pavesi, v. c. s. efeito da criolesão no remodelamento da matriz extracelular mme. 2008
TRANSCRIPT
0
UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO
Vanessa Christina Santos Pavesi
EFEITO DA CRIOLESÃO NO REMODELAMENTO DA MATRIZ
EXTRACELULAR EM MÚSCULO ESQUELÉTICO DE RATO
São Paulo, SP
2008
1
UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO
Vanessa Christina Santos Pavesi
EFEITO DA CRIOLESÃO NO REMODELAMENTO DA MATRIZ
EXTRACELULAR EM MÚSCULO ESQUELÉTICO DE RATO
Dissertação de Mestrado
apresentada à Universidade
Nove de Julho, para obtenção
do título de Mestre em Ciências
da Reabilitação.
Orientadora: Profa. Dra. Manoela Domingues Martins
Co-orientadora: Profa. Dra. Raquel Agnelli Mesquita Ferrari
São Paulo, SP
2008
2
Pavesi, Vanessa Christina Santos.
Efeito da criolesao no remodelamento na matriz extracelular em
músculo esquelético de rato. / Vanessa Christina Santos Pavesi.
São Paulo : 2008.
78f.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Nove de Julho, 2008.
Orientador: Profa. Manoela Domingues Martins.
1. Remodelamento muscular. 2. Matriz extracelular. 3. Colágeno IV.
I. Martins, Manoela Domingues.
CDU 612
3
Dedicatória
Aos meus filhos José Fernando e Maria Júlia, sem sua colaboração e compreensão a mamãe não teria conseguido.
4
Agradecimentos
A Deus que se fez sentir presente em todos os momentos.
Aos meus pais José e Fátima, por todo apoio, carinho, amor e compreensão.
Muito obrigada por tudo.
Às minhas irmãs, Andressa e Talissa, por não me deixarem nunca desistir
dos meus objetivos.
À minha querida orientadora e amiga Profa. Dra. Manoela Domingues
Martins, pessoa admirável, a quem devo toda a minha trajetória acadêmica,
aprendi a amar a pesquisa graças ao seu exemplo de competência e ao seu
estímulo.
À minha co-orientadora e amiga Profa. Dra. Raquel Agnelli Mesquita-Ferrari,
profissional e pessoa incrível, agradeço por toda dedicação e paciência.
Às minhas queridas, Profa. Dra. Kristianne Porta Santos Fernandes e Profa.
Dra. Sandra Kalil Bussadori, que sempre acreditaram no meu potencial,
torcendo e comemorando junto comigo cada acerto. Obrigada por todo carinho.
Ao técnico do laboratório de pesquisa, Bruno Duzzi, por toda sua fundamental
colaboração.
Aos técnicos dos laboratórios multidisciplinares da UNINOVE, pela ajuda e
palavras de incentivo.
Ao Prof. Dr. Décio dos Santos Pinto Júnior, Prof. Dr. Fabio Daumas Nunes
e Profa. Dra. Márcia Martins Marques, da Faculdade de Odontologia da USP
que foram essênciais nessa caminhada, colaborando no aperfeiçoamento das
técnicas utilizadas neste estudo.
5
Ao Prof.Dr.Carlos Alberto Silva pelas conversas e trocas de informações que
foram fundamentais para a conclusão desse projeto. A sua querida co-
orientada Joyce por toda atenção e carinho.
A todos os colegas do Mestrado, em especial Marcos Paulo, Luciane e
Lara, pelo convívio e troca de experiências que contribuíram para meu
crescimento pessoal e profissional
Aos alunos de iniciação científica Dayane Aparecida Mesquita, Juliana
Baptista, Sérgio Bezerra e Aline Cervera, pelo agradável convívio e
empenho na execução deste e de outros trabalhos.
À técnica Elisa Santos, do laboratório de Patologia Bucal da FOUSP, por
sempre se mostrar disposta a ajudar.
Ao Prof. Dr. Marcelo Betti Mascaro e as técnicas do laboratório de
Neurociência do ICB-USP Sra. Joelcimar Martins da Silva e Sra. Amanda
Ribeiro de Oliveira pela disposição e atenção durante a utilização do criostato.
Aos amigos que mesmo distantes, sempre estiveram muito presentes, Marcelo
Cancherini, Mirela Cunha, Adriana Tavares e Dr. Mário Velloni.
Aos professores do Programa de Mestrado em Ciências da Reabilitação por
todos os ensinamentos e agradável convívio.
Ao Prof. Dr. João Carlos Ferrari Correa, coordenador do Programa de
Mestrado em Ciências da Reabilitação da UNINOVE, pela oportunidade.
À secretária do Programa de Mestrado em Ciências da Reabilitação da
UNINOVE, Srta. Juliana Ribeiro por toda ajuda e atenção.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela
bolsa concedida.
6
Resumo
O objetivo deste estudo foi investigar os componentes da matriz
extracelular (MEC) durante a regeneração muscular esquelética. Foram
utilizados 60 ratos Wistar sendo que destes, foram organizados 4 grupos
avaliados 1, 7, 14 e 21 dias após a lesão (10 animais/grupo). Esses grupos
foram submetidos à criolesão no músculo tibial anterior do lado esquerdo e os
músculos contralaterais foram os controles. Foi realizado um grupo sham, que
recebeu apenas o procedimento cirúrgico e um grupo de animais controle que
não recebeu nenhuma intervenção. Os músculos foram submetidos à
colorações por hematoxilina & eosina e imuno-histoquímica para detecção de
colágeno tipo IV, MMP-2 e MMP-9. A atividade enzimática de MMPs foi
verificada pela zimografia. Os músculos controle mostraram morfologia normal,
o grupo sham exibiu leve infiltrado inflamatório. No grupo criolesionado foi
observado após 1 dia moderado infiltrado inflamatório e áreas de necrose.
Após 7 e 14 dias pode-se observar redução significativa do processo
inflamatório, ausência de necrose e presença de células musculares imaturas.
Aos 21 dias o músculo mostrou evidência de reparo completo. O colágeno IV
mostrou-se desorganizado por entre as fibras lesadas após 1 dia da criolesão e
se reorganizou gradualmente ao longo dos 21 dias. A imunoreatividade da
MMP-2 e MMP-9, assim como a atividade de MMP-2 se mostraram
relacionadas com a fase do reparo tecidual. Após 1 dia da injúria foi observado
aumento da imunomarcação da MMP-2 e MMP-9 e da atividade da MMP-2.
Conclui-se que, aumento e diminuição dos níveis de marcação e atividade de
MMPs estão relacionados com a degradação e o acúmulo de colágeno IV,
durante o remodelamento da MEC no músculo esquelético.
Palavras chaves: remodelamento muscular, matriz extracelular, colágeno IV,
MMP-2, MMP-9.
7
Abstract
The aim of the present study was to investigate components of
extracellular matrix (ECM) during the skeletal muscle regeneration after
cryolesion in rats. Sixty adult Wistar rats were used. The animals were divided
into 4 groups: 1, 7, 14 and 21 days post-injury (10animls/group). One of the
tibialis anterior muscles was cryolesioned and the contralateral muscle was
used as the control. One sham group, in which animals received only the
surgical procedure and one group of control animals that do not receive any
intervention were included. The muscles were submitted to hematoxylin-eosin
and immunohistochemistry staining for collagen IV, MMP-2 and MMP-9
detection. The MMP enzymatic activity was verified by zymography. The control
muscles showed normal morphology and the sham group exhibited an
inflammatory infiltrated. After 1 day, the cryolesioned group exhibit moderate
inflammatory infiltrated and necrosis areas. At 7 and 14 days a significant
reduction of the inflammatory process, absence of necrosis and presence of
immature muscular cells could be observed. The injured group revealed total
remodeling after the 21 days. Collagen IV showed a disordered distribution
pattern after 1 day of injury and gradually it was reorganized during the 21 days
of the muscle regeneration. The MMP-2 and MMP-9 immunolabeling, as well,
the MMP-2 activity were related to the phase of skeletal muscle repair. After 1
day, an increase on MMP-2 and MMP-9 labeling and MMP-2 activity were
observed. In conclusion, the increase and decrease of immunolabeling and
activity of MMP were related to the break down and accumulation of collagen IV
during the skeletal muscle remodeling.
Keywords: muscle remodeling, extracellular matrix, collagen IV, MMP-2, MMP-
9
8
Sumário
1. Contextualização.............................................................................12
2. Estudos............................................................................................15
2.1. Artigo 1- Remodelamento do músculo esquelético: papel da matriz
extracelular..............................................................................................15
2.2. Artigo 2- Distribuição do colágeno IV no remodelamento de músculo
esquelético de rato após criolesão..........................................................32
2.3. Artigo 3- Estudo da imunolocalização e atividade da MMP-2 e MMP-
9 durante o remodelamento muscular após injúria..........…………….…50
3. Considerações Finais.......................................................................70
Referências Bibliográficas...................................................................71
Anexos...................................................................................................74
9
Lista de Ilustrações
Artigo 1
Figura 1. Fotomicrografias de marcação imuno-histoquímica para colágeno I, III
e IV em músculos normais........................................ .......................................26
Artigo 2
Figura 1 - Peso corporal médio (g) inicial e final ± desvio padrão dos animais
durante todos os períodos experimentais..........................................................40
Figura 2 - Peso médio (g) do músculo criolesionado e controle ± desvio padrão
dos animais durante todos os períodos experimentais......................................41
Figura 3. Fotomicrografias dos cortes histológicos de músculos controle e
criolesionados corados por hematoxilina & eosina............................................42
Figura 4. Fotomicrografias de marcação imuno-histoquímica para colágeno IV
em músculos controle e criolesionados............ ...............................................44
Artigo 3 Figura 1. Distribuição imuno-histoquímica da MMP-2 no músculo esquelético
em ratos …....................……………………………………………………….....…57
Figura 2. Análise imuno-histoquímica da MMP-9 no músculo esquelético. A
distribuição de MMP-9 foi semelhante à MMP-2.…………………………......…58
Figura 3. Análise da atividade das MMP-2 (62kDa) e MMP9 (82kDa) em extratos de músculo TA por zimografia em SDS-PAGE gelatina1%. ...............59
Figura 4. Concentração de MMP-2 no músculo TA apresentados como a média
e DP.…..………………………………………………………………………………60
10
Lista de Abreviaturas e Símbolos
%- Percentual
µg- Microgramas
µm- Micrômetros
ABR- Affinity BioReagents
BSA- Albumina de soro bovina
CaCl2- Cloreto de cálcio
COBEA- Colégio Brasileiro de Experimentação animal
DAB- 3-31-diaminobenzidina
ECM- Extracellular matrix
HCl- Ácido clorídrico
HE- Hematoxilina-eosina
HGF- Fator de crescimento de hepatócitos
HPR- Enzima horseradish peroxidase
ICLAS- International Council of Laboratory Animal Science
ICTP- Concentração intersticial terminal de telopeptideos
IGF- Fator de crescimento insulina-símile
LSAB- Labeled streptavidinbiotin
MEC- Matriz extracelular
mg/mL- Miligrama por mililitro
Min- Minutos
mM- Milimolar
MMP- Metaloproteinase
MyoD- Fator miogênico
NaCl- Cloreto de sódio
NaN3- Azida Sódica
NIH- National Institutes of Health
oC- Graus Celsius
PBS- Tampão salina fosfato
pH- Potencial hidrogeniônico
RNAm- Ácido ribonucléico
s- Segundos
11
SDS- Sodium dodecyl sulfate
TA- Tibial anterior
TIMP- Inibidor tecidual de MMPs (metalopeptidases);
TNF- Fator de necrose tumoral
TrisHCl- Tampão contendo Tris 10mM e NaCl (cloreto de sódio) 100mM
ZnCl2- Cloreto de zinco
12
1. Contextualização
As lesões musculares, freqüentes dentro das práticas desportivas e
ambiente de trabalho, levam ao comprometimento de atividades ocupacionais e
de lazer1. Assim sendo, existe considerável interesse na regeneração do
músculo esquelético em função de várias situações que necessitam desta
como: transplantes, distrofias musculares, traumas despostivos entre outras2.
Os músculos esqueléticos são tecidos dinâmicos compostos por fibras
musculares e células satélites embebidas em uma matriz extracelular (MEC)
que exibem capacidade de se adaptar ou se modificar frente a diversos
estímulos3,4.
O processo de remodelamento muscular pode ser dividido em três fases
denominadas de destruição, reparo e remodelamento tecidual. Na primeira,
observa-se a formação de hematomas, necrose tecidual, degeneração e
resposta inflamatória celular. Na segunda nota-se fagocitose do tecido
degenerado, regeneração das fibras musculares, produção tecidual e
crescimento vascular. Na última fase denominada de remodelamento ocorrem
os processos de maturação das fibras regeneradas e reorganização tecidual5,6.
O remodelamento fisiológico ou patológico do músculo esquelético
depende, dentre outros fatores, da ação coordenada da degradação e síntese
de proteínas intracelulares e dos componentes da matriz extracelular. Portanto,
modificações nos músculos esqueléticos tais como aumento ou diminuição de
atividade contrátil, lesão muscular que gere inflamação ou atrofia promovem o
remodelamento da MEC. Esta por sua vez, representa um conglomerado de
substâncias com propriedades bioquímicas e biofísicas, que mantém a
integridade estrutural e individual das fibras musculares7. As interações entre
célula-célula e célula–MEC suprem as células com informações essenciais
para homeostase e para o controle da morfogênese, crescimento e
diferenciação 8,9.
As principais macromoléculas que compõem a MEC são representadas
por proteínas colagênicas (colágenos) e não-colagênicas (fibronectina,
tenascina, laminina), proteoglicanas, incluindo-se o ácido hialurônico, sulfato de
condroitina e sulfato de heparana e fosfolipídios7.
13
Os principais colágenos identificados no músculo esquelético são os
tipos I e III no epimísio, perimísio e endomísio e os tipos IV e V na membrana
basal, em volta das fibras individuais do músculo, fibras de músculo liso de
vasos sangüíneos e células de Schwann7. A associação entre o aumento da
síntese de colágeno e os processos regenerativos que ocorrem no tecido
muscular após dano, principalmente os causados por exercício, tem sido
demonstrada na literatura10-19.
As metaloproteinases de matriz (MMPs) compreendem uma família de
endoproteases que degradam um ou vários componentes da MEC tais como
colágeno, elastina, laminina e proteoglicanos. As MMPs, portanto, estão
envolvidas no remodelamento da matriz extracelular em uma grande variedade
de fenômenos fisiológicos e patológicos nos diferentes tecidos dentre eles, no
músculo esquelético 9,20,21.
A MMP-2 e a MMP-9 parecem ter um papel mais importante na
adaptação do músculo esquelético a alterações de demanda contrátil ou em
resposta a injúria e atividade física. A ativação de MMP-2 e MMP-9 também
está envolvida em várias miopatias e alterações inflamatórias induzidas em
músculos esqueléticos 18,22-26.
Alguns modelos de estudo de remodelamento muscular frente a
diferentes exercícios físicos e a miotoxinas já estão bem estabelecidos na
literatura 26-29 e verificam as modificações do padrão dos diferentes tipos de
colágeno e expressão de MMPs .
O modelo de criolesão promove necrose em uma área delimitada do
músculo, consequentemente edema e reação inflamatória. Alguns trabalhos
estudaram o remodelamento do músculo frente à criolesão 28,30-32 entretanto,
estes não abordaram as características da MEC no remodelamento muscular.
Os estudos sobre as modificações da MEC no músculo esquelético, em
situações fisiológicas e patológicas, vêem sendo desenvolvidos para melhor
compreender o papel da cada proteína tecidual, mas, principalmente, para
desenvolver métodos de prevenção e reabilitação de lesões musculares;
seleção de tipo, carga e duração do exercício em treinamento físico e para
contribuir no desenvolvimento de novas terapias para doenças musculares
congênitas e inflamatórias. O melhor entendimento sobre a participação da
14
MEC na adaptação tecidual frente aos diversos tipos de demanda torna-se um
ponto crucial para o estabelecimento das vias envolvidas no remodelamento do
músculo esquelético. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar os
componentes da MEC, colágeno IV, MMP-2 e MMP-9, durante a regeneração
muscular esquelética em rato.
15
2. Estudos
2.1. Artigo 1- Submetido para publicação no periódico Fisioterapia em
Movimento (Anexo 1).
Remodelamento do músculo esquelético: papel da matriz extracelular
Skeletal muscle remodeling: role of extracellular matrix
Vanessa Christina Santos Pavesi1, Raquel Agnelli Mesquita-Ferrari2, Dayane
Aparecida Mesquita3, Juliana Baptista4, Manoela Domingues Martins2.
1 Aluna de mestrado em Ciências da Reabilitação da Universidade Nove de
Julho e bolsista de Mestrado FAPESP;
2 Docentes do Mestrado em Ciências da Reabilitação da Universidade Nove de
Julho – UNINOVE;
3 Aluna de Iniciação Científica do Curso de Fisioterapia da Universidade Nove
de Julho e bolsista de Iniciação Científica FAPESP;
4 Aluna de Iniciação Científica do Curso de Fisioterapia da Universidade Nove
de Julho e bolsista PIBIC/CNPq.
Endereço para contato: *Manoela Domingues Martins, Rua Demóstenes, 636
apto 11, Campo Belo, CEP 04614-010, São Paulo-SP, Brasil, 11-83156030 E-
mail: [email protected]
TÍTULO CONDENSADO: Matriz extracelular no remodelamento muscular
16
Remodelamento do músculo esquelético: papel da matriz extracelular
Skeletal muscle remodeling: role of extracellular matrix
TÍTULO CONDENSADO: Matriz extracelular no remodelamento muscular
Resumo
A plasticidade ou remodelamento do músculo esquelético em resposta a
estímulos diferentes, tanto em situações fisiológicas como patológicas, tem
sido demonstrada em vários modelos experimentais e estudos clínicos. Este
processo depende de uma ação coordenada entre a degradação e síntese da
matriz extracelular (MEC) e, portanto, as alterações nos componentes da
matriz vêm sendo alvo de inúmeros trabalhos nos últimos anos. O objetivo do
presente estudo foi revisar a literatura sobre o papel dos diversos tipos de
colágeno, que são os principais componentes da MEC, das metaloproteinases
(MMPs) e dos inibidores de metaloproteinases (TIMPs) no processo de
remodelamento muscular esquelético.
Palavra-chave: Músculo esquelético; Matriz extracelular, Remodelamento
muscular, Colágeno, Metaloproteinases.
Abstract
The skeletal muscle remodeling in response to several stimuli in
physiological and pathological conditions have been demonstrated by different
experimental and clinical studies. This process depends on an interaction
between the degradation and synthesis of extracellular matrix. Therefore, the
modifications in the extracellular matrix components have been studied in last
years. The aim of this study was to revise the literature about collagen types
that are the main components of the MEC, metalloproteinases (MMPs) and
metalloproteinases inhibitors (TIMPs) during the skeletal muscle healing
process.
Keywords: Skeletal muscle, Extracellular matrix, Muscle remodeling, Collagen,
Metalloproteinases.
17
Introdução
Os músculos esqueléticos representam cerca de 40 a 45% do peso
corpóreo total e são essenciais para o movimento do corpo, respiração e
manutenção da postura. Esse tecido é dinâmico e pode alterar suas
características fenotípicas, proporcionando uma melhor adaptação funcional
frente a estímulos variados. Sendo que, após o nascimento, a massa muscular
e o fenótipo são determinados, em parte, por influências e sinais ambientais
(1,2).
Existe considerável interesse na regeneração do músculo esquelético
em função de várias situações que necessitam desta como: reparo rápido de
lesões em atletas, transplantes, distrofias musculares, atrofias por desuso ou
permanência no espaço entre outras (2).
O remodelamento tecidual fisiológico ou patológico do músculo
esquelético depende da ação coordenada da degradação e síntese de
proteínas intracelulares e dos componentes da matriz extracelular (MEC). Esta
por sua vez, representa uma enorme e complexa rede de macromoléculas
compostas de várias proteínas versáteis e polissacarídeos que são secretados
localmente e montados em associação com a superfície celular que os produz.
As interações entre célula-célula e célula–MEC suprem as células com
informações essenciais para homeostase e para o controle da morfogênese,
funções tecido-específicas, migração celular, reparo e morte celular (3,4).
As variações nas quantidades relativas dos diversos tipos de
macromoléculas e o modo como são organizadas na MEC geram uma grande
diversidade de formas, cada uma adaptada às necessidades funcionais
particulares de cada tecido. Nos tecidos musculares a MEC circunda as fibras
musculares conferindo suporte e proteção e é importante na manutenção da
integridade funcional das fibras (5).
O objetivo principal do presente estudo foi revisar a literatura sobre o
papel dos diferentes componentes da MEC, das metaloproteinases (MMPs) e
inibidores de metaloproteinases (TIMPs) no processo de remodelamento
muscular esquelético.
1. Regeneração e Remodelamento do Músculo Esquelético
A lesão muscular é um fenômeno comum que pode ocorrer em função de
18
exercícios físicos intensos, traumas, contusões, eletroestimulação entre outros
e envolve uma resposta inflamatória seguida de processo de cicatrização e
reparo tecidual. Este processo de remodelamento do músculo esquelético após
injúria é complexo e ocorre em várias etapas interconectadas que envolvem a
ativação de diferentes tipos de células, em especial as inflamatórias e as
células satélites, com a função de manter e preservar a estrutura e função do
tecido muscular (2,6).
O reparo muscular ocorre em quatro fases interdependentes:
degeneração, inflamação, regeneração e fibrose. As duas primeiras fases são
observadas nos primeiros dias após a agressão enquanto que, a regeneração
muscular ocorre por volta de 7 a 10 dias, com pico máximo na 2a semana
diminuindo na 3a semana. A formação de fibrose (escara) inicia-se entre a 2a
semana e 3a semana após injúria aumentando de tamanho com o passar do
tempo (2,6,7) .
Estudos demonstram que após a agressão muscular, ocorre dano ao
sarcoplasma ou reticulo sarcoplasmático levando a necrose das fibras
musculares e os fenômenos de regeneração muscular são iniciados pela
infiltração de neutrófilos, seguidos de fagocitose dos restos necróticos pelos
macrófagos que invadem a área danificada. As células inflamatórias também
auxiliam na formação de um novo tecido muscular por meio da secreção de
fatores quimiotáticos para outras células inflamatórias e produção de fatores de
crescimento que agem na ativação das células satélites (2,7).
Após o aumento da síntese e da liberação de mediadores químicos
como o IGF (Insulin-like Growth Factor) e HGF (Hepatocyte Growth Factor) e
fatores de transcrição como o MyoD, no local da agressão as células satélite
tornam-se ativadas (7,8). Após a ativação, as células satélites passam por uma
série de estágios que envolvem proliferação, diferenciação em mioblastos e
fusão as miofibras para reparar o dano muscular e/ou para facilitar o aumento
de tamanho do músculo (6). Esses fenômenos estão acompanhados do
aumento da síntese protéica e da expressão gênica no tecido muscular.
Assim como pode ocorrer em outros tecidos conjuntivos vascularizados,
o músculo quando agredido, pode ter ao final do processo inflamatório a
regeneração tecidual ou a fibrose (cicatrização da ferida). Alguns fatores são
determinantes para definir qual desfecho irá ocorrer tais como severidade da
19
injúria, tipo de músculo lesado, intervenção realizada após a lesão, entre outros
fatores (2,9).
Pesquisas vêm sendo desenvolvidas na área de remodelamento tecidual
para desenvolvimento de novas terapias e tecnologias para manter as citocinas
e fatores de crescimentos importantes para a regeneração muscular atuantes,
por longo período de tempo, até que o reparo muscular ocorre por completo.
2. MEC no músculo esquelético
A MEC representa uma complexa rede de macromoléculas composta de
várias proteínas versáteis e polissacarídeos que são secretados localmente e
montados em associação com a superfície celular que os produz. As interações
entre célula-célula e célula–MEC suprem as células com informações
essenciais para homeostase, controle da morfogênese, funções tecido-
específicas, migração celular, reparo e morte celular (3,10,11).
As principais macromoléculas que compõem a matriz extracelular são
representadas por proteínas colagênicas (colágenos) e não-colagênicas
(fibronectina, tenascina, laminina, entre outras), proteoglicanas, incluindo-se o
ácido hialurônico, sulfato de condroitina e sulfato de heparana e fosfolipídios
(3,10,11).
No músculo esquelético, a MEC além de proporcionar a estruturação do
tecido possui um papel bioativo na regulação do comportamento celular,
influenciando assim o seu desenvolvimento e o remodelamento tecidual
fisiológico ou patológico (3,4,12).
A MEC circunda as fibras musculares conferindo suporte e proteção e é
importante na manutenção da integridade funcional das fibras (5). Assim, frente
a qualquer estímulo mecânico existe uma adaptação da MEC que procura
tornar o músculo mais resistente ao dano, para permitir uma transmissão
adequada da força durante a contração muscular (3).
Além disto, a MEC possui importante papel no remodelamento do tecido
muscular, pois este ocorre a partir da ação coordenada da degradação e
síntese de proteínas intracelulares e dos componentes da MEC (3,4,12).
No tecido muscular adulto, um grupo distinto de moléculas da MEC está
envolvido na manutenção da estrutura e função normal deste tecido. As
proteínas predominantes são a laminina-2 e 4 , fibronectina, tenascina,
20
colágeno I, III e IV, e as proteoglicanas como o sulfato de dermatano e de
heparana. Nas situações onde é necessária a adaptação e regeneração do
músculo a expressão destas moléculas pode estar aumentada e alguns outros
tipos podem ser sintetizados localmente tais como laminina-8,-9,-10, -11 e
sindecano (13).
Os principais colágenos identificados no músculo esquelético são os
tipos I e III no epimísio, perimísio e endomísio (Figura 1 a-f) , sendo que os
tipos IV e V estão presentes na membrana basal, em volta das fibras
individuais do músculo, fibras de músculo liso de vasos sangüíneos e células
de Schwann (3). O tipo e a quantidade de colágeno variam de acordo com o
músculo avaliado devido ao papel que o tecido conjuntivo apresenta em cada
tipo de músculo (3,14). Assim como, nas situações de dano muscular gerado
por exercício tem sido observado aumento da síntese de colágeno durante a
regeneração (15).
O colágeno I é importante para a estabilização da arquitetura tecidual e
é chamado de colágeno intersticial uma vez que forma estruturas fibrilares no
espaço intercelular (Figura 1a,b,c). O colágeno tipo I representa a maior parte
do colágeno intramuscular variando entre 30% e 97% do colágeno total
(2,3,15).
Os colágenos II e III também são chamados de colágenos intersticiais,
uma vez que formam estruturas fibrilares no espaço intercelular. O colágeno III
é mais presente em tecido conjuntivo frouxo, possui uma importante função na
elasticidade do tecido (32).
O colágeno IV é exclusivo de membrana basal e é produzido pelas
células musculares sendo formado por moléculas de colágeno que não se
associam em fibrilas, mas prendem-se umas as outras pelas extremidades,
formando uma rede semelhante a uma tela de arame (Figura 1g,h,i). Ele se
associa as várias moléculas não fibrosas da matriz extracelular e forma uma
membrana contínua que compatimentaliza certos tecidos denominada de
membrana basal (3).
No músculo, o colágeno tipo IV é o principal componente da membrana
basal sendo responsável pela manutenção da estabilidade mecânica da fibra
muscular esquelética. Tem sido sugerido que o colágeno tipo IV tem um papel
crítico no arranjo dentro do tecido, embora ele sozinho constitua uma pequena
21
parte do total da MEC. No entanto, a tolerância da membrana basal celular ao
―stress‖ pode no caso de lesões extensas, ser dependente da integridade do
componente colagenoso (16).
3. Remodelamento da matriz extracelular em músculo esquelético frente a
estímulos fisiológicos e patológicos
Modificações na composição da MEC em músculo esquelético humano
sob condições fisiológicas e patológicas têm sido demonstradas (3,14,17) e,
em especial, são analisados os colágenos e as MMPs.
No que diz respeito ao componente colagenoso da MEC, uma íntima
relação tem sido estabelecida entre aumento da síntese de colágeno e o
processo regenerativo que ocorre no músculo esquelético em resposta as
diferentes atividades físicas (3). Sendo que, o aumento da síntese de colágeno
após exercício pode representar uma adaptação fisiológica ou parte do
processo de reparo com ou sem dano tecidual evidente (18).
Estudos demonstram que o colágeno IV aumenta nos músculo de ratos
após longos períodos de treinamento (19), após contrações (20, 21), exercícios
agudos (14,15,22,23) e hipertrofia compensatória experimental (40). Assim
como, foi verificado o aumento dos níveis de RNAm de colágeno I e III no
músculo esquelético de ratos após corrida (18).
Koskinen et al.(14) estudaram o efeito do exercício intenso no
remodelamento da MEC do músculo. Estes autores mostraram que o dano
muscular causado pelo exercício agudo em animais ocasiona modificações na
concentração de colágeno IV intramuscular. Neste estudo foi observado que a
MMP-2, enzima que degrada o colágeno tipo IV, esteve aumentada nas fases
de dano muscular severo e o aumento de colágeno IV esteve associado à
regeneração da membrana basal da miofibrilas. TIMP-1, uma enzima que inibe
a atividade de MMP, parece estar ativada durante as fases iniciais do dano
tecidual enquanto que o inibidor TIMP-2 foi ativado nas fases tardias do dano
muscular.
Mackey et al. (21)avaliaram o efeito da contração excêntrica máxima no
remodelamento do colágeno em humanos. Os voluntários realizaram 100
contrações excêntricas máximas voluntárias de extensão do joelho. Foram
realizadas biópsias musculares antes, após 4 e 22 dias de exercício. Os
22
autores observaram um aumento do colágeno tipo IV no endomísio após uma
única contração excêntrica máxima sugerindo um remodelamento da MEC.
Moore et al. (24) avaliaram o perfil do colágeno e de proteínas
miofibrilares após contração muscular máxima em posição de alongamento e
encurtamento muscular. Ambas as situações de contração máxima provocaram
aumento na síntese das proteínas miofibrilares, entretanto durante o
alongamento este aumento foi mais rápido e maior quando comparado a outra
situação podendo ocasionar hipertrofia muscular. A análise da síntese de
colágeno mostrou aumento desta proteína após contração máxima em ambas
as formas de contração.
Em contraste com o aumento muscular, durante o envelhecimento,
imobilização e denervação, ocorre um aumento na concentração da MEC, em
especial dos colágenos, no músculo (25,26,27). A imobilização de membros de
ratos leva a uma diminuição da atividade de biosíntese de colágeno (3,26,29)
evidenciando-se pela diminuição dos níveis de RNAm dos colágenos I, III e IV
após imobilização (17, 28) e diminuição da taxa de degradação do colágeno
(25,28) promovendo o acúmulo deste componente da MEC.
Metaloproteinases de Matriz (MMPs)
As metaloproteinases de matriz (MMPs) compreendem uma família de
pelo menos vinte enzimas (endoproteases) que degradam um ou vários
componentes da matriz extracelular, portanto, estão envolvidas no
remodelamento da matriz extracelular em situações fisiológicas e patológicas
(30, 31,32).
Com base em sua estrutura primária, organização, especificidade de
substrato e localização celular, as MMPs tem sido classificadas em 6
subfamilias maiores quem incluem as colagenases (MMP-1, MMP-8, MMP-13 e
MMP-18), gelatinases (MMP-2 e MMP-9), estromelisinas (MMP-3, MMP-10 e
MMP-11), MMPs tipo membrana (MMP-14 até MMP-17), e outras MMPs como
a matrilisina (MMP-7),e metaloeslastase (MMP-12) (33). O número de MMPs
descritas tem aumentado, embora o atual conhecimento sobre seus padrões de
expressão em vários tecidos permaneça incompleto (34).
As MMPs podem degradar os componentes da matriz extracelular sendo
que as colagenases (MMP-1 e MMP-8) iniciam a degradação do colágeno tipo
23
I, colágeno tipo II e outras fibrilas colagênicas; as gelatinases (MMP-2 e MMP-
9) quebram o colágeno tipo IV e outros componentes da matriz extracelular
enquanto que a MMP-9 também é capaz de digerir colágeno tipo XI, and XIV
(5,26).
No músculo esquelético, as MMPs desempenham um importante papel
no desenvolvimento, homeostase e regeneração da matriz extracelular (MEC).
Alterações da exigência do músculo esquelético (sobrecarga ou redução da
atividade contrátil) promovem o remodelamento da MEC e consequentemente
ativam as MMPs específicas que garantirão este processo (35).
As alterações na atividade das MMPs podem também estar associadas
a quadros patológicos uma vez que a excessiva ou inapropriada expressão de
MMPs contribui para a patogênese de muitos processos teciduais destrutivos,
incluindo artrite reumatóide, miosite focal, esclerose múltipla e periodontite (36)
e falhas na atividade de MMPS podem ser notadas nas doenças fibróticas
devido a uma maior deposição de MEC (10,11).
Várias MMPs estão presentes no músculo, mas particularmente duas
possuem um importante papel na adaptação muscular frente a alteração de
demandas contráteis e em resposta a lesão, sendo estas a MMP-2 (também
conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (gelatinase B). Ambas pertencem a um
grupo de endoproteinases de cálcio e zinco que degradam o colágeno tipo IV e
tem uma importante função na homeostase da MEC durante a morfogênese,
proliferação e apoptose celular em uma larga gama de tecidos (37).
Nos músculos esqueléticos normais os níveis de MMP-2 ativas são
relativamente baixos na MEC e a atividade da MMP-9 está ausente, sendo que
a expressão destas enzimas sofre regulação por citocinas e fatores de
crescimento (37). No entanto, o aumento de expressão de ambas MMPs, -2 e -
9, têm sido demonstrado em várias miopatias e em condições inflamatórias no
músculo esquelético (37,38). Além disso, o aumento da MMP-2 também tem
sido descrito em situações de proliferação e diferenciação de células
musculares, cicatrização após injúria e manutenção do tecido conjuntivo
circunjacente (35).
Outros estudos evidenciaram que a expressão de MMP-2 nos músculos
esqueléticos sofreu aumento após aplicação de estimulação elétrica crônica
24
(39), após corrida e após exercícios de alta intensidade (35). Já a expressão de
MMP-9 aumentou após aumento crônico do fluxo sanguíneo (40), após corrida
(35) e em fases iniciais da resposta inflamatória do músculo frente à miotoxina
(41),
Rodolico et al. (36) estudaram o padrão imunoistoquímico das MMPs 2,
7 and 9 em miosite focal e compararam com polimiosite e dermatomiosite. Os
autores observaram que existe um aumento de imunoreatividade para MMP-9
nas células musculares em todas as miopatias e sugerem que a MMP-2 e
MMP-7 não estão implicadas na miosite focal, pois as amostras desta condição
não mostraram imunoreatividade para estas proteínas teciduais.
Reznick (42) avaliaram as MMPs após imobilização e verificaram por
meio de zimografia que a atividade da MMP-2 sofre aumento de expressão
durante as 4 semanas de imobilização. Com relação a MMP-9 também foi
possível observar uma aumento de expressão após esta imobilização e, além
disso, deve ser ressaltado o fato de que esta protease não foi detectada nos
animais controle, que não sofreram imobilização. De acordo com os autores, o
papel da MMP-2 e MMP-9 provavelmente seja diferente uma vez que a MMP-2
é secretada por vários tipos de células do tecido conjuntivo e pode degradar
vários colágenos intersticiais (I-V) e a MMP-9 é produzida nos músculos
principalmente pelas células inflamatórias e sua expressão está aumentada em
condições inflamatórias severas. Apesar de MMP-2 e MMP-9 terem os mesmos
substratos elas são expressas e moduladas por diferentes citocinas e fatores
de crescimento. Por exemplo, TNF (fator de necrose tumoral) secretado pelos
macrófagos regula positivamente mais a MMP-9 do que a MMP-2.
Inibidores de metaloproteinases (TIMPS)
Existem vários mecanismos regulatórios que influenciam na ação das
MMPs sobre a degradação da MEC. Dentre estes, os mais estudados são a
regulação da transcrição, ativação de MMPs latentes e inibição por TIMPs, uma
família de proteínas que inibem seletivamente e reversivelmente as MMPs (43).
Os TIMPs são derivados das células musculares e secretados na MEC e
se ligam as MMPs na forma de zimogênio regulando a formação e a maturação
da MMP-2 e MMP-9 (31). TIMP-2 é conhecido por se ligar mais efetivamente a
25
MMP-2, enquanto que TIMP-1 possui maior afinidade pela MMP-9. Assim, os
níveis de atividade dos TIMPs mudam em paralelo com as alterações da
atividade da MMP-2 e MMP-9 (14,44).
Alterações no balanço entre MMPs e TIMPs podem causar alterações na
composição da MEC e afetar as funções celulares (45).
Curiosamente, TIMPs são as vezes ativados juntos com as MMPs em
resposta a atividade física indicando estimulação simultânea e inibição da
degradação. Em vez de considerar estas, como ações competitivas, é provável
que a atividade da MMP proceda a atividade dos TIMPs, e portanto, TIMPs
servem como reguladores da degradação terminal para garantir um limite de
degradação. Para sustentar mais que uma reação de integração das MMPs e
TIMPs existentes, TIMP-2 tem se mostrando importante para uma ativação de
pro-MMP-2 in vivo. TIMP-1 tem sido encontrada correlacionada com
concentração intersticial terminal de telepeptídeos (ICTP) em pacientes com
câncer indicando atividade em e controle da degradação de colágeno (3).
Embora MMPs e TIMPs sejam expressados no músculo, pouco é
conhecido sobre seu papel no desenvolvimento, remodelamento e função do
tecido músculo esquelético (46).
Considerações finais
Os estudos sobre as modificações da MEC no músculo esquelético, em
situações fisiológicas e patológicas, vêem sendo desenvolvidos para melhor
compreender o papel da cada proteína tecidual, mas, principalmente, para
desenvolver métodos de prevenção e reabilitação de lesões musculares;
seleção de tipo, carga e duração do exercício em treinamento físico e para
contribuir no desenvolvimento de novas terapias para doenças musculares
congênitas e inflamatórias. Desta forma, o melhor entendimento sobre a
participação de MMPs e respectivos TIMPs na adaptação tecidual frente aos
diversos tipos de demanda torna-se um ponto crucial para o estabelecimento
das vias que estariam envolvidas e que permitiriam o remodelamento do
músculo esquelético.
26
Figura 1. Fotomicrografias de marcação imuno-histoquímica para colágeno I, III
e IV em músculos normais. O colágeno I (a,40x; b,100x; c,400x) e III (d,40x;
e,100x; f,400x) distribui-se de forma linear em torno do endomísio e perimísio.
O colágeno III mostra uma marcação mais intensa (d,e,f). O colágeno IV no
endomísio (g, 40x) e perimísio (h, 100X; i,400x) mostra marcação mais
delicada.
Agradecimentos
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela
bolsa de IC (processo no 07/55439-6) e de mestrado (processo no 07/52927-0).
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico pela bolsa
de Iniciação Científica.
Col I
Col III
Col IV
27
Bibliografia
1. Goldspink G. Selective gene expression during adaptation of muscle in
response to different physiological demands. Comp Biochem Physiol B
Biochem Mol Biol 1998; 120:5-15.
2. Huard J, Li Y, Fu FH. Muscle injuries and repair: current trends in
research. J Bone Joint Surg Am 2002; 84:822-32.
3. Kjaer M. Role of extracellular matrix in adaptation of tendon and skeletal
muscle to mechanical loading. Physiol Rev 2004; 84:649-98.
4. Carmeli E, Moas M, Reznick AZ , Coleman R. Matrix metalloproteinases
and skeletal muscle: a brief review. Muscle Nerve 2004; 29: 191–197.
5. Chiquet M, Matthison M, Koch M, Tannheimer M, Chiquet-Ehrismann R.
Regulation of extracellular matrix synthesis by mechanical stress.
Biochem Cell Biol 1996; 74:737–744.
6. Shi X, Garry DJ. Muscle stem cells in development, regeneration, and
disease. Genes Dev 2006; 20:1692-708.
7. Bischoff R. The satellite cell and muscle regeneration. In: Engel AG,
Franzini-Armstrong C, editors. Myology. Basic and clinical. 2nd ed. New
York: McGraw-Hill; 1994. p 97-118.
8. Hawke TJ, Garry DJ. Myogenic satellite cells: physiology to molecular
biology. J Appl Physiol 2001; 91:534–551.
9. Prisk V, Huard J. Muscle injuries and repair: the role of prostaglandins
and inflammation. Histol Histopathol 2003; 18:1243-56.
10. Tracy A-KL, Senior RM. Fragments of extracellular matrix as mediators
of inflammation. Int J Biochem Cell Biol 2008; 40: 1101-1110.
11. Velleman SG. The Role of the Extracellular Matrix in Skeletal Muscle
Development. Poltry Science 1999; 78:778-784.
12. Carmeli E, Moas M, Lennon S, Powers SK. High intensity exercise
increases expression of matrix metalloproteinases in fast skeletal muscle
fibres. Exp Physiol 2005; 90: 613-9.
13. Lewis MP, Machell JR, Hunt NP, Sinanan AC, Tippett HL. The
extracellular matrix of muscle-implications for manipulation of the
craniofacial musculature. Eur J Oral Sci 2001; 109: 209-21.
14. Koskinen SO, Wang W, Ahtikoski AM, Kjær M, Han XY, Komulainen J,
Kovanen V, and Takala TES. Turnover of basement membrane type IV
28
collagen in exercise-induced skeletal muscle injury. Am J Physiol Regul
Integr Comp Physiol 2001; 280: R1292– 1300.
15. Myllylä R, Salminen A, Peltonen L, Takala TE, Vihko V. Collagen
metabolism of mouse skeletal muscle during the repair of exercise
injuries. Pflugers Arch 1986; 407:64–70.
16. Ahtikoski AM, Tuominen H, Korpelainen JT, Takala TE, Oikarinen
A.Collagen synthesis and degradation in polyneuropathy and
myopathies. Muscle Nerve 2004; 30: 602-8.
17. Ahtikoski AM, Koskinen SOA, Virtanen P, Kovanen V, and Takala TES.
Regulation of synthesis of fibrillar collagens in rat skeletal muscle during
immobilization in shortened and lengthened positions. Acta Physiol
Scand 2001; 172: 131–140.
18. Han XY, Wang W, Komulainen J, Koskinen SO, Kovanen V, VihkoV,
Trackman PC, Takala TE. Increased mRNAs for procollagens and key
regulating enzymes in rat muscle following downhill running. Pflugers
Arch 1999; 437: 857–864.
19. Kovanen V, Suominen H, Risteli J, Risteli L. Type IV collagen and
laminin in slow and fast skeletal muscle in rats--effects of age and life-
time endurance training. Coll Relat Res 1988; 8: 145-53.
20. Koskinen SO, Ahtikoski AM, Komulainen J, Hesselink MK, Drost MR,
Takala TE. Short-term effects of forced eccentric contractions on
collagen synthesis and degradation in rat skeletal muscle. Pflugers Arch
2002; 444: 59-72.
21. Mackey AL, Donnelly AE, Turpeenniemi-Hujanen T, Roper HP. Skeletal
muscle collagen content in humans after high-force eccentric
contractions. J Appl Physiol 2004; 97: 197-203.
22. Savolainen J, Väänänen K, Vihko V, Puranen J, Takala TES Effect of
immobilization on collagen synthesis in rat skeletal muscles. Am J
Physiol 1987; 252: R883–R888.
23. Zimmerman SD, McCormick RJ, Vadlamudi RK, Thomas DP. Age and
training alter collagen characteristics in fast-and slow-twitch rat limb
muscle. J Appl Physiol 1993; 75: 1670–1674.
24. Moore DR, Phillips SM, Babraj JA, Smith K, Rennie MJ. Myofibrillar and
collagen protein synthesis in human skeletal muscle in young men after
29
maximal shortening and lengthening contractions. Am J Physiol
Endocrinol Metab 2005; 288: E1153–1159.
25. Kannus P, Jozsa L, Jarvinen TL, Kvist M, Vieno T, Jarvinen TA, Natri A,
Jarvinen M. Free mobilization and low- to high-intensity exercise in
immobilization-induced muscle atrophy. J Appl Physiol 1998; 84: 1418–
1424.
26. Savolainen J, Myllylä V, Myllylä R, Vihko V, Väänänen K, Takala TE.
Effects of denervation and immobilization on collagen synthesis in rat
skeletal muscle and tendon. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol
1988; 254: R897–902.
27. Virtanen P, Tolonen U, Savolainen J, Takala TE. Effect of reinnervation
on collagen synthesis in rat skeletal muscle. J Appl Physiol 1992; 72:
2069–2074.
28. Ahtikoski AM, Koskinen SOA, Virtanen P, Kovanen V, Risteli J, Takala
TE. Type IV collagen in rat skeletal muscle during immobilization in
shortened and lengthened positions. Acta Physiol Scand 2003; 177:
473–481.
29. Savolainen J, Väänänen K, Puranen J, Takala TE, Komulainen J, Vihko
V. Collagen synthesis and proteolytic activities in rat skeletal muscles:
effect of cast-immobilization in the lengthened and shortened positions.
Arch Phys Med Rehabil 1988; 69: 964–969.
30. Chakraborti S, Mandal M,Das S, Mandal A, Chakraborti T. Regulation of
matrix metalloproteinases.Mol Cell Biol 2003; 253:269 –285.
31. Guerin CW, Holland PC. Synthesis and secretion of matrix degrading
metalloproteinases by human skeletal satellite cells. Dev Dyn 1995; 202:
91–99.
32. Curran S, Murray GI. Matrix metalloproteinases: molecular aspects of
their roles in tumor invasion and metastasis. Eur J Cancer 2000; 36:
1621-1630.
33. Nagase H, Woessner JFJr. Matrix metalloproteinases: a minireview. J
Biol Chem 1999; 274: 21491–21494.
34. Yohei O, Hideaki T, Seiki M. Multifuncional roles of MT1-MMP in
myofiber and morphostatic of sketal muscle. J Cell Sci 2006; 22: 3822-
3832.
30
35. Carmeli E, Haimovitch TG. The expression of MMP-2 following
immobilization and high-intensity running in plantaris muscle fiber in rats.
Scientific World Journal 2006; 6: 542-50.
36. Rodolico C, Mazzeo A, Toscano A, Messina S, Aguennouz M, Gaeta M,
Messina C, Vita G. Specific matrix metalloproteinase expression in focal
myositis: an immunopathological study. Acta Neurol Scand 2005; 112:
173-7.
37. Carmeli E, Haimovitch TG, Nemcovsky CE. Expression of matrix
metalloproteinase 2 and heat shock protein-72 in immobilized muscle in
rats. J Musculoskelet Neuronal Interact 2006; 6: 96-102.
38. Koskinen SO, Kjaer M, Mohr T, Sørensen FB, Suuronen T, Takala TE.
Type IV collagen and its degradation in paralyzed human muscle: effect
of functional electrical stimulation. Muscle Nerve 2000; 23: 580-9.
39. Haas TL, Milkiewicz M, Davis SJ, Zhou AL, Egginton S, Brown MD,
Madri JA, Hudlicka O. Matrix metalloproteinase activity is required for
activity-induced angiogenesis in rat skeletal muscle. Am J Physiol Heart
Circ Physiol 2000; 279: H1540–1547.
40. Van Gieson EJ, Skalak TC. Chronic vasodilatation induces matrix
metalloproteinase 9 (MMP-9) expression during microvascular
remodeling in rat skeletal muscle. Microcirculation 2001; 8: 25–31.
41. Rucavado A, Escalante T, Teixeira CF, Fernandes CM, Diaz C, Gutierrez
JM. Increments in cytokines and matrix metalloproteinases in skeletal
muscle after injection of tissue-damaging toxins from the venom of the
snake Bothrops asper. Mediators Inflamm 2002; 11: 121-8.
42. Reznick AZ, Menashe O, Bar-Shai M, Coleman R, Carmeli E.Expression
of matrix metalloproteinases, inhibitor, and acid phosphatase in muscles
of immobilized hindlimbs of rats. Muscle Nerve 2003; 27: 51-9.
43. Chang C, Werb Z. The many faces of metalloproteases: cell growth,
invasion, angiogenesis, and metastasis. Trends Cell Biol 2001; 11: 37-
43.
44. Gomez DE, Alonso DF, Yoshiji H, Thorgeirsson UP. Tissue inhibitors of
metalloproteinases: structure, regulation and biological functions. Eur J
Cell Biol 1997; 74: 111-22.
45. Singh A, Nelson-Moon ZL, Thomas GJ, Hunt NP, Lewis MP.
31
Identification of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors type
1 and 2 in human masseter muscle. Arch Oral Biol 2000; 45: 431-40.
46. Lluri G, Jaworski DM.Regulation of TIMP-2, MT1-MMP, and MMP-2
expression during C2C12 differentiation. Muscle Nerve 2005; 32: 492-9.
32
2.2. Artigo 2- Submetido para publicação no periódico Revista Brasileira
de Fisioterapia/Brazilian Journal of Physical Therapy (Anexo II).
Distribuição do colágeno IV no remodelamento de músculo esquelético
de rato após criolesão
Colagen IV distribution during rat skeletal muscle remodeling after
cryolesion
Dayane Aparecida Mesquita1, Vanessa Christina Santos Pavesi2, Raquel
Agnelli Mesquita-Ferrari3, Décio dos Santos Pinto Júnior4, Fábio Daumas
Nunes4, Manoela Domingues Martins3.
1 Aluna de Iniciação Científica do Curso de Fisioterapia da Universidade Nove
de Julho e bolsista de Iniciação Científica FAPESP;
2 Aluna de mestrado em Ciências da Reabilitação da Universidade Nove de
Julho e bolsista de Mestrado FAPESP;
3 Docentes do Mestrado em Ciências da Reabilitação da Universidade Nove de
Julho – UNINOVE;
4 Professor Associado do Departamento de Estomatologia, Disciplina de
Patologia Bucal da Faculdade de Odontologia da USP.
Endereço para contato: *Manoela Domingues Martins, Rua Demóstenes, 636
apto 11, Campo Belo, CEP 04614-010, São Paulo-SP, Brasil, 11-83156030 E-
mail: [email protected]
TÍTULO CONDENSADO: Colágeno IV no remodelamento muscular
33
RESUMO
O objetivo do presente estudo foi investigar a distribuição do colágeno IV
durante a regeneração muscular esquelética em modelo de criolesão em rato.
Foram utilizados 25 ratos da linhagem Wistar submetidos a criolesão no
músculo tibial anterior (TA) do lado esquerdo e o músculo contralateral foi o
controle. Os animais foram divididos aleatoriamente em 4 grupos, os quais
foram avaliados 1 dia, 7 dias, 14 dias e 21 dias após a lesão. Foi realizado um
grupo sham, animais controle, que receberam apenas o procedimento
cirúrgico. O peso corpóreo e dos músculos foram obtidos em todos os tempos
experimentais. Os músculos foram analisados pela coloração de H&E e o
colágeno IV pela técnica imuno-histoquímica. Histologicamente, os músculos
controle mostraram morfologia normal, o grupo sham exibiu leve infiltrado
inflamatório e células musculares com núcleo centralizado. No grupo
criolesionado foi observado após 1 dia moderado infiltrado inflamatório e áreas
de necrose. Após 7 dias pode-se observar redução significativa do processo
inflamatório, ausência de necrose e presença de células musculares imaturas.
Aos 21 dias o músculo mostrou evidência de reparo completo. O colágeno IV
mostrou-se desorganizado por entre as fibras lesadas no primeiro dia após a
criolesão e se reorganizou gradualmente durante as fases de remodelamento
muscular ao longo dos 21 dias. Conclui-se que existem modificações na
distribuição do colágeno IV ao longo do remodelamento muscular após
criolesão e que este componente da MEC leva em torno de 21 dias para se
organizar de forma semelhante aos músculos normais
Palavras chave: músculo esquelético, matriz extracelular, colágeno IV,
remodelamento muscular
34
ABSTRACT
The aim of the present study was to investigate the distribution of
collagen IV during skeletal muscle regeneration after cryolesion in rats. Twenty-
five adult Wistar rats were used. One of the tibialis anterior muscles was
cryolesioned and the contralateral muscle was used as the control. The animals
were divided into 4 groups: 1, 7, 14 and 21 days post-injury. One sham group,
in which animals received only the surgical procedure was included and
analyzed after 7 days. Animals were sacrificed and the muscles were submitted
to hematoxylin-eosin and immunohistochemistry staining. Histologically, the
control muscles showed normal morphology and the sham group exhibited an
inflammatory infiltrated. After 1 day, the cryolesioned group exhibit moderate
inflammatory infiltrated and necrosis areas. At 7 days a significant reduction of
the inflammatory process, absence of necrosis and presence of immature
muscular cells could be observed. The injured group revealed total remodeling
after the 21 days. Collagen IV revealed a disordered pattern of distribution after
1 day post-injury and gradually it was reorganized during the 21 days of the
muscle regeneration. In conclusion, this study demonstrates that collagen IV
staining vary according to the phase of tissue repair after cryolesion. This
component of the extracellular matrix leads around 21 days to organize itself of
similar form to the normal muscles.
Key Words: skeletal muscle, extracellular matrix , collagen IV, muscle
remodeling
35
INTRODUÇÃO
O músculo esquelético morfologicamente consiste de fibras musculares,
sendo estas, constituídas de miofibrilas e células satélites embebidas em uma
matriz extracelular (MEC), associados a uma rede de vasos sanguíneos e
nervos 1,8. Frente a estímulos fisiológicos e patológicos distintos, este tecido
possui capacidade de se adaptar, o que caracteriza a sua propriedade de
plasticidade 5,8.
O processo de remodelamento muscular é complexo, ocorre em várias
etapas interconectadas (necrose/degeneração, inflamação, reparo e fibrose)
que envolvem a ativação de diferentes tipos de células e de uma ação
coordenada entre a degradação e síntese da MEC com a função de
restabelecer a estrutura e função do tecido muscular 2,3,4,7,8,9,20,22,23.
No tecido muscular adulto, um grupo distinto de moléculas da MEC está
envolvido na manutenção da sua estrutura e função normal. As proteínas
predominantes são a laminina-2 e 4 , fibronectina, tenascina, colágeno I, III e
IV, e as proteoglicanas como o sulfato de dermatano e de heparana.
Modificações na composição da MEC em músculo esquelético sob condições
fisiológicas e patológicas têm sido demonstradas 9,11 e, em especial , são
analisados os colágenos e as metaloproteinases de matriz (MMPs).
Dentre os diversos tipos de colágenos que podem ser observdos no
músculo, o tipo IV, é o principal componente da membrana basal, sendo
responsável pela manutenção da estabilidade mecânica da fibra muscular
esquelética. Tem sido sugerido que o colágeno tipo IV tem um papel crítico no
arranjo dentro do tecido, embora ele sozinho constitua uma pequena parte do
total da MEC. No entanto, a tolerância da membrana basal celular ao estresse,
como no caso de lesões, serem dependente da integridade desta proteína 9.
Com o intuito de estudar a regeneração muscular e os recursos
terapêuticos utilizados na reabilitação de lesões musculares, vários modelos
experimentais em animais foram desenvolvidos10,11,16,17,19,21,25 tais como:
criolesão, miotoxina, contusão, eletroestimulação, exercício físico,
desnervação, desvascularização que apresentam características próprias de
resposta tecidual. Entretanto, existem lacunas no conhecimento no que diz
respeito a distribuição da MEC durante o remodelamento muscular. Com base
no exposto, o presente estudo teve como objetivo analisar o padrão de
36
distribuição do colágeno IV, a curto e longo prazo, durante o remodelamento do
músculo tibial anterior de rato submetido à criolesão.
MATERIAL E MÉTODOS
A metodologia utilizada neste estudo foi elaborada atendendo às
resoluções 196/96 do Conselho Nacional de Saúde e aprovada pelo Comitê de
Ética (protocolo ANO13/2007-Anexo III). O protocolo experimental utilizado
neste estudo segue os princípios de ética e experimentação animal, elaborados
pelo COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal), entidade filiada ao
International Council of Laboratory Animal Science (ICLAS) com base nas
normas internacionais, que visam o aprimoramento de condutas na
experimentação animal baseando-se em três princípios básicos: sensibilidade,
bom senso e boa ciência.
Animais
Foram utilizados 25 ratos (Rattus norvegicus albinus, Rodentia,
Mammalia da linhagem Wistar) machos, com 8 semanas de vida, com peso
médio inicial de 234g± 37,99g mantidos no biotério da UNINOVE- Unidade
Vergueiro. Os animais foram mantidos em caixas plásticas apropriadas,
temperatura ambiente (25°C) e luminosidade controlados com ciclo de 12 horas
sendo que os animais possuíram comida e água ad libitum.
Em todos os animais utilizados neste estudo um músculo tibial anterior
(TA) foi criolesionado (pata esquerda) e o TA contralateral (pata direita) foi
usado como controle. Os animais foram divididos randomicamente em cinco
grupos sendo classificados de acordo com os períodos de avaliação após a
lesão em: Grupo 1dia (n=5), Grupo 7 (n=5), Grupo 14 dias (n=5) e Grupo 21
dias (n=5) e Grupo sham 7 dias (n=5) que foram animais controle, que
receberam apenas o procedimento cirúrgico (incisão e exposição do TA), sem
criolesão. Os grupo 1 e 7 dias são considerados períodos de avaliação de
remodelamento muscular de curto prazo, enquanto que após 14 e 21 dias de
agressão muscular pode-se considerar avaliação de longo prazo.
37
Modelo de Criolesão
Os procedimentos cirúrgicos foram realizados após os animais terem
sido anestesiados com injeção intramuscular de anestésico geral injetável a
base de Ketamina (Dopalen®) e de Xilazina (Anasedan®). Para aplicação da
anestesia intramuscular foram utilizadas seringas da marca BD 100 Unidades
com Agulha BD Ultra-Fine®, modelo insulina com a agulha Ultra-Fine®
(regular), comprimento: 12,7 mm, calibre: 0,33 mm e bisel trifacetado. Cada
animal foi anestesiado utilizando-se uma mistura de ketamina (0,1 ml/100
gramas do animal) e de xylazina (0,1 ml/100 gramas do animal). O modelo de
criolesão que foi utilizado está de acordo com o descrito por Miyabara et al.16 .
A pele que recobre o músculo da pata esquerda foi tricotomizada, limpa, a
seguir foi realizada uma incisão transversal e afastamento da fáscia que o
recobre.
A criolesão foi realizada por meio de duas aplicações (duração de 10
segundos cada), utilizando bastão metálico de extremidade plana, previamente
resfriado em nitrogênio líquido, diretamente na musculatura. O bastão metálico
a ser utilizado no músculo TA foi de 0.4 x 1 cm. Após o procedimento foi
realizada a sutura das áreas incisadas utilizando-se fio de poliamida (6,0) e os
animais foram mantidos em gaiolas com aquecimento para prevenir a
hipotermia.
O modelo de lesão muscular por meio de criolesão foi o escolhido para
este estudo devido ao fato deste, ser um modelo no qual se consegue executar
uma injúria na superfície ventral do músculo, com características semelhantes,
de forma limpa, causando menor variabilidade na severidade da lesão18.
Os animais foram pesados antes da realização da lesão e nos dias de
sacrifício de cada grupo. Os animais foram sacrificados com overdose de
anestésico.
Técnica histológica
Após o sacrifício dos animais, os músculos TA (controle e tratado) foram
cuidadosamente dissecados, divididos em dois fragmentos, proximal e distal,
imediatamente resfriados em isopentano por 10 segundos e congelados a
seguir em nitrogênio líquido. Os fragmentos musculares foram posicionados de
38
modo a fornecer, durante a microtomia cortes transversais. Esses materiais
foram armazenados em freezer -70º C.
Cortes seriados de 10 μm foram obtidos em criostato, à temperatura de
−20°C, coletados em lâminas de vidro silanizadas e submergidos em acetona e
secos à temperatura ambiente por 10 minutos em cada etapa.
Para análise morfológica utilizou-se coloração com Hematoxilina e
Eosina (HE) e os cortes histológicos foram avaliados por microscopia de luz
(microscópio Axioplan 2 Zeiss).
Os critérios morfológicos utilizados para avaliar as etapas do
remodelamento tecidual foram a presença e o tipo de infiltrado inflamatório,
edema, necrose, fibras com núcleos centralizados e fibras com nucléolos
proeminentes.
Técnica imuno-histoquímica
Com o intuito de avaliar a imunomarcação do colágeno IV, secções
histológicas foram obtidas e as lâminas passaram pelo procedimento de
bloqueio da peroxidase endógena que consistiu em banhos de: (1) 15min em
solução de metanol 50%; (2) lavagem em água destilada; (3) imersão em
tampão fosfato (PBS1X) por 10 min; (4) imersão em tampão PBS1X / BSA 2%
por 20 e (5) imersão em tampão PBS 1X por 10 minutos.
Após as etapas descritas, as lâminas foram incubadas na presença de
anticorpo primário anti-colágeno IV (Dako, anti-mouse, lote MO785) diluído
1:50 em solução de PBS1X/ BSA por 1 hora. Ao término do período de
incubação, as lâminas foram lavadas com tampão PBS1X por 10 min e
incubadas com anticorpo secundário conjugado a peroxidase HRP do ―Kit
DakoCytomation LSAB plus System HRP‖ por 30 min. Ao final desta incubação,
foi realizada a lavagem novamente com tampão PBS1X por 10 min e
incubação com o anticorpo terciário (deste mesmo kit) por 30min. Retirado o
anticorpo terciário, as lâminas passaram por uma lavagem final com PBS 1X
seguiu-se com o procedimento de detecção. A detecção consistiu de incubação
com solução cromógena, contendo 0,03% de 3-31-diaminobenzidina (tabletes
DAB, Novocastra) em tampão Tris-Hcl 0,05M, pH 7,4 e adicionado peróxido de
hidrogênio a 0,3%. Após a revelação, foi realizada a contra-coloração das
39
lâminas com solução de hematoxilina de Mayer, durante 10 minutos, seguida
de lavagem em água corrente por 10 minutos e passagem em água destilada.
A seguir as lâminas passaram pelo processo de desidratação em cadeia
de concentração ascendentes de etanol (etanol 50% a etanol absoluto),
diafanização em xilol e, finalmente, a montagem em meio sintético (Erv-Mount,
Erviegas).
Todas as reações foram acompanhadas de controles positivos. No
controle negativo os anticorpos primários foram substituídos por albumina
sérica bovina (BSA) a 1% diluída em tampão TRIS-HCL, pH 7,4.
Análise estatística
Na análise do peso dos músculos e dos animais os dados obtidos foram
de peso inicial e peso no sacrifício; peso de músculo normal e peso de músculo
criolesionado, medidos em diversos momentos (1, 7, 14 e 21 dias). Para a
análise estatística foi adotado um modelo inteiramente casualizado
considerando 5 momentos com 5 repetições. Os dados não apresentavam
distribuição normal. Neste caso, foram usadas as transformações recíprocas
quadráticas para peso inicial e no sacrifício bem como, logarítmica para os
músculos criolesionados e recíproca para os músculos controle.
Na análise para peso dos animais inicial e no sacrifício os dados
apresentaram distribuição normal e foi feita uma análise da variância Anova
com aplicação do teste F e atribuída significância de 5% (p≤0.05).
RESULTADOS
Peso dos animais e peso dos músculos
Durante todo o período experimental, os animais apresentaram aspecto
saudável, sem manifestação de distúrbios locomotores. A análise estatística
do peso inicial dos animais revelou que o p-valor obtido pelo teste F foi maior
que 5%, mostrando que o peso inicial dos animais para os diversos momentos
não difere significativamente, ou seja, os pesos iniciais podem ser
considerados homogêneos. Entretanto, quando analisados os resultados do
peso dos animais após o sacrifício o p-valor do teste F foi menor que 5%,
indicando que existe diferença entre os momentos para o peso no sacrifício.
Para verificar em quais momentos os pesos diferiam, foi feito um teste de
40
Tukey para comparações múltiplas. Os resultados mostraram que os animais
do dia 1 não apresentaram diferença de peso no sacrifício em relação aos
animais do dia 7 e sham. Entretanto, quando comparado aos animais após 14
e 21 dias observou-se que os animais ganharam peso com o passar do tempo
de forma estatisticamente significante. A Figura 1 mostra o peso corporal médio
inicial e final dos animais nos diferentes períodos de tempo analisados.
Figura 1 - Peso corporal médio (g) inicial e final ± desvio padrão dos
animais durante todos os períodos experimentais.
A análise do peso dos músculos controles ao longo dos períodos
experimentais mostrou que o p-valor do teste F foi maior que 5%, indicando
que não existe diferença entre os momentos. Entretanto, o peso dos músculos
criolesionados variou de forma a apresentar diferença estatisticamente
significante (p≤ 0.05) indicando que existe diferença entre os grupos analisados
de acordo com o tempo após lesão. Para verificar em quais momentos os
pesos diferiram, foi feito um teste de Tukey para comparações múltiplas. Foi
observado que os animais após 7 dias, tanto com criolesão ou sem (sham)
mostraram perda de peso muscular com diferença estatisticamente significante
entre os demais períodos (Figura 2).
41
Figura 2 - Peso médio (g) do músculo criolesionado e controle ± desvio
padrão dos animais durante todos os períodos experimentais.
Análise morfológica
O resultado da análise histopatológica dos músculos controle mostrou
que os mesmo exibem morfologia normal, com presença de fibras com núcleo
periférico, de formato poligonal e sem sinais de lesão ou processo inflamatório
(Figura 3a).
O grupo sham apresentou leve infiltrado inflamatório predominantemente
mononuclear situados em região superficial (Figura 3b).
Na análise de curto prazo, ou seja, 1 e 7 dias após injúria exibiram
processo inflamatório e degeneração de fibras musculares de forma mais
intensa do que os músculos avaliados em longo prazo, 14 e 21 dias, que
mostraram reorganização das fibras musculares e discreto processo
inflamatório residual.
No grupo criolesionado após 1 dia foi observado intenso edema entre as
fibras musculares (Figura 3c), moderado infiltrado inflamatório com neutrófilos e
macrófagos dispersos por entre as fibras de aspecto normal e áreas de
necrose(seta) caracterizadas pelo rompimento e desorganização das fibras
musculares .
42
Após 7 dias pode-se observar redução do processo inflamatório (Figura
3d), ausência de necrose e presença de células com núcleo centralizado e
fibras cortadas (separadas) indicando renovação tecidual. Formação de vasos
novos (angiogênese) entre as novas fibras pode ser evidenciada de forma
exuberante nesta fase.
Após 14 dias, apenas algumas células musculares com núcleo
centralizado e fibras separadas foram notadas. Não foram evidenciadas células
inflamatórias após este período (Figura 3e). Aos 21 dias o músculo mostrou
evidência de reparo (regeneração) completa morfologicamente (Figura 3f).
Figura 3. Fotomigrafias dos cortes histológicos de músculos controle e
criolesionados corados por hematoxilina & eosina. Músculo controle exibindo morfologia normal (A, 400x). Grupo sham exibindo processo inflamatório na região superficial do (B, 100x). A área criolesionada após 1 dia
43
mostrando edema intercelular, necrose das células musculares (seta) e infiltração de neutrófilos (*) (C, 400x). Após 7 dias nota-se manutenção do edema, diminuição do infiltrado inflamatório e fibras regeneradas imaturas(setas) (D, 100x). Em longo prazo nota-se restabelecimento da arquitetura muscular aos 14 dias, diminuição do edema e células musculares regeneradas pequenas (E, 400x). Aos 21 dias observou-se ausência de edema e de infiltrado inflamatório, células musculares maiores, de aspecto poligonal e com maior grau de maturação. Apenas algumas células exibiam núcleo ainda não totalmente disposto na periferia (F, 400x).
Análise imuno-histoquímica
Na análise imuno-histoquímica dos músculos normais (controle), em
todos os períodos experimentais, foi observado que o colágeno IV esteve
presente como uma linha tênue envolvendo as fibras musculares (endomísio) e
com marcação mais abundante no perimísio (Figura 4 a,b,c) porém houve
alteração na intensidade desta marcação, tanto no endomísio quanto no
perimísio, dependendo do estágio (período) de regeneração muscular.
Após 1 dia de injúria pode-se observar uma modificação no padrão de
marcação e distribuição do colágeno IV tanto no perimíso como no endomísio
(Figura 4 d). A imunomarcação mostra um colágeno IV mais difuso por entre as
células musculares lesadas e em algumas células com nítido rompimento de
sarcolema evidencia-se marcação intra-citoplasmática desta proteína (Figura 4
e,f)
Aos 7 e 14 dias o colágeno IV mostrou uma marcação delimitando as
fibras musculares jovens, com núcleo centralizado entretanto, em áreas focais
onde ainda não houve a fusão completa dos mioblastos, o colágeno IV
encontra-se difuso, disperso na MEC em reorganização (Figura 4 g, h, i). Foi
evidenciada marcação mais intensa para o colágeno IV nos músculos
criolesionados após 14 dias em comparação ao controle e demais períodos
analisados (Figura 4 j, k, l).
Aos 21 dias pós-agressão verificou-se que o padrão de marcação do
colágeno IV foi semelhante ao do músculo controle, mesmo havendo algumas
44
Figura 4.Distribuição do colágeno IV no remodelamento do músculo tibial anterior de rato. No músculo controle nota-se linha tênue de marcação do
colágeno IV no endomísio (*) (a, 40x; b, 100X; c,400x) e perimísio (seta)
(a,40x). Após 1 dia de criolesão nota-se o colágeno IV ainda delimitando algumas células lesadas (seta), espalhado no endomísio (d, 40x; e, 100x) e disposto intracelularmente quando há rompimento evidente do sarcolema (*) (f, 400x). Após 7 (g, 40x; h, 100x; i,400x) e 14 dias (j, 40x; k, 100x; l,400x)o colágeno IV em áreas está difuso de permeio as células musculares imaturas e em áreas delimita o sarcolema de células musculares regeneradas pequenas, mas com núcleos periféricos (setas). Aos 21 dias nota-se padrão de
células apresentando aspecto morfológico imaturo, com núcleo centralizado
(setas) (Figura 4 m, n, o).
45
normalidade na distribuição do colágeno IV no perimísio e endomísio (m, 40x; n, 100x; o, 400x).
DISCUSSÃO
Os resultados deste estudo mostram que o trauma agudo, por meio de
criolesão em animais, tem impacto importante na distribuição do colágeno IV
nas diferentes etapas do remodelamento muscular. Evidenciou-se que mesmo
havendo colágeno IV presente no tecido, este necessita cerca de 21 dias para
se organizar de forma semelhante ao músculo não agredido, tanto no
endomísio quanto no perimísio.
No que diz respeito à análise morfológica dos músculos após a criolesão
nosso resultados estão de acordo com os descritos por Miyabara et al., que
identificaram regeneração completa após 3 semanas de injúria. Entretanto,
nenhum estudo do arranjo da MEC durante o remodelamento após criolesão foi
encontrado na literatura. Os trabalhos que analisam colágeno IV utilizam
metodologias de treinamento prolongado13, contrações12,14, exercícios agudos
6,10,11,17,21,25, hipertrofia compensatória experimental24 onde os resultados
demonstram um aumento na quantidade desta proteína tecidual. Essas
pesquisas avaliam a relação entre a agressão muscular e a quantidade de
colágeno total ou de algum subtipo de colágeno. Esta forma de análise é
importante, porém o conhecimento da localização e da distribuição do colágeno
é fundamental, pois a presença de colágeno IV disperso pela MEC sem a
organização não garante o suporte mecânico adequado às fibras musculares.
Os achados da análise de curto prazo, após 1 dia de injúria, mostram
que neste modelo de injúria há lesão muscular acompanhada de rompimento
da membrana plasmática da célula muscular, mionecrose, edema intercelular,
inflamação acompanhado da desorganização da estrutura da matriz de
colágeno. Neste momento o colágeno IV é observado delimitando algumas
células musculares, entretanto, devido ao rompimento da membrana
plasmática essa proteína passa a ocupar o espaço intra-citoplasmático. Após
14 dias, um dos períodos de avaliação de longo prazo, a área criolesionada
mostrou restabelecimento das características morfológicas normais sendo que,
46
algumas células musculares ainda se encontram imaturas. Ao
correlacionarmos com os achados da distribuição do colágeno IV fica
evidenciado que a MEC ainda não estava madura uma vez que o colágeno IV
apresentou-se disperso por entre as fibras musculares de maneira difusa e
apenas após a organização mais poligonal das células musculares o colágeno
IV se posicionou delimitando a célula como componente da membrana basal
reorganizada. Apenas aos 21 dias pode-se verificar a maturação morfológica e
a distribuição do colágeno IV de forma semelhante ao tecido muscular normal,
tanto no endomísio quanto no perimísio.
Nossos achados diferem dos observados por Koskinen et al.12 no qual
contrações excêntricas não levaram a alteração da imunomarcação do
colágeno tipo I, III e IV no músculo TA de ratos. Esses autores verificaram que
ambos os tipos de colágeno estavam localizados tanto nas fibras aumentadas,
necróticas e regeneradas, observados após 6h, 2 dias e 7 dias, de forma
similar ao músculo não lesionado. Essa diferença de distribuição do colágeno
pode estar relacionada ao fato do dano celular no modelo de criolesão ser
maior do que o observado no modelo de injúria muscular por contração e
corrobora com a afirmação de Koskinen et al.11de que alterações na
concentração de colágeno IV dependem da severidade do dano muscular.
A MEC do músculo possui um papel importante na transmissão lateral
da força produzida nas fibras musculares. Esta transmissão diminui a agressão
causada pela contração conseqüentemente, mudança na composição da MEC
pode conduzir às mudanças na habilidade do músculo de transmitir a força e o
limite entre contração/dano muscular. Dentre as proteínas da MEC, o colágeno
IV, apesar de estar em pequena quantidade, tem sido considerado o
componente da MEC responsável pela estabilização mecânica das fibras
musculares e organização das células musculares no tecido. Assim sendo, a
morfologia tecidual e a resistência tecidual parecem dependentes da
integridade da membrana basal e do seu componente colagenoso9. Os
presentes achados permitiram verificar que a integridade da MEC,
especialmente com relação a distribuição adequada do colágeno IV, foi
alcançada apenas fases mais tardias do processo de regeneração após
criolesão e, desta forma, antes deste período o músculo não possui a
47
capacidade total de transmissão de forças geradas por contrações musculares
tornando-se mais vulnerável a uma nova lesão.
Os resultados do presente estudo mostram que uma lesão local pode ter
influência no peso muscular, neste caso observado por meio da diminuição da
massa muscular quando comparado os animais submetidos à criolesão com os
controles. Esses achados podem ser decorrentes da diminuição do número de
células musculares devido à necrose tecidual que foram substituídas por
edema inflamatório. No que diz respeito ao peso corpóreo dos animais não
houve alteração do ganho de peso ao longo dos 21 dias mostrando que este
modelo de agressão muscular não afeta os hábitos alimentares e de
locomoção dos animais. Ambos os resultados corroboram os observados por
Miyabara et al.16 .
Conclui-se que existem modificações na distribuição do colágeno IV ao
longo do remodelamento muscular após criolesão e que este componente da
MEC leva em torno de 21 dias para se organizar de forma semelhante aos
músculos normais. Estes dados são importantes para que condutas
reabilitadoras sejam aplicadas de forma a não gerar maior dano tecidual e
possam propiciar um remodelamento adequado da MEC, restabelecendo a
integridade morfológica e funcional do músculo afetado.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Best TM, McElhaney J, Garrett WE Jr, Myers BS. Characterization of the
passive responses of live skeletal muscle using the quasi-linear theory of
viscoelasticity. J Biomech. 1994; 27(4):413-419.
2. Bischoff R. Myogenesis. McGraw-Hill, New York, 1994. Brinckerhoff,
Matrisian, 2002.
3. Carmeli E, Moas M, Reznick AZ , Coleman R. Matrix metalloproteinases
and skeletal muscle: a brief review. Muscle Nerve 2004; 29(2): 191–197.
4. Chakraborti S , Mandal M, Das S, Mandal A, Chakraborti T. Regulation
of matrix metalloproteinases: An overview. 2003; 258(1-2): 269-285.
5. Goldspink G. Selective gene expression during adaptation of muscle in
response to different physiological demands. Comparative Biochemistry and
Physiology Part B 1999; 120 (1): 5-15.
48
6. Han XY, Wang W, Komulainen J, Koskinen SO, Kovanen V, VihkoV,
Trackman PC, Takala TE. Increased mRNAs for procollagens and key
regulating enzymes in rat muscle following downhill running. Pflugers Arch.
1999;437(6):857-64
7. Hawke TJ, Garry DJ. Myogenic satellite cells: physiology to molecular
biology. J Appl Physiol 2001; 91:534–551.
8. Huard J, Li Y, Fu FH. Muscle injuries and repair: current trends in
research.J Bone Joint Surg Am. 2002; 84-A(5):822-32.
9. Kjaer M. Role of extracellular matrix in adaptation of tendon and skeletal
muscle to mechanical loading. Physiol Rev. 2004; 84(2):649-98.
10. Koskinen SO, Kjaer M, Mohr T, Sørensen FB, Suuronen T, Takala TE.
Type IV collagen and its degradation in paralyzed human muscle: effect of
functional electrical stimulation. Muscle Nerve. 2000; 23(4):580-9.
11. Koskinen SO, Wang W, Ahtikoski AM, Kjær M, Han XY, Komulainen J,
Kovanen V, Takala TES. Turnover of basement membrane type IV collagen in
exercise-induced skeletal muscle injury. Am J Physiol Regul Integr Comp
Physiol. 2001; 280(5): R1292– R1300.
12. Koskinen SOA, Athikoski AM, Komoulainen J, Hesselink MKC, Drost
MR, Takala TES. Short-term effects of forced eccentric contractions on collagen
synthesis and degradation in rat skeletal muscle. Pflugers Arch. 2002; 444(1-2):
59–72.
13. Kovanen V, Suominen H, Risteli J, Risteli L. Type IV collagen and
laminin in slow and fast skeletal muscle in rats—effects of age and life-time
endurance training. Coll Relat Res.1988; 8(2): 145–153.
14. Mackey AL, Donnelly AE, Turpeenniemi-Hujanen T, Roper HP. Skeletal
muscle collagen content in humans after high-force eccentric contractions. J
Appl Physiol. 2004; 97(1):197-203.
15. Miyabara EH, Aoki MS, Moriscot AS. Cyclosporin A preferentially
attenuates skeletal slow-twitch muscle regeneration. Braz J Med Biol Res.
2005; 38(4):559-563.
16. Miyabara EH, Aoki MS, Soares AG, Moriscot AS. Expression of tropism-
related genes in regenerating skeletal muscle of rats treated with cyclosporin-A.
Cell Tissue Res. 2005; 319(3):479-489.
49
17. Myllylä R, Salminen A, Peltonen L, Takala TE, Vihko V. Collagen
metabolism of mouse skeletal muscle during the repair of exercise injuries.
Pflugers Arch. 1986; 407(1):64-70.
18. Oliveira NML, Gava AD, Salvini TF. Crioterapia na lesão muscular: uma
análise morfométrica. Rev bras fisioter. 2007; 11(5): 403-409.
19. Rucavado A, Escalante T, Teixeira CF, Fernandes CM, Diaz C, Gutierrez
JM. Increments in cytokines and matrix metalloproteinases in skeletal muscle
after injection of tissue-damaging toxins from the venom of the snake Bothrops
asper. Mediators Inflamm. 2002;11(2):121-128.
20. Sakuma K, Nishikawa J, Nakao R, Watanabe K, Totsuka T, Nakano H,
Sano M, Yasuhara M. Calcineurin is a potent regulator for skeletal muscle
regeneration by association with NFATc1 and GATA-2. Acta Neuropathol. 2003
Mar;105(3):271-280.
21. Savolainen J, Väänänen K, Vihko V, Puranen J, Takala TES. Effect of
immobilization on collagen synthesis in rat skeletal muscles. Am J Physiol.
1987; 252(5 Pt 2):R883-888.
22. Shi X, Garry DJ. Muscle stem cells in development, regeneration, and
disease. Genes Dev. 2006; 20(13):1692-1708.
23. Tidball, JG, Wehling-Henricks, M. Damage and inflammation in muscular
dystrophy: potential implications and relationships to autoimmune myositis
Current Opinion in Rheumatology Curr Opin Rheumatol. 2005; 17(6):707-13.
24. Wiliams PE and Goldspink G. Connective tissue changes in surgically
overloaded muscle. Cell Tissue Res. 1981; 221(2):465-470.
25. Zimmerman SD, McCormick RJ, Vadlamudi RK & Thomas DP. Age and
training alter collagen characteristics in fast-and slow-twitch rat limb muscle. J
Appl Physiol. 1993; 75(4):1670-1674.
50
2.3. Artigo 3- Submetido para publicação no periódico European Journal
Journal of Applied Physiology (Anexo IV).
Estudo da imunolocalização e atividade da MMP-2 e MMP-9 durante o
remodelamento do músculo esquelético após injúria
V. C. S. Pavesi · R.A.Mesquita-Ferrari · S.K.Bussadori · F.D.Nunes ·
K.P.S.Fernandes · D.A.Biasotto-Gonzalez · M.D.Martins.
V. C. S. Pavesi · R.A.Mesquita-Ferrari · S.K.Bussadori · K.P.S.Fernandes ·
D.A.Biasotto-Gonzalez · M.D.Martins, Mestrado em Ciências da Reabilitação,
Universidade Nove de Julho- UNINOVE, São Paulo, Brazil.
F.D.Nunes, Departamento de Estomatologia, Disciplina de Patologia Bucal,
Faculdade de Odontologia, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brazil.
Autor Correspondente:
Manoela Domingues Martins
Rua: Demóstenes, 636 apto.11
CEP 04614-013
Campo Belo São Paulo SP
Brazil
Phone/FAX: 11-55425422
51
RESUMO
O objetivo do presente estudo foi investigar a imunomarcação e
atividade MMP-2 e MMP-9 durante o reparo muscular após criolesão. Sessenta
ratos Wistar adultos foram usados. O músculo tibial anterior esquerdo foi
criolesionado e o músculo contralateral foi usado como controle. Os animais
foram divididos em 6 grupos: 1, 7, 14 e 21 dias pós-lesão, grupos sham e
controle. Os animais foram sacrificados, foram realizados cortes do tecido que
foram coradas por hematoxilina-eosina e submetidos a imunomarcação, outras
amostras foram submetidas à análise zimografica. O grupo injuriado revelou
total remodelamento tecidual após 21 dias. A distribuição e imunomarcação
das MMP-2 e MMP-9 apresentaram perfil semelhante ao longo de todo o
período estudado. A análise imuno-histoquímica revelou um aumento na
marcação das MMPs após 1 dia, seguido por uma redução de 7 e 14 dias e
aumento 21 dias após a criolesão. A zimografia mostrou uma maior atividade
da MMP-2, depois de 1 dia da criolesão e uma diminuição após 7 dias. Após
14 e 21 dias, a MMP-2 níveis foram semelhantes ao grupo controle. A atividade
da MMP-9 foi detectada, mas foi em pequena quantidade em todos os grupos.
Em conclusão, o presente estudo demonstra que a MMP-2 e MMP-9 a
marcação e a atividade da MMP-2 varia de acordo com a fase de reparo
tecidual, indicando um papel diferente das MMPs musculares em todo o
processo de reparação.
Palavras-chave: Matrix metaloproteinases (MMPs), músculo esquelético,
MMP-2, MMP-9; remodelamento; criolesão.
INTRODUÇÃO
Músculo esquelético é um tecido dinâmico que tem um elevado grau de
plasticidade funcional e estrutural em resposta à atividade contrátil, a danos
diretos (por exemplo, lacerações, contusões, estiramentos) ou a danos
indiretos (por exemplo, isquemia, disfunção neurológica) (Huard et al. 2002;
Cossu e Biressi 2005; Shi e Garry 2006). Muitos modelos têm sido propostos
52
para a investigar os mecanismos de regeneração do músculo esquelético,
incluindo esmagamento, congelamento, injúrias químicas ou por veneno
(d'Albis et al. 1988; Garry et al. 1997; Cornelison et al. 2004, Durigan et al.
2008 ).
O modelo de criolesão tem sido eficaz na indução da lesão e posterior
regeneração em uma área bem delimitada do ventre muscular e oferece uma
ferida limpa e fácil reprodutibilidade (Irintchev et al. 2002; Miyabara et al. 2005).
Em todos os modelos, o processo de neoformação muscular exige céluas
quiescentes mononucleadas precursoras de fibras musculares (mioblastos) ao
tornar-se ativado, proliferam, diferenciam e se fundem para formar células
musculares multinucleadas jovens, conhecida como miotubos. Estes miotubos,
em seguida, são submetidos a uma maior diferenciação e maturação de forma
a se tornarem fibras musculares totalmente funcionais (Grounds et al 2002;
Huard et al. 2002; Cossu e Biressi 2005; Shi e Garry 2006). Além disso, novas
exigências no músculo esquelético promovem o remodelamento da matriz
extracelular (MEC), que prevê o apoio estrutural e de proteção, e é importante
na manutenção da integridade funcional das fibras (Birkedal-Hansen et al.1993;
Kjaer 2004; Carmeli et al. 2004).
O remodelamento da MEC do músculo em condições fisiológicas e
patológicas é principalmente realizada pelas metaloproteinases de matriz
(MMPs), que são uma família de enzimas zinco-dependentes que têm a
capacidade de regular a composição célula-matriz (Matrisian 1992; Kjaer 2004;
Carmeli et al. 2004). MMPs são classificados em seis grandes subfamílias com
base em suas estruturas primárias, organização do domínio, especificidade do
substrato e localização na célula. Estas subfamílias são colagenases (MMP-1,
MMP-8, MMP-13, e MMP-18), gelatinases (MMP-2 e MMP-9), estromelisinas
(MMP-3, MMP-10, e MMP-11), MMPs do tipo membrana (MMP-14 e MMP-17),
e outros, tais como matrilisinas MMPs (MMP-7) e metaloelastase (MMP-12)
(Nagase e Woessner 1999; Carmeli et al. 2004).
No músculo esquelético, MMP-2 (também conhecida como gelatinase A)
e MMP-9 (também conhecida como gelatinase B) mostraram-se envolvidos em
processo de resposta à lesão, bem como em miopática e alterações induzidas
por inflamação (Choi & Dalakas, 2000 ; Koskinen et al. 2000; Kieseier et al.
2001, Durigan et al. 2008). Estas gelatinases principalmente quebram
53
colágeno tipo IV e outros compostos MEC. Embora haja certa preferência para
as diferentes MMPs no que diz respeito aos tipos de colágeno, a especificidade
de certos tipos de MMPs em relação um determinado colágeno pode ser menor
do que se pensava anteriormente (Kjaer 2004).
A expressão de MMP-2 e MMP-9 no músculo esquelético, foi encontrada
aumentada em diferentes situações patológicas (Kieseier et al. 1999; Haas et
al. 2000, Van Gieson & Skalak 2001, Bani et al. 2008; Brown e Hudlicka 2003,
Durigan et al. 2008). No entanto, a sua participação no remodelamento do
músculo esquelético, especialmente em resposta a criolesão, tem sido pouco
investigada . Além disso, a maioria dos estudos simplesmente observaram a
atividade destas proteínas e não mostraram sua localização específica.
Imunolocalização é importante para determinar a relação entre celulares e
componentes da MEC durante o processo de remodelamento.
Sabendo que a compreensão das mudanças patológicas no músculo
esquelético são essenciais para a concepção de medidas terapêuticas
eficazes, o objetivo do presente estudo foi avaliar a imunolocalização e da
atividade de MMP-2 e MMP-9 na MEC durante remodelamento do músculo
esquelético após lesão .
MATERIAIS E MÉTODOS
Sessenta ratos machos (Rattus novegicus albinus, Rodentia mammalia -
linhagem Wistar) pesando 250 entre 300 g foram utilizados neste estudo. Os
animais foram mantidos sob condições constante de temperatura ambiente (22
◦ C), umidade (40%), com ciclo 12/12 h dia-noite e alimentados antes e durante
o período experimental com ração sólida e água ad libitum. Os protocolos
experimentais utilizados neste estudo estão, em conformidade com os
princípios de experimentação animal formulados pelo Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA) e foram aprovados pelo Comitê de Ética da
Universidade Nove de Julho.
Em todos os animais, o músculo do tibial anterior (TA) foi criolesionado
(perna esquerda) e o contralateral TA (perna direita) foi utilizado como controle.
Os animais foram divididos aleatoriamente em seis grupos (10 animais / grupo).
Quatro grupos foram divididos de acordo com o período analisado: 1, 7, 14 e
21 dias após a lesão. Outros grupos denominados grupos sham e controle
54
foram incluídos. O grupo Sham foi composto por animais que foram submetidos
ao procedimento cirúrgico, porém não sofreram criolesão e foram analisados
após 7 dias. O grupo controle foi representado por animais sem qualquer tipo
de manipulação dos tecidos.
Os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob a administração da
ketamina 1mL/kg de 1% HCL (Dopalen, Vetbrands, São Paulo) e xilazina 2%
(Anasedan, Vetbrands, São Paulo, Brasil). Exposição cirúrgica do músculo TA
e criolesão foram realizadas conforme descrito por Miyabara et al. (2005) e
constou de dois ciclos de criolesão do músculo in situ. Congelamento foi
realizado mediante a aplicação de uma peça de aço (0,4 x 1 cm) previamente
resfriado em nitrogênio líquido na superfície do músculo e foi mantido nesta
posição por 10 s. O mesmo procedimento foi repetido duas vezes consecutivas
com um intervalo de tempo de 30 s. Após a criolesão , o ferimento foi fechado
com suturas poliamida (6-0) e os animais foram mantidos por várias horas em
caixas aquecidas (37 ° C) para evitar hipotermia.
Os animais foram sacrificados por uma overdose anestésica e os TA
músculos à esquerda e à direita foram retirados e imediatamente congelados
em isopentano resfriado e armazenado em nitrogênio líquido. Os músculos
congelado foram cortados em secções transversais de 10-μm de espessura em
criostato (Leica CM3050, Nussloch, Alemanha). Os espécimes foram corados
com hematoxilina-eosina para exame histológico e imunoistoquímico (Zeiss
Axioplan 2). Os demais músculos foram congelados em nitrogênio líquido e
armazenadas a -80 ° C.
Análise imuno-histoquímica
Os cortes foram fixados em acetona 20% por 10 minutos, em seguida,
incubadas durante 15 minutos em solução de metanol 50% por duas vezes e
lavados em água destilada, incubados por 10 min em solução fosfato-salina
tamponada (PBS) 1X e 20 min, em PBS1X / 2% de albumina soro bovino (BSA)
para bloquear as ligações inespecíficas. Os cortes foram incubadas por 1 h à
4° com anticorpos primários anti-MMP-2 (ABR, rato monoclonal, MMP2/8B4,
MA1-16641 catálogo) e anti-MMP-9 (ABR, rato monoclonal, clone 2C3, MA1-
12894 catálogo) com diluição 1:50 em 0,1% BSA / PBS, respectivamente.
55
Após a incubação com o anticorpo primário, os cortes foram exaustivamente
lavados com PBS1X por 10 min e exposta ao anticorpos secundários (1:100)
(LSAB plus System HRP, Dako) por 30 min e, após uma nova lavagem,
incubadas com estreptavidina-biotina complexo durante 30 min. Os cortes
foram então incubados com diaminobenzidina tetra-hidrocloreto (DAB,
Novocastra) e contracorados com hematoxilina de Mayer. Controles negativos
foram obtidos através da substituição dos anticorpos primários com soro não-
imune. A análise das lâminas foi feita de forma qualitativa objetivando
descrever os achados microscópicos e o padrão de imunomarcação. Todas as
lâminas foram avaliadas por dois examinadores previamente calibrados
Zimografia
A atividade de proteinase foi detectada em géis SDS-gelatina (Cleutjens
et al., 1995). Resumidamente, tecidos congelados (40 mg) foram lavados com
solução salina fria e homogeneizados em 1 mL extração tampão (10 mM
cacodylic ácido, pH 5,0, 150 mM NaCl, 1 M ZnCl2, 20 mM de CaCl2, 1,5 mM
NaN3, e 0,01% Triton X -100). O pH foi aumentado para 7,5, em seguida, com
1 M Tris, pH 8.0. Teor de proteína total foi estimada utilizando o corante BioRad
(BioRad Laboratories, Hercules, CA, E.U.A.), de acordo com o método de
Bradford. Para o ensaio enzimático, géis SDS (10%) foram preparados com 1
mg / mL de gelatina e foram aplicados 30 mg de proteínas por faixa, sem
redução. Após a eletroforese, géis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 2,5% Triton X-100 a fim de eliminar SDS. Os géis foram
então incubadas overnight a 37 º C em tampão substrato (50 mM Tris-HCl, pH
8,5, 5 mM de CaCl2, e 0,02% NaN3). Ambos os géis foram corados por 30 min
com Coomassie blue 0,05% R-250 em ácido acético: metanol: água (1:4:5) e
descorados com a mesma solução. Todos os géis foram preparados e
executados ao mesmo tempo. As bandas foram quantificadas por densitometria
utilizando o software Image J (NIH). A significância estatística foi avaliada por
ANOVA seguida pelo teste Dunnett. Os ensaios enzimáticos também foram
feitos na presença de 15 mM de EDTA no substrato tampão. Foram realizados
três géis independentes (triplicata).
56
RESULTADOS
Análise imuno-histoquímica de MMP-2 e MMP-9 revelou um padrão
semelhante de distribuição dessas proteínas no tecido muscular. Os músculos
do grupo controle apresentaram morfologia normal, a presença de fibras
poligonais com núcleos periféricos e sem sinais de lesão. Neste grupo, as
MMPs apareceram como uma tênue linha que envolvem fibras musculares
(endomisio), com imunocoloração mais abundantes no perimísio (Fig.1 a, b e 2
a, b). Os músculos obtidos de animais controle (sem manipulação)
apresentaram resultados semelhantes aos obtidos a partir de músculos TA
contralaterais (perna direita), que foi utilizado como músculos controle.
Um dia após lesão, o músculo esquelético exibiu infiltração neutrofílica,
com edema e fibras necróticas. As MMP-2 e MMP-9 sofreram uma importante
mudança na distribuição, especificamente na área criolesionada. Comparado
com o grupo controle, essas MMPs exibiram mais intensa e difusa
imunomarcação entre as células da região lesionada do músculo esquelético.
Na região da criolesão revelaram-se células necróticas, com ruptura do
sarcolema e a invasão da MMP-2 e MMP-9, no espaço celular (Fig. 1 c, d e 2 c,
d).
Aos 7 dias, o tecido exibiu uma redução do infiltrado inflamatório e o
aparecimento de células imaturas do músculo esquelético. A área criolesionada
ainda exibiu mais intensa marcação das MMP-2 e MMP-9 em comparação com
o grupo controle, mas houve menor marcação em comparação com o 1 º dia
grupo. A distribuição de MMP-2 e MMP-9 revelou ligeira imunomarcação no
endomísio e marcação mais abundante no perimísio (Fig. 1 E, F e 2 e, f).
Aos 14 dias, a imunomarcação das MMP-2 e MMP-9 em áreas com
regeneração de fibras do músculo esquelético foi semelhante à obtida em 7
dias. MMP-2 e MMP-9 mantiveram uma aparência linear em torno das células.
No entanto, em regiões onde a fusão completa dos mioblastos ainda não tinha
ocorrido, nota-se o aumento MMPs, com o aparecimento do MEC
desorganizada e difusa (Figura 1 G, H e 2 g, h).
Com 21 dias, MMP-2 e MMP-9 apresentaram aumento na
imunomarcação em endomísio quando comparado com o musculo controle e
outros dias de análise. A maioria das células já apresentou uma aparência
57
madura, mas outras ainda apresentaram uma morfologia imatura com presença
de um núcleo central.
Fig.1. Distribuição imuno-histoquímica da MMP-2 no músculo esquelético em ratos. No grupo controle (A, 400x; b, 1000x) a MMP-2 aparece no endomísio seta) e perimísio (*). Depois de 1 dia pós-criolesão, um aumento de imunomarcação da proteína pôde ser observada (C, 400x; d, 1000x). Nota-se desorganização da MEC (seta) e células necróticas (*). Em 7 dias (e, 400x, f, 1000x) e 14 dias (g, 400x; h, 1000x) uma diminuição da marcação da MMP-2 é
58
notada no endomísio (seta).O perimísio exibe forte marcação (*). Em 21 dias o remodelamento muscular é observado com aumento na marcação da MMP-2.
Fig. 2. Análise imuno-histoquímica da MMP-9 no músculo esquelético. A distribuição de MMP-9 foi semelhante à MMP-2. No grupo controle (A, 400x; b, 1000x) tênue linha no endomísio (seta), com abundantes imunomarcação no perimísio (asterisco). Depois de 1 dia, MMP-9 exibe mais intensiva imunomarcação (C, 400x; d, 1000x), desorganização da MEC (seta ) e células necróticas (*). Após 7 dias (e, 400x, f, 1000x) e 14 dias (g, 400x; h, 1000x) tecido exibiu uma redução da marcação da MMP-9, em espcial no endomísio (seta) O perimísio exibe marcação forte para MMP-9 (*). Após 21 dias, a MMP-9 apresentou um aumento da imunomarcação nesse tecido.
59
A Figura 3 mostra a atividade proteolítica dos extratos do TA sobre a
gelatina. Cada faixa representa um pool das amostras dos animais de cada
grupo (n = 5 amostras formando um pool de 30µ). Os extratos musculares dos
animais controle (cont) apresentaram algum grau de atividade gelatinase (Fig.
3B), que foi claramente aumentado no grupo 1 dia após criolesão (Fig.3E). As
massas moleculares das bandas lítica estão aproximadamente em 62 kDa,
sugerindo a forma ativa da MMP-2. No grupo 7 dias após criolesão (Fig3. D)
foi verificada uma diminuição na atividade MMP-2, quando comparado com os
outros grupos, mas nos grupos após 14 (Fig.3F) e 21 (Fig.3G) dias um
aumento de MMP-2 atividade pode ser notado mostrando que a atividade e foi
semelhante ao sham (Fig.3A), os animais do grupo controle (Fig.3B) e ao
controle 1 dia (fig.3C). Assim, concluiu-se que este modelo de lesão, por si só
aumentou actividade da MMP. As amostras que foram testadas com
etilenodiamina tetraacetic (ácido EDTA; não mostrados) não exibiram atividade.
Fig.3. Análise da atividade das MMP-2 (62kDa) e MMP9 (82kDa) em extratos de músculo TA por zimografia em SDS-PAGE gelatina1%. Cada faixa representa um conjunto de amostras (n = 5; 30µ de cada grupo) a partir de diferentes grupos animais - A: Sham; B: Controle; C: Controle 24h; D: Criolesão 1 dia; E: Criolesão 7 dias; F : Criolesão 14 dias; G: Criolesão 21 dias. Antes da coloração com Coomassie o gel foi incubado por 20 h em tampão substrato a 37 ° C.
60
Géis foram analisados por densitometria utilizando o software Image-J (NIH) e
a atividade foi expressa em unidades arbitrárias, considerando-se um valor
para o grupo controle. Os valores são apresentados por média e desvio padrão
(DP), P <0,05. * Diferença estatisticamente significativa entre os grupos foi
analisada através de análise de variância (ANOVA) e o teste de Dunnet.
Concentração de MMP-2 no músculo TA apresentada como a média e o
desvio padrão estão representados na Figura 4. A concentração da MMP-2 foi
determinada pela soma da densidade óptica integrada (IOD) obtida (expressos
em unidades arbitrárias) para as três faixas (pró-MMP, intermediária e forma
ativa). Nenhuma diferença estatística foi encontrada entre o controle, o controle
1 dia, sham, criolesionado 14 e 21 dias grupos. Todavia, pode-se notar um
aumento significativo da concentração da MMP-2 no grupo criolesionado 1 dia
e uma diminuição significativa da concentração presente no grupo
criolesionado 7 dias (* P <0,05, ** P <0,01; ANOVA - Dunnet's teste).
Fig.4. Concentração de MMP-2 no músculo TA apresentados como a média e DP. A concentração de MMP-2 foi determinada pela soma da densidade óptica integrada (IOD) obtida (expressos em unidades arbitrárias) para as três faixas (pró-MMP-2, intermediário e forma ativa). Nenhuma diferença estatística foi encontrada entre o controle, o controle 1 dia, sham, grupos crioelsionados 14 e 21 dias grupos. Todavia, pode-se notar um aumento significativo na concentração MMP2 no grupo criolesionado 1 dia e uma diminuição significativa da concentração presente no grupo criolesionado 7 dias (* P <0,05, ** P <0,01; ANOVA - teste de Dunnet) .
61
A MMP-9 atividade foi detectada, mas a sua actividade foi em pequena
quantidade e similares em todos os grupos analisados.
DISCUSSÃO
Este estudo demonstra o comportamento da imunomarcação das MMP-
2 e MMP-9 durante o processo de remodelamento do músculo esquelético
após criolesão. Além disso, análise zimografica distingue a forma ativa da
MMP-2 em todos os grupos durante cada fase de remodelamento do músculo
esquelético, no entanto, diferenças no seu nível foi observada somente no
grupo criolesionado. Estes resultados indicam um papel diferente para MMPs
durante todo o processo de reparação muscular.
As MMPs formam um grupo de mais de 20 enzimas com a capacidade
de degradar componentes da matriz extracelular, especialmente proteínas
colagênicas e são essenciais ao desenvolvimento embrionário, reprodução,
remodelamento tecidual e inflamação (Carmeli et al. 2004), bem como de
alterar o funções biológicas das macromoléculas da MEC (Marqueti et al.
2006).
Tem sido relatado que as MMP-2 e MMP-9 em condições normais do
músculo esquelético têm expressão relativamente baixa e que essas proteínas
aumentam poucos dias após lesão (Carmeli et al. 2005) ou na distrofia
muscular (Bani et al. 2008; Kherif et al . 1999). MMP-2 e MMP-9 nativas
degradam colágenos tipos IV e V, bem como colágenos intersticial desnaturado
(Aimes e Quiley 1995). Sabe-se que a MMP-2 é também secretados no
músculo esquelético por fibroblastos e células satélites, já a MMP-9 é um
importante produto de leucócitos (Carmeli et al. 2004; Kherif et al. 1999;
Trocmé et al. 1998).
No presente estudo, os músculos esqueléticos controle apresentaram
uma tênue linha de MMP-2 e MMP-9 no endomísio e maior depósito no
perimísio. O grupo músculo criolesionado exibiu nas diferentes fases de
rmodelamento , como a degeneração, inflamação e regeneração, um perfil
diferente na distribuição de MMP-2 e MMP-9. Para explicar essas variações de
MMP-2 e MMP-9 a imunoistoquimica foi importante para demostrar que o
remodelamento fisiológicos e patológicos do músculo esquelético depende da
62
coordenação entre degradação e síntese de proteínas intracelulares e matriz
extracelular componentes (Kjaer, 2004). Assim, é necessário estabelecer um
paralelo entre as MMPs, inflamação e colágeno.
Degeneração muscular e inflamação ocorrerem nos primeiros dias pós-
lesão, enquanto a regeneração muscular ocorre normalmente sete a dez dias
após o estímulo. O pico do processo de regeneração geralmente se dá em
duas semanas e, em seguida, diminui em três a quatro semanas pós-lesão. A
formação de tecido cicatricial (fibrose) começa entre a segunda e a terceira
semana pós-lesão e tecido cicatricial aumenta de tamanho ao longo do tempo
(Huard et al. 2002).
Em um dia (degeneração e inflamação fases), na sequência , necrose da
região da criolesão e um processo inflamatório agudo foram observados. A
imunomarcação das MMP-2 e MMP-9 e a atividade aumentada da MMP2 na
área lesada, quando comparado com o controle músculos. Estes resultados
corroboram uma série de estudos que demonstram uma participação destas
MMPs no transporte de células linfóides da circulação para os tecidos,
macrófagos,células T-adesão e células endoteliais para a matriz, e a
propagação da resposta inflamatória (Phillips et al. 1990, Watt et al. 1994).
Além disso, é possível que MMPs eliminem fibras necróticas (Guerin e Holland
1995) para facilitar a migração das células satélites através da membrana
basal, a fim de criar uma passagem n MEC (NISHIMURA et al 2008) durante a
regeneração muscular ( Phillips et al. 1990, Watt et al. 1994).
O aumento inicial da imunomarcação da MMP2 e de sua atividade pode
ser explicada pelo fato de que ela desempenha um papel fundamental na
proliferação e diferenciação dos mioblastos ,a recuperação após lesão e a
homeostase local dos tecidos. Imediatamente após uma lesão, as células
satélite são ativadas e tornam-se precursoras células musculares, chamadas
mioblastos, que expressam um elevado nível de MMP. Este aumento no nível
MMPs resulta na migração celular á áreas lesionadas, com a posterior
diferenciação e fusão de mioblastos em miofibras (Marqueti et al, 2008). Além
disso, produção de MMP-2 parece estar correlacionada com a gravidade da
lesão muscular e provavelmente reflete a regeneração das membranas basais
das miofibras (Koskinen et al. 2001).
63
Aos 7 e 14 dias (fase regenerativa), a marcação das MMP-2 e MMP-9 foi
menor do que em um dia pós-lesão, mas maior que no grupo controle,
especialmente no perimísio. Além disso, a atividade da MMP2 após 7 dias foi
menor que todos os grupos e após 14 dias foi semelhante ao grupo controle.
Estes resultados podem ser explicados pelo fato de que a área danificada foi
substituída por células imaturas do músculo esquelético e da necessidade de
biossíntese de matriz extracelular para restabelecer as propriedades
morfológicas e funcionais do músculo. Assim, um baixo nível de MMPs é
necessário. Alguns autores (Mackey et al. 2004; Koskinen et al. 2002)
relataram que, após a lesão, o músculo apresenta um aumento de colágeno e
uma diminuição na MMPs é necessária a fim de aumentar a biossíntese de
colágeno no tecido muscular esquelético de ratos.
Com 21 dias, a área lesada exibiu a restauração da arquitetura celular e
houve um aumento de marcação das MMP-2 e MMP-9, no entanto, a atividade
da MMP-2 foi semelhante ao grupo controle. Este período é caracterizado pela
maturação das células musculares e sua membrana basal, bem como a
formação de tecido cicatricial (fibrose) (Goetsch et al. 2003). Assim, a fim de
prevenir ou manter a fibrose em níveis aceitáveis, as MMP-2 e MMP-9 deve
estar presente no endomísio e perimísio. No presente estudo, não foi
observada fibrose, em qualquer momento e, portanto, a combinação entre
síntese e degradação mecanismos bioquímicos foi bem coordenada.
A marcação imuno-histoquímica e atividade das MMPs analisadas no
presente estudo poderiam ser comparadas com as mudanças na marcação do
colágeno IV. Em um nosso estudo anterior (dados não publicados), a
imunomarcação de colágeno IV no mesmo modelo lesão revelou que, no dia 1,
colágeno exibiu marcação elevada e com um padrão difuso de distribuição, que
é semelhante à distribuição das MMPs. Aos 7 e 14 dias, colágeno IV
apresentou um aumento gradual na marcação, decorrentes da organização da
nova MEC no endomísio e perimísio. O remodelamento do Colágeno IV foi
semelhante ao que no grupo controle apenas em 21 dias pós-lesão.
Comparando os resultados do entre os dois estudos, os altos e baixos níveis
de MMPs estão relacionados com a degradação do colágeno IV e ou seu
acumulo durante o remodelamento do músculo esquelético.
64
Parece que o equilíbrio entre síntese e ativação de MMP-2 e MMP-9 é
uma processo fundamental na degeneração e regeneração da fibra muscular
esquelética, com diferentes padrões de expressão em todo o percurso da
regeneração muscular. No presente estudo, a imunomarcação de MMP-2 e
MMP-9 foi semelhante e as duas enzimas mostraram-se aumentadas no grupo
criolesionado. Depois de 1 dia de lesão a marcação das MMPs foi aumentada e
diminuiu após 7 e 14 dias. No entanto, somente a atividade MMP-2 foi detetada
em todos os períodos analisados. Outros estudos confirmam que a MMP-2 é
amplamente expressa no dia seguinte a criolesão, atingindo um pico entre 3 e
7 dias pós-lesão, enquanto que 10 dias pós-lesão, ele retorna a níveis basais
na regeneração do músculo esquelético (Kherif et al. 1999; Ferre et al. 2007,
Durigan et al. 2008). Nossos resultados mostraram que a atividade de MMP-2
no dia 7 divergem com a obtida por Duringan et al., 2008. Estes autores
detectaram a máxima ativação da MMP-2 em 7 dias que 10 dias pós-lesão a
MMP retornou ao nível basal. No nosso estudo a MMP-2 retornou ao menor
nível em 7 dias. Atividade de MMP-9 não foi quantificada nos géis de
zimografia. Na maioria dos estudos não se detectou a atividade de MMP-9 em
diferentes modelos de remodelação muscular (Ahtikoski et al., 2004; Hass et al.
2000). Curiosamente, Durigan et al., 2008 observaram um aumento na
atividade MMP-9 apenas após 3 dias de criolesão.
Na maioria dos estudos, a MMP-2 está relacionada com a regeneração
de novas miofibras, possivelmente devido à degradação do colágeno tipo IV na
membrana basal (Kherif et al. 1999; Ohtake et al. 2006; Fukushima et al. 2007).
Por outro lado, a MMP-9 está relacionada à ativação inflamatória inicial e a
ativação de células satélites (Kherif et al. 1999; Fukushima et al. 2007).
Contudo, Fukushima et al. (2007) sugerem que ambas as MMPs (2 e 9) estão
relacionadas com a degeneração e regeneração das fibras do músculo
esquelético.
A maior imunomarcação de MMP-2 e MMP-9 em 1 e 21 dias pós-lesão
pode refletir o impacto das MMPs na degradação do MEC durante a fase
inflamatória, a fim de permitir a proliferação de células satélites musculares e
manter níveis adequados de proteínas colágenas durante a remodelação, a fim
de evitar fibrose tecidual. MMPs são geralmente encontradas na forna inativa
(pró-MMPs) nos tecidos e sua expressão é altamente regulada por fatores de
65
crescimento e citocinas durante a remodelação tecidual (Marqueti et al. 2008).
Com base nesta propriedade, não se pode diferenciar moléculas ativas das
inativas das MMPs através análise imuno-histoquímica, porque os anticorpos
utilizados identificam os dois tipos. No entanto, imunomarcação permite a
identificação, distribuição e localização dessas proteínas em comparação com
a morfologia tecidual. Outras técnicas são mais indicadas para avaliar os
aspectos quantitativos (RNAm expressão, Western blot) e atividade (zimografia
e específicos ensaio enzimático) das MMPs. Utilizamos a zimografia para
verificar a atividade de MMP-2 e MMP-9 no entanto apenas a MMP-2 foi
detectada.
O músculo TA apresenta MMP-2 e MMP-9 durante o remodelamento
após criolesão, mas este perfil varia nos diferentes tipos de músculos são
estudados. Fibras-lentas do músculos de ratos contêm mais colágeno na MEC
que fibras-rápidas (Zimmerman et al. 1993; Ahtikoski et al. 2003). Assim, é
concebível que a respostas de adaptação dos músculos com predominância de
fibras-lentas seja diferente dos de fibras-rápidas e isso pode traduzir-se em
mudanças na expressão das MMPs.
O papel das MMPs no processo inflamatório e reparativo após a
criolesão necessita de mais investigação, especialmente no que respeito à sua
atividade e outros marcadores imunológicos (por exemplo, quimiocinas,
interleucinas, etc) Este modelo pode ser usado para estudar diferentes técnicas
terapêuticas para melhorar a reparação muscular e compreender melhor os
efeitos desses procedimentos sobre componentes desse tecido.
Agradecimentos
Os autores são gratos à Sras. Elisa Santos, Joelcimar Martins da Silva e
Amanda Ribeiro de Oliveira pelos seus excelentes conhecimentos técnicos e
assistência, e ao apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa de São
Paulo (FAPESP, número: 07/52927- 0).
66
Referências
1. Ahtikoski AM, Koskinen SOA, Virtanen P et al (2003)Type IV collagen in
rat skeletal muscle during immobilization in shortened and lengthened
positions. Acta Physiol Scand 177: 473–481
2. Aimes RT, Quiley JP (1995) Matrix metalloproteinase-2 is an interstitial
collagenase. Inhibitor-free enzyme catalyzes the cleavage of collagen
fibrils and soluble type I collagen generating the specific 3/4- and 1/4-
length fragments. J Biol Chem 270:5872–5876
3. Bani C, Lagrota-Candido J, Pinheiro DF et al (2008) Pattern of
metalloprotease activity and myofiber regeneration in skeletal muscles of
mdx mice. Muscle Nerve 37:583-592
4. Birkedal-Hansen H, Moore WG, Bodden MK, et al (1993) Matrix
metalloproteinases: a review, Critical Reviews in Oral Biology and
Medicine 4:197–250
5. Brown MD, Hudlicka O. (2003). Modulation of physiological angiogenesis
in skeletal muscle by mechanical forces: involvement of VEGF and
metalloproteinases. Angiogenesis 6: 1 -14
6. Carmeli E, Moas M, Lennon S et al (2005) High intensity exercise
increases expression of matrix metalloproteinases in fast skeletal muscle
fibres. Exp Physiol 90: 613-9
7. Carmeli E, Moas M, Reznick AZ et al (2004) Matrix metalloproteinases
and skeletal muscle: a brief review. Muscle Nerve 29: 191–197
8. Choi YC & Dalakas MC (2000). Expression of matrix metalloproteinases
in the muscle of patients with inflammatory myopathies. Neurology 54,
65–71
9. Cornelison DD, Wilcox-Adelman SA, Goetinck PF, et al (2004). Essential
and separable roles for Syndecan-3 and Syndecan-4 in skeletal muscle
development and regeneration. Genes Dev 18:2231–2236
10. Cossu G, Biressi S (2005).Satellite cells, myoblasts and other occasional
myogenic progenitors: Possible origin, phenotypic features and role in
muscle regeneration. Semin. Cell Dev Biol 16: 623–631
11. d'Albis A, Couteaux R, Janmotet al (1988) Regeneration after cardiotoxin
injury of innervated and denervated slow and fast muscles of mammals.
Myosin isoform analysis. Euro J Biochem 174:103–110
67
12. Durigan JL, Peviani SM, Russo TL et al (2008) Effects of alternagin-C
from Bothrops alternatus on gene expression and activity of
metalloproteinases in regenerating skeletal muscle. Toxicon 52:687-94
13. Ferre PJ, Liaubet L, Concordet D,et al (2007) Longitudinal analysis of
gene expression in porcine skeletal muscle after post-injection local
injury. Pharm Res 24:1480-1489
14. Fukushima K, Nakamura A, Ueda H, et al (2007) Activation and
localization of matrix metalloproteinase-2 and -9 in the skeletal muscle of
the muscular dystrophy dog (CXMDJ).BMC Musculoskelet Disord 8:54.
15. Garry DJ, Yang Q, Bassel-Duby R et al(1997) Persistent expression of
MNF identifies myogenic stem cells in postnatal muscles. Dev Biol 188:
280–294
16. Goetsch SC, Hawke TJ, Gallardo TD et al (2003) Transcriptional profiling
and regulation of the extracellular matrix during muscle regeneration.
Physiol Genomics 14: 261–271
17. Grounds MD, White JD, Rosenthal N et al (2002) The role of stem cells
in skeletal and cardiac muscle repair. J Histochem Cytochem 50:589–
610
18. Guerin CW, Holland PC (1995) Synthesis and secretion of
matrixdegrading metalloproteases by human skeletal muscle satellite
cells. Dev Dyn 202: 91-99
19. Hawke TJ, Garry DJ (2001) Myogenic satellite cells: Physiology to
molecular biology. J Appl Physiol 91: 534– 551.
20. Huard J, Li Y, Fu FH (2002) Muscle injuries and repair: current trends in
research. J Bone Joint Surg Am 84:822-32
21. Haas TL, Milkiewicz M, Davis SJ et al (2000) Matrix metalloproteinase
activity is required for activity-induced angiogenesis in rat skeletal
muscle. Am J Physiol Heart Circ Physiol 279, 1540–1547
22. Irintchev A, Zweyer M, Cooper RN et al (2002) Contractile properties,
structure and fiber phenotype of intact and regenerating slow-twitch
muscles of mice treated with cyclosporin A. Cell & Tissue Res. 308: 143-
156.
68
23. Kherif S, Lafuma C, Dehaupas M et al (1999) Expression of
matrixmetalloproteinases 2 and 9 in regenerating skeletal muscle: a
study in experimentally injured and mdx muscles. Dev Biol 205: 158-170
24. Kieseier BC, Seifert T, Giovannoni G & Hartung HP (1999). Matrix
metalloproteinases in inflammatory demyelination: targets for treatment.
Neurology 53: 20–25.
25. Kjaer M. (2004) Role of extracellular matrix in adaptation of tendon and
skeletal muscle to mechanical loading. Physiol Rev 84:649-698.
26. Koskinen SAO, Kjaer M, Mohr T, et al(2000) Type IV collagen and its
degradation in paralyzed human muscle: effect of functional electrical
stimulation. Muscle Nerve 23, 580–589
27. Mackey AL, Donnelly AE, Turpeenniemi-Hujanen T et al (2004) Skeletal
muscle collagen content in humans after high-force eccentric
contractions. J Appl Physiol (1):197-203.
28. Marqueti RC, Prestes J, Paschoal M et al (2008) Matrix metallopeptidase
2 activity in tendon regions: effects of mechanical loading exercise
associated to anabolic-androgenic steroids. Eur J Appl Physiol 104:
1087-93
29. Matrisian, L.M. (1992) The matrix-degrading metalloproteinases.
Bioessays 14: 455-463
30. Miyabara EH, Aoki MS, Soares AG et al (2005) Thyroid hormone
receptor-beta-selective agonist GC-24 spares skeletal muscle type I to II
fiber shift. Cell and Tissue Research 321: 233–241
31. Nagase H, Woessner JF (1999) Matrix metalloproteinases. J Biol Chem
274: 21491–21494
32. Nishimura T, Nakamura K, Kishioka Y et al (2008) Inhibition of matrix
metalloproteinases suppresses the migration of skeletal muscle cells. J
Muscle Res Cell Motil 29:37-44
33. Ohtake Y, Tojo H , Seiki M (2006) Multifunctional roles of MT1-MMP in
myofiber formation and morphostatic maintenance of skeletal muscle. J
Cell Sci 119: 3822-32
34. Phillips GD, Hoffman JR, Knighton DR (1990) Migration of myogenic
cells in the rat extensor digitorum longus muscle studied with a split
autograft model. Cell Tissue Res 262:81-86
69
35. Shi X , Garry DJ(2006) Muscle stem cells in development, regeneration,
and disease. Genes Dev 20:1692-708.
36. Trocmé C, Gaudin P, Berthier S et al (1998) Human B lymphocytes
synthesize the 92-kDa gelatinase, matrix metalloproteinase-9. J Biol
Chem 273:20677– 20684
37. Van Gieson EJ & Skalak TC (2001) Chronic vasodilation induces matrix
metalloproteinase 9 (MMP-9) expression during microvascular
remodeling in rat skeletal muscle. Microcirculation 8: 25–31
38. Watt DJ, Karasinski J, Moss J et al (1994) Migration of muscle cells.
Nature 368:406 -407
39. Zimmerman SD, McCormick RJ, Vadlamudi RK et al (1993) Age and
training alter collagen characteristics in fast- and slow-twitch rat limb
muscle. J Appl Physio l75:1670-1676
70
3. Considerações Finais
Os nossos trabalhos mostraram a distribuição e a interação entre alguns
componentes da MEC, como colágeno IV, MMP-2 e MMP-9, durante o
remodelamento do músculo esquelético em rato após criolesão. Estas
proteínas teciduais sofrem modificações durante a organização da MEC nas
diferentes etapas do remodelamento do músculo TA.
A análise da MEC foi realizada nestes estudos pela técnica
imunoistoquímca que permite a observação da distribuição das proteínas
teciduais juntamente com a análise da morfologia. Assim pode-se estabelecer
uma correlação entre a imunomarcação do colágeno IV, da MMP-2 e MMP-9 e
as diferentes fases do reparo muscular. Esta metodologia tem sido pouco
utilizada em músculos esqueléticos, principalmente para avaliar a composição
e distribuição da MEC.
A análise morfológica dos músculos depois da criolesão mostrou
remodelamento completo após 3 semanas e a imunomarcação mostrou uma
correlação inversa entre o colágeno IV e as MMP-2/ MMP-9.
Na fase de remodelamento muscular após 7 dias houve aumento da
presença de colágeno IV e foi verificada a diminuição da marcação da MMP-
2/MMP-9, concomitantemente com a diminuição da atividade enzimática da
MMP-2.Neste momento, morfologicamente há maior formação de novas fibras
ainda imaturas e síntese de colágeno tecidual.Assim sendo, justifica-se o
aumento da imunomarcação de colágeno IV e diminuição das MMPs tanto do
ponto de vista imunoistoquímico como de atividade enzimática.
Nas fases mais tardias (14 e 21 dias) o colágeno IV mostrou diminuição
gradual da imunomarcação enquanto que, as MMPs aumentaram. Na
zimografia a MMP-2 exibiu, nestes dois períodos, atividade semelhante aos
músculos controles.
No período de 14 dias, morfologicamente o músculo apresentava-se
remodelado, porém algumas células exibiam ainda núcleo centralizado,
indicativo de imaturidade celular e a MEC não se mostrou remodelada de forma
semelhante ao músculo controle. O colágeno IV delineou de forma tênue
apenas as fibras maduras e esteve de forma difusa nas áreas de fibras
71
imaturas. Paralelamente as MMPs mostraram pequena imunomarcação e baixa
atividade enzimática. Se correlacionarmos estes achados entre si pode-se
inferir que a diminuição da atividade de MMP-2 neste período ocorre para que
o colágeno IV possa se manter em níveis teciduais necessários, maior do que o
normal (controle), para auxiliar na orientação e maturação das fibras que só
ocorrem após 21 dias.
Aos 21 dias pode-se verificar tanto morfologiamente, como do ponto de
vista imunoistoquímico e enzimático, que há um restabelecimento morfológico
do tecido muscular e um padrão de MEC semelhante ao controle.
Neste contexto, estes dados são importantes para que condutas
reabilitadoras sejam aplicadas de forma a não gerar maior dano tecidual e
possam propiciar um remodelamento adequado da MEC, restabelecendo a
integridade morfológica e funcional do músculo afetado.
O modelo de criolesão se mostrou importante para o estudo da MEC e
poder ser utilizado para estudar diferentes técnicas terapêuticas que visem
melhorar a reparação muscular e para entender de forma mais detalhada os
efeitos desses processos nos componentes teciduais.
Referências Bibliográficas
1. Kirkendall DT, Garrett WE Jr. Clinical perspectives regarding eccentric
muscle injury. Clin Orthop Relat Res. 2002;(403 Suppl):S81-9.
2. Huard J, Li Y, Fu FH. Muscle injuries and repair: current trends in
research. J Bone Joint Surg Am 2002; 84:822-32.
3. Seale P, Rudnicki MA. A new look at the origin, function, and "stem-cell"
status of muscle satellite cells. Dev Biol. 2000; 218:115-24.
4. Grounds MD, White JD, Rosenthal N, Bogoyevitch MA. The role of stem
cells in skeletal and cardiac muscle repair. J Histochem Cytochem 2002;
50:589-610.
72
5. Chan YS, Li Y, Foster W, Horaguchi T, Somogyi G, Fu FH, Huard J.
Antifibrotic effects of suramin in injured skeletal muscle after laceration. J
Appl Physiol. 2003; 95:771-80.
6. Gomez, M. The physiology and biochemistry of soft tissue healing.
Rehabilitation of Injured Knee, 2nd Ed. 34-44, 1995.
7. Kjaer M. Role of extracellular matrix in adaptation of tendon and skeletal
muscle to mechanical loading. Physiol Rev 2004; 84:649-98.
8. Chakraborti S, Mandal M,Das S, Mandal A, Chakraborti T. Regulation of
matrix metalloproteinases.Mol Cell Biol 2003; 253:269 –285.
9. Carmeli E, Moas M, Reznick AZ , Coleman R. Matrix metalloproteinases
and skeletal muscle: a brief review. Muscle Nerve 2004; 29: 191–197.
10. Foidart M, Foidart JM, Engel WK. Collagen localization in normal and
fibrotic human skeletal muscle. Arch Neurol. 1981; 38:152-7.
11. Myllylä R, Myllylä VV, Tolonen U, Kivirikko KI. Changes in collagen
metabolism in diseased muscle. I. Biochemical studies. Arch Neurol.
1982;39:752-5.
12. Salonen V, Lehto M, Kalimo M, Penttinen R, Aro H. Changes in
intramuscular collagen and fibronectin in denervation atrophy. Muscle
Nerve. 1985; 8:125-31.
13. Han XY, Wang W, Komulainen J, Koskinen SO, Kovanen V, VihkoV,
Trackman PC, Takala TE. Increased mRNAs for procollagens and key
regulating enzymes in rat muscle following downhill running. Pflugers
Arch 1999; 437: 857–864.
14. Kovanen V, Suominen H, Risteli J, and Risteli L. Type IV collagen and
laminin in slow and fast skeletal muscle in rats—effects of age and life-
time endurance training. Coll Relat Res. 1988; 8: 145–153.
15. Myllylä R, Salminen A, Peltonen L, Takala TE, Vihko V. Collagen
metabolism of mouse skeletal muscle during the repair of exercise
injuries. Pflugers Arch. 1986; 407:64-70.
16. Savolainen J, Väänänen K, Vihko V, Puranen J, Takala TES. Effect of
immobilization on collagen synthesis in rat skeletal muscles. Am J
Physiol. 1987; 252:R883–R888.
17. Zimmerman SD, McCormick RJ, Vadlamudi RK, Thomas DP. Age and
training alter collagen characteristics in fast-and slow-twitch rat limb
73
muscle. J Appl Physiol. 1993; 75: 1670–1674.
18. Koskinen SO, Kjaer M, Mohr T, Sørensen FB, Suuronen T, Takala TE.
Type IV collagen and its degradation in paralyzed human muscle: effect
of functional electrical stimulation. Muscle Nerve. 2000; 23: 580-9.
19. Koskinen SO, Wang W, Ahtikoski AM, Kjær M, Han XY, Komulainen J,
Kovanen V, and Takala TES. Turnover of basement membrane type IV
collagen in exercise-induced skeletal muscle injury. Am J Physiol Regul
Integr Comp Physiol. 280: R1292– R1300, 2001.
20. Stetler-Stevenson WG. Dynamics of matrix turnover during pathologic
remodeling of the extracellular matrix. Am J Pathol. 1996; 148:1345-50.
21. Massova I, Kotra LP, Fridman R, Mobashery S. Matrix
metalloproteinases: structures, evolution, and diversification. FASEB J.
1998 Sep;12(12):1075-95.
22. Verzola RM, Mesquita RA, Peviani S, Ramos OH, Moriscot AS, Perez
SE, Selistre-de-Araújo HS. Early remodeling of rat cardiac muscle
induced by swimming training. Braz J Med Biol Res. 2006; 39(5):621-7.
23. Haas TL, Milkiewicz M, Davis SJ, Zhou AL, Egginton S, Brown MD,
Madri JA, Hudlicka O. Matrix metalloproteinase activity is required for
activity-induced angiogenesis in rat skeletal muscle. Am J Physiol Heart
Circ Physiol. 2000; 279: H1540–1547.
24. Carmeli E, Moas M, Lennon S, Powers SK. High intensity exercise
increases expression of matrix metalloproteinases in fast skeletal muscle
fibres. Exp Physiol. 2005; 90: 613-9.
25. Van Gieson EJ, Skalak TC. Chronic vasodilatation induces matrix
metalloproteinase 9 (MMP-9) expression during microvascular
remodeling in rat skeletal muscle. Microcirculation. 2001; 8: 25–31.
26. Rucavado A, Escalante T, Teixeira CF, Fernandes CM, Diaz C, Gutierrez
JM. Increments in cytokines and matrix metalloproteinases in skeletal
muscle after injection of tissue-damaging toxins from the venom of the
snake Bothrops asper. Mediators Inflamm. 2002; 11:121-8.
27. Aoki MS, Miyabara EH, Soares AG, Salvini TF, Moriscot AS.
Cyclosporin-A does not affect skeletal muscle mass during disuse and
recovery. Braz J Med Biol Res. 2006; 39:243-51.
74
28. Miyabara EH, Martin JL, Griffin TM, Moriscot AS, Mestril R.
Overexpression of inducible 70-kDa heat shock protein in mouse
attenuates skeletal muscle damage induced by cryolesioning. Am J
Physiol Cell Physiol. 2006; 290:C1128-38.
29. Salvini TF, Morini CC, Selistre-de-Araujo HS, Ownby CL. Long-term
regeneration of fast and slow murine skeletal muscles after induced
injury by ACL myotoxin isolated from Agkistrodon contortrix laticinctus
(Broad-banded copperhead) venom. Anatom Rec. 1999; 254:521-333.
30. Irintchev A, Zweyer M, Cooper RN, Butler-Browne GS, Wernig A.
Contractile properties, structure and fiber phenotype of intact and
regenerating slow-twitch muscles of mice treated with cyclosporin A. Cell
Tissue Res. 2002; 308:143-56.
31. Miyabara EH, Aoki MS, Soares AG, Moriscot AS. Expression of tropism-
related genes in regenerating skeletal muscle of rats treated with
cyclosporin-A. Cell Tissue Res. 2005; 319:479-89.
32. Miyabara EH, Tostes RC, Selistre de Araújo HS, Aoki MS, Salvini TF,
Moriscot AS. Cyclosporin A attenuates skeletal muscle damage induced
by crotoxin in rats. Toxicon. 2004; 43:35-42.
75
ANEXO I
Prezado (a) Colaborador (a)
Vimos pela presente, acusar o recebimento de seu artigo
“Remodelamento do músculo esquelético: papel da matriz extracelular”
manuscrito 626 ao Conselho Editorial desta revista. Solicitamos que grave o
número do mesmo, pois todo contato posterior a esse será feito através desse
número.
No momento estamos apreciando o conteúdo de seu artigo, assim que
tivermos um parecer entraremos em contato.
Sem mais para o momento, agradecemos com os votos de estima e
consideração.
Conselho Editorial
Prof a Dra Auristela Duarte Lima Moser
Editora da Revista
―Fisioterapia em Movimento‖
76
ANEXO II
77
ANEXO III
78
ANEXO IV