POLIMORFISMOS DO GENE EGFR E

ASSOCIAÇÃO COM FATORES PROGNÓSTICOS

DO CÂNCER DE MAMA

MARCELO SOBRAL LEITE

RIO DE JANEIRO

2012

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS

DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGIA E QUÍMICA

MEDICINAL

Marcelo Sobral Leite

POLIMORFISMOS DO GENE EGFR E

ASSOCIAÇÃO COM FATORES PROGNÓSTICOS

DO CÂNCER DE MAMA

Orientadora:

Prof.ª Dr.ª Rosane Vianna Jorge

Rio de Janeiro

2012

Dissertação apresentada à

Pós-Graduação em Farmacologia e

Química Medicinal do Instituto de

Ciâncias Biomédicas da

Universidade Ferderal do Rio de

Janeiro, como requisito à obtenção

do título de mestre em

Farmacologia.

Leite, Marcelo Sobral.

Polimorfismos do gene EGFR e associação com fatores prognósticos

do câncer de mama Rio de Janeiro: UFRJ/ICB, 2012.141f.

Orientadora: Profª. Drª Rosane Vianna-Jorge.

Dissertação (Mmstrado)–UFRJ/ICB/Pós-graduação de Farmacologia

e Química Medicinal, 2012.

Referências Bibliográficas: f. 110-132.

1. Câncer de mama. 2.Polimorfismo. I. Título.

CDD:

...à minha mãe.

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer primeiramente a todas as mulheres,

pacientes de câncer de mama do Hospital do Câncer III do INCA, pelo carinho,

sorrisos, forças, emoções e aprendizados. Sinceros agradecimentos às

pacientes que aceitaram participar deste estudo e se esforçaram para

responder sinceramente ao questionário aplicado.

Este trabalho não teria sido realizado sem o apoio dos diversos

setores do Hospital do Câncer III do INCA. Muito obrigado a todos os colegas

dos Serviços de Psicologia, Serviço Social, Fisioterapia, em especial ao

Fisioterapeuta Ricardo Dias, Érica, Maria Gisele, Nayana, Elisângela, e a

Zuleica, a Penha e tantos outros. Obrigado a todos do Laboratório de Análises

Clínicas, a Tereza, Rita, Rosane; da Oncologia Clínica, ao Dr. Luis Guilherme,

a todos da Farmácia, do Centro de Estudos, do Serviço de Quimioterapia e

todas as enfermeiras.

Agradeço imensamente a colaboração do prof. Rodrigo Moura-Neto e a

todos de seu laboratório, Priscila, Tatiana; a colaboração da Dra Gisele

Vigdinal do Serviço de Patologia do INCA; a colaboração do Departamento de

Genética do CPq/INCA, em especial a Kelly, Leila, Priscila, Hanna, João; a

colaboração do prof. Marcelo Alex, e de todos os colegas da farmacologia do

INCA, Renata, João, Giu, Cínthias, Mateus, Fê, Vera, Vanessa, Thales; a todos

da Pesquisa Clínica e BNT, Maurício, Fernandinha, Vivi, Haynna, Andrea e

Valadão; e aos amigos do Grupo de Farmacologia Clínica e Assistência

Farmacêutica: Ju, Carol, Diogo, Vanessa, Sheyla, João, Tales, Taiana, Padula,

Hayra, Laura, Camila, Márcia... e em especial a Letícia Giacomin pela parceria

e a Rosane pela orientação.

Agradeço ao Departamento de Farmacologia e Química Medicinal da

UFRJ, as professoras Tereza Sollero, Cláudia Benjamin, Cláudia Martins e

Eline, os professores Paulo Melo e Newton, e a todos os alunos da pós pelo

apoio incondicional.

Agradeço a American Association for Cancer Research e a Avon

Fundation pelo apoio, oportunidade e incentivo. Aos colegas da Perinatal,

Chico, Simones, Adriano, Anna, Ana, Susana, Michael, Odália, Dr. Jofre e Dr.

Fernando, Izaura, Marta, Fábia, etc...

Agradeço a todos os meus amigos que me apoiaram e incentivaram, a

minha irmã Gê, a Paulinha, Jô, Carol, Om, Clara, Gracinha, Chamusca, Torvi,

Ariel, Blenda, Billy, Pryia, amigo Felipe, Enoque e todos da Mansão. Gio,

obrigado, sua força chegou aqui.

Por fim, minha eterna gratidão ao meu Mestre da Vida, Dr. Daisaku

Ikeda, Presidente da Soka Gakkai Internacional; e a todos os amigos místicos

da Associação Brasil SGI, Simas, Monique, Selma, Joanas, Cida, Wal,

Giovana, Ari, Naza, Earl Taylor, Márcia Nicolau e tantos maravilhosos

companheiros! Forte agradecimento ao Paulo, Vitor, Tom e todos os membros

do Tayio Ongakutai!

A minha afilhada Letícia, meus cumpadres Lázaro e Yara, pela ausência

necessária. A toda minha família, primo Augusto, Vanessa, prima Nina, Andrea

tia Celita, Tania, minha Vó, Laís e Alexandre. Meus sinceros agradecimentos

eternos ao meu pai, e a minha mãe.

"Se você quer descobrir alguma

coisa, tem que acordar e dormir com

essa coisa na cabeça. Não pode

dispersar. “

Octavio Augusto Ceva Antunes

Lista de Simbolos

º grau(s)

® marca registrada

% porcentagem

∑ somatória

≤ menor ou igual

≥ maior ou igual

< menor que

> maior

μ micro (10-6)

Lista de Abreviaturas

ác. ácido

ajus ajustado

Arg arginina

cr crude

IC95% Intervalo de confiança de 95%

Lys lisina

mg miligramas

min minuto(s)

N número de amostras

p/v peso por volume

pb pares de base

pN status linfonodal

pT tamanho tumoral

pTMN estadiamento TNM

p/ para

s/ sem

Lista de Siglas

ASCO American Society of Clinical Oncology

CAP College of American Pathologists

DNA ác. desoxirribonucleico

EGF epidermal growth factor.

EGFR receptor de EGF

ERR Estimativa de Risco de Recorrência da Doença

GSK-3ß glicogênio sintase cinase 3ß

HBEGF heparin‑binding EGF‑like growth factor

INCA Intituto Nacional do Câncer

IP3 trifosfato de inositol-1,4,5

MAPK cinases ativadas por mitógeno

NPI Nottingham Prognostic Index

NRG neuregulin

OR odds ratio

PCR polymerase chain reaction

PI3K fosfatidilinositol trifosfato cinase

PIP3 fosfatidilinositol trifosfato

RE Receptor de Estrogênio

RFLP restriction fragment length polymorphism

RNA ác. ribonucleico

RP Receptor de Progesterona

SNP single nucleotide polymorphism -

TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TGFα transforming growth factor‑α

UICC International Union Against Cancer

WHO World Health Organization

SUMÁRIO

RESUMO

ABSTRACT

1. INTRODUÇÃO......................................................................... 13

1.1. CÂNCER........................................................................... 13

1.2. CÂNCER DE MAMA........................................................ 20

1.3. POLIMORFISMOS GENÉTICOS...................................... 35

2. OBJETIVOS........................................................................... 49

2.1. OBJETIVO GERAL........................................................... 49

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................. 49

3. MATERIAL E MÉTODOS....................................................... 50

3.1. DESENHO DO ESTUDO.................................................. 50

3.2. PACIENTES..................................................................... 50

3.3. FORMULÁRIOS............................................................... 51

3.4. VARIÁVEIS CLINICO-PATOLÓGICAS............................ 51

3.5. ANÁLISE DOS POLIMORFISMOS.................................. 60

3.6. ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................. 71

4. RESULTADOS....................................................................... 72

4.1. POPULAÇÃO................................................................... 72

4.2. ASSOCIAÇÕES GENÓTIPO X FENÓTIPO.................... 78

5. DISCUSSÂO.......................................................................... 101

6. CONCLUSÂO........................................................................ 110

7. REFERÊNCIAS..................................................................... 111

ANEXOS

RESUMO

Introdução: O receptor do fator de crescimento epidermal (EGFR) é um

receptor tirosina-cinase que desempenha papel crucial no crescimento celular,

regulando a diferenciação das células e tecidos. O EGFR encontra-se

frequentemente super expresso em muitos tumores, inclusive no câncer de

mama e contribui para uma proliferação anômala. Um polimorfismo do gene

EGFR é uma sequência de repetição CA no intron 1 (rs72554021). Sequências

mais curtas, i. e (CA)n ≤ 16 são associadas a maior atividade transcricional em

tumores de mama. Outro polimorfismo, uma troca de um único nucleotídeo,

R497K (rs11543848), localizado no exon 13, está associado a um prognóstico

favorável em carcinoma colorretal e em câncer de pulmão.O objetivo deste

estudo foi investigar a associação entre estes polimorfismos do gene EGFR e

variáveis histopatológicas com valor prognóstico em câncer de mama.

Materiais e métodos: A população de estudo foi formada por mulheres

brasileiras (≥ 18 anos de idade), com diagnóstico confirmado de câncer de

mama unilateral não metastático. O DNA genômico foi extraído de amostras de

sangue e a análise do tamanho de fragmento do intron 1 foi determinado por

eletroforese de capilar em 426 pacientes, enquanto o polimorfismo R497K foi

identificado em 472 pacientes por reações de PCR seguidas de digestão com

enzima de restrição. O perfil histopatológico foi determinado após a ressecção

do tumor. A associação entre os genótipos do EGFR e as características

histopatológicas foram analisadas pelo teste do chi-quadrado, com cálculo das

razões de chance (odds ratio, OR) simples e ajustadas, com seus intervalos de

confiança (IC95%). Resultados e discussão: Onze alelos diferentes foram

encontrados para o polimorfismo (CA)n, variando de 14 a 24 repetições,

formando 37 genótipos diferentes. O alelo mais frequente foi o de 16 repetições

CA (0,425; IC95%, 0,398-0,460). A frequência do alelo variante do R497K

(Lys), foi de 0,218 (IC95%, 0,192–0,245). Pacientes com os dois alelos longos,

i.e (CA)n > 16 repetições, mostraram menor chance de apresentar status de

receptor de progesterona negativo (ORajus = 0,324; IC 95%, 0,124–0,845).

Pacientes com pelo menos um alelo Lys mostraram menor chance de

apresentar status linfonodal pN2 ou pN3 (ORajus = 0,332; IC95%, 0.164–0.671),

o que contribui para melhor estadiamento TNM (ORajus = 0,389; IC95%, 0,202–

0,749) e melhor estimativa de risco de recorrência (OR = 0.470; IC95%, 0,278–

0,794) quando comparados aos pacientes com genótipo R497K predominante

(Arg/Arg). Pacientes com pelo menos um alelo Lys e com os dois alelos de

repetição CA longos mostraram menor estimativa de risco de recorrência (OR =

0,210; IC95%, 0,063–0,695). Conclusão: A combinação dos dados dos dois

polimorfismos do gene EGFR sugere que a presença das formas variantes

contribui para melhor prognóstico no câncer de mama.

Palavras-chave: EGFR, polimorfismo, câncer de mama, prognóstico.

ABSTRACT

Introduction: The epidermal growth factor receptor (EGFR) is a

transmembrane tyrosine kinase receptor, which plays an essential role in

growth by regulating the differentiation of cells and tissues. EGFR is frequently

overexpressed in many tumors, including breast cancer, and contributes to

unrestricted proliferation. One EGFR gene polymorphism is a (CA)n

dinucleotide repeat sequence (rs72554021) in intron 1. Shorter sequences, i.e

(CA)n ≤ 16 dinucleotide repeats are associated with increased EGFR

transcriptional activity in breast tumors. Other, single nucleotide polymorphism,

R497K (rs11543848), located in exon 13, is associated with favorable prognosis

in colorectal carcinoma and lung cancer. The aim of the present study was to

investigate the association between EGFR polymorphisms and

histopathological variables with prognostic value in breast cancer. Material and

method: The study population consisted of Brazilian women (≥ 18 years old)

with a confirmed diagnosis of unilateral non-metastatic breast cancer. Genomic

DNA was extracted from blood samples and the fragment length of the intron 1

was determined by capillary electrophoresis in 426 patients, whereas R497K

was identified in 472 patients by PCR-RFLP. The histopathological profile was

determined after tumor resection. The association between EGFR genotypes

and histopathological features was evaluated by the Chi-square test, with

calculation of the adjusted odds ratios (ORajus) and their 95% confidence

intervals (95%CI). Results and discussion: Eleven different (CA)n alleles were

found, ranging from 14 to 24 repeats, forming thirty seven different genotypes.

The major frequent allele was (CA)16 (0.425; 95%CI, 0.398–0.460).The

frequency of the R497K variant (Lysi) allele was 0.218 (95%CI; 0.192–0.245).

Patients with two long alleles, i.e. (CA)n > 16 repeats, showed a lower chance

of being negative for progesterone receptor (ORajus = 0.324; 95%CI, 0.124–

0.845). Patients with at least one Lys allele showed a lower chance of

presenting lymph node status pN2 or pN3 (ORajus = 0.332; 95%CI, 0.164–0.671),

which contributed for lower stages in TNM status, (ORajus = 0.389; 95%CI, 0.202–

0.749) and lower estimated risk of recurrence (OR = 0.470; 95%CI, 0.278–

0.794), than those who were Arg/Arg. Patients with at least one Lys allele and

with two long (CA)n alleles showed a lower estimated risk of recurrence (OR =

0.210; 95%CI, 0.063–0.695). Conclusion: The combined data of R497K and

(CA)n repeat polymorphism suggests that the presence of the variant forms of

EGFR contribute for better prognosis in breast cancer.

Key-words: EGFR, polymorphism, breast cancer, prognosis.

13

1 INTRODUÇÃO

1.1 CÂNCER

Câncer é o nome genérico dado a um conjunto de mais de 100 doenças

que têm em comum o crescimento desordenado de células que invadem

tecidos e órgãos. Dividindo-se rapidamente, estas células tendem a ter um

perfil metabólico anômalo e arranjo celular desordenado, determinando a

formação de tumores malignos, que podem espalhar-se para outras regiões do

corpo (Moore 1966).

O câncer pode ser considerado uma doença genética, uma vez que é

desencadeado por alterações no DNA da célula. No entanto, o câncer não é

necessariamente uma doença hereditária. Os cânceres humanos são, na sua

maioria, de origem somática, resultantes da interação de fatores genéticos e

ambientais (Perera et al. 1997).

A incidência de câncer no mundo vem aumentando rapidamente nos

últimos anos em decorrência do envelhecimento da população mundial e da

crescente exposição a fatores de risco ambientais. A Organização Mundial da

Saúde estimou que, no ano 2030, podem-se esperar 27 milhões de casos

incidentes de câncer, 17 milhões de mortes por câncer e 75 milhões de

pessoas vivas, anualmente, com câncer (WHO 2010). Assim, terapias cada vez

mais eficazes para o combate a esta enfermidade e a otimização de terapias

utilizadas atualmente se fazem necessárias.

No Brasil, as estimativas do Instituto Nacional do Câncer para o ano de

2012 (válidas também para 2013) apontam a ocorrência de 518.510 casos

novos de câncer, incluindo os casos de pele não melanoma, reforçando a

magnitude do problema do câncer no país (INCA 2011).

O quadro 1 mostra os 10 tumores com maiores estimativas de incidência

em 2012, excetuando-se o câncer de pele não melanoma, e suas respectivas

distribuições percentuais de acordo com o sexo (INCA 2011).

14

1.1.1 Biologia do câncer

A formação de um tumor é um processo complexo e frequentemente se

estende por décadas. A maioria dos tumores humanos se desenvolve a partir

de tecidos epiteliais. Os tumores oriundos destes tecidos são denominados

carcinomas (Peto 2001).

O aumento no grau de anormalidade tecidual de células em crescimento

e proliferação exacerbada é um processo comum no caminho da progressão

tumoral, no qual células consideradas normais se desenvolvem

progressivamente em fenótipos malignos, passando por etapas que mantém o

seguinte sentido: normal → hiperplásico → displásico → neoplásico →

metastático. A ciência busca entender a relação entre causa e efeito destes

eventos (Preston-Martins et al 1990).

Hanahan et al. (2000) enumeraram as seis alterações celulares básicas

que contribuem para a carcinogênese. Podem ser citadas: autossuficiência em

relação aos fatores de crescimento; insensibilidade aos inibidores de

crescimento; evasão à morte celular programada por apoptose; potencial

ilimitado de replicação; angiogênese sustentada; invasão tecidual;

disseminação à distância (figura 1).

Quadro 1: Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes estimados para

2012 por sexo, exceto pele não melanoma (números arredondados para 10 ou múltiplos de 10)

(INCA 2011).

15

Assim, diversos genes associados a estes mecanismos e ao reparo aos

danos do DNA são atualmente estudados buscando a compreensão do

processo de carcinogênese (Hoeijmakers 2001; Wilson et al. 2002).

1.1.1.1 Fatores de crescimento

As células normais necessitam de sinais mitogênicos para desencadear

seus processos de transformação do estado quiescente para os estados ativo

ou proliferativo (Fedi et al. 1997). São sinais estimulatórios, mediados por

fatores de crescimento, que se ligam a receptores transmembranares, que

integram tal sinal de ligação a circuitos complexos dentro da célula (Alberts et

al. 2004). Em sequência ao evento inicial de ligação entre o fator de

crescimento e seu respectivo receptor, diversas moléculas mensageiras

realizam a transdução de sinal via uma rede de proteínas transdutoras que irão

desencadear atividades celulares, tais como a transcrição gênica no núcleo e o

repasse destas informações para células vizinhas (Alvarado et al. 2010). Esta

Figura 1: Capacidades adquiridas na carcinogênese.

Ocorrem de maneira semelhante nos processos de

desenvolvimento dos tumores, através de funções

originadas por diversos mecanismos e estratégias

celulares. Adaptado de Hanahan et al. (2000).

16

cadeia de eventos se inicia com a fosforilação de resíduos de tirosina na

porção intracelular do receptor e, para tanto, os domínios com atividade

tirosina-cinase cumprem papel crucial no mecanismo de transdução de sinal

proliferativo (Aaronson 1991; Avraham & Yarden 2011).

A família ErbB de receptores com atividade tirosina-cinase consiste de

quatro membros: receptor para fator de crescimento epidermal (EGFR; ErbB-

1), HER2 (ErbB-2 ou Her2-neu), HER3 (ErbB-3) e HER4 (ErbB-4) (figura 2);

que desempenham funções envolvidas nos processos de migração,

crescimento, adesão e diferenciação celular, eventos chaves na progressão

tumoral (Shepard et al. 2008; Flynn et al. 2009; Da Silva et al. 2010).

1.1.1.1.1 EGFR

O receptor do fator de crescimento epidermal (epidermal growth factor

receptor – EGFR), é uma estrutura transmembrana sensível a sinais

proliferativos representados pelo fator de crescimento epidermal (epidermal

growth factor – EGF) e pelo fator de transformação e crescimento α

(transforming growth factor-α – TGF-α). O receptor do fator de crescimento

Epidermal (EGFR) é uma glicoproteína transmembrana de 170 kDa, com

atividade tirosina-cinase, que tem um papel crucial na proliferação,

Figura 2: Representação esquemática dos ligantes da família ErbB de Homo sapiens. A semelhança entre as cadeia de aminoácidos dos os receptores varia de 53% entre EGFR e ErbB3 a 64% entre EGFR e ErbB2 (Jorissen 2003). Pelo ponto de vista tridimensional, as regiões extracelulares da região C-terminal se diferenciam mais entre os homólogos da família. Quando ligantes específicos interagem com o domínio cinase, ocorre a formação de dímeros e ativação dos domínios tirosina-cinase e promoção da atividade intracelular. A formação de homodímeros e heterodímeros é definida de acordo com os ligantes e a

interação entre os homólogos (Olayioye et al. 2000). HBEGF: heparin‑binding EGF‑like

growth factor; NRG: neuregulin; TGFα, transforming growth factor‑α; EGFR: epidermal

growth factor. Adaptado de Avraham & Yarden (2011).

17

diferenciação e motilidade de células normais e tumorais (Jimeno & Hidalgo

2006). O EGFR é uma proteína codificada pelo gene EGFR, que está situado

no braço longo do cromossomo 7, sendo codificado a 25 exons. É sintetizado a

partir de um precursor polipeptídico de 1210 resíduos e, após clivagem de

sequência da porção N-terminal, a proteína de 1186 resíduos é inserida na

membrana celular (Jorissen 2003).

A ligação de fatores específicos promove a formação de homodímeros

ou heterodímeros com outros membros da família erbB, desencadeando a

fosforilação de vários resíduos de tirosina do domínio intracelular (Olayioye et

al. 2000; Modjtahedi & Essapen 2009) (figura 3). Aqui, são descritos alguns

mecanismos que resultam na fosforilação de vários substratos intracelulares

que irão ativar diversas cascatas intracelulares (Shepard et al. 2008; Spano et

al. 2008).

A cascata de fosforilação desencadeada pela ativação do EGFR vai

atuar através da atividade de uma complexa rede de proteínas que atuam

como mensageiras da transdução de sinais proliferativos (Mendelsohn &

Baselga 2003; Jimeno & Hidalgo 2006; Flynn et al. 2009; Jorissen 2003) (figura

4). Um dos principais mecanismos do receptor envolve a ativação da proteína

Ras via um fator de troca de nucleotídeo de guanina, levando à atividade de

uma série de cinases ativadas por mitógeno (MAPK), como Raf, MEK, Erk1 ou

2, que irão regular a transcrição de genes e fatores de transcrição (c-myc, c-

Figura 3: Um receptor de fator de crescimento epidermal funcionando normalmente emite sinais (em vernelho) em resposta à interação com o ligante

Adaptado de Weinberg (2008).

18

Jun, JNK e p38) associados ao início do ciclo de divisão e transformação

celular (Jimeno & Hidalgo 2006; Modjtahedi & Essapen 2009).

A ação da cascata de fosforilação do receptor EGFR desencadeia

também a formação de trifosfato de inositol-1,4,5 (IP3) e diacilglicerol, pela

ação catalítica da enzima fosfolipase C sobre o fosfatidilinositol exposto na

porção hidrofílica citoplasmática da bicamada lipídica. Estes eventos

desencadeiam a formação de fosfatidilinositol trifosfato (PIP3) pela ação da

fosfatidilinositol trifosfato cinase (PI3K) (figura 5). PIP3 torna-se um sítio de

ancoragem de uma cinase treonina-serina chamada Akt/PKB que

desencadeará o trabalho de uma série de fatores de síntese proteica, como

mTOR (mammalian Target of Rapamycin) e de estimulação da proliferação

celular, como o glicogênio sintase cinase 3ß (GSK-3ß) (Kallergi et al. 2008;

Gori et al. 2009).

A ativação da via do PI3K via EGFR desempenha um papel central

numa série de rotas sinalizadoras associadas ao crescimento, mobilidade,

proliferação, diferenciação e a sobrevivência celular, além de influenciar a

redução da possibilidade de ativação do programa de apoptose (Zhang et al.

2006; Dong et al. 2009; Matsubara et al. 2010).

Figura 4: Exemplo de associação intermolecular para ativação de Ras via associação com Sos, um fator de troca de guanina. Uma proteína adaptadora Grb2 utiliza seus domínios SH3 para ligar Sos e seu domínio Sh2 para ligar-se a uma fosfotirosina numa proteína de sustentação Shc, que por sua vez, utiliza seu próprio domínio Sh2 para ancorar numa fosfotirosina do receptor

EGFR quando este é ativado. Adaptado de Weinberg (2008).

19

Em células neoplásicas, alguns eventos como a superexpressão do

receptor, mutações e amplificações de seu gene, podem resultar numa

superatividade e retroalimentação das cascatas proliferativas (Moroni et al.

2005; Siena et al. 2009 Wykosky et al. 2011). Estes são mecanismos

oncomoleculares importantes para coordenação bioquímica da divisão celular,

adesão, reparo, invasão e sobrevivência celular (Levin 2003; Gonçalves et al.

2008).

Diversos trabalhos mostram a associação entre superatividade desta via

proliferativa e piores desfechos no tratamento de inúmeros tipos de câncer. O

aumento do nível da expressão gênica do gene EGFR está relacionado a

piores desfechos clínicos em diferentes neoplasias, inclusive em câncer de

mama (Mendelsohn & Baselga 2003; Brandt et al. 2006; Agelopoulos et al.

2007). Entretanto, as causas e mecanismos neoplásicos que levam a esta

superatividade ainda não são compreendidos por completo (Edwards et al.

2006; Liu et al. 2007; Rego et al. 2010).

Figura 5: A de atividade de PIK3 formando PIP3, cria um sítio de ancoragem de Akt/PKB pelo seu domínio PH, que uma vez ancorado, sofre fosforilação de duas outras cinases (PDK1 e PDK2), estimulando

uma série de substratos. Adaptado de Weinberg (2008).

20

1.2 CÂNCER DE MAMA

1.2.1 Epidemiologia

O câncer da mama é o tipo de câncer que mais acomete as mulheres

em todo o mundo, tanto em países em desenvolvimento quanto em países

desenvolvidos. Cerca de 1,4 milhões de casos novos dessa neoplasia foram

esperados para o ano de 2008 em todo o mundo, o que representa 23% de

todos os tipos de câncer (WHO 2010).

Apesar de apresentar um bom prognóstico quando diagnosticado

precocemente e tratado imediatamente, o câncer de mama é responsável por

18% dos óbitos por câncer, em mulheres, por ano (INCA 2009). De acordo com

dados do INCA, esperam-se, para o Brasil, em 2012, 52.680 casos novos de

câncer da mama, com um risco estimado de 52 casos a cada 100 mil mulheres

(INCA 2011). Dessa forma, o câncer de mama é considerado um problema de

saúde pública no Brasil.

No estágio atual do conhecimento, não existem medidas específicas de

prevenção primária para o câncer de mama. A detecção precoce é o objetivo

principal, visando à diminuição da mortalidade e o aumento da sobrevida livre

de doença (Lee et al. 2012), com este objetivo, diversos países, inclusive o

Brasil, implantaram programas de rastreamento da doença com exame

mamográfico. (Boyle & Levin 2008; INCA 2011).

1.2.2 Fatores de risco

Embora não se conheça exatamente todo o mecanismo causal do

câncer de mama, não há dúvida de que a interação entre os fatores genéticos

e ambientais exerce papel fundamental na etiologia e na evolução dos casos

(Mill et al. 2010).

Dados clínicos, epidemiológicos e experimentais têm demonstrado que o

risco de desenvolvimento de câncer de mama esporádico está fortemente

relacionado à produção de esteroides sexuais. Condições endócrinas

moduladas pela função ovariana, como a menarca precoce, menopausa tardia

21

e gestação, assim como a utilização de estrógenos exógenos, são

componentes relevantes do risco de desenvolvimento do câncer de mama

(MacMahon et al. 1970; Lambe et al. 1996; Greenlee et al, 2000).

A utilização de contraceptivos hormonais orais e terapia hormonal pós-

menopausa podem causar pequenos aumentos no risco de câncer de mama

(Key et al. 2001). É controversa a hipótese de que o consumo de álcool (Kelsey

et al. 1996), o sedentarismo, a obesidade e a dieta lipídica aumentam o risco

de câncer de mama (Marchant, 1997; National Cancer Institute Bethesda 2008;

Mill et al. 2010).

Entre os fatores ambientais, a exposição à radiação ionizante é

sabidamente associada ao câncer de mama. Os campos eletromagnéticos

assim como os pesticidas também têm sido apontados como possíveis

responsáveis pelo aparecimento deste tipo de câncer (Kelsey et al. 1996; INCA

2011).

Estima-se que cerca de 5 a 10% dos casos de câncer de mama estejam

ligados a causas hereditárias de desenvolvimento do câncer. Nestes casos é

possível determinar claramente um padrão de herança familiar associada a

mutações em genes determinantes de susceptibilidade ao câncer (Easton

1993; Ford 1998). Os casos de câncer de mama hereditários têm como

importante característica o acometimento de mulheres jovens. Quando a

doença se apresenta antes dos 35 anos, em 25% dos casos existe uma

relação com fatores hereditários (Gomes et al. 2002; Anders et al. 2008).

BRCA1 e BRCA2 são genes humanos que estão na classe dos genes

conhecidos como supressores de tumor. Mutações nestes genes estão ligadas

ao aumento do risco de câncer de mama hereditário e câncer de ovário (Dapic

et al 2005). Mulheres com predisposição hereditária associada a mutações no

gene BRCA1 têm um risco estimado de 56-80% para o desenvolvimento do

câncer de mama (contra 11% na população geral) e de 16 a 60% para câncer

de ovário (contra 1,4 a 2,5% na população geral) (Miki et al 1994; Spurdle et al.

2011).

22

1.2.3 Diagnóstico

O advento da mamografia e sua modernização têm trazido benefício

para o diagnóstico do câncer de mama. Diante de leões suspeitas detectadas

pelos exames de imagem, a prática das biópsias percutâneas como punção

aspirativa com agulha fina, core-biopsy ou mamotomia possibilitou a

confirmação ou a invalidação de malignidade, evitando-se procedimentos mais

invasivos (Fumagalli & Sotiriou 2010; Leong & Zhuang 2011). O diagnóstico do

câncer de mama em estádio inicial tem sido associado a muitas variáveis, entre

elas, a posição sócio-econômica e o acesso à saúde oferecido à população

(Lanin et al. 1998; Richardson et al. 2001; Bradley et al. 2002; Lee et al. 2012).

O sistema de estadiamento usado com mais freqüência é o de

classificação TNM (T = tamanho; N = nódulos linfáticos comprometidos; M =

metástases a distância) da International Union Against Cancer (UICC, 2002).

Com relação ao Brasil, com base nos dados disponíveis de registros

hospitalares, 60% dos tumores de mama, em média, são diagnosticados em

estádio III ou IV (INCA 2005; Simon et al. 2009).

1.2.4 Patologia

As neoplasias de mama têm apresentação clínico-patológica e

comportamento biológico extremamente heterogêneo, em parte pela variedade

de tecidos envolvidos na gênese das lesões epiteliais, mesenquimais e

mioepiteliais, em parte pela composição genética de cada tipo histológico. O

conhecimento dos aspectos morfológicos, moleculares e bioquímicos tem sido

importante no sentido de auxiliar nas estratégias de tratamento local e

sistêmico (Peto 2001; Yenidunya et al. 2011). Dentre os fatores clínico-

patológicos, o tamanho do tumor, o grau tumoral, o estado do envolvimento dos

linfonodos regionais e a idade seguem sendo as variáveis de maior impacto no

prognóstico do câncer de mama (Arriagada et al. 2006; Soerjomataram et al.

2008; Anders et al. 2008). O tipo histopatológico, o grau nuclear, o nível de

expressão do receptor HER-2 e do receptor de estrogênio, entre outras

23

variáveis, também contribuem para refinar a classificação dos casos (Carvalho

et al. 2011; Danova et al. 2011).

1.2.4.1 Tipos histopatológicos

A classificação histopatológica baseia-se em características celulares e

padrão de crescimento de células sem considerar o local de origem da

neoplasia. Adjetivos como ductal ou lobular definem padrões de apresentação

morfológica com critérios definidos pela Organização Mundial de Saúde

(Travassoli & Devilee 2003) e pelo College of American Pathologist

(Fitzgibbons et al. 2000). Quanto ao aspecto morfológico, as neoplasias de

mama se apresentam na forma in situ ou invasiva.

1.2.4.1.1 Carcinomas in situ

Caracteriza-se por proliferação epitelial neoplásica, sem sinais de

ultrapassagem da membrana basal (Pinder & Ellis 2003). São comumente

considerados como uma etapa na sequência que antecede o carcinoma

invasivo, entretanto, é importante reconhecer que nem sempre o processo é

contínuo, e nem todos os carcinomas in situ evoluem para a forma invasiva

(Silverstein et al, 1996).

1.2.4.1.2 Carcinomas Invasivos

Apresentam-se geralmente constituídos por células epiteliais poligonais,

com atipia variável, distribuídas em agrupamentos coesos com a tendência de

formação de espaços em meio ao estroma com variáveis desmoplásicas e

infiltrados linfoides (Fitzgibbons et al. 1999). O tipo mais frequente é o ductal,

seguido de longe pelo carcinoma lobular. Entre os tipos especiais, alguns têm

comportamento biológico mais favorável em relação ao tipo ductal, como os

carcinomas tubular, mucinoso do tipo colóide, cribriforme infiltrativo, secretor e

adenocístico, enquanto outros têm comportamento mais agressivo, tais como o

metaplásico e o micropapilar invasivo (Di Saverio et al. 2008).

24

1.2.4.2 Grau Histológico

Os carcinomas invasivos são subdivididos de acordo com o grau de

diferenciação celular. Esta graduação busca estimar o quanto as células

neoplásicas se distanciam de um fenótipo normal (E. A. Rakha, Reis-filho, et al.

2010). Dados clínicos e patológicos vêm mostrando que o grau histológico é

um fator que, aliado ao status linfonodal, tem grande valor na predição de

desfecho da doença. Sua caracterização é relativamente simples, com custo

econômico baixo, requerendo apenas a avaliação de um patologista treinado

para análise microscópica de um corte tecido tumoral corado em hematoxilina-

eosina. (Galea et al. 1992; Walker 2003).

Dentre os sistemas mais usuais de graduação histológica, destacam-se

a classificação de Scarff-Bloom-Richardson, o sistema de graduação nuclear

de Fisher e o sistema de Nottingham. Em todos eles, o aumento do grau é

associado a piores desfechos clínicos (Harris et al. 2004).

A UICC (2002) utiliza o sistema de Nottingham para graduação

histológica de 1 a 3 de acordo com o arranjo tubular, o pleomorfismo nuclear e

a contagem mitótica presente na análise microscópica tumoral (Elston & Ellis,

1991) (figura 6). A sobrevida em 20 anos entre pacientes com neoplasias 1, 2

e 3 é estimada, respectivamente, em 41%, 29% e 21% (Hutter 1990; Adly et al.

2010).

Figura 6: Grau histológico definido pelo sistema de Nottingham para graduação histológica;

a) tumor bem diferenciado (grau 1), alta homologia com a morfologia de um ducto mamário

normal, formação tubular (> 75%), um pleomorfimo nuclear médio e baixo índice mitótico

baixo; b) um tumor moderadamente diferenciado (grau 2); c) tumor com pouca diferenciação

celular (grau 3), caracterizado por alto pleomorfismo nuclear, frequentes mitoses e sem

formação tubular (< 10%). Adaptado de Rakha et al. (2010).

25

Nas últimas décadas, o grau histológico tem demonstrado imenso valor

preditivo da progressão da doença e na definição da terapia adjuvante

(Carvalho et al. 2011; Berruti et al. 2011).

1.2.4.3 Tamanho tumoral

O tamanho do tumor e a condição dos linfonodos axilares são os dois

mais importantes indicadores de prognóstico para o câncer de mama e,

portanto, constituem a base do estadiamento TNM, estabelecido e promulgado

pela União Internacional Contra o Câncer (Carter et al. 1989). Com o advento

da mamografia e a gradual difusão do método, associada a maior

conscientização da população sobre sua importância, vem-se observando em

alguns países desenvolvidos a redução significativa no tamanho dos tumores

quando do diagnóstico (Abreu & Koifman 2002).

É certo também que o tamanho do tumor está diretamente relacionado

ao risco de recidiva, sendo que, nos casos de pacientes com ausência de

comprometimento metastático dos linfonodos, o tamanho do tumor torna-se a

melhor característica preditora de recidiva (Arriagada et al. 2006; Fumagalli &

Sotiriou 2010). Os tumores de menor tamanho estão invariavelmente

relacionados a melhor prognóstico tanto para sobrevida global quanto para

sobrevida livre de doença, independentemente do tipo de tratamento aplicado

(Abreu & Koifman 2002; Soerjomataram et al. 2008).

1.2.4.4 Envolvimento linfonodal

A circulação linfática participa do processo de drenagem de substâncias

geradas pelo metabolismo celular, e, auxiliado pelo baço e pelo timo, compõe o

sistema linfático. Todo este sistema se encontra bastante hiperativo durante o

processo inflamatório, que é bem característico no câncer (Hirakawa 2009; Ji

2006). A detecção de células neoplásicas em linfonodos adjacentes a um tumor

primário caracteriza-se pela ocorrência de metástase linfonodal (Nakamura et

26

al. 2009). O sistema linfático é, portanto o sítio mais comum de metástases

(Wong & Hynes, 2007). Aparentemente, as células malignas chegam à linfa

muito mais facilmente do que à circulação ou a outros órgãos distantes. A

metástase linfonodal é, sobretudo, um marcador de prognóstico, pois existe

uma associação entre número de linfonodos acometidos e a ocorrência de

metástases à distância, com consequente redução da sobrevida em pacientes

oncológicos (Nakamura et al. 2009; Zwaans & Bielenberg 2007).

Os vasos linfáticos possuem menor densidade e pressão hidrostática do

que o sanguíneo. Possuem também mais invaginações, menor revestimento

muscular e lâmina basal descontínua, ao contrário do endotélio do sistema

circulatório sanguíneo (Wong & Hynes 2007; Hirakawa 2009). Estes fatores

contribuem para uma transferência de células neoplásicas do tecido primário

para a linfa de forma razoavelmente permissiva. Aliado a isso, o fluxo da

drenagem das células adjacentes ao tumor segue o fluxo em direção ao

linfonodos regionais. (Weinberg 2008). O linfonodo sentinela é a primeira

estrutura a receber as células cancerosas que se desprenderam do seu local

primário. O método de pesquisa de células tumorais no linfonodo sentinela

diminuiu substancialmente o número de esvaziamentos axilares

desnecessários na cirurgia oncológica (Qian et al. 2006).

Neste cenário, os nódulos linfáticos drenantes do tumor primário

poderiam funcionar como áreas de preparação, como um nicho onde células

tumorais ali permanecem em diferenciação, ganhando novas características

malignas até atingirem a circulação sistêmica com mais facilidade (Ochi et al.

2007). Ou então, a chegada de células neoplásicas nos linfonodos já

representaria um sinal de que as unidades celulares da massa tumoral primária

estariam num nível de diferenciação e malignidade tal, que seriam capazes de

invadir tecidos e nele se aderir (Nakamura et al. 2009; Hirakawa 2009).

O status linfonodal é um dos fatores mais importantes no prognóstico do

câncer de mama. O impacto negativo nas sobrevidas global e livre de doença é

modulado pelo tamanho da metástase, número de linfonodos acometidos e

localização das estruturas envolvidas (axilar, supra ou infraclavicular) (UICC

2002).

27

No câncer de mama, pacientes diagnosticados com invasão metastática

linfonodal possuem um risco 60% maior de mortalidade quando comparados

com pacientes sem invasão linfonodal (Schoppimann et al. 2004; Lee et al.

2006). A figura 7 mostra a correlação entre o número de linfonodos

comprometidos com metástases e a redução da sobrevida global e pacientes

com câncer de mama (Soerjomataram et al. 2008).

1.2.4.5 Receptores

Os receptores hormonais (RH) destacam-se dentre os marcadores

moleculares como definidores de perfil tumoral. De acordo com o nível de

amplificação, o status dos RH exibe uma associação com o perfil proliferativo

da neoplasia (Berry et al. 2006). Existem diferenças na probabilidade de

sobrevida e nas taxas e locais de recidiva entre o status positivo e negativo

para receptores hormonais (de estrogênio, e em menor extensão o de

progesterona). Estas diferenças aumentam de acordo com a fração de células

positivas e negativas e o valor prognóstico desaparece após dois anos (Hess at

Figura 7: Proporção da sobrevida cumulativa em 8162 pacientes

diagnosticados com câncer de mama na região sul da Holanda entre 1970

e 1994, acompanhadas até 2004, e agrupadas de acordo com o status

linfonodal (node): linfonodo negativo (-■-); 1 a 3 linfonodos positivos (-♦-);

de 4 a 9 linfonodos positivos (-▲-); 10 ou mais linfonodos positivos (-X-).

Adaptado de Soerjomataram et al. (2008).

28

al, 2003). A presença de receptores hormonais com status positivo no tumor é

indicativo para tratamento antiestrogênico, porém, a positividade não garante

uma resposta favorável.

1.2.4.5.1 Receptor de estrogênio

O receptor de estrogênio (RE) é um regulador de crescimento celular,

proliferação e diferenciação. É o mais importante marcador biológico de

resposta terapêutica para o tratamento adjuvante do câncer de mama

(Partridge et al. 2003).

Na década de 1990, foram descritas isoformas deste receptor, e hoje

são descritos como receptor de estrogênio alfa (α) e beta (ß). São codificados

por genes distintos, mas apresentam analogia estrutural. Ambos os receptores

podem mediar transcrição gênica através do elemento de resposta ao

estrogênio ou por meio dos fatores de transcrição jus e fos. Pela primeira via,

ambos atuam estimulando atividade proliferativa, enquanto que pela via dos

fatores de transcrição, o RE-α estimula a proliferação celular enquanto o RE-ß

inibe (Paech 1997; Travis & Key 2003; Massarweh et al. 2008). Na última

década, identificou-se uma isoforma deste receptor situada na membrana

nuclear que pode estar ligada a uma rápida ação não genômica do estrogênio,

mediada por ativação de fatores de crescimento celular (Hanstein et al. 2004).

Os tumores com status RE- associam-se a maiores taxas de recidiva e

óbito nos 2 primeiros anos após cirurgia. O status de RE+ é um fator

determinante para indicação de terapia hormonal no câncer de mama (Hess at

al, 2003; Partridge et al. 2003; Geiger et al. 2004; Fisher et al. 2005; Stingl

2011).

1.2.4.5.2 Receptor de progesterona

O gene PR que codifica o receptor de progesterona (RP) é regulado pela

atividade de RE-α (Horwitz & McGuire 1975; Thakkar & Mehta 2011). Assim,

quando o RP está presente nas células neoplásicas, frequentemente significa

29

que a atividade do RE-α está funcional (Allred 2010). O RP é crucial no

desenvolvimento do lóbulo alveolar da mama, e é responsivo ao hormônio

progesterona, ativando algumas funções celulares, incluindo proliferação. É

representado por duas isoformas, RP-A e RP-B (Jacobsen et al. 2005). Maior

incidência de câncer de mama também é notada em mulheres que realizaram

terapia de reposição hormonal com estrogênio e progesterona, em comparação

com mulheres que realizaram esta terapia apenas com reposição de estrogênio

(Cui et al. 2005).

Com relação ao desfecho clínico, mulheres diagnosticadas com tumores

com status RP negativo (RP-) possuem pior sobrevida global do que quando o

RP é positivo (Hoefnagel et al. 2012; Bardou et al. 2003). Porém, o status de

RP sozinho tem um valor preditivo fraco (Allred 2010; Stingl 2011). Apesar de

existir uma associação entre a expressão de RE e RP, suas expressões podem

ter status diferentes nos tumores de mama (Rakha et al. 2010). O status do RP

também tem valor preditivo de resposta à terapia hormonal adjuvante no

câncer de mama: pacientes com status RP - apresentam pior tempo livre de

recorrência para este tratamento, independentemente do status do RE (Bardou

et al. 2003; Jacobsen et al. 2005; Jacobsen & Horwitz 2012)

1.2.4.5.3 HER2

Em células normais, o gene erbB2 codifica a proteína do receptor de

crescimento epidermal humano do tipo 2 (epidermal growth factor receptor type

2; HER2 ou ErbB2 ou ainda HER-2/neu), que irá desencadear respostas

celulares semelhantes aos receptores de sua família (Jorissen 2003; Murphy &

Modi 2009). Cerca de 15 a 30% dos tumores de mama superexpressam HER2

(Suo et al. 2002), o que implica em menor sobrevida global e livre de doença a

estes pacientes (Yonemori et al. 2010).

A superexpressão de HER2 é fator preditivo para indicação de terapia

com anticorpo monoclonal trastuzumab e outras terapias-alvo (Gori et al. 2009;

Yonemori et al. 2010;Sanpaolo et al. 2011). A associação deste anticorpo

monoclonal à quimioterapia com antraciclinas e taxanos demonstrou

30

significativa redução da mortalidade, recorrência da doença e ocorrência de

metástases (Viani et al. 2007). Porém, ainda é discutido qual tempo de uso do

trastuzumab adjuvante poderia trazer a melhor relação de benefícios

(Jahanzeb 2008).

1.2.4.5.4 EGFR

Em modelos de câncer de mama pré-clínicos, a superexpressão do

EGFR leva uma transformação maligna de células de camundongos (Di Fiori et

al. 1987). O EGFR encontra-se superexpresso em cerca de 20 a 40% dos

carcinomas de mama (Meche et al. 2009). Em neoplasias de mama, o EGFR

está associado à proliferação e à resistência a apoptose (Kersting et al. 2006;

Edwards et al. 2006).

Em 1987, já havia descrição da relação do status EGFR+ e pior

prognóstico do câncer de mama (menor sobrevida livre de doença e menor

sobrevida global) (Sainsbury et al 1987; Jones et al. 1996; Nieto et al. 2007).

Modelos experimentas de análise do perfil genético do câncer de mama

mostram que o gene EGFR está na lista dos principais genes associados à

ocorrência de metástase cerebral no câncer de mama (Bos et al. 2009).

Existem muitos estudos que fazem referência a pior desfecho no

tratamento do câncer de mama com superexpressão tumoral de EGFR (Xu et

al. 2005; Agelopoulos et al. 2007; Brand et al. 2011), sobretudo em pacientes

com tumores classificados como triplo negativo (RE-, RP- e HER2-). Quando

estas pacientes possuem status EGFR positivo, apresentam pior sobrevida e

menor tempo livre de recorrência (Tischkowitz et al. 2007; Bouchalova et al.

2009). Porém, ao contrário do que ocorre em outros carcinomas, nos tumores

de mama, a superexpressão do EGFR não está necessariamente associada à

amplificação de seu gene (Yu et al. 2008).

31

1.2.5 Estimativas de Prognóstico

O curso clínico do câncer de mama e a sobrevida variam de acordo com

as características próprias do tumor e da paciente. Esta variação é

determinada por uma série complexa de características que podem contribuir

para um desfecho favorável ou trazer complicações (Kelsey & Berkowitz 1988).

Fatores prognósticos em câncer de mama são parâmetros possíveis de serem

mensurados no momento do diagnóstico e que possuem um valor preditor da

sobrevida da paciente (Soerjomataram et al. 2008).

A aplicação e o conhecimento dos fatores prognósticos em câncer de

mama tem fundamental importância para a definição do tratamento. De uma

forma geral, quando estes fatores indicarem um desfecho desfavorável, o

tratamento seguirá para uma indicação mais agressiva. Por outro lado,

pacientes que possuem características indicativas de bom prognóstico,

receberão um tratamento mais conservador e de menor toxicidade (Chotteau-

Lelièvre et al. 2004; Fryback et al. 2006).

Sendo o câncer de mama uma doença bastante heterogênea, não é

surpreendente que as respostas aos tratamentos também possam variar. Neste

sentido, uma busca em construir modelos de predição de evolução clínica e

resposta terapêutica têm sido objeto de vários estudos nas últimas décadas

(Adly et al. 2010; Danova et al. 2011). Estes modelos contribuem para melhorar

a qualidade de vida do paciente e para definições de políticas em saúde

(Williams et al. 2006)

As características histopatológicas são fatores prognósticos clássicos e

continuam a ser a principal base de vários sistemas de agrupamento de casos,

como o estadiamento TNM e a categorização de St Gallen (UICC 2002;

Goldhirsch et al. 2005). Ao longo dos anos, os receptores hormonais passaram

a ter grande importância preditiva e orientadora da conduta terapêutica, sendo

incorporados aos modelos de classificação tumoral (Hind et al. 2007; Fisher et

al. 2005).

Com o desenvolvimento das técnicas de análise genética e moleculares,

a identificação de diferentes grupos de câncer de mama veio ganhando

32

diversidade, o que resultou no reconhecimento de subtipos como: basalóide,

HER2, luminais A e B (Bertucci et al. 2002; Voduc et al. 2010), que levam em

conta o status dos receptores hormonais, HER2 e outras proteínas como as

citoqueratinas. Os tipos luminais correspondem a 60% a 70% dos casos,

enquanto o tipo HER2, a 15% a 20% e o basalóide, a 10% a 15% (Blows et al.

2010; Wang et al. 2011).

Plataformas de testes genéticos que levam em conta o nível de

expressão de inúmeros genes no tumor têm diversificado ainda mais as

subclassificações biológicas, proporcionando modelos que verificam a

assinatura genética tumoral e assim, predições sobre as características

neoplásicas (Sørlie et al. 2001; Finak et al. 2006; Parisi et al. 2010).

Atualmente, existem alguns métodos de fácil classificação que têm

norteado os clínicos para decidir o tratamento. O Índice de Prognóstico de

Nottingham (Nottingham Prognostic Index - NPI), estabelecido desde os anos

1980, leva em conta o tamanho tumoral, o grau histológico e o status linfonodal

para inferir a provável sobrevida em 5 anos após cirurgia (Blamey et al. 1979;

Haybittle et al. 1982; Adly et al. 2010). No Reino Unido, o Índice de Prognóstico

de Oxford (Oxford Prognostic Index) foi elaborado para predição de sobrevida

num mais longo prazo (Campbell et al. 2010). A plataforma eletrônica Adjuvant!

(http://www.adjuvantonline.com) possibilita ao usuário a inclusão de

informações relevantes sobre o paciente e a doença e indica o melhor

esquema de tratamento adjuvante. Por fim, o consórcio Early Breast Cancer

Trialists’ Collaborative Group (2012) publica meta-análises periódicas,

avaliando estudos clínicos sobre respostas a esquemas de terapia

antineoplásica sistêmica, hormonioterapia e radioterapia.

1.2.6 Tratamento

Atualmente, o tratamento do câncer de mama é interdisciplinar. A correta

associação do tratamento cirúrgico, da radioterapia e dos tratamentos

sistêmicos é indispensável quando se pensa em maior sobrevida e controle

local da doença (Leite 1999; Mauri et al. 2008; Lee et al. 2012).

33

O tratamento cirúrgico tem como objetivo controlar a doença loco-

regional, estadiar cirurgicamente para estabelecer os grupos de alto risco para

recorrência local, orientar a terapia sistêmica, proporcionar maior sobrevida,

identificar grupos de maior risco de metástase à distância e sempre que

possível, evitar mutilação ou oferecer à paciente o benefício da reconstrução

mamária (Franco et al, 1997). Dentre os tipos de abordagem cirúrgica, os

principais são: cirurgias radicais (mastectomias), cirurgias conservadoras

(tumorectomia, quadrantectomia) (Veronesi et al 1990) e linfadenectomia axilar

(aliado ao estudo de linfonodo sentinela) (Piato 2002).

A irradiação da mama é considerada recomendada às mulheres

submetidas à cirurgia conservadora para o câncer de mama em estádios

iniciais. O tratamento baseia-se na irradiação de ondas de energia originadas

de material radioativo sobre o local definido pela equipe médica (INCA 2011).

Com o desenvolvimento das técnicas radiológicas, surgiu a radioterapia

tridimensional e a modulação de intensidade do feixe de radiação (IMRT), que

permitem proteger o coração e outros órgãos, diminuindo a chance de

toxicidade e proporcionando doses mais homogêneas (Vicini et al, 2002).

O tratamento farmacológico do carcinoma de mama envolve,

atualmente, a utilização de uma variedade de compostos, como

quimioterápicos antineoplásicos, incluindo a quimioterapia de compostos

citostáticos, compostos hormonais e modificadores de resposta biológica, em

particular representados pelos anticorpos monoclonais e os inibidores de

tirosina cinase (Goldhirsch et al. 2009; Bouchalova et al. 2010; Sanpaolo et al.

2011; Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group 2012).

As abordagens mais comuns de terapia sistêmica curativa se dividem

em neo-adjuvante e adjuvante.

1.2.6.1 Tratamento neoadjuvante

O tratamento neoadjuvante ou tratamento primário, consiste na

aplicação de procedimentos sistêmicos em pacientes portadores de carcinoma

localmente avançado da mama, contribuindo para cirurgias menores, com

34

possível benefício na sobrevida (Fisher et al, 1997, von Minckwitz et al. 2008).

Há, porém, discussões quanto ao risco de recorrência local em caso de cirurgia

conservadora (Barnadas 2010; Beasley & Olson 2010). Estudos randomizados

têm mostrado que a asssociação de docetaxel a esquemas com antraciclinas

oferece melhor resposta ao tratamento neoadjuvante (Valero, 2002; Smith et al,

2002) do que os esquemas com antraciclinas apenas, porém ainda há dúvidas

quanto aos riscos desta terapias, em decorrência da morbidade associada a

reações adversas (Huober et al. 2010).

1.2.6.2 Tratamento adjuvante:

O tratamento quimioterápico adjuvante contribui para aumento do tempo

livre de progressão da doença. Nos últimos anos, vários estudos clínicos e

meta-análises vêm abordando o favorecimento do uso de agentes como as

antraciclinas e os taxanos no tratamento antineoplásico adjuvante (Guimarães

2008; Jacquin et al. 2012). O uso da poliquimioterapia adjuvante por mais de

quatro meses reduz o risco de recorrência em 41% e o índice anual de morte

em 31% (Breast Cancer Study Group, 2002).

A hormonioterapia no tratamento adjuvante do câncer de mama tem tido

grande impacto positivo, beneficiando mulheres cujas neoplasias expressam

receptores hormonais positivos. Inúmeros estudos têm demonstrado que a

utilização de tamoxifeno, um antagonista do receptor de estrogênio, por 5 anos

após tratamento cirúrgico, reduz efetivamente o risco de recorrência, a

incidência de câncer de mama contralateral e a mortalidade em mulheres,

independentemente da faixa etária. (Hind et al. 2007). Os inibidores de

aromatase de terceira geração (anastrozol e letrozol) têm sido indicados para o

tratamento de pacientes resistentes ao tamoxifeno, por terem melhor

tolerabilidade do que os inibidores de progesterona, como o megestrol (Buzdar

et al 2001; Cuzick et al. 2010).

O advento da terapia anti-HER2 trouxe uma nova linha de tratamento

para inibir a progressão da doença (Gilmer et al. 2008). A partir daí, novos

candidatos a terapia-alvo vêm sendo estudados.

35

1.2.6.3 Terapia anti-EGFR

O EGFR foi proposto como um alvo molecular nos anos de 1980 (Sato et

al. 1983; Masui at al. 1984; Mendelson 2002). O Cetuximab é o anticorpo

monoclonal anti-EGFR que mais se destacou até agora e vem sendo utilizado

no tratamento do câncer colorretal e de cabeça e pescoço (Mendelsohn &

Baselga 2003; Flynn et al. 2009; Park et al. 2011).

Outros inibidores de tirosina-cinase com atividade anti-EGFR mostraram

alguma importância no tratamento do câncer de pulmão de células não

pequenas (Rosell et al. 2012), porém não obtiveram resultados promissores no

tratamento do câncer de mama (Ciardiello et al. 2006).

Na família dos inibidores de tirosina-cinase, o Lapatinib demonstrou

efeito anti-EGFR e anti-HER2 e tem alcançado resultados na terapia do câncer

de mama metastático quando associado a outros quimioterápicos (Bilancia et

al. 2007; Gilmer et al. 2008). Buscando melhorar os resultados com esta

terapia, estudos vêm sendo desenvolvidos para avaliar os valores preditivos do

EGFR e HER2 na resposta ao uso do Lapatinib em câncer de mama, bem

como suas prováveis vias de resistência (Polli et al. 2009; Andre et al. 2010;

Bouchalova et al. 2010).

1.3 POLIMORFISMOS GENÉTICOS

Polimorfismo genético é a ocorrência simultânea em uma mesma

população de duas ou mais formas distintas de um gene (alelos), que se

caracterizam por variações nas sequências de nucleotídeos, tais como

substituições, deleções, inserções e duplicação ou deleção de genes. Por

definição, um gene é considerado polimórfico quando o alelo menos frequente

ocorre na população com uma frequência de pelo menos 1% (Miller et al.,

2001). As variações alélicas podem resultar em alteração da expressão ou da

funcionalidade dos produtos gênicos.

36

É muito comum a ocorrência de duas possibilidades de nucleotídeos na

sequência do DNA do genoma humano, o que é chamado de substituição de

um único nucleotídeo (single nucleotide polymorphism - SNP). As combinações

possíveis geralmente formam 3 possibilidades de genótipos, que podem ou não

diferir em fenótipos (Voet et al. 2000).

Os polimorfismos de região microssatélites são trechos de DNA que

consistem em unidades repetidas de dois, três ou quatro nucleotídeos. O

número de unidades de nucleotídeos repetidos contidos dentro de qualquer

microssatélite pode diferir entre os dois cromossomos homólogos de uma

pessoa e entre pessoas na população (Easton et al. 2009). Uma determinada

região microssatélite é, portanto, um locus polimórfico, e os diferentes números

de unidades repetidas em um determinado microssatélite constituem os alelos

deste lócus (Lewin 2001).

A evolução das espécies é um fenômeno que possui relação com as

características adaptativas individuais dos indivíduos (Darwin 1859).

Polimorfismos são distribuídos por todo o DNA genômico dos organismos, e

compõem os fatores que proporcionam a diversidade de fenótipos e as

variabilidades adaptativas numa mesma espécie (Tan 2008).

Com o Projeto Genoma Humano e com o advento das técnicas de

mapeamento genético, um grande número de polimorfismos vêm sendo

estudado (Marzolini et al., 2004; Pirmohamed et al., 2011). Perguntas quanto a

frequência em determinadas populações, relação hereditária, possíves

associações fenotípicas e causas de patologias vêm tentando ser respondidas

(Thompson & Thompson 2002).

1.3.1 Polimorfismos e câncer

Vários estudos vêm sendo realizados buscando identificar os fatores de

risco associados ao desenvolvimento e à progressão do câncer. Variações

individuais na ativação ou detoxificação de carcinógenos exógenos, no

metabolismo de hormônios e no reparo de DNA contribuem para diferentes

perfis de susceptibilidade ao câncer (Irigaray et al., 2007). De forma

37

semelhante, variações na sensibilidade aos fármacos antineoplásicos podem

afetar a eficácia e a segurança do tratamento.

Por se tratar de uma doença complexa, com vários fatores causais,

diferentes perfis moleculares e de evolução clínica e cujo tratamento envolve

diversas abordagens terapêuticas, a avaliação de associação entre genótipos

individuais e desfechos clínicos no câncer de mama requer a realização de

estudos de epidemiologia molecular, com análise integrada dos fatores

genéticos e ambientais.

1.3.2 Polimorfismos do gene EGFR

Com relação às variáveis genéticas individuais, há especial interesse em

alterações que possam interferir na atividade de alvos moleculares

potencialmente envolvidos com o risco de progressão do câncer de mama,

como é o caso do gene EGFR, que possui inúmeros de pontos de variabilidade

genética.

Buscando melhor compreender os fatores que interferem nos níveis de

expressão de EGFR, sua estabilidade proteica, sua atividade e afinidade com

ligantes e como elas se relacionam com a sinalização celular, dois de seus

polimorfismos foram pesquisados. Uma vez que estes polimorfismos podem

estar associados a determinadas funções gênicas e proteicas, a classificação

genotípica poderia funcionar como um biomarcador de prognóstico da doença

ou como preditor de resposta a terapias antineoplásicas.

1.3.2.1 Polimorfismo de Repetição CA

Regiões microssatélites possuem valor ainda não completamente

elucidado sobre a replicação, transcrição e leitura do código genético.

Mecanismos envolvendo regiões microssatélites, regiões intrônicas e

processos de transcrição têm sido alvo de inúmeros estudos (Kashi et al. 1997;

Chorev & Carmel 2012). A função das regiões microssatélites não transcritas

tem sido relacionada à formação de nucleossomos, interferindo na ligação de

38

proteínas relacionadas a transcrição nas regiões promotoras do gene (Buerger

et al. 2001).

No intron 1 do gene EGFR existe uma região microssatélite de repetição

de dinucleotídeos chamada de CA simple sequence repeat 1 (CA SSR I), ou,

polimorfismo de repetição CA (rs 72554020), onde ocorre uma variação de 14 a

25 repetições CA (figura 8). Um mecanismo de regulação transcricional

dependente do número de repetições CA tem sido descrito, com impacto sobre

o nível de síntese de pré-mRNA (Chi et al 1992). Gebhardt et al. (1999)

estudaram polimorfismos relacionados com a expressão aumentada de EGFR

nos tumores de mama, e demonstraram que o número de repetições CA no

intron 1 deste gene estaria inversamente relacionado à síntese de seu pré-

mRNA. Evidências deste mecanismo foram reforçadas por estudo do mesmo

grupo, que mostrou a associação entre alta expressão e ocorrência de alelos

da repetição CA mais curtos (Buerger et al. 2000).

A influência de uma proteína inibidora de transcrição do DNA nos alelos

com maior número de repetições CA é um modo de explicar esta associação.

Pode-se alternativamente especular que a região de repetição CA, por estar

situada entre a região promotora e a região enhancer, onde existem sítios de

ligação de elementos reguladores, a afinidade da formação de complexos

estaria comprometida nos alelos com tamanhos mais longos (Burkhard Brandt

et al. 2006).

Figura 8: Estrutura da região 5’ do gene EGFR. O início do gene como na maioria dos genes

estruturais, encontramos uma sequência tipo caixa GpC. O processo de transcrição do gene

EGFR inicia pela ligação de promotores em múltiplas regiões ricas em GC. Fator de transcrição

Sp1 entre outros contribuem para atividade do promotor. (Haley & Waterfield 1991). Dentre os

fatores que influenciam neste nível de transcrição, a existência de uma região de repetição de

dinucleotídeos (citosina-adenina) no intron 1 (CA SSR 1) logo antes de regiões enhancer 2

(+1,788 a +2,318) influenciam numa parada prematura de transcrição ou não. Adaptado de

Brandt et al. (2006).

39

País Câncer Amostragem n Genótipos Achados Referência

Europa

Itália

pulmão (não

pequenas células)

pacientes em tratamento com Geitinib:

um alelo com 16 repetições

versus (CA)n de outros tamanhos

Os pacientes com alelo de 16 repetições CA se beneficiaram mais com uso de gefitinibe apresentando uma melhor curva de sobre vida do que os pacientes com (CA)n de outros tamanhos (p =

0,044).

(Tiseo et al. 2010) 91

França Colon amostras tumorais de pacientes:

42 pelo menos 1 alelo ≥20 CA versus dois alelos <20 CA

Nenhuma associação entre tamanho dos alelos e intabilidade genômica foi encontrada. Bem como nenhuma associação com a

expressão de EGFR mRNA. (Buisine et al. 2008).

Espanha Cabeça e pescoço

pacientes genotipados para R497K tratados com químio e rádioterapia:

78 os dois alelos <17 CAn

versus pelo menos 1 alelo ≥17 CAn

O polimorfismo de repetição CA não apresentou associações com características histopatológicas ou sobrevida em 60 meses.

(Bandrés et al. 2007)

França Cabeça e pescoço

tecidos normais e tumorais de pacientes em tratamento:

Homozigotos versus heterozigotos ou 2 alelos <17 versus 2 alelos ≥ 17

repetições

Nos tecidos tumorais foi encontrada uma maior expressão de EGFR nos pacientes que tinham o polimorfismo (CA)n em

homozigotos (p=0,02). Nos tecidos normais não houve diferença.

(Etienne-Grimaldi et al. 2005)

109

Alemanha Mama

caso / controle: 2 alelos ≤18 versus Pacientes com 2 alelos ≥19 repetições CA apresentaram uma

OR=10,4 (1.85–58,70) para chance de histórico de parentesco de 1º grau com câncer de mama (p=0.015).

(Brandt et al. 2004). sadios: 604 com ≤18 e ≥19 repetições

pacientes: 1063 versus 2 alelos ≥19

repetições

Alemanha Mama pacientes submetidas a mastectomia, em tratamento:

82

Homozigotos p/ repetição CA versus heterozigotos

com ou sem desbalanceamento alélico

Pacientes heterozigotos para repetição CA e com desbalanceamento alélico tiveram uma pior sobrevida de 5 anos

do que os pacientes homozigotos e heterozigotos sem desbalanceamento alélico (p<0.001).

(Tidow et al. 2003)

Alemanha mama linhagens celulares: 7 menor alelo com 16 versus

17 versus 18 versus 20 versus 21 repetições

A atividade transcricional do gene EGFR é diminuída em até 80% nos genótipos com alelos de 21 repetições.

(Gebhardt et al. 1999)

Quadro 2: Painel dos estudos envolvendo o polimorfismo de repetição CA do gene EGFR e o câncer em diferentes populações.

40

País Câncer Amostragem n Genótipos Achados Referência

América

EUA Tumores sólidos

pediátricos

pacientes de 5 estudos pediátricos em tratamento com gefitinib:

109

soma dos alelos ≤35 repetições CA versus soma dos alelos >35 repetições

CA

CASSRI não apresentou associações com a ocorrência de efeitos adversos no tratamento com gefitinib. Não foi realizada análise de

resposta ao tratamento na população. (McKibbin et al. 2010)

EUA

pulmão (não

pequenas células)

pacientes tratados com Gefitinib:

homozigoto com ≤16 CAn Pacientes homozigotos com ≤ 16 repetições CA nos dois alelos

tiveram uma melhor sobrevida livre de progressão comparados com outros genótipos. Log-rank test: p=0.03).

(Liu et al. 2008) 92

versus os outros genótipos

EUA Colon

metastático

pacientes genotipados para R497K: pelo menos 1 alelo ≥20 CA

versus dois alelos <20 CA

CASSRI não apresentou associações. Pacientes mulheres Lys/Lys

e alelo ≥20 (longo/-) apresentaram uma pior mediana de sobrevida

(RR=1,90; IC95%; 1,10-3,29 p=0,008).

(Press et al. 2008) mulheres: 141

homens: 175

EUA Vários linhagens celulares do painel de tumores NCI60:

58 16/16 versus 16/17 versus 16/18 versus 16/20 versus

20/20

CASSRI não apresentou associações com a maior expressão de RNAm do gene EGFR.

(Liu et al. 2007)

EUA

pulmão (não

pequenas células)

pacientes: 157

soma dos alelos: >35 repetições versus ≤35 ou

Uma melhor média de sobre vida foi observada entre os pacientes com um mais de 35 repetições na soma dos alelos (p=0,03). Não

houve significância quando comparados os homozigotos x heterozigotos.

(Dubey et al. 2006) homozigotos versus

heterozigotos

Quadro 2: Continuação.

41

País Câncer Amostragem n Genótipos Achados Referência

EUA Retal pacientes em tratamento adjuvante genotipados para R497K:

59 pelo menos 1 alelo ≥20 CA versus dois alelos <20 CA

CASSRI não apresentou associações. Apenas quando consideramos os dois polimorfismos juntos, um pior tempo livre de recorrência para os pacientes com alelo Arg e os dois alelos <20

(curto/curto), p=0,05; log-rank test.

(Zhang et al. 2005)

EUA

Cabeça e pescoço

linhagens celulares: 13 soma dos alelos ≤35

repetições CA versus soma dos alelos >35 repetições

CA

Células com a soma de repetições ≤35, tiveram um menor crescimento do que as células com >35 repetições quando ambas

foram tratadas com inibidor de EGFR: Erlotinib (p=0,03).

(Amador et al. 2004)

colorretal amostras tumorais do sangue de pacientes tratados com gefitinib:

19

Mostrou que não houve diferença entre as repetições CA do sangue periférico e do tumor. Não foi encontrada amplificação do

gene. Pacientes com > 35 repetições tiveram uma menor ocorrência de rash cutâneo durante o tratamento (p=0,04).

Ásia

Taiwan câncer oral tumor e tecido normal de pacientes de Taiwan:

homozigotos versus

Pacientes homozigoto para CA SSR1 tiveram um pior prognóstico do que os heterozigotos (P < 0.001).

(Lin et al. 2011) 47

heterozigotos.

Taiwan esôfago pacientes chineses:

homozigotos <20 repetições CA versus homozigotos ≥ 20

repetições

Pacientes homozigotos para alelo curto (<20CA) tiveram uma sobrevida mais curta do que os homozigotos para alelo longo

(≥20). Hazard ratio of death=1.88; 95%CI, 1,02–3,49 (p=0,045). (Lee et al. 2011) 148

Quadro 2: Continuação.

42

País Câncer Amostragem n Genótipos Achados Referência

China

pulmão (não

pequenas células)

pacientes tratados com Gefitinib genotipados para *2A (3801 T>C) no gene CYP1A1:

pelo menos um alelo ≤16 repetições

Pacientes com alelo T/T para o gene CYP1A1 e curto/curto para

CA SSRI (≤16 CAn) apresentaram uma melhor resposta (p =

0.002) comparado com os pacientes de alelos T/C ou C/C para CYP1A1 e longos para CA SSRI (os dois alelos >16 CAn).

(Nie et al. 2011) 115 os dois alelos > 16

repetições

Coreia Colorretal amostras tumorais de pacientes tratados com Cetuximab:

75 soma dos alelos ≤ 36 CAn Não foi encontrada acossiação entre os grupo de polimorfismo de

repetição CA e a sobrevida livre de progressão e sobrevida global. (Park et al. 2011)

versus soma > 36 CAn

Japão Pulmão

caso/controle em sobreviventes da bomba atômica no japão:

soma dos alelos ≤ 37

repetições CA versus Indivíduos sobreviventes da bomba atômica com a soma das

repetições CA ≤ 37 mostraram um maior risco relativo de diagnóstico de câncer de pulmão do que os indivíduos com a

soma dos alelos ≥ 38 repetições CA (RR=1.79 IC95% 1,14–2,82)

(Yoshida et al. 2009) casos: 113 soma dos alelos ≥ 38

repetições CA controles: 2066

Taiwan

pulmão (não

pequenas células)

pacientes tratados com gefitinib:

52

2 alelos ≤18 versus Pacientes curto/curto apresentaram uma maior incidência de rash cutâneo grau 2ou 3 do que pacientes com outros genótipos

(p=0,031). CASSRI não apresentou associação com resposta ao tratamento.

(Huang et al. 2009) com ≤18 e ≥19 repetições

versus 2 alelos ≥19 repetições

China

pulmão (não

pequenas células)

pacientes tratados com Gefitinib:

84

pelo menos um alelo ≤16 repetições versus

Pacientes com pelo menos um alelo ≤16 (CA)n tiveram uma maior taxa de resposta em tratamento com Gefitinib do que pacientes

portadores de dois alelos longos >16 (CA)n (88,5% versus 48,3%, p<0,001).

(Ma et al. 2009) os dois alelos > 16

repetições

Irã Mama

caso x controle: 2 alelos ≤18 versus Mulheres com genótipo curto/curto (2 alelos ≤18) tiveram um maior risco de desenvolvimento de câncer de mama (OR= 1,86; 95% CI,

1,019–4,671 e p=0,043). (Jami et al. 2008) sadios: 216 heterozigotos ≤18 e ≥19

pacientes: 108 versus 2 alelos ≥19

repetições CA

Japão pulmão amostras tumorais e amostras de tecido não neoplásico de pacientes:

74 média das repetições CA dos 2 alelos: <17 versus

≥17

Aumento do nível de expressão de RNAm nos tecidos normais de pecientes com alelos mais curtos (<17), comparado com os

pacientes com alelos mais longos (≥17) (p=0,02).

(Sueoka-Aragane et al. 2008)

Quadro 2: Continuação.

43

País Câncer Amostragem n Genótipos Achados Referência

Coreia

pulmão (não

pequenas células)

pacientes tratados com Gefitinib:

86

soma dos alelos > 37 repetições CA versus soma dos alelos ≤ 37 repetições

CA

Pacientes com a soma de repetições de alelos ≤37 tiveram uma melhor resposta objetiva ao Gefitinib (p=0,029) e um menor

tempo de progressão nestes pacientes. Porém sem diferenças na sobrevida global.

(Han et al. 2007)

Multiétnicos

EUA, Japão e

Itália

pulmão (não

pequenas células)

amostras tumorais: média dos tamanhos de

CAn dos 2 alelos comparados entre as etinias

populacionais.

Indivíduos do leste asiático apresentaram os dois alelos para CASSRI maiores do que de indivíduos de outras etnias (p =

0.001). (Nomura et al. 2007)

descendência européia: 306

do leste asiático: 331

Cingapura, EUA e

Inglaterra Mama

caso/controle em populões asiáticas:

frequência dos números de repetição CA entre as

populações: curtos (15 e 16 repetições) versus longo (20

repetições)

A frequência do alelo de 14 e 15 repetições CA foi maior na população asiática neste estudo do que em outros estudos feitos por Caucasianos. A frequência do alelo de 20 repetições nesta

população asiática foi 5% menor do que em outros estudos.

(Zhou et al. 2006)

sadios 295

pacientes 22

Alemanhã e Japão

Mama

amostras tumorais: ≤18 CA repeats versus

>18 CA repeats

Os japoneses apresentaram um perfil de tumor mais homogêneo com predominância dos alelos longos >18 repetições, numa

frequência de 67% dos alelos. (p<0,001) ( Buerger et al. 2004) Alemães: 180

Japoneses 126

EUA Mama

pacientes:

Genótipo 16/16 versus 16/20 versus 20/20

A frequência do alelo de 20 repetições CA foi maior entre os indivíduos asiáticos comparado com a frequência dos caucasianos

(p = 2 x 10-18

). O alelo 16, foi um alelo mais frequente em caucasianos e afro-americanos do que dentre os asiáticos (p = 10

-

7).

(Liu et al. 2003) caucasianos: 133

afro-americanos: 66

asiáticos: 66

Quadro 2: Continuação.

44

Alguns estudos avaliando a associação deste polimorfismo com o risco

de desenvolvimento do câncer, com o processo de carcinogênese e com a

resposta à terapia antineoplásica foram desenvolvidos nos últimos anos. No

quadro 2, podemos visualizar um painel dos principais achados nestes estudos.

Nos trabalhos com populações ocidentais, o alelo de 16 repetições CA é

descrito como o mais frequente, enquanto que os trabalhos que envolvem

populações asiáticas descrevem a ocorrência do alelo de 20 repetições CA

como o alelo mais frequente. Estes dados sugerem que indivíduos asiáticos

possuem uma frequência de alelos maiores, ou com um maior número de

repetições CA do que as populações ocidentais (Liu et al. 2003; Buerger et al.

2004). Não são conhecidos trabalhos com a análise deste polimorfismo na

população brasileira.

Analisando todos os trabalhos de forma global, nota-se uma dificuldade

de classificação dos grupos genotípicos gerados pelos alelos de repetição CA.

Nos quadros aqui representados, verificamos diferentes formas de agrupar os

genótipos do polimorfismo de repetição CA. Não existe, portanto, um ponto de

corte ou um limite de tamanho usual na literatura que classifique exatamente os

alelos como curto ou longo.

1.3.2.2 Polimorfismo R497K

O outro polimorfismo escolhido para este estudo representa uma

mudança de um único nucleotídeo na região codificante (G > A), no exon 13,

gerando uma substituição de uma Arginina (Arg) por uma Lisina (Lys) no códon

497 (R497K) (Moriai et al. 1993) (figura 9). Moriai et al. (1994) demonstraram

que células expressando EGFR com Lys nesta posição apresentavam menor

resposta ao crescimento na presença dos ligantes TGF-α e EGF, além de

apresentarem indução reduzida dos efetores fos, jun, myc.

O EGFR, por ser um receptor a ativado pela formação de homodímeros

ou heterodímeros com outros homólogos de sua família, possui um mecanismo

de acoplamento, atividade e ciclização ainda não completamente estabelecido

(Endres et al. 2011). Estudos cristalográficos suspeitam que alguns

45

mecanismos refinados de acoplamento e dimerização entre os monômeros e

seus domínios possam interferir na atividade do receptor (Alvarado et al. 2010)

(figura 10). Suspeita-se que o polimorfismo R497K e outros polimorfismos em

regiões adjacentes possam interferir na formação dos dímeros e a estabilidade

destas ligações (Choura et al. 2010).

Alguns estudos avaliando a associação deste polimorfismo com o risco

de desenvolvimento câncer, com a carcinogênese e com a resposta à terapia

antineoplásica foram desenvolvidos nos últimos anos e estão compilados no

quadro 3. Entre eles, Wang et al. (2007) observaram uma associação entre a

forma variante R497K e uma diminuição no nível de fosforilação e de ativação

do EGFR em tumores de pacientes com carcinoma colorretal. Estes pacientes

portadores do alelo variante apresentaram menor envolvimento linfonodal,

menor ocorrência de metástases e, portanto, um melhor prognóstico.

Figura 9: Representação esquemática da

estrutura do receptor EGFR e suas unidades.

Os domínios extra celulares I, II, III e IV

encontram-se destacados. No domínio IV, na

posição 497, o sítio de troca de aminoácidos

arginina (Arg) por um lisina (Lys) gerada pela

ocorrência do polimorfismo R497K. Adaptado

de Flynn et al. (2009)

46

O único estudo encontrado envolvendo a pesquisa deste polimorfismo

em pacientes com câncer de mama foi publicado por um grupo da Tunísia,

(Kallel et al. 2009), que observou uma distribuição genotípica diferente entre as

pacientes com linfonodos negativos.

País Câncer Amostragem n Alelo Lys

Achados Referência

Europa

França colon pacientes metastáticos tratados com cetuximab

32 23,4%

Pacientes com a variante Lys e mostraram com melhor sobrevida do que os

pacientes selvagens quando tratados com cetuximab. (p = 0,041)

(Gonçalves et al. 2008)

Espanha cabeça e pescoço

pacientes tratados com quimio e radioterapia

76 29,6%

Quando combinado com polimorfismo de repetição CA, os pacientes homozigotos

selvagens e heterozigotos tiveram um pior resposta ao tratamento. (p = 0,034)

(Bandrés et al. 2007)

Quadro 3: Painel dos estudos envolvendo o polimorfismo R497K do gene EGFR e o câncer em

diferentes populações.

Figura 10: Representação esquemática dos domínios extra celulares do receptor EGFR (I, II,

III, IV). Modelo de mecanismo para uma cooperação negativa da atividade do receptor. (A)

Posicionamento de receptores EGFR em forma ligada em homodímeros ou na forma

monomérica. (B) Ligação de um único ligante (rosa) na molécula da esquerda; o domínio I

(azul) e o domínio III (amarelo) se deslocam para acoplar a molécula da direita pelo colapso

entre os domínios II (verde) de cada receptor. (C) Quando outra molécula ligante se envolve

com o receptor da direita, o espaço de acoplamento não é sensibilizado da mesma forma do

que no primeiro evento, deixando a estrutura dimérica assimétrica e por conseguinte, não

contribuindo para a ativação consistente da cascata de fosforilação. (D) Os dois ligantes

realizando o mesmo acoplamento, contribuindo para uma dimerização simétrica. Adaptado

de Alvarado et al. (2010).

47

País Câncer Amostragem n Alelo

Lys Achados Referência

América

EUA Tumores sólidos

pediátricos

pacientes de 5 estudos pediátricos em tratamento com gefitinib:

106 23,1% Nenhuma associação foi encontrada entre efeitos adversos ao uso de gefitinib e este

polimorfismo.

(McKibbin et al. 2010)

EUA colon Pacientes metastáticos tratados com cetuximab

26,6 %

Pacientes homozigotos selvagem e heterozigotos tiveram uma melhor

sobrevida livre de doença (1,8 meses) do que pacientes homozigotos selvagem (1,3

meses - p = 0,017).

(Lurje et al. 2008)

122

EUA Colon

metastático

pacientes genotipados para R497K:

> 25%*

Pacientes com genótipo Arg/Arg tiveram uma pior curva de sobrevida para o

tratamento de câncer de colon metastático (p = 0,003)

(Press et al. 2008) mulheres: 141

homens: 175

EUA Retal pacientes em tratamento adjuvante:

59 36,9 %

Quando o polimorfismo R497K é analisado com o polimorfismo de

repetição CA, é observado um pior tempo livre de recorrência para os pacientes com

alelo Arg e dois alelos < 20 repetições, p=0,05; log-rank test.

(Zhang et al. 2005)

Ásia

Tunísia mama

caso x controle com estudo prospectivo:

casos: 23,6%

Pacientes com alelo variante Lys apresentaram menor incidência de

presença de linfonodos positivos (p = 0,030)

(Kallel et al. 2009) casos: 148

controles: 25,5%

controles: 303

Taiwan

pulmão (não

pequenas células)

pacientes tratados com gefitinib

52 50% Nenhuma associação foi encontrada entre efeitos adversos ao uso de gefitinib e este

polimorfismo.

2009 - Huang et al

China pulmão

pacientes tratados ou não com gefitinib

O polimorfismo R497K esteve associado a uma melhor sobrevida entre pacientes

com linfonodo positivo (p = 0,004). Quando tratados com gefitinibe, a

sobrevida entre os genótipos se igualou.

(Sasaki et al. 2009)

225

60,8%

China colon Pacientes metastáticos 200 48,0% Pacientes com a variante Lys e mostraram

com melhor sobrevida do que os pacientes selvagens. (p < 0,001)

( Wang et al. 2007)

Um panorama dos estudos nos mostra que o alelo variante Lys parece

ser mais frequente nas populações da Ásia oriental do nas populações

europeia e americana.

Quadro 3: continuação

48

Zhang et al (2005) demonstraram que o variante Lys em combinação

com o maior número de repetições CA do intron 1 em pacientes com câncer

colorretal está associado a menor recorrência de doença durante tratamento

com quimioterapia e radioterapia adjuvante.

Sugere-se também, que a forma variante do polimorfismo R497K (Lys)

pode estar associada a um prognóstico favorável em câncer avançado de

pulmão. Sasaki et al. (2009) demonstraram que pacientes Lys tiveram uma

melhor sobrevida entre os pacientes que fizeram quimioterapia à base de

platina.

Estes dados justificam a importância da análise da genotipagem do

EGFR e suas associações com os fatores prognósticos em estudo clínico, e

avaliação de sua contribuição como marcador de predição do desfecho do

tratamento adjuvante da doença.

49

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

• Determinar a magnitude de associação entre polimorfismos genéticos do

gene EGFR e variáveis clínico-patológicas com valor prognóstico para o

câncer de mama.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar a prevalência dos polimorfismos de repetição CA e R497K

do gene EGFR pacientes com câncer de mama.

Determinar a magnitude da associação destes polimorfismos com o

prognóstico de pacientes diagnosticadas com câncer de mama.

50

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 DESENHO DO ESTUDO

Trata-se de um estudo observacional exploratório em coorte hospitalar

de mulheres diagnosticadas com câncer de mama, no Hospital do Câncer

III/INCA. A coorte consistiu de uma série de casos de pacientes com indicação

de cirurgia curativa.

As participantes deste estudo fizeram parte do projeto “Polimorfismos

genéticos e evolução clínica, resposta terapêutica e reações adversas em

pacientes submetidas ao tratamento do câncer de mama”, aprovado pelo

Comitê de Ética em Pesquisa do INCA, aprovado em 12 de fevereiro de 2009,

sob registro nº 129/08 (Anexo 1). Esse projeto teve o intuito de documentar a

ocorrência das principais complicações associadas ao tratamento

antineoplásico em pacientes com câncer de mama, e avaliar a influência de

variáveis sócio-demográficas, terapêuticas, clínicas e genéticas, relacionadas

ao tumor e ao indivíduo.

As pacientes aqui analisadas foram convidadas a participar deste estudo

no período de 12 de fevereiro de 2009 a 1º de abril de 2011. Todas as

participantes assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (anexo

2).

3.2 PACIENTES

3.2.1 Critérios de inclusão

Foram consideradas elegíveis para o estudo mulheres com câncer de

mama primário, não-metastático, que receberam indicação inicial de tratamento

cirúrgico com intenção curativa, que aceitaram participar da investigação e

conseguiram responder às perguntas durante entrevista inicial. As mulheres

que, após a cirurgia, foram diagnosticadas com câncer de mama bilateral não

foram incluídas no estudo.

51

3.2.2 Critérios de exclusão

Foram excluídas do estudo as mulheres que solicitaram desligamento da

participação no estudo.

3.3 FORMULÁRIOS

Dados sócio-demográficos foram obtidos através de entrevista no

momento do recrutamento (Anexo 3). As pacientes incluídas foram

acompanhadas através de consultas ao prontuário para obtenção de

informações sobre a cirurgia, tratamento adjuvante e laudo histopatológico

(Anexo 4). Todos os dados foram registrados em formulário padronizado

específico e em banco de dados eletrônico utilizando o programa Microsoft

Office Excel (versão 2007).

3.4 VARIÁVEIS CLÍNICO-PATOLÓGICAS

3.4.1 Idade:

Foi considerada a idade na data do diagnóstico do câncer de mama. Na

análise, a idade foi estudada como variável contínua e no formato dicotômico.

Quando analisada no formato dicotômico, as categorias de idade foram

definidas no momento do diagnóstico como “superior a 36 anos”,

representando o grupo de melhor prognóstico versus “menor ou igual a 35 anos

de idade”, representando o grupo de pior prognóstico (Aebi et al, 2000).

3.4.2 Classificação histológica:

A classificação histológica foi definida por médico patologista do Serviço

de Patologia Clínica do INCA, com base na análise microscópica de cortes da

peça cirúrgica. De acordo com a apresentação morfológica, e utilizando os

critérios definidos pela Organização Mundial de Saúde (Tavassoli, 2003) e o

College of American Pathologists (Fitzgibbons et al, 1999), os tumores das

pacientes deste estudo receberam uma das seguintes classificações:

52

carcinoma ductal in situ;

carcinoma lobular in situ;

carcinoma ductal invasivo;

carcinoma lobular invasivo;

carcinoma misto.

Quando analisada no formato dicotômico, a classificação histológica foi

agrupada em pacientes diagnosticadas com carcinoma invasivo versus

pacientes diagnosticadas com carcinoma in situ, representando os grupos de

melhor e pior prognóstico respectivamente. Neste formato, os pacientes

diagnosticados com carcinoma misto foram retirados da análise.

3.4.3 Grau histológico:

Seguindo as recomendações da UICC (2002), foi utilizado o sistema de

Nottingham (Elston & Ellis, 1991) para graduação histológica, que prevê índices

de 1 a 3 de acordo com as seguintes características microscópicas tumorais:

arranjo tubular, pleomorfismo nuclear e contagem mitótica.

No arranjo tubular, os índices se referem à proporção de estruturas

tubulares na lesão. O pleomorfismo nuclear é avaliado levando-se em

consideração o tamanho do núcleo, contornos, uniformidade da cromatina e

variação de forma e tamanho, enquanto a atividade mitótica é avaliado

contando-se o número de figuras em 10 campos microscópicos contíguos de

grande aumento. O somatório dos índices pode variar de 3 a 9. A graduação

final foi obtida através de laudo histopatológico do Serviço de Patologia Clínica

do INCA que define como:

grau 1: somatório de 3 a 5;

grau 2: somatório de 6 a 7;

grau 3: somatório de 8 ou 9 pontos.

Quando analisado no formato dicotômico, o grau histológico foi agrupado

em pacientes classificadas como grau 1 ou 2 versus pacientes classificadas

53

como grau 3, representando os grupos de melhor e pior prognóstico

respectivamente.

3.4.4 Tamanho tumoral:

O tamanho tumoral foi anotado de acordo com o laudo histopatológico

de cada paciente, divulgado pelo Serviço de Patologia Clínica do INCA. As

medidas foram obtidas dos cortes histológicos da peça cirúrgica.

A categorização do tamanho tumoral (pT) foi baseada na Classificação

de Tumores Malignos TNM (UICC 2002). Para tal, foi levada em conta a

medida de maior diâmetro do tumor invasivo relatada no laudo histopatológico.

Nos casos onde foram encontrados tumores múltiplos, o valor de maior

diâmetro foi levado em conta para fins de estadiamento pT nas seguintes

categorias:

pTis: presença exclusiva de carcinoma ductal ou lobular in situ

independente da extensão;

pT1: Tumor com 2 cm ou menos em sua maior dimensão;

pT2: Tumor com mais de 2 cm, porém não mais de 5 cm em sua

maior dimensão;

pT3: Tumor com mais de 5 cm em sua maior dimensão;

pT4: Tumor de qualquer tamanho com extensão direta à parede

torácica ou à pele.

Quando analisado no formato dicotômico, o tamanho tumoral foi

agrupado independentemente da classificação histológica, em tumores com até

2 cm versus tumores maiores do que 2 cm, representando os grupos de melhor

e pior prognóstico respectivamente.

54

3.4.5 Grau de envolvimento linfonodal:

O número de linfonodos axilares retirados foi obtido pelo exame

histopatológico da peça cirúrgica oriunda da pesquisa do linfonodo sentinela

e/ou durante linfadenectomia axilar.

O número de linfonodos positivos para metástase regional foi anotado no

laudo histopatológico divulgado pelo Serviço de Patologia Clínica do INCA,

independentemente do nível do esvaziamento axilar (I, II ou III) secundário ou

não à biópsia do linfonodo sentinela. O grau de envolvimento linfonodal (pN) foi

categorizado de acordo com a Classificação de Tumores Malignos TNM (UICC

2002):

pN0: ausência de metástase em linfonodos regionais.

pN1: de 1 a 3 linfonodo(s) metastáticos;

pN2: de 4 a 9 linfonodos metastáticos;

pN3: metástase em 10 ou mais linfonodos.

Quando analisado no formato dicotômico, o grau de envolvimento

linfonodal foi agrupado como pN0 ou pN1 versus pN2 ou pN3, representando

os grupos de melhor e pior prognóstico respectivamente.

3.4.6 Status do Receptor de Estrogênio:

O status de amplificação do Receptor de Estrogênio (RE) nos tumores

pesquisados foi obtido através de reações de imuno-histoquímica em cortes

tumorais parafinados, pelo método de incubação em panela de pressão, em

solução de acido cítrico a pH 6,0, utilizando o anticorpo Clone SP1

(Neomarkers, Fremont, EUA). Foi anotada a porcentagem de marcação para

RE, de acordo com o laudo histopatológico divulgado pelo Serviço de Patologia

Clínica do INCA. Os tumores foram considerados RE-positivos quando o

percentual de células marcadas foi igual ou superior a 1% (NIH Consens,

2000).

55

Está variável foi analisada no formato dicotômico, sendo os grupos

categóricos definidos como RE-positivo versus RE-negativo, representando os

grupos de melhor e pior prognóstico, respectivamente.

3.4.7 Status do Receptor de Progesterona:

O status de amplificação do Receptor de Progesterona (RP) nos tumores

pesquisados foi obtido através de reações de imuno-histoquímica em cortes

tumorais parafinados, pelo método de incubacão em panela de pressão, em

solução de ácido cítrico a pH 6,0, utilizando o anticorpo Clone 16 (Novocastra

Laboratories, Newcastle, Reino Unido). Foi anotada a porcentagem de

marcação para RP, de acordo com o laudo histopatológico divulgado pelo

Serviço de Patologia Clínica do INCA. Os tumores foram considerados RP-

positivos quando o percentual de células marcadas foi igual ou superior a 1%

(NIH Consens, 2000).

Esta variável foi analisada no formato dicotômico, sendo os grupos

categóricos definidos como RP-positivo versus RP-negativo, representando os

grupos de melhor e pior prognóstico, respectivamente.

3.4.8 Status HER2:

O status de amplificação do Receptor do Fator de Crescimento

Epidermal do tipo 2 (HER2) nos tumores pesquisados foi obtido através de

reações de imunohistoquímica em cortes tumorais parafinados, pelo método de

Incubação em forno de micro-ondas, em solução de ácido cítrico a pH 6,0,

utilizando o anticorpo policlonal de coelho (Dako Denamark A/S, Glostrup,

Dinamarca). A gradação da reação imuno-histoquímica à positividade foi

definida em escores (0, 1+, 2+ e 3+) de acordo com as recomendações da

American Society of Clinical Oncology e do College of American Pathologists

(ASCO/CAP, 2007).

No laudo histopatológico divulgado pelo Serviço de Patologia Clínica do

INCA, o status HER2 foi definido da seguinte forma:

56

HER2 negativo: escore 0 ou 1+;

HER2 indeterminado: escore 2+;

HER2 positivo: escore 3+.

Algumas amostras tumorais em que o status HER2 foi considerado

indeterminado foram encaminhadas para pesquisa do gene HER2 por

hibridização in situ por fluorescência (FISH), efetuando a razão da média de

sinais do gene HER2 e da porção centromérica cr17, através do HER2 FISH

DAKO pharmDx Kit (Dako Denamark A/S, Glostrup, Dinamarca).

A presença de amplificação do gene HER2 foi considerada quando a

relação HER2/Cr17 foi superior a 2,2. Quando a relação foi superior a 1,8 e

inferior a 2,2, o teste foi determinado inconclusivo e quando igual ou inferior a

1,8, o gene HER2 foi considerado não amplificado (ASCO/CAP, 2007). O

resultado do teste inconclusivo manteve o status indeterminado para o HER2

daquela amostra. O status HER2 foi assumido como positivo ou negativo

quando os seguintes resultados foram encontrados; respectivamente: superior

a 2,2 ou igual ou inferior a 1,8.

Quando analisado no formato dicotômico, o status HER2 foi

categorizado como HER2-negativo versus HER2-positivo, representando os

grupos de melhor e pior prognóstico respectivamente. Neste formato, as

pacientes com status HER2 indeterminado foram retirados da análise.

3.4.9 Subclassificação biológica:

A identificação de diferentes perfis fenotípicos do câncer de mama pode

ser determinada segundo o nível de expressão de uma lista de genes,

caracterizando subgrupos denominados: luminal A, luminal B, basal-símile e

tipo HER2 (Sotiriou et al , 2003). Estes subgrupos fenotípicos possuem valor

prognóstico e podem eventualmente definir candidatos a alvos terapêuticos

(Sørlie et al, 2001).

Neste estudo, com os resultados da análise dos receptores de

estrogênio, progesterona e HER2 disponíveis no laudo histopatológico

57

divulgado pelo Serviço de Patologia Clínica do INCA, foi possível agrupar os

tumores na seguinte subclassificação biológica (Huober at al, 2010):

lumial A: tumores RE+, RP+, HER2 -;

lumial B: tumores RE+, RP-, HER2- ou RE+, RP-, HER2+ ou RE-,

RP+, HER2- ou RE+, RP+, HER2+;

tipo HER2: tumores RE-, RP+, HER2+ ou RE-, RP-, HER2+;

triplo negativo: RE-, RP-, HER2-.

3.4.10 Estadiamento:

A União Internacional Contra o Câncer, através da Classificação de

Tumores Malignos TNM, agrupa os estádios da doença de acordo com o

tamanho tumoral, o grau de envolvimento linfonodal e o número de metástases

à distância, no momento do diagnóstico. Uma vez que neste estudo não foram

incluídos pacientes com tumores metastáticos, o estadiamento foi feito de

acordo com o tamanho tumoral e o grau de envolvimento linfonodal obtidos nos

laudos histopatológicos, sendo caracterizados os seguintes níveis:

estádio 0: pTis, pN0;

estádio I: pT1, pN0;

estádio IIA: pT1, pN1 ou pT2, pN0;

estádio IIB: pT2, pN1 ou pT3, pN0;

estádio IIIA: pT1, pN2 ou pT2, pN2 ou pT3, pN1 ou pT3, pN2;

estádio IIIB: pT4, qualquer N (exceto pN3);

estádio IIIC: qualquer T, pN3.

Quando analisado no formato dicotômico, os níveis de estadiamento

foram agrupados em estádios 0, I, IIA ou IIB versus estádios IIIA, IIIB ou IIIC,

representando os grupos de melhor e pior prognóstico respectivamente.

58

3.4.11 Prognóstico de Nottingham

O Índice de Prognóstico de Nottingham (NPI - Nottingham Prognostic

Index) é usado para determinar o prognóstico/probabilidade da sobrevida

global durante os 5 anos após a abordagem cirúrgica do câncer de mama

(Haybittle et al, 1982; Galea et al. 1992). Seu valor ou índice é calculado

usando três critérios patológicos, o tamanho do tumor ressecado, o status

linfonodal e o grau histológico do tulmor, aplicados na seguinte formula:

NPI = [0.2 x S] + N + G

Onde:

(S) = tamanho do tumor em centímetros;

(N) = o número de linfonodos metastáticos;

o pN0 = 2;

o pN1 = 2;

o pN2 ou pN3 = 3.

(G) = o grau histológico:

o grau 1 = 1;

o grau 2 = 2;

o grau 3 = 3;

Dependendo do valor do score NPI encontrado com a aplicação da

fórmula, cada paciente foi categorizada num grupo de prognóstico com base na

estimativa de sobrevida em 5 anos de pós operatório (quadro 4).

59

Quando analisado no formato dicotômico, o NPI foi agrupado em

moderado a excelente versus ruim, representando os grupos de melhor e pior

prognóstico respectivamente.

3.4.12 Estimativa de risco de recorrência:

No momento atual, a escolha do tratamento adjuvante do câncer de

mama envolve a observação do tipo e do grau histológico, tamanho do tumor,

invasão linfonodal, expressão de receptores hormonais e HER2, idade e outros

marcadores moleculares.

A fim de nortear as condutas terapêuticas para o tratamento do câncer

de mama, o Serviço de Oncologia do INCA (2011) utiliza consensos de dados

da literatura (Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group, 2005) para

definir uma Estimativa de Risco de Recorrência da Doença (ERR) que

categoriza a paciente com base nos fatores prognósticos conhecidos (quadro

5).

Quadro 4: Definição dos níveis de Risco de Estimativa de Recorrência.

60

Quando analisada no formato dicotômico, a ERR foi agrupada em risco

baixo ou intermediário versus risco elevado.

3.5 ANÁLISE DOS POLIMORFISMOS

3.5.1 Colheita de sangue

Uma amostra de sangue periférico de cada paciente (5 ml) foi colhida

por profissional treinado, aproveitando a rotina hospitalar de exames

laboratoriais já existente. Uma agulha acoplada a uma seringa foi introduzida

na veia de mais fácil acesso e uma amostra do sangue colhido foi logo

repassada para tubo apropriado. Todos os cuidados foram tomados, de forma

a tornar mínimos os riscos de infecção, contaminação, sangramento e dor.

3.5.2 Extração do DNA genômico

A extração do DNA genômico foi realizada a partir de células

mononucleares de amostras de sangue periférico colhido de cada paciente,

utilizando-se o sistema “blood genomic prep mini spin kit” (GE Heathcare,

Buckinghamshire, UK), de acordo com os procedimentos recomendados pelo

fabricante. O DNA foi armazenado a -20°C.

Quadro 5: Definição dos níveis de Risco de Estimativa de Recorrência.

61

3.5.3 Identificação do polimorfismo

O método utilizado para amplificação das regiões de DNA estudadas

neste trabalho foi a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase

chain reaction – PCR). Esta técnica permite-nos obter uma grande quantidade

de DNA da região pretendida partindo de uma amostra relativamente pequena.

As sequências nucleotídicas foram identificadas pelo programa BLAST

disponível no portal do National Center for Biotechnology Information (NCBI,

2009). Os iniciadores senso e reverso utilizados para amplificação das regiões

de interesse foram desenhados a partir da observação das sequências

identificadas no portal do NCBI e confirmadas por análises de sequenciamento.

3.5.4 Genotipagem do polimorfismo de repetição CA

3.5.4.1 Amplificação da região de interesse

Para genotipar este polimorfismo situado no intron 1 do gene EGFR, tal

região foi amplificada por PCR a partir de uma mistura de reação de 10 μL

contendo: 0,4 μl de DNA genômico do paciente, 200 μM de dNTPs, 2,5 nM de

MgCl2, 50 mM de KCl, 10 mM de tris-HCl (pH 9.0), 0,25 U de Taq polimerase e

0,4 μM de cada oligonucleotídeo iniciador, sendo o senso: 5'-

CTCCACCTGCAGCCCTTC-3', marcado com fluorescência 6-FAMTM (Life

Thechnology, Carlsbad, EUA) e o reverso: 5'-CAAGGTCTGGGAACCACTGT-

3'. A mistura de reação foi processada em termociclador automático VeritiTM

(Applied Biosystems, Foster City, USA) nas seguintes condições: desnaturação

inicial a 95ºC por 5 min, seguido de 35 ciclos com 30 segundos de

desnaturação a 95ºC, 30 segundos de hibridização a 60 ºC e 30 segundos de

extensão a 72ºC; com uma etapa final de extensão a 72ºC por 5 minutos.

Os produtos de reação foram analisados por eletroforese em gel de

agarose a 2% (p/v) na presença de brometo de etídeo e visualizados sob luz

UV. O resultado foi a geração de fragmento(s) amplificado(s) de

aproximadamente 200 pb (figura 11).

62

3.5.4.2 Análise de tamanho de fragmento

Os produtos amplificados foram analisados por eletroforese de capilar

para obtenção dos tamanhos exatos referentes a cada alelo de cada paciente.

Inicialmente, 1μL do produto amplificado foi diluído em 3μL de

formamida high dye (pH 7,0). Utilizando placa de 96 poços, foram adicionados

em cada um deles: 1 μL do produto diluído, 0,5μL de padrão de peso molecular

GeneScan-400HD (Applied Biosystems, Foster City, EUA) e 8,5 μL de

formamida high dye (pH 7,0). A placa foi incubada a 95ºC por 3 minutos e logo

em seguida, mantida a 4ºC por 2 minutos.

A placa foi inserida em aparelho sequenciador automático modelo ABI

3130 (Applied Biosystems, Foster City, EUA) onde as misturas foram

submetidas à eletroforese de capilar de 30 cm em polímero POP7.

Após aproximadamente uma hora e meia, os fragmentos de DNA

marcados com a fluorescência FAMTM foram separados de acordo com seus

Figura 11: Observação sob luz UV do produto da

amplificação de sequencia do intron 1 do gene

EGFR de 3 pacientes (1 a 3) após eletroforese em

gel de agarose 2% (p/v). Obtenção de produto

esperado de aproximadamente 200 pb (p: padrão

de peso molecular de 50pb).

63

tamanhos, com a sensibilidade de diferença de um nucleotídeo entre cada

fragmento. A detecção da fluorescência por comprimento de onda foi

interpretada pelo sistema computacional do equipamento segundo códigos de

cores ao passarem pela região de leitura ótica do sequenciador.

Os eletroferogramas da separação foram gerados no programa

GeneMapper® v.3.7 (Applied Biosystems). Na figura 12, a área assinalada

corresponde ao pico de detecção do tamanho do fragmento alélico.

Os outros picos adjacentes correspondem aos fragmentos gerados

erroneamente pela Taq polimerase durante a amplificação dos alelos

genômicos originais. É sabido que estes erros de polimerização durante as

Figura 12: Eletroferograma de corrida de eletroforese de capilar

de dois pacientes diferentes gerados pelo programa

GeneMapper® v.3.7. Na análise do primeiro paciente

observamos fragmentos de 192 e 196 pares de base, enquanto

no segundo, os dois fragmentos alélicos apresentam tamanho

de 200 pares de base.

64

reações de amplificação em cadeia geram fragmentos de tamanhos menores

do que os originais genômicos (Ellegren 2004).

As pacientes que apresentaram dois alelos de tamanhos diferentes na

análise foram consideradas heterozigotas para o polimorfismo de repetição CA,

ou seja, apresentaram número de repetições diferente em cada alelo. As

pacientes que não apresentaram tamanhos de alelos diferentes na análise

foram consideradas homozigotas para este polimorfismo.

3.5.4.3 Confirmação por sequenciamento direto

A fim de estimar a correspondência entre o tamanho do fragmento

amplificado e o número exato de repetições CA neste fragmento, sete amostras

de pacientes homozigotas (figura 13) foram selecionadas para realização de

sequenciamento direto do DNA genômico empregando o método de

terminação em cadeia (Sanger et al., 1977).

A reação de sequenciamento foi composta pela mistura de DNA

genômico (1-3 ng), 1,5 μl de tampão de reação contendo os

dideoxinucleotídeos fluorescentes ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP disponíveis

no kit ABI PRISM Dye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, Foster City, USA),

3,2 pmols dos iniciadores específicos senso ou reverso anteriormente descritos

para amplificação de região de interesse do exon 13 do gene EGFR e água

deionizada para volume final de 10 μl. As misturas de reação foram

processadas em termociclador automático VeritiTM (Applied Biosystems, Foster

City, USA) programado para uma desnaturação inicial por um minuto a 96°C,

seguida de 25 ciclos de 15 segundos de desnaturação a 96ºC, 15 segundos de

hibridização a 50 ºC e 4 minutos de extensão a 60ºC.

65

Os produtos amplificados foram submetidos à precipitação, realizada em

placas de 96 poços com uma inicial centrifugação a 600 rpm por 1 minuto,

seguida da adição de 30 μl de isopropanol a 75% (v/v) em água deionizada. A

placa foi incubada por 15 minutos a temperatura ambiente, ao abrigo da luz e

em seguida centrifugada a 4.000 rpm, durante 45 minutos, a temperatura de

4°C. Posteriormente, o isopropanol foi cuidadosamente retirado e foram

adicionados 50μl de etanol a 75% (v/v) em água deionizada. Em seguida, uma

nova etapa de centrifugação foi realizada durante 15 minutos a 14.000 rpm e

4ºC, objetivando a precipitação do DNA contendo os dideoxinucleotídeos

marcados.

Finalmente, o etanol foi removido por inversão cuidadosa da placa em

superfície absorvente. Uma última etapa de centrifugação foi realizada com a

Figura 13: Eletroferograma de quatro das

sete amostras de pacientes homozigotas com

tamanhos de fragmentos diferentes,

selecionadas para análise por

sequenciamento.

66

placa invertida até alcançar 600 rpm. A placa foi incubada a 60°C durante 10

minutos sob abrigo da luz para completa evaporação do etanol. Após esta

etapa, a placa foi mantida a -20ºC até o momento de ser encaminhada a

eletroforese em sequenciador automático.

Os poços da placa contendo as amostras de produto amplificado e

precipitado foram reconstituídos em 10 uL de formamida high dye (pH 7,0). A

placa foi submetida à etapa de choque térmico a 95°C por dois minutos,

objetivando a quebra de estruturas secundárias que possam impedir a correta

separação dos fragmentos de DNA marcados e em seguida, foi submetida à

eletroforese em capilar de 30 cm em sequenciador automático modelo ABI

3130 (Applied Biosystems, Foster City, EUA).

Após aproximadamente uma hora e meia, os fragmentos de DNA

marcados foram separados de acordo com seus tamanhos (diferença de um

nucleotídeo entre cada fragmento), e sequenciados por emissão de

fluorescência em diferentes comprimentos de onda para cada nucleotídeo, ao

passarem pela região de leitura ótica do sequenciador. Os comprimentos de

onda eram interpretados pelo sistema computacional do equipamento segundo

códigos de cores (azul, vermelho, verde e amarelo para cada nucleotídeo).

As sequências obtidas foram analisadas pelo programa Geneious 5.5

(Biomatters Ltd, Auckland, Nova Zelândia). Após o emparelhamento das fitas

geradas por cada um dos dois iniciadores, senso e reverso, foi possível estimar

o número de repetições CA existentes nos fragmentos de tamanho conhecido

analisados (figura 14).

Figura 14: Eletroferograma de sequenciamento dos produtos amplificados do intron 1 do gene

EGFR pelo programa Geneious 5.5. Emparelhamento da sequencia senso e reverso de um

paciente com tamanho de fragmentos de 192 pares de base. Na análise é possível observar

uma sequencia com 16 repetições CA.

67

A partir dessa análise, o programa GeneMapper® v.3.7 (Applied

Biosystems) foi configurado para assumir determinado número de repetições

CA de acordo com o número de pares de base (pb) encontrado (figura 15).

3.5.5 Genotipagem do polimorfismo R497K

3.5.5.1 Amplificação da região de interesse

Para genotipar o polimorfismo R497K situado no exon 13 do gene

EGFR, tal região foi amplificada por PCR a partir de uma mistura de reação de

30 μL contendo: 1 μl de DNA genômico do paciente, 200 μM de dNTPs, 2,5 nM

de MgCl2, 50 mM de KCl, 10 mM de tris-HCl (pH 9.0), 1,5 U de Taq polimerase

e 0,4 μM de cada oligonucleotídeo iniciador, sendo o senso: 5'-

TGCTGTGACCCACTCTGTCT-3' e o reverso: 5'-CCAGAAGGTTGCACT-

TGTCC-3'. A mistura de reação foi processada em termociclador automático

VeritiTM (Applied Biosystems, Foster City, USA) nas seguintes condições:

Figura 15: A eletroforese de capilar de amostras de duas pacientes

diferentes geradas pelo programa GeneMapper® v.3.7. O primeiro foi

caracterizado como heterozigoto de alelos com 16 e 18 repetições CA.

O segundo foi caracterizado como um paciente homozigoto de alelo

com 20 repetições.

68

desnaturação inicial, a 95ºC por 5 minutos, seguido de 35 ciclos de 30

segundos de desnaturação a 95ºC, 30 segundos de hibridização a 56 ºC e 30

segundos de extensão a 72ºC; com uma etapa final de extensão a 72ºC por 5

minutos. Os produtos de reação foram analisados por eletroforese em gel de

agarose a 2% (p/v) na presença de brometo de etídeo e visualizados sob luz

UV. O resultado foi a geração de um fragmento amplificado de 156 pb (figura

16).

3.5.5.2 Digestão com enzima de restrição

A digestão foi realizada em uma mistura de reação de 15μl contendo 5μl

do produto de DNA amplificado do paciente, 5U da enzima de restrição BstNI

(Bio Labs, New England, UK) e tampão de reação correspondente. A mistura

foi incubada por uma hora a 60ºC. Logo após, receberam a adição de mais 2 U

da enzima BstNI, seguido de mais 2 horas de incubação a 60ºC.

Os produtos da digestão foram analisados por eletroforese em gel de

agarose 2% (p/v) corados com brometo de etídeo e visualizados sob luz UV.

Figura 16: Observação sob luz UV do produto

da amplificação de sequencia do exon 13 do

gene EGFR de 3 pacientes (1 a 3) após

eletroforese em gel de agarose 2% (p/v).

Obtenção de produto esperado de

aproximadamente 150 pb (p: padrão de peso

molecular de 50pb).

69

Os produtos de digestão relacionados ao genótipo homozigoto selvagem

(GG) apresentaram dois fragmentos: um de 50 e outro de 106 pb. Em

contraste, os produtos pertencentes ao genótipo homozigoto variante (AA)

apresentaram apenas um fragmento de 156 pb, com perfil idêntico ao padrão

de produto não digerido. Em contraste, produtos pertencentes ao genótipo

heterozigoto (GA), apresentaram os três fragmentos de 56, 100 e 156 pb

(figura 17).

3.5.5.3 Confirmação por sequenciamento direto

Para confirmação dos dados encontrados nas reações de digestão com

enzima de restrição, seis pacientes de cada grupo genotípico tiveram seu DNA

genômico encaminhado para sequenciamento direto de acordo com a

metodologia anteriormente descrita.

As sequências obtidas foram analisadas pelo programa BioEdit v7.1.3

(Ibis Biosciences, Carlsbad, EUA). A leitura final mostrou similaridade entre os

genótipos sequenciados e os obtidos através da reação de digestão com

enzima de restrição em todas as amostras analisadas (figura 18).

Figura 17: Observação sob luz UV do produto da reação de digestão com enzima de restrição

para genotipagem do polimorfismo R497K de 10 pacientes (1 a 10) após eletroforese em gel de

agarose 2% (p/v). Os tamanhos dos produtos de reação determinam os genótipos de cada

paciente (p: padrão de peso molecular de 50pb; c: controle, produto amplificado não digerido).

70

A mudança de um nucleotídeo guanina (G) por adenina (A) na posição

1749 do gene EGFR (códon 497) resulta na substituição de um aminoácido

arginina (Arg) quando a sequência determinante for AGG, por um aminoácido

lisina (Lys), quando a sequência for AAG.

Figura 18: Observação dos eletroferogramas dos sequenciamentos das amplificações do

exon 13 do gene EGFR gerados pelo programa BioEdit v7.1.3. Observa-se a presença dos

nucleotídeos G ou A na posição 1749 dos alelos examinados, determinando a presença de

um aminoácido arginina ou lisina, respectivamente. (C: citosina; A: adenina; G: guanina,

Arg: Arginina; Lys: lisina).

71

3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Para gerenciamento das análises estatísticas, foi utilizado o programa

SPSS (Statistical Package for the Social Sciences, versão 15.0).

Foi realizado um estudo descritivo da população em estudo, através da

análise das medidas de tendência central e de dispersão e distribuição de

freqüência para as variáveis independentes.

Os resultados encontrados na identificação dos polimorfismos foram

utilizados para estimar a frequência alélica. A aderência ao princípio de Hardy-

Weinberg foi avaliada pelo teste do qui-quadrado.

O teste do qui-quadrado foi usado para comparação de dados de

frequência, com exceção das comparações com frequencia menor que 5, em

que usou-se o teste de Fisher.

O cálculo de tendência da incidência dos fenótipos de acordo com a

presença da variante alélica polimórfica foi realizado por associação linear.

A avaliação de associações entre as variáveis clínico-patológicas e a

presença de polimorfismos foi realizada através do cálculo de razão de

chances (OR - odds ratio), considerando um intervalo de confiança de 95%.

Os ajustes nos cálculos de razão de chance pelas variáveis de

interferência foram realizados por regressão binária.

Neste estudo, o nível de significância para rejeição da hipótese de

nulidade foi de 5% (p ≤ 0,05). Os resultados com valor de p menor do que 0,05

foram destacados em negrito.

72

4 RESULTADOS

4.1 POPULAÇÃO

4.1.1.1 Recrutamento

Durante o período de recrutamento, foi possível selecionar 540

pacientes com diagnóstico de câncer de mama, das quais 492 foram incluídas.

Os genótipos para o polimorfismo de repetição CA e para o polimorfismo

R497K foram obtidos em 426 e 472 pacientes, respectivamente (quadro 6).

Portanto, dentre as 426 pacientes genotipadas para o polimorfismo de

repetição CA, todas foram também genotipadas para o polimorfismo R497K.

4.1.1.1 Descrição da população

As características clinico-patológicas das 472 pacientes que tiveram seu

DNA analisado para pelo menos um polimorfismo são descritas na tabela 1.

Não parece haver diferença no perfil descritivo da população quando as 48

Quadro 6: Fluxograma de inclusão e análise da população do estudo.

73

pacientes que não foram elegíveis para o estudo são retiradas da análise

descritiva.

Perfil clínico patológico

N N

Idade 472 anos Status Linfonodal 472

média 58,5 pN0 296 62,7

mediana 58 pN1 108 22,9

faixa 27 ~ 92 pN2 45 9,5

pN3 23 4,9

Idade 472 %

< 35 anos 2,3 Receptor de Estrogênio 453

≥ 35 anos 97,7 negativo 72 15,9

positivo 381 84,1

Tipo histológico 472 % s/ informação (19)

ductal invasivo 404 85,6

ductal in situ 35 7,4 Receptor de Pregesterona 452

lobular in situ 2 0,4 negativo 120 26,5

lobular invasivo 26 5,5 positivo 332 73,5

misto 5 1,1 s/ informação (20)

Grau tumoral 418 % HER2 432

grau 1 58 13,9 negativo 351 81,3

grau 2 162 38,8 positivo 65 15,0

grau 3 198 47,4 intermediário 16 3,7

s/ informação (54) s/ informação (40)

Tamanho tumoral 450 % Subclassificação biológica 415

pTis 37 8,2 luminal A 276 66,5

pT1 197 43,8 luminal B 73 17,6

pT2 200 44,4 tipo Her2 25 6,0

pT3 15 3,3 triplo negativo 41 9,9

pT4 1 0,2 s/ classificação (57)

s/ informação (22)

Utilizando as variáveis estudadas, os perfis de prognóstico da população

incluída foram observados pelo estadiamento, pelo prognóstico de Nottingham

e pela estimativa de risco de recorrência (tabela 2). Nota-se que existe um

grupo composto por cerca de 20% desta população que tem um provável

desfecho desfavorável.

Tabela 1: Descrição das características clínico-patológicas da população com o

DNA analisado estudo.

74

Estadiamento e prognóstico N

Estadiamento (pTNM) 451 %

0 37 8,2

I 141 31,3

II A 138 30,6

II B 66 14,6

III A 45 10,0

III B 1 0,2

III C 23 5,1

s/ classificação (21)

Prognóstico de Nottingham 374

excelente 22 5,9

bom 72 19,3

moderado 200 53,5

ruim 80 21,4

s/ classificação (98)

Risco de Recorrência 427

baixo 25 5,9

intermediário 316 74,0

alto 86 20,1

s/ classificação (45)

4.1.1.2 . Polimorfismo de repetição CA

Observando os resultados dos ensaios de genotipagem de 426

pacientes para o polimorfismo de repetição CA, foi detectada a ocorrência de

alelos contendo entre 14 e 24 repetições CA (gráfico 1). Os alelos de 16 e de

20 repetições foram os alelos mais frequentes na população e suas frequências

alélicas podem ser observadas na tabela 4. A análise de todos os tamanhos

alélicos encontrados na população indica 37 genótipos diferentes.

Tabela 2: Descrição das características patológicas

pelas estimativas de prognóstico.

75

Assumiu-se o alelo mais frequente como limiar de corte para definir um

alelo como curto ou longo. Assim, um alelo foi denominado curto quando

apresentou número de repetições CA igual ou menor que 16, enquanto um

alelo longo foi assim denominado quando apresentou mais de 16 repetições

CA. A partir desta definição, foram caracterizados os grupos genotípicos

curto/curto, considerado “homozigoto” predominante; curto/longo ou

heterozigoto, e longo/longo, considerado “homozigoto” variante (tabela 3).

Como não há consenso na literatura quanto à forma de definir os

genótipos do polimorfismo de repetições CA, foi considerada também outra

forma de avaliação, analisando o somatório de repetições CA dos dois alelos

de cada paciente (gráfico 2).

Gráfico 1: Gráfico mostrando a frequência alélica de acordo com o número de

repetições CA.

76

Polimorfismo de repetição CA (rs72554021)

Grupos alélicos 852 % longo/longo 124 %

curto = CA ≤ 16 398 46,7 18/20 36 8,5

longo = CA > 16 454 53,3 20/20 17 4,0

18/18 12 2,8

curto/curto % 19/20 10 2,3

16/16 85 20,0 17/20 8 1,9

15/16 6 1,4 17/18 7 1,6

14/16 4 0,9 17/19 6 1,4

14/15 1 0,2 17/21 6

20/21 6

curto/longo % 17/17 4 0,9

16/20 70 16,4 19/19 3 0,7

16/18 45 10,6 18/19 2 0,5

16/17 32 7,5 20/22 2

16/19 17 4,0 18/21 1 0,2

16/21 15 3,5 19/21 1

15/20 12 2,8 19/22 1

16/18 4 0,9 21/21 1

14/21 2 0,5 21/23 1

15/21 2

18/23 2 Genótipos 426 %

14/24 1 0,2 curto/curto 96 22,5

15/17 1 curto/longo 206 48,4

15/19 1 longo/longo 124 29,1

15/23 1

16/22 1 Alelos frequencia

alelica IC 95%

16 repetições 0,425 (0,398~0,460)

20 repetições 0,208 (0,180~0,236)

Analisando as frequências dos somatórios das repetições CA e a linha

de tendência de média móvel de dois períodos gerada pelo programa Microsoft

Office Excel (versão 2007) no gráfico 2, podemos identificar dois grupos: um

Tabela 3: Descrição dos grupos alélicos e genotípicos do polimorfismo de repetição CA.

77

grupo que apresentou soma igual ou maior ou igual a 36 repetições CA, e um

grupo que apresentou soma de repetições CA menor do que 36.

A tabela 4 mostra a proporção entre os grupos ∑CAn < 36 e ∑CAn ≥ 36 ,

que apresentaram frequências semelhantes, 51,9% e 48,1%, respectivamente.

Soma das repetições CA

Repetição CA 426 %

∑CAn < 36 221 51,9

∑CAn ≥ 36 205 48,1

4.1.2 Polimorfismo R497K

A tabela 5 mostra a distribuição do polimorfismo R497K entre as 472

pacientes da população estudada. Observando os resultados dos ensaios de

Gráfico 2: Frequência genotípica de acordo com a soma das repetições CA dos alelos de cada

paciente.

Tabela 4: Descrição dos grupos genotípicos do

polimorfismo de repetição CA agrupados pela

soma das repetições.

78

genotipagem, foi encontrada uma frequência de 21,8% para o alelo variante A

(adenina), representado pelo fenótipo Lys. Analisando a distribuição genotípica

descrita na tabela 5, observamos que a população estudada encontra-se

dentro do equilíbrio de Hardy-Weinberg.

Grupos genotípicos R497K (rs11543848)

Alelos 944 frequência alélica (IC 95%)

Arg 739 0,782 (0,755~0,808)

Lys 205 0,218 (0,192~0,245)

Genótipos 472 %

Arg/Arg 285 60,4

Arg/Lys 169 35,8

Lys/Lys 18 3,8

Equilíbrio de Hardy-Weinberg

X2 = 1,329736298

p = 0,248852312

4.2 ASSOCIAÇÕES FENÓTIPO X GENÓTIPO

4.2.1 Polimorfismo de repetição CA

A seguir analisaremos a distribuição dos grupos genotípicos de repetição

CA em função das características clínico-patológicas. Na tabela 6, são

apresentadas as variáveis de idade e de descrição morfológica dos tumores,

não havendo diferenças significativas para a distribuição dos grupos

genotípicos de repetição CA.

Tabela 5: Descrição dos grupos alélicos e genotípicos do polimorfismo de

repetição CA agrupados pela soma das repetições.

79

Repetição CA

Características Histopatológicas

Total curto/curto

CA ≤ 16 / CA ≤ 16 curto/longo

CA ≤ 16 / CA > 16 longo/longo

CA > 16 / CA > 16 p valor

426 N % N % N %

Idade no diagnóstico 426

> 35 anos 416 94 22,6 203 48,8 119 28,6 0,320

≤ 35 anos 10 2 20,0 3 30,0 5 50,0

Tipo histológico 421

in situ 32 6 18,8 15 46,9 11 34,4 0,759

invasivo 389 89 22,9 188 48,3 112 28,8

Grau tumoral 377

grau 1 54 14 25,9 23 42,6 17 31,5 0,614

grau 2 or 3 323 68 21,1 159 49,2 96 29,7

Tamanho tumoral 385

T ≤ 2cm 185 42 22,7 81 43,8 62 33,5 0,111

T > 2cm 200 45 22,5 106 53,0 49 24,5

Status linfonodal 426

N0 ou N1 364 81 22,3 172 47,3 111 30,5 0,306

N2 ou N3 62 15 24,2 34 54,8 13 21,0

Tabela 6: Distribuição das características histopatológicas entre os grupos genotípicos do polimorfismo de repetição CA.

80

Repetição CA

Receptores Total curto/curto

CA ≤ 16 / CA ≤ 16 curto/longo

CA ≤ 16 / CA > 16 longo/longo

CA > 16 / CA > 16 p valor

426 N % N % N %

Receptor de estrogênio

positivo 343 71 20,7 167 48,7 105 30,6 0,492

negativo 65 17 26,2 32 49,2 16 24,6

Receptor de progesterona

positivo 297 56 18,9 144 48,5 97 32,7 0,039

negativo 110 31 28,2 55 50,0 24 21,8

Her2 status 375

negativo 316 69 21,8 157 49,7 90 28,5 0,497

positivo 59 13 22,0 25 42,4 21 35,6

Tabela 7: Distribuição do status dos receptores hormonais e HER2 entre os grupos genotípicos do polimorfismo de repetição CA.

81

Repetição CA

Prognostico Total curto/curto

CA ≤ 16 / CA ≤ 16 curto/longo

CA ≤ 16 / CA > 16 longo/longo

CA > 16 / CA > 16 p valor

426 N % N % N %

Estadiamento (pTNM) 406

≤ II 344 76 22,1 164 47,7 104 30,2 0,473

≥ III 62 15 24,2 33 53,2 14 22,6

Prognóstico de Nottingham (NPI) 338

moderado a excelente 264 58 22,0 122 46,2 84 31,8 0,282

ruim 74 16 21,6 41 55,4 17 23,0

Risco de recorrência 387

baixo ou intermediário 310 70 22,6 145 46,8 95 30,6 0,308

elevado 77 18 23,4 42 54,5 17 22,1

Tabela 8: Distribuição das estimativas de prognóstico entre os grupos genotípicos do polimorfismo de repetição CA.

82

Na tabela 7, estão apresentados os perfis de expressão de receptores e

nota-se que a distribuição dos genótipos de repetição CA é diferente em função

do status do receptor de progesterona.

Na tabela 8, são avaliadas as variáveis de estimativa de prognóstico não

havendo diferenças significativas para a distribuição dos grupos genotípicos de

repetição CA.

Dentre as características clinico-patológicas estudadas, o status de

progesterona foi a única variável que demonstrou ter um p valor menor do que

0,05 para a diferença entre as distribuições genotípicas de repetição CA. No

gráfico 3, observamos a tendência de diminuição da ocorrência do status RP-

entre os grupos genotípicos de repetição CA (p = 0,011).

Embora as razões de chance entre os grupos curto/longo e curto/curto

ou entre os grupos longo/longo e curto/longo ultrapassem o valor de referência

(OR = 1,0), as pacientes com genótipo longo/longo têm por volta de 50%

menos chance de ter um status RP- do que pacientes com genótipo curto/curto

ou curto/longo (tabela 9). Quando ajustamos o cálculo de OR para outras

Gráfico 3: Tendência de diminuição da proporção de pacientes com

status RP negativo entre os grupos genotípicos de repetição CA.

83

variáveis que também poderiam estar associadas ao status de RP-, a

associação entre genótipo longo/longo e o status RP- manteve-se

estatisticamente significativa.

Repetição CA

Características curto/curto + curto/longo

longo/longo

OR = 1,000 OR cr (IC95%)

OR ajus (IC95%)

Receptor de progesterona 0,575 (0,344~0,961)

negativo 0,324 (0,124~0,845)

OR: odds ratio; ORcr: OR crude; OR ajus: OR ajustado:

IC 95%: intervalo de confiança de 95%

(RP) OR ajus p/ idade, tipo histológico, grau, pT, pN, RE e HER2.

A definição de pontos de corte para classificação dos alelos com

repetição CA em curtos ou longos para este polimorfismo revela desafios

devido à variabilidade dos tamanhos entre os alelos na população e a

indefinição sobre a real associação entre determinado tamanho ou grupo

específico de repetições CA e o perfil transcricional diferenciado.

Assim, também foi analisada a influência das características clínico-

patológicas sobre a distribuição os grupos genotípicos de repetição CA,

divididos de acordo com a soma alélica de repetições CA de cada paciente:

∑CAn < 36 versus ∑CAn ≥ 36. Novamente, apenas o status de RP- afetou a

proporção entre os grupos ∑CAn < 36 e ∑CAn ≥ 36 (tabela 10), isto é, as

pacientes com genótipo ∑CAn ≥ 36 têm por volta de 50% menos chance de ter

um status RP- do que as pacientes com ∑CAn < 36. Quando ajustamos este

cálculo para outras variáveis que também poderiam estar associadas ao status

Tabela 9: Cálculo de razão de chances para o status RP negativo

entre os grupos genotípicos de Repetição CA.de repetição CA.

84

de RP negativo, a associação entre genótipo ∑CAn ≥ 36 e o status RP negativo

continua estatisticamente significativa.

Repetição CA

Características ∑CAn < 36 ∑CAn ≥ 36

OR = 1,000 OR cr (IC95%)

OR ajus (IC95%)

Receptor de progesterona 0,536 (0,343~0,838)

negativo 0,277 (0,125 ~ 0,613)

OR: odds ratio; ORcr: OR crude; OR ajus: OR ajustado:

IC 95%: intervalo de confiança de 95%

(RP) OR ajus p/ idade, tipo histológico, grau, pT, pN, RE e HER2.

Visto que o diagnóstico de tumor com status RP- reflete pior prognóstico

para o tratamento do câncer de mama, deste resultado infere-se que a

ocorrência do genótipo variante do polimorfismo de repetição CA, representado

pela presença de dois alelos longos (CAn > 16) ou pela soma dos alelos maior

ou igual a 36 (∑CAn ≥ 36), poderia estar associado a um perfil de melhor

prognóstico da doença.

4.2.2 Polimorfismo R497K

A seguir, analisaremos a distribuição dos grupos fenotípicos gerados

pelo genótipo do polimorfismo R497K em função das características clínico-

patológicas, estadiamento e estimativas de prognóstico. Os resultados de

distribuição estão apresentados na tabela 11, 12 e 13.

Tabela 10: Cálculo de razão de chances para o status RP negativo

entre os grupos genotípicos de Repetição CA, agrupados pela soma

alélica de cada paciente.

85

R497K

Características clínico-patológicas

Total Arg/Arg Arg/Lys Lys/Lys p valor

472 N % N % N %

Idade no diagnóstico 472

> 35 anos 461 281 61,0 162 35,1 18 3,9 0,139

≤ 35 anos 11 4 36,4 7 63,6 0 0,0

Tipo histológico 467

in situ 37 24 64,9 12 32,4 1 2,7 0,832

invasivo 430 259 60,2 154 35,8 17 4,0

Grau tumoral 418

grau 1 58 35 60,3 21 36,2 2 3,4 0,958

grau 2 ou 3 360 219 60,8 126 35,0 15 4,2

Tamanho tumoral 424

T ≤ 2cm 202 115 56,9 79 39,1 8 4,0 0,464

T > 2cm 222 138 62,2 74 33,3 10 4,5

Status linfonodal 472

N0 / N1 404 233 57,7 153 37,9 18 4,5 0,008

N2 / N3 68 52 76,5 16 23,5 0 0,0

Tabela 11: Distribuição das características histopatológicas entre os grupos fenotípicos do polimorfismo R497K.

86

R497K

Receptores Total Arg/Arg Arg/Lys Lys/Lys p valor

472 N % N % N %

Receptor de estrogênio 453

positivo 381 225 59,1 141 37,0 15 3,9 0,221

negativo 72 50 69,4 19 26,4 3 4,2

Receptor de progesterona 452

positivo 332 200 60,2 119 35,8 13 3,9 0,884

negativo 120 75 62,5 40 33,3 5 4,2

Her2 status 415

negativo 350 206 58,9 127 36,3 17 4,9 0,449

positivo 65 42 64,6 23 35,4 0

Tabela 12: Distribuição do status dos receptores hormonais e HER2 entre os grupos fenotípicos do polimorfismo R497K.

87

R497K

Prognostico Total Arg/Arg Arg/Lys Lys/Lys p valor

472 N % N % N %

Estadiamento (pTNM) 451

≤ II 382 220 57,6 144 37,7 18 4,7 0,018

≥ III 69 51 73,9 18 26,1 0

Prognóstico de Nottingham (NPI) 374

moderado a excelente 294 166 56,5 113 38,4 15 5,1 0,054

ruim 80 57 71,3 21 26,3 2 2,5

Risco de recorrência 427

baixo ou intermediário 341 192 56,3 132 38,7 17 5,0 0,006

elevado 86 63 73,3 23 26,7 0

Tabela 13: Distribuição das estimativas de prognóstico entre os grupos fenotípicos do polimorfismo de R497K.

88

A única variável independente que mostrou associação com a

distribuição dos grupos fenotípicos foi o status linfonodal. Entre as pacientes

com status linfonodal N2 ou N3 houve menor prevalência do alelo variante para

Lisina (Lys).

Na tabela 13, a distribuição dos grupos fenotípicos gerados pelo

genótipo do polimorfismo R497K é avaliada em função das variáveis de

estimativa de prognóstico. Entre as pacientes com doença em estádio ≥ III ou

consideradas com alto risco de recorrência houve menor ocorrência do alelo

variante para Lisina (Lys).

No gráfico 4, observamos a tendência da diminuição de status linfonodal

pN2/pN3 em função dos genótipos R497K (p = 0,002). A proporção de status

pN2/pN3 em relação ao status pN0/pN1 foi significativamente menor entre as

pacientes Arg/Lys quando comparadas às pacientes com o genótipo/fenótipo

de referência Arg/Arg com OR (IC 95%) = 0,468; (0,258 ~ 0,850). Entre as 18

pacientes homozigotas para o genótipo/fenótipo variante (Lys/Lys) não houve

ocorrência de status linfonodal pN2/pN3, não sendo possível determinar a

razão de chances nesse caso. Entretanto, tal ausência da categoria de pior

prognóstico pN2/pN3 entre as pacientes Lys/Lys reforça a magnitude de

associação entre o status linfonodal e o polimorfismo R497K. De acordo com

esta noção, o estadiamento e a estimativa de risco de recorrência, que são

variáveis afetadas pelo status linfonodal, também influenciaram

significativamente a distribuição dos genótipos/fenótipos R497K (tabela 14). O

prognóstico de Nottingham pareceu influenciar a distribuição dos

genótipos/fenótipos R497K, embora tal associação não tenha alcançado

significância estatística (p = 0,054).

As variáveis que demonstraram ter um valor de p menor do que 0,10

para a diferença entre as distribuições fenotípicas de R497K foram

selecionadas para avaliação das razões de chance considerando os

genótipos/fenótipos variantes de forma agrupada (Arg/Lys + Lys/Lys) para

comparação com o genótipo/fenótipo de referência (Arg/Arg). A tabela 14

mostra que as pacientes com genótipos/fenótipos variantes possuem menos

chance de ter status linfonodal pN2/pN3 do que as pacientes Arg/Arg (OR =

89

0,419). Tal associação foi encontrada também para as variáveis definidoras de

prognóstico, como o estadiamento, prognóstico de Nottingham e estimativa de

risco de recorrência.

Quando ajustamos o cálculo das razões de chance para outras variáveis

independentes, a associação entre a presença de pelo menos um alelo

variante (Lys) e pior status linfonodal, pior estadiamento e pior prognóstico de

Nottingham mantiveram-se estatisticamente significativas.

Com relação à estimativa de risco de recorrência, o ajuste não se aplica,

pois tal variável consiste de uma composição de todas as variáveis estudadas.

Visto que o diagnóstico de tumor com status linfonodal pN2/pN3 possui

um pior prognóstico para o tratamento do câncer de mama, este resultado

sugere que a presença do alelo variante do polimorfismo R497K, alelo Lys (G

→ A), poderia estar associado a um perfil de melhor prognóstico da doença.

Gráfico 4: Tendência de diminuição da proporção de pacientes com

status linfonodal pN2 / pN3 entre os grupos fenotípicos do

polimorfismo R497K.

90

R497K

Características Arg/Arg Arg/Lys + Lys/Lys

OR = 1,000 OR cr (IC95%)

OR ajus (IC95%)

Status linfonodal 0,419 (0,231 ~ 0,759)

N2 ou N3 0,332 (0,164 ~ 0,671)

Estadiamento (pTNM) 0,479 (0,269 ~ 0,851)

≥ III 0,389 (0,202 ~ 0,749)

Prognóstico de Nottingham (NPI) 0,523 (0,306 ~ 0,895)

ruim 0,515 (0,294 ~ 0,901)

Risco de recorrência 0,470 (0,278 ~ 0,794)

elevado N.A.

OR: odds ratio; ORcr: OR crude; OR ajus: OR ajustado:

IC 95%: intervalo de confiança de 95%

(pN) OR ajus p/ idade, tipo histológico, grau, pT, RE, RP e HER2.

(pTNM) OR ajus p/ idade, tipo histológico, grau, RP, RE e HER2.

(NPI) OR ajus p/ idade, tipo histológico, RP, RE e HER2.

N.A.: não se aplica

4.2.3 Modelo de grupos polimórficos do gene EGFR.

Com a finalidade de avaliar a interação ente os dois principais

polimorfismos do gene EGFR quanto à associação com variáveis de

prognóstico do câncer de mama, buscou-se avaliar um modelo de predição de

desfecho com base na análise combinada dos genótipos de repetição CA e

R497K. Inicialmente, para construção do modelo foi preciso estabelecer os

grupos considerados como referência ou variantes em cada caso. Para o

polimorfismo de repetição CA foram analisados dois modelos: 1) o modelo

Tabela 14: Cálculo de razão de chances para características

histopatológicas entre os grupos fenotípicos do polimorfismo R497K.

91

baseado no tamanho de cada alelo, definidos como curto (CA ≤ 16) ou longo

(CA > 16), ou 2) o modelo baseado na soma dos dois alelos individuais,

caracterizando dois genótipos, definidos como ∑CAn < 36 ou ∑CAn ≥ 36. Para

o polimorfismo R497K, o genótipo/fenótipo predominante Arg/Arg foi

considerado como referência para o modelo, enquanto os genótipos/fenótipos

contendo Lys em hetrozigose ou homozigose foram considerados variantes.

Foram avaliados a seguir dois modelos preditivos de interação entre os

polimorfismos EGFR, EGFR16 e EGFR35, cuja diferença reside na forma de

definição dos genótipos de repetição CA, seguindo, respectivamente, o modelo

curto/longo para os alelos individuais ou o ∑CAn.

4.2.3.1 Modelo EGFR16

Neste modelo, os genótipos dos polimorfismos do gene EGFR foram

agrupados como Referência16 (Ref16) e Variante16 (Var16), conforme descrito no

quadro 7.

Grupos EGFR

R497K Repetição CA

Referência

16 Arg/Arg

curto/curto ou curto/longo

Variante

16

Arg/Lys ou Lys/Lys

longo/longo

Quadro 7: Definição dos grupos genotípicos de

referência e variante do modelo EGFR16

.

92

4.2.3.2 Modelo EGFR35

Neste modelo, os genótipos dos polimorfismos do gene EGFR foram

agrupados como Referência35 (Ref35) e Variante35 (Var35) de acordo com o

quadro 8.

Grupos EGFR35

R497K Repetição CA

Referência

35 Arg/Arg ∑CAn < 36

Variante

35

Arg/Lys ou Lys/Lys

∑CAn ≥ 36

4.2.3.3 Aplicação do modelo EGFR16

A tabela 15 mostra as variáveis clinico-patológicas que apresentaram

associação significativa com algum dos polimorfismos EGFR quando

analisados de forma independente. Aqui, o modelo EGFR16 é usado para

avaliação de associação com tais variáveis selecionadas. Com exceção do

status de RP, todas as demais variáveis afetaram significativamente a

distribuição dos grupos genotípicos do modelo EGFR16.

Analisando a variável histopatológica que apresentou diferença na

distribuição dos polimorfismos, o status linfonodal se apresentou

estatisticamente diferente, e assim, observando as razões de chance, o grupo

Var16/Var16 é o único que difere do grupo referência.

Quadro 8: Definição dos grupos genotípicos de

referência e variante do modelo EGFR35

.

93

Modelo EGFR16

Características Total Ref16/Ref16 Ref16/Var16 Var16/Var16 p valor

N % N % N %

426 186 43,7 183 43,0 57 13,4

Status linfonodal 426

N0 ou N1 364 151 41,5 158 43,4 55 15,1 0,015

N2 ou N3 62 35 56,5 25 40,3 2 3,2

Receptor de progesterona 407

Positivo 297 122 41,1 130 43,8 45 15,2 0,125

Negativo 110 54 49,1 47 42,7 9 8,2

Estadiamento (pTNM) 406

≤ II 344 141 41,0 153 44,5 50 14,5 0,042

≥ III 62 34 54,8 25 40,3 3 4,8

Prognóstico de Nottingham 338

moderado a excelente 264 104 39,4 118 44,7 42 15,9 0,027

Ruim 74 39 52,7 31 41,9 4 5,4

Risco de recorrência 387

baixo ou intermediário 310 126 40,6 134 43,2 50 16,1 0,011

Elevado 77 41 53,2 33 42,9 3 3,9

Referência: Arg/Arg e CA ≤ 16 / CA ≤ 16 ou CA ≤ 16 / CA > 16;

Variante: Arg/Lys ou Lys/Lys e CA > 16 / CA > 16

Tabela 15: Cálculo de razão de chances para características histopatológicas entre os grupos genotípicos do modelo EGFR16

.

94

Na tabela 16, observamos a tendência da diminuição de status linfonodal

pN2/pN3 em função dos genótipos EGFR16 (p = 0,005). A proporção de status

pN2/pN3 em relação ao status pN0/pN1 foi significativamente menor entre as

pacientes Var16/Var16 quando comparadas às pacientes Ref16/Ref16 com OR (IC

95%) = 0,156; (0,036 ~ 0,674).

A tabela 17 mostra o cálculo das razões de chance para o genótipo

EGFR16 Var/Var, que reúne os dois polimorfismos, em comparação com os

demais genótipos, aqui considerados em conjunto.

Os resultados indicam que o genótipo EGFR16 Var/Var está associado a

uma menor ocorrência de mais de 3 metástases linfonodais e que está

associado a índices de melhor prognóstico de Nottingham bem como ao menor

risco de recorrência. Tais associações se mantêm após o ajuste para outras

variáveis independentes.

Tabela 16: Tendência de diminuição da proporção de pacientes com status linfonodal

pN2 / pN3 entre os grupos genotípicos do modelo EGFR16

.

95

Modelo EGFR16

Características Ref

16/Ref

16 +

Ref16

/Var16

Var

16/Var

16

OR = 1,000 OR cr (IC95%)

OR ajus (IC95%)

Status linfonodal 0,187 (0,044 ~ 0,788)

N2 ou N3 0,216 (0,048 ~ 0,971)

Estadiamento (pTNM) 0,299 (0,090 ~ 0,991)

≥ III 0,316 (0,092 ~ 1,091)

Prognóstico de Nottingham (NPI) 0,302 (0,105 ~ 0,872)

ruim 0,320 (0,108 ~ 0,951)

Risco de recorrência 0,210 (0,063 ~ 0,695)

elevado N.A.

Ref16: Arg/Arg e CA ≤ 16 / CA ≤ 16 ou CA ≤ 16 / CA > 16

Var16: Arg/Lys ou Lys/Lys e CA > 16 / CA > 16

OR: odds ratio; ORcr: OR crude; OR ajus: OR ajustado:

IC 95%: intervalo de confiança de 95%

(pN) OR ajus p/ idade, tipo histológico, grau, pT, RE, RP e HER2.

(pTNM) OR ajus p/ idade, tipo histológico, grau, RP, RE e HER2.

(NPI) OR ajus p/ idade, tipo histológico, RP, RE e HER2.

N.A.: não se aplica

4.2.3.4 Aplicação do modelo EGFR35

Dentre as características clinico patológicas estudadas, o status do

envolvimento linfonodal, do receptor de progesterona, do estadiamento, do

prognóstico de Nottihgham e da estimativa do risco de recorrência

apresentaram uma associação significativa com algum dos polimorfismos

Tabela 17: Cálculo de razão de chances para características

histopatológicas entre os grupos grupos genotípicos do modelo

EGFR16

.

96

estudados. A distribuição destas características entre os grupos genotípicos do

modelo EGFR35 foram comparadas. Na tabela 18, observamos que o status do

envolvimento linfonodal, o RP, o prognóstico de Nottihgham e a estimativa do

risco de recorrência mostraram uma distribuição estatisticamente diferente

entre os grupos do modelo EGFR35. A incidência de pacientes com status RP

negativo pareceu diminuir de acordo com a ocorrência do grupo de genótipos

variante35.

97

Modelo EGFR35

Características Total Ref35/Ref35 Ref35/Var35 Var35/Var35 p valor

N % N % N %

426 136 31,9 202 47,4 88 20,7

Status linfonodal 426

N0 ou N1 364 115 31,6 166 45,6 83 22,8 0,025

N2 ou N3 62 21 33,9 36 58,1 5 8,1

Receptor de progesterona 407

positivo 297 84 28,3 144 48,5 69 23,2 0,048

negativo 110 44 40,0 49 44,5 17 15,5

Estadiamento (pTNM) 406

≤ II 344 109 31,7 158 45,9 77 22,4 0,056

≥ III 62 20 32,3 36 58,1 6 9,7

Prognóstico de Nottingham 335

moderado a excelente 261 74 28,4 125 47,9 62 23,8 0,028

ruim 74 24 32,4 43 58,1 7 9,5

Risco de recorrência 387

baixo ou intermediário 310 98 31,6 134 43,2 78 25,2 0,002

elevado 77 25 32,5 46 59,7 6 7,8

Referência: Arg/Arg e ∑CAn < 36

Variante: Arg/Lys ou Lys/Lys e ∑CAn ≥ 36

Tabela 18: Distribuição das características histopatológicas entre os grupos genotípicos do modelo EGFR16

.

98

Na tabela 19, observamos que não houve tendência de diminuição da

ocorrência de pacientes com status linfonodal pN2 / pN3 dentre os grupos do

modelo EGFR35 (p = 0,084). Porém, as razões de chance envolvendo a

incidência de pacientes com status RP negativo foram estatisticamente

diferentes entre o grupo Ref35/Var35 e Var35/Var35.

Também na tabela 19, observamos que houve uma tendência de

diminuição da ocorrência de pacientes com status RP negativo dentre os

grupos do modelo EGFR35 (p = 0,015). Porém, as razões de chance

envolvendo a incidência de pacientes com status RP negativo não parecem

diferir entre os grupos.

Dentre as características estudadas na tabela 18, o status do

envolvimento linfonodal, do RP, do estadiamento, do prognóstico de

Nottingham e da estimativa de risco de recorrência foram as a variáveis que

demonstraram ter um valor de p menor que 0,10 para a diferença entre as

distribuições dos grupos deste modelo. Para cálculo de odds ratio, os grupos

foram dicotomizados em pacientes Ref35/Ref35 e pacientes Ref35/Var35 versus

pacientes Var35/Var35. A tabela 20 mostra que as pacientes com genótipo

Var35/Var35 têm por volta de 70% a menos de chance de ter status linfonodal

pN2 / pN3 do que pacientes Ref35/Ref35 ou Ref35/Var35, com um OR (IC95%) =

0,297 (0,115 ~ 0,765).

Tabela 19: Tendência de diminuição da proporção de pacientes com status linfonodal pN2

/ pN3 entre os grupos genotípicos do modelo EGFR35

.

99

Quando ajustamos este cálculo por outras variáveis que também

poderiam estar associadas ao status linfonodal pN2 / pN3, a mesma

associação continua significativa.

Tabela 20: Cálculo de razão de chances para características

histopatológicas entre os grupos genotípicos do modelo EGFR16

.

100

Ainda observando a mesma tabela, verificamos que das variáveis

definidoras de prognóstico, apenas o estadiamento apresentou associação

entre as pacientes do grupo Var35/Var35 e perfis de melhor prognóstico. Quando

o ajuste do cálculo de odds ratio foi realizado, esta associação com o

estadiamento permaneceu estatisticamente significativa. Finalmente,

observamos que as pacientes com genótipo Var35/Var35 têm por volta de 75% a

menos de chance de ter um risco elevado de recorrência do que as pacientes

Ref35/Ref35 ou Ref35/Var35, com um OR (IC95%) = 0,251 (0,105 ~ 0,601).

101

5 DISCUSSÃO

O câncer de mama é uma doença heterogênea e de fisiologia complexa

e ainda não totalmente compreendida. A biologia do processo de

carcinogênese se apresenta de maneiras variadas em pacientes com a mesma

doença. Durante o processo de diferenciação e proliferação celular, diversas

moléculas efetoras e receptoras realizam cruciais processos de transmissão da

informação pelos tecidos e todos os genes que codificam estas proteínas

possuem versões polimórficas cuja frequência e distribuição muitas vezes são

distintas entre as populações (Tan 2008). Assim, estas variações genéticas têm

se mostrado possíveis biomarcadores de prognóstico do câncer (Azzato et al.

2010).

Dentre os genes notadamente relacionados com a carcinogênese (os

oncogenes), está o gene EGFR (Miller et al. 1994; Wykosky et al. 2011). O

gene EGFR possui variações polimórficas cujas distribuições são

desconhecidas na população brasileira. O perfil genético da população

brasileira, por ter sofrido alguns processos de miscigenação em sua história,

apresenta uma variabilidade que não permite sua identificação de

ancestralidade pela cor da pele (Pimenta et al. 2006; Suarez-Kurtz 2010).

Neste estudo, pudemos avaliar as distribuições genotípicas de dois

polimorfismos numa população de mulheres com câncer de mama. Analisando

a distribuição do polimorfismo de repetição CA, os alelos com 16 repetições CA

apresentaram uma frequência de 0,425 (IC95% = 0,398 ~ 0,458) entre as

pacientes. Este achado possui semelhança com os resultados publicados

sobre este polimorfismo em população norte-americana e de outros continentes

(Liu et al. 2003) (Gráfico 5). Estudos em populações orientais mostram maior

frequência de alelos longos, de 20 repetições CA do que entre os ocidentais

(Buerger et al. 2004; Nomura et al. 2007)

O polimorfismo R497K apresentou frequência do alelo variante Lys de

0,218 (IC95% = 0,192 - 0,245), resultado que não difere das frequências

relatadas para pacientes europeus e norte-americanos (Gonçalves et al. 2008;

McKibbin et al. 2010). Populações orientais apresentam aparentemente maior

102

frequência do alelo Lys do que populações ocidentais (Sasaki et al. 2009;

Huang et al. 2009).

Os polimorfismos do gene EGFR aqui estudados já foram investigados

em alguns trabalhos (Agelopoulos et al. 2008; Zhou et al. 2009). No caso do

polimorfismo de repetição CA, estudos com pacientes com câncer de mama

não possuem tamanho amostral amplo e não definem com clareza uma

associação causal entre os tamanhos das repetições dos dinucleotídeos e a

atividade do gene (Jami et al. 2008; Lin et al. 2011). Alguns autores que

publicaram resultados de ensaios in vitro apresentam a hipótese de que os

alelos maiores possuem menor atividade transcricional e assim, apresentam

quantidade de transcrito inferior às células com alelos menores (Liu et al.

2007).

Diante dos dados publicados compilados no quadro 2, e a diversidades

alélica encontrada para este polimorfismo, o agrupamento genotípico para este

polimorfismo foi testado de duas formas. Uma, levando em conta o número de

repetições em cada alelo por homozigose ou heterozigose. Os alelos curtos,

formados pelo alelo mais frequente (16) e os outros menores; e os alelos

longos formados pelos alelos maiores que 16 repetições CA, onde o alelo 20

CA, foi o mais frequente. A outra, levando em conta a soma do número de

Gráfico 5: Distribuição dos genótipos 16/16, 16/20 e 20/20 do polimorfismo de repetição CA em diferentes etnias. A) Frequência dos genótipos no presente estudo, representando a população brasileira. B) Estudo de avaliação da distribuição deste polimorfismo em caucasianos, afro-americanos, chineses e asiáticos não-chineses publicado por Liu et al.

(2003).

103

repetições dos dois alelos da paciente estudada. As somas de 36 e logo em

seguida de 32 repetições CA foram as mais frequentes. Assim, por este

modelo, as pacientes com somas maiores do que 35 repetições CA foram

agrupadas. Quando analisamos a associação deste polimorfismo com as

características histopatológicas, verificamos que as pacientes com alelos

maiores, ou seja, com maior número de repetições CA, tiveram menor chance

de ter status RP-, tanto quando analisamos pelo modelo de alelos curtos e

longos, tanto pelo modelo das somas.

Não é comum associar o status RP- com algum fenótipo específico no

câncer de mama quando analisado isoladamente, embora a ausência de super

expressão de RP no câncer de mama esteja associada à progressão da

doença, sobretudo em mulheres pós-menopausa (Balleine et al. 1999).

Entender a atividade do RP no contexto da carcinogênese e do tratamento

adjuvante também é um desafio (Lange et al. 1998). Um mecanismo de

crosstalk (intercomunicação) entre as vias de cascata sinalizadora dos

receptores esteróides e dos receptores de fatores de crescimento tem sido

descrito em estudos moleculares (Fox et al. 2010; Hoefnagel et al. 2012).

Existem algumas evidências sugerindo que este crosstalk entre receptores de

estrogênio e receptores da família erbB aciona cascatas de sinalização que

podem levar a uma regulação negativa dos níveis de transcrição de receptores

de progesterona (Massarweh et al. 2008). A regulação transcricional regida

pela via PIK3-Akt-mTOR, disparada pela atividade sinérgica do EGFR e do ER

é descrita como um mecanismo de diminuição dos níveis de RP (Thakkar &

Mehta 2011).

No contexto do presente estudo, partindo da hipótese de que a atividade

transcricional do gene EGFR é inversamente proporcional ao número de

repetições CA, tumores com alelos mais longos estariam associados a menor

atividade do EGFR e, portanto, esta via de regulação negativa do RP não

estaria tão ativa, contribuindo para menor chance de ter status RP-. Este

raciocínio poderia justificar o resultado encontrado de que as pacientes

longo/longo apresentaram menor ocorrência de tumores com status RP- do que

pacientes curto/curto (OR= 0,447; IC95% = 0,238 - 0,836). Assumindo-se que

104

tumores RP- apresentam pior prognóstico, pacientes com alelos maiores

(longo/longo ou ∑CAn > 35) também teriam esta estimativa.

Estudos com outros tipos de câncer parecem corroborar a noção de que

alelos maiores (longo/longo ou ∑CAn > 35) estão associados a melhores

desfechos. Num estudo em câncer de pulmão, Dubey e colaboradores (2006)

demonstraram que pacientes com alelos mais longos (∑CAn > 35), tiveram

melhor sobrevida (p = 0,03) (Dubey et al. 2006). Em outro estudo em câncer de

esôfago, pacientes com alelos mais longos (homozigotos de alelos ≥ 20

repetições CA) tiveram melhor sobrevida (p = 0,045) (Lee et al. 2011). Porém,

no câncer de mama, o status de RP, quando analisado isoladamente, parece

contribuir pouco para o prognóstico.

O status do RP e, principalmente de RE, além de contribuírem para

estimativa dos prognósticos de sobrevida e de risco de recorrência, são

determinantes para predição de resposta à terapia hormonal no câncer de

mama (Massarweh et al. 2008; Harrell et al. 2006). Dentre as pacientes RE+, o

status de RP parece ter também valor preditivo (Bardou et al. 2003). O status

do EGFR também tem sido pesquisado como marcador de resposta à terapia

hormonal e sua maior atividade é descrita como via de resistência (Arpino et al.

2005). É possível que a presença dos polimorfismos EGFR possa influenciar o

status do EGFR e, indiretamente, a resposta terapêutica à terapia hormonal

adjuvante. O presente trabalho não avaliou a associação entre os

polimorfismos EGFR e o padrão de expressão ou o status de atividade do

EGFR.

Analisando os resultados de associação entre o polimorfismo R497K e

variáveis histopatológicas, identificamos que a ocorrência do alelo variante Lys

está associada a menor invasão linfonodal, num modelo de co-dominância, ou

seja, a tendência de se encontrar pacientes com status pN2 ou pN3 parece

diminuir progressivamente em função da ocorrência do alelo variante em

heterozigose ou homozigose (Ptendência = 0,002). Estes dados corroboram os

resultados encontrados no único estudo publicado envolvendo câncer de mama

e o polimorfismo EGFR R497K, segundo o qual pacientes com alelo variante

105

Lys apresentaram menor prevalência de presença de linfonodos positivos (p =

0,030) (Kallel et al. 2009).

Quando pesquisamos sobre os mecanismos que podem estar

associados ao processo de invasão linfonodal, o EGFR parece desempenhar

um fator crucial nas vias de diferenciação celular de formação de um fenótipo

neoplásico mais invasivo e aderente, não só no câncer de mama (Jones et al.

1996; Oonk et al. 2007; Sarkis et al. 2010). Alguns trabalhos em modelos

experimentais sugerem que a via de ativação do EGFR está em crosstalk com

vias de ativação de moléculas como integrinas, metaloproteinases e E-

caderina, responsáveis pela característica celular de invasão tecidual e,

portanto, formação de metástases (Ricono et al. 2010; Georgopoulos et al.

2010; Hudson & Stack 2010).

As quimiocinas e seus receptores também parecem desempenhar papel

crucial no mecanismo de linfangiogênese. Assim, a atividade destas moléculas

nos tumores de mama parece estar associada à ocorrência de metástases

linfonodais (Müller et al. 2001; Cabioglu et al. 2007). Os complexos

mecanismos de sinalização celular relacionados com esta associação não

estão por completo elucidados. Porém, Liu et al. (2010) demonstraram que a

expressão de receptores de quimiocinas como CXCR4 e CCR7 está

estatisticamente associada ao status EGFR positivo em tumores invasivos de

mama (p < 0,01), levando a maior ocorrência de metástases linfonodais nestes

tumores do que naqueles que apresentaram uma baixa expressão destes

receptores (p < 0,001). O status linfonodal é um fator fundamental na definição

de estimativas de prognóstico por notoriamente influenciar o desfecho final da

doença (Chagpar et al. 2011).

Quando analisamos o EGFR sob o ponto de vista da interação com os

seus ligantes, considerando a conformação espacial de seus domínios e o

processo de dimerização, muitas variáveis podem contribuir para o nível de sua

atividade (Shepard et al. 2008). Estudos cristalográficos e de modelagem

molecular buscam entender quais mudanças estruturais podem contribuir para

uma menor afinidade do sítio catalítico com os ligantes (Samaga et al. 2009;

Alvarado et al. 2010).

106

A associação entre o alelo Arg e o status linfonodal positivo parece

sugerir que a forma selvagem do polimorfismo R497K contribua para maior

atividade do EGFR, favorecendo maior capacidade proliferativa e maior poder

invasivo no câncer de mama.

A consequência da troca de um aminoácido Arg por um Lys na atividade

do receptor foi inicialmente descrita nos estudos de Moriai et al. (1994), que

mostraram menor ativação dos fatores de transcrição c-myc, fos e jun em

associação à estrutura da versão variante, possivelmente por atenuada

interação com o ligante e reduzida capacidade de dimerização.

Os resultados encontrados no presente estudo se mostram de acordo

com os achados de Moriai et al. (1994) e de.Brandt et al. 2006, que, de uma

forma geral, propõem que as formas variantes dos polimorfismos EGFR estão

associadas a características de prognóstico favorável para melhor desfecho do

tratamento do câncer de mama. Entretanto, tais estudos prévios têm limitações

em relação ao tamanho amostral e não analisaram os dois polimorfismos em

conjunto. Dessa forma, no presente trabalho, avaliamos modelos de

agrupamento dos genótipos predominantes (considerados de referência) e dos

genótipos variantes para uma análise conjunta do impacto dos dois principais

polimorfismos EGFR sobre fatores prognósticos do câncer de mama.

No modelo EGFR16, a tendência de melhor desfecho de acordo com a

ocorrência das variantes polimórficas se mantém, exceto para a associação

com o status do RP. A associação entre as formas variantes e os parâmetros

de estadiamento ou as estimativas de prognóstico apresentaram maior

magnitude e maior significância estatística do que quando estudadas

separadamente para cada polimorfismo. Este aumento de magnitude na

associação parece traduzir um efeito sinérgico entre os dois plimorfismos, de

tal forma que o grupo variante na análise combinada apresenta chance de alto

risco de recorrência cerca de 80% menor do que o grupo de referência. O

modelo EGFR35 seguiu o mesmo perfil, porém os valores associativos se

apresentaram ligeiramente menores. Estes resultados parecem corroborar os

dados publicados por Zhang et al. (2005), que mostraram que pacientes com

107

genótipo Arg/Arg e dois alelos < 20 repetições CA tiveram pior sobrevida livre

de recorrência do que pacientes com genótipos variantes.

Analisando os estudos a seguir, observamos que a terapia anti-EGFR

em pacientes de câncer de pulmão e colon mostraram potencial influência dos

polimorfismos EGFR. Ma et al. (2009) mostraram que o gefitinibe, um inibidor

tirosina-cinase indicado para o tratamento do câncer de pulmão de células não

pequenas foi mais eficaz em pacientes com pelo menos um alelo ≤16

repetições CA (p < 0,001). De forma semelhante, Sasaki et al. (2009)

mostraram que a presença do alelo Lys em pacientes com câncer de pulmão e

linfonodo positivo resultou em melhor sobrevida em resposta ao tratamento

com gefitinibe (p = 0,004) Pacientes com genótipo selvagem parecem se

beneficiar mais desta terapia do que os pacientes com genótipo variante

(Sasaki et al. 2009). Em câncer de colon metastático, Wang et al. (2007) e

Gonçalves et al. (2008) descreveram que pacientes Lys parecem exibir melhor

sobrevida livre de doença do que os pacientes Arg quando tratados com

cetuximabe, um anticorpo monoclonal anti-EGFR (p < 0,001 e p = 0,042,

respectivamente). Press et al. (2008) e Park et al. (2011) não encontraram

associações entre a resposta ao tratamento com cetuximabe em pacientes com

câncer de colon metastático e o número de repetições CA do gene EGFR. De

todo modo, a investigação sobre a resposta aos antineoplásicos citostáticos

clássicos e a terapia anti-EGFR no câncer de mama merece ser avaliada de

acordo com o perfil genotípico destes polimorfismos.

Com os resultados obtidos neste estudo, é possível perceber que

variações na atividade do EGFR interferem com fatores prognósticos do câncer

de mama. Algumas associações com relação ao impacto deste polimorfismo na

ação de fármacos antineoplásicos foram frutos de testes em modelos in vitro

porém ainda sem definição clara sobre as associações e seus impactos nas

condutas clínicas (Puyo et al. 2008).

Alterações no gene EGFR e nos genes que codificam proteínas de suas

cascatas de sinalização podem notoriamente interferir no prognóstico de alguns

tipos de câncer, como a mutação de do gene KRAS em pulmão e colon

influenciando significativamente na resposta a terapia anti-EGFR (Park et al.

108

2011; Milano et al. 2008). Formas mutantes do receptor são frequentemente

encontradas em células neoplásicas de alguns tumores (Nomura et al. 2007). A

forma mutante mais comum é o EGFRVIII, resultado da deleção dos exons 2 a

7, que pode estar expresso em gliobastoma multiforme, câncer de pulmão,

próstata, ovário e mama (Gupta et al. 2010).

Mutações em K-Ras e em EGFR não parecem ocorrer frequentemente

no câncer de mama nem ter associação com prognóstico (Sánchez-Muñoz et

al. 2010; Nieto et al. 2007; Dahan et al. 2011). Diferentemente das mutações,

os polimorfismos são variações que ocorrem naturalmente na espécie humana.

No contexto do câncer de mama, os polimorfismos do gene EGFR podem ter

algum valor prognóstico e devem ser avaliados como potenciais biomarcadores

na construção de modelos preditivos de resposta do câncer de mama.

Outras inúmeras variáveis genéticas e epigenéticas podem também

interferir na expressão e na atividade do EGFR (Franco-Hernandez et al. 2007;

Jovanovic et al. 2010), bem como na atividade de inúmeras vias de sinalização

do processo de carcinogênese, interferindo na indicação e na resposta ao

tratamento antineoplásico do câncer de mama (Bouchalova et al. 2010;

Thompson et al. 2011). A elaboração de modelos que reúnam fatores clinico-

patológicos, genéticos, hábitos de vida e o histórico familiar da paciente têm

sido elaborados por inúmeros pesquisadores e agências científicas no mundo

todo (Relling et al. 2010; Parisi et al. 2010).

O presente trabalho faz parte de um projeto chamado “Polimorfismos

genéticos e evolução clínica, resposta terapêutica e reações adversas em

pacientes submetidas ao tratamento do câncer de mama”, que envolve o

acompanhamento de pacientes diagnosticadas com câncer de mama no

Hospital do Câncer III / INCA. Dentre os objetivos deste projeto, está a

construção de um modelo preditor de sobrevida e recorrência de metástases

no tratamento do câncer de mama. A análise da contribuição das variações

alélicas normais do genoma humano nos desfechos do tratamento é parte da

estratégia para construção deste modelo.

As associações encontradas neste estudo, devem ser melhor

investigadas, pela quantificação de RNAm do gene EGFR em tumores destas

109

pacientes e avaliação da expressão do EGFR nestes tumores por ensaios de

imunohistoquímica (Suo et al. 2002). Porém, os resultados encontrados aqui já

sugerem que estas variações genéticas podem ser biomarcadores de

prognóstico do câncer de mama, e quando aplicados juntos a outras

plataformas de perfil de assinatura gênica tumoral poderiam acrescentar poder

de predição e de determinação de condutas terapêuticas mais eficazes, com o

objetivo de gerar melhor qualidade de vida às pacientes e menores custos em

políticas de saúde (Brandt et al. 2006; Spano et al. 2008;; Williams et al. 2006).

110

6 CONCLUSÕES

Os polimorfismos do gene EGFR selecionados para o presente estudo

apresentam freqüências alélicas em brasileiros semelhantes às relatadas para

europeus e americanos, incluindo dados de afro-americanos.

Os polimorfismos do gene EGFR apresentam associação com fatores

prognósticos do câncer de mama, particularmente com a presença de

metástases linfonodais e parecem ter uma interação sinérgica nesta

associação.

A associação entre os polimorfismos do gene EGFR e a estimativas de

prognóstico se mantiveram mesmo quando ajustadas para outras variáveis

independentes, sugerindo que a combinação dos grupos genotípicos

identificados como variantes possa contribuir como um biomarcador na

construção de modelos preditivos de evolução do câncer de mama.

Com base nos dados de associação entre os polimorfismos estudados e

fatores prognósticos do câncer de mama, e considerando o papel funcional

estabelecido para este receptor em processos tumorais, propomos que os

grupos genotípicos EGFR sejam avaliados como biomarcadores de resposta

terapêutica aos antineoplásicos citostáticos clássicos e a terapias anti-EGFR

no câncer de mama.

111

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ANEXO I

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ANEXO III

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ANEXO IV