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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ALDAIR DE SOUSA PAIVA
PERFIS IMUNOFENOTÍPICOS DAS DOENÇAS
LINFOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS
NO RIO GRANDE DO NORTE
NATAL/RN 2018
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Elaborado por Adriana Alves da Silva Alves Dias - CRB-15/474
CDU 616-006.44 RN/UF/BSCCS
1. Doenças Linfoproliferativas Crônicas Citometria de Fluxo -
Tese. 2. Imunofenotipagem - Tese. 3. Citometria de Fluxo - Tese.
I. Cavalcanti Júnior, Geraldo Barroso. II. Título.
Paiva, Aldair de Sousa.
Perfis imunofenotípicos das doenças linfoproliferativas
crônicas no Rio Grande do Norte / Aldair de Sousa Paiva. - 2018.
150f.: il.
Tese (Doutorado em Ciências da Saúde) - Universidade Federal
do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de
Pós-Graduação em Ciências da Saúde. Natal, RN, 2018.
Orientador: Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior.
ii
ALDAIR DE SOUSA PAIVA
PERFIS IMUNOFENOTÍPICOS DAS DOENÇAS LINFOPROLIFERATIVAS
CRÔNICAS NO RIO GRANDE DO NORTE
Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior
NATAL/RN 2018
iii
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde:
Prof.: Dra. Ana Katherine da Silveira Gonçalves de Oliveira
Vice-Cordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saude:
Pro. Dr. Guilherme Maranhão Chaves
NATAL/RN 2018
iv
v
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao amigo, Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior, meu orientador, que
pela sua simplicidade, ética, senso apurado e investigativo, matém unidos todos os
hematologistas deste Estado em benefício dos pacientes hematológicos.
vi
AGRADECIMENTOS
A minha família Sanali, Hugo, Gustavo e Larissa pela compreensão e estímulo.
Aos colegas Dr. Rodrigo Villar e Dr. Marcelo Rocha, Diretor e Vice Diretor do
Hemocentro Dalton Cunha, por sua prestimosa dedicação a esta Instituição.
A Coordenação e equipe de funcionários do Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde pela oportunidade e desempenho nas suas tarefas.meu
agradecimento especial a Kaliene, Alana (Secretarias).
A Fundação de Apoio à Pesquisa do estado do Rio Grande do Norte (FAPERN)
pelo apoio financeiro.
Aos membros da banca de qualificação, Prof. Dr. Aldo Medeiros, Prof. Dr. Paulo
Medeiros, Prof. Dr. Irami Araújo Filho, que com suas valiosas observações muito
contribuíram para o aperfeiçoamento do trabalho final.
Aos colegas Dr. Marcos Leão, Dr. Henrique Fonseca, Dr. Claudio Macêdo, Dr.
Afonso Lamas, Dr. Francisco Fernandes Júnior, Dr. Rodrigo Villar, Dr. Enildo Alves,
Dra. Irian Farkat, Dra. Telma Cassandra, Dr. Rodolfo Soares, Dr. Andre Hipólito, Dr.
Francisco Cury, Dr. Lavoisier Campos, Dr. Marcelo Rocha, Dr. James Farley, Dr.
Kleber Cavalcanti, Dra. Edilene Melo, Dr. Wilson Cleto de Medeiros Filho, Dra Maria
Zélia Fernandes e Dra. Edvis Serafin, Dr. Frank Bahia, Dra Carolina Vilarim, Dra.
Daniela Albuquerque por permitirem compartilhar estas informações.
A Dra. Linete Rocha fundadora do Hemocentro Dalton Cunha e Núcleo de
Hematologia e Hemoterapia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pelo
empenho e dedicação em prol da Hematolgia e Hemoterapia do Rio Grande do
Norte,uma das pioneiras da hemoterapia no Brasil. Seu exemplo inspirou muitos ,
dentre estes me incluo.
vii
A Dra. Gabriela Vasconcelos, Pos Doutoranda, pela sua presteza, extremo rigor
científico na produção dos resultados e revisão do manuscrito.
Ao valioso time do Laboratório de Citometria de Fluxo do Hemocentro Dalton
Cunha: Lorena, Gilena e Rozana (Farmaceuticas–Bioquimicas), Giliane , Alessandra,
Victor Cezar, Eduarda, João (Estagiarios), pelo empenho na realização dos exames
de imunofenotipagem.
viii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ac Anticorpos
ALK Anaplastic lymphoma kinase
ATL Adult T Cell Leukemia
BCL-2 gene anti-apoptótico
CCND1 Ciclina D1
CD Cluster differentiation
CF Citometria de Fluxo
CFU–GEMM Unidade Formadora de Colônia de Granulócitos, Eosinófilos, Monócitos
e Macrófagos
CTL Célula Tronco Linfóide
DLBCL Diffuse Large B Cell Lymphoma
DLC Doença Linfoproliferativa Crônica
DLPC Doença Linfoproliferativa Crônica
EBER-ISHVírus Epstein Barr na Hibridização in situ
EBV Epstein Barr Vírus
EUA Estados Unidos da América
FCL Free Chain Light
FISH Hibridizaçãoin situ por fluorescência
HCL Hairy Cell Leukemia
HHV8 Herpes Vírus Tipo 8
HIV Vírus da Imunodeficiência humana
HLA-DR Receptor de Superfície Celular MHC classe II
HTLV Vírus T-linfotrópico Humano
Ig Imunoglobulina
IgHV3 Immunoglobulin Heavy-Chain Variable Region 3
INCA Instituto Nacional do Câncer
IRF4 Fator Regulatório de Interferon 4
LB Linfócito B
LB Linfócito B
LCTP Linfoma de Célula T Periférico
LCM Linfoma de Células do Manto
ix
LCP Leucemia de Células Plasmáticas
LCV Leucemia de Células Vilosas
LCVv Leucemia de Células Vilosas Variante
LECV Linfoma Esplênico de Células Vilosas
LF Linfoma Folicular
LGLG-T Leucemia de Grandes Linfócitos Granulares T
LGLG-NK Leucemia de Grandes Linfócitos Granulares NK
LLC Leucemia Linfocítica Crônica
LLP Linfoma Linfoplasmocítico
LLTA Leucemia Linfoma T do Adulto
LNH Linfoma Não Hodgkin
LPL-B Leucemia Prolinfocítica B
LPL-T Leucemia Prolinfocítica T
LT Linfócito T
LTc Linfócito T citotóxico
LTh Linfócito T helper
MALT Tecido linfóide associado à mucosa
MF Micose Fungóide
MI Mononucleose Infecciosa
MM Mieloma Múltiplo
MO Medula Óssea
MUM1 Oncogene-1 do Mieloma Múltiplo
MW Macroglobulinemia de Waldestron
NK Natural Killer
OMS Organização Mundial da Saúde
SC Stem cell
SIDA Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
SNC Sistema Nervoso Central
SP Sangue Pereiférico
SS Síndrome de Sézary
TCR Receptor de Célula T
TACTH Tranplante Autólogo de Células Tronco Hematopoiética
TCD4+ Linfócito T CD4+
x
TdT Terminal Deoxynucleotidyl Transferase
ZAP-70 Zeta-Chain Associated Protein Kinase of 70 KDA
xi
RESUMO
Introdução: As Doenças Linfoproliferativas Crônicas (DLPC) constituem um grupo de
neoplasias linfáticas que se caracterizam pela proliferação de linfócitos maduros
neoplásicos. A Imunofenotipagem por Citometria de Fluxo (ICF) é uma prática de
rotina no diagnóstico diferencial desses tumores, contribuindo para maior precisão.
Objetivos: Demonstrar os perfis imunofenotípicos diagnóstico de pacientes
portadores de DLPC no Rio Grande do Norte(RN); Demonstrar a aplicabilidade de
painel específico para o diagnóstico de pacientes com Mieloma Multiplo; Determinar a
monoclonalidade das DLPC-B; Implementar base de dados para pesquisas clínicas
Métodos: Pacientes (n = 500) com DLPC foram investigados pela CF. Além disso,
foram reunidas outras informações dos pacientes, como idade, sexo e dados
hematológicos. Resultados: Os resultados mostraram que 86,6% dos casos eram
DLPC-B e 13,4%, DLPC-T/NK. A distribuição das DLPC-B foi: 279 Leucemia
Linfocítica Crônica ; 17 Leucemia Prolinfocítica B; 11 Leucemia de Células Vilosas; 3
Linfoma Folicular ; 3 Linfoma Esplênico com Linfócitos Vilosos; 12 Linfoma de Células
do Manto; 01 Macroglobulinemia de Waldenstron; 47 Mieloma Múltiplo; 12 Leucemia
de Células Plasmáticas; 09 Linfoma de Burkitt e 39 LNH- Leucemizado . A
classificação DLPC de T/NK foi: 11 Leucemia de Grandes Linfócitos Granulares; 14
Leucemia Prolinfocítica T; 10 Leucemia de Células T do Adulto; 8 Síndrome de Sézary
e 24 Linfoma Periférico T. Conclusão: Os dados demonstram que a
imunofenotipagem é uma técnica confiável e segura no esclarecimento diagnóstico
dos pacientes portadores de DLPC. Foi possível a detecção de monoclonalidade nas
DLPC-B. O diagnóstico de mieloma múltiplo se beneficia da aplicação do painel
específico. Este estudo se consolida como base de pesquisa clínica para as DLPC no
Rio Grande do Norte. Aprovado pelo Comitê de Ética em pesquisa do Hospital
Universitário Onofre Lopes- UFRN
Palavras-chave: Citometria de Fluxo. Imunofenotipagem. Transtornos
linfoproliferativos
xii
ABSTRACT
Introduction: Chronic Lymphoproliferative Diseases (DLPC) are a group of lymphatic
neoplasms characterized by the proliferation of mature neoplastic lymphocytes.
Immunophenotyping by Flow Cytometry (ICF) is a routine practice in the differential
diagnosis of these tumors, contributing to greater precision. Objectives: To
demonstrate the immunophenotypic profiles of patients with DLPC in Rio Grande do
Norte (RN); Demonstrate the applicability of a specific panel for the diagnosis of
patients with multiple myeloma; Determine the monoclonality of DLPC-B; Implement
database for clinical research Methods: Patients (n = 500) with DLPC were
investigated by CF. In addition, other patient information, such as age, sex and
haematological data, was collected. Results: The results showed that 86.6% of the
cases were DLPC-B and 13.4%, DLPC-T / NK. The distribution of DLPC-B was: 279
Chronic Lymphocytic Leukemia; Prolinfocytic Leukemia B; 11 Vilous Cell Leukemia; 3
Follicular lymphoma; 3 Splenic Lymphoma with Vilous Lymphocytes; 12 Mantle Cell
Lymphoma; 01 Macroglobulinemia of Waldenstron; 47 Multiple Myeloma; 12 Plasma
Cell Leukemia; 09 Burkitt's Lymphoma and 39 NHL-Leucemy. The DLPC classification
of T / NK was: 11 Granular Lymphocyte Leukemia; 14 Prolinfocytic Leukemia T; 10
Adult T-Cell Leukemia; 8 Conclusions: The data demonstrate that
immunophenotyping is a reliable and safe technique in the diagnostic clarification of
patients with DLPC. It was possible to detect monoclonality in DLPC-B. The diagnosis
of multiple myeloma benefits from the specific panel application. This study
consolidates as a clinical research base for DLPC in Rio Grande do Norte. Approved
by ethics committee in research Hospital Onofre Lopes- UFRN
Keywords: Flow cytometry. Immunophenotyping. Lymphoproliferative Disorders
xiii
SUMÁRIO
1. Introdução……………………………………………………………………. 18
2. Revisão de Literatura …………………………………………................... 21
2.1. Células do Sistema Imune …………………………………………………. 21
2.1.1. Linfócitos …………………………………………………………………….. 23
2.1.1.1. Linfócitos B ………………………………………………………………….. 24
2.1.1.2. Linfócitos T ………………………………………………………………….. 25
2.1.1.3. Células Natural Killer ………………………………………………………. 26
2.2. Órgãos Linfoides e a Rede Linfática …………………………………...... 26
2.3. Linfocitose x Linfopenia ………………………………………………........ 30
2.4. Doenças Linfoproliferativas Crônicas …………………………………….. 32
2.4.1. Considerações Gerais ……………………………………………………... 32
2.4.2. Classificação ………………………………………………………………... 33
2.4.3. Importância da Imunofenotipagem por Citometria de Fluxo no
Diagnóstico e Classificação das Doenças Linfoproliferativas Crônicas
……………………………………………………………………...................
36
2.4.4. Doençãs Linfoproliferativas Crônicas de Células B ……………….......... 42
2.4.4.1. Leucemia Linfocítica Crônicas (LLC) ……………………………………… 42
2.4.4.2. Leucemia Prolinfocítica B (LPL-B) ……………………………………....... 53
2.4.4.3. Leucemia da Células Vilosas (LCV) …………………………………........ 55
2.4.4.4. Leucemia de Células Vilosas Variante (LCV-v) …………………….......... 58
2.4.4.5. Linfoma Folicular ( LF) ……………………………………………………… 59
2.4.4.6. Linfoma de Células do Manto (LCM) …………………………………........ 60
2.4.4.7. Linfoma Esplênico de Células Vilosas (LECV) ……………………........... 62
2.4.4.8. Linfoma Linfoplasmocítico (LLP) / Macroglobulinemia de Waldströn
(MW) ………………………………………………………….......................
62
2.4.4.9. Linfoma de Burkitt (LB) ……………………………………………………… 64
2.4.4.10. Mieloma Múltiplo (MM) ……………………………………………………… 66
2.4.5. Doenças Linfoproliferativas Crônicas de Células T ………………........... 70
2.4.5.1. Leucemia Prolinfocítica T (LPL-T) ……………………………………........ 70
2.4.5.2. Leucemia de Grandes Linfócitos Granulares (LGLG-T) …………........... 71
xiv
2.4.5.3. Micose Fungoide/Síndrome de Sézary (SS) …………………………....... 73
2.4.5.4. Leucemia/Linfoma de Célula T do Adulto (LLTA)…………………........... 75
3. Justificativa ………………………………………………………….............. 77
4. Objetivos…………………………………………………………………….... 78
4.1. Geral ………………………………………………………………………..... 78
4.2. Específicos …………………………………………………………………... 78
5. Casuística e Metodologia…………………………………………………… 79
5.1. Seleção das Amostras de Pacientes …………………………………........ 79
5.2. Métodos ……………………………………………………………………… 80
5.2.1. Teste de Viabilidade Celular ……………………………………………….. 80
5.2.2. Hemograma e Estudo Citomorfológico ……………………………………. 80
5.2.3. Imunofenotipagem ………………………………………………………….. 81
5.2.3.1. Marcação de Antígenos de Superfície ………………………………......... 81
5.2.3.2. Investigação de Cadeias Leves das Imunoglobulinas ……………........... 82
5.2.3.3. Marcação de Antígenos Intracitoplasmáticos e Nucleares ………........... 82
5.2.3.4. Leitura e Análises …………………………………………………………… 83
5.3. Exames Adicionais ………………………………………………………….. 84
6. Resultados………………………………………………………………….... 86
6.1. Classificação Imunológica ………………………………………………….. 86
6.2. Dados Demográficos ……………………………………………………….. 87
6.3. Parâmetros hematológicos ………………………………………………… 88
6.4. Citomorfologia ……………………………………………………………..... 91
7. Discussão…………………………………………………………………….. 141
8. Conclusões…………………………………………………………………… 159
9. Considerações Finais e Pespectivas Futuras…………........................... 160
10. Referências Bibliograficas………………………………………………….. 161
xv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Fluxo do paciente com linfocitose ...................................................... 32
Figura 2. Cintometria de fluxo ........................................................................... 36
Figura 3. Algoritmo do diagnóstico das neoplasias da células B ........................ 39
Figura 4. Morfologia de células sanguíneas de DLPC-B ............................... 99
Figura 5. Morfologia de células sanguíneas de DLPC-T ................................ 100
Figura 6. Dot Plot representativo dos fenótipos de DLPC-B ........................... 101
Figura 7. Dot Plot representativo do fenótipo de DLPC-T ............................... 102
Figura 8. Doenças linfoproliferativas crônicas – Neoplasia B e Neoplasia T .. 131
Figura 9. Distribuições de neoplasias .............................................................. 131
Figura 10. Doenças linfoproliferativas crônicas B – LLC ................................. 132
Figura 11. Doenças linfoproliferativas crônicas B - LPL- B ................................. 132
Figura 12. Doenças linfoproliferativas crônicas B – LCM ................................... 133
Figura 13. Doenças linfoproliferativas crônicas B – LF ....................................... 133
Figura 14. Doenças linfoproliferativas crônicas B – LNH – Fase leucêmica .... 134
Figura 15. Doenças linfoproliferativas crônicas B – LCV .................................. 134
Figura 16. Doenças linfoproliferativas crônicas B – LCVv ................................ 135
Figura 17. Doenças linfoproliferativas crônicas B – LELV................................. 135
Figura 18. Doenças linfoproliferativas crônicas B – MW .................................. 136
Figura 19. Doenças linfoproliferativas crônicas B – MM ................................... 136
Figura 20. Doenças linfoproliferativas crônicas B – LCP................................... 137
xvi
Figura 21. Doenças linfoproliferativas crônicas B – LB .................................... 137
Figura 22. Doenças linfoproliferativas crônicas T – LPL-T ............................... 138
Figura 23. Doenças linfoproliferativas crônicas T – LGLG-T............................. 138
Figura 24. Doenças linfoproliferativas crônicas T – LGLG – NK....................... 139
Figura 25. Doenças linfoproliferativas crônicas T – LCTA................................. 139
Figura 26. Doenças linfoproliferativas crônicas T – SS .................................... 140
Figura 27. Doenças linfoproliferativas crônicas T – LCTP................................. 140
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Classificação da OMS para as neoplasias do tecido linfóide............... 35
Tabela 2. Classificação das Doenças Linfoproliferativas Crônicas .................... 40
Tabela 3. Características Imununológicas das DLPC-B .................................... 41
Tabela 4. Painel de Anticorpos monoclonais ..................................................... 85
Tabela 5. Subgrupos das Doenças Linfoproliferativas Crônicas n ..................... 94
Tabela 6. DLPC-B e a incidência do fenótipo detectado .................................. 95
Tabela 7. Distribuição em subgrupos das DLPC-T ............................................ 96
Tabela 8. Dados demográficos e laboratoriais das DLPC-B ............................ 97
Tabela 9. Dados demográficos e laboratoriais DLPC-T .................................... 98
xvii
ANEXOS
Aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa....................................................... 177
Publicações ......................................................................................................... 178
18
1. INTRODUÇÃO
As doenças linfoproliferativas crônicas (DLPC) representam um grupo de
neoplasias do sistema linfo hematopoiético que apresentam características clínicas,
morfológicas e imunológicas heterogêneas. Constituem proliferações clonais de
natureza maligna de células maduras do sistema imune, com diferentes
comportamentos clínicos, fatores prognósticos e características epidemiológicas,
podendo envolver linfócitos B, T e células Natural Killer (NK)(1).
Trata-se de neoplasias que acometem geralmente pessoas com idade superior
a 50 anos, podendo ocasionalmente ocorrer em pessoas mais jovens, afetando mais
homens que mulheres na proporção de 2:1, respectivamente, proporção esta que
tende a decrescer com o aumento da faixa etária(2)
Nessas doenças é importante a distinção entre DLPC primárias e a fase de
leucemização dessas entidades, sendo usualmente designadas por leucemias ou
linfomas leucemizados quando predomina a sua expressão no sangue periférico (SP)
e/ou na medula óssea (MO) ou simplesmente linfomas quando predomina infiltração
dessas células restritas nos órgãos linfoides secundários ou outros tecido(3).
A denominação “crônica”, consagrado pela caracterização de doença indolente
ou assintomática, induz em erro, pois algumas DLPC incluídas nessa designação têm
um comportamento clínico agressivo e evolução rapidamente fatal. Podendo também
pensar o mesmo, para o termo “linfoproliferativas”, também empregado na
classificação dessas neoplasias, pois na maioria dos mecanismos envolvidos na sua
patogénese consiste fundamentalmente na inibição da apoptose e não numa
proliferação celular descontrolada como observada nas leucemias agudas(4).
Todas elas apresentam, no entanto, uma característica comum: o fenótipo
maduro de células linfóides, independentemente das características morfológicas
sugestivas de “maturidade” ou de “imaturidade” e do curso clínico menos ou mais
agressivo(4).
Não é possível a abordagem das DLPC sem um entendimento claro dos
conceitos de “clonalidade”, “neoplasias” e “malignidade” já que existe um paralelismo
entre eles ou seja os processos neoplásicos são de uma forma geral monoclonais e
potencialmente malignos, enquanto os processos reacionais constituem expansão do
tipo policlonal ou oligo-clonal e portanto clinicamente benignos. Desta forma, quando
relatamos as DLPC é importante referir o conceito de “monoclonalidade”, ou seja, de
19
que os linfócitos expandidos têm origem numa célula comum e, portanto, partilham o
mesmo tipo de rearranjo genético que codificam para o receptor de células T ou “T-
Cell Receptor” (TCR) no caso das DLPC de células T ou para as imunoglobulinas (Igs)
no caso das DLPC de células B que pode ser demonstrada, por técnicas de biologia
molecular ou imunofenotipagem por citometria de fluxo, ficando explicito que uma
resposta imune fisiológica se organiza sempre de uma forma policlonal e a de que
uma expansão monoclonal é sempre de natureza maligna(4).
Até recentemente, a caracterização dessas neoplasias eram realizadas
basicamente pela análise descritiva da citomorfologia de distensão de SP, aspirado
de MO ou imprintch de tecidos afetados tais como linfonodos ou massas tumorais. No
entanto, em função da similaridade da morfologia muitas vezes observada nessas
entidades, sua classificação e, consequentemente, a escolha do tratamento são
bastante dificultados, exigindo a confirmação diagnóstica por meio de outros
procedimentos tais como biopsia, imunofenotipagem e genotipagem dentre outros(4).
Nos últimos anos a Organização Mundial de Saúde (OMS) dos tumores dos
tecidos hematopoiético e linfoide preconiza uma abordagem diagnóstica com ênfase
nos seguintes parâmetros: morfológico, fenotípico e genotípico. No entanto, não é
necessário e tão pouco favorável do ponto de vista custo-benefício realizar múltiplos
testes em todas as amostras(5).
Nos dias atuais, o diagnóstico hematopatológico dessas entidades é
dependente de uma combinação de análise citomorfológica e histológica. No entanto,
técnicas de imunofenotipagem como a citometria de fluxo (CF) e a imuno-histoquímica
(IHQ) tem trazido informações relevantes ao diagnóstico, como o estágio de
maturação das populações celulares analisadas, a presença de células com fenótipos
significativamente anormais, além de avaliar a presença de marcadores associados
ao prognóstico ou até mesmo marcadores que são alvos terapêuticos(5).
Nos últimos anos, a CF substituiu progressivamente a microscopia de
imunofluorescência, constituindo hoje o método de referência para a identificação,
caracterização e quantificação de células neoplásicas das DLPC.(6)
A popularização da CF deve-se a vantagens únicas desta tecnologia:
simplicidade, rapidez e capacidade de análise de um grande número de células num
curto espaço de tempo; a possibilidade de avaliar a expressão antigénica de uma
forma qualitativa e quantitativa além da possibilidade de uma avaliação
20
multiparamétrica determinada pelo número crescente de anticorpos monoclonais
(AcMo) e de fluorocromos disponíveis(7).
Do ponto de vista de diagnóstico, a imunofenotipagem por CF é empregada
fundamentalmente para identificação e caracterização das células linfóides
neoplásicas com interesse na classificação das DLPC. Mais recentemente, a utilidade
da CF tem sido ampliada a outras áreas de interesse clínico que incluem a
investigação de prognostico, monitoramento de doença residual mínima após
tratamento e seleção de pacientes para tratamento alvo específico(8).
As DLPC mais comuns são as de células B. Entretanto, várias outras entidades
originárias de células T e NK, embora mais raras podem atualmente ser bem
caracterizadas utilizando por imunofenotipagem através da CF(8).
Na caracterização das DLPC de células B, o painel de AcMo deve distinguir
essas doenças das alterações reativas (não clonais), através da demonstração de
monoclonalidade pela demonstração de um clone com predomínio da expressão de
um único tipo de cadeia leve das imunoglobulinas (kappa ou lambda), na superfície
ou intracitoplasmático(8).
As DPLC e células T são neoplasias de origem pós-timicas caracterizando-se,
portanto, pelo fenótipo “terminal deoxytidyl transferase” (TdT) e CD1a negativos,
aliado a positividade para um ou mais marcadores de linfócitos T(9).
As DLPC de células NK são entidades raras, caracterizando-se pela presença
de linfocitose de linfócitos grandes e granulares (LGL) associados com a expressão
de antígenos relacionados a células NK tidas como o CD16, CD56 e CD57(9).
21
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Células do sistema imune
O sistema imune é o conjunto de células, tecidos, órgãos e moléculas que em
humanos servem para a eliminação de agentes ou moléculas estranhas, inclusive o
câncer, com a finalidade de manter a homeostasia do organismo(10).
Os mecanismos fisiológicos do sistema imune consistem numa resposta
coordenada dessas células e moléculas diante de agentes infecciosos e outros
ativadores, levando ao surgimento de respostas específicas e seletivas (memória
imunológica), podendo também ser induzida através das vacinas. Na ausência de um
sistema imune funcional, infecções leves podem sobrepujar o hospedeiro e levá-lo à
morte. Porém, mesmo com um sistema imune funcional, o homem, por exemplo, pode
adquirir uma doença infecciosa ou um câncer, pois a resposta imune específica, diante
de um agente agressor, leva tempo para se desenvolver e, além disso, tanto
organismos estranhos, como células neoplásicas, desenvolvem mecanismos de
evasão para fugir da resposta imune (11).
As respostas imunes são mediadas por uma variedade de células e por
moléculas que estas expressam. Os leucócitos são as células que desempenham as
principais ações, mas outras células, que se encontram nos tecidos, também
participam da resposta imunitária, enviando sinais e recebendo estímulos dos
leucócitos(11).
As células que participam do sistema imunitário se originam na medula óssea
(MO), onde evoluem para a fase adulta. Nos seus estágios mais precoces, as células
tronco diferenciam-se em duas vias originando células progenitoras linfoides e células
progenitoras mielóides. Posteriormente as células progenitoras perdem a capacidade
de diferenciação, dando origem, cada uma delas, apenas a uma linhagem celular(11).
A partir da medula, e por meio de vasos sanguíneos, elas migram junto com
todos os elementos celulares do sangue. As células da linhagem linfóide darão origem
os linfócitos B, T e células natural killer (NK). As células progenitoras mielóides darão
origem aos, granulócitos, juntamente com as hemácias, que transportam o oxigênio e
as plaquetas que participam da coagulação. As células que derivam do progenitor
mieloide e do progenitor linfoide são as que mais interessam para o entendimento das
22
ações do sistema imunitário, de modo que, nesta revisão, não serão considerados os
megacariócitos e os eritrócitos(12).
A resposta imune é exercida por dois eixos biológicos principais: a imunidade
inata e imunidade adaptativa, esta última exercida por dois eixos biológicos principais:
a imunidade humoral que compreende essencialmente a produção de anticorpos (Ac)
e a imunidade celular desempenhada pelos linfócitos T. Ambos os sistemas
dependem dos linfócitos, quer seja na produção de anticorpos, quer seja na resposta
imune celular. Estas células derivam das células primitivas pluripotentes (células
tronco multipotentes) presentes na medula óssea (MO) que têm a capacidade de auto-
renovação, proliferação e diferenciação (13).
O progenitor mieloide é o precursor dos granulócitos, fagócitos mononucleares
(macrófagos), células dendríticas e mastócitos do sistema imune. Os macrófagos são
as células fagocitárias mais relevantes. Estas células são a forma diferenciada dos
monócitos sanguíneos, que se encontram estrategicamente distribuídos em vários
tecidos para dar origem ao sistema fagocitário mononuclear
Os microgliócitos são os macrófagos do cérebro, as células de Kupffer são os
macrófagos do fígado, os macrófagos alveolares fazem parte do tecido pulmonar,
entre outros macrófagos residentes em diferentes tecidos. As funções dos macrófagos
se caracterizam pela neutralização, ingestão e destruição de partículas, incluindo os
biopatógenos, além de processar e apresentar antígenos para os linfócitos T (14).
Neste contexto, são as células dendríticas as mais especializadas na captura e
na apresentação de antígenos para os linfócitos T. As células dendríticas imaturas
migram do sangue para residirem nos tecidos e realizam tanto a fagocitose quanto a
micropinocitose. Após contato com um patógeno, maturam rapidamente e migram
para os nódulos linfáticos, onde encontram o ambiente adequado para a apresentação
de antígenos aos linfócitos T (15).
Os granulócitos recebem essa denominação por possuírem grânulos em seu
citoplasma que se coram especificamente por corantes hematológicos tradicionais.
São também chamados de leucócitos polimorfonucleares, devido às formas de seus
núcleos. Existem três tipos de granulócitos, sendo eles os neutrófilos, os eosinófilos e
os basófilos; todos com um tempo de vida relativamente curto(12).
23
Os neutrófilos, assim como os macrófagos e as células dendríticas, são
representantes do grupo de células fagocitárias do sistema imunitário inato, mas,
diferentemente destas células, não apresentam antígenos para os linfócitos T(16).
Os neutrófilos são os elementos celulares mais numerosos presentes no SP e
importantes da resposta imune inata. Os eosinófilos são importantes na resposta
contra infecções parasitárias ou processos alérgicos. Os basófilos tem função
provavelmente similar e complementar à dos mastócitos, células cujo precursor
parece ser comum aos basófilos sanguíneos que, devido a semelhanças funcionais,
também se diferenciam ao chegar aos tecidos onde residem. Eles se localizam
principalmente à margem dos vasos sanguíneos e liberam mediadores que agem nas
paredes vasculares quando ativados (16).
2.1.1- Linfócitos
Os linfócitos maduros constituem 20-40% dos glóbulos brancos do sangue
periférico. Circulam continuamente e são capazes de migrar para espaços tissulares
e órgãos linfoides, servindo como ponte entre diferentes estruturas do sistema
imunitário(17).
As populações de linfócitos B, T e células NK são diferentes quanto à sua
função, mas de difícil identificação do ponto de vista morfológico, tornando a
imunofenotipagem por citometria de fluxo um método fundamental para distinção
destas células normais bem como de sua contraparte maligna com nas leucemias e
linfomas. Adicionalmente, a expressão diferencial de determinados marcadores
celulares de diferenciação tem sido utilizada para delinear estágios de diferenciação
e de ativação celular, e identificar distintos subtipos funcionais de linfócitos(17).
Os linfócitos T são células capazes de reconhecer estruturas polipeptídicas
através de um complexo macromolecular CD3/receptor clonal de célula T (CD3/TCR
), enquanto os linfócitos B exercem o reconhecimento através de imunoglobulinas
de superfície celular. Embora as estruturas de reconhecimento das células NK não
sejam totalmente conhecidas, sabe-se que elas expressam proteínas associadas à
linhagem T (CD2 e CD8), e ainda moléculas específicas ou relacionadas como o
CD16, o CD56 e o CD57, além de expressarem moléculas de adesão como o CD11b
e CD11c(18).
24
2.1.1.1. Linfócitos B
Os linfócitos B (LB) se formam na medula óssea circulam, migrando depois para
os órgãos linfóides secundários tornando-se células efetoras após ativação por
antígeno. Durante esta fase do desenvolvimento os LB iniciam o rearranjo da sua
cadeia pesada de Ig (células pró-B), produzem a cadeia pesada (células pré-B),
expressam o receptor de células pré-B na superfície celular (células pré-B tardias),
completam o rearranjo das cadeias leves e expressam IgM de superfície (células B
imaturas) e IgM e IgD na superfície celular (células B maduras), reagem com o
respectivo antígeno (tornando células B ativadas) gerando posteriormente linfócitos B
de memória e células produtoras de anticorpos ou plasmócitos (17).
Os LBs expressam inicialmente o antígeno CD19 que é restrito à linhagem B,
com expressão do HLA-DR e do antígeno CD34. Segue-se então o aparecimento do
antígeno CD10. A expressão do CD10 distingue duas fases no desenvolvimento da
célula B: uma inicial caracterizada por alta densidade de CD10 e uma tardia com baixa
densidade do CD10, perda do CD34 e ganho do antígeno CD20. Nesta segunda fase,
algumas células exibem cadeias “mü” citoplasmáticas (c) significando diferenciação
para o estágio de célula pré-B. As células pré-B são bem caracterizadas por
apresentarem c e ainda não apresentarem imunoglobulinas de superfície (sIg)(17).
O estágio final da diferenciação terminal dos LBs ocorre nos órgãos linfóides
periféricos, sendo caracterizado pela mudança de classe da cadeia pesada das
imunoglobulias, com perda da IgM de superfície e aquisição de outros isotipos, tais
como a IgG, IgE ou IgA, através de um novo rearranjo do gene da imunoglobulina(17).
Os LB maduros são caracterizados pela expressão de novos antígenos restritos
à célula B, como o CD21 e o CD22 que estão presentes em linfócitos em repouso. A
ativação dos linfócitos implica na perda desses antígenos e da IgD, com concomitante
surgimento do antígeno CD23(17).
Durante todo este processo podemos caracterizar estes tipos celulares e
estudar a progressão do desenvolvimento dos LB através da expressão de
marcadores celulares ou antígenos de diferenciação celular (Cluster of diferentiation
ou CD), presentes durante toda a diferenciação, como o CD19, ou específicos de cada
25
estágio de diferenciação, como o CD34, CD10, CD22, CD20, CD21, CD24 e o
complexo CD79a/CD79b dentre outros(17).
Os LB circulantes correspondem entre 10 a 15% dos linfócitos totais circulantes
e caracterizam-se pela expressão do CD19 e CD20, e de cadeias leves kappa () ou
lambda (λ) das imunoglobulinas, nunca as duas, em uma relação к/λ de 3:2 ou seja
60% e 40% para e respectivamente (17)
2.1.1.2. Linfócitos T
Os linfócitos T (LT) correspondem a cerca de 70 a 80% dos linfócitos circulantes
no sangue periférico. No início de seu desenvolvimento as células pre-T saem da
medula óssea numa forma imatura (CD4-/CD8-) e sem o receptor de células T (TCR),
migrando para o timo onde se tornam células T maduras, migrando posteriormente
para os órgãos linfóides secundários. Durante o processo de maturação elas sofrem
proliferação, rearranjo dos genes do TCR para gerar uma grande diversidade de
especificidades antigénicas, e adquirem marcadores de superfície específicos de
células T(18).
Durante a sua maturação no timo essas células passam a expressar uma
molécula de ligação a antígenos(TCR). Posteriormente adquirem outros marcadores
como o CD3 (inicialmente intracitoplasmático), CD1a, CD2, CD5 e CD7. Os estágios
do desenvolvimento das células T podem ser definidos pelo rearranjo e expressão do
TCR e pela expressão de CD4 e CD8 que segue a sequência: CD4-/CD8- ou células
duplamente negativas, CD4+/CD8+ ou células duplamente positivas e finalmente,
células CD4/-CD8- ou CD4-CD8+. Na fase final de diferenciação celular, pode-se
distinguir duas subpopulações funcionalmente distintas de linfócitos T, que se
denominam T-helper (LTh ou TCD4+) e T citotóxicas (LTc ou TCD8+), graças a
presença do antígeno CD4 e ausência de CD8 e vice-versa, respectivamente(18).
A relação normal de células TCD4/TCD8 é de 2:1, podendo ser alterado em
condições patológicas tais como nas infecções por vírus como, por exemplo, nos
indivíduos infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) e na
mononucleose infecciosa, quando ocorre inversão da relação TCD4/TCD8 ou
26
presença de células duplamente positivas podendo estas condições também serem
observadas nas imunodeficiências, doenças auto-imunes e outras patologias,
nomeadamente leucemias e linfomas(18).
2.1.1.3 Células Natural Killer
As células natural killer (termo oriundo do inglês Natural Killer Cell), também
conhecidas como células exterminadoras naturais ou células NK são definidas como
células citotóxicas não específicas que são importantes na resposta precoce às
células tumorais e infecções virais(18).
As células NK são oriundas da medula óssea, que correspondem a 5 a 15%
das células mononucleares do sangue periférico. Possui tamanho ligeiramente maior
que o do linfócito pequeno e presença do citoplasma granular abundante, permitindo
diferenciá-las do linfócito T, sendo comumente denominadas como linfócitos
granulares grandes. Seu citoplasma, bem como o dos linfócitos T citotóxico ou TCD8+,
é caracterizado por conter grânulos contendo substancias citotóxicas (granzimas e
perfurinas) mediadores de mecanismos da lise da célula-alvo(18).
As células NK e os linfócitos T expressam numerosas moléculas de superfície
semelhantes entre si e que exterminam as células infectadas e células neoplásicas
por meio de mecanismos similares. Dois marcadores encontradas na membrana,
CD16 e CD56, são comumente utilizadas para identificação das células NK.
Diferentemente dos linfócitos citotóxicos, as NK não são restritas por proteínas MHC
(exibidas na superfície das células infectadas), são constitutivamente citolíticas e não
desenvolvem memória. Por as células NK serem ativadas precocemente em uma
resposta imune e não requererem sensibilização prévia para o desenvolvimento de
células de memória após a sua ativação, elas são as células citotóxicas da imunidade
inata, em contrapartida ao linfócito T citotóxico da resposta imune adaptativa (18).
2.2 Órgãos Linfoides e a Rede Linfática
Apenas 1% da população total dos linfócitos é encontrada circulando no SP. Na
sua maioria, os linfócitos são encontrados nos chamados órgãos linfoides,
classificados em primários (ou centrais) e secundários (periféricos)(19).
27
Os órgãos linfoides são tecidos organizados que contêm grandes quantidades
de linfócitos em um ambiente de células não linfoides. Nesses órgãos, as interações
que os linfócitos têm com as células não linfóides são importantes, tanto para o
desenvolvimento dos linfócitos e o início da resposta imune adaptativa, como para a
manutenção dos mesmos. Tais órgãos podem ser divididos em órgãos linfoides
centrais ou primários, produtores de linfócitos, e órgãos linfoides periféricos ou
secundários, que desempenham a função de maximizar o encontro entre os linfócitos
e os produtos processados pelas células apresentadoras de antígenos, dando início
à resposta imune(20).
Do ponto de vista funcional, o sistema linfoide pode ser dividido em três
compartimentos: i) O primeiro compreende um reservatório de células não
diferenciadas, denominadas de células tronco multipotentes ou stem cells (SC) que
darão origem às células tronco linfoides (CTL), as quais são capazes de proliferação
e maturação; ii) Um segundo compartimento consiste nos tecidos linfoides centrais ou
primários (MO e Timo) que controlam o desenvolvimento das células linfoides, sendo
focos de intensa linfopoese independente de estímulos antigênicos; iii) O terceiro
compartimento inclui os órgãos linfoides periféricos ou secundários onde se observa
uma população mista de linfócitos B e T(20).
Nos seres humanos, os órgãos linfoides centrais são a medula óssea e o timo,
este último um grande órgão localizado na porção superior do tórax. Tanto os linfócitos
B como as células T surgem na medula óssea, mas apenas os linfócitos B ali se
diferenciam. Os linfócitos T migram para o timo para sofrer seu processo de
diferenciação. Uma vez completada sua maturação celular, os dois tipos de linfócitos
entram na corrente sanguínea, migrando posteriormente para os órgãos linfoides
periféricos(21).
Os órgãos linfóides periféricos são especializados na captura do antígeno
possibilitando o início das respostas imunes adaptativas. Os microrganismos
patogênicos podem penetrar no hospedeiro por muitas portas de entrada, instalando
o processo infeccioso em qualquer sítio, mas o encontro do antígeno com os linfócitos
acontecerá nos órgãos linfóides periféricos: os nódulos linfáticos, o baço e tecidos
linfóides associados às mucosas(21).
Os linfócitos estão em contínua recirculação entre esses tecidos, para os quais
o antígeno também é carreado, vindo de locais procedentes de infecções,
28
primariamente dentro de células apresentadoras de antígenos (CAA) (macrófagos e
células dendriticas dentre outras). Dentro dos órgãos linfoides, células especializadas,
como as CAA, apresentam o antígeno para os LT até então células naives(22).
A rede linfática consiste em um extenso sistema de vasos que coletam o líquido
intersticial, fazendo-o retornar para o sangue. Esse líquido intersticial é produzido
continuamente pela passagem de água e solutos de baixo peso molecular através das
paredes vasculares que penetram no espaço intersticial, pela secreção celular e
outros fatores de excreção. Ao ser parcialmente drenado para os vasos linfáticos,
passa a ser chamado de linfa. A linfa flui lentamente pelos vasos linfáticos primários,
deságua em vasos linfáticos de calibre progressivamente maior, que convergem para
o ducto torácico, e desemboca na veia cava superior que, por sua vez, devolve todo
o volume para a corrente sanguínea, num fenômeno denominado recirculação(21).
Localizados em pontos de convergência da rede vascular, encontram-se os
nódulos linfáticos (linfonodos) constituídos de uma série de órgãos encapsulados em
forma de caroço de feijão, que se distribuem ao longo dos vasos linfáticos. Os vasos
linfáticos aferentes drenam o fluido dos tecidos e carrega antígenos e células
infectadas aos seios dos nódulos linfáticos, onde os antígenos são capturados. Os
seios são revestidos por orifícios minúsculos, que permitem a linfa e seu conteúdo
atravessarem o nódulo linfático e entrarem em contato com os linfócitos(23)
Nos nódulos linfáticos os linfócitos B e T estão situados em regiões distintas.
As células B encontra-se principalmente nos folículos presentes na área cortical. Os
linfócitos B localizam-se em folículos e nas áreas corticais, os linfócitos T encontram-
se mais difusamente distribuídas em torno das áreas paracorticais, também
conhecidas como zonas de células T ou áreas T-dependentes. Alguns folículos
contêm áreas centrais chamadas de centros germinativos, os quais coram-se
levemente com corantes histológicos. Os folículos sem centros germinativos,
chamados de folículos primários, contêm principalmente linfócitos B maduros "naives".
Os foliculos com centros germinativos (folículos secundários), isto é, que estão
ativados, surgem após estimulação antigênica mediados pelas células T auxiliares,
constituindo locais de proliferação e seleção de células B que produzem anticorpos de
alta afinidade e geração de células B de memória. A formação do centro germinativo
desloca as células originais do folículo primário para a periferia, que passam então a
constituir a “zona do manto” do folículo secundário(23).
29
Cada centro germinativo consiste de uma zona escura repleta de células B que
proliferam, chamadas de centroblastos, e uma zona leve que contém células
chamadas de centrócitos, os quais pararam de proliferar e estão sendo selecionados
para sobreviver e diferenciar ainda mais (13). Por fim, a linfa sai por um vaso linfático
eferente no lado oposto do nódulo linfático, numa região conhecida como hilo(24).
O baço encontra-se situado atrás do estômago e filtra o sangue da mesma
forma como os nódulos linfáticos filtram a linfa e coletam antígenos. Também captura
e se desfaz de células vermelhas senescentes. A massa principal deste órgão é
composta pela polpa vermelha e os linfócitos circundam as arteríolas que o penetram,
formando áreas da polpa branca, cuja região mais interna é dividida em uma camada
linfoide periarteriolar, contendo principalmente células T e revestidas por uma coroa
de células B(25).
A expressão tecido linfoide associado à mucosa (MALT) do termo em inglês
“mucosal associated lymphoid tissue” é uma descrição geral para os tecidos linfoides
não encapsulados, que existem nas regiões subjacentes às mucosas. Os MALTs se
distribuem anatomicamente e seus componentes individuais incluem: i) O anel de
Waldeyer - Anel de estruturas linfoides que circunda a faringe, sendo formado pelas
tonsilas e adenoides, ii) Tecido linfoide associado aos brônquios (BALT) do termo em
inglês bronchial-associated lymphoid tissue constituído por agregados linfocitários
semelhantes, mas organizados difusamente, que protegem o epitélio respiratório, iii)
Tecidos linfoides associados ao intestino (GALT) do termo em inglês “gut-associated
lymphoid tissues” os quais Incluem os folículos linfoides isolados e o apêndice cecal,
além de estruturas especializadas do intestino delgado, as placas de Peyer e tecido
linfático urogenital(26).
A diferenciação dos linfócitos B e T seguem três diferentes estágios: o primeiro
estágio ocorre na MO quando as SC, dependendo de estímulos, se diferenciam em
célula tronco linfoide (CTL), que é um precursor comum dos linfócitos B, T e células
NK, e em células progenitoras mielóides ou Unidade Formadora de Colônia de
Granulócitos, Eritrocitos, Monócitos e Megacariocitos ou CFU-GEMM do termo em
inglês “Colony-Forming Unit-Granulocyte, Erythrocyte, Monocyte/macrophage,
Megakaryocyte(23)”.
Na segunda fase, algumas das CTL migram para o timo onde, sob influência
do microambiente , se diferenciam em LT. Os precursores linfoides que permanecem
30
na MO sofrem diferenciação que culminará com a formação dos LB. O terceiro e último
estágio corresponde à aquisição de imunocompetência o que ocorre a nível dos
órgãos linfóides secundários(23).
2.3 Linfocitose x Linfopenia
A linfocitose corresponde a um número aumentado de linfócitos circulantes,
superior a 4.000/ µL.. na maioria dos laboratórios clínicos; enquanto a linfocitopenia
refere-se à diminuição dos linfócitos no SP que, geralmente, corresponde a menos de
1.000 linfócitos/µL em adultos. Assim, para a contagem de glóbulos brancos em
adultos, o intervalo normal (ou seja, dois desvios padrão acima e abaixo da média) é
de 4.400 a 11.000 células/µL na maioria dos laboratórios clínicos. Os linfócitos,
geralmente, constituem de 8% a 33% dos glóbulos vermelhos no SP(27).
Os mecanismos da indução de uma linfocitose pode ser causada pelo aumento
da produção, redistribuição (da MO e/ou órgãos linfóides secundários) e/ou diminuição
da morte celular. As várias causas de linfocitose diferem-se na contribuição de cada
um desses mecanismos (27).
O aumento da produção de linfócitos pode ser devido a um processo maligno
ou em resposta a um estímulo infeccioso ou inflamatório. A linfocitose maligna
envolvendo a expansão de um clone de células relacionadas, ao passo em que os
processos reativos, geralmente, refletem a expansão policlonal de vários clones de
linfócitos (resposta policlonal). Os processos reativos podem levar à expansão de um
ou mais subconjuntos de linfócitos (a exemplo de células T, células B e/ou células
NK)(27).
Dentre as causas mais comuns de linfocitose reativas destacam-se: i)
Linfocitose fisiológica da infância (do nascimento até aos 2 anos); ii) Infecções
especialmente virais tais como rubéola, varicela, influenza, e todas as doenças
exantemáticas da infância além do vírus Epstein-Barr, vírus Coxsackie, adenivírus,
toxoplasmose, citomegalovírus, ou infecções como brucelose, tuberculose, sífilis
secundária, vírus linfotropico de células T-humana (HTLV) e infecções por Rickettsias;
iii). Situações diversas, como alergias medicamentosas, doença do soro, após
esplenectomia, doença de Addison, hipopituitarismo, hipertiroidismo e em fumantes
crônicos, dente outra.(27).
31
As causas da linfocitose clonal existem em um espectro e variam de distúrbios
pré-malignos os quais podem evoluir para doenças malignas abertas em uma
variedade de linfomas e leucemias tais como as doenças linfoprolifertivas crônicas
(DLPC) a LLCB e os linfomas não-Hodgkin leucemizados (LNHL) dentre outras(27).
A urgência da avaliação da natureza de uma linfocitose é orientada pela
condição clínica do paciente, o grau e a taxa de aumento da linfocitose (se conhecida),
bem como achados preocupantes (por exemplo, explosões leucêmicas) no esfregaço
sanguíneo com presença de formas atipicas. Embora toda linfocitose maligna seja
clonal, nem todas as expansões clonais são malignas. Algumas causas infecciosas
ou inflamatórias da linfocitose podem estar associadas à expansão oligoclonal de
linfócitos(27).
Distinguir os processos clonais dos policlonais, muitas vezes, é um passo
importante na determinação da causa da linfocitose. A clonalidade não pode ser
determinada pela avaliação inicial (história, exame físico ou hemograma completo).
Nestes casos as técnicas de imunofenotipagem como a citometria de fluxo é a técnica
inicial preferida para definir a clonalidade. Figura 1 (27).
No entanto, a citometria de fluxo não deve ser realizada em todos os pacientes
com linfocitose. Assim, a decisão da realização da citometria de fluxo e a urgência do
teste são determinadas pelo estado clínico do paciente, o nível de linfocitose e sua
evolução (se conhecida), achados preocupantes em esfregaço sanguíneo (atipias
linfocitárias, plaquetopenia e alterações citomorfologicas dos eritrócitos dente outras)
e a preocupação do clínico e/ou do paciente(27).
Em geral, a citometria de fluxo do sangue periférico é o teste inicial preferido
para a determinação da clonalidade no paciente com linfocitose. Comparada com
outras técnicas especializadas (por exemplo: análise cromossômica e testes
moleculares/genéticos), a citometria de fluxo fornece resultados mais rápidos e
econômicos. Esta técnica pode definir clonalidade e determinar a linhagem e o
imunofenótipo dos linfócitos(27).
32
Figura 1 – Fluxo do paciente com Linfocitose
2.4 Doenças Linfoproliferativas Crônicas
2.4.1. Considerações gerais
As Doenças Linfoproliferativas Crônicas (DLPC) constituem um grupo
heterogêneo de doenças neoplásicas que, em comum, têm a sua origem a partir de
células linfóides maduras (periféricas), as quais podem estar presentes na MO ou SP,
podendo também se infiltrar em outros órgãos, como pele e órgãos linfóides
secundários, linfonodos e baço, dentre outros (28).
Apesar de, na denominação “Doenças Linfoproliferativas”, enquadrarem-se
todas as proliferações linfoides, na prática clínica, este termo encontra-se restrito a
um grupo heterogêneo de neoplasias linfóides caracterizadas por um acúmulo de
linfócitos B, T e NK de aparência madura e função anormal no SP. Essas entidades
são classificadas conforme as características morfológicas, imunofenotípicas e
citogenéticas, com alterações moleculares específicas (29).
As DLPC podem também cursar com adenopatias e hepato-esplenomegalia.
Mas, em algumas destas patologias, a expressão da doença se dá através da
linfocitose, consequência da fase de leucemização dessas neoplasias (29).
33
2.4.2. Classificação
Devido à complexidade considerável do sistema imune, não é surpreendente
que os tumores originários desses tecidos sejam numerosos e complexos. Por
conseguinte, a classificação dessas doenças tenta identificar as origens de células de
tumores e sua maturidade aparente. Os primeiros sistemas de classificação
basearam-se na arquitetura dos tecidos e nas aparências citológicas das células
neoplásicas. Para algumas entidades, as características morfológicas são muitas
vezes suficientes para estabelecer o diagnóstico. No entanto, com o desenvolvimento
e aplicação da imunofenotipagem, testes genéticos e moleculares, reconheceu-se a
existência de muitas entidades distintas, que não podiam ser distinguidas de forma
confiável apenas pela morfologia (30).
A classificação dos cânceres linfóides proposta pela Organização Mundial de
Saúde (OMS) foi concebida através de um consenso entre líderes internacionais em
hematopatologia e oncologia clínica, levando em consideração as informações
morfológicas, clínicas, imunológicas e genéticas para dividir os linfomas não-Hodgkin
(LNH) e outros cânceres linfóides em entidades clínicas/patológicas que tenham
relevância clínica e terapêutica(28).
A classificação da OMS foi publicada em 2008 e atualizada em 2016.
Fundamenta-se também em critérios morfológicos e imunohistoquímicos bem
definidos, comprovadamente associados à elevada concordância inter-observadores,
havendo também forte fundamentação biológica, incluindo-se as mais atuais
evidências da genética molecular. Esse sistema é apresentado na Tabela 1.
De forma geral e de acordo com a OMS, os diferentes tumores hematológicos
foram agrupados em: Neoplasias mielóides, derivadas das células progenitoras da
MO que, normalmente, desenvolvem-se em eritrócitos, granulócitos, monócitos e
megacariócitos; Neoplasias histiocíticas/dendríticas, derivadas de células
apresentadoras de antígeno; Neoplasias linfóides, derivadas de forma variável de
progenitores de células B (derivadas da MO), progenitores de células T (derivados do
timo), linfócitos T maduro (células T citotóxicas, células T auxiliares ou células T
reguladoras) ou linfócitos B maduros (células B ou células plasmáticas)(28).
34
Ainda nesta perspectiva, há as neoplasias que mostram as evidências de
diferenciação mielóide e linfóide, presumivelmente, porque são derivadas de células
progenitoras multipotentes (28).
As neoplasias linfóides T maduras e NK compreendem: Linfomas de Células T
Periférico; Linfoma Anaplásico de Grande Células (LAGC); Linfoma de Células T
Periféricas Cutâneas Primárias; Linfoma de Células T do Adulto; Leucemia de
Grandes Linfócitos Granulares (LGLG); Leucemia Prolinfocítica T e Leucemia de
Células NK (28).
Embora essa classificação seja apoiada por uma abordagem multiparamétrica
ao diagnóstico, com identificação citomorfológica, imunofenotipagem e características
genotípicas de cada entidade, não é necessária nem rentável a execução de múltiplos
estudos em cada caso diagnosticado (31).
Diversos autores têm sugerido a utilização da imunofenotipagem por citometria
de fluxo, aliada à citologia convencional, como método rápido e não invasivo de
diagnóstico alternativo dessas neoplasias (31).
Trata-se de um método mais preciso, baseado na expressão de antígenos de
diferenciação celular (marcadores de células) identificados através de um painel de
anticorpos monoclonais (AcMo), os quais determinarão a fase em que está o processo
de maturação dos linfócitos B e T/NK (31).
Alguns desses marcadores são considerados críticos e, portanto, suficientes
para determinar a linhagem. No entanto, um painel mais extenso de AcMo pode
proporcionar informações mais detalhadas sobre o processo leucêmico, podendo
também avaliar a expressão de antígenos de valor prognóstico e determinação da
clonalidade, além de também poder ser usado na avaliação da doença residual
mínima (DRM) durante a terapia(32).
35
Tabela 1 - Classificação da OMS para as neoplasias do tecido linfóide.(5)
Neoplasias de Células B Neoplasias de Células T e Natural Killer (NK)
Neoplasias de Células B Precursoras Neoplasias de Células T Precursoras
Linfoma e Leucemia Linfoblástica de Células B
Precursoras
Linfoma e Leucemia Linfoblástica de Células T
Precursoras
Neoplasias de Células B Maduras (periféricas) Neoplasias de Células T Maduras (periféricas) e de
Células NK
Leucemia Linfocítica Crônica e Linfoma
Linfocítico de Pequenas Células B
Leucemia Prolinfocítica de Células T
Leucemia Prolinfocítica de Células B Leucemia Linfocítica granular de Células T
Linfoma Linfoplasmocítico Leucemia de Células NK agressivo
Linfoma de Células B de Zona Marginal Esplênico
(± linfócitos vilosos)
Leucemia ou Linfoma de Células T Adultas (HTLV
I)
Leucemia de Células Cabeludas Linfoma Extranodal de Células T e NK, tipo nasal
Mieloma de Células Plasmáticas ou
Plasmocitoma
Linfoma de Células T, tipo enteropatia
Linfoma de Células B de Zona Marginal
Extranodal associado à Mucosas (MALT)
Linfoma de Células T hepatoesplênico
Linfoma de Células B de Zona Marginal Nodal Linfoma Subcutâneo de Células T, do tipo
peniculite
Linfoma Folicular Micose Fungóide e Síndrome Sézary
Linfoma de Células do Manto Linfoma Cutâneo Primário de Grandes Células
Anaplásicas
Linfoma Difuso de Grandes Células B Linfoma de Células T periféricas, não especificado
Linfoma Mediastinal de Grandes Células B Linfoma de Células T angioimunoblástico
Linfoma Primário de Efusão Linfoma Sistêmico primário de Grandes Células
Anaplásicas
Linfoma Intravascular de Grandes Células B Neoplasias de Células de linhagem T e Estágio de
Diferenciação Incertos
Linfoma de Burkitt ou Leucemia de Células de
Burkitt
Linfoma de Células NK blásticas
Neoplasias de Células B de Potencial Maligno
Incerto
Neoplasias de Células T de Potencial Maligno
Incerto
Granulomatose Linfomatóide Desordem Proliferativa Cutânea CD30+ (papulose
linfomatóide)
Doença Linfoproliferativa Pós-Transplante
(polimorfa)
36
2.4.3 Importância da Imunofenotipagem por citometria de fluxo no
diagnóstico e classificação das Doenças Linfoproliferativas Crônicas
A imunofenotipagem por citometria de fluxo (ICF) é um processo de
análise multiparamétrica por meio do qual as características físicas e/ou
químicas das células são medidas enquanto circulam numa corrente líquida,
alinhadas uma a uma, em frente a um laser. O impacto do laser em cada célula
produz sinais que representam diferentes parâmetros da célula e, depois, são
recolhidos por detectores responsáveis por converterem os sinais recebidos em
sinais eletrônicos a serem digitalizados e armazenados em suporte informático
Figura 2 (33).
Para isso, os citômetros dispõem de um sistema hidráulico para a
circulação do fluxo contínuo monocelular, de um sistema de luz laser que incide
sobre as células, de um sistema óptico e eletrônico que recolhe a luz dispersada
e de um sistema informático para processar os dados(33).
Apesar de a ICF ser uma técnica utilizada em vários autoanalizadores
hematológicos, o termo restringe-se aos aparelhos que lêem e interpretam
reações nas quais intervêm substâncias fluorescentes(33).
Figura 2 – Citometria de fluxo
37
Os parâmetros medidos podem ser relacionados às características
intrínsecas da célula, como tamanho e complexidade do núcleo e citoplasma, os
quais são baseados em sinais de dispersão, ou parâmetros relacionados às
propriedades antigênicas da célula, baseadas em sinais de fluorescência (31)
Os sinais de dispersão resultam da interação física da luz monocromática
com uma partícula, como uma célula que produz uma mudança na direção da
luz, em todas as direções. As características morfológicas fornecidas são o
tamanho celular, características da membrana, do núcleo e do material granular
no interior da célula (31).
Os sinais de fluorescência devem-se aos fluorocromos. O complexo
antígeno-anticorpo é marcado por um fluorocromo que emite luz a determinado
comprimento de onda quando excitado pela luz do laser (31).
Entre as várias aplicações da Citometria de Fluxo (CF), encontra-se a
imunofenotipagem leucocitária, ou seja, a identificação de populações e
subpopulações de leucócitos, particularmente de linfócitos, tendo como base a
expressão de antígenos de membrana (34).
A ICF é uma técnica importante no diagnóstico e caracterização de
neoplasias hematológicas. Ela permite a identificação de células com
imunofenótipo aberrante, tornando-se uma ferramenta diagnóstica precisa
mesmo na ausência de sintomatologia clínica (34).
A análise multiparamétrica, através da citometria de fluxo, é um método
rápido, objetivo e quantitativo para determinação da linhagem celular (B, T e NK),
caracterização do estádio maturativo das células no diagnóstico diferencial entre
linfocitose reacional e proliferação monoclonal de células B, além de
caracterização da heterogeneidade e dos aspectos aberrantes de células
malignas, permitindo o monitoramento da terapia e detecção de doença residual
mínima. Também, através da CF, podem ser identificados marcadores
prognósticos, como a análise de ZAP-70, CD38, CD49d, dentre outros (33).
Cerca de 80% a 85% das DLPC são de linhagem B, ou seja, ocorrem a
transformação maligna e expansão de um único clone de linfócitos B, originando
as DLPC de células B, nas quais se destacam a Leucemia Linfocítica Crônica de
Células B (LLC-B); a Leucemia Prolinfocítica de Linfócitos B (LPL-B); a
38
Tricoleucemia ou "Hairy Cell Leukemia" (HCL) e os linfomas linfocíticos de baixo
grau em fase leucêmica, como o Linfoma de Células do Manto (LCM), o Linfoma
Folicular (LF), o Linfoma Esplênico de Linfócitos Vilosos (LELV) e o Linfoma
Linfoplasmocitóide ou Macroglobulinemia de Waldestrom (MW); podendo
também ser incluídas neste grupo as discrasias de células plasmáticas, como o
Mieloma Múltiplo (MM) e a sua forma leucêmica ou Leucemia de Células
Plasmáticas (LCP)(35).
Na caracterização das neoplasias da linhagem B, por maior frequência,
melhor conhecimento dos fenótipos anormais e maior disponibilidade de
marcadores, a CF é amplamente utilizada. Nas neoplasias de células T, em
contraste com as B, ainda é difícil identificar fenótipos aberrantes sendo,
portanto, muitas neoplasias categorizadas como linfomas T não
especificado(35).
No entanto, quando utilizada em conjunto com outras informações
clínicas, análises citomorfológicas, colorações citoquímicas, imuno-
histoquímicas, análises moleculares e citogenéticas, a ICF pode auxiliar na
conclusão do diagnóstico (36).
As DLPC de linhagem B podem ser confirmadas por duas evidências que
caracterizam a presença de células neoplásicas desta linhagem: i) Presença de
monoclonalidade para as cadeias leves da imunoglobulina de superfície (Igs). As
DLP de linhagem B, habitualmente, apresentam um único clone derivado de uma
célula com expressão de um único tipo de imunoglobulina, evidenciando pela
superexpressão de um único tipo de cadeia leve, ou κ ou λ, em contraste com o
padrão policlonal dos casos de linfocitose reacional que apresentam uma relação
к/λ normal. ii) Expressão de fenótipos aberrantes relacionados a doenças
específicas, tais como expressão aberrante do antígeno T CD5 na LLC-B. Figura
3 (34,37).
As DLPC de células T são menos frequentes que as DLPC-B e,
frequentemente, podem ser identificadas por ICF. As neoplasias pós-tímicas
caracterizam-se pelo fenótipo “terminal deoxytidyl transferase” (TdT) e CD1a
negativos, aliadas à positividade para um ou mais marcadores de células T
39
.Adicionalmente, a presença de fenótipo aberrante nas células T neoplásicas
deve ser distinguida da variação imunofenotípica normal, observada em
linfocitoses de células T não neoplásicas, tal como nas infecções virais (38).
Figura 3 – Algoritmo do diagnóstico das neoplasias de células B
As DPLC de células NK são raras e apresentam características clínicas e
biológicas mal definidas, caracterizando-se pela expressão de antígenos
relacionados a células NK, tais como CD16, CD56, CD57 e CD8, além de
antigenos compartilhados com os linfócitos T: CD2, CD8, granzimas e perfurinas,
dentre outros (34,39).
As tabelas 2 e 3 mostram resumidamente a classificação das DLPC de
linfócitos B, T e células NK, de acordo com o padrão de imunofenotipagem obtido
pela CF.
40
Tabela 2 - Classificação das Doenças Linfoproliferativas Crônicas
DOENÇAS LINFOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS DE CÉLULAS B
1) Leucemias Primárias
Leucemia Linfóide Crônica (LLC)
Leucemia Prolinfocítica (LPL)
Leucemia de Células Vilosas (LCV) ou “Hairy Cell Leukemia” (HCL)
Leucemia de Células Vilosas, forma variante (LCPv)
2) Linfomas Não Hodgkin em Fase Leucêmica (LNHL)
Linfoma Folicular (LF)
Linfoma de Células do Manto (LCM)
Linfoma Esplênico com Linfócitos Vilosos (LELV)
Linfoma Linfoplasmocitóide ou Macroglobulinemia de Waldenström (MW)
Linfoma de Burkitt (LB)
3) Mieloma Múltiplo (MM)
Leucemia de Células Plasmáticas (LCP)
DOENÇAS LINFOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS DE CÉLULAS T e NK
1) Leucemias Primárias
Leucemia de Linfócitos Grandes e Granulares (LLGG): Células T e NK
Leucemia Prolinfocítica (LPL)
2) Linfomas Não Hodgkin em Fase Leucêmica (LNHL)
Leucemia de Células T do Adulto (LCTA) ou “Adult T Cell Leukemia” (ATLL)
Micose Fungoide /Síndrome de Sézary (MF/SS)
Linfoma de Células T Periférico (LCTP)
Baseado em: Ruiz-Argüelles, GJ. & San-Miguel, JF. (29).
41
Tabela 3 - Características imunológicas das Doenças Linfoproliferativas Crônicas.
Antígenos
Células – B Células T – NK
LLC LPL LCV LLC LPL LECV LLC LPL LGC LPL LCTA SS LCTP
Antígenos de Células B
sIg + + + + + + + + (cyt) - - - - -
CD10 - - - + - - - - - - - - -
CD19 + + + - + + + - - - - - -
CD20 + + + + + + + - - - - - -
CD21 + + + - + + + - - - - - -
CD22 + + + + + + + - - - - - -
CD23 + + + + - ? + - - - - - -
CD79b -/+ + + + + + + - - - - - -
CD52 + + + - + + + - - - - - -
CD103 - - +/- - - - - - - - - - -
CD138 - - - - - - - + - - - - -
CD200 + + + + + + + - - - - - -
FMC7 -/+ + + + + + + - - - - - -
Antígenos de células T e NK
CD2 - - - - - - - - + + + + +
CD3 - - - - - - - - +(T) + + + +
CD4 - - - - - - - - -/+ + + + +/-
CD5 + -/+ - - + - - - +(T) + + + +
CD7 - - - - - - - - +(T) + -/+ - -/+
CD8 - - - - - - - - +/- +/- - - -
CD16-56 - - - - - - - +/- +(NK) - - - -
TCR - - - - - - - - -/+ + + + +
TCR - - - - - - - - +/- + + + +
TCL-1
(cyt) - - - - - - - - +/- +/- +/- +/- +/-
Granzime - - - - - - - - + +/- - - -
Perfurine - - - - - - - - + +/- - - -
Outros
Ciclina-D1 - - - - + - - - - - - - -
HLA-Dr + + + + + + + - - - + - -
CD11c - - + -/+ - -/+ - - - - - - -
CD25 -/+ - + - - - + - -/+ - + - -
CD38 -/+ - + - - - +/- + +/- - + - -
CD45 + + + + + + + - + + + + +
Nota: (sIg) Imunogl. de superfície; (TCR ϒ/δ) Receptor de cél. T gama/delta; (TCR α/β) Receptor de cél. T alfa/beta; (TCL1) Proteína 1A das células T de leucemia/Linfoma; (HLA-Dr) Receptor de Superfície MHC classe II; (-) ausência de antigêno; (+) presença de antigeno; (-/+) antígeno presente em menos de 50% dos pacientes; (+/-) antígeno presente em mais de 50% dos pacientes; () expressão antigênica forte; () expressão antigênica fraca; (cyt) presente no citoplasma; (T) Positivo em neoplasias T; (?) desconhecido; (LLC) Leuc. Linfoc. Crônica; (LPL) Leuc. Prolinfocítica; (LCV) Leuc. de Células Vilosas; (LF) Linfoma Folicular; (LCM) Linfoma do Manto; (LECV) Linfoma Esplênico de Células Vilosas; (MW) ; (LCP) Leuc. de Cél. Plasmáticas; (LGLG) Leuc. de Grandes Linfóc. ; (LTA) Leuc.de Cél. T do Adl.; (SS) Síndrome Sézary; (LTP) Linfoma de Células T Periférico. Adaptado de Ruiz-Argüelles, GJ. & San-Miguel, JF (29).
42
2.4.4. Doenças Linfoproliferativas Crônicas de Células B
2.4.4.1. Leucemia Linfocítica Crônica (LLC)
A Leucemia Linfocítica Crônica (LLC) é a mais prevalente malignidade
hematológica no ocidente, caracterizada pelo acúmulo anormal de linfócitos
imuno-incompetentes(40)
É uma doença de adultos, ocorrendo em populações maiores que 35
anos. Estima-se que ocorram aproximadamente 15.100 novos casos por ano nos
EUA, com uma prevalência de 140.000 casos(41)
Representa de 22% a 30% de todos os casos de leucemia, com uma
incidência global projetada para algo entre <1 e 5,5 por 100.000 pessoas ao ano.
Países como a Austrália, Estados Unidos da América (EUA), Irlanda e Itália têm
as maiores taxas de incidência mundial, e a idade média do diagnóstico é em
torno de 72 anos, com predomínio do sexo masculino na proporção de 2:1. Cerca
de 5% a 10% dos casos, ocorrem entre familiares (42)
Houve uma crença geral de ser uma doença indolente, associada a um
curso clínico prolongado, ou seja, de 10 a 20 anos, cuja eventual causa de morte
pode não estar relacionada à LLC. No entanto, esta observação é verdadeira
para menos de 30% dos pacientes(42).
Alguns pacientes, rapidamente, morrem de complicações ou causas
ligadas diretamente à LLC, dentro de 2 a 3 anos, após o diagnóstico. Outros
pacientes vivem de 5 a 10 anos com um curso inicial relativamente benigno,
seguido de uma fase terminal de 1 a 2 anos. Durante esta fase, há uma
morbidade considerável tanto da própria doença quanto de complicações da
terapia(42) .
Durante a fase assintomática, os pacientes são capazes de manter o estilo
de vida habitual. Mas, durante a fase terminal, o status de desempenho é fraco,
com necessidades recorrentes de hospitalização. As causas mais frequentes de
mortes são infecções sistêmicas graves, sangramentos ou caquexia (43)
Várias propostas têm sido sugeridas para a origem celular da LLC e,
embora não haja consenso de qual seja seu correspondente celular anormal,
43
atualmente, o perfil de expressão gênica e de fenótipos de superfície de
membrana são identificados nas células patológicas, não sendo claro se a célula
oriunda da LLC tem um precursor único ou múltiplos, nem o estágio em que as
células normais evoluem para LLC (44).
A teoria mais aceita é a de que clones celulares com a cadeia pesada de
região variável de imunoglobulina (IGVH) mutada não derivam de células B da
zona marginal e têm um precursor simples, mas ainda faltam algumas peças
nesse quebra-cabeça (45,46).
O quadro clínico da LLC pode ser bastante variado, porém tem se
observado que o diagnóstico em pacientes assintomáticos dobrou nos últimos
anos, atingindo uma média entre 40% e 60% das pessoas. Isto se deve ao fato
de exames sanguíneos de triagem serem realizados com maior frequência,
assim como pela melhora nos métodos diagnósticos. Inclusive, há evidências de
predisposição genética, e parentes de primeiro grau têm um risco 7 vezes maior
de apresentarem a doença ou outra doença linfoproliferativa (40).
O envelhecimento está associado à maioria das mudanças na imunidade
humoral, incluindo diminuição do repertório de anticorpos e aumento da
frequência de população de células B oligoclonal (44,47).
Por isso, indivíduos com idade superior a 60 anos ou mais, algo em torno
de 5%, apresentam população de células B monoclonal detectada pela CF. Esta
condição, chamada de linfocitose B monoclonal, sendo considerada um passo
inicial para o surgimento da Leucemia Linfocítica Crônica (49).
O achado anormal mais comum no exame físico do doente com LLC é a
linfadenopatia, presente em 50% a 90% dos pacientes. O alargamento dos
linfonodos pode ser generalizado ou localizado, e os gânglios linfáticos
individuais podem variar muito em tamanho. Os sítios mais comumente afetados
são cervical, supraclavicular e axilar. Caracteristicamente, os linfonodos
aumentados na LLC são firmes, arredondados, discretos e, livremente, móveis à
palpação. Exceções a essas generalizações são encontradas especialmente
quando crescem rapidamente (40)
O baço é o segundo órgão linfóide mais frequentemente aumentado,
sendo palpável em 25% a 55% dos casos. Assim como no caso dos gânglios
44
linfáticos alargados, um baço alargado na LLC é geralmente indolor e não
palpado, uma superfície firme e lisa. O alargamento esplênico doloroso e o
infarto são características de apresentação. O aumento do fígado pode ser
observado no momento do diagnóstico inicial em 15 a 25% dos casos(50).
A infiltração com células da LLC pode ocorrer em qualquer órgão. Mas,
no momento do diagnóstico, a pele (leucemia cutis) é o órgão não linfático mais
comumente envolvido. Essas lesões, geralmente, envolvem o rosto e podem se
manifestar como máculas, pápulas, placas, nódulos e úlceras. Praticamente
qualquer tecido linfóide pode estar aumentado no diagnóstico, incluindo o anel
de Waldeyer na faringe(50).
Em contraste com outros linfomas, o envolvimento mucosal
gastrointestinal clinicamente relevante, raramente, é observado na LLC. Da
mesma forma, a leucemia meníngea é incomum no momento da apresentação
inicial (51).
A anormalidade laboratorial mais notável encontrada na LLC é a
linfocitose no SP e na MO. Embora o limiar absoluto de linfócitos sanguíneos
para o diagnóstico de LLC tenha sido colocado em > 5000/L linfócitos B, uma
proporção significativa de pacientes apresentam contagens elevadas (>
100.000/L (50,52).
A neutropenia, anemia e trombocitopenia podem ser observadas no
momento do diagnóstico inicial e, geralmente, não são graves. Estes sinais
podem ser relacionados à anemia hemolítica autoimune, aplasia de eritrócitos
puros, trombocitopenia autoimune ou agranulocitose (51).
Pacientes com LLC apresentam maior incidência de anemia hemolítica
autoimune (AHAI).O teste direto de Coombs, ou prova da antiglobulina humana,
pode ser positivo em algum momento durante o curso da doença em até 35%
dos casos (51).
A trombocitopenia (auto) imune é sugerida quando uma biópsia da MO
mostra um número adequado de megacariócitos, mas o SP possui uma
contagem plaquetária anormalmente baixa. Esta complicação ocorre em 2% a
3% dos pacientes com LLC e pode ser o evento que, inicialmente, leva o paciente
à atenção médica (53,54)
45
Raramente, a agranulocitose pode ser encontrada na LLC
(aproximadamente 0,5%). A hipogamaglobulinemia está presente em
aproximadamente 8% dos pacientes no momento do diagnóstico inicial e pode
desenvolver-se em até dois terços dos pacientes no decurso da doença
(52,55,56).
Normalmente, as três classes de imunoglobulina (IgG, IgA e IgM) estão
diminuídas. Mas, em alguns pacientes, apenas uma ou duas podem estar baixas.
Graus significativos de hipogamaglobulinemia e neutropenia, quando presentes,
resultam em maior vulnerabilidade dos pacientes com LLC para grandes
infecções bacterianas. Aumentos policlonais nas gamaglobulinas podem ser
vistos em até 15% dos pacientes, enquanto uma proteína monoclonal está
presente em até 5% destes (55,56).
O esfregaço de SP de pacientes com LLC demonstra uma linfocitose. As
células leucêmicas são tipicamente pequenos linfócitos aparentemente
maduros, com núcleo denso, cromatina parcialmente agregada ("clump") e sem
nucléolos discerníveis. Há uma borda estreita de citoplasma claro a,
ligeiramente, basofílico(57).
Além disso, uma proporção de células pode ser composta por linfócitos
maiores, com núcleos grandes, cromatina nuclear com aparência de frouxa e
nucléolos proeminentes e visíveis. Estas células, com morfologia de
"prolinfócitos", geralmente, representam uma minoria da população global de
linfócitos, mas podem compreender até 55%. O esfregaço também contém
frequentemente restos celulares, isto é, linfócitos que parecem ter sido rompidos
no processo de propagação na lâmina de vidro (58).
A análise imunofenotípica por CF é um componente chave para o
diagnóstico de LLC. Existem três principais achados imunofenotípicos
característicos: i) Expressão de antígenos associados a células B, incluindo
CD19, CD20 e CD23. A expressão de CD20, geralmente, é fraca; enquanto a
expressão de CD21 e CD24 podem ser vista, mas não é necessária para o
diagnóstico. ii) Expressão de CD5, antígeno comumente expresso por células T;
e iii) Baixos níveis de expressão antigênica imunoglobulina da membrana (sIgG)
(52,59).
46
As imunoglobulinas mais frequentes é a IgM e/ou IgD, com predomínio de
um único tipo de cadeia leve (kappa ou lambda), confirmando a natureza clonal
da proliferação celular, podendo em alguns casos raros haver existência de mais
de um clone com expressão de cadeias leves distintas
Além disso, na maioria das vezes, as células leucêmicas da LLC são
negativas para ciclina D1, CD10, FMC7,CD79b, sendo o CD22 comumente
negativo ou fracamente expressos (52)
A grande maioria dos casos demonstra por CF um único clone de linfócitos
B circulantes anormais. Raramente, identifica-se a doença como biclonal. Em
grande estudo, estimou-se que, quando ocorre a biclonalidade, ela representa
1,4% dos casos (60).
O aspirado e a biópsia da MO não são necessários para o diagnóstico de
LLC. Se a biópsia e a aspiração da MO são realizadas no momento do
diagnóstico inicial, geralmente, demonstram contagem celular aumentada, com
linfócitos representando mais de 30% de todas as células nucleadas (60).
Além de uma porcentagem aumentada de linfócitos que aparecem
maduros nos esfregaços do aspirado da MO, existem três tipos principais de
padrões infiltrativos de linfócitos reconhecidos em amostras de biópsia de MO:
nodular, intersticial e difusa (60).
Às vezes, em uma dada amostra de biópsia, pode-se ver uma mistura de
padrões nodulares e intersticiais, ou nodulares e difusos infiltrativos.
Historicamente, os pacientes com infiltração difusa tendem a ter doença
avançada e um prognóstico mais fraco, enquanto para fins prognósticos, padrões
nodulares e intersticiais podem ser agrupados na categoria "não difusa",
prognosticamente melhor. No entanto, com a descoberta de marcadores
celulares prognósticos adicionais na LLC, o valor prognóstico da biópsia da MO
ficou menos necessário(61).
LLC e Linfoma Linfocítico de Pequenas Células (LLPC) são considerados
a mesma doença com diferentes manifestações clínicas. Historicamente, o
diagnóstico de LLPC era feito através de uma biópsia de linfonodos em um
paciente com linfadenopatia, mas sem linfocitose periférica, enquanto a LLC era
47
diagnosticada através do exame do SP e da MO em pacientes com linfocitose
(62).
Atualmente, o diagnóstico de LLPC é reservado para pacientes que
demonstram patologia dos linfonodos consistente com LLC/LLPC, mas com uma
contagem absoluta de linfócitos clonais periféricos não excedendo 5.000/L ,
assim como nenhuma evidência de neutropenia, anemia ou trombocitopenia
relacionada à doença (62).
A atualização do IWCLL (International Workshopp on Chronic
Lymphocytic Leukemia) das diretrizes do National Cancer Institute, em 2008,
sobre o diagnóstico e tratamento da LLC, concluiu que os dois critérios a seguir
devem ser atendidos: contagem absoluta de linfócitos B no SP ≥ 5000//L, com
uma população preponderante de linfócitos pequenos que aparecem
morfologicamente maduros; demonstração da clonalidade dos linfócitos B do SP
circulantes pela CF(63)
A maioria da população deve expressar o seguinte padrão de marcadores
de células B monoclonais: níveis extremamente baixos de expressão de SmIg e
kappa ou lambda (mas não as duas cadeias leves); expressão de antígenos
associados a células B (CD19, CD20 e CD23) e expressão do antígeno
associado às células T CD5(52).
No sistema atual, os pacientes com uma contagem absoluta de linfócitos
inferior a 5000/L e nenhuma evidência de outras manifestações da doença (por
exemplo, gânglio linfático aumentado) são diagnosticados com uma linfocitose
monoclonal benigna(61).
Conforme mencionado anteriormente, LLC e LLPC apresentam
características patológicas e imunofenotípicas idênticas e, portanto, são
considerados duas manifestações clínicas da mesma doença. Os pacientes com
linfadenopatia e uma contagem absoluta de linfócitos B periféricos inferior a
5000/L recebem o diagnóstico de LLPC em vez de LLC (64)
Antes dos critérios diagnósticos atuais, o diagnóstico de LLC baseava-se
em uma contagem absoluta de linfócitos (CAL) igual ou superior a 5000/L na
configuração de um imunofenótipo apropriado. No entanto, com esse sistema,
os pacientes com contagem absoluta de linfócitos B (CAL-B) inferiores a
48
5000//L e um CAL superior a 5000//L representam uma sobreposição entre
LLC e linfocitose monoclonal benigna (50,65).
O sistema de Estadiamento Rai baseia-se no conceito de que, na LLC, há
um aumento gradual e progressivo da carga corporal de linfócitos leucêmicos,
começando no sangue e MO (linfocitose), envolvendo progressivamente os
linfonodos (linfadenopatia), o baço e o fígado (organomegalia), com eventual
comprometimento da função da MO (anemia e trombocitopenia) (66)
Na série original que descreve o sistema de estadiamento Rai, no
momento do diagnóstico inicial, o estágio foi aproximadamente: Estágio 0
(linfocitose) - 25%; Estágio I a II (linfadenopatia, organomegalia) - 50% e Estágios
III a IV (anemia, trombocitopenia) – 25% (66).
Desde então, alguns relatórios descreveram uma mudança para estágios
anteriores na apresentação inicial enquanto outros, não. Isso pode refletir
mudanças no uso de testes de laboratório "rotineiros", com contagem sanguínea
completa (67,68).
Além disso, a sobrevivência mediana estimada por estágio, melhorou à
medida que os tratamentos evoluíram. Na série original que descreve o sistema
de estadiamento Rai, a partir do momento do diagnóstico, de acordo com o
estágio, a sobrevivência mediana ficou assim: Estágio 0 - 150 meses; Estágio I
- 101 meses; Estágio II - 71 meses; Etapas III e IV - 19 meses (66).
Com o passar do tempo, os pacientes tendem a progredir de um estágio
inicial para um estágio intermediário e, eventualmente, para um estágio
avançado. No entanto, se a remissão completa ou parcial for obtida com uma
terapia bem-sucedida e o estágio do paciente mudar de um risco maior para uma
categoria de risco menor, a perspectiva de sobrevivência melhora em
conformidade. Assim, o prognóstico para cada estágio melhora com o advento
de novos regimes terapêutico.(66)
O sistema de Estadiamento de Binet leva em consideração cinco
possíveis locais de envolvimento: nódulos linfáticos cervicais, axilares e inguinais
(seja unilateral ou bilateral, cada área é contada como uma), baço e fígado. O
envolvimento é julgado apenas pelo exame físico e não leva em consideração
os resultados dos estudos de imagem para fins de estadiamento(69).
49
. Os pacientes são classificados de acordo com o número de sítios
envolvidos mais a presença de anemia (hemoglobina inferior a 10 g/dL) e/ou
trombocitopenia (plaquetas abaixo de 100.000/L). Sendo, portanto: Estágio A -
menos de três locais linfóides envolvidos; Estágio B - três ou mais locais linfóides
envolvidos e Estágio C - presença de anemia e/ou trombocitopenia (70).
Embora a sobrevivência por estágio tenha melhorado com a evolução do
tratamento, a sobrevivência mediana para os grupos prognósticos estudados por
Binet foi: Estágio A - comparável aos controles combinados com a idade; Estágio
B - 84 meses e Estágio C - 24 meses (52).
A Tomografia Computadorizada (TC) do tórax, do abdômen e da pelve
não é rotineiramente realizada como parte do estadiamento de pacientes com
LLC fora de um ensaio clínico, mas pode ser indicada com base nos sintomas
do paciente (52).
As TC podem revelar o aumento dos nódulos retroperitoneais ou
mediastinais que, atualmente, não estão incluídos nos cinco locais de áreas
linfóides palpáveis. Os pacientes com citopenias, devido a processos auto-
imunes, parecem ter um prognóstico melhor do que os pacientes com citopenias
devido à insuficiência da MO (71).
Os pacientes classificados como estágio C, devido a citopenias auto-
imunes, tiveram uma sobrevivência mediana significativamente melhor do que
os pacientes com citopenias devido à infiltração da MO (7,4 versus 3,7 anos),
além de uma pior sobrevivência média do que aqueles com doença do estádio A
(10, 2 anos) (71).
Os sistemas de Estadiamento de Rai e Binet foram projetados a fim de
fornecer informações prognósticas para o atendimento ao paciente e estão em
grande uso na prática clínica. No entanto, alguns pacientes classificados como
tendo a doença em estágio inicial progridem rapidamente. Por esse motivo,
outros fatores prognósticos foram investigados. Então, a idade, o sexo e o estado
de desempenho foram correlacionados com o prognóstico, mas a importância e
a magnitude desse efeito variaram entre os estudos (72).
O tempo de duplicação de linfócitos (TDL), beta-2 microglobulina (b2M) e
anormalidades genéticas, atualmente, são utilizados clinicamente para fornecer
50
informações prognósticas ou terapia guia. O tratamento é realizado com base
em marcadores prognósticos mais recentes (por exemplo, CD38, ZAP-70 ou
IGVH, mutação genética, bem como mutações genéticas em TP53, SF3B1 e
outros)(73).
O TDL é o número de meses que leva a contagem absoluta de linfócitos
para dobrar, o que pode fornecer uma estimativa do ritmo da doença. No entanto,
esse fator é um pouco limitado em utilidade porque leva tempo para medir. Um
TDL real ou projetado em pacientes não tratados, a partir da observação, está
associado a um curso progressivo, assim como um TDL mais longo está
associado a um curso indolente (74,75).
Em pacientes com doença em estágio inicial, a presença de um pequeno
TDL pode favorecer a uma terapia mais agressiva (66,74).
Vários fatores prognósticos foram testados e encontrados no curso de
estágios não avançados da LLC como sendo de utilidade limitada
Esses fatores prognósticos incluem: extensão da linfocitose do sangue e
características morfológicas dos linfócitos do sangue (ou seja, a proporção
relativa de pró-linfócitos)(76).
Anormalidades citogenéticas específicas, identificadas pela análise
Fluorescente da Hibridização in situ (FISH), e anormalidades em certos genes,
identificadas por testes genéticos moleculares, conferem significância
prognóstica em pacientes com LLC (77).
Na avaliação de pré-tratamento de pacientes com LLC, rotineiramente,
realiza-se FISH do SP para del (17p), del (11q), trissomia 12 e del (13q). Destes,
a del(13q) e a trissomia 12 são achados prognósticos favoráveis.
Historicamente, pacientes com del (17p) ou del (11q) correm alto risco de não
responder ao tratamento inicial ou de recidiva, logo após a remissão (77).
Os níveis de beta 2 microglobulina (b2M) se correlacionam com o estágio
da doença e o tamanho da massa tumoral em pacientes com LLC, cujos níveis
cada vez maiores estão associados a um prognóstico pior (78–81).
A b2M pode ser regulada, pelo menos em parte, por citocinas exógenas
(82). A fonte destas citocinas elevadas em LLC não é clara, embora a IL-6,
51
inibidora da apoptose em células LLC, possa ser liberada a partir do endotélio
vascular.(83).
Os níveis de b2M também aumentam com a piora da função renal,
levando alguns pesquisadores a sugerir uma medida de b2M ajustada para a
Taxa de Filtração Glomerular (b2M ajustada à TFG) (83).
Na maioria dos estudos, o status mutacional da cadeia pesada dos genes
da imunoglobulina (IGVH) são definidos como tendo uma diferença maior do que
2% em comparação com a sequência de nucleotídeos do ácido
desoxiribonucléico (DNA) da linha germinal (84,85).
Aproximadamente metade dos clones de LLC demonstrará regiões
variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina não mutadas, um achado
associado a uma sobrevida mais curta e, em geral, a um maior risco de recaída
após o tratamento, incluindo o transplante de células hematopoiéticas (84).
A detecção da positividade do CD38 pela CF pareceu correlacionar-se
com a presença de cadeias pesadas variáveis de imunoglobulina não mutadas
na LLC (84).
A presença do CD38 parece estar associada, de forma independente, a
um prognóstico adverso. A proteína associada à cadeia Zeta 70 (ZAP-70), uma
tirosina quinase, normalmente expressa por células NK e T, é necessária para a
sinalização do receptor de células T normais ZAP-70, o qual não é normalmente
expresso em linfócitos B, mas foi encontrado em subconjunto de pacientes com
LLC e parece correlacionar-se com a sobrevivência (86).
Desta forma, o melhor valor de corte para determinar a positividade da
ZAP-70 não está claro, e os níveis parecem mudar ao longo do tempo (86).
A expressão anormal de ZAP-70 em células LLC-B está fortemente
associada à presença de um gene de região variável de cadeia pesada de Ig não
mutado (IgVH(87,88).
Na análise multivariada, cinco fatores foram identificados como preditores
independentes de sobrevivência curta, e foi atribuída uma pontuação ponderada:
del (17p) ou mutação TP53 - 4 pontos; Soro b2M acima de 3,5 mg/L- 2 pontos;
IGVH não mutado - 2 pontos; Rai fase I para IV ou Binet estágio B ou C - 1 ponto;
Idade superior a 65 anos - 1 ponto (89).
52
A análise desses cinco fatores resultou em um escore do prognóstico final
que foi capaz de identificar quatro grupos de risco, com taxas estimadas
significativamente diferentes de sobrevivência global (SG), no conjunto de dados
de validação interna: Baixo risco (0 a 1 ponto) - 91 e 87% de SG de cinco e dez
anos, respectivamente (mediana não alcançada); Risco intermediário (2 a 3
pontos) - 80 e 40% de SG de cinco e dez anos, respectivamente (mediana de
104 meses); Alto risco (4 a 6 pontos) - 53 e 16% de cinco e dez anos de SG,
respectivamente (mediana de 63 meses); Risco muito alto (7 a 10 pontos) - 19 e
0% de SG de cinco e dez anos, respectivamente (mediana de 31 meses) (89).
A LLC, em um considerável percentual de pacientes e, geralmente, como
um evento terminal, transforma-se em outra doença linfoproliferativa. Conforme
observado em uma das maiores pesquisas epidemiológicas, pacientes com LLC,
em comparação com a população em geral, parecem ter um risco aumentado de
duas a cinco vezes de desenvolver uma segunda doença maligna linfóide (90).
Em aproximadamente 60% dos casos, as células transformadas estão
clonalmente relacionadas às células LLC-B originais, enquanto nos 40%
restantes, elas parecem derivadas de uma célula de origem desconhecida (91).
As transformações seguintes são as mais comumente relatadas: Linfoma
agressivo ou altamente agressivo (Transformação de Richter, TR) – 3% a 7%;
Leucemia Prolinfocítica (LPL - B) - 2%; Linfoma de Hodgkin - 0,5% a 2% e
Mieloma Múltiplo - 0,1%(43).
Nesta perspectiva, após um acompanhamento mínimo de 15 anos, a
transformação de Richter (TR) desenvolveu-se em 34 pacientes (7%) e a LPL-B
desenvolveu-se em 10 pacientes (2%)(90).
A incidência de TR e LPL-B foi independente da terapia inicial. Em 1% a
10% dos pacientes com LLC, ocorre a transformação para um linfoma Não-
Hodgkin altamente agressivo (Síndrome de Richter ou TR). Esta transformação
é anunciada por uma deterioração clínica repentina, caracterizada por aumento
da linfadenopatia, esplenomegalia, agravamento dos sintomas "B" (isto é, febre,
suores noturnos, perda de peso), um curso clínico descendente rapidamente
progressivo, aumento da lactato desidrogenase (LDH) e uma mediana da
sobrevivência de 5 a 8 meses (91).
53
Entretanto, nem todos os pacientes com LLC necessitam de tratamento
no momento do diagnóstico. Isto ocorre, principalmente, porque a LLC é uma
doença extremamente heterogênea, com certos subconjuntos de pacientes com
taxas de sobrevivência sem tratamento semelhantes à população normal(65).
2.4.4.2. Leucemia Prolinfocítica B (LPL-B)
A leucemia prolinfocítica de células B (LPL-B) é uma neoplasia de células
B muito rara, composta pelos chamados prolinfócitos, representando muito
menos de 1% das leucemias de células B (92).
Classificar morfologicamente as células presentes com o nome de
"prolinfócitos" é incorreto, pois as células tumorais, nessa doença, são células B
ativadas maduras e, por definição, compreendem mais de 55% das células no
sangue e na MO. Porém, tipicamente, a porcentagem de prolinfócitos é maior do
que 90%(92).
A LPL-B afeta principalmente a idosos com idade média na apresentação,
entre 65 e 70 anos. Homens e mulheres parecem igualmente afetados, assim
como a grande maioria dos pacientes é caucasiana (92).
Os pacientes, tipicamente, apresentam uma contagem de glóbulos
brancos em rápida elevação superior a 100.000/L e esplenomegalia maciça.
Neste contexto, Anemia e trombocitopenia estão presentes em
aproximadamente 65% e 35% dos casos, respectivamente. Ademais, sintomas
B sistêmicos (por exemplo: febres, suores noturnos e perda de peso) são
comuns. Se presente, a linfadenopatia periférica não é proeminente (93).
Os prolinfócitos do SP são células de tamanho médio (aproximadamente,
o dobro do tamanho de um linfócito pequeno), com cromatina moderadamente
condensada e um único nucléolo vesicular proeminente. O núcleo, geralmente,
é redondo ou oval, e o citoplasma, na maioria das vezes, é moderadamente
abundante e ligeiramente basofílico (92).
A MO é infiltrada em um padrão intersticial ou nodular por células
semelhantes. No imunofenótipo, as células tipicamente expressam fortemente
IgM+/IgD- de superfície, IgL forte de superfície ou cadeia leve
54
predominantemente do tipo lambda, CD20 forte e CD19, CD22, CD79b e FMC7.
A expressão de CD5 e CD23, geralmente, é fraca ou ausente. Bem como o
CD11c, CD103, CD10 e CD25 e ciclina D1 que facilita a distinção entre a LPL-B
do linfoma do manto(LM)(92) No entanto, há um contraste com a LLC que,
geralmente, tem expressão fraca de sIg e CD20, o ZAP-70 e CD38 são
expressos em cerca de 50% dos casos, enquanto os CD5 e CD23 são expressos
em cerca de um terço dos casos. Assim, CD38 e ZAP-70 não têm significado
prognóstico (92).
Então, o diagnóstico de LPL-B, comumente, é feito com base nos
resultados da análise imunofenotípica e genética do SP. Os resultados do
aspirado e biópsia da MO podem confirmar esses achados. Porém, quando a
contagem de glóbulos brancos é elevada e uma avaliação do SP e da MO é
consistente com LPL-B, a biópsia dos linfonodos, raramente, fornece
informações adicionais e, portanto, não é necessária. A esplenectomia pode ser
necessária em pacientes com uma apresentação pouco clara e um baço
vastamente ampliado (93).
O curso clínico da LPL-B é variável e a terapia não pode ser indicada
inicialmente em pacientes assintomáticos (94). A maioria dos pacientes, no
entanto, requer tratamento, porém a escolha mais apropriada não é clara devido
à falta de dados clínicos. A LPL-B, frequentemente, é mais tratada com regimes
de combinação utilizados para LLC (95).
A sobrevida desses pacientes, geralmente, é de três a cinco anos apesar
da terapia. Nesta perspectiva, ressalta-se que é difícil determinar marcadores
prognósticos para pacientes com LPL-B por ser um tumor muito raro e porque
as pesquisas anteriores, que continham pacientes com LPL-B, também
apresentavam LPL de células T ou Linfoma de Células do Manto (95–97).
55
2.4.4.3. Leucemia de Células Vilosas (LCV)
A leucemia de células vilosas (LCV) é uma doença linfoproliferativa de
células B rara, caracterizada pelo acúmulo de pequenas células B maduras, com
citoplasma abundante e projeções "vilosas" no SP, MO e baço. Na maioria das
vezes, resulta em esplenomegalia e uma redução variável na produção de
glóbulos vermelhos normais, plaquetas, granulócitos maduros e monócitos(98).
As exposições a radiações ionizantes e pesticidas na agricultura foram
mencionadas como possíveis agentes etiopatogênicos (99,100).
Embora a LCV tenha sido diagnosticada em adultos mais jovens, a idade
média do diagnostico é de 50 a 55 anos. Além disso, há uma forte predominância
em individuos do sexo masculino, com uma relação de aproximadamente 4:1,
sendo também observada incidência três vezes maior nos caucasianos do que
nos negros (101)
A maioria dos pacientes com LCV apresenta sintomas relacionados à
esplenomegalia ou citopenias (por exemplo: anemia, trombocitopenia,
neutropenia e monocitopenia), incluindo fraqueza e fadiga, infecções de
severidade variável e/ou achados hemorrágicos, como sangramento gengival,
equimoses e epistaxis. As combinações desses sintomas são comuns e podem
apresentar-se clinicamente de várias maneiras diferentes (102).
A esplenomegalia é uma característica clássica em 80% a 90% dos casos,
cuja incidência e gravidade podem diminuir à medida que os pacientes são
diagnosticados no curso da doença. Os sintomas de B (isto é, febre, sudorese
noturna e perda de peso), habitualmente, não estão associados à LCV, e se a
febre estiver presente, é provável que seja uma infecção(104,105).
Neste contexto, 60% a 80 % dos pacientes com LCV apresentam
pancitopenia, com hematócritos na faixa de 20% a 35%, uma contagem total de
glóbulos brancos, de regra, abaixo de 4.000/L e uma contagem de plaquetas
na faixa de 20.000 a 100.000/L . Logo, Monocitopenia e neutropenia são
comuns, bem como a LDH, em geral, é normal (106).
O SP, frequentemente, demonstra pancitopenia com monocitopenia e
células tumorais circulantes, características da LCV, as quais podem ser
56
identificadas em aproximadamente 90% dos pacientes, compreendendo 20% ou
menos da contagem total de glóbulos brancos. No entanto, em 10% dos
pacientes que apresentam leucocitose, a célula LCV é o glóbulo branco
circulante predominante. Uma porcentagem muito pequena de pacientes
apresenta leucocitose acentuada, com uma contagem de glóbulos brancos
superior a 200.000//L (107).
Além disso, a célula LCV é mononuclear que, na maioria das vezes, é de
uma a duas vezes o tamanho de um linfócito maduro (107).
Os núcleos, por sua vez, são frequentemente excêntricos na posição, mas
podem ser centrais. Em geral, são ovóides, mas podem ser redondos, ovais,
reniformes ou em forma de ferradura; enquanto as aparências morfológicas
atípicas são mais frequentes nos casos variantes das células vilosas. O padrão
de cromatina é reticular ou similar à rede, já os nucléolos são indistintos ou
ausentes (108).
Apesar de ser bastante abundante, o citoplasma é variável em
quantidade, de cor azul pálido a azul-cinza. O contorno citoplasmático,
frequentemente, é indistinto devido à presença de diferentes números de
projeções. Por isso, é melhor visto em microscopia de contraste de fase, dando
à célula uma aparência "vilosa" quando as projeções são finas e uma aparência
"pregueada", quando mais largas (109).
As projeções citoplasmáticas são prontamente evidentes ao microscópio
eletrônico e, particularmente, na microscopia eletrônica de varredura. A MO,
muitas vezes, é difícil ou impossível de aspirar devido à fibrose induzida pela
doença. Assim sendo, o diagnóstico depende muito da análise do SP (107).
Na LCV clássica, as células vilosas exibem um fenótipo de células B
maduras e, tipicamente, expressam uma ou mais cadeias pesadas de
imunoglobulina e cadeias leves monotípicas. Ainda, expressam fortemente
antígenos de célula pan-B, incluindo CD19, CD20 e CD22 e, geralmente, não
expressam CD5, CD10, CD21, CD23 e CD27(110).
As células vilosas expressam CD11c (um marcador associado às células
mielomonocíticas), CD25 (a cadeia alfa do receptor da interleucina-2), CD103,
57
CD123 (forte) e ciclina D1 (geralmente fraca). A Expressão do CD200 é muito
forte (110).
O antígeno de linfócitos da mucosa, CD103, é um marcador sensível para
LCV (111). Ele é um membro da família das integrinas e está presente em células
T associadas à mucosa e a alguns linfócitos ativados. A presença de CD103,
quando co-expresso com outros marcadores de célula pan-B, é altamente
sugestivo de LCV (112).
Raramente, a LCV tem um imunofenótipo atípico com a expressão dos
marcadores CD5 e CD10. Porém, a expressão desses fenótipos aberrantes não
cria dificuldades diagnósticas, uma vez que outras características da LCV,
incluindo sua morfologia distinta e padrão de infiltração da medula, distinguem-
na de outros tumores CD5+, como o Linfoma de Células do Manto e a LLC, e
tumores CD10+, como o Linfoma Folicular (112).
Praticamente todos os casos de LCV demonstram a mutação V600E,
somática clonal na serina/treonina quinase BRAF (uma isoforma da RAF),
levando à ativação aberrante constitutiva da via de sinalização RAF-MEK-ERK
que transduz sinais promotores da proliferação e do aumento da sobrevivência
celula(110).
Outras anormalidades cariotípicas clonais estão presentes em
aproximadamente dois terços dos pacientes. As anormalidades do cromossomo
5 estão presentes em aproximadamente 40%, com maior frequência, a trissomia
do cromossomo 5, inversões pericêntricas e deleções intersticiais envolvendo a
banda 5q13 (113).
A célula, na LCV, produz muita fibronectina e várias citocinas, como o fator
de crescimento de fibroblasto básico (FCFb, FGF-2), o Fator de Crescimento
Transformante beta (TGF-beta) e o Fator de Necrose Tumoral (TNF). Os três
primeiros são responsáveis pela fibrose da MO, caracteristicamente vista na
LCV, enquanto o TNF pode ser responsável pela supressão da medula e
consequente pancitopenia (115).
A extensão do envolvimento da MO, frequentemente, é melhor estimada
por coloração imunohistoquímica de seções para antígenos associados a células
58
B, como o CD20. A maioria dos casos tem uma medula hipercelular, e a
infiltração de células vilosas pode ser difusa ou intersticial (116).
Os padrões nodulares de infiltração da medula ocorrem raramente. Uma
minoria de pacientes, talvez de 10% a 20%, exibe uma MO hipocelular. A
hipocelularidade pode sugerir aplasia da medula mesmo com apenas um
pequeno número de células vilosas que se infiltram em torno das células
adiposas. Em pacientes com envolvimento difuso, grandes áreas da MO podem
ser completamente tomadas por células vilosas (116,117).
Historicamente, a demonstração da atividade da fosfatase ácida
resistente ao tartarato (TRAP) em filmes de SP, esfregaços de aspiração de
medula ou preparações de MO foi rotineiramente utilizada para confirmar o
diagnóstico de LCV (118).
No entanto, a TRAP é uma coloração citoquímica tecnicamente difícil e,
embora sensível à LCV, não é tão específica como outros marcadores que
podem ser identificados pela ICF ou imunohistoquímica, o que tornou o uso da
coloração TRAP obsoleto (118).
2.4.4.4. Leucemia de Células Vilosas Variante (LCV-v)
A leucemia de células vilosas variante (LCV-v) é uma neoplasia linfóide
de células B crônica rara que, anteriormente, pensava-se ser um subtipo de LCV.
No entanto, agora, é considerada uma entidade biologicamente distinta(119).
Ela exibe características morfológicas intermediárias entre células vilosas
e prolinflócitos. Ao contrário da LCV, normalmente, possui nucléolos
proeminentes e menos infiltração da medula. Esta condição é frequentemente
associada à leucocitose extrema, muitas vezes sem neutropenia, monocitopenia,
anemia e trombocitopenia, como observadas na LCV (120).
A LCV e a LCV-v são melhor distinguidas uma da outra com base no
imunofenótipo. Tanto a LCV quanto a LCV-v expressa CD20, CD22, CD11c e
CD103. Ao contrário da LCV que, tipicamente, tem uma expressão forte de
CD123 e CD25, a LCV-v não expressa CD25 e, geralmente, é fraca ou negativa
59
para CD123. Além disso, a anexina A1 é expressa em aproximadamente 75%
dos casos de LCV, sendo universalmente negativa na LCV-v.(121).
Ainda, a LCV-v carece da mutação BRAF V600E, e um subconjunto tem
mutações ativadoras em MAP2K1, um gene que codifica MEK1, um componente
a jusante da cascata de sinalização BRAF-MEK-ERK (122).
2.4.4.5. Linfoma folicular (LF)
O LF é o segundo LNH-B mais comum e o primeiro dentre os linfomas
indolentes (123). Nos EUA, entre 1992 e 2001, a incidência foi de 3,8 casos por
100.000 habitantes, demonstrando predileção pela população branca e idosa,
porém não havendo clara predileção por sexo(41).
No entanto, a história familiar de um parente de primeiro grau aumenta
em até 4 vezes o risco de desenvolver a doença. As células do LF são formadas
por centrócitos (pequenas células clivadas) e centroblastos (grandes células não
clivadas), em proporções variadas, oriundos do centro germinativo. Os
linfonodos acometidos, geralmente, apresentam um padrão folicular com
sobreposição dos folículos (124).
Desta forma, o LF se apresenta inicialmente com uma adenomegalia que
acomete as cadeias cervicais, axilares, inguinais e/ou femorais, com a
característica de alternar momentos de melhora e piora. Não há remissão
completa do quadro (125).
Na imunohistoquímica, pesquisa-se a positividade para CD20, CD5,
CD10, BCL-2, BCL-6, CCND1, CD21 e CD23. Apesar de ser um LNH-B bastante
frequente, a forma leucêmica é raramente observada. Nessa situação, a ICF
60
mostra um fenótipo: CD19+, CD20+, CD5-/+, CD23- e CD10+. Também,
pesquisa-se BCL-2+, IgM+ e/ou IgD+.(126).
Em situações especiais, pode-se realizar estudo citogenético ou FISH
para as translocações t(14;18) e t(8;14) ou suas variantes; pesquisa do antígeno
Ki-67, além de estudo molecular em busca do rearranjo no BCL-2 (131).
2.4.4.6. Linfoma de Células do Manto (LCM)
O Linfoma de células do manto (LCM) é um dos LNH de células B
maduras. Embora seja frequentemente discutido, juntamente com as formas
clinicamente indolentes da LNH, seu comportamento é associado a uma doença
agressiva com maior frequência (127).
O LCM foi referido anteriormente como linfoma linfocítico intermediário,
linfoma da zona do manto, linfoma centrocítico e linfoma linfocítico de
diferenciação intermediário. Representa cerca de 7% dos LNH em adultos nos
EUA e na Europa, com uma incidência de aproximadamente 4 a 8 casos por
milhão de pessoas ao ano (128).
A incidência aumenta com a idade e parece aumentar, em geral, nos EUA.
Aproximadamente três quartos dos pacientes são homens, e os caucasianos são
afetados com frequência de quase duas vezes mais que os negros. A idade
média, no momento do diagnóstico, é de 68 anos (67).
Para o LCM, foram propostas duas origens celulares distintas, cada uma
dando origem a diferentes formas da doença. Acredita-se que o LCM clássico
seja originado de células B "naives" que expressam o gene SOX11 e,
tipicamente, envolva nódulos linfáticos e sítios extranodais, como o trato
gastrointestinal (129).
Assim, a aquisição de anormalidades genéticas adicionais pode levar à
progressão para formas mais agressivas, com morfologias blastóides ou
pleomórficas(128).
O outro tipo de LCM se desenvolve a partir de células B SOX11-negativas
já apresentadas a antígenos. Por razões pouco claras, na maioria das vezes,
61
essa variante poupa os gânglios linfáticos e envolve principalmente o SP, a MO
e, muitas vezes, o baço. Essas variantes "leucêmicas" são clinicamente
indolentes, embora possam adquirir anormalidades secundárias e mutações
TP53 específicas, as quais levam a um curso muito agressivo (130).
Ambos os tipos de LCM estão altamente associados à translocação
t(11;14) que desregula o gene da ciclina D1. A maioria dos pacientes tem doença
em estágio avançado ao diagnóstico (75%), e a doença extranodal é a principal
apresentação nos 25% restantes (130).
As células do linfoma do manto expressam altos níveis de IgM e IgD de
superfície e mostram restrição da cadeia leve lambda em até 80% dos casos.
Também, expressam antígenos de célula pan-B (por exemplo, CD19 e CD20),
bem como raros casos expressam CD5 ou CD23(128).
Os genes das cadeias pesadas e leves de imunoglobulina são
rearranjados enquanto os genes da região IgV carecem de mutações somáticas
na maioria dos casos, indicando um estágio central pré-germinal de
diferenciação consistente, com uma origem de células B imunologicamente
"naive" da camada do manto (131).
A superexpressão da ciclina D1 está fortemente associada a t(11; 14)
(q13;q32), uma translocação entre o locus de ciclina D1 (BCL-1, CCND1 e
PRAD1) e o locus da cadeia pesada da imunoglobulina (IgH) (127,129).
Todavia, essa translocação não é específica para LCM mesmo que leve
à expressão desregulada do gene codificador da ciclina D1, que está envolvida
no controle da fase G1 do ciclo celular e, normalmente, não é expressa em
células linfóides (129).
A cariotipagem dos cromossomos da metáfase revela a t(11;14) (q13;q32)
em apenas 50% a 65% dos pacientes com LCM. Mas, por hibridação
fluorescente in situ (FISH), uma fração muito maior de casos com
superexpressão da ciclina D1 contém os genes de fusão BCL-1/IgH (129).
Pacientes suspeitos de ter LCM devem ser submetidos à biópsia de
tecido. Além da histologia de rotina e imuno-histoquímica, o envolvimento da
ciclina D1 deve ser avaliado por imuno-histoquímica. Neste sentido, a detecção
62
citogenética da t(11;14), quer por cariotipagem ou hibridação in situ fluorescente
(FISH), é um teste adjuvante útil (132).
2.4.4.7. Linfoma Esplênico de Células Vilosas (LECV).
Constitui menos de 1% de todos os LNH-B; de 1% a 2% das leucemias
linfóides indolentes encontradas no exames da medula óssea / e ou sangue
periferico e até 25% dos neoplasmas de células B de baixo grau. Compreende a
maioria das leucemias crônicas e linfomas de células B que acometem o
baço(133).
O LECV ocorre em uma idade média de 65 a 70, sendo rara antes dos 50
anos. Acomete todas as raças e localizações geográficas. A incidência varia de
acordo com a etnia. Assim sendo, a incidência em brancos é aproximadamente
o dobro do que em outras raças, não havendo predominância de gênero(133).
Imunofenotipicamente, apresenta Ig de superfície, CD19+, CD20+/-,
CD22+, CD11c+/-, CD24+, CD25+, HLA-DR+ e CD45+. A negatividade do
CD103 é útil para a diferenciação com a HCL, sendo também
caracteristicamente negativo para os CD5, CD10 e CD23(134).
2.4.4.8. Linfoma Linfoplasmocítico (LLP) / Macroglobulinemia de
Waldeströn (MW)
Macroglobulinemia de Waldeströn (MW) é uma doença rara com uma
incidência de aproximadamente 03 casos por milhão de pessoas ao ano, com
1.400 novos casos diagnosticados nos EUA a cada ano (135,136).
Quanto à idade média para o diagnóstico, sabe-se que é de 64 anos.
Entretanto, menos de 1% dos pacientes tem menos de 40 anos, e
aproximadamente 60% são do sexo masculino (137).
.
63
A maioria dos pacientes apresenta sintomas constitucionais não
específicos, mas até um quarto dos pacientes podem estar assintomáticos no
momento do diagnóstico (138,139).
As características de apresentação mais comuns incluem fraqueza,
fadiga, perda de peso e supressão crônica de sangue, na qual são observados
pequenos sangramentos no nariz ou gengivas. Infecções recorrentes também
podem ocorrer devido à diminuição relativa de outras imunoglobulinas (149).
Um aspirado e uma biópsia de MO, demonstrando LLP, são componentes
essenciais do diagnóstico de MW. Embora o aspirado da MO seja
frequentemente hipocelular, a amostra da biópsia, geralmente, é hipercelular e,
extensivamente, infiltra-se com célulase plasmocitóides (144).
Neste contexto, a detecção de uma proteína IgM monoclonal no soro é
um critério de diagnóstico chave para MW. A eletroforese de proteínas séricas
(EPS) revela uma faixa afilada, estreita ou densa de IgM monoclonal, de regra,
migrando na área gama (153,154).
Assim, o diagnóstico de MW é feito com base na avaliação de uma
amostra de biópsia da MO, análise dos componentes protéicos séricos e
consideração do cenário clínico (140,141).
Em resumo, para fazer um diagnóstico de MW, os seguintes critérios
devem ser atendidos: uma gamopatia monoclonal IgM (de qualquer tamanho)
deve estar presente no soro; 10% ou mais da amostra de biópsia da MO devem
demonstrar infiltração por pequenos linfócitos, os quais se apresentam
plasmocitóides ou diferenciação de células plasmáticas (características
linfoplasmocíticas ou linfoma linfoplasmocítico) com um padrão intertrabecular.
Estes infiltrados devem expressar um imunofenótipo típico, por exemplo:
IgM de superfície, CD5+/-, CD10-, CD11c, CD19+, CD20+, CD22+, CD23-,
CD25+, CD27+, FMC7+, CD103- e CD138+. O componente plasmocítico será
CD138+, CD38+ e CD45- ou fraco (144).
Ressalta-se que podem ocorrer variações do imunofenótipo típico, mas o
objetivo é excluir de forma satisfatória outros distúrbios linfoproliferativos,
incluindo LLC e LCM (124,145).
64
A OMS também enfatiza que o diagnóstico de MW é essencialmente de
exclusão. O "cut off" sugerido para MW varia de 0,5 g/dL a 3g/dL de proteína
monoclonal sérica, entretanto, sendo observados casos de pacientes com
concentrações abaixo de 0,5 g/dL com sintomatologia. Segundo alguns autores,
apenas o pico monoclonal de IgM é suficiente para confirmação do diagnóstico
(144,156).
2.4.4.9. Linfoma de Burkitt (LB)
O linfoma de Burkitt (LB) é um LNH de células B altamente agressivo,
caracterizado pela translocação de material genético entre os cromossomos 8 e
14, t(8;14)(q24;q32) em 80% dos casos. Os outros 20% correspondem às
translocações t(2;8)(p12;q24) e t(8;22)(q24;q11). O envolvimento do
cromossomo 8 leva à desregulação do gene c-MYC (147).
Nas células do LB, o oncogene c-MYC também pode sofrer
recombinações. Essas alterações desregulam a expressão da proteína c-myc,
levando a um aumento anormal da proliferação das células B que, somado a
outras mutações, podem induzir à formação de tumor (148).
A leucemia e o LB são considerados diferentes manifestações da mesma
doença pela classificação de doenças malignas hematológicas da OMS (124).
A incidência mundial exata do LB não é conhecida, uma vez que a coleta
desses tipos de dados epidemiológicos é limitada pela falta de recursos
necessários para a verificação precisa do caso e do diagnóstico nos países em
desenvolvimento, ou seja, aqueles que apresentam maior incidência aparente (a
exemplo da África equatorial) (149).
São reconhecidas 03 formas clínicas distintas do LB: endêmicas
(africanas), esporádicas (não-endêmicas) e associadas à imunodeficiência.
Embora sejam histologicamente idênticas e tenham um comportamento clínico
similar, existem diferenças na epidemiologia e nas características genéticas
(147).
As variantes clínicas endêmicas e esporádicas do LB diferem
geograficamente. A variante endêmica é encontrada na África equatorial e na
65
Nova Guiné, apresentando-se na mandíbula ou tumor ósseo facial em 50% a
60% dos casos(147).
O envolvimento primário do abdômen, por sua vez, é menos comum,
assim como dos gânglios linfáticos periféricos, mediastino e baço. O tumor
primário pode disseminar para locais extranodais, incluindo o mesentério, ovário,
testículo, rim, mama e meninges. Já o envolvimento da MO está presente em
menos de 10% dos pacientes no momento da apresentação inicial, mas é uma
complicação comum da doença recorrente ou resistente ao tratamento .(150).
A incidência do LB na África é aproximadamente 50 vezes maior que a
observada nos EUA. Representa 30% a 50% de todos os cânceres da infância
na África equatorial, com uma incidência estimada de 3 a 6 casos por cada
100.000 crianças ao ano. Neste sentido, o pico de incidência ocorre em crianças
de 04 a 07 anos, e a relação masculino:feminino é de aproximadamente
2:1(150).
A infecção crônica do vírus Epstein-Barr (EBV) parece desempenhar um
papel em praticamente todos os casos de LB endêmico (africano) e em uma
minoria de LB esporádica associada à imunodeficiência (149).
Pacientes com LB apresentando massa tumoral em rápido crescimento,
muitas vezes, apresentam evidências de lise tumoral espontânea, com uma
concentração muito elevada de LDH sérica e níveis elevados de ácido úrico. O
tempo de duplicação do tumor é muito curto (25 horas) (147).
Um padrão clássico de "céu estrelado", em geral, está presente,
transmitido por numerosos macrófagos benignos (histiócitos) que ingeriram
células tumorais apoptóticas. Os histiócitos benignos ("as estrelas") são grandes
e abundantes(148).
Citotologicamente, as células tumorais do LB são classicamente
monomórficas, de tamanho médio, com núcleos redondos, múltiplos nucléolos
escuros e citoplasma basofílico, e se assemelham a pequenas células não
clivadas dentro dos centros germinativos normais do folículo linfóide secundário.
Por sua vez, os vacúolos lipídicos citoplasmáticos proeminentes são evidentes
em impressões ou esfregaços secos ao ar, enquanto os histiócitos benignos
66
intercalados são grandes e de forma irregular, com citoplasma abundante e
claro, núcleos pálidos e nucléolos discretos(148).
As células tumorais expressam imunoglobulina superficial (Ig) do tipo IgM,
cadeias leves de imunoglobulina (kappa mais frequente do que lambda),
antígenos associados a células B (CD19, CD20, CD22 e CD79a) e marcadores
associados ao centro germinal (CD10 e BCL-6). São negativos os marcadores:
BCL-2, HLA-DR, CD5, CD23, CD43 e TdT(148).
O imunofenótipo das variantes do LB é muito semelhante ao LB embora
a expressão de imunoglobulina superficial (sIg), CD10 e CD21 seja mais variável
(147). Os sintomas apresentados podem incluir aqueles relacionados à
obstrução intestinal ou sangramento gastrointestinal, muitas vezes, imitando
apendicite aguda. Todavida, se presente, a linfadenopatia está localizada. Nesta
perspectiva, o envolvimento da MO e SNC ocorre em aproximadamente 30% e
15 % dos casos, respectivamente, no momento da apresentação inicial, sendo
complicações comuns da doença (150,151).
2.4.4.10. Mieloma Múltiplo (MM)
O MM representa em torno de 1% de todos os cânceres e pouco mais de
10% das doenças malignas hematológicas nos EUA. A incidência anual, neste
país, é de aproximadamente 4 a 5 casos por cada 100.000 pessoas (3-5). Em
todo o mundo, há cerca de 154.000 casos e 101.000 mortes por ano(152).
Neste contexto, o MM ocorre em todas as raças e em todas as
localizações geográficas, porém a incidência varia de acordo com a etnia. Assim,
em afro-americanos e negros da África, incide de 02 a 03 vezes mais do que em
brancos (153).
Em contraste, o risco é menor nos asiáticos do Japão e nos mexicanos.
Também, é um pouco mais frequente em homens do que em mulheres
(aproximadamente 1,4:1), e o risco de desenvolvê-lo aumenta com o índice de
massa corporal (154–157). Inclusive, trata-se de uma doença de adultos mais
67
velhos, uma vez que a idade média no diagnóstico é de 66 anos. Apenas 10% e
2% dos pacientes são menores de 50 e 40 anos, respectivamente(158,159).
A maioria dos pacientes com MM apresenta sinais ou sintomas relacionados
à infiltração de células plasmáticas no osso ou outros órgãos, ou ao dano renal
causado por excesso de cadeias leves. Como exemplo, uma análise
retrospectiva de 1.027 pacientes sequenciais diagnosticados com MM em uma
única instituição encontrou os seguintes sintomas e sinais na apresentação:
anemia, dor óssea, creatinina elevada, fadiiga, hipercalcemia e perda de peso
(154).
A grande maioria (97%) dos pacientes possui uma proteína monoclonal
(M) produzida e secretada pelas células plasmáticas malignas, que pode ser
detectada por eletroforese protéica do soro e/ou urina (154).
Desta forma, a imunofixação do soro confirma a presença de uma proteína
M e determina seu tipo, a qual se apresenta como um único pico estreito na
região gama, beta ou alfa-2 (154).
As células plasmáticas malignas podem produzir cadeias pesadas de
imunoglobulina e cadeias leves isoladas. Apresentam as seguintes frequências
de imunofixação no soro: IgG - 52%; IgA - 21%; Cadeia leve Kappa ou lambda
apenas (Bence Jones) - 16%; IgD - 2%; Biclonal - 2%; IgM - 0,5%; Negativo -
6,5%. Kappa é o isotipo de cadeia leve predominante em comparação com a
lambda, por um fator de 2 a 1 (154).
No que diz respeito aos achados mais frequentes no esfregaço do SP,
aparecem a formação de "rouleaux" (> 50%) ("forma de pilha de moedas"),
leucopenia (20%) e trombocitopenia (5%) (152).
Células plasmáticas monoclonais, raramente, são observadas no
esfregaço do SP dos pacientes. Uma contagem absoluta dessas células, que
detecta ≥ 100 células/microL (≥ 0,1 x 10 9/L), é encontrada em aproximadamente
10% dos casos de MM (160).
A Leucemia de Células Plasmáticas (LCP), uma forma rara e agressiva
de MM, caracterizada por níveis elevados de células plasmáticas que circulam
no SP, deve ser considerada sempre que as células plasmáticas circulantes
68
forem prontamente detectadas na avaliação convencional de contagem
sanguínea completa(152).
Neste contexto, as células plasmáticas monoclonais circulantes podem
ser detectadas usando um ensaio de imunofluorescência baseado em slide, uma
técnica de imunoensaio em duas cores (ELISPOT) ou citometria de fluxo por
"gating" em células CD38+ (161).
Aspirado de MO e biópsia são componentes-chave para o diagnóstico
de MM. A percentagem de células plasmáticas da MO deve ser estimada a partir
de uma amostra da biópsia central, quando possível. No entanto, se a
porcentagem de células plasmáticas diferir na aspiração e na biópsia, o valor
mais alto deve ser usado (161).
A CF não é usada para determinar a porcentagem de células plasmáticas
da MO para fins de diagnóstico. Logo, a clonalidade pode ser estabelecida
demonstrando a restrição da cadeia leve kappa/lambda na citometria de fluxo,
imuno-histoquímica ou imunofluorescência (161).
A MO da grande maioria dos pacientes contém 10% ou mais de células
plasmáticas clonais. No entanto, devido ao envolvimento irregular da MO, a
aspiração e a biópsia podem apresentar menos de 10% de células plasmáticas
numa média de 4% dos pacientes (153,161).
Um diagnóstico de MM pode ser feito em pacientes com menos de 10%
de células plasmáticas clonais presentes em biópsia de MO se outros critérios
diagnósticos forem cumpridos após a confirmação histopatológica de um tecido
mole ou plasmocitoma ósseo (162).
Vale destacar que as características morfológicas das células plasmáticas
podem variar dependendo da sua maturidade e, às vezes, podem ser
morfologicamente indistinguíveis dos mieloblastos (163).
As células plasmáticas maduras são ovaladas com abundante citoplasma
basofílico. O núcleo é redondo e localizado em posição excêntrica, com um halo
perinuclear marcado ou clareamento citoplasmático. A cromatina apresenta-se
como vidro fosco, sem nucléolos, enquanto as células plasmáticas apresentam
cromatina nuclear dispersa, nucléolos proeminentes e uma alta relação núcleo-
citoplasma (164).
69
Muito parecidas com as células plasmáticas normais, as células de
mieloma expressam CD79a, VS38c, CD138 e CD38. No entanto, em contraste,
frequentemente, expressam CD19. A expressão do CD45 é variável com a
maioria das células de mieloma, sendo tipicamente CD45 negativas. Em média,
70% das células de mieloma irão expressar CD56, tipicamente negativo em
células plasmáticas normais e na Leucemia de Células Plasmáticas (159).
Não existe uma única anormalidade citogenética que seja típica ou
diagnóstica de MM, uma vez que a maioria dos tumores de mieloma apresenta
anormalidades genéticas que podem ser detectadas com técnicas genéticas
moleculares sensíveis, como a hibridização in situ por fluorescência (FISH)
(165).
O ensaio da cadeia leve livre (FLC) mede as cadeias de imunoglobulina
kappa e lambda, as quais não estão ligadas a cadeias pesadas no soro. A
relação FAP normal de kappa/lambda é de 0,26 a 1,65; já as razões anormais
de FLC são observadas em distúrbios de células plasmáticas clonais quando há
produção em excesso de um tipo de cadeia leve (kappa ou lambda) e
identificadas em aproximadamente 90% dos pacientes com MM (182).
Há pouco conhecimento sobre a incidência e os aspectos clínicos do MM
na América Latina. No Brasil, por exemplo, a incidência é praticamente
desconhecida, uma vez que a doença não aparece nas estimativas anuais
fornecidas pelo Instituto Nacional do Câncer-INCA (168).
Em estudo recente, foi observado o perfil do mieloma em 16 instituições
brasileiras. Dos 1.112 pacientes avaliados, no período de 1998 a 2004, 49,7%
dos casos eram referentes ao sexo feminino e 50,3%, ao sexo masculino, com
idade mediana de 60,5 anos, sendo que a maioria dos pacientes apresentava
doença avançada (169).
70
2.4.5. Doenças Linfoproliferativas Crônicas de Células T
2.4.5.1. Leucemia Prolinfocítica T (LPL-T)
A Leucemia Prolinfocítica de células T (LPL-T) é uma neoplasia de células
T rara que acomete cerca de 2% das leucemias linfocíticas maduras em adultos,
sendo composta por células linfoides T, com envolvimento do SP, MO, linfonodos
e baço. O nome "prolinfócitos", realmente, é incorreto, já que as células tumorais
são originadas de células T pós-tímicas nesta doença(92)
Trata-se de uma leucemia de células T altamente agressiva, com uma
sobrevida média inferior a um ano. Na apresentação, a LPL-T esporádica afeta
principalmente os idosos com idade média de 65 anos, e não foi relatado em
crianças ou adultos jovens. Há uma ligeira predominância masculina, com uma
relação masculino:feminino de 1,33 (187).
A maioria dos pacientes apresenta uma contagem sanguínea elevada
(tipicamente superior a 100.000/L leucócitos), hepatoesplenomegalia (75%),
linfadenopatia generalizada (50%). A anemia e trombocitopenia podem ser
observadas, mas são menos comuns do que na leucemia prolinfocítica de
células B (LPL-B). Adicionalmente a infiltração da pele e derrames serosos (a
exemplo da pleural) podem em aproximadamente 25% e 15% dos pacientes,
respectivamente O exame do SP demonstra uma predominância de células
linfóides de tamanho médio, com cromatina moderadamente condensada e um
nucléolo visível (171).
O núcleo pode ser redondo ou oval; já o citoplasma, geralmente, é
moderadamente abundante e ligeiramente basofílico, sem grânulos (172)
O diagnóstico de LPL-T, em geral, é feito por análise do SP e da MO
(biópsia e aspiração) e uma avaliação clínica apropriada. Quando avaliadas pela
CF, essas amostras demonstram um imunofenótipo de células T maduras. As
células expressam o CD52 (fortemente) e marcadores de células pan-T (CD2,
CD3 e CD7), bem como a superexpressão de TCL1(173).
Neste sentido, a desoxinucleotidil transferase terminal (TdT) não é
expressa enquanto o CD3 pode ser expresso na membrana celular em níveis
71
baixos ou altos. A expressão de CD4 e CD8, por sua vez, é variável: 60% dos
casos são CD4+/CD8-, 25% dos casos são duplo positivos (CD4+/CD8+), 15%
dos casos são CD4-/CD8+ e 1% é CD4-/CD8- (171).
2.4.5.2. Leucemia de Grandes Linfócitos Granulares (LGLG- T)
A Leucemia de Grande Linfócitos Granulares (LGLG) é uma doença
clonal, caracterizada por infiltração linfocítica do SP e MO, por linfócitos grandes
granulares (LGG) cursando com esplenomegalia e citopenias, mais comumente
a neutropenia (174).
O LGG é um subtipo linfóide morfologicamente distinto, maior do que a
maioria dos linfócitos circulantes, que apresenta grânulos azurofílicos
característicos, contendo hidrolases ácidas. Os LGG compreendem de 10% a
15% das células mononucleares do SP normal (174,175).
As LGLG surgem de duas linhagens principais: em média, 85% são
células T (CD3+/CD8+) correspondendo as células T citotóxicas de memória
efetoras ativadas por antígeno in vivo (LTCD8+), enquanto os 15% restantes são
células CD3-/ CD56+ e, portanto, células NK (176).
O termo LGLG foi proposto para este transtorno com base na
demonstração da invasão da MO, baço e fígado por celulas LGL, isto é, na
primeira prova de que as células foram expandidas clonalmente. Uma
subsequente classificação francesa-americana-britânica (FAB) reconheceu a
LGLG como um dos quatro subgrupos de Leucemias Linfóides de Células T
Crônicas e, em 1993, propôs-se que as LGLG pudessem ser classificadas em
células TCD8+ e células NK (191).
Em 2016, a classificação da OMS das neoplasias LGLG de células T e NK
maduras continua a distingui-las com base em suas características moleculares
e clínicas únicas, em uma entidade provisória do transtorno linfoproliferativo
crônico de células NK (também conhecida como linfocitose crônica de células
NK), assim, distinguindo-a da leucemia de células NK, que é muito mais
agressiva (195).
72
A LGLG de células T é responsável por uma média de 2% a 5% dos
distúrbios linfoproliferativos crônicos na América do Norte e até 6% na Ásia. A
incidência, nos EUA, foi estimada em cerca de 1 caso a cada 10 milhões de
pessoas (179). Quanto à idade mediana de início da LGLG-T, é de 60 anos (faixa
de 4 a 88), sem predileção masculina ou feminina. Apenas 10% dos pacientes
têm menos de 40 anos. Logo, a doença é rara em crianças (180).
Uma característica proeminente da LGLG-T é uma associação com outras
doenças em 40% dos casos, particularmente, a artrite reumatóide e outras
doenças hematológicas. Neste sentido, a LGLG-T também foi relatada em
pacientes com transtornos auto-imunes, como artrite reumatóide (AR) e
Síndrome de Sjögren. Raramente, os pacientes podem ter citopenias auto-
imunes (anemia hemolítica, aplasia pura de eritrócitos e trombocitopenia imune),
sendo a AR a doença mais comumente associada, ocorrendo em
aproximadamente 25% dos pacientes(181).
A maioria dos pacientes com LGLG-T apresentam sintomas relacionados
à neutropenia. A febre com infecções bacterianas recorrentes ocorre em 20% a
40% dos pacientes. As infecções, geralmente, envolvem áreas da pele,
orofaríngeas e periretais, mas também pode ocorrer sepse grave ou pneumonia.
Infecções oportunistas são incomuns. Assim sendo, aproximadamente um terço
dos pacientes sentem-se perfeitamente bem sem sintomas quando uma
contagem sanguínea de rotina revela uma citopenia, levando ao diagnóstico de
LGLG de células T(181).
Pacientes com a variável gamma/delta do receptor de células T (TCR) são
menos comuns do que as variáveis do TCR alfa/beta, porém têm um padrão
clínico semelhante(181).
A MO pode ser hipocelular, normocelular, ou ligeiramente hipercelular,
com fibrose de reticulina leve à moderada. Normalmente, há uma mudança na
maturação dos granulócitos para formas mais imaturas. Os GLGs monoclonais,
geralmente, representam menor de 50% das células nucleadas. Há infiltração
intersticial e/ou intrasinusoidal de células T clonais (malignas) com CD8
expresso, acompanhada de agregados linfáticos ou nódulos compostos por
células T e B reativas (policlonais) (182).
73
A LGLG-T mostra um fenótipo pós-tímico maduro, com certo grau de
heterogeneidade da membrana. A grande maioria expressa CD3, CD8, CD16,
CD57, CD45, CD2 e o receptor de células T (TCR) alfa/beta, porém não
expressam CD4, CD56, CD28 e o TCR ϒδ. Também, expressam
constitutivamente CD2, CD45RA e o receptor beta de IL-2 (p75, CD122), mas
não o receptor de IL-2 alfa (CD25). Ainda, a expressão dos marcadores CD5,
CD7, CD94. A presença de Granzima e Perfurina é variável, podendo estar
presente ou não. Algumas células expressam o antígeno CD4 com ou sem
coexpressão do CD8. Um fenótipo CD4-/CD8-, raramente, foi descrito (182).
2.4.5.3. Micose Fungoide/Síndrome de Sézary (SS)
Os linfomas cutâneos são proliferações linfocitárias malignas primárias da
pele. Ao contrário dos linfomas sistêmicos ou nodais, em que o linfócito B é mais
frequentemente envolvido, na pele, predominam os linfomas cutâneos de células
T (183).
A síndrome de Sézary (SS) e a Micose Fungóide (MF) são os subtipos
mais comuns de linfomas cutâneos. A MF é um LNH de células T maduras com
apresentação na pele, mas com potencial envolvimento do sangue e vísceras.
As lesões cutâneas incluem manchas, placas ou tumores, que podem ser
localizados ou difundidos, e eritrodermia (184).
A MF é um tipo específico de linfoma cutâneo, no qual é marcante o
epidermotrofismo. Acomete principalmente indivíduos entre 55 e 60 anos, com
predomínio do sexo masculino (184).
A SS é definida como uma forma eritrodérmica distinta, com envolvimento
leucêmico de células T malignas, considerada como uma evolução da MF. É
caracterizada pela tríade eritrodermia, linfoadenopatia generalizada e células T
neoplásicas (Células de Sézary) na pele, linfonodos e SP (185).
Trata-se de uma doença de adultos mais velhos, com poucos casos
relatados em pacientes com menos de 30 anos. Nos EUA, a incidência é maior
entre os brancos (0,36 casos por milhão de pessoas ao ano) do que entre os
negros (0,04 casos por milhão de pessoas ao ano). Assim, SS não é uma doença
74
hereditária. Logo, irmãos e filhos de pacientes portadores da doença não têm
um risco substancialmente aumentado de desenvolvê-la (186).
Pacientes com SS, comumente, apresentam eritrodermia e linfadenopatia
generalizada, desenvolvidas em semanas a meses. A pele é muitas vezes
pruriginosa, e a qualidade de vida do paciente pode ser profundamente afetada
(187).
Em 2007, o sistema de teste para MF e SS foi revisado a fim de incorporar
o envolvimento do sangue e uma definição padronizada de eritrodermia. Em
2011, foram publicadas novas revisões para o estadiamento do sangue e dos
linfonodos, as quais definem e padronizam a extensão extracutânea da doença.
Essas mudanças no estadiamento permitem avaliar os resultados em pacientes
com MF eritrodérmico separadamente daqueles de SS (188).
O SP de pacientes com SS é caracterizado por um grande número de
células mononucleares atípicas com núcleos moderados, com contorno nuclear
irregular (cerebriformes), denominadas células de Sézary, são células são
maiores do que o tamanho de um linfócito normal (em média, do mesmo tamanho
de um monócito normal) (189).
A utilização da CF para avaliar um subconjuntos de células T fornece um
meio objetivo, quantificável e reprodutível de identificar e rastrear o envolvimento
do sangue na SS (190).
As células tumorais são CD4 positivas e reconhecidas pela frequente
perda do CD26 em mais de 90% dos casos, bem como a perda de CD7 em cerca
de 50% dos casos (188). O imunofenotipo típico da população de células T de
SP anormais e caracterizada por: CD3+/CD4+ e CD3+/CD8-, CD2+/CD7-, CD5+,
CD26- e CD8-. Em alguns casos, a expressão de um fenótipo aberrante, ou seja,
perda de expressão de marcadores celulares presentes em linfócitos normais
como o CD2, CD3, CD4 ou CD5, contribui para o diagnóstico da doença (8)
embora a perda do CD7 não seja específica para os linfomas cutâneos, pois
podem ocorrer também em dermatoses inflamatórias benignas (186). O calculo
da relação CD4/CD8, também pode ser usada para determinar o status de
malignidade para fins de estadiamento e avaliação da resposta à terapia, sendo
em geral maior que 1:10 (190).
75
Atualmente, para o diagnóstico de síndrome de Sézary, a Sociedade
Internacional para linfomas cutâneos recomenda que haja um ou mais dos
seguintes critérios presentes em SP: demonstração de clonalidade das células
T por métodos moleculares ou citogenéticos e número absoluto de células de
Sézary circulantes igual ou superior a 1.000/L, ou presença de anormalidades
imunofenotípicas nas células T tais como relação CD4/CD8 ≥10, células
CD4+/CD7- ≥ 40%, célula CD4+/CD26- ≥ 30%, ou perda de um ou mais
antígenos de células T maduras tais como o CD3 ou CD5 (190).
2.4.5.4. Leucemia/Linfoma de Célula T do Adulto (LLTA)
O linfoma /leucemia de células T de adultos (LCTA), de acordo com a
classificação mais recente da OMS de neoplasmas linfoides, é definido como
uma neoplasia de células T periféricas associada à infecção pelo Vírus T-
Linfotrópico Humano, tipo I (HTLV-I) (191).
Embora seja considerada uma das variantes altamente agressivas do
LNH de células T (NHL), o curso da doença é variável e, às vezes, bastante
indolente. O vírus HTLV-I é transmitido principalmente pela amamentação, ainda
que a propagação via transfusão de sangue, compartilhamento de agulhas e
relações sexuais também ocorra (192).
A LCTA se desenvolve em cerca de 1% a 5% dos indivíduos soropositivos,
habitualmente, após mais de 2 décadas de persistência viral. Ocorre em adultos
com idade média de 55 anos, com discreta predominância em homens(191).
A incidência varia de acordo com a prevalência da infecção pelo HTLV-I
pela população. A infecção pelo HTLV-1 é endêmica em várias ilhas do sul do
Japão, na bacia do Caribe (por exemplo, Jamaica e Trinidad), África Ocidental,
Peru, Nordeste do Irã e parte Sudeste dos EUA. Os pacientes mais afetados
vivem ou se originam dessas áreas (193).
Uma vez que a LCTA está associada à infecção por HTLV-I, os pacientes
também estão em risco de desenvolver mielopatia associada ao HTLV-I,
igualmente conhecida como paraparesia espástica tropical (194). Quanto às
características clínicas da LCTA, elas incluem evidências de linfadenopatia
76
generalizada, hepatoesplenomegalia, imunossupressão, hipercalcemia, lesões
ósseas líticas e lesões cutâneas; podendo manifestar-se sob a forma de quatro
variantes clínicas: forma aguda (leucêmica), crônica, linfomatosa e indolente
(193).
A apresentação mais comum de LCTA, ocorrida em cerca de 60% dos
casos, é a variante aguda que tem um prognóstico pobre, com a sobrevivência
medida de meses a um ano, apesar do tratamento agressivo (195,196). Desta
forma, pacientes com a variante aguda de LCTA apresentam com maior
frequência sintomas sistêmicos: organomegalia, linfadenopatia, níveis elevados
de LDH e células malignas circulantes. A contagem de glóbulos brancos,
geralmente, é elevada e pode ser superior a 100.000/mm3(193).
A característica morfológica da LCTA é observada no SP de casos
leucêmicos. Nestes casos, podem ser encontrados linfócitos de tamanho médio,
com cromatina condensada e núcleos hiperlobados bizarros ("folha de trevo" ou
"células de flores"). Além disso, há uma pequena proporção de células tipo
explosão, com citoplasma profundamente basofílico (193).
Para fins de diagnóstico as células tumorais expressam antígenos
associados a células T (CD2, CD4 e CD5), podendo apresentar expressão de
CD3 fraca ou ausência do CD7. A maioria dos casos são CD4+/CD8-,
observando todavia casos raros CD4-/CD8+ ou CD4+/CD8+, enquanto o CD25
é expresso na maioria dos casos, assim como o CD52 e CD38. As variantes de
células grandes anaplásicas reagem com CD30, porém os imunofenotipos mais
comuns são CD4+, CD25+, CD7- e CD8-(197).
77
3 JUSTIFICATIVA
Devido à considerável complexidade do sistema imunológico, nãoé
surpreendente que os tumores originados nesses tecidos sejam numerosos e
complexos, sendo várias as tentativas de classificação destas entidades a
classificação da Organização Mundial de Saúde (OMS) para tumores dos tecidos
hematopoiéticos e linfóides tem sido recomendada. Essa classificação endossa
uma abordagem multiparamétrica para o diagnóstico, baseado em
características citomorfológicas de sangue periférico, aspirado de medula óssea
ou massa tumoral, anatomopatologicas, imunofenotípicas e genotípicas de cada
tumor.
Entretanto, não é necessário nem economicamente viável realizar
múltiplos estudos em cada caso isoladamente, atualmente a imunofenotipagem
por citometria de fluxo complementada pela citomorfologia convencional fornece
dados suficientes para diagnosticar e classificar a maioria desses cânceres
hematologicos.
A análise citomorfológica isolada, apesar de ser imprescindível, apresenta
limitações técnicas, com importante subjetividade, demandando profissionais
muito qualificados. A imunofenotipagem por citometria de fluxo é um método
confiável para avaliação quantitativa e qualitativa de células hematopoiéticas e
desempenha um papel cada vez mais importante no diagnóstico, classificação e
prognóstico dessas neoplasias, tornando o exame citomorfológico uma triagem
inicial ou método suplementar quando combinado com imunofenotipagem pela
citometria de fluxo, possibilitando o diagnóstico rápido, preciso e objetivo.
Diante da escassez de dados referentes ao diagnostico e classificação
das doenças linfoproliferativas crônicas por citometria de fluxo no Brasil, e
particularmente no Rio Grande do Norte, que justifica a realização deste estudo
quantitativo transversal pioneiro em nossa região.
78
4. OBJETIVOS
4.1. GERAL
Demonstrar a relevância da citometria de fluxo no diagnostico e
classificação das Doenças Linfoproliferativa Crônica (DLPC) em pacientes com
linfocitose periférica ou anormalidade citomorfológicas no sangue periférico e /
ou medula óssea.
4.2. ESPECÍFICOS
1. Propor a criação um painel de AcMo para o diagnóstico e classificação das
DLPC incluindo as discrasias de células plasmáticas( mieloma múltiplo e/ou
leucemia de células plasmáticas);
2. Implantar a técnica de investigação de monoclonalidade de células B, por
citometria de fluxo (teste kappa / lambda);
3. Criação no Hemocentro Dalton Cunha-HEMONORTE de um banco de
dadosde registro e classificação de portadores de doenças hematológicas
malignas, com finalidade diagnóstica, epidemiológica, pesquisa clínica e
controle de seguimento dos pacientes.
79
5. CASUÍSTICA E METODOLOGIA
5.1. Seleção das amostras de pacientes
A seleção dos pacientes para o estudo foi efetuada durante o período de
4 anos e 4 meses e realizada no Laboratório de Hematologia do Hemocentro
Dalton Cunha - HEMONORTE. O presente estudo foi submetido e aprovado pelo
Comitê de Ética do Hospital Universitário Onofre Lopes.
Critério de inclusão: Pacientes com linfocitose prolongada e ou alterações
citomorfológicas vistas em hemograma ou lâminas de medula óssea.
Critérios de exclusão: Pacientes com doenças hematológicas benignas e
pacientes que recusaram termo de consentimento livre esclarecido.
Foram coletadas amostras de 500 pacientes com histórico de linfocitose
(relativa e absoluta) persistente e ou alterações citomorfológicas no sangue
periférico ou medula óssea, sugestivas de uma neoplasia do sistema
linfohematopoético.
O diagnóstico dessas leucemias baseou-se em critérios clínicos e
laboratoriais. Estes últimos incluíam o hemograma, contagem de plaquetas e
imunofenotipagem celular por citometria de fluxo, com um painel de anticorpos
monoclonais para a caracterização de doenças linfoproliferativas crônicas
(Tabela 4).
Informações a respeito de procedência, sexo , idade e informações
clínicas dos pacientes foram obtidas no momento em que as amostras deram
entrada no Laboratório de Hematologia do HEMONORTE. Durante a coleta das
amostras foram anotados dados demográficos, clínicos e laboratoriais dos
pacientes ou por análises dos prontuários arquivados no arquivo médico do
HEMONORTE. Um modelo pré-definido para a coleta de dados incluiu etnia,
sexo, idade, dosagem de hemoglobina, contagem de plaquetas, leucometria
global e contagem diferencial dos leucócitos.
Em algumas patologias foi procedida paralelamente a coleta de aspirado
de medula óssea para análise citomorfológicas e exames de imunofenotipagem.
Para este procedimento foram incluídos pacientes com suspeita de mieloma
80
múltiplo (MM), leucemia de células vilosas (LCV), linfoma do manto (LM) e
Leucemia de Células T do Adulto (LLTA).
5.2. MÉTODO
5.2.1 Teste de viabilidade celular
Células mononucleares foram incubadas em solução de azul de trypan
(Merck, USA) a 0,5% em solução salina tamponada com fosfatos (PBS, pH 7,4)
(phosphate buffered saline, Sigma Chemical Co, ST. Luis, CA, USA), na
proporção de 9/1. Após homogeneização, a mistura foi observada ao
microscópio óptico com objetiva de 20x, sendo descartadas as amostras com
viabilidade inferior a 80%.
5.2.2. Hemograma e estudo citomorfológico
Sangue periférico dos pacientes foi coletado em frascos à vácuo marca
“vacutainer” com EDTA potássico para hemograma rotineiro.
Estudos citomorfológicas de distensão de SP e / ou MO dos pacientes foram
realizados após coloração pelo Leishman. As lâminas depois de coradas foram
examinadas no microscópio ótico, inicialmente com objetiva de 40 e,
posteriormente, com objetiva de 100.
Na avaliação morfológica de distensão do SP, procedeu-se a contagem
específica de leucócitos no sangue periférico, além das observações de
alterações morfológicas adicionais, tais como presença de células plasmáticas,
pro-linfócitos, restos nucleares e linfócitos vilosos, flower cells, linfócitos grandes
granulares dentre outras.
81
Parâmetros hematológicos tais como leucometria, determinação das
concentrações de hemoglobina e contagem de plaquetas foram realizada no
Analisador Hematológico (Micros 60-ABX, USA).
5.2.3. Imunofenotipagem
As amostras de sangue periférico ou de medula óssea foram submetidas a
imunofenotipagem por citometria de fluxo utilizando-se um painel de AcMo
diretamente conjugado com fluorocromos como o isotiocianato de fluoresceína
ou FITC do inglês fluoresceinisothiocyanatee / ou Phicoeritrina (PE) e / ou
proteína do chlorophyll de Peridinin (PerCP), correspondentes as fluorescências
verde, laranja e vermelha respectivamente, possibilitando a dupla ou tripla
marcação em uma única etapa.
Para análise de amostras procedentes de sangue periférico, utilizou-se a
mesma amostra colhida para o hemograma rotineiro, quando o material
analisado foi medula óssea, utilizou-se para tal, aspirado de medula óssea em
seringa previamente heparinizada (Liquemine-Roche).
A imunofenotipagem foi realizada por citometria de fluxo utilizando-se um
painel de anticorpos monoclonais (AcMo) (Becton Dickinson, San José CA, USA)
para DLPC (Tabela 4).
5.2.3.1 Marcação de Antígenos de Superfície
A reação de imunofluorescência foi realizada em 50 microlitros (μL) de
suspensão de células totais (MO e/ ou SP) previamente homogeneizadas, as
quais foram incubadas com 20 μL de AcMo específico por 30 minutos ao abrigo
da luz em temperatura ambiente. Após esta etapa, a suspensão celular foi
novamente homogeneizada e acrescentada à mesma cerca de 2 mililitros (mL)
de solução de lise, havendo nova incubação por mais 10 minutos no escuro à
temperatura ambiente. Após este período, a suspensão celular foi centrifugada
por 5 minutos a 1.500 rotações por minutos (RPM), o sobrenadante desprezado
e o sedimento ressuspenso em solução salina tamponada Ph 7,4 (PBS, Sigma
82
USA) e novamente centrifugado a 1.500 RPM por 5 minutos, sendo esta última
etapa repetida mais uma vez. Ao final desta etapa, o sedimento foi então
ressuspenso em 1mL de solução de PBS/ formaldeído a 0,5% (Formaldeído PA
/ Vetec, Brasil) e estocado ao abrigo da luz, sob refrigeração, até o momento da
análise. Para cada amostra foi utilizado um tubo controle de marcação
inespecífica, empregando-se para tal, imunoglobulina inespecífica conjugada ao
FITC, PE e Pcyp.
5.2.3.2. Investigação de cadeias leves das Imunoglobulinas
Para investigação das cadeias leves das imunoglobulinas (teste
procedeu-se inicialmente incubação da suspensão celular (50 L) em soro
bovino fetal diluído na concentração de 2% em PBS, por 20 minutos a 37ºC.
Após este procedimento, foi realizada uma lavagem da suspensão celular com
PBS, procedendo-se em seguida a incubação com os anticorpos anti e anti
de acordo com o procedimento da marcação de superfície anterioemnte descrito.
5.2.3.3. Marcação de antígenos intracitoplasmáticos e nucleares
Por se tratar de antígenos cujos epítopos se encontram localizados na
região intracelular (núcleo e citoplasma), foi necessária uma prévia
permeabilização celular, possibilitando dessa forma o acesso e reatividade dos
AcMo para os seguintes antígenos: TdT, ZAP-70, Perfurina, Granzima-B, TCL1
e Ciclina-D. Para este procedimento foi utilizado o protocolo, empregando
solução de lise (BectonDickinson´s FACS lysingsolution, San José CA, USA)
para a permeabilização celular previamente descrita na literatura.
Cerca de 50μL por tubo de amostra de SP e / ou MO previamente
homogeinizada foi incubada com solução de lise previamente diluída a 10% em
água destilada por 10 minutos à temperatura ambiente, seguido de uma
centrifugação a 1.500 rpm por 7 minutos, descarte do sobrenadante e
83
homogeneização do sedimento. Após ressuspender o sedimento em 2 mL de
solução de Tween-20 diluído a 0, 5% em PBS (Tween-20 / BHD, England), esta
mistura foi centrifugada 2 vezes a 1.500 RPM.
Após o descarte do sobrenadante, o sedimento foi homogeneizado e
adicionado sobre o mesmo 10μL do AcMo, seguida de uma incubação por 30
minutos à temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Após esta etapa, o
sedimento foi homogeneizado em 2 mL de PBS, seguida de centrifugação a
1.500 RPM por 5 minutos, desprezado o sobrenadante e o sedimento
ressuspendido e submetido a mais uma lavagem em PBS. Após o descarte do
sobrenadante, ao sedimento final foi adicionado 1 mL de solução de formaldeído
diluído a 1% em PBS e estocado na geladeira ao abrigo da luz até o momento
da leitura no citômetro de Fluxo.
Para investigação do ZAP70/PE este procedimento foi realizado
posteriomente a marcação de superfície para o CD19/ FICT e CD3/ PeCy5,
seguida do procedimento de marcação intracelular anteriormente descrito.
Para cada amostra foi utilizado um tubo controle de marcação
inespecífica, empregando-se para tal, imunoglobulina inespecífica conjugada ao
FITC diluída conforme as especificações do fabricante.
5.2.3.4. Leitura e Análises
As análises foram realizadas em um citometro de fluxo (FACScalibur da
Becton e Dickinson), utilizando-se o programa Cell Quest, com aquisição de
10.000 eventos, levando-se em conta os parâmetros Forward Scatter (FSC) em
escala linear que avalia o tamanho celular, Side Scatter (SSC) também em
escala linear, o qual avalia a complexidade e granulosidade celular, FL1, FL2 e
FL3 em escala logarítmica que detectam a fluorescência verde e laranja, ou seja,
a reação antígeno anticorpo conjugado ao FICT, PE e PerCP respectivamente.
Os resultados foram fornecidos na forma de histogramas em percentagens
da população celular com reação positiva ou negativa. Avaliação de intensidade
de expressão também foram devidamente observadas nos histogramas emitido
pelo citometro para posterior auxílio na interpretação dos resultados.
84
5.3. Exames adicionais
A sorologia para o Vírus Linfotrópico de Células T Humana foi realizada
em todos os casos de DLPC-T/NK, sendo reagente nos pacientes com LCTA.
Dosagem de Cálcio Sérico e Lactato Desidrogenase (LDH) foram
realizadas em todos os pacientes com LCTA, mostrando níveis elevados em
todos os casos.
Pesquisa de Beta2- microblobulina sérica e teste de imunofixação para
cadeis leves das imunoglobulinas e eletroforese de proteinas foi realizada em
nos casos de mieloma múltiplo e / ou leucemia de células plasmáticas.
Pacientes com imunofenotipagem sugestiva para LM e LF leucemizado
foram confirmados pela biopsia de linfonodo e pesquisa citogenética. Nos
pacientes com LCM leucemizado foi confirmado pela presença de t (11; 14) e t
(1;12) e LF leucemizado pela t (14;18) (q32;q21). Em todos os pacientes com
expressão leuçêmica de LNH ( Manto, Burkitt e Linfoma Flocular ) , foram
realizadas biópsias de linfonodos e estudo imunohistoquímico.
85
Tabela 4. Painel de Anticorpos monoclonais
Tube Nº
FICT
AcMo
PE
AcMo
PerCP
AcMo
Interpretação
01 IC/IgG1 IC/IgG1 IC/IgG1 Controle isotípico de marcação inespecífica
02 CD3 CD19 CD45 Distinção entre neoplasias T e B
03 CD4 CD8 CD3 Linfócitos T helper e citotóxico
04 CD3 CD16-56 CD45 Células T e Natural Killer
05 CD103 CD22 CD20 Distinguir neoplasia linfóide B. LCV CD103+/CD20+/CD22+
06 CD19 CD5 CD3 Distinguir neoplasia linfóide B. Leucemia Linfocítica Crônica: CD5+/CD19+
07 CD19 CD200 CD45 Distinguir neoplasia linfóide B. Leucemia Linfocítica Crônica: CD200+
08 FMC7 CD19 CD45 Distinguir neoplasia linfóide B. LLC: FMC7+/CD19+
09 TCR TCR CD3 Células T maduras, em associação com sCD3
10 CD10 CD19 CD45 Distinguir neoplasia linfóide B. Linfoma Folicular: CD10+/CD19+.
11 CD38 CD138 CD45 Identificação de Células Plasmáticas. Mieloma Múltiplo CD38+/CD138+
12 13 14 15
CD19 CD45RA CD45RO
IgM
CD79b CD19 CD19 IgD
CD45 CD3 CD3
CD19
Distinguir neoplasia linfóide B. Leucemia Linfocítica Crônica: CD79b-/+ Células B e T naive
Células B e T de memória Distinguir neoplasia linfóide B. Leucemia Linfocítica Crônica: IgM/IgD fraco
16 17 18
anti-CD2
HLADR
anti-CD7 CD25
CD19 CD3 CD3
Kappa/Lambda: restrição de cadeia leve das imunoglobulinas Distinguir neoplasia linfóide T. Sindrome de Sezary: CD7-
Células T ativadas
19 20 21 22 23
Perfurine D-Cycline
CD19
Granzime
nu TdT cyt TCL-1 cyt Zap-70
CD3
CD3
Grazimas e perfurinas: Células Citotóxicas Distinguir neoplasia linfóide B. Linfoma do manto: Ciclina D+ Terminal deoxinucleotidil Transferase: Células progenitoras
Neoplasias de Células T Marcador prognostico para leucemia linfocítica crônica
86
6. RESULTADOS
6.1. Classificação Imunológica
A Classificacão das DLPC determinda pelo resultado da imunofenotipagem
seguiram os criterios estabelecidos pelas tabelas 2, 3 e 4. Dos 500 pacientes com
DLPC analisados, 433 casos (86,6 %) foram catergorizados como DLPC de linfócitos
B (DLPC-B) e 67 (13,48%) de linfócitos T e células NK ou DLPC-T/NK (Tabela 5).
O diagnostico e classificação das DLPC-B foi baseado na reatividade das
células momonucleares aos vários AcMo direcionados a antígenso B relacionados
associados a forte expressão antigênica ao antígeno leucocitário Comum (CD45).
Adicionalmente aos resultados obtidos pela imunofenotipagem, a classificação deste
grupo de doenças foi complementada por uma avaliação citomorfologica de distensão
de SP e/ou aspirado de MO corados pelo MGG, constatando a presença de 279
pacientes com LLC-B, 17 LPL-B, 06 LCV, 03 LF leucemizado, 12 com LCM, 03 com
LELV, um caso com MW, 47 com MM, 12 LCP, 09 com LB leucemizado e por fim, 39
casos que classificados como DLPC-B não especificado, sendo categorizados como
linfomas não-Hodgkin em fase leucêmica (B cell- NHL) (Tabela 5).
O diagnostico e classificação das DLPC-T/NK foi baseada na forte expressão
antigênica ao CD45, negatividade ao CD1a e TdT, e reatividade a um ou mais
antígenos relacionados a linfócitosT e células NK, também complementada pela
análise citomorfologica de SP e / ou MO.
Neste Grupo, 10 Casos apresentaram caracteristicas citomorfologicas de
linfócitos grandes e granulares (LGL). O Padrão de imunofenotipagem destes 10
pacientes constatou-se a presenca de 10 casos de LGL-T (CD2+, CD3+, CD7+, CD5+,
CD8+, TCRa/b+, TCL-1+) e um caso LGL-NK (CD16+, CD56+, CD8+), constatando
também a expressão de Granzima e Perfurina nestes 10 casos. Observou-se também
a presença de 14 Casos de LPL-T, 10 casos de LCTA, 8 casos de SS/MF e 24 casos
de LCTP (Tabela 5).
87
6.2. Dados Demográficos
As Tabelas 8 e 9 mostram resumidamente os dados relacionados ao gênero e
faixa etária dos pacientes acometidos por DLPC-B e DLPC-T/NK respectivamente.
Do total dos 500 casos analisados, 52,39 % eram pacientes do sexo masculino
e 47,61 % do sexo feminino. Nas DLPC-B a distribuição dos casos em relação ao sexo
foi de 213 pacientes do sexo masculino e 185 do sexo feminino. Nas DLPC-BT/NK
constatou-se a presença de 28 homens e 34 mulheres.
Nas DLPC-B, a faixa etária variou de 05 a 100 anos. Nas LLC-B, a variação foi
de 46 a 94 anos com mediana de 62 anos. Na LPL-B observou-se variação de 51 a
100 anos e mediana de 76 anos. Na LCV e LCVv a faixa etária variou de 70 a 78 anos
com mediana de 67 anos e 70-78 anos com mediana de 76 anos respectivamente.
Nos únicos pacientes com LF leucemizado e MW constatou-se idade de 59 e71 anos
respecitvamente. No LCM a oscilação da faixa etária e mediana das idades foi de 50
a 88 anos e 77 anos respectivamente. O LELV observou-se variação da faixa etária
de 61 a 66 anos. No MM e MM/LCP observou-se variação da faixa etária de 44 a 100
anos e 60 a 100 respectivament e mediana de idade de 67 anos para ambas as
entidades. No LB leucemizado a faixa etára foi de 05 a 57 anos e mediana de idade
de 27 anos. Nos casos de LNH-Bleucemizado, observou-se variação de 44 a 100 anos
com mediana de 67 anos.
Nas DLPC-T/NK, a faixa etária variou de 30 a 89. Na LGL-T observou-se
vartiação de 30 a 77 anos e mediana de 63 anos, O paciente com LGL-NK tina idade
de 45 anos. Na LPL-T a variação da faixa etária foi de 35 a 73 anos com mediana de
idade de 58 anos. Nos pacientes com LCTA observou-se variação de 31 a 76 anos
com mediana de 35 anos. Na MF/SS constatou-se variação da faixa etária de 60 a 71
anos e mediana 68 anos. Nos casos de LCTP a faixa etária e mediana de idade dos
pacientes foi de 30 a 89 e 55 anos respectivamente.
88
6.3. Parâmetros hematológicos
Parâmetros hematológicos das DLPC-B também estão resumidas nas tabela 8,
constando de leucometria, contagem de absoluta de linfócitos, contagem de plaquetas
e dosagem de hemoglobina no sangue periférico.
Na LLC-B, a leucometria mostrou-se variável com contagens oscilando entre
6.9 e 420 x 109/L, com mediana de 64.0 x 109/L, leucometria ≤ 10 x 109 /L foi
constatada em 11 casos, variando entre 10 e 50 x 109/L em 172 casos e acima de 50
x 109/L em 64 casos. Valores da contagem global de linfócitos variaram entre 5.1 e
350 x 109/L, com mediana de 22 x 109/L, predominando casos com contagens
oscilando entre 10 até 50 x 109/L (n= 164), seguido por níveis de linfócitos acima de
50 x 109/L (n= 50) e inferior a 10 x 109/L (n=46). Na contagem de plaquetas
observaram-se contagens ≤ 100 x 109 /L em 16 casos, entre 100 e 150 x 109/L em 13
casos em 88 casos em acima de 150 x 109/L em 143 casos. Níveis de hemoglobina,
abaixo de 10g/dL foi observada em 33 casos, oscilando entre 10 e12 em 120 casos
maior que 12g/dL em 94 casos.
Nos pacientes com LPL-B, a leucometria variou de 10 à 50 x 109/L e acima de
50 x 109/L em 8 e 10 casos respectivamente.
Valores da contagem global de linfócitos e pro-linfócitos variaram entre 18.5 e
201.0 x 109/L, com mediana de 22 x 109/L, predominando casos com contagens
oscilando entre 10 até 50 x 109/L (n= 8), seguido por níveis de linfócitos acima de 50
x 109/L (n= 09). Nestas leucemias nestas, a contagem de pro-linfócitos estavam acima
de 55% em todos os casos. A contagem de plaquetas inferior a 100 x 109/L e oscilando
entre 100 a 150 x 109/L foi observada em 4 e 13 casos respectivamente. Observou-
se níveis de dosagem de hemoglobina abaixo de 10.0 g/dL, variando entre 10.0 e
12.0 g/dL e acima de 12.0 g/dL em 04, 10 e 03 casos respectivamente.
A LCv e LCVv cursaram com leucopenia e leucocitose respectivamente. Na
LCV a leucometria variou entre 2.000 a 4.500 x 109/L com media de 2.500 x 109/L. Na
LCVv, valores mínimo, máximo e mediana para este parâmetro foram de 14.7 x 109/L,
43.0 x 109/L and 22.0 x 109/L. A contagem global de linfócitos abaixo de 10 x 109/L e
variando entre 10.000 e 50.000 x 109 /L foi observada em todos os casos de LCV e
LCVv respectivamente. Contagem de plaquetas inferior a 100.x 109 /L foram
observados em todos os casos de LCV e LCVv. Níveis de hemoglobina abaixo de 10.0
89
g/dL e variando entre 10.0 e 12.0 g/dL foram observadas em 3 e 1 casos de LCV e
em 3 e 1 respectivamente.
O paciente com LF leucemizado, apresentou os seguintes parâmetros
hematológicos: leucometria na faixa de 10 à 50 x 109/L, contagem de linfócitos também
na faixa de 10 à 50 x 109/L, contagem de plaquetas acima de 150 x 109 /L e dosagem
de hemoglobina abaixo de10g/dL.
Os pacientes com LCM apresentaram hiperleucocitose (leucometria acima de
50 x 109/L) associada com contagem global de elevada linfócitos em todos os casos.
A contagem de plaquetas nas faixas de inferior a100 x 109 /L e acima de 150 x109 /L
foi observada em 3 e 11 casos respectivamente. Níveis de hemoglobina inferior
a10g/dL foi observada em 05 casos, 10-12 casos em 104 casos acima de 12g/dL em
05 casos.
Os dois pacientes com LECV apresentaram os seguintes parâmetros
hematológicos: leucometria na faixa de 10 à 50 x 109 /L, contagem global de linfócitos
também na faixa de 10 à 50 x 109 /L, contagem de plaquetas abaixo de 100 x 109 /L e
dosagem de hemoglobina inferior a10g/dL.
O paciente com MW apresentou os seguintes parâmetros hematológicos: WBC
e contagem absoluta de linfócitos acima de 50 x 109 /L, contagem de plaquetas dentro
dos limites de normalidade e dosagem de hemoglobina faixa de superior a 10.0 g/dL.
Os pacientes com MM apresentaram leucopenia e linfopenia em todos os
casos. Contagem de plaquetas abaixo de 100 x 109 /L foram observados em um
paciente, oscilando entre 100 a 150 x 109/L em 34 pacientes e acima de 150 x 109/L
em 03 casos. Níveis de hemoglobina abaixo de 10.0 g/dL e variando entre 10.0 e
12.0 g/dL foram observadas em 9 e 31 casos respectivamente.
Na variante leucêmica do MM (LCP), WBC abaixo de 10 x 109/L foi constatada
em 07 casos, entre 10 e 50 x 109/L em 06 casos e acima de 50 x 109 /L em um caso.
Contagem de linfócitos abaixo de 10 x 109/L foi observada em todos pacientes, sendo
observando entretanto a presença de células plasmáticas neoplásicas com contagem
mínima de 10% e máxima de 70%. Contagem de plaquetas abaixo de 100 x 109 /L
foram observados em 9 pacientes, oscilando entre 100 a 150 x 109/L em 03 pacientes
e acima de 150 x 109/L em 03 casos. Todos os pacientes apresentaram níveis de
hemoglobina abaixo de 10.0 g/dL.
90
Os pacientes com LB leucemizado apresentaram leucometria nas faixas de 10
a 50x109/L e acima de 50 109/L em 6 e 3 casos respectivamente acompanhada. de
contagens de linfócitos atípicos de 10 a 50 x 109/L e acima de 50 x 109/L também em
6 e 3 casos respectivamente. Contagem de plaquetas abaixo de 100 x 109/L foram
observados em todos os pacientes. A dosagem de hemoglobina abaixo de 10.0 g/dL
foi observada em todos os casos.
Nos pacientes com LNH-B leucemizados apresentaram leucometria nas faixas
de abaixo de 10 x 109/L e entre 10 a 50 x 109/L em 11 e 26 casos respectivamente. A
contagem de linfócitos abaixo de 10 x 109/L e variando entre 10.000 à 50.000 x 109/L
foi constatada em 17 e 20 casos respectivamente. A contagem de plaquetas inferior
a100 x 109/L foi observada em 6 pacientes, variando entre 100 a 150 x 109/L em 11
casos e acima de 150 x 109/L em 20 casos. Níveis de hemoglobina abaixo de 10.0
g/dL, variando entre 10.0 e 12.0 g/dL e acima de 12.0 g/dL foram detectados em 06,
19 e 12 casos respectivamente.
De acordo com os dados resumidos na tabela 9 dos pacientes com LGL-T, 8
apresentaram WBC nas faixas de abaixo de de 10 x 109/L e 2 na faixa de >10.0 a
50.0 x 109/L. A contagem de linfócitos na faixa de 10 x 109/L foi detectada em 3 casos,
na faixa acima de 10 a 50 x 109 /L em 6 casos e superior a 50 x 109/L em um caso. A
contagem de plaquetas abaixo de 100 x 109/L e acima 100 a 150 x 109/L foram
observadas em 4 casos cada e superior a 150 x 109/L em 2 pacientes.
Níveis de hemoglobina abaixo de 10.0 g/dL e variando entre 10.0 e 12.0 g/dL
foram detectados em 2 e 8 casos respectivamente.
O paciente com LGLG-NK apresentou os seguintes parâmetros hematológicos:
leucometria e contagem absoluta de linfócitos na faixa compreendida entre 10 a 50 x
109/L, contagem de plaquetas na faixa de superior a 100 a 150 x 109/L e dosagem de
hemoglobina acima de 10.0 g/dL.
Nos pacientes com LPL-T, a leucometria oscilou entre 10 a 50 x 109 /L e acima
de 50 x 109/L em 9 e 4 casos respectivamente. As contagens de linfócitos mostraram-
se nas faixas de 10 a 50 x 109/L e acima de 50 x 109/L em 12 e um caso
respectivamente. A contagem de plaquetas abaixo de 100 x 109/L e oscilando entre
100 a 150 x 109/L foi observada em 3 e 10 casos respectivamente. Observou-se níveis
de dosagem de hemoglobina abaixo de 10.0 g/dL, variando entre 10.0 a 12.0 g/dL e
acima de 12.0 g/dL em 4, 5 e 3 casos respectivamente.
91
Os pacientes com LCTA apresentaram leucometria variando na faixa de 10 -
50 x 109/L e acima de 50 x 109/L em 7 e um caso respectivamente, As contagens de
linfócitos mostraram-se nas faixas de 10 a 50 x 109 /L e acima de 50 x 109 /L em 7 e
um caso respectivamente. A contagem de plaquetas abaixo de 100 x 109/L foi
observada em um caso, entre 100 a 150 x 109/L em 6 casos e acima de 150 x 109/L
em um caso. Observou-se níveis de hemoglobina inferior a 10.0 g/dL, variando entre
10.0 a 12.0 g/dL e acima de 12.0 g/dL em 1, 5 e 2 casos respectivamente.
Os pacientes com MF/SS apresentaram nas faixas de WBC de 10 x 109/L e 10
a 50 x 109/L em 4 e 2 casos respectivamente. A contagem de linfócitos na faixa de 10
x 109/L e 10 a 50 x 109/L foram observada em 4 e um caso respectivamente. A
contagem de plaquetas na faixa de 100 a 150 x 109/L foi detectada em todos do
pacientes. Todos os pacientes apresentaram dosagem de hemoglobina entre 10.0 a
12.0 g/dL.
Nos pacientes com LCTP leucemizado apresentaram leucometria inferiores a
10 x 109/L e superior a 10 a 50 x 109/L em 5 e 17 casos respectivamente. A contagem
de linfócitos menor que 10 x 109/L e variando entre 10.000 à 50.000 x 109 /L foi
constatada em 17 e 5 casos respectivamente. A contagem de plaquetas nas faixas de
abaixo de 100 x 109 /L e acima de 100 to 150 x 109/L foram observadas em 9 e 13
casos respectivamente. Níveis de hemoglobina abaixo de 10.0 g/dL, variando entre
10.0 a 12.0 g/dL e acima de 12.0 g/dL foram detectados em 05, 04 e 13 casos
respectivamente.
6.4. Citomorfologia
Alterações citomorfológicas características de cada entidade observadas nas
análises de distensões sanguíneas de SP e/ ou MO coradas pelo MGG também foram
devidamente registradas.
A maioria das DLPC-B diagnosticadas foram categorizadas como LLC-B. Nas
análises citomorfológicas de distensão de SP dessa leucemia, observou-se
predomínio de linfócitos pequenos, com núcleo redondo, cromatina densa e
citoplasma escasso. A presença de restos celulares (manchas de Gumprecht) na
distensão de SP também foi um achado comum desta leucemia Figura 4.
92
Na LPL-B, observou-se contagem de pro-linfócitos 55%, caracterizadas como
células de tamanho médio, com diâmetro duas vezes maior que o pequeno linfócito
tipicamente observado na LLC-B. Nestas células, a cromatina nuclear apresenta-se
moderadamente condensada, com contorno nuclear uniforme e presença de um
nucléolo proeminente na região central. O citoplasma apresentou-se relativamente
escasso e levemente basofílico sem grânulos.
Na LCV e LCVv observou-se presença de linfócitos de tamanho intermédio ou
grande, com quantidades moderada de citoplasma pálido azul-acinzentado, com
bordas irregulares serreadas e com projeções citoplasmáticas delgadas em formato
de cabelo. O núcleo mostrou-se redondo, oval, em forma de ferradura ou ligeiramente
dobrado e, com frequência, tem localização excêntrica na maioria dos casos. A
cromatina mostrou distribuição uniforme, moderadamente grosseira ou pontilhada,
com presença de um ou mais nucléolos pequenos.
Os linfócitos do paciente com LF leucemizados, mostraram-se heterogêneos
de pequeno para médio tamanho, com núcleo de contorno irregular na maioria dos
casos.
Os linfócitos dos pacientes com LECV caracterizaram-se por apresentarem
projeções citoplasmáticas curtas em um polo da célula.
Os linfócitos observados nos pacientes com LCM caracterizam-se por
apresentarem um padrão heterogêneo de pequeno e médio, com núcleo de contornos
irregulares, cromatina frouxa e nucléolos pouco visíveis.
No paciente com MW, a distensão sanguínea apresentaram células atípicas
com morfologia linfo-plasmocitária.
No MM, a medula óssea, apresentou contagem de células plasmáticas
anormais 10%. Nos pacientes com a variante leucêmica desta entidade (MM/LCP)
observou-se presença destas células no SP.
No exame citológico do LB observaram-se presença de células atípicas, de
grande tamanho, citoplasma basofílico, vacuolado, núcleo redondo, cromatina frouxa
com nucléolos proeminentes, sendo também observada grande quantidade de
mitoses.
Na maioria dos pacientes com LNH-B leucemizado, observou-se linfócitos
atípicos com acentuado polimorfismo de forma e tamanho, com presença de células
93
de pequeno e médio tamanho, com núcleo de contornos irregulares, cromatina frouxa
e nucléolos pouco visíveis.
Alterações citomorfológicas de pacientes com DLPC-T/NK também foram
constatadas e devidamente registradas. Na LGLG apresentam-se no sangue
periférico de tamanho medio a grande com citoplasma abundante, levemente
basofílicos, contendo grânulos azurófilos, com núcleo periférico na maioria das vezes.
Nestes casos, o diagnostico diferencial entre LGLG-T e NK ocorreu após a
imunofenotipagem por CF. Figura 5.
Na LPL-T observaram-se células atípicas de tamanho médio e citoplasma
basofílico com "blebs" ou projeções ocasionais. O nucléolo é redondo ou oval algumas
com núcleo cerebriformes.
Na LCTA Os linfócitos apresentaram acentuado polimorfismo com núcleo
polilobulado característico com aspecto de trevo ou flor ("flower cell").
No sangue periférico dos pacientes com SS, observaram-se presença de
linfócitos atípicos de pequeno a médio tamanho, com núcleo irregular, algumas de
aspecto cerebriformes e nos pacientes com LCTP observou-se linfócitos com
apresentaram acentuado polimorfismo de forma e tamanho.
94
Table 5 - Subgrupos das Doenças Linfoproliferativas Crônicas neste estudo
Doenças Linfoproliferativas Crônicas Nº (%)
Total das Doenças Linfoproliferativas Crônicas de Células B 433 (86.6)
Leucemia Linfocítica Crônica (LLC)
Leucemia Prolinfocítica (LPL-B)
Leucemia de Célula Vilosa (LCV)
Leucemia de Célula Vilosa Variante (LCVv)
279 (55.8)
17 (03.4)
06 (01.2)
05 (01.0)
Linfoma Folicular (LF)
Linfoma de Célula do Manto (LCM)
Linfoma Esplênico com Linfócitos Vilosos (LELV)
Macroglobulinemia Waldstrom (MW)
03 (00.6)
12 (02.4)
03 (0.60)
01 (0.20)
Mieloma Múltiplo (MM)
Leucemia de Célula PLasmática (LCP)
47 (09.4)
12 (02.4)
Linfoma de Burkitt (LB)
Linfomas Não-Hodgkin em Fase Leucêmica (LNH-B) (*)
09 (01.8)
39 (07.8)
Total das Doenças Linfoproliferativas Crônicas de Células T e NK 67 (13.4)
Leucemia de Grande Linfócitos Granulares T (LGLG-T)
Leucemia de Grandes Linfócitos NK (LGL-NK)
Leucemia Prolinfocítica (LPL-T)
Leucemia/Linfoma da Célula T do Adulto (LLTA)
Síndrome de Sezary (SS)
Linfoma de Célula T Periférica (LCTP)
10 (02.0)
01 (0.20)
14 (02.8)
10 (02.0)
08 (01.6)
24 (04.8)
Total das Doenças Linfoproliferativas Crônicas 500 (100)
95
Tabela 6 - DLPC-B e a incidência do fenótipo detectado nas amostras e sua distribuição em subgrupos de acordo com o diagnóstico
Anticorpos
monoclonais
LLC N= 279
LPL-B N= 17
LCM n= 12
LF n= 03
LCV n= 06
LCVv n= 05
LELV n= 03
MW n= 01
MM n= 47
LCP n= 12
LB n= 09
LLNH-B n= 39
N+ (%) N+ (%) N+ (%) N+ (%) N+ (%) N+ (%) N+ (%) N+ (%) N+ (%) N+ (%) N+ (%) N+ (%)
CD10 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 03 (100) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 0 ( - ) 0 ( - )
CD11c 00 ( - ) 0 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 06 (100) 05 (100) 00 ( - ) 0 ( - ) Nr Nr nr nr
CD19 279 (100) 17 (100) 12 (100) 03 (100) 06 (100) 05 (100) 03 (100) 01 (100) 07 (14.9) 00 ( - ) 09 (100) 31 (79.5)
CD20* 125 (44.8) 15 (88.2) 12 (100) 03 (100) 06 (100) 05 (100) 03 (100) 01 (100) 02 (04.3) 00 ( - ) 09 (100) 27 (69.2) CD22* 256 (91.8) 15 (88.2) 12 (100) 03 (100) 06 (100) 05 (100) 02 (66.7) 01 (100) 00 ( - ) 00 ( - ) 09 (100) 27 (69.2)
CD23 261 (93.6) 03 (17.7) 06 (50.0) 03 (100) 01 (16.7) 01 (20.0) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 09 (23.1)
CD25 81 (29.0) 03 (17.7) 04 (33.3) 00 ( - ) 06 (100) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 10 (25.6)
CD38 60 (21.5) 03 (17.7) 09 (75) 00 ( - ) 06 (100) 05 (100) 00 ( - ) 00 ( - ) 47 (100) 12 (100) 09 (100) 17 (43.6)
CD21 68 (24.4) 17 (100) 10 (83.3) 03 (100) 06 (100) 05 (100) 03 (100) 01 (100) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 39 (100) CD79b* 30 (10.8) 17 (100) 12 (100) 03 (100) 06 (100) 05 (100) 03 (100) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) nr 35 (89.7)
CD103 00 ( - ) 0 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 06 (100) 03 (60) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - )
CD123 00 ( - ) 0 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 06 (100) 00 ( - ) 00 ( - ) 0 ( - ) Nr Nr nr nr CD138 00 ( - ) 0 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 47(100) 12 (100) 00 ( - ) 00 ( - )
CD200** 260 (93.2) 04 (23.5) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 01 (33.3) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) nr 00 ( - ) FMC7 12 (04.3) 13 (76.5) 12 (100) 06 (100) 06 (100) 05 (100) 03 (100) 01 (100) 0 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 39 (100)
HLADR 270 (96.8) 17 (100) 12 (100) 03 (100) 06 (100) 05 (100) 03 (100) 01 (100) 0 ( - ) 00 ( - ) 09 (100) 37 (94.9)
nuCiclina D1 00 ( - ) 00 ( - ) 12 (100) 00 ( - ) Nr nr np 00 ( - ) Nr Nr nr 00 ( - )
CD19+/CD5+ 253 (90.7) 12 (70.6) 08 (66.7) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 01 (2.1) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - )
CD19+/Zap-70+ 26 (09.3) 16 (94.1) nr nr Nr nr nr Nr Nr Nr nr nr CD16/56+ 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 47(100) 12 (100) 00 ( - ) 00 ( - )
sIgM+/sIgD+* 151 (54.1) 05 (29.4) 08 (66.7) 03 (100) 04 (66.7) 04 (80.0) 01 (33.3) 00 ( - ) Nr Nr 00 ( - ) 12 (30.8)
sIgM+/sIgD-* 62 (22.2) 03 (17.7) 00 ( - ) 00 ( - ) 02 (33.3) 01 (20.0) 00 ( - ) 01 (100) Nr Nr 09 (100) 08 (20.5)
sIgM-/sIgD+* 20 (07.2) 02 (11.8) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) Nr Nr 00 ( - ) 04 (10.3)
sIgM-/sIgD-* 46 (16.5) 07 (41.2) 01 (08.3) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) Nr Nr 00 ( - ) 15 (38.5) sIgG* 10 (03.6) 01 (05.9) 06 (50.0) 01 (33.3) 00 ( - ) 00 ( - ) 02 (66.7) 00 ( - ) Nr Nr 00 ( - ) 15 (38.5)
CD19/sIg+* 193 (69.2) 15 (88.2) 07 (58.3) 01 (33.3) 03 (50.0) 05 (100) 02 (66.7) 01 (100) Nr Nr 08 (88.9) 26 (66.7) CD19/sIg+* 70 (25.1) 02 (11.8) 05 (41.7) 02 (66.7) 03 (50.0) 00 ( - ) 01 (33.3) 00 ( - ) Nr Nr 01 (11.1) 06 (15.4)
CD19/sIg-/- 16 (05.7) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) Nr Nr 00 ( - ) 07 (18)
citIgH Nr Nr nr nr Nr nr nr 01 (100) 47(100) 12 (100) 09 (100) nr
CD45FORTE 279 (100) 17 (100) 12 (100) 03 (100) 06 (100) 05 (100) 03 (100) 01 (100) 00 ( - ) 00 ( - ) 09 (100) 39 (100)
Nota:(LLC)Leucemia Linfoc. Crônica; (LPL)Leuc. Prolinfocítica; (LCV) Leuc. de Cél. Vilosas; (LF)Linf. Folicular; (LCM)Linf. de Cél.do Manto; (LELV)Linf.Esplênico com Linfócitos Vilosos; (LB) Linf.
de Burkitt; (MW) Macroglobulinemia de Waldenstrom; (MM) Mieloma Múltiple; (LCP) Leuc. de Cél. Plasmáticas; (LLNH-B) Linf. Não-Hodgkin de Célula B nem fase leucêmica; (citIgH) Cadeia Pesada da
Ig Cit. (HLA-DR) MHC classe II; (sIg) Cadeia Leve da Igde Superfície kappa; (sIg) Cadeia Leve da Ig de Superfície lambda; (ZAP-70) ProteínaZeta-associada; (np) não realizada; (IgM) Imunoglobulina
IgM; (IgD) Imunoglobulina IgD; (IgG) Imunoglobulina IgG; (nu) Expressão Nuclear; (cit) Expressão Citoplasmática; (s) Expressão de Superfície; (*) Expressão Fraca na LLC; (**) Expressão Forte na LLC.
96
Table 7. Distribuição em subgrupos das DLPC-T e NKe a incidência do fenótipo
aberrante de acordo com o diagnóstico.
Anticorpos monoclonais
LGLG-T
N=10
LGLG-NK
N=01
LPL-T
n=14
LLTA
n=010
MF/SS
n=08
LPCT
n=24
N+ (%) N+ (%) N+ (%) N+ (%) N+ (%) N+ (%)
CD1a
CD2
00 ( - )
20 (86.9)
00 ( - )
01 (100)
00 ( - )
13 (92.9)
00 ( - )
04 (40)
00 ( - )
06 (75.0)
00 ( - )
20 (83.3)
CD3 10 (100) 00 ( - ) 14 (100) 10 (100) 08 (100) 23 (95.8)
CD7 10 (100) 00 ( - ) 14 (100) 02 (20.0) 00 ( - ) 23 (95.8)
CD25 02 (20.0) 00 ( - ) 06 (42.9) 10 (100) 00 ( - ) 08 (33.3)
CD3+/CD38+ 07 (70.0) 00 ( - ) 11 (78.6) 10 (100) 00 ( - ) 14 (58.3)
CD3+/HLA-DR+ 04 (40.0) 00 ( - ) 04 (28.6) 10 (100) 04 (50.0) 13 (54.2)
TCR α/β 10 (100) 00 ( - ) 09 (64.3) 10 (100) 08 (100) 22 (91.7)
TCR γ/δ 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 01 (04.2)
Granzima Bcit 10 (100) 01 (100) 01 (07.1) 00 ( - ) 00 ( - ) 09 (37.5)
Perforinacit 10 (100) 01 (100) 01 (07.1) 00 ( - ) 00 ( - ) 09 (37.5)
TCL-1cit 07 (70.0) 00 ( - ) 10 (71.4) 10 (100) 08 (100) 24 (100)
CD3+/CD4+ 00 ( - ) 00 ( - ) 07 (50.0) 10 (100) 08 (100) 16 (66.7)
CD5+/CD19- 09 (90.0) 00 ( - ) 14 (100) 10 (100) 07 (87.5) 23 (95.8)
CD3+/CD8+ 10 (100) 00 ( - )* 06 (42.9) 00 ( - ) 00 ( - ) 15 (62.5)
CD3+/CD4+/CD8+ 01 (10.0) 00 ( - )* 05 (35.7) 00 ( - ) 00 ( - ) 05 (20.8)
CD4-/CD8- 00 ( - ) 00 ( - )* 02 (14.3) 00 ( - ) 00 ( - ) 01 (04.2)
CD16-56 00 ( - ) 01 (100) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - )
CD3+/CD16-56+ 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 01 (04.2)
CD45FORTE 10 (100) 00 ( - ) 14 (100) 10 (100) 08 (100) 24 (100)
CD45FRACO 00 ( - ) 01(100) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - )
TdTnu 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - )
Nota:(LGLG-T) Leucemia de Grandes Linfócitos Granulares de Células T; (LGLG-NK) Leucemia de Grandes Linfócitos
Granulares de Células NK; (LLTA) Linfoma/Leucemia de Células T do Adulto; (LPL-T) Leucemia Prolinfocítica de Células
T; (SS) Síndrome de Sézary; (LPCT) Linfoma Periférico de Células T; (FORTE) Expressão Forte; (FRACA) Expressão Fraca;
(nu) Expressão Nuclear; (cit) Expressão Citoplasmática; (S) Expressão da Superfície; (TCL-1) Leucemia de células
T/Proteína 1A; (HLA-DR) MHC classe II.
97
Table 8- Dados demográficos e laboratoriais de acordo com os subrupos das DLPC-B
DADOS LLC
N= 279 LPL-B N= 17
LCV N= 06
LCVv N= 05
LF N= 03
LCM N= 12
LELV N= 03
MW N= 01
MM N= 47
LCP N= 12
LB N= 09
NLNH N= 39
Idade Min – Max (Média)
48 - 94 (64) 51 - 100 (67) 50 - 78 (67) 70 - 78 (73) 59 - 79 50 - 89
(67) 64 71 44 - 100 (67) 60 - 100 (67) 05 - 57 (27) 36 - 87 (60)
Nº (%) Nº (%) Nº (%) Nº (%) Nº (%) Nº (%) Nº (%) Nº (%) Nº (%) Nº (%) Nº (%) Nº (%)
Masculino Feminino
155 (55.6) 124 (44.4)
11 (64.7) 06 (35.3)
003 (50.0) 003 (50.0)
002 (40.0) 003 (60.0)
02 (66.7) 01 (33.3)
09 (75.0) 03 (25.0)
02 (66.7) 01 (33.3)
( - ) 01 (100)
17 (36.2) 30 (63.8)
02 (16.7) 10 (83.3)
09 (100) ( - )
23(59.0) 16 (41.0)
WBC (x 109/L) ≤ 10
>10 - 50 > 50
011 (03.9) 190 (68.1) 078 (28)
( - )
007 (41.2) 010 (58.8)
006 (100)
( - ) ( - )
( - )
004 (80.0) 001 (20.0)
( - )
001 (33.3) 002 (66.7)
( - )
001 (08.3) 011 (91.7)
( - )
003 (100) ( - )
( - ) ( - )
01 (100)
047 (100)
( - ) ( - )
007 (58.3) 002 (16.7) 003 (25.0)
( - )
006 (66.7) 003 (33.3)
013 (33.3) 026 (66.7)
( - )
Linf (x 109/L) ≤ 10
>10- 50 > 50
038 (13.6) 186 (66.7) 055 (19.7)
( - )
008 (47.1) 009 (52.9)
006 (100)
( - ) ( - )
( - )
004 (80.0) 001 (20.0)
( - )
003 (100) ( - )
( - )
007 (58.3) 005 (41.7)
( - )
003 (100) ( - )
( - ) ( - )
01 (100)
047 (100)
( - ) ( - )
012 (100)
( - ) ( - )
( - )
006 (66.7) 003 (33.3)
019 (48.7) 020 (51.3)
( - )
Plaq(×109/L) ≤100
>100 - 150 >150
017 (06,1) 088 (31,5) 174 (62,4)
004 (23.5) 013 (76.5)
( - )
006 (100)
( - ) ( - )
005 (100)
( - ) ( - )
( - ) ( - )
003 (100)
003 (25.0) 001 (83.3) 008 (66.7)
003 (100)
( - ) ( - )
( - ) ( - )
01 (100)
001 (02.2) 039 (83.0) 007 (14.8)
004 (33.3) 003 (25.0) 005 (41.7)
009 (100)
( - ) ( - )
008 (20.5) 011 (28.2) 020 (51.3)
Hb (g/dL) ≤10.0
>10.0 – 12.0 >12.0
044 (15,8)
146 (52.3) 089 (31.9)
004 (23.5)
010 (58.8) 003 (17.7)
005 (85.3)
001 (16.7) ( - )
001 (20.0)
004 (80.0) ( - )
001 (33.3)
002 (66.7) ( - )
006 (50.0)
004 (33.3) 002 (16.7)
001 (33.3)
002 (66.7) ( - )
( - )
01 (100) ( - )
017 (36.2)
030 (63.8) ( - )
012 (100)
( - ) ( - )
009 (100)
( - ) ( - )
008 (20.5)
019 (48.7) 012 (30.8)
Nota: (LLC) Leucemia Linfocítica Crônica; (LPL) Leucemia Prolinfocítica; (LCV) Leucemia de Células Vilosas; (LF) Linfoma Folicular; (LCM) Linfoma de Células do
Manto; (LELV) Linfoma Esplênico com Linfócitos Vilosos; (LB) Linfoma de Burkitt; (MW) Macroglobulinemia de Waldenstrom; (MM) Mieloma Múltiplo; (LCP)
Leucemia de Células Plasmáticas; (LLNH-B) Linfoma não Hodgkin de Células B não especificado em fase leucêmica; (WBC) glóbulo branco; (Linf) Contagem de
linfócitos periféricos; (Plaq) Contagem de plaquetas; (Hb) Dosagem de hemoglobina.
98
Tabela 9 - Dados demográficos e laboratoriais de acordo com os subrupos das DLPC-T
DADOS LGLG-T
N=10
LGLG-NK
N=01
LPL-T
N=14
LLTA
N=10
MF/SS
N=08
LPCT
N=24
Idade
Min -
Max(Med)
30 - 77 (63)
45
35 - 73 (58)
31 - 76 (35)
60 - 71 (68)
30 - 89 (55)
Nº (%) Nº (%) Nº (%) Nº (%) Nº (%) Nº (%)
Masculino
Feminino
005 (50.0)
005 (50.0)
( - )
001 (100)
008 (57.1)
006 (42.9)
004 (40.0)
006 (60.0)
003 (37.5)
005 (62.5)
011 (45.8)
013 (54.2)
WBC (x 109/L)
≤ 10
>10 - 50
> 50
( - )
008 (80.0)
002 (20.0)
( - )
001 (100)
( - )
( - )
010 (71.4)
004 (28.6)
( - )
08 (80.0)
02 (20.0)
006 (75.0)
002 (25.0)
( - )
018 (75.0)
006 (25.0)
( - )
Linf (x 109/L)
≤ 10
>10- 50
> 50
003 (30.0)
006 (60.0)
001 (10.0)
( - )
001 (100)
( - )
( - )
012 (85.7)
002 (14.3)
00 ( - )
008 (80.0)
002 (20.0)
004 (50.0)
004 (50.0)
( - )
018 (75.0)
006 (25.0)
( - )
Plaq (×109/L)
≤ 100
>100 - 150
>150
004 (40.0)
004 (40.0)
002 (20.0)
( - )
001 (100)
( - )
004 (28.6)
010 (71.4)
( - )
001 (10.0)
002 (20.0)
007 (70.0)
( - )
008 (100)
( - )
011 (45.8)
013 (54.2)
( - )
Hb (g/dL)
≤10.0
>10.0 – 12.0
>12
003 (30.0)
007 (70.0)
( - )
001 (100)
( - )
( - )
004 (28.6)
005 (35.7)
005 (35.7)
002 (20.0)
006 (60.0)
002 (20.0)
( - )
008 (100)
( - )
006 (25.0)
007 (29.2)
011 (45.8)
Nota: (LGLG-T) Leuc. de Grandes Linfóc. Gran. de células T; (LGLG-NK) Leuc. de Grandes Linfócitos Gran. NK; (LLTA) Leuc. de Cél. T do Adulto; (LPL-T) Leuc. Prolinf. T; (SS) Sínd. de Sézary; (LPCT) Linf. Perif. T; (WBC) glóbulo branco; (Lin) Contagem de linfócitos periféricos; (Plaq) Contagem de plaquetas; (Hb) Dosagem de hemoglobina.
99
Figura 4 - Citomorfologia de células sanguíneas de algumas Doenças Linfoproliferativas Crônicas de células B. Nota: A) Leucemia linfocítica crônica (LLC); B) Leucemia Prolinfocítica de Célula B (LPL-B); C) Leucemia de Células Vilosas (LCV); D) Linfoma Splênico com Linfócitos Vilosos (LELV).
A) LLC
B) LPL-B
A) LCV
D) LELV
100
Figure 5- Citomorfologia de células sanguíneas de algumas Doenças Linfoproliferativas Crônicas de células T. Nota:A) Leucemia de Grandes Linfócitos Granulares de células T (LGLGL); B) Leucemia Prolinfocítica de células T (T-PLL); C) Linfoma/Leucemia de células T do Adulto (LLTA); D) Síndrome de Sézary (SS).
A) LGLG-T
B) LPL-T
C) LLTA
D) SS
101
Figura 6. Dot Plot representativo dos fenótipos das Doenças Linfoproliferativas Crônicas B. Painel A mostra Leucemia Linfocítica Crônica: CD19+/CD5+, CD19+/CD200+, CD23+/FMC7- e CD19+/CD79b-. Painel B mostra Linfoma de Célula do Manto: CD19+/CD5+, CD19+/CD200-, CD22+/CD20+ e Ciclina D1+. Painel C mostra Linfoma Folicular: CD19+/CD5-, CD20+/CD10+, CD19+/FMC7+, CD19+/CD79b+. Painel D mostra Leucemia de Células Vilosas: CD22+/CD103+, CD19+/CDFMC7+, CD19+/200- e CD19+/CD79b+.
A) Leucemia Linfocítica Crônica
B) Linfoma doManto
C) Linfoma Folicular
D) LCV
102
Figura 7. Dot Plot representativo do fenótipo das Doenças Linfoproliferativas Crônicas T. Painel A mostra Leucemia/Linfoma de Grandes Linfócitos Granulares T: expressão de antígenos Pan-
T (CD3+/CD2+/CD7+),CD3+/CD8+ ae Granzima-B+. Painel B mostra Leucemia/Linfoma de Célula T
do Adulto: CD3+/CD19-, CD3+/CD4+, CD2+/CD7+ e CD3+/CD8-. Painel C mostra Leucemia
Prolinfocítica T: CD2+/CD7+, CD3+/CD4+, célula T duplo positiva ou CD4+/CD8+ e CD3+/CD8+.
Painel D mostra Síndrome de Sézary: CD5+/CD19-, CD4+/CD8-, CD2+/CD7- e Receptor de Célula T
A) Leucemia/Linfoma de Grande Linfócitos Granulares T
D) Síndrome de Sézary
B) Leucemia de Célula T do Adulto
C) Leucemia Prolinfocítica T
131
Figura 8 – Doenças Linfoproliferativas crônicas – Neoplasias B e Neoplasias T
Figura 9 – Distribuições de neoplasias
132
Figura 10 – Doenças linfoproliferativas crônicas B - LLC
Figura 11 – Doencas linfoproliferativas crônicas B – LPL-B
133
Figura 12 - Doencas linfoproliferativas crônicas B – LCM
Figura 13 - Doencas linfoproliferativas crônicas B – LF
134
Figura 14 - Doencas linfoproliferativas crônicas B – LNH – Fase leucêmica
Figura 15 - Doencas linfoproliferativas crônicas B – LCV
135
Figura 16 - Doencas linfoproliferativas crônicas B – LCVv
Figura 17 - Doencas linfoproliferativas crônicas B – LELV
136
Figura 18 - Doencas linfoproliferativas crônicas B – MW
Figura 19 - Doencas linfoproliferativas crônicas B – MM
137
Figura 20 - Doencas linfoproliferativas crônicas B – LCP
Figura 21 - Doencas linfoproliferativas crônicas B - LB
138
Figura 22 - Doencas linfoproliferativas crônicas T – LPL-T
Figura 23 - Doencas linfoproliferativas crônicas T – LGLG-T
139
Figura 24 - Doencas linfoproliferativas crônicas T – LGLG-NK
Figura 25 - Doencas linfoproliferativas crônicas T-LCTA
140
Figura 26 - Doencas linfoproliferativas crônicas T – SS
Figura 27 - Doencas linfoproliferativas crônicas T - LCTP
141
7 . DISCUSSÃO
O diagnóstico e a classificação das DLPC são fundamentais para a
estratificação dos pacientes, avaliação de risco e planejamento do tratamento. Um
diagnóstico preciso dessas doenças apresenta inúmeros desafios que só pode ser
alcançado por uma abordagem diagnóstica combinatória envolvendo o exame
citomorfológico.
A analise citogenética é de difícil realização nesses casos devido a
dificuldades de padronização metodologica de cultivo e indução de ploriferação das
células tumorias, enquanto a morfologia isoladamente pode fornecer uma triagem
diagnóstica, mas não pode definir com precisão o tipo de DLPC . O desempenho da
imunofenotipagem por CF foi crucial no diagnóstico e classificação dessas doenças.
Adicionalmente, a expressão de determinados marcadores celulares tem papel
relevante na avaliação prognóstica e monitoramento desenvolvimento da doença após
a terapia (28,34).
Cerca de 80% e 85% das DLPC são originários de células B, sendo as
procedentes de células T ou NK mais raramente observadas. No presente estudo,
86,6%, 13,2% e 0,20% dos casos foram classificados como de origem de células B, T
e NK, respectivamente, corroborando os relatos da literatura (Tabela 5) Figura
8(8,198).
Nas DLPC-B, a imunofenotipagem da FC deve inicialmente estabelecer a
natureza neoplásica pela determinação da restrição clonal, revelando o predomíneo
de expressão de um tipo de cadeias leve das imunoglobulina associada à expressão
de marcadores pan- B diferenciando de uma linfocitose reacional (benigna) cuja
relação kappa/lambda oscila emtorno de de 2:1 a 3: 1. Nas DLPC-B, observa-se
predomíneo de clones com de um tipo de cadeia leve de imunoglobulina ( ou ) em
uma relação em geral acima de 1/10. No entanto, a restrição apenas de cadeias leves
não deve ser considerada neoplásica, e o resultado deve sempre ser interpretado em
conjunto com dados clínicos e hematológicos, bem como com outros achados de
imunofenotipagem Figura 6 (34).
No presente estudo, diferentes combinações de AcMo tais com como
142
CD3/CD19/CD45; CD5/CD23/CD19; CD200/CD79b/CD19; FMC7/CD23/CD19,
CD103/CD22/CD20 e CD19/sIg/sIg, possibilitaram a identificação de fenótipos
aberrantes de células B neoplásicas em quase todos os casos (Tabela 4) Figura 9.
A leucemia linfocítica crônica de células B (LLC-B) é a mais comum de todas
as DCP, ocorrendo com maior incidência em indivíduos do sexo masculino. A média
de idade dos pacientes ao diagnóstico é de 65 anos sendo é rara em pessoas com
idade inferior aos 50 anos. O diagnóstico laboratorial da LLC é estabelecido pela
presença de linfocitose absoluta persistente (superior a 5.000/mL), com tendência a
aumentar com a progressão da doença. Os linfócitos leucêmicos são
morfologicamente homogenos de pequeno tamanho e de aspecto maduro,presença
de fragmentos de núcleo são comumente observadas nestas doenças (manchas de
Gumprecht). Aproximadamente 20% dos pacientes apresentam anemia ou
trombocitopenia em dados da literatura , os quais observamos no estudo presente.
Figura 10(50,65).
No presente estudo, a LLC-B representou 55,8% de todos os pacientes
investigados (n=500), com predomínio do sexo masculino e idade média de 64 anos
(Tabela 4). Em relação aos parâmetros hematológicos, encontramos uma contagem
de linfócitos acima de 5.000/L em todos os casos, com a maior incidência variando
de 10.0 a 50.0/L, compatível com os resultados observados em outros centros. A
incidência de anemia (Hb inferior a10,0 g/dL) e trombocitopenia (menor que100,0/L)
foi de 15,8% e 6,1%, respectivamente, menor que a descrita na literatura (Tabela 7).
Isso provavelmente ocorreu devido à alta incidência de pacientes com LLC-B,
assintomáticos, diagnosticados precocemente pela presença de linfocitose por exame
hematológico de rotina(50).
O diagnóstico laboratorial da LLC-B geralmente é evidenciado quando a
população de celulas leucêmicas apresenta as seguintes características de
imunofenotipagem: Linfócitos maduros com alta expressão antigênica para o CD5 e
CD23, fraca expresssão ou ausência de CD22 e de imunoglobulina monoclonal de
superfície (sgIs) geralmente IgM e/ou IgD, associado à falta de expressão de FMC7,
CD10, CD103 ou CD79b. A expressão forte de CD200, que geralmente é positiva, é
importante no diagnóstico diferencial de outras DLPC-B/CD5+, particularmente no
linfoma de células do manto leucemizado (LCM), onde este marcador é negativo ou
143
fracamente expresso (199).
Em 1994, Matutes propôs um sistema de pontuação baseado na avaliação
de 5 parâmetros de imunofenotipagem para o diagnostico diferencial a LLC-B: CD5,
CD23, FMC7, intensidade de marcação dos linfócitos em cadeias leves de
imunoglobulina além da expressão do CD22 e CD79b. A pontuação acima de 3
caracteriza a LLC-B típica, até 3 LLC-B atípica e entre zero e 2 excluiria o diagnóstico
dessa leucemia (24). Os problemas surgem quando se lida com imunofenótipos não
característicos, envolvendo escores de 3. Casos atípicos especiais seriam os que não
apresentavam sIg, CD5 e CD23 ou expressão forte e/ou moderada de CD20, CD22 e
CD79b (200).
Do ponto de vista prático, a imunofenotipagem também deve ser capaz de
distinguir a LLC-B de outras DLPC-B, especialmente aquelas com diferentes fatores
prognósticos ou modalidades terapêuticas, tais como LPL-B, LCM, LF, LCV, LELV,
MW, MM, LB e LNH-B não especificado (201).
No presente estudo nosso painel de MoAbs foi capaz de diagnosticar LLC-B
típica com CD23, CD200, e CD19+/CD5+ fortemente expressos associados com a
expressão negativa de FMC7 na maioria dos casos diagnosticados, sendo tambem a
caracteização de casos de LLC-B atípicas com a expressão do FMC7 e CD79b em
4,3% e 10,7% dos casos respectivamente, negatividade ao CD5, CD23, IgM/IgD e
cadeias leves em 10%, 6,5%, 16,5% e 5,7% de casos, respectivamente. Finalmente,
outros marcadores celulares, como CD21 e HLA-Dr, foram detectados em 24,3% e
96% dos casos, respectivamente (Tabela 5).
O comportamento clínico dos pacientes com LLC-B é heterogêneo. Enquanto
alguns pacientes têm doença indolente e não apresentam complicações relacionadas
à doença há muitos anos, outros desenvolvem doença progressiva e ou sintomática
requerendo terapia após o diagnóstico. A definição de marcadores celulares que
possam estratificar os pacientes de forma confiável em grupos com baixo risco ou alto
risco pode facilitar estudos clínicos que avaliem o benefício potencial do tratamento
precoce. Vários desses marcadores celulares podem ser determinados pela CF, que
pode ser incorporada ao painel de AcMo para o diagnóstico de LLC-B, com destaque
para o CD38, ZAP-70 e p53 (45).
A expressão de genes da região variável da cadeia pesada de imunoglobulina
144
(IgVH) prediz comportamento clínico mais agressivo, estando associada assim como
a expressão do CD38 a da proteína ZAP-70 sendo esses marcadores incluídos em
nosso painel de MoAbs (Tabela 3).
O CD38 é uma glicoproteína transmembranar do tipo II de 46 kDa expressa
na superficie de células hematopoiéticas e não hematopoiéticas, stando associada a
proliferação e ativação celular. Na LLC, a expressão elevada de CD38 também está
relacionada a vários outros fatores prognósticos adversos tais como estágio avançado
da doença, maior incidência de linfadenopatia, alto risco, menor tempo de duplicação
de linfócitos (TLD) e pior resposta à terapia (202).
O ZAP-70 é um membro da família da proteína tirosina quinase Syk-ZAP-70.
É expresso por células T normais e células natural killer e desempenha um papel
crítico no desenvolvimento e diferenciação destes tipos de células, não sendo
expresso em linfócitos B normais podendo ser detectada em células leucêmicas da
LLC-B. Foi sugerido que a expressão de ZAP-70 não só poderia apenas prever o
status mutacional IgVH, mas também servir como um fator prognóstico para esta
leucemia (203).
Alterações envolvendo o braço curto do cromossomo 17 (17p13.1) durante a
progressão da LLC-B tem sido relatadas (17, 19).
Nessa região cromossômica esta alocado o gene supressor de tumoral
TP53, um fator importante na evolução dessa leucemia (28).
O seu produto de transcrição é uma proteína de 53 Kd de 393 aminoácidos
(proteina p53 ou p53) que atua como um fator de transcrição multifuncional estando
envolvida na parada, diferenciação, reparo do DNA e estabilidade genômica do ciclo
celular(72)
Mutações gene TP53 desempenham um papel importante no início e / ou
progressão da doença numa variedade de cânceres humanos, incluindo malignidades
linfoides tais como LLC-B, estando tambem associados à progressão da doença e
resistência ao tratamento(72).
Mutações do gene TP53 levam ao acúmulo de proteina p53 anormal (não
funcional) no núcleo das células neoplásicas a qual pode ser detectada por métodos
145
imunológicos em contraste com a p53 normal do tipo selvagem, que não pode ser
detectada por tais métodos devido à sua curta vida útil. Existem vários AcMo que
podem ser usados para estimar a expressão anormal do p53, que pode o western
blotting, imuno-histoquímica ou CF. O método da FC é uma técnica simples que pode
ser usada rotineiramente e incorporada nos ensaios clínicos da LLC , mas este
marcador não foi utilizado no presente estudo (199).
A leucemia prolinfocítica de células B (LPL-B) é uma DLPC-B rara que é
definida pela proliferação no sangue periferico de células atipicas com características
morfológicas de prolinfócitos de natureza clonal, que afetam exclusivamente
indivíduos adultos, geralmente acima dos 60 anos de idade com predomínio em
homens. A LPL-B é a leucemia que apresenta o pior prognóstico entre as DLPC-B
com uma sobrevivencia média de um ano após o diagnostico. A contagem de
leucócitos geralmente excede 100.000/L, sendo a análise de distensão de SP e / ou
MO é o principal exame para o diagnóstico diferencial com um percentual de
prolinfócitos suprior a 55%, geralmente acima de 70%. Os prolinfócitos circulantes têm
um fenótipo de célula B clonal madura, incluindo forte expressão de CD19, CD20,
CD22, CD79b e FMC7 associada a forte expressão de imunoglobulina de superfície,
enquanto a expressão de CD5 ou CD23 pode mostra-se presente em pequenos
numero de casos. As cadeias pesadas de Ig predominantes expressas são IgM e / ou
IgD, mas uma minoria dos casos é IgG ou IgA . Tanto o CD38 como o ZAP-70 são
comumente expressos. Figura 11 (204).
Os prolinfócitos circulantes têm um fenótipo de célula B clonal madura,
incluindo forte expressão de CD19, CD20, CD22, CD79b e FMC7 associada a forte
expressão de imunoglobulina de superfície, enquanto a expressão de CD5 ou CD23
pode mostra-se presente em pequenos número de casos. As cadeias pesadas de Ig
predominantes expressas são IgM e / ou IgD, mas uma minoria dos casos é IgG ou
IgA (11, 30). Tanto o CD38 como o ZAP-70 é comumente expresso (92).
No presente estudo, foi constatada contagem elevada de leucócitos com
predomínio de prolinfócitos em esfregaços de SP, trombocitopenia e anemia, na
maioria dos casos, condizentes com os resultados descritos na literatura assim como
o imunofenotipo (Tabela 8).
O linfoma de células do manto (LCM) é uma neoplasia agressiva de células
146
B, responsável por 2-10% dos linfomas não Hodgkin. A média de idade é de 60 anos,
com predomínio no sexo masculino. Uma pista diagnóstica no diagnóstico do LCM é
o pleomorfismo celular obsevado no SP, que pode variar de pequenas formas para
células médias com contornos nucleares irregulares (128).
A imunofenotipagem por CF mostra expressão moderada ou forte de CD20,
CD22, CD79b, FMC7 e com predominância de cadeia leve lambda, associada à
expressão aberrante do CD5. A ausência do CD23 e CD200 pode distinguir LCM da
LLC-B na maioria dos casos. Adicionalmente, as células leucêmicas podem
apresentar expressão ocasional de CD38 e CD25. A superexpressão da ciclina D1 é
um marcador sensível e mais específico para o LCM. Este antígeno nuclear pode ser
detectado pela CF após a permeabilização celular, estando presente em todos os
casos. Nesses casos, é importante confirmar a expressão da ciclina D1 por imuno-
histoquímica para confirmar o diagnóstico, o que foi feito no presente estudo em todos
os casos positivos detectados pela CF. Figura 12 (128,205).
O linfoma folicular (LF) é o segundo tipo mais comum de linfoma não-Hodgkin
na América do Norte e na Europa Ocidental e é uma neoplasia de células B do linfoma
do centro do folículo. O envolvimento da MO ocorre em 60% a 70% dos casos. Figura
13 (10, 14).
Anormalidades laboratoriais podem incluir anemia, elevados níveis séricos
de desidrogenase láctica (LDH) e citopenias acentuadas, causadas por envolvimentos
esplênico e / ou infiltração tumoral da MO, e, muito raramente, células leucêmicas
circulantes (fase leucêmica). Isso explica o pequeno número de pacientes
diagnosticados com CF em nossa amostragem, composta principalmente de amostras
de PB de pacientes com linfocitose persistente (Tabela 8). A imunofenotipagem
mostra positividade para antígenos pam-B: CD19, CD20, CD22, CD79b, FMC7 e
CD21 associados à expressão de CD10. A ausência de expressão do CD5 e CD200,
alta expressão antigenica de Igs e negatividade a Ciclina-D1 ajudam a distinguir o FL
a LLC-B e LCM, respectivamente (206,207).
A leucemia de células vilosas(LCV) ou hairy cell leukemia (HCL), representa
uma DLPC-B rara e de natureza indolente com uma incidência inferior a 1 por 100.000
pessoas, sendo caracterizada por infiltrado difuso na MO e esplenomegalia. A média
de idade ao diagnóstico é de 55 anos sendo mais predominante homens . Em nossa
casuística, a forma clássica (LCVc) e variante (LCVv) foram responsáveis por 1,2% e
147
1,0% de todos os casos, respectivamente, predominando em homens e
diagnosticados com idade média de 64 anos(108) Figura 15.
A anemia e / ou trombocitopenia associadas a leucocitose são comuns no
diagnóstico da forma variante (LCVv), enquanto a pancitopenia, granulocitopenia e
monocitopenia são achados comuns na forma clássica da doença (LCVc).
Comumente observa-se eritrócitos em forma da lágrima (dacriócitos), sugerindo
fibrose da medula óssea. A imunofenotipagem por CF é mandatório para o diagnóstico
diferencial entre LCVc, LCVv e o linfoma esplênico de linfócitos vilosos (LELV),
embora também deva ser levado em consideração dados clínicos e hematológicos.
As células da LCVc são sempre positivas para uma célula B madura com forte
expressão de IgS, CD19, CD20, FMC7, CD22, CD11c, CD103, CD123, CD38 e
receptor de interleucina-2 (IL-2R ou CD25). No caso da LCVv as células leucêmicas
são sempre negativas para CD25 e CD123 e ocasionalmente positivo para CD103. No
LELV, o CD103, CD123 e CD11c são negativos e CD25 pode ser positivo ou negativo.
Casos raros de LCV podem expressar CD5, mas geralmente não há problema em
distinguir entre LCV e LLC-B. As células leucêmicas da LCV apresentam uma
dispersão lateral ligeiramente aumentada (SSC), colocando-as na região “monocítica”
do CD45 versus SSC(110,208).
O CD103 é um membro da família da integrinas e expresso em linfócitos
associados à mucosas, incluindo os linfócitos T. Quando expresso simultaneamente
com marcadores celulares pan-B é fortemente indicativo de LCV(110).
O CD123 é uma glicoproteína contendo 360 aminoácidos também conhecida
como subunidade alfa transmembrana do receptor da interleucina-3 (IL-3R). Após a
ligação da IL-3, o IL-3R induz a proliferação celular e a sobrevivência. O CD123
tambem pode ser expresso em leucemias agudas e malignidades associadas a
células assassinas naturais (Natural Killer ou NK) e leucemias de células dendríticas,
sendo raramente expresso em neoplasias de células B maduras, com excessão da
LCV(112).
CD25 tambem conhecido como receptor para IL-2, é uma proteína
transmembrana do tipo 1 presente em linfócitos T e B ativados, alguns timócitos e
precursores mieloides. O CD25 é comumente expresso na maioria das neoplasias de
células B e T, algumas leucemias agudas, neuroblastomas sendo tambem observados
em infiltrados linfocitários de tumores sólidos(112).
148
Essas peculiares características hematológicas e imunofenotípicas da LCV
também foram observadas no presente estudo tais como a pancitopenia e linfocitose
na LCVc e LCVv, respectivamente. Em todos os casos de células LCVc observou-se
expressão de CD11c, CD103 e CD123 associado ao CD19, CD20 forte, CD22 forte,
FMC7, CD79b, HLA-Dr, CD38, CD25 e imunoglobulina monoclonal(= 5 e = 1). Na
LCVv observou-se ausência do CD25, CD123, CD103 em todos os casos. Ambos os
grupos LCV também foram negativos para o CD200 (Tabela 6).
O linfoma esplênico com linfócitos vilosos (LELV) é uma DLPC-B rara, com
características hematológicas e de imunofenotipagem próprias. O LELV são
predominantementes linfomas esplênicos. O exame hematológico revela anemia leve
e trombocitopenia, enquanto a contagem de leucócitos apresenta-se normal ou
levemente elevada, raramente excedendo 30.000/L.
Os linfócitos infiltrados são evidentes nos esfregaços sanguineos, medular e
de aspirado de baço. As células desse linfoma são tipicamente linfócitos com
projeções “vilosas” citoplasmáticas bipolares. O curso geralmente é crônico e benigno,
fazendo parte do grupo de linfomas de células B da zona marginal, juntamente com
linfoma extranodal da zona marginal e linfoma nodal da zona marginal. Figura 17
(209).
O diagnóstico diferencial é geralmente necessário para distinção entre o LELV
e a LLC-B, LCM e LCV. A imunofenotipagem mostra um fenótipo de linfócitos B
maduros, com expressão de CD19, CD20, CD22, FMC7 e HLA-DR com sIg clonal de
intensidade moderada a forte (8)
A cadeia pesada das imunoglobulinas mais freqüentemente observada é a IgM
seguida pela IgG ou IgA, enquanto IgD é incomum, sendo negativas para CD5, CD10,
CD23 e ciclina-D, o que ajuda a distingui-las dos distúrbios da LLC-B, LF e LCM. A
maioria dos casos, mas não todos, expressam CD11c, CD25 e CD38. A ausência de
CD103, CD123 permite o diagnóstico diferencial com LCV(8).
No presente estudo, observamos três casos de características hematológicas
e imunofenotípicas compatíveis com LELV (Tabelas 5 e 6).
A macroglobulinemia de Waldenström (MW), também conhecida como linfoma
linfoplasmocitário ou imunocitoma, é um linfoma de células B extremamente raro,
indolente, que ocorre em menos de dois por cento dos pacientes com LNH. A doença
149
geralmente afeta adultos mais velhos afetando principalmente a medula óssea,
embora os linfonodos e o baço possam estar envolvidos
As células leucêmicas e soro de pacientes com MW apresentam altos níveis de
imunoglobulinas IgM. Esses níveis elevados de IgM sérica podem causar
hiperviscosidade sanguínea, resultando em sintomas como hemorragias nasais, dores
de cabeça, tontura e perda de visão. O imunofenótipo típico da MW consiste na
expressão de marcadores de superfície de células pan-B tais como o CD19, CD20,
CD22, FMC7, CD38, CD79a e IgM, sendo negativos para o CD10 e CD23. O MW
mostra-se expresso em 5% a 20% dos casos. Figura 18 (210).
Por ser uma doença extremamente rara, conseguimos observar apenas um
paciente com características clinicas, hematológicas e imunologicas compatíveis com
MW (Tabelas 5 e 6).
O mieloma múltiplo (MM) é uma proliferação clonal de plasmócitos neoplásicos
que acometem adultos sendo mais predominante em indivíduos de raça negra e o
sexo masculino, frequentemente precedida por uma gamopatia monoclonal de
significado indeterminado ou monoclonal gammopathy of undetermin(MGUS)(211)
As características clínicas do MM estão relacionadas à produção de uma
proteína monoclonal no sangue periférico e/ urina e infiltração da MO por células
plasmáticas neoplásicas, as quais podem causar lesões ósseas líticas. A anemia está
presente em cerca de 70% dos pacientes sendo geralmente normocítica e
normocrômica, podendo tambem ser observada plaquetopenia. Estas altrações
hematológicas são consequencias infiltração de células tumorais resultando na
inibição da produção normal dos elementos normais pelas citocinas. A hipercalcemia
é outra consequência da infiltração medular pelas células tumorais.Figura 19 (211)
O SP dos pacientes com MM apresentam pancitopenias leves. A formação de
“roleaux” geralmente ocorre devido à presença de excesso de imunoglobulinas
séricas. Em alguns casos podem ser observadas células plasmaticas circulantes,
sendo a presença dessas células em circulantes usados para discriminar entre MM e
a leucemia de células plasmaticas (LCP) (161).
Na LCP observa-se contagem de células plasmaticas anormais em esfregaços de
sangue periférico maior que 20% ou contagem de leucócitos acima de 20.000/L (34).
150
Com base nessas premissas, 9,15% e 2,55% dos nossos casos foram
categorizados como MM e LCP, respectivamente. Níveis de HB inferior a 10g/foram
observados em 30,2% e todos os pacientes com MM e LCP (Tabela 6).
O MM/LCP têm sido tradicionalmente difíceis de diagnosticas pela CF. Os
plasmócitos neoplásicos freqüentemente expressam fortemente o CD38 e CD138
associado com CD45 fraco ou negativo bem como o CD19. A expressão aberrante do
CD56 é encontrada na maioria dos casos. O painel de AcMo recomendado e realizado
no presente estudo consistiu de CD138, CD38, CD45, CD16-56, CD19, CD20 e cyIgH.
Destes, CD138, CD56 e CD38 são considerados essenciais. No presente estudo os
dados da imunofenitipagem foram compatíveis com os descritos na literatura,
mostrando forte exprssão do CD138, CD38, CD16-56 em todos os casos e ausência
de CD45, CD20 e CD19 na maioria deles (Tabela 6).
Embora exista uma boa correlação entre a análise da CF e a citomorfologia de
aspirado de MO na investigaçao de MM é importante notar que na avaliação
morfológica, o percentual de células plasmáticas é usualmente maior do que aquela
determinada pela CF, havendo uma série de razões para este fenômeno, destacando
o fato de que os plasmócitos malignos são frágeis podendo os marcadores de
membrana serem perdidos durante o processamento da amostra. Outro fato é que os
plasmócitos malignos geralmente formam aglomerados no microambiente da medula,
tornando-os pouco acessiveis ao processo de aspiração para análise pela CF(144).
Por esse motivo, alguns laboratórios, suplementando a imunofenotipagem por
CF, optam por tambem investigar a restrição clonal através da detecção de
imunoglobulinas de cadeia leve séricas utilizando imunofixação. Por meio dessa
metodologia complemntar, demonstramos que a maioria dos casos de MM e LCP foi
kappa+ (n= 45); seguido por 12 casos lambda+ e um pequeno número de casos (n=
2 pacientes) não expressavam nenhuma cadeia leve livre no soro (dados não
mostrados nas tabelas).
O linfoma de Burkitt (LB), é uma neoplasia muito agressiva derivada de células
B originária do centro germinativo que afeta principalmente grupos etários mais
jovens. As células procedentes do linfoma de Burkitt são compostas por células
monomórficas de tamanho intermediário com citoplasma extemamente basofílico e
vacuolado. Figura 21 (150).
151
A alteração genética t(8;14) (q24,q32) é observada em 80% dos casos,
enquanto os outros 20% observa-se a t(2,8) (p12,q24) e a t(8,22) (q24,q11). Essas
translocações cromossômicas envolvem a superexpressão do gene c-Myc e são
determinantes no desenvolvimento dessa patologia (212).
A imunofenotipagem por CF confirma o diagnóstico inicialmente
citomorfológico. As células neoplásicas são fortemente positivos para o CD45, CD20,
CD22, CD19 e HLA- Dr. O CD10 pode ser positivo fraco ou negativo e
carateristicamente observa-se forte expressão da imunoglobulina IgM de superfície
O antígeno CD38 está presente na maioria dos casos com ausência de TdT,
CD5, CD21 e CD23. Essas características peculiares hematologicas e da
imunofenotipagem do LB também foram observadas em nosso estudo (Tabelas 5 e
6)(213).
A característica definidora do DLPC-B com classificação imunológica não
específica cursa com linfocitose discreta com linfócitos atípicos de aspcto
heterogêneos, em contraste com as células B de desordens linfoproliferativas
discutidas até o momento. Essa entidade constitui cerca de 30% a 40% de todos os
as DLPC e expressam antígenos pan-B tais como CD19, CD20, CD22 na maioria dos
casos . Em nosso estudo, observamos 39 casos de DLPC-B que apresentaram
características hematológicas e imunofenotípicas sugestivas desta categoria de
doença. A negatividade de CD10, CD103 e ciclina-D1 permitiram a exclusão de LF,
LCV e LCM, respectivamente. Expressão forte de FMC7, CD79b, CD20, CD22 e sIg,
associadas à ausência de CD200 e CD5, também possibilitaram estabelecer a
exclusão da LLC (Tabela 6). Por fim, a complementação das análises citomorfológicas
também permitiram a exclusão de outras entidades tais como a LPL-B, LELV, MW,
MM/LCP e LB.
As doenças linfoproliferativas crônicas de linfócitos T e células NK (DLPC/T/NK)
englobam uma variedade de entidades que resultam da proliferação clonal de células-
T pós-tímicas, caracterizadas pela ausência de TdT e CD1a, juntamente com
positividade para um ou mais marcadores celulares relacionados a linfócitos T e
células NK maduras (171).
Em contraste com o observado nas neoplasias linfoides B, nas quais a análises
das cadeis leves das imunoglobulinas podem determinar a clonalidade, não existem
marcadores específicos de clonalidade de células T ou linfocitose T malignas.
152
Consequentemente, a análise de CF das doenças linfoprolferativas de células T
requerem um amplo painel de marcadores celulares que devem estar associadas com
a correlação com dados clínicos, citomorfológicos e laboratoriais relevantes,
especialmente estudos moleculares para o rearranjo gênico de receptores de células
T (TCR) (171).
No presente estudo proprusemos critérios mais úteis para a identificação de
populações de células T maduras anormais, incluindo forte expressão de CD45
(indicador de maturidade), expressão alterada de antígenos pan-T tais como o CD2,
CD3, CD5, CD7, com atenção especial à baixa densidade antigênica para CD3 e
perda do CD7. Figura 7
A restrição do subgrupo de células TCD4+ ou TCD8+, presença de fenótipos
aberrantes tais como presençade células T duplo positivas (CD4+/CD8+) ou duplo
negativas (CD4-/CD8-), presença de marcadores de células T adicionais, tais como
TCR ( or , proteína associada A1 a leucemia de células T leucemia/ Linfoma de
células T (TCL-1) .
Marcadores associados a células NK (CD16-56), antígenos intracitoplasmáticos
associados a grânulos citotóxicos (perforinas e granzima-B) e expressão negativa
para o TdT e CD1a que associadas como alterações morfológicas das células
leucêmicas detectadas pela alterações de dispersão de luz, induzidas pelo laser do
citometro de fluxo (FSC x SSC), possibilitaram a identificação de imunofenótipos
associados a LPL-T, LGLG-T de células T / NK, LLTA, SS e LCTP em 10, um, 10, 8 e
24 casos respectivamente.
Um resumo dos imunofenótipos mais característicos destes diferentes T - células
DLPC é apresentada na tabela 6 e na figura 4.
A leucemia prolinfocítica de células T (LPL-T) é uma doença rara, responsável
por aproximadamente 2% de todos os casos de DLPC, que afeta adultos (idade média:
65 anos) sendo mais frequente no sexo masculino. Uma minoria de pacientes é
assintomática e apresenta linfocitose, lentamente progressiva semelhante ao
observado na LLC-B ou LPL-B. A sorologia e / ou análise de DNA para o HTLV-I / II
são negativas (171,172).
O principal achado laboratorial é a linfocitose acentuada (superior a 50.000/L).
153
Anemia e trombocitopenia também são comuns, e esses parâmetros hematológicos
foram observados no presente estudo com linfocitose, anemia e trombocitopenia
detectados em quase todos os casos (Tabela 9).
A morfologia celular e os marcadores celulares são os principais parâmetros
para o diagnóstico. Em dois terços dos casos, as células exibem cromatina nuclear
condensada de contorno irregular, nucléolo único proeminente e citoplasma basofílico
com protrusões sem grânulos, possibilitando o diagnóstico diferencial com a leucemia
de células grandes granulares ou T-Cell Large Granular Lymphocytes Leukemia
(LGLG-T). Em 20% dos casos, as células são menores e o nucléolo é pequeno ou não
visível à microscopia convencional. Embora esses casos tenham sido referidos como
LPL-T de células pequenas e variante de LPL-T de núcleo de aspecto cerebriforme,
previamente designados por leucemia de células semelhantes a sídrome de Sézary
(SS), o que torna a análise por CF essencial para o diagnóstico diferencial dessas
doenças. Figura 22 (172).
A imunofenotipagem por CF mostra que as células leucêmicas são linfócitos T
pós-tímicos (ausência de CD1a e TdT) com expressão de CD2, CD5, CD7 forte e TCL-
1. A expressão superficial fraca de CD3 e TCRT está presente em cerca de 80%
dos casos, mas esses marcadores são sempre expressos no citoplasma. O fenótipo
mais comum é TCD4+/CD8- (65% dos casos), cerca de 10% das células são
TCD8+/CD4-, 25% duplo positivos (CD4 +/CD8+) e 1% duplo células duplo negativo
(CD4-/CD8-). A presença de antígenos associados à ativação de células T, como HLA-
Dr, CD25 e CD38, é variável. Marcadores de células NK (CD16, CD56) são
tipicamente negativos; no entanto, a positividade para perforina e granzima B pode
ocorrer em casos de LPL-T CD8+ (172).
Em nossa casuística de LPL-T foram observadas expressão de CD5 associado
a CD3 fraco e CD7 forte em todos os casos. Outros marcadores celulares, como CD2,
TCL-1 e TCR estavam presentes na maioria dos casos. Com relação à expressão
dos antígenos CD4 e CD8, foram observadas LPL-T de células T CD4+/CD8-, CD4-
/CD8 +, CD4+/CD8+ e CD4-/CD8- em 50%, 42,9%, 35,7% e 14,3% dos casos,
respectivamente. A perforina e a granzima B foram expressas em apenas um caso
com fenótipo TCD8+. A expressão de antígenos associados à ativação celular CD25,
CD38 e HLA-Dr foram observados em 42,9%, 78,6% e 28,6% dos casos
respectivamente (Tabela 7).
154
Dependendo da sua origem, a LGLG-T pode ser classificada em dois grupos
principais: derivados de células T (CD3+) ou NK (CD3-) (12-13, 19, 35-37). Linfócitos
grandes linfócitos granulares têm morfologia característica. São células de tamanho
médio a grande, com núcleos não nucleodos, citoplasma abundante e grânulos
azurofílicos grosseiros. Figura 23 (214).
A grande maioria dos LGLG-T exibe um fenótipo T-citotóxico maduro:
CD3+/CD8+, CD2+, CD7+ e TCR + na maioria dos casos (181).
Os receptores HLA-Dr e interleucina-2 (CD25) são expressos em um número
variável de casos. Cerca de 50% dos casos carecem de expressão de CD5 e CD7.
Embora raros, células CD4+ e duplo positivas (CD4+/CD8+) ou TCR foram
descritos(214).
A LGL-NK é uma DLPC muito rara e ocorre em adultos com idade média de 60
anos em igual proporção entre homens e mulheres, sendo assintomática na maioria
dos casos ao diagnóstico. Figura 24 (12)
A abordagem diagnóstica no caso de possível LGL-NK requer que três requisitos
iniciais sejam atendidos: i) documentação do aumento persistente de células LGLs
circulantes ( superior a 2.000/ mL) na contagem de leucócitos totais com predomíeo
de células LGL na contagem diferencial ; ii) que LGLs são células NK (não linfócitos
T citotóxicos), determinadas por imunofenotipagem por CF e iii) exclusão de causas
reativas de linfocitose de células NK (avaliações clínicas e laboratoriais excluem
infecção, neoplasia subjacente, vasculite, neuropatia e distúrbios autoimunes
(206,214).
A abordagem diagnóstica no caso de possível LGL-NK requer que três requisitos
iniciais sejam atendidos: i) documentação do aumento persistente de células LGLs
circulantes ( superior a 2.000/ mL) na contagem de leucócitos totais com predomíeo
de células LGL na contagem diferencial ; ii) que LGLs são células NK (não linfócitos
T citotóxicos), determinadas por imunofenotipagem por CF e iii) exclusão de causas
reativas de linfocitose de células NK (avaliações clínicas e laboratoriais excluem
infecção, neoplasia subjacente, vasculite, neuropatia e distúrbios autoimunes
(206,214).
Embora não possa definir a clonalidade da linhagem NK, a imunofenotipagem por
155
FC é o método mais recomendado para sua identificaçãocom positividade para o CD2,
CD8, CD16 e CD56 associados à ausência de marcadores de células T, tais como
CD3, CD5, CD7, TCL-1 e TCR. Granzyma-B e Perforin podem se expressar bem como
no caso de LGLG-T (11). No presente estudo, nosso painel de AcMo permitiu o
diagnóstico diferencial dessa leucemia (Tabela 7).
Além de citopenias variáveis, a contagem de células sangüíneas revelará uma
modesta linfocitose absoluta com morfologia típica de LGLG-T, e o diagnóstico é
frequentemente considerado devido a infecções bacterianas recorrentes e/ou
fatigabilidade, que são secundárias a neutropenia associada à doença e anemia,
respectivamente. Em pacientes com LGL-NK, a neutropenia grave é rara, mas a
anemia está presente em quase todos os casos. A trombocitopenia grave também é
mais comum em LGLL-NK, contrastando com a trombocitopenia geralmente
moderada observada em T-LGLL. Essas características hematológicas foram
observadas no presente estudo (Tabela 9).
A leucemia / linfoma de células T do adulto (LCTA) é uma neoplasia de células T
periférico, causado pela infecção do vírus linfotrópico de células T humanas (HTLV- 1).
Quatro variantes clínicas com diferentes riscos de progressão da doença e morte são
reconhecidas. Estes incluem aguda, crônica, latente e linfomatosa.Figura 25 (215).
A variante aguda é a forma mais comum sendo caracterizada por um grande
número de células leucêmicas circulantes, desidrogenase láctica (LDH) sérica elevada
e hipercalcemia, com aumento frequente dos linfonodos, hepatoesplenomegalia e
lesões cutâneas. A forma crônica mostra leucocitose menos intensa, mas com
presença de células atípicas no SP e, ocasionalmente, linfoadenomegalia e
hepatomegalia, além de sobrevida mais prolongada. A forma latente tem uma
pequena porcentagem de células atípicas circulates e um curso clínico mais indolente
(173,193).
O diagnóstico diferencial da LLTA inclui LPL-T, LGLG-T e LCTP. Análises
citomorfológicas, imunofenotipagem pela FC e testes sorologicos para detecção do
HTLV-1 são mandatórios para se obter um diagnóstico correto (193).
Embora achados inespecíficos tais como contagem elevada de leucócitos,
linfocitose, eosinofilia e anemia possam estar presentes, o foco principal do exame do
sangue em pacientes com LLTA é identificar células T malignas circulantes. Por
156
convenção, estas células circulantes são referidas como células LlTA, que podem ser
identificadas pela sua aparência morfológica ou propriedades imunofenotípicas,
embora o imunofenótipo seja muito mais fiável. As células LLTA são de médio para
grande tamanho e apresentam pleomorfismo característico com núcleos hiperlobados
em forma de trevo ou flor (Flower Cells) (193).
Os resultados imunofenotípicos das células LLTA demonstram que são células T
maduras, sem expressão de TdT e CD1a. Vários antígenos de células pan T são
expressos; incluindo CD3, CD2 e CD5, enquanto a expressão de CD7 está ausente
ou fraca. Expressão reduzida de CD3 é observada em cerca de metade dos casos.
As células LLTA também expressam geralmente antigenos de ativação,
principalmente CD25, CD38 e HLA-Dr. A maioria dos casos demonstra um fenótipo
de células T auxiliares (CD4 +); embora um pequeno número de casos demonstre a
coexpressão de CD4 e CD8, casos raros não possuem CD4 ou CD8, e outros casos
raros demonstram apenas expressão do CD8(191).
No presente estudo, encontramos uma contagem elevada de leucócitos com
predominância de “flower cells” no esfregaço de SP na maioria dos casos.
Trombocitopenia e anemia foram observadas em 10% e 20% dos casos,
respectivamente. A imunofenotipagem e sorologia reagente para anticorpos ati-
HTLV-1 confirmou o diagnostico diferencial com outras doenças linfoprliferativas
(Tabelas 7 e 9).
A síndrome de Sézary (SS) é uma variante leucêmica da micose fungóide (MF),
linfoma cutâneo indolente de células T. Ambas as afecções acometem pacientes
idosos, mais frequentes em homens que apresentam eritrodermia generalizada e / ou
nódulos cutâneos, placas, adenopatias periféricas ou células mononucleares atípicas
circulantes com núcleos cerebriformes (células Sezary); organomegalia, no entanto, é
rara (216).
O diagnóstico da SS é baseado em um ou mais dos seguintes critérios: i)
contagem elevada de células de Serary circulates; ii) Razão CD4/CD8 igual a 10 ou
superior devido a um aumento nas linfócitos T auxiliares circulantes ou uma perda ou
expressão aberrante de marcadores de células T-pan; iii) aumento da contagem de
linfócitos cisrculantes com evidência de um clone de células T detectado pelas
técnicas de Southern blot ou reação em cadeia da polimerase. Figura 26 (217).
157
A imunofenotipagem revela uma população de TCR a/b com predomíneo T
auxiliar (TCD4+). A relação CD4/CD8 normalmente excede 10. (12, 19, 36-40). Outros
antígenos de células T tais como o CD2, CD3 e CD5, podem apresentar expressão
aberrante fraca ou forte. Perda do CD7 e / ou CD26 é o achado mais frequente (216).
Nossos resultados foram condizentes com os da literatura, sugerindo que a falta
de CD7 é uma característica constante da células de Sezary circulantes e que os níveis
da subpopulação CD4+/CD7-/CD3 + fraco. Assim, o envolvimento de SP foi capaz de
diferenciar entre pacientes com SS e outras DLPC T (Tabela 7).
O linfoma de células T periféricas não específicas (LCTP) compreende um grupo
heterogêneo de linfomas não-Hodgkin de células T maduros na fase leucêmica que
não satisfazem critérios morfológicos, fenotípicos ou genéticos para qualquer
categoria distinta de linfoma de células T maduras. Eles são designados como “sem
outra especificação” e afetam pacientes idosos, predominantemente homens que
apresentam linfadenopatia generalizada, embora qualquer outro local no trato
gastrointestinal, baço, fígado e pele possam ser afetados; infiltração na medula óssea,
no entanto, é rara. Figura 27(218).
Na disseminação leucêmica, a linfocitose persistente é o principal achado
hematológico. As características citológicas são variáveis, com células de médio a
grande tamanho, contendo núcleos atípicos e pleomórficos. Outras características
comuns observadas no sangue incluem trombocitopenia e anemia (219).
A imunofenotipagem por CF desempenha um papel importante no diagnóstico
diferencial entre o LCTP e outras DLPC-T , bem como as linfocitoses reativas. Células
neoplásicas expressam CD45 forte na maioria dos casos, mas alguns casos mostram
CD45 fraco ou negativo. Embora a expressão normal de vários marcadores de células
T pan-T, como CD2, CD3, CD5 e CD7 seja ocasionalmente visto, a maioria dos casos
mostram expressão aberrante de um ou mais dos antígenos pan-T. Destes o CD7 e
CD2 são mais frequentemente perdidos. A fraca expressão de CD2, CD3, CD5 e CD7
é notada em alguns casos. Embora a maioria dos casos seja T CD4+, casos T CD8+,
dupla positividade ou negatividade para CD4 e CD8 são observados em um número
significativo de casos (219).
Em nosso estudo, observamos expressão de CD2 em 83,3% dos casos e CD3,
CD5 e CD7 em 95,8% dos casos. Além disso, outros marcadores celulares, como
158
TCL-1, perforina e granzima-B, estavam presentes em todos e em 37,5% dos casos,
respectivamente. A maioria dos casos foram de células T CD4+ seguido pelas T CD8+,
presentes em 66,7% e 62,5% dos casos, respectivamente. Um pequeno número de
casos apresentou expressão dupla de CD4+/CD8+ (n= 20,8%) e duplo negativo (n=
4,2%). Os antígenos CD25, CD38 e HLA-Dr associados à ativação celular foram
positivos em 33,3%, 58,3 e 54,2% dos casos, respectivamente (Tabela 7).
Finalizando, a citometria de fluxo é atualmente uma técnica amplamente
utilizada em meio laboratorial, sendo uma ferramenta efectivamente útil na
investigação das linfocitoses, detecção de monoclonalidade e caracterização
imunofenotípica das doenças linfoproliferativas.
159
8. CONCLUSÕES
De acordo com os resultados deste trabalho podemos concluir que:
1. Observou-se evidências de forte associação entre a linfocitose em pacientes
com idade avançada e a presença de patologia linfoproliferativa.
2. A investigação de linfocitoses prolongadas pela citómetria de fluxo previamente
detectadas em hemogramas de rotina ou aspirado medular, mostrou-se eficaz
no diagnóstico e classificação de patologias linfoproliferativas com ou sem
manifestação clínica.
3. O diagnóstico de mieloma múltiplo previamente feito pela análise
citomorfológica da medula óssea, eletroforese de proteínas sérica e teste de
imunofixação de cadeias leves das imunoglobulinas se beneficia da aplicação
de painel especiífico conforme demostrado no presente trabalho.
4. Na análise dos pacientes portadores das DLPC-B, foi possível a detecção da
monoclonalidade por citometria de fluxo (teste kappa/lambda) na maioria dos
casos.
5. Nas DLPC-T , o diagostico foi confirmado pela detecção de fenótipos
aberrantes como por exemplo elevada relação CD4/CD8, presença de células
T duplo positivos ou duplo negativo dentre outras.
6. Dentre as DLPC, investigadas a LLC-B foi observada com maior frequência
estando estes dados condizentes com relatos da literatura.
7. A implementação do estudo protocolado de imunofenotipagem das linfocitoses
prolongadas encontradas em hemogramas de rotina, especialmente em
pacientes de idade avançada, é recomendada.
8. O presente estudo se consolida coma criação de um banco de dados clínicos,
demográficos e análises laboratoriais, como base consolidada de pesquisa
clínica nesta área.
160
9. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PESPECTIVAS FUTURAS:
As doenças linfoproliferativas crônicas compreendem uma variedade de
doenças com características clínicas e laboratoriais distintas. A aplicação de novas
técnicas de diagnóstico, como a imunofenotipagem por citometria de fluxo, juntamente
com análises citomorfológicas, contribuem significativamente para o entendimento de
sua patogênese, permitindo a classificação destas entidades com perfis laboratoriais
únicos, fornecendo também informações sobre o prognóstico e atualmente tem
servido como base para a implantação de novas modalidades de tratamento. Este
interesante mundo da imunofenotipagem me fascinou no aprofundamento neste
estudo como investigador e principalmente médico oncohematologista em busca do
melhoramento do diagnóstico, entendimento dos mecanismo destas doenças. Este
estudo deu-se inicio no desenvolvimento de meu mestrado, tendo dado continuidade
ao mesmo tema no doutorado, pretendendo dar continuidade um futuro pos-
doutorado, desta vez , atenção em mecanismos e técnicas moleculares aplicáveis à
prática clínica. Pretendo tambem me enganjar na linha de pesquisa de meu orientador
de quem ja recebi proposta de continuidade dessa parceria, como co-orientador de
futuros trabalhos de pos-graduação desenvolvidos no HEMOCENTRO e na
Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
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