preparo de amostras

1PREPARO DE AMOSTRAS PARA ANALITOS ORGNICOS

Material desenvolvido por:

Prof. Dr. Fbio Augusto (Unicamp)Profa. Dra. Maria Elisa Pereira Bastos de

Siqueira (Unifal-MG) Profa. Dra. Isarita Martins (Unifal-MG)

Por qu necessrio o preparo da amostra??

xAmostra coletada HPLC, ou LC-MS/MS

Amostra = no apropriada para a anlise...POR QU??

Muito suja contm outros componentes na matriz que interferem com a anlise Muito diluda analitos no esto concentrados suficientemente para perimitir a deteco Matriz no compatvel ou perigosa para a coluna/sistema cromatogrfico

Amostragem

Preparo das amostras

Identificao e/ou quantificao

Coleta de amostras representativas do material a ser analisado

Eliminao de interferentes e isolamento dos analitos de interesse

Separao, identificao e quantificao dos analitosquantificao

Processamento dos resultados

Avaliao dos resultados

dos analitos

Mtodos algbricos/ estatsticos para estimar quantidades e incertezas

Deciso sobre aes a serem tomadas em face aos resultados

Mtodo idealizado de preparo de amostra

analito interferente matriz

Separar analitos quantitativamente dos interferentes da matriz

Cromatografar a poro concentrada e limpa de analito

CG/CLAE

Volume Vam da amostra contendo ngramas de analito

Concentrao = Cam

n g de analito concentrados em um volume VamVfinal > Cam

CG/CLAE

O preparo de amostras envolve procedimentos de

Preparo de amostras: finalidades

Isolar os componentes de interesse (analitos) de uma matriz.

O preparo de amostras envolve procedimentos deextrao e pode tambm incluir etapa de purificao(cleanup) para amostras muito complexas.Esta etapa tambm objetiva trazer os analitos numnvel de concentrao adequado para a deteco eassim, tcnicas de preparo de amostras tipicamenteincluem o enriquecimento.

Finalidades do preparo de amostras

1. Purificao (clean up) da amostra- eliminao de interferentes que possam danificar o sistema cromatogrfico ou que possam interferir nasistema cromatogrfico ou que possam interferir na identificao e/ou quantificao dos analitos.

2. Pr concentrao dos analitos

2Benefcios do preparo de amostras

1. Tornar a matriz compatvel com a fase mvel e o detector.

2 Proteger o sistema e coluna cromatogrfica de2. Proteger o sistema e coluna cromatogrfica de contaminao por partculas e material de elevado peso molecular:

- aumento da vida til da coluna;

- menor gasto com manuteno;

- menos problemas operacionais.

Benefcios do preparo de amostras

3. Remover interferncias:

- simplificando a extrao;

- diminuindo o tempo de anlise;

- aumentando o limite de carga/ sensibilidade.

4. Concentrar componentes de interesse:

- aumentando a sensibilidade (detectabilidade);

- aumentando a reprodutibilidade.

Materiais biolgicos so complexos: contm protenas, sais, bases, lipdeos, carboidratos e compostos orgnicos s vezes similares quimicamente aos

Preparo de amostras biolgicas

orgnicos, s vezes similares quimicamente aos analitos.

Analitos: presentes em quantidades muito pequenasna amostra e ainda ligados s protenas.

COMO SEPARAR ANALITOS, MATRIZ E INTERFERENTES?

1. Propriedades fsico-qumicas dos constituintes da amostra

- analitos, interferentes e matriz so volteis?

- polares? apolares?

t lid ? l id ? ?- amostra: slida? lquida? gasosa?

- analitos so quimicamente e/ou termicamente estveis?

2. Concentrao de analitos e interferentes na amostra

- Quais as concentraes esperadas de analitos e de interferentes na amostra?

COMO SEPARAR ANALITOS, MATRIZ E INTERFERENTES?

3. Caractersticas da instrumentao disponvel

-O detector sensvel? seletivo? especfico? para o analito

- Algum componente do sistema incompatvel com constituintes d t t d ?da amostra ou reagentes usados?

4. Requisitos tcnico-gerenciais

- Existe metodologia oficial a ser seguida?

- Quantas amostras sero analisadas por dia?

- Existe pessoal capacitado para cumprir estas demandas?

Os objetivos da anlise indicam quanto de esforo deve ser envidado no preparo da amostra.Quesitos para um eficiente preparo da amostra:

Preparo de amostras

a) Perda mnima da amostra e boa recuperao do analito; ) p ;b) Componentes existentes na amostra e sem interesse

devem ser removidos eficientemente; c) No devem ocorrer problemas no sistema

cromatogrfico;d) O procedimento deve ser feito de forma conveniente e

rpido; e) O custo da anlise deve ser baixo.

3Preparo de amostras: tipos de tcnicas

1) Exaustivas

O objetivo a remoo completa dos analitos daO objetivo a remoo completa dos analitos da matriz e sua transferncia para a fase extratora.

- extrao lquido-lquido e extrao em fase slida (SPE)

Preparo de amostras: tipos de tcnicas

2) No-exaustivasbaseadas em princpios de equilbrio

2.1 Pequeno volume da fase extratora: SPME

2.2 Baixa constante de distribuio amostra/fase extratora: headspace

REMOO DE PROTENAS: precipitao, ultrafiltrao e dilise

Tratamento prvio de amostras

Desproteinizao requer:

(a) temperaturas elevadas

(b)alterao da fora inica ou osmtica ou do pH;

(c) agentes orgnicos de precipitao;

(d)enzimas proteolticas.

REMOO DE PROTENAS: VANTAGENS


(a) Simplicidade (2 a 3 etapas)(b) Baixo custo(c) Facilidade de automao

REMOO DE PROTENAS - PROBLEMAS


- precipitao incompleta das protenas (e algumas globulinas podem permanecer no sobrenadante eglobulinas podem permanecer no sobrenadante e passarem para o sistema de deteco);

- diluio da amostra (mais usado para concentraes mais elevadas de analitos);

- gerao de picos no CLAE ou interferncia na leitura espectrofotomtrica devido ao agente precipitante usado.

REMOO DE PROTENAS - Agentes mais usados:


a) Solventes orgnicos miscveis em gua (metanola) Solventes orgnicos miscveis em gua (metanol, etanol, acetonitrila, acetona, entre outros)

b) cidos: tricloractico, perclrico, sulfosaliclico, tngstico

c) Hidrxido de zinco

4HIDRLISE DE CONJUGADOS


(a)Especfica ou enzimtica, onde so utilizadas enzimas como as -glicuronidases e as aril-sulfatases

HIDRLISE DE CONJUGADOS


(a)Especfica ou enzimtica, onde so utilizadas enzimas como as -glicuronidases e as aril-sulfatasesFFontes: Helix pomatia (tbm sulfatases) e a Patella vulgata, Helix aspersa e a Escherichia coli.

- mais lenta, porm, menos vigorosa e mais seletiva, e no degrada os analitos;- exige que a atividade da enzima seja avaliada periodicamente, atravs do estudo de sua eficincia no processo de hidrlise; alm disto, a atividade da enzima pode ser inibida por componentes da matriz.


b) No-especficos, utilizando-se a hidrlise cida ou

HIDRLISE DE CONJUGADOS

alcalina.

- utiliza condies extremas de pH e de temperatura;- formao de produtos que interferem na extrao e

derivatizao, ou no perfil cromatogrfico dos analitos.

Principais processos fsico-qumicos de separao usados em metodologias de preparo de amostras

A PARTIO

B ADSORO

Os analitos so removidos da amostra por dissoluo em solvente apropriado

Os analitos so coletados na superfcie de B ADSORO

C VOLATILIZAO

pum slido com elevado poder adsortivo

Os analitos so evaporados seletivamente e separam-se da matriz e dos interferentes

PARTIO: Princpio bsico de operao

analito apolar matriz aquosa solvente apolar

Como a afinidade dos analitos pelo solvente apolar maior que sua afinidade pela matriz, eles tendem a se DISSOLVER (serem absorvidos) nessa fase apolar, imiscvel na matriz

Na separao por partio, os analitos so transferidos da matriz para um solvente extrator, formando uma soluo

PARTIO: fundamentos tericos

1 volume Vam da amostra com concentrao Cam do analito

2 volume Vext do solvente extrator adicionado

3 analitos dissolvem-se no solvente extrator at que ocorra o equilbrio

No equilbrio: Cres concentrao residual na amostra

Cext concentrao na fase extratora

K = Cext / Cres K = constante de distribuioParmetro bsico do equilbrio de partio

5PARTIO: fundamentos tericos

Equilbrio de partio:

Cext = next/ VextC / C / /K = Cext / Cres K = next/ nres . Vam/ Vext

Cres = nres /Vam

A constante de distribuio K pode ser expressa em termos do volume de amostra Vam e da fase extratora Vext usada, e das massas extradas next e residual (no-extrada) nres

PARTIO: materiais mais comuns

1. Solventes orgnicos: hidrocarbonetos (hexano, ter de petrleo); solventes organoalogenados (clorofrmio, diclorometano), etc.

2. Polmeros: acima da temperatura de transio vtrea (Tg), os polmeros orgnicos tm comportamento dissolvente semelhante aos dos lquidos convencionaisdissolvente semelhante aos dos lquidos convencionais

Polidimetilsiloxano Poliacrilatos

PDMS, silicona (Tg = -120C) R = metila, etila, etc. (Tg = - 24C)

ADSORO: fundamento da operao

Adsoro temporria!!!

Os analitos so transferidos seletivamente da matriz para o adsorvente

ADSORO: fundamentos tericos

Cada stio ativo: liga uma molcula por vez

A superfcie contm nmero grande, porm finito, de stios ativos

ligao do analito no stio ativo

Atrao entre dipolos (van der Waals): FISISORO

Por ligao qumica covalente:QUIMISORO

ADSORO: fundamentos tericosKads = coeficiente de adsoro. DEPENDE da afinidade do analito pelo slido adsorvente e pela matriz (similar ao K para a partio)

fisisoro

Quanto mais elevado o Kads, maior a quantidade de analito adsorvida no equilbrio.

ADSORO: classes de material adsorvente

1. CARVES: carvo ativo, carvo ativo grafitizado (Carboxeno), peneiras moleculares carbonceas (Carbosleves).

Grande afinidade por compostos orgnicos volteis (e amostras gasosas). Elevada estabilidade trmica (Tmax = 400 450 o. C)

2. ADSORVENTES INORGNICOS: quase sempre de alumina (Al3O2) e slica (SiO2) s vezes recobertos por filmes orgnicos quimicamente ligados.

Mais usados para compostos orgnicos de diferentes volatilidades (amostras gasosas e lquidas). Alta estabilidade trmica (Tmax = 400 450 o. C)

6ADSORO: classes de material adsorvente

3. POLMEROS ORGNICOS: grande variedade de materiais

Menor estabilidade trmica (Tmax= 180 - 350 o C); podem se decompor e introduzir contaminantes (artefatos) nos extratos.

Tenax TA

Polioxi de 2,6- difenileno

VOLATILIZAO: fundamentos tericos

matriz aquosa ou slida fase gasosa (headspace)

analito voltil interferente no-voltil

O headspace (espao confinante) pode ser introduzido diretamente no CG ou passar por outras etapas para isolamento do analito.

VOLATILIZAO: fundamentos tericosPode-se empregar um modelo simplificado similar ao da partio:

1. Volume Vm da amostra em contato com volume Vhs do headspace

2. Antes do equilbrio: concentrao Cam do analito no-voltil

3. Aps o equilbrio: Cres na amostra e Chs no headspace

Constante de Henry KhsKhs = Chs/ Cres

VOLATILIZAO: fundamentos tericos

Constante de Henry Khs

Khs = Chs/ Cres Khs ChsMais analito transferido da amostra para o headspace!!!

natureza do analito e da matriz constituinte da amostra

temperatura

amostra aquosa: pH, presena de sais, partculas, etc.

O valor de Khs varia com:

Baseia-se na afinidade daf li fli d lit

EXTRAO LQUIDO-LQUIDO (ELL)

forma lipoflica do analito porum solvente orgnico

EXTRAO LQUIDO-LQUIDO: procedimento convencional

Ocorre partio dos analitos entre a amostra aquosa e o solvente extrator orgnico.

7EXTRAO LQUIDO-LQUIDO: procedimento convencional

A quantidade extrada depende do volume de amostra e de solvente extrator e da constante de distribuio K

Eficincia da extrao = K / K + = Vam / Vext

Aumento do volume do extrator incrementa a frao extrada de um li d i d l d danalito em um determinado volume da amostra, mas pode

comprometer o efeito de pr-concentrao do analito extrado.


Escolha do agente extrator:

- maior compatibilidade com a ELL: baixo ponto

Solvente Solubilidade %

Isooctano 0.0002Heptano 0.0003Ci l h 0 006com a ELL: baixo ponto

de ebulio e baixa viscosidade;

- seletividade maior: solventes menos polares

Ciclo-hexano 0.006Hexano 0,014Pentano 0,040Clorofrmio 0,815Diclorometano 1,6ter etlico 6,89lcool Isobutlico 8,50Acetato de Etila 8,70Inalterado x Metablitos

Tipos de solvente

Triagem Mistura de solventes.


Anlise direcionada Solventecom maior afinidade pelo analito.cido hiprico: acetato de etila

Concentrao do extrato:Fluxo de N2 Acelera avaporizao sem aumento dat t


temperatura.

O2 Oxidar compostos maissensveis

EXTRAO(lquido-lquido)

EFEITO SALTING OUT = molcula de gua

+ NaCl (cloreto de sdio)CH2 CH N

H

H + NaCl (cloreto de sdio)

Na+ Cl-

CH3 H

CH2 CHCH3

NH

H

EXTRAO LQUIDO-LQUIDO procedimento convencional: efeito do pH

8Extrao cida:pH cido substncias decarter cido prevalecem na


carter cido prevalecem naforma no ionizada, lipoflica

INFLUNCIA DO pH NA HIDROSSOLUBILIDADE/LIPOSSOLUBILIDADEsubstncias de carter cido. Ex. cido 11-nor-delta -9-THC-COOH

COOH H+

Forma no-

ionizada

C

OH

OOH


cido 11-nor-delta -9-THC-COOH

OCH3CH3

OH

C5H11

OCH3CH3

C5H11

OH-Forma

ionizada

C

OCH3CH3

OH

C5H11

OO

Extrao bsica:

pH bsico substncias decarter bsico prevalecem na


carter bsico prevalecem naforma no ionizada, lipoflica

INFLUNCIA DO pH NA HIDROSSOLUBILIDADE/LIPOSSOLUBILIDADEsubstncias de carter bsico. Ex. anfetaminas

HH+

CH2 CHCH3

N+H

H

H


Anfetamina

CH2 CHCH3

NH

HForma ionizada

OH-

Forma no-ionizada

CH2 CHCH3

NH

H

EXTRAO(lquido-lquido)

urina

Solvente orgnicourina

Drogas/ metablitos

Agitao

Centrifugao Separao da fase orgnica extrato

Desvantagens:

Vantagem:extremamente simples e rpida


/ grande volume de solventes/ descarte do material/ formao de emulso/ seletividade sofrvel/ efeito de pr-concentrao limitado

9EXTRAO EM FASE SLIDA

SOLID PHASE EXTRACTION (SPE)

Extrao em fase slida

Permite a separao seletiva,purificao e a concentrao decompostos presentes emmatrizes complexas

CARTUCHO PARA SPE: seringa de polipropileno ou de vidro, contendo uma pequena quantidade de material sorvente ou adsorvente finamente granulado

DEPENDE:

volume da amostra, tipo de matriz, nmero etipo de analitos, entre outros...

OPERAO BSICA DE SPE

Escolha do cartucho

Mais usados: volume pequeno 200mg (1,2mL amostra); volume grande 500mg (4-5mL amostra).

Massa de sorvente varia entre 25 mg e 10 g

OPERAO BSICA DE SPEPre-tratamento da amostra, dependendo de:

- tipo de analito;

- tipo de matriz;

- natureza da reteno qumica.

ENVOLVE:- ajuste de pH;

- centrifugao;

- filtrao;

- diluio;

- adio de tampo, etc

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OPERAO BSICA DE SPEEtapa 1 Condicionamento do dispositivo de extraoPassagem de pequeno volume de solvente apropriado para umedecer o sorvente (grupos funcionais ligados) e garantir interao consistente

Natureza do solvente: depende do sorvente [slica e sorventes apolares metanol; sorventes polares solventes orgnicos] e da matriz

- depende da aplicao do materialde recheio;

- necessrio para ativar a fase;

OPERAO BSICA DE SPE

Etapa 1 Condicionamento do dispositivo de extrao

p ;

- no permite que o material seque.

Equilibrio: Sorvente/ fase tratada com soluo similar (em polaridade, pH, etc) matriz para maximizar a reteno dos analitos.

OPERAO BSICA DE SPE

Etapa 2 Eluio da amostra (lquida ou aquosa)Passagem da amostra no sorvente - volume de L a L;

- ajustes de pH, fora inica pode ser feito;(analito permanece na forma no dissociada paraficar mais retido no adsorvente)

OPERAO BSICA DE SPE

Etapa 2 Eluio da amostra (lquida ou aquosa)

)

Base fraca: pH 2 acima do pKa

cido fraco: pH 2 abaixo do pKa

- passar a amostra com vcuo ou presso;

- fluxo pode afetar a eficincia.

OPERAO BSICA DE SPE

Etapa 3 Lavagem do sorvente (clean up)

Natureza do solvente para clean up: poder de dissoluo suficiente para dessorver materiais fracamente sorvidos (interferentes?) mas no(interferentes?) mas no espcies fortemente sorvidas (analitos?)

descarte

- eluio do material no desejado ou noretido lavado com mesmo solvente daamostra;

OPERAO BSICA DE SPE

Etapa 3 Lavagem do sorvente (clean up)

- passando um solvente mais forte que aamostra pode remover algumas impurezasindesejveis (pode retirar o analito.Perigoso para a anlise).

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OPERAO BSICA DE SPE

Etapa 4 Dessoro dos analitosSolvente: deve possibilitar dessoro completa (quantitativa) dos analitos

Volume do solvente: o menor possvel (pr-

Volume do solvente: o menor possvel (pr-

concentrao)Preferncia a solventes

volteis

Anlise cromatogrfica

Aplicao da SPE: analitos no-volteis e semi volteis em amostras aquosas + separao cromatogrfica

concentrao)Preferncia a solventes

volteis

- eluio com pequeno volume de solvente

OPERAO BSICA DE SPE

Etapa 4 Dessoro dos analitos

- eluio com pequeno volume de solvente adequado (forte); Concentra o analito

- duas alquotas pequenas so mais eficientes que uma grande;

- interao por vrios segundos aumentam a eficincia da extrao.

Analito deve ser adsorvido no sorvente da SPE

Deve haver tempo suficiente de contato

REGRAS NO USO DA SPE

analito/sorvente

Interferentes endgenos da amostra devem ser seletivamente separados dos analitos

Analitos devem ser capazes de ser eficientemente removidos do sorvente

SPE: Mecanismos de separao

1. Adsoro: material slido que noapresenta filme lquido depositado napartcula - slica gel

Slica: dimetro da partcula: 30-50 mSuperfcie: 500-600 m2 /g

2. PARTIO: com fase quimicamente ligada (comportamento similar a de um filme de sorvente lquido na superfcie = partio)


p )

- fase normal: polar + matrizapolar retm analitos polarese os apolares so eludos

FASE NORMAL : polares

-INTERAES POLARES (Dipolo-dipolo, pontes de H)

Si C N

H O

CNCianopropil

Si NH

H

H

O

NH2Aminopropil

Si OOH

OH

H

NH

2OHDiol

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-fase reversa: apolar + matrizpolar retm analitos apolares

l l d


e os polares so eludos90% de uso em anlises de frmacos e toxicantes

Deseja reter um analito apolar no dissociado num meio aquoso. Matriz polar: urina

SPE FASE REVERSA: REGRAS

Reteno: mecanismos no-polares ou interaes hidrofbicas

Matriz (amostra): aquosa (fluidos biolgicos, guas)C t ti d lit ibi Caractersticas dos analitos: exibirem grupos funcionais no polares (a maioria de analitos orgnicos)

Esquema de eluio: interaes hidrofbicas so rompidas com solues mais hidrofbicas ou com solventes (metanol, diclorometano, etc ou combinao de gua ou tampes/solventes)

-INTERAES NO-POLARES (Van der Waals)

SiC8

Octila

FASE REVERSA: apolares

SiPH

Fenila

SiCHCiclohexila

Papel crtico do pH em SPE

-fases especiais e mecanismosmistos: fase mista contm parteda molcula apolar e parte com


da molcula apolar e parte comradicais polares: usadas parareter analitos polares e apolaresPouco eficiente: retm muitos interferentes

3. Pareamento inico

Fase apolar + matriz polarcom analitos inicos Adio de


com analitos inicos. Adio decontra-on neutraliza o analitoque retido na fase apolar(=mecanismo da fase reversa)dentro da prpria matriz passa um on e depois um contra on

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4. Troca inica

Fase modificada comfuncionalidade inica; analito de


funcionalidade inica; analito decarga oposta fase ser retido.Trocadores aninicos fortes (tetraalquilamneo) e fracos (amina)

Trocadores catinicos fortes (cidosulfnico) e fracos (cido carboxlicos)

-INTERAES INICAS (Eletrosttica)

SiCO

O- +NH3 RCBA

cido carboxlico

SPE: TROCA INICA

Si

SO3- +NH3

SCXcido

benzenosulfnico

Si N+(CH3)3 -SO3 RSAX

Trimetil aminopropil

SPE TROCA INICA : regrasMecanismos de reteno interaes eletrostticas

- o sorvente e os grupos funcionais do analito devem ter cargas opostas

Amostra (matriz) no polar ou polar

Caractersticas do analito troca catinica para compostos bsicos (ex: aminas))

troca aninica para compostos acdicos (ex. cidos carboxlicos, cidos sulfnicos, fosfatos)

Esquema de eluio quebra de ligaes eletrostticas - modificao do pH para neutralizar grupos funcionais do analito ou sorvente;- uso de um contra-on de grande seletividade para o sorvente com relao ao analito

!

Natureza dos solventes x SPE

Se for usada a partio: K = Cext / Cres

Concentrao no equilbrio:

Cext = na fase sorvente extratora

Cres = na amostra ou solvente de eluioK = f

afinidade sorvente

afinidade matriz/ solvente de eluio{Carregamento da amostra Clean up Dessoro dos analittosg

Soro dos analitos

K alto

Matriz com menor afinidade pelos analitos do que o

sorvente

Clean up

Dessoro de interferentes

K baixo

Solvente com maior afinidade pelos

interferentes de que o sorvente

Dessoro dos analittos

Dessoro de analitos

K baixo

Solvente com maior afinidade pelos analitos de

que o sorvente

INSTRUMENTAO PARA SPE

O SPE pode trabalhar on line(analitos transferidos diretamentedo SPE para o CG ou HPLC) ou offp )line (analitos coletados em tubos etransferidos para o cromatgrafo)

INSTRUMENTAO PARA SPE

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DISCOS DE SPEOperao similar filtrao vcuo

Recomendados: para grandes volumes de amostra contendo material particulado

Extrao mais rpida de que em cartuchos, permitindo uso de vazes elevadas de amostra.

Volumes maiores de amostra podem ser necessrios para aumentar a detectabilidade dos analitos.

DISCOS DE SPE

Maior dificuldade para otimizar seu uso (desenvolvimento do mtodo)

DESVANTAGENS DA SPE

Grande variedade de substncias qumicas, muitas escolhas para manipular solventes

Vrias etapas e maior tempo requerido Maior custo por amostra

VANTAGENS DA SPE

uso de pequeno volume de solvente pouco manuseio da amostra ausncia de emulso facilidade na automao baixo consumo de vidrarias menor tempo de anlise menor custo de mo de obra

Exemplos de aplicaes da SPE em Anlises Toxicolgicas

AplicaesGrupo

funcional do analito

Matriz Sorventes Solvente de eluio

Anlise de frmacos, drogas de

abusoAnlise de

praguicidas

Anis aromticos,

cadeias alquil

gua, tampes,

fludosbiolgicos

Octadecil, octil, etil, ciclohexil,

fenil, cianopropil

Metanol, acetonitrila,

acetato de etila, clorofrmio,

metanolacidificado,

hexano

Anlise de f i Hidroxilas,

Hexano, l

Cianopropil, diol, slica, Metanol, i l fenis,

aminas

Hidroxilas, aminas leos,

clorofrmio

diol, slica, aminopropil,

amina

isopropanol, acetona

Herbicidas, frmacos

Aminas, piridinas

gua, tampescidos, fludos

biolgicos

Trocadorfortemente ou

fracamentecatinico

Tampesbsicos, tampes

com alta forainica

cidosorgnicos, fosfatos

cidoscarboxlicos,

cidossulfnicos,

fosfatos

gua, tampesbsicos, fludos

biolgicos

Trocadorfortemente ou

fracamenteaninico

Tampes cidos, tampes com

alta fora inica

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HEADSPACE

EXTRAO POR HEADSPACE

DETERMINAO DE VOLTEIS

Amostra (urina, sangue ou saliva) + sulfato de sdio ESTUFA 70C

30 i GC

seringa

+ PI 30 min GC

preparo de amostras

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