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CINÉTICA ENZIMÁTICA

Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.

E + S SE E + P


• Proteínas con actividad catalítica de los seres vivos.

• Unidades del Metabolismo

• Regulan la vel. de las reac. quím. espontáneas (DG-).

• No promueven reacciones no-espontáneas (DG +).

• Incrementan la Vel. De reacción 103 a 1012 veces sin

afectar el sentido de la reacción.

• No forman parte del producto de la reacción.


PROPIEDADES GENERALES• AUMENTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN

– De 106 to 1012 veces vs sin enzima.

– Aún más rápido que los catalizadores químicos.

• CONDICIONES DE REACCIÓN– Temperatura 25-40 oC (algunas hasta 75 oC)

– pH neutro (5-9), la mayoría 6.5 – 7.5

– Presión atmosférica normal

• CAPACIDAD DE REGULACIÓN– Por concentración de sustrato

– Por concentración de enzima

– Por inhibidores competitivos (semejantes al sustrato)

– Por inhibidores no competitivos (modificación covalente de la enzima)

– Por regulación alostérica

• ALTA ESPECIFICIDAD DE REACCIÓN– Interacción estereoespecífica con el sustrato

– No hay productos colaterales


ALTA

ESPECIFICIDAD

DE REACCIÓN

INTERACCIÓNESTEREO

ESPECÍFICA CON SU

SUSTRATO


Los Substratosse acercan a la Enzima

(sitio Activo)

Enzima

Substratos

HO-

H-


Los reactivos

interaccionan

con la enzima

(sitio activo)


Cambia la

configuración de la

enzima


La unión del sustrato produce un cambio conformacional

de la enzima hexoquinasa (cinasa), la cual es monomérica.

Substrato

de glucosa

Sitio de enlace


Se realiza la

reacción

catalítica


Actividad enzimática finales del siglo XIX.

En 1882: complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática.

En 1913: Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron esta teoría y propusieron una

ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de los enzimas.

http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz3.htm#mm

[ET] = [E] + [ES]

Como [E] = [ET] - [ES], resulta que: v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]


Leonor Michelis y Maud Menten (1913)

Tiempo

Co

nc

en

t.


E + S ESK1

K-1

ES E + PK2

K-2

[Et ] = Concentración de E total libre y combinada

[ES]

[Et ] – [ES] = Concentración de E libre

[S] normalmente > a [Et ] de tal forma [ES] es despreciable Vs [S]

1.- Vel. de formación ES = K1 ( [Et ] – [ES] ) [S]

La deducción comienza por considerar

las Velocidades de Formación y de Descomposición de ES

La velocidad de formación de ES a partir de E + P es muy pequeña y puede despreciarse

[ES]

[E] + [S]K1 =

K1 ( [E] + [S] ) = [ES]

2.- Vel. de descomposición de ES = K-1 [ES] + K2 [ES]

3.- Estado estacionario.

Vel. de formación de ES = vel. de descomposición. La [ES] se mantiene constánte

4.- Separación de las constantes de velocidad

K1 ( [Et ] – [ES] ) [S] = K-1 [ES] + K2 [ES]

K1 [Et ] [S] – K1 [ES] [S] = (K-1 + K2) [ES]

K1 [Et ] [S] = K1 [ES] [S] + (K-1 + K2) [ES] Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.

K1 [Et ] [S] = K1 [ES] [S] + (K-1 + K2) [ES]

K1 [Et ] [S] = ( K1 [S] + (K-1 + K2) ) [ES] simplificando

K1 [Et ] [S]

K1 [S] + (K-1 + K2) [ES] =

5.- Definición de la velocidad inicial (Vo) en función de [ES]

La Vel. Inicial de acuerdo con la Teo. de M-M, está determinada por la

vel. de descomposición del [ES], K2 ,

ES E + PK2

K-2

Vo

K2

[ES] =

[Et ] [S]

[S] + (K-1 + K2)

K1

[ES] =

Vo = K2 [ES]

[ES]

[ES]

K2 [Et ] [S]

[S] + (K-1 + K2)

K1

Se puede simplicar:

Vo = Definiendo KM

Cte. De Michaelis-Menten como(K-1 + K2)

K1

Vmax como K2 [Et] que es la Vel. Cuando todo el

enzima disponible E, se halla presente en forma de ES.Vmax [S]

[S] + KM

Vo =Ecuación de Michaelis-Menten o Ecuación de Velocidad

para una reacción de un solo S catalizada por un E.


ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN Vo = V max [S]

Km + [S]

1

2 Vo = Vmax

De la ecuación de M-M se deduce una rel. numérica importante

Cuando la Vo es la mitad de la Vmax

Vmax Vmax [S]

2 KM + [S] =

1 [S]

2 KM + [S] =

KM = 2 [S] – [S]

KM = [S]Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.

E E-S E

S P

Velocidad: cantidad de producto formado en una unidad de tiempo

S E P

100 1000 100

1000

1000

1000

1000

1000

1000

250 250

500 500

750 750

1000 1000

2000 1000

3000 1000

Vmax

(mM) mU (mM/ min)


Cinética enzimática en función de la concentración

de sustrato

KM

1

2 Vo = Vmax

KM = [S]

Vmax


Catalasa H2O2 25.0

Hexoquinasa ATP 0.4

D-Glucosa 0.05

D-Fructosa 1.5

Anhidrasa carbónica HCO3- 9.0

Quimotripsina Gliciltirosinilglicina 108.0

N-Benzoiltirosinamida 2.5

-Galactosidasa D-Lactosa 4.0

Treonina deshidrogenasa L-Treonina 5.0

ENZIMA SUSTRATO Km (mM)


• La KM es inversamente proporcional con la

actividad de la enzima.

• Valor de KM grande, baja actividad

• Valor de KM pequeño, alta actividad

La KM

es un parámetro de

Actividad Enzimática


Catalasa H2O2 25.0

Hexoquinasa ATP 0.4

D-Glucosa 0.05

D-Fructosa 1.5







En ayunas 95 mg/dl. 950 mg/L = 5.27 mM

Después de comer …. Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.

H2O

Quimotripsina Ac-Phe-Ala Ac.Phe + Ala 150

H2O

Pepsina Phe-Gly Ac-Phe + Ala 0.3

H2O

Ribonucleasa Citidina 2’,3’ Citidina 3’ 7.9

fosfato cíclico fosfato

Anhidrasa Carbónica

Km de algunas enzimas


Mathews C.K. y Van Holde K.E 1998. .Bioquímica 2ª. Ed. McGraw-Hill Interamericana. España. Pag 418


Hexosa Cerebral

Azúcar Km

(mol/ L)

Cinasas

D-Glucosa 8 X 10 -6 Glucocinasa

Hexocinasa IV

D-Fructosa 2 X 10 -3 Fructocinasa

D-Manosa 5 X 10 -6 Manocinasa

D-Galactosamina 8 X 10 -5 Galactocinasa

Km

(mmol/ L)

8

2000

5

80

Km

(mmol/ L)

0.008

2.0

0.005

0.08


ATP + Glucosa ADP + 6-fosfato de glucosa

2 Rutas

Enzimas: pueden catalizar reacciones donde hay 2 S =

Hexocinasa

•Desplazamiento Simple, los 2 S se unen a la E

A + B + E EAB C + D

•Doble desplazamiento o ping-pong

A + B + E AE BE + C

D


Determinación Cuantitativa de la Cinética Enzimática

1. La reacción global

2. Procedimiento analítico para determinar el S que

desaparece o el P que aparece

3. Sí el E requiere Cofactores (iónes o coenzimas)

4. La dependencia de la actividad enzimática con la

[S] o sea la KM de la Enzima.

5. El pH óptimo

6. Un intervalo de temperatura en la que la E es

estable y muestra actividad elevada.


Catalasa H2O2 25.0

Hexoquinasa ATP 0.4

D-Glucosa 0.05

D-Fructosa 1.5







En ayunas 95 mg/dl. 950 mg/L = 5.27 mM

Después de comer …. Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.

Pepsina 1.5

Tripsina 7.7

Catalasa 7.6

Arginasa 9.7

Fumarasa 7.8

Ribonucleasa 7.8

Enzima pH óptimo

Vo


4 37 85

Temperatura oC)

Vo

10 50 100

Coenzima

Vo

10 30 50 70 100

Tiempo (min)

Vo


1.0 Unidad de Actividad Enzimática (U):

La cantidad que transforma 1.0 mmol (10-6 M) de S /min,

a 25 0C, en las condiciones de medida óptima.

Actividad específica:

Es el no. de U de una E / mg de proteína.

Es decir: una medida de la pureza de la E.

Al purificarla, el valor llega a un máximo y es estable.

Número de recambio

No. de moléculas de S transformadas /unidad de tiempo,

por una molécula de E ( o por un solo sitio catalítico)

Enzima No. de Recambio

Anhidrasa carbónica 36 000 000

B-Amilasa 1 000 000

B-Galactosidasa 12 000

Fosfoglucomutasa 1 240


[S] (mM) Vo (mM/ min)

1.25 0.86

1.67 1.02

2.5 1.32

5 1.67

10 2.09

¿Vmax?

¿KM?


y = m x + b

Transformación de la M-M. Representación Doble Recíproco

Vmax [S]

[S] + KM

Vo =

Vmax [S]

KM + [S]Vo =

1 KM + [S]

Vo Vmax [S] =

Sí se toman los recíprocos de ambos

1 KM 1 [S]

Vo Vmax [S] Vmax [S] =

Separando los componentes de numerador

+

1 KM 1 1

Vo Vmax [S] Vmax

=

Simplificando

+Ecuación de

Lineweaver-Burk


0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00

0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60

Vo

(mm

ol/L

min

)

[S] mM

Michaelis Menten

S (mM) Vo (mmol/L min)

0.05 0.71

0.10 1.07

0.20 1.50

0.35 1.80

0.50 1.88

1/S 1/Vo

20.0 1.4

10.0 0.9

5.0 0.7

2.9 0.6

2.0 0.5y = 0.0494x + 0.4257

R² = 0.9991

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

-10.0 -5.0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0

Linewever-Burk

1/[S]

1/ V

o

1 KM 1 1

Vo Vmax [S] Vmax

= +

y = m x + b


Gráfica de Eadie-Hofstee

Vmax [S]

KM + [S]Vo =

(KM + [S]) Vo = Vmax [S]

KM Vo [S] Vo Vmax [S]

[S] [S] [S]=

+

Vo = - KM Vo Vmax

[S]

+

y = m x + b

Vo

[S]

V max

KM

Vo

Vmax


S (mM) Vo (mmol/L min)

0.05 0.71

0.10 1.07

0.20 1.50

0.35 1.80

0.50 1.88

1/S 1/Vo

20.0 1.4

10.0 0.9

5.0 0.7

2.9 0.6

2.0 0.5

Vo/S Vo

14.200.71

10.701.07

7.501.5

5.141.8

3.761.88

y = -0.1168x + 2.3571R² = 0.9947

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Vo

Vo/S

E-H

7


Cuando:

Vo= Vmax Todos los sitios activos están

ocupados y no hay moléculas de E libre.

KM= [S] Sí... ½ Vmax

KM representa la cantidad de sustrato

necesaria para fijarse a la mitad de la E

disponible y producir la mitad de la Vmax

KM representa la concentración del sustrato en

una célula


Gracias


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