Thayssa Escobar || Biomed7UFRGS

PCRContituintes:- DNA Molde segmento de DNA que tu quer clonar; o tamanho que tu quer tem que ser observado caso depois tu v colocar o clone em um vetor (plasmdeos suportam at 3Kb) - Par de primers para se anelar e limitar o segmento a ser amplificado; tem que observar a % de CG, que vai influenciar na To de anelamento (CG = To) - Enzima Taq DNA Polimerase enzima que vai fzer o alongamento da fita; o excesso de enzima pode prejudicar a eficincia da reao. - Mg+2 colocado, na reao, o sulfato de magnsio; lembrar que Mg co-fator da enzima Taq; o Mg+2 faz interaes de cargas e pode alterar a taxa de anelamento (alteram, portanto, a especificidade de anelamento). Quando h muito Mg+2 vai haver competio e neutralizao das cargas negativas dos primers e dNTPs (que tm fosfatos). Isso pode causar amplificaes inespecficas e falsos-positivos (dmeros de primes e hairpins - especificidade ). Quando h pouco Mg+2, tem-se muito pouco produto ou nenhum. - dNTPs so as bases nitrogenadas que constituiro as novas cadeias de DNA; possuem grupamentos fosfatos, que conferem a carga negativa. - Tampo Geralmente o Tris e um pouco de sal para manter a fora inica constante e, consequentemento, manter o pH constante.

Etapas do processo:1. Desnaturao - Aquecimento para a separao das fitas de DNA molde - A temperatura deve ser superior a T de fuso (Tm) da regio de DNA que se quer amplificar Hibridizao /Anelamento - Esfriamento rpido (abaixo da Tm) para permitir a hibridizao Elongamento /Extenso - a etapa de amplificao propriamente dita.

2.

3.

Recordando da replicao bacteriana, podemos ver que ela se assemelha e se diferencia reao de PCR em alguns aspectos: Helicase temperatura de desnaturao (94C); lembrar que ela corta as fitas (separa) Primers de RNA(nas bactrias) primers de DNA sintetizados in vitro (para a PCR) e temperatura de anelamento (50 a 60 C) DNA Polimerase homloga DNA polimerase recombinante heterloga e temperatura de extenso (72C) Alm disso, na replicao bacteriana h o mesmo tipo de processividade (exponencial e bidirecional) e feita uma cpia fiel da que a originou.

Thayssa Escobar || Biomed7UFRGS Fatores que influenciam na especificidade:

Deteco:- Os produtos de PCR no podem se multiplicar para sempre: Limites: Quantidade de primer, tividade da Taq Polimerase Uma vez atingido o plat...: No h mais aumento na quantidade de produto Deteco end point (no plat): Nmero fixo de ciclos e depois se verifica a presena de produto em gel de agarose. Esse mtodo apresenta alguns problemas: Preciso baixa ( sensibilidade) Baixa resoluo No automatizado Baseado somente no tamanho Resultados no expressam em nmeros O corante brometo de etdeo no quantitativo

Rendimento do processo:- A reao de PCR no 100% eficiente (gira em torno de 60 - 80%), ou seja, no ocorrem as duplicaes de TODAS as fitas em todos os ciclos. - Produtos de PCR menores amplificam com eficincia maior - O nmero de cpias ao final dos ciclos realizados pode ser calculado como:

A eficincia diminui quanto maior for o nmero de ciclos, porque pirofosfato acumula-se e comea a faltar dNTP e primer. Ento, a eficincia tende a zero.

PCR Real-time- Faz o monitoramento da fluorescncia aps cada ciclo de amplificao (desnaturao, anelamento e extenso) da fluorescncia incorporada ao amplicon

Vantagens:

Thayssa Escobar || Biomed7UFRGS Rendimento do processo:- O rendimento pode ser medido pela mesma frmula:

eficincia => deslocamento para direita(1 grfico) => inclinao da reta (2 grfico)

- O nmero de amplicons proporcional fluorescncia; ele depende da quantidade inicial de molde - Em um determinado ciclo (Ct threshold cycle), quanto maiores os valores de fluorescncia, maior concentrao inicial de molde, ou seja, quanto maior o Ct, mais DNA tinha inicialmente, pq atingiu a fluorescncia do threshold (limiar) primeiro. - Threshold Cycle (Ct); o ciclo aonde um aumento significativo na quantidade de amplificado primeiramente detectado; o parmetro usado para a quantificao. Resumindo, o 1 ponto de fluorescncia em que todo mundo comeou a crescer

Fluorforos:- Os mtodos de deteco so baseados em: 1. 2. Fluorforos intercalantes de DNA em dupla fita SYBR-Green Oligonucleotdeos marcados com fluorforos TaqMan, Molecular Beacons PS: o comprimento de onda da absoro geralmente MENOR que da emisso SYBR-Green: - O SYBR se liga entre a dupla fita de DNA e com a excitao da luz amitida pelo sistema tico do termiciclador, emite uma fluorescncia verde. No comeo da amplificao, a mistura da reao contm o DNA desnaturado, os primers e o SYBR Green. As molculas no-ligadas do SYBR apresentam fluorescncia fraca produzindo um sinal mnimo sendo este subtrado durante a anlise do computador. Aps o reconhecimento dos primers, algumas molculas do SYBR podem ligar-se na fita dupla previamente formada. Durante a polimerizao pela Taq, as molculas do SYBR vo se ligando ao DNA recentemente sintetizado, aumentando, assim, a fluorescncia detectada. No ciclo seguinte, na etapa de desnaturao do DNA, as molculas de SYB Green so liberadas e h queda no sinal de fluorescncia. A deteco de fluorescncia no fim da etapa de extenso Fluorforos so molculas que absorvem luz e emitem em um comprimento de onda especfico.

Thayssa Escobar || Biomed7UFRGSde cada ciclo permite monitorar a quantidade crescente de DNA amplificado. *O SYBR no ligado ao DNA emite uma fluorescncia muito pequena que realada quando ligado fita dupla do DNA Vantagens: baixo custo, facilidade no uso e sensibilidade Desvantagens: Ligao em todo o DNA fita dupla que surge durante a reao, incluindo os dmeros de primers e outros produtos inespecficos, podendo superestimar a concentrao do fragmento alvo.

- Na PCR em tempo real utilizando SYBR green, estamos simplesmente medindo o aumento de fluorescncia medida que o corante se liga e a quantidade de DNA aumenta. Desejamos que este aumento na fluorescncia seja proveniente do DNA que desejamos medir, mas uma parte do sinal pode vir de DNA diferente do que estamos tentando ampliar. Uma maneira de verificar os produtos fazendo uma curva de melting fuso). A mquina da RT-PCR no s monitora a sntese de DNA durante a PCR, como tambm determina o ponto de melting do produto

no final das reaes de amplificao. A temperatura de melting (Tm) de uma dupla de DNA depende da sua composio de bases (e de sua extenso se for muito curto). Todos os produtos de PCR para um mesmo par de primers devem ter a mesma Tm - a menos que haja contaminao, mispriming, artefatos de primers, ou algum outro problema. Como o SYBR green no faz distino entre um e outro DNA, um importante meio de controle de qualidade verificar se todas as amostras tm uma temperatura de melting similar. Depois da amplificao da PCR-RT, a mquina pode ser programada para fazer uma curva de melting, em que a temperatura elevada por uma frao de um grau e a mudana de fluorescncia medida. No ponto de melting, as duas fitas de DNA sero separadas e a fluorescncia diminui rapidamente. *Um artefato de primer d um pico com uma temperatura de fuso mais baixa (porque um DNA a um curto). *Na Tm, 50% das fitas esto desnaturadas Mispriming: produtos de PCR feita devido ao anelamento dos primers para seqncias complementares, ou parcialmente complementares sobre DNAs no alvos. Artefatos de Primer: os primers podem s vezes se anelar entre si e criar modelos pequenos para a amplificao PCR.

Sondas TaqMan: - Essa sonda apresenta em uma extremidade um fluorforo e na outra um quencher (molcula que aceita enerdia do fluorforo na forma de luz e a dissipa na forma de luz ou calor). Os produtos da reao so detectados pela fluorescncia gerada aps a atividade axonuclease 5 3 da Taq DNA polimerase. Durante a RT-PCR, a sonda TaqMan hibridiza com a sequncia da fita simples de DNA complementar alvo para a amplificao. No processo da amplificao, a sonda TaqMan degradada devido atividade da polimerase, separando o quencher da molcula fluorescente durante a extenso. A separao do fluorforo do quencher aumenta a distncia entre eles e resulta em um aumento da intensidade de fluorescncia.

Thayssa Escobar || Biomed7UFRGSAssim, durante o processo de amplificao, a emisso de luz aumentada na forma exponencial. Esse aumento de fluorescncia apenas ocorre quando a sonda hibridiza e quando a amplificao da sequncia alvo feita. Ele proporcional quantidade de produto sendo formado.

Aplicaes da PCR para manipulao- A partir da reao de PCR, podemos fazer clonagem de genes e construo de bibliotecas genmicas e de cDNA. * Clonagem: 1. O fragmento de DNA contendo o gene a ser clonado, inserido em uma molcula circular de DNA (vetor), para produzir uma molcula de DNA recombinante. 2. O vector transporta o gene numa clula hospedeira, que geralmente uma bactria, embora outros tipos de clula viva possam ser usadas. 3. Dentro da clula hospedeira, o vetor se multiplica, produzindo numerosas cpias idnticas, no s de si prprio, mas tambm do gene que leva. 4. Quando a clula hospedeira se divide, cpias da molcula de DNA recombinante so passados para os descendentes e a ocore a replicao do vetor. 5. Aps um grande nmero de divises celulares, uma colnia, ou clone, de clulas hospedeiras idnticos produzida. Cada clula no clone contm um ou mais cpias da molcula recombinante de DNA; o gene transportado pela molcula recombinante agora dito clonado.

PCR Inverso:- um mtodo usado para permitir a PCR quando somente uma seqncia interna conhecida. Esta especialmente til na identificao de seqncias flanqueadoras para vrios genomas inseridos. - Envolve uma srie de digestes do DNA e ligao prpria, resultando em seqncias conhecidas a cada final da seqncia desconhecida. - Utilizado para amplificar regies adjacentes a um fragmento conhecido. Por exemplo, amplificar as regies 5 (promotor) e 3 (terminador) de um dado gene; - Constremse primers baseados na seqncia conhecida. Porm, a direo dos primers invertida. - O processo de i-PCR envolve a digesto do DNA, circularizao dos fragmentos lineares e a amplificao do DNA circular de cadeia-dupla, utilizando primers especiais para i-PCR. - Pode-se acoplar essa tcnica com a RT-PCR para detectar os transcritos, por exemplo para a clonagem de cDNAs com o objetivo de produzir protenas recombinates

PCR em estudos biolgicos:

Thayssa Escobar || Biomed7UFRGS

Deteco de vrus, bactrias, protozorios parasitos PCR ou RT-PCR direto de tecidos/secrees Identificao de organismos geneticamente modificados (OGM) PCR Deteco de armas biolgicas Estudos em evoluo e filogenia RAPD Medicina forense DNA fingerprinting, PCR Anlise de fsseis PCR comparando regies conservadas entre mamutes e elefantes, por exemplo.

Variantes da tcnica de PCR:AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism): - PCR baseada em marcadores moleculares para verificao rpida de variaes genticas (SNPs, InDel) - Os primers gerados so baseados no padro de clivagem do DNA genmico com algumas enzimas de restrio, como MseI e EcoRI. - O processo desta tcnica dividido em trs passos: 1. Digesto de DNA celular total com uma ou mais enzimas de restrio e ligao de adaptadores especficos para as extremidades coesivas de todos os fragmentos de restrio gerados. 2. Amplificao seletiva de alguns destes fragmentos com dois primers que vo se ligar aos adaptadores correspondente e s sequncias com stios de restrio especficos. 3. Separao eletrofortica dos amplicons em uma matriz, e visualizao de bandas RAPD PCR (Random Amplification of Polymorfic DNA): - Funo semelhante ao AFLP, verifica a variao entre genomas de organismos da mesma espcies (como linhagens de fungos e cepas de bactrias ou leveduras); - Os segmentos de DNA amplificados so aleatrios. RAPD no requer qualquer conhecimento especfico da sequncia de DNA do organismo alvo: os primeris vo ou no amplificar um segmento de DNA, dependendo das posies de anelamento nas sequncias complementares dos primers. Por exemplo, nenhum fragmento produzido se os primers anelarem muito distantes ou se as extremidades 3 dos primers no esto uma diante da outra (anelou do lado errado). Portanto, se uma mutao ocorreu no DNA molde no stio que era anteriormente complementar ao primer (onde ele se anela), um produto de PCR no vai ser produzido, resultando em um padro diferente de segmentos de DNA amplificados no gel. - primers curtos (at 10 nt) e aleatrios, at mesmo gerados por programas estatsticos.

Multiplex PCR: - PCR com mais de um par de primers. H trabalhos com at 25 pares! - til na deteco de linhagens patognicas de bactrias e fungos, anlise de mutaes, delees, deteco de RNA, estudos forenses. - Ela produz uma economia considervel de tempo e esforo dentro do laboratrio, sem comprometer a utilidade do experimento. - Alm disso, tem-se o RealTime MULTIPLEX PCR que usa sondas com fluorforos diferentes.