássica:

Área do pico em função da concentração da espécie que se pretende quantificar

Concentração

Área do pico

É o método mais usado em HPLC

Apresenta como ponto mais frágil o facto de não haver hipótese de detectar e de compensar devidamente qualquer anomalia que surja durante todo o processo analítico a que as amostras são sujeitas: p. ex., engano na medição de um volume durante o processo extractivo; perda do analito numa coluna de SPE mal solvatada; injecção de uma quantidade indevida, etc.



Implica a adição a todas as soluções de calibração (soluções padrão) e a todas as amostras de uma quantidade igual de uma segunda substância designada por padrão interno

O padrão interno deve apresentar as seguintes características:

Ter um comportamento químico e físico o mais idêntico possível ao do analito

Não estar presente nas amostras

Dar origem nas amostras a picos cromatográficos bem resolvidos

Método do Padrão Interno



Método do Padrão Interno

Implica a construção de uma Curva de Calibração alternativa:

Relação área do pico de analito/ área do pico do padrão interno em função da concentração da espécie que se pretende quantificar

Concentração

Área do pico/Área do PI

É o método mais usado em GC

Permite compensar automaticamente qualquer anomalia que surja durante todo o processo analítico a que as amostras são sujeitas. Qualquer perda (ou ganho) anormal de analito durante todo o processo, irá afectar de igual forma a área do pico correspondente ao padrão interno



Método das Adições de padrão

Fundamenta-se no traçado de uma curva de regressão de A em função da concentração ou da massa de analito adicionado a alíquotas da amostra contendo a espécie que se pretende quantificar.

Área do pico ouÁrea do pico/Área do PI

Quantidade adicionada

A = Área do pico do analito

i) Método do Padrão Externo

A = Área do pico do analito/área do pico do PI

ii) Método do Padrão Interno


O resultado é calculado com base no valor da abcissa

correspondente à interpolação do dobro da ordenada

na origem ou pelo módulo da abcissa obtido após

extrapolação da recta de regressão.

A

m


Método das Adições de padrão



Método da Normalização

Consiste em considerar o somatório das áreas de todos os picos cromatográficos como

100% e quantificar o analito em estudo pela % relativa da área do respectivo pico

Tem uma aplicação muito reduzida, sendo útil apenas em casos muito especiais (p. ex.

quantificação de ácidos gordos por GC em amostras de gorduras alimentares)

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