juliana do nascimento da silva estrutura da matriz extracelular e … · 2018-04-20 · estrutura...

Universidade Federal do Rio de Janeiro Campus Macaé

Programa de Pós-graduação em Produtos

Bioativos e Biociências

Juliana do Nascimento da Silva

Estrutura da matriz extracelular e recelularização de rins de Rattus novergicus

Macaé, 2017

ii

Universidade Federal do Rio de Janeiro Campus Macaé

Programa de Pós-graduação em Produtos

Bioativos e Biociências



Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Produtos Bioativos e Biociências da

Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte das

exigências para obtenção do título de Mestra em

Ciências.

Orientadores: Prof. Dr. Jackson de Souza Menezes

Profa. Dra. Cintia Monteiro de Barros

Macaé, 2017

iii

FICHA CATALOGRÁFICA

iv



Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Produtos Bioativos e Biociências da

Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte das

exigências para obtenção do título de Mestra em

Ciências.

Aprovado em 08 de dezembro de 2017.

Prof. Dr. Eldo Campos

Prof. Dra. Flávia Borges Mury

Prof. Dr. Mauro Sérgio Gonçalves Pavão

Orientador: Prof. Dr. Jackson de Souza Menezes

Coorientadora: Prof. Dra. Cintia Monteiro de Barros

v

Dedico esta obra ao meu filho, Luiz Felipe, como

demonstração de carinho e reconhecimento pelo

constante apoio inconsciente e amor incondicional.

vi

"Se não houve frutos, valeu a beleza das flores

Se não houve flores, valeu a sombra das folhas

Se não houve folhas, valeu a firmeza do caule

Se não houve caule, valeu a intenção da

semente"

Autor desconhecido

vii

Agradecimentos

Meus sinceros agradecimentos:

• Aos meus pais, Osvaldo Luiz e Laura Helena, pelo constante apoio e incentivo,

pelo amor gratuito e incondicional que sempre me fortalece.

• Aos demais familiares, pelo amor e incentivo e por me proporcionar momentos

felizes e contribuírem para meu equilíbrio diante das dificuldades.

• A você, Fabio, pela compreensão, paciência, carinho e amor.

• Ao meu orientador, Jackson de Souza Menezes, pelo aprendizado adquirido,

pela confiança e liberdade às quais foram de fundamental importância para meu

crescimento pessoal e profissional.

• À minha orientadora, Cintia Monteiro de Barros, pela constante presença,

confiança, dedicação e principalmente, pela compreensão e incentivo.

• À minha querida amiga, Marcelle Maria de Oliveira, pela amizade e ombro amigo.

• Ao meu querido amigo, Fernando Procópio Ferreira, por SEMPRE me salvar das

enrascadas tecnológicas.

• Aos meus cunhados, Maria José dos Santos Coelho da Silva e Bruno Azevedo

da Silva, pelo apoio como cuidadores infantil em muitos finais de semana.

• À técnica do Laboratório Integrado de Ciências Morfofuncionais, Paula Veronesi

Marinho Pontes, pela assistência na execução deste trabalho, pela amizade e

apoio.

• Ao aluno de iniciação científica, Matheus Silva da Mata, pela oportunidade de

crescimento profissional, pelo apoio e amizade.

• Ao aluno de pós-doutorado, Lupis Ribeiro Gomes Neto, pelas várias ajudas com

o sistema de perfusão.

• Aos professores Rodrigo Nunes da Fonseca e Nathália Martins Feitosa do

Laboratório Integrado de Ciências Morfofuncionais pelo aprendizado, apoio,

compreensão e incentivo.

viii

• As professoras Rosane Aparecida Ribeiro, Taís Fontoura de Almeida e Helene

Nara Blanc do Laboratório Integrado de Morfologia pelo grande aprendizado e

apoio em momentos cruciais.

• Aos colegas do Laboratório Integrado de Morfologia pelos momentos de

discussão científica, compreensão e apoio.

• Aos colegas do Laboratório Integrado de Ciências Morfofuncionais pelos

momentos de discussão científica, compreensão, apoio e momentos de

descontração.

• Aos professores do Campus UFRJ-Macaé Professor Aloísio Teixeira, pelo

aprendizado adquirido.

• Aos funcionários da Secretaria Acadêmica do Programa de Pós-Graduação em

Produtos Bioativos e Biociências pela assistência durante esses anos de

convívio.

• Ao bioterista Josué Marcelo de Almeida Silva, pelo cuidado com os animais que

foram utilizados neste trabalho.

• A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste

trabalho.

ix

Resumo

A doença renal crônica (DRC) é caracterizada pela presença de alterações na

estrutura e/ou funções dos rins. Atualmente, o que se tem como terapia renal

substitutiva em estágio avançado da DRC são os procedimentos de diálise e

transplante renal. Estes possuem elevado custo e diversas limitações como oferta de

órgãos e biocompatibilidade. Sendo assim, novas pesquisas têm sido desenvolvidas

para prover alternativas aos usuais tratamentos para as DRC, onde novas fontes de

órgãos têm sido estudadas pela medicina regenerativa a partir da tecnologia de

engenharia de tecidos. A bioengenharia tecidual utiliza a matriz de tecido decelularizado

como suporte tridimensional para uma possível recelularização. Sendo assim,

avaliamos a eficiência de decelularização de diferentes detergentes sobre os

componentes da matriz extracelular, realizamos colorações específicas para os

componentes de matriz e análises morfométricas, além de analisarmos a

recelularização de matriz extracelular em 2D por linhagem de células renais. Nossos

resultados mostraram que, embora os rins decelularizados usando dodecil sulfato de

sódio (SDS) tenham tido as células adequadamente removidas e, as proteínas

colágeno e elastina tenham, morfologicamente, sido preservados, as análises

bioquímicas revelaram que o conteúdo de glicosaminoglicanos (GAGs) foi reduzido em

86% quando comparado ao rim controle. Além disso, no processo de recelularização,

as células LLCPK-1 monstraram serem capazes de aderir a matriz extracelular tanto no

córtex quanto na medula. Encontrar um equilíbrio entre remoção de células,

preservação da matriz extracelular renal (MER) e de GAGs é vital para obtenção de

protocolo ideal de decelularização.

Palavras chaves: Bioengenharia tecidual; decelularização; SDS; glicosaminoglicanos;

colágeno

https://pt.wikipedia.org/wiki/Rim

x

Abstract

Chronic kidney disease (CKD) is characterized by the presence of changes in

kidney structure and / or functions. What is currently being used as an advanced renal

replacement therapy for CKD are dialysis and renal transplant procedures. These have

high cost and various limitations such as organ supply and biocompatibility. Thus, new

research has been developed to provide alternatives to the usual treatments for CKD,

where new sources of organs have been studied by regenerative medicine from tissue

engineering technology. Tissue bioengineering uses the decellularized tissue matrix as

a three dimensional support for possible recellularization. Therefore, we evaluated the

efficiency of decellularization of different detergents on the components of the

extracellular matrix, we performed specific staining for the matrix components and

morphometric analysis, besides analyzing the extracellular matrix recrystallization in 2D

per kidney cell line. Our results showed that, although the kidneys decellularized using

sodium dodecyl sulfate (SDS) had the cells properly removed, and the collagen and

elastin proteins were morphologically preserved, biochemical analyzes revealed that the

glycosaminoglycan content (GAGs) was reduced by 86% when compared to the control

kidney. In addition, in the process of recellularization, LLCPK-1 cells have been shown

to be able to adhere to the extracellular matrix in both the cortex and the marrow.

Finding a balance between cell harvesting, preservation of renal extracellular matrix

(MER) and GAGs is vital to obtain optimal decellularization protocol.

Keywords: Bioengineering; decellularization; SDS; glycosaminoglycans; collagen

xi

Lista de Figuras

Figura 1 Esquema representativo da histoarquitetura renal. ........................................... 1

Figura 2 Esquema representativo do túbulo urinífero. ..................................................... 2

Figura 3 Esquema representativo do corpúsculo renal. ................................................... 3

Figura 4 Micrografia eletrônica de varredura dos podócitos e seus prolongamentos. ..... 4

Figura 5 Micrografia eletrônica de transmissão da barreira de filtração glomerular de

rato. ......................................................................................................................... 5

Figura 6 Representação esquemática dos principais componentes da matriz

extracelular. ........................................................................................................... 15

Figura 7 Representação geral da composição da estrutura de um GAG. ...................... 17

Figura 8 Unidades dissacarídicas presente nos GAGs. ................................................ 18

Figura 9 Estrutura geral de um monômero de detergente. ............................................ 25

Figura 10 Fatores resumidos baseados em estudos recentes que associaram

decelularização renal e recelularização. ................................................................ 32

Figura 11 Sistema de perfusão para o processo de decelularização. ............................ 37

Figura 12 Esquema representativo das etapas envolvidas no processo de extração dos

GAGs. .................................................................................................................... 41

Figura 13 Esquema representativo do cultivo de células sobre a MER. ........................ 45

Figura 14 Representação esquemática das etapas de decelularização e recelularização

deste trabalho. ....................................................................................................... 46

Figura 15 Esquema representativo da análise da morfologia glomerular. ..................... 47

Figura 16 Imagens macroscópicas do órgão antes e após o processo de

decelularização com detergentes. .......................................................................... 49

Figura 17 Histologia renal após decelularização com diferentes detergentes. .............. 50

Figura 18 Marcação nuclear com DAPI após decelularização com SDS. ...................... 52

Figura 19 Histologia renal após decelularização com 1% SDS. .................................... 55

xii

Figura 20 Histologia renal após decelularização com 1,0% SDS. ................................. 56



Figura 23 Representação gráfica da média do tempo (h) de decelularização do rim após

tratamento com 0,5% SDS. .................................................................................... 59

Figura 24 Representação gráfica da média da massa úmida renal após tratamento com

0,5% SDS. ............................................................................................................. 60

Figura 25 Representação gráfica do eixo longitudinal renal após tratamento com 0,5%

SDS. ...................................................................................................................... 60

Figura 26 Representação gráfica da média do eixo antero-posterior renal após

tratamento com 0,5% SDS. .................................................................................... 61

Figura 27 Representação gráfica do eixo transversal renal após tratamento com 0,5%

SDS. ...................................................................................................................... 62

Figura 28 Representação gráfica da média da área do glomérulo após tratamento com

0,5% SDS. ............................................................................................................. 63

Figura 29 Representação gráfica da média da área do tufo glomerular após tratamento

com 0,5% SDS. ...................................................................................................... 63

Figura 30 Representação gráfica da média da área do espaço urinário após tratamento

com 0,5% SDS. ...................................................................................................... 64

Figura 32 Eletroforese em gel de agarose dos GAGs de rins controle e decelularizado.

.............................................................................................................................. 65

Figura 33 Histologia de córtex renal após recelularização com células LLCPK-1 e

decelularização com 0,5% SDS. ............................................................................ 68

Figura 34 Histologia de medula renal após recelularização com células LLCPK-1 e


Figura 35 Marcação nuclear com DAPI de córtex renal após recelularização com células

LLCPK-1 e decelularização com 0,5% SDS. .......................................................... 70

xiii

Figura 36 Marcação nuclear com DAPI de medula renal após recelularização com

células LLCPK-1 e decelularização com 0,5% SDS. .............................................. 71

Figura 37 Imunofluorescência de córtex renal para Heparam Sulfato (HS) após


Figura 38 Imunofluorescência de medula renal para Heparam Sulfato (HS) após


xiv

Lista de Tabelas

Tabela 1 Registro Brasileiro de Transplantes (RBT) Ano XXIII nº 1. .............................. 8

Tabela 2 Número Absoluto de Transplantes anual até março/2017. ............................... 9

Tabela 3 Dados numéricos de transplantes de rim por ano........................................... 10

Tabela 4 Número de transplantes por estado, entre janeiro a março de 2017. ............. 11

Tabela 5 Número Comparativo do Período de janeiro a março de 2016/2017. ............. 12

Tabela 6 Número por milhão de população por estado, entre janeiro e março de 2017.

.............................................................................................................................. 13

Tabela 7 Dosagem de ácido urônico antes e após o processo de decelularização. ...... 66

xv

Lista de Abreviaturas

ABTO Associação Brasileira de Transplante de Órgãos

ADH Hormônio Antidiurético

CHAPS [(3-colamidopropil) dimetilammonio] -1-propanossulfonato]

COOH Grupo Carboxila

CS Condroitim Sulfato

CTRL Controle

DAPI (4,6-diamidino-2-fenilidona)

DECEL Decelularizado

DMEM Meio de cultura Dulbecco modificado Eagle

DNA Ácido Desoxirribonucleico

DRC Doença Renal Crônica

DS Dermatam Sulfato

ECA Enzima Conversora de Agiotensina

EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-acético

EXT Extração

GAGs Glicosaminoglicanos

GlcA Ácido Glucurônico

GlcNAc N-acetilglucosamina

GlcNS Glucosamina N-sulfatada

H&E Hematoxilina e Eosina

HA Ácido Hialurônico

Hep Heparina

HexA Ácido Hexurônico

HGF Fator de Crescimento de Hepatócitos

HS Heparam Sulfato

IdoA Ácido Idurônico

KS Queratam Sulfato

LLCPK-1 Célula Renal Epitelial Suína (Lewis-lung Cancer Porcine Kidney-1)

MBG Membrana Basal Glomerular

xvi

MEC Matriz Extracelular

MER Matriz Extracelular Renal

MR Medicina Regenerativa

NaDOC Desoxicolato de Sódio

NKCs Células renais neonatais de rato

P.A. Para Análise

PAA Ácido Paracético

PAS Ácido Periódico Reativo de Schiff

PBS Solução Tampão de fosfato de sódio

PCR Picrosirius

PG Proteoglicano

RBT Registro Brasileiro de Transplantes

SDS Dodecilsulfato de Sódio

SO4-2 Íon Sulfato

TGF-β Fator de Transformação do Crescimento Beta

TSFR Terapias Substitutivas da Função Renal

HUVECs Células Endoteliais Venosas de Cordão Umbilical Humano

UV Ultra-violeta

VEGF Fator de Crescimento Endotelial Vascular

Xyl Xilose

xvii

Sumário

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................... 1

1.1 HISTOARQUITETURA RENAL.................................................................. 1

1.2 DOENÇA RENAL CRÔNICA ..................................................................... 6

1.3 BIOENGENHARIA TECIDUAL................................................................. 21

1.4 MATRIZ EXTRACELULAR ...................................................................... 14

1.5 GLICOSAMINOGLICANOS ..................................................................... 16

1.6 AGENTES DECELULARIZANTES: VISÃO GERAL ................................. 23

1.6.1 MÉTODOS FÍSICOS (MECÂNICOS) ................................................... 24

1.6.2 MÉTODOS QUÍMICOS ........................................................................ 25

1.6.3 MÉTODOS BIOLÓGICOS .................................................................... 28

1.6.4 MÉTODOS COMBINADOS .................................................................. 29

1.7 RECELULARIZAÇÃO .............................................................................. 29

2 JUSTIFICATIVA ....................................................................................... 34

3 OBJETIVOS............................................................................................. 35

3.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................. 35

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................... 35

4 MATERIAL E MÉTODOS......................................................................... 36

4.1 REMOÇÃO DO RIM ................................................................................ 36

4.2 PROCESSO DE DECELULARIZAÇÃO ................................................... 37

4.3 CARACTERIZAÇÃO DA MATRIZ RENAL DECELULARIZADA............... 38

4.3.1 PROCESSAMENTO PARA MICROSCOPIA ÓPTICA .......................... 38

4.3.2 EXTRAÇÃO DOS GAGs ...................................................................... 40

4.3.3 DOSAGEM DE ÁCIDO URÔNICO ....................................................... 42

xviii

4.3.4 LOCALIZAÇÃO DE HEPARAM SULFATO........................................... 43

4.4 RECELULARIZAÇÃO DA MATRIZ EXTRACELULAR RENAL (MER) ..... 44

4.5 MORFOMETRIA ...................................................................................... 46

4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................................................................... 47

5 RESULTADOS ........................................................................................ 48

5.1 DECELULARIZAÇÃO RENAL ................................................................. 48

5.1.1 COMPARAÇÃO DE DETERGENTES .................................................. 48

5.1.2 COMPARAÇÃO DE CONCENTRAÇÕES DE SDS .............................. 53

5.2 MORFOMETRIA ...................................................................................... 59

5.2.1 MORFOMETRIA MACROSCÓPICA .................................................... 59

5.2.2 MORFOMETRIA GLOMERULAR ......................................................... 62

5.3 ANÁLISE DOS GAGS .............................................................................. 64

5.3.1 COMPARAÇÃO DOS GAGS................................................................ 64

5.3.2 QUANTIFICAÇÃO DOS GAGS ............................................................ 66

5.4 RECELULARIZAÇÃO .............................................................................. 67

5.5 IMUNOFLUORESCÊNCIA ....................................................................... 72

5.6 LOCALIZAÇÃO DE HS ............................................................................ 72

5.7 DISCUSSÃO ............................................................................................ 75

6 CONCLUSÃO .......................................................................................... 82

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 83

1

1. INTRODUÇÃO

1.1. HISTOARQUITETURA RENAL

Os rins são órgãos pareados que apresentam a forma de um grão de feijão,

tendo uma borda convexa e outra côncava. Estão situados na parede posterior do

abdômen, em cada lado da coluna vertebral. Revestindo-o há uma cápsula de tecido

conjuntivo denso, resistente e inextensível. É dividido em zona cortical e medular. Na

região cortical encontramos, com raras exceções, os glomérulos e na região medular,

os diferentes túbulos com seus diferentes tipos celulares (Figura 1) (KOEPPEN e

STANTON, 2009).

Figura 1 Esquema representativo da histoarquitetura renal. Evidencia características ultraestruturais de células epiteliais e de suas localizações nos túbulos uriníferos e no ducto coletor. As células da parte espessa da alça de Henle e as do túbulo distal são semelhantes em sua ultraestrutura, porém, têm funções diferentes. Adaptado (JUNQUEIRA, 2010).

2

Os rins são responsáveis pela manutenção da osmolalidade e volume dos

fluidos intra e extracelulares, balanço eletrolítico, equilíbrio ácido-básico além de

excretar produtos oriundos do metabolismo como uréia, ácido úrico e creatinina, entre

outros (AIRES, 2012).

Cada rim humano contém aproximadamente 1,3 milhões de túbulos uriníferos.

O túbulo urinífero é a unidade funcional do rim. Sendo assim, pode desempenhar todas

as funções do órgão. Cada túbulo urinífero, simplificando, é composto pelo corpúsculo

renal, túbulo contorcido proximal, alça de Henle, túbulo contorcido distal e sistema do

ducto coletor (Figura 2) (KIERSZENBAUM, 2008; AIRES, 2012).

Figura 2 Esquema representativo do túbulo urinífero. Constitui néfron da zona cortical externa, túbulo e ductos coletores medulares. A representação também mostra a sua vascularização sanguínea. (JUNQUEIRA, 2013).

3

O corpúsculo renal é formado pelo glomérulo, um enovelamento de capilares

(por onde entra a arteríola aferente, que origina os capilares do glomérulo, e sai à

arteríola eferente) e pela cápsula de Bowman, que é uma estrutura oca que circunda o

glomérulo. A parede externa da cápsula é constituída de epitélio pavimentoso simples e

forma o revestimento do corpúsculo renal (Figura 3) (JUNQUEIRA, 2013).

Figura 3 Esquema representativo do corpúsculo renal. O túbulo distal junto ao pólo vascular, o glomérulo e o pólo urinário do corpúsculo, onde tem início o túbulo contorcido proximal. Observam-se detalhes das arteríolas, aferente e eferente; da mácula densa e células justaglomerulares; dos podócitos e das características de células do folheto parietal da cápsula de Bowman. Adaptado (JUNQUEIRA, 2010).

Por dia, 180 L de plasma são filtrados, mas apenas cerca de 1 L a 2 L formarão

a urina. A formação da urina inicia-se no glomérulo, onde 20% do plasma que entra no

rim pela artéria renal e são filtrados através da barreira de filtração glomerular. Após o

processo de filtração glomerular, o ultrafiltrado de composição semelhante à do plasma,

percorre os túbulos renais (túbulo proximal, alça de Henle, túbulo distal e ductos

4

coletores), onde a composição e o volume do filtrado glomerular são modificados

através dos mecanismos de reabsorção e secreção tubulares. Consequentemente,

ocorre uma variação da quantidade de solutos que são excretados na urina final

(AIRES, 2012).

O epitélio da cápsula de Bowman que circunda cada capilar glomerular consiste

em células especializadas, os podócitos. Os podócitos possuem um grande corpo

celular, de onde se projetam numerosos prolongamentos. Dos prolongamentos

primários partem prolongamentos secundários, que se interpenetram e se ancoram à

lâmina basal dos capilares pela ligação das integrinas à laminina. Os espaços entre os

prolongamentos secundários, as fendas de filtração, são cobertos por uma fina lâmina

basal que ajuda na filtração (Figura 4) (SILVERTHORN, 2010; JUNQUEIRA, 2013).

Figura 4 Micrografia eletrônica de varredura dos podócitos e seus prolongamentos. (1) prolongamentos primários e (2) secundários que partem de célula do folheto visceral da cápsula de Bowman ou (P) podócitos, e circundam capilares glomerulares. Os espaços delgados situados entre prolongamentos secundários adjacentes são as fendas de filtração (setas). (10.700X). (JUNQUEIRA, 2013).

5

A lâmina basal é organizada numa trama composta pelo colágeno do tipo IV,

glicosaminoglicanos (GAGs) e pelos prolongamentos dos podócitos. Estes, atuam como

barreira física à passagem de moléculas com mais do que 70kDa (ou 3,5nm), e a carga

negativa dos GAGs da lâmina basal e do glicocálix dos podócitos produz uma barreira

elétrica contra a passagem de moléculas aniônicas (Figura 5) (SILVERTHORN, 2010;

AIRES, 2012).

Entre os capilares, sustentando-os, há células mesangiais e sua matriz

extracelular, constituindo o mesângio. As células mesangiais são irregulares, com

vários prolongamentos e núcleo ovoide ou esférico. Pela sua atividade fagocitária,

removem as macromoléculas retidas na lâmina basal dos capilares. A matriz mesangial

é constituída pelos colágenos do tipo IV, V e VI, pela fibronectina, pela laminina e por

GAGs, especialmente de heparam sulfato (HS), presentes na membrana basal

glomerular. A matriz mesangial e a membrana basal glomerular estão intimamente

relacionadas com a presença de proteínas na urina (proteinúria) e desenvolvimento de

diversas doenças renais (AIRES, 2012; JUNQUEIRA, 2013).

Figura 5 Micrografia eletrônica de transmissão da barreira de filtração glomerular de rato. O endotélio fenestrado está representado por E, a membrana basal capilar por MB, a fenda de filtração pelas setas pretas e os pedicelos por P. Adaptado (PAVENSTADT et al., 2003). Aumento de 48.000X.

6

1.2. DOENÇA RENAL CRÔNICA

A doença renal crônica (DRC) consiste em lesão renal e perda progressiva e

irreversível da função dos rins (REMUZZI & PERICO, 2014). É a lenta perda de

funcionamento dos rins. A DRC assumiu, nos últimos anos, o status de problema de

saúde pública devido à elevação de sua prevalência entre a população mundial.

Existem inúmeras doenças que podem causar insuficiência renal crônica, desde

doenças sistêmicas até malformações congênitas. Das diversas causas, destacam-se

as seguintes: diabetes mellitus, hipertensão arterial, glomerulonefrite crônica, doença

renal policística, pielonefrite crônica, malformações congênitas, doenças autoimunes,

necrose cortical bilateral, nefroesclerose hipertensiva, nefropatia obstrutiva e refluxo

vesicoureteral. Todas essas doenças após um período variável podem evoluir para um

estado de insuficiência renal em fase terminal (KDIGO, 2012).

Uma vez instalado o quadro de DRC, o indivíduo deve se submeter a terapias

substitutivas da função renal (TSFR) tais como hemodiálise, diálise peritoneal e

transplante renal (SALGADO FILHO, 2006). As TSFR são extremamente custosas e

debilitantes ao paciente e o transplante renal, quando bem sucedido, consegue

substituir a função do órgão do indivíduo receptor, mas apresenta uma série de

restrições de incompatibilidade e várias situações de rejeição do novo órgão. Além

disso, a necessidade de órgãos ainda é muito maior que a oferta de doadores (ABTO,

2017).

Nos Estados Unidos, vinte e seis milhões de americanos apresentam DRC com

a progressão da doença levando à insuficiência renal e a necessidade de transplante ou hemodiálise para sustentar vida (NAKAYAMA et al., 2010). E, da mesma forma,

dados recentes mostram que no Brasil, as informações obtidas junto à Sociedade

Brasileira de Nefrologia e Ministério da Saúde são semelhantes.

Dados de 2017 da Associação Brasileira de Transplantes de Órgãos (ABTO)

mostram que o rim é o órgão mais requisitado por pacientes ativos na lista de espera

para o transplante com relação ao somatório total dos estados e quando comparado a

outros órgãos (Tabela 1). Em 10 anos, a prevalência do número de transplantes renal

7

aumentou 62% e o número absoluto de transplantes vem aumentando gradativamente

(Tabela 2). Com relação ao número de transplantes renal, comparado com 2016, houve

aumento de 2,8% com incremento modesto, tanto com doador falecido (3,2%), quanto

com doador vivo (1,0%) (Tabela 3). Além disso, os estados de São Paulo, Minas gerais

e Rio Grande do Sul são os que mais realizaram transplante renal entre janeiro e março

de 2017 (Tabela 4). A prevalência do número de transplantes renal aumentou no último

ano em 15 dos 22 estados da federação (Tabela 5). E considerando o número

populacional de cada estado, São Paulo, Rio Grande do Sul e Paraná realizaram o

maior número de transplante renal entre janeiro e março de 2017 (Tabela 6). E

semelhantemente ao observado em outros países, o custo do tratamento de TSFR no

Brasil também é muito alto (ABTO, 2017).

8

Estado RIM FÍGADO CORAÇÃO PULMÃO PÂNCREAS PÂNC/RIM CÓRNEA TOTALTotal - Brasil 20.965 1.312 288 183 23 541 11.072 34.384

Acre 21 4 0 0 0 0 12 37Alagoas 263 0 1 0 0 0 195 459

Amazonas 0 0 0 0 0 0 28 28Bahia 790 15 0 0 0 0 1.055 1.860Ceará 520 150 12 3 1 10 2 698

Distrito Federal 235 10 11 0 0 0 83 339Espírito Santo 941 50 8 0 0 0 148 1.147

Goiás 223 0 3 0 0 3 374 603Maranhão 167 0 0 0 0 0 691 858

Mato Grosso 0 0 0 0 0 0 224 224Mato Grosso do Sul 35 0 0 0 0 0 65 100

Minas Gerais 2.352 41 34 0 1 52 912 3.392Pará 91 0 0 0 0 0 1.024 1.115

Paraíba 170 0 0 0 0 0 326 496Paraná 1.087 73 29 0 0 11 69 1.269

Pernambuco 605 52 9 0 0 0 171 837Piauí 96 0 0 0 0 0 377 473

Rio de Janeiro 1.277 91 15 0 0 0 1.316 2.699Rio Grande do Norte 157 0 0 0 0 0 142 299

Rio Grande do Sul 805 148 23 81 5 15 46 1.123Rondonia 64 0 0 0 0 0 102 166

Santa Catarina 293 6 2 0 1 10 74 386São Paulo 10.773 672 139 99 15 440 3.440 15.578

Sergipe 0 0 2 0 0 0 196 198

Pacientes ativos em Lista de Espera - (Março 2017)

Tabela 1 Registro Brasileiro de Transplantes (RBT) Ano XXIII nº 1. Adaptado: Associação Brasileira de Transplante de Órgãos (ABTO). Dados numéricos dos pacientes ativos na lista de doação de órgãos realizados por Estado no período: Janeiro/março – 2017. O rim é o órgão mais requisitado por pacientes ativos na lista de espera por transplante.

9

2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017*jan/2007 mar/2017

1997 atémar/2017

Coração 161 201 201 166 160 228 271 311 353 357 83 2.492 4.158Fígado 1.008 1.177 1.334 1.413 1.496 1.600 1.722 1.757 1.809 1.881 506 15.703 22.442

Pâncreas 163 174 160 133 181 153 143 128 120 134 32 1.521 2.747Pulmão 46 53 59 61 49 69 80 67 74 92 16 666 1.031

RIM 3.475 3.823 4.298 4.662 4.993 5.435 5.464 5.657 5.590 5.512 1.416 50.325 83.3342017* gráfico com projeção anual

Número Anual de Transplantes de 2007 até março/2017

332 - Coração

2.024 - Fígado

128 - Pâncreas64 - Pulmão

5.664 - RIM

0

1.000

2.000

3.000

4.000

5.000

6.000

2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017*

núm

ero

de tr

ansp

lante

s

Número Absoluto de Transplantes (anual)

Tabela 2 Número Absoluto de Transplantes anual até março/2017. Adaptado: Associação Brasileira de Transplante de Órgãos (ABTO), Registro Brasileiro de Transplantes (RBT) Ano XXIII nº 1. Número anual de transplantes de 2007 até março/2017.

10

2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017*Falecido 1.751 2.035 2.546 3.006 3.331 3.931 4.078 4.271 4.401 4.296 1.109

Vivo 1.724 1.788 1.752 1.656 1.662 1.504 1.386 1.386 1.189 1.216 307Parente 1.439 1.463 1.455 1.371 1.364 1.230 1.133 1.103 964 959 249

Não Parente - Cônjuge 165 199 188 175 185 196 186 187 166 173 39Não Parente - outros 120 126 109 110 113 78 67 96 59 84 19

Total 3.475 3.823 4.298 4.662 4.993 5.435 5.464 5.657 5.590 5.512 1.4162017* gráfico com projeção anual

Número anual conforme tipo de doador

4.436 falecido

1.228 vivo996 parente

156 Cônjuge76 não parente0

500

1.000

1.500

2.000

2.500

3.000

3.500

4.000

4.500

5.000

2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017*

núm

ero

de tr

ansp

lant

es

Tabela 3 Dados numéricos de transplantes de rim por ano. Adaptado: Associação Brasileira de Transplante de Órgãos (ABTO), Registro Brasileiro de Transplantes (RBT) Ano XXIII nº 1, p. 6. Transplantes de Rim, Número Anual Conforme Tipo de Doador.

11

Estado Vivo Falecido TotalSP 157 368 525MG 47 104 151RS 4 127 131PR 30 81 111RJ 13 85 98PE 6 66 72SC 1 52 53CE 0 48 48BA 4 43 47DF 4 24 28ES 8 20 28PA 7 21 28RN 3 22 25GO 5 13 18MA 5 10 15PB 5 6 11PI 3 7 10RO 4 2 6AL 0 5 5AC 0 4 4MS 1 1 2

Brasil 307 1109 1416

Número por estado, entre janeiro e março de 2017

0

100

200

300

400

500

600

SP MG RS PR RJ PE SC CE BA DF ES PA RN GO MA PB PI RO AL AC MS

Falecido

Vivo

núm

ero d

e tra

nspla

ntes

Tabela 4 Número de transplantes por estado, entre janeiro a março de 2017. Adaptado: Associação Brasileira de Transplante de Órgãos (ABTO), Registro Brasileiro de Transplantes (RBT) Ano XXIII nº 1, p. 6. Transplantes de Rim, Número por estado, entre janeiro e março de 2017.

12

Estado 2016 2017SP 494 525MG 139 151RS 166 131PR 111 111RJ 82 98PE 68 72SC 51 53CE 57 48BA 19 47DF 34 28ES 20 28PA 12 28RN 11 25GO 24 18MA 7 15PB 8 11PI 2 10RO 4 6AL 0 5AC 0 4MS 1 2AM 9 0

Brasil 1319 1416

Número comparativo do período de janeiro a março de 2016/2017

0 100 200 300 400 500 600

SP

MG

RS

PR

RJ

PE

SC

CE

BA

DF

ES

PA

RN

GO

MA

PB

PI

RO

AL

AC

MS

AM

2017

2016

Tabela 5 Número Comparativo do Período de janeiro a março de 2016/2017. Adaptado: Associação Brasileira de Transplante de Órgãos (ABTO), Registro Brasileiro de Transplantes (RBT) Ano XXIII nº 1, p. 6. Transplantes de Rim, Número Comparativo do Período de janeiro a março de 2016/2017.

13

Estado Vivo Falecido TotalSP 14,0 32,9 46,9RS 1,4 45,0 46,4PR 10,7 28,8 39,5DF 5,4 32,2 37,6SC 0,6 30,1 30,7PE 2,6 28,1 30,7RN 3,5 25,3 28,8MG 9,0 19,8 28,8ES 8,1 20,1 28,2RJ 3,1 20,4 23,5CE 0,0 21,4 21,4AC 0,0 19,6 19,6PA 3,4 10,2 13,6RO 9,0 4,5 13,5PI 3,7 8,7 12,4BA 1,0 11,3 12,3PB 5,0 6,0 11,0GO 3,0 7,8 10,8MA 2,9 5,8 8,7AL 0,0 6,0 6,0MS 1,5 1,5 3,0

Brasil 6,0 21,5 27,5

Número por milhão de população por estado, entre janeiro e março de 2017.

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

SP RS PR DF SC PE RN MG ES RJ CE AC PA RO PI BA PB GO MA AL MS

Falecido

Vivo

núm

ero

de tr

ansp

lant

es p

or m

ilhão

de p

opul

ação

Tabela 6 Número por milhão de população por estado, entre janeiro e março de 2017. Adaptado: Associação Brasileira de Transplante de Órgãos (ABTO), Registro Brasileiro de Transplantes (RBT) Ano XXIII nº 1, p. 6. Transplantes de Rim, Número por milhão de população por estado, entre janeiro e março de 2017.

Diante desta realidade, novas pesquisas têm sido desenvolvidas para prover

alternativas aos usuais tratamentos para as DRC. Onde novas fontes de órgãos têm

sido estudadas pela medicina regenerativa a partir da tecnologia de engenharia de

tecidos no campo da bioengenharia tecidual renal. E, um significativo avanço no campo

da bioengenharia é a utilização de tecido decelularizado como suporte (scaffold)

tridimensional para uma possível recelularização. Esses tecidos decelularizados são

caracterizados, principalmente, por não apresentarem células, mas preservarem sua

arquitetura estrutural e bioquímica. Com objetivo de servirem de ferramenta clínica em

pacientes com DRC (ATALA, 2010; NAKAYAMA, 2010; BONANDRINI, 2014).

14

1.3. MATRIZ EXTRACELULAR

A MEC é uma enorme e complexa rede de macromoléculas presente no espaço

extracelular, variando seus componentes entre os organismos, em diferentes tecidos de

um mesmo organismo e dependendo do estágio de desenvolvimento do mesmo. Ela é

naturalmente um material secretado e fabricado pelas células residentes de cada tecido

e órgão. A organização 3D complexa da MEC e seus componentes são ditados pelo

tecido a partir do qual é derivado. Esta matriz é composta por várias proteínas e

carboidratos que são secretados localmente e organizados em uma rede associada à

superfície celular que os produz (ALBERTS, 2002). As variações nas quantidades

relativas dos diversos tipos de macromoléculas na MEC e o modo como são

organizadas, geram uma diversidade de formas, cada uma adaptada às necessidades

funcionais particulares de cada tecido (GULLBERG & EKBLOM, 1995).

As duas classes principais de macromoléculas extracelulares que formam a

matriz são (1) cadeias de polissacarídeos da classe chamada GAGs, e (2) proteínas

fibrosas de dois tipos funcionais predominantemente: estruturais (colágeno e elastina,

por exemplo) e predominantemente adesivas (fibronectina e laminina) (Figura 6). As

moléculas estruturais e funcionais da MEC estão num estado de equilíbrio dinâmico

dentro dos tecidos circundantes, e também proporcionam o meio pelo qual as células

se comunicam entre si e com o ambiente externo afetando a migração celular, a

proliferação e a diferenciação celular (ALBERTS, 2002; BADYLAK, 2004; KOLKER et

al., 2005; KATARI et al., 2014)).

A descoberta de citocinas, fatores de crescimento e proteínas funcionais

potentes que residem dentro da MEC caracterizaram-na como uma rodovia de

informação virtual entre células. A tradução deste fenômeno para o uso terapêutico da

MEC como um suporte para aplicações de engenharia de tecidos está sendo bastante

estudado. Uma vantagem de utilizar a MEC em seu estado nativo como um suporte

para o reparo de tecidos é a presença de todos os fatores de crescimento associados

(e seus inibidores) nas quantidades relativas que existem em natureza e talvez o mais

importante, na sua ultraestrutura tridimensional (BADYLAK, 2004).

15

Figura 6 Representação esquemática dos principais componentes da matriz extracelular. A matriz extracelular consiste em uma rede de proteínas e carboidratos. A proteína mais abundante é o colágeno. As fibras de colágeno são entrelaçadas com moléculas de proteína contendo carboidratos. Adaptado (OPENSTAX CNX, 2013).

A matriz extracelular é de uma importância indiscutível para a função dos rins.

As diversas proteínas constituintes não só contribuem para a sua formação e função,

mas também alguns dos componentes têm mostrado estar envolvidos em doenças

glomerulares e tubulointersticiais (MINER, 2012). Toda a superfície exterior de cada

túbulo urinífero é revestido por uma membrana basal, composta, principalmente, por

proteínas e proteoglicanos, como o proteoglicano de heparam sulfato (HS). A

membrana basal renal desempenha a função de filtração, adesão, migração e

diferenciação celular (AIRES, 2012; MINER, 2012).

O glomérulo é a estrutura central no processo de ultrafiltração. A integridade

geral de sua rede capilar e seus respectivos componentes são os elementos críticos na

ultrafiltração. A permeabilidade através da parede do capilar glomerular para

16

determinada molécula é altamente dependente de seu tamanho, forma e carga e é, em

grande parte, determinada pelas propriedades eletrostáticas do HS dentro da membrana basal glomerular (MBG) (KANWAR et al., 1980; RAATS, 2000).

No córtex do rim, a MEC está presente em diferentes áreas anatômicas, com

diferentes funções dependendo dos seus componentes moleculares. A MEC presente

na medula intersticial é fisiologicamente mais proeminente e quantitativamente maior do

exterior ao interior da medula. A MEC do interstício renal normalmente consiste em

colágeno tipo I, III, V, VI, VII e XV, e alguns GAGs e outros polissacarídeos (GENOVESE et al., 2014).

Assim, a obtenção de suporte renal, ocorre por processos que ocasionam a

decelularização desse órgão. A preservação da ultraestrutura nativa e a composição da

MEC durante o processo de decelularização do tecido é o desejável (KATARI et al.,

2014). Um protocolo considerado ideal para decelularização é o que consiga remover

eficientemente todo material celular e nuclear, com o mínimo de dano a composição, a

atividade biológica e a integridade mecânica da matriz extracelular renal (MER). O rim

devido à sua anatomia e fisiologia peculiar leva o suporte de MER ser um ponto de

partida racional para a regeneração renal (GILBERT, 2006).

A principal função da matriz extracelular biológica é servir de suporte para

células que serão cultivadas ocasionando uma recelularização. A matriz então poderá

ser remodelada e reutilizada como um novo órgão ou tecido (TAYLOR, 2006).

1.4. GLICOSAMINOGLICANOS

Os glicosaminoglicanos (GAGs) são macromoléculas de natureza glicídica que

interagem com proteínas específicas formando complexos de alto peso molecular,

chamado de proteoglicanos e modulam diversos processos biológicos, como

desenvolvimento, angiogênese, crescimento axonal, progressão do câncer, patogênese

microbiana, hemostase, dentre outros (SASISEKHARAN, 2006).

Os diferentes tipos de GAGs podem ser classificados de acordo com o tipo do

ácido Hexurônico (HexA): (ácido glucurônico (GlcA) ou ácido idurônico (IdoA)), pelo tipo

17

da hexosamina: (glucosamina (GlcNac) ou galactosamina (GalNac)), pelo tipo de

ligação glicosídica e pelo padrão de substituição de sulfato(s) pela(s) hidroxila(s) das

unidades dissacarídicas que o compõem (Figura 7). São aniônicos devido à presença

de sulfatos (SO4-2) e/ou grupos carboxilas (COOH) presentes nos monossacarídeos

constituintes. As exceções são o ácido hialurônico (HA), que não é sulfatado, e

queratam sulfato, o qual contém D-galactose (Gal) (açúcar neutro) em vez de ácido

hexurônico. São descritos seis tipos de GAGs em tecidos de mamíferos: o condroitim

sulfato (CS), dermatam sulfato (DS), queratam sulfato (KS), heparam sulfato (HS), heparina, e ácido hialurônico (HA) (Figura 8) (BERNFIELD et al., 1999).

Figura 7 Representação geral da composição da estrutura de um GAG.

Os proteoglicanos também são amplamente distribuídos em grânulos

intracelulares e na superfície da célula, onde funcionam como co-receptores para

ajudar as células a responderem a pepitídeos sinais. Além disso, são componentes

essenciais da MEC onde formam géis hidratados. Eles também têm sido relacionados a

vários processos fisiopatológicos: a organização do tecido, crescimento celular,

maturação e na modulação da ação de fatores de crescimento entre outros (CADAVAL

RA et al., 2000).

GAG = Hexosamina + Ácido Hexurônico (HexA)

↓ ↓ ↓ ↓ N-acetil N-acetil Ácido Ácido

Galactosamina Glucosamina Glucurônico Idurônico (GalNac) (GlcNac) (GlcA) (IdoA) ou D-galactose (Gal)

18

Figura 8 Unidades dissacarídicas presente nos GAGs. Com exceção de bactérias, fungos e protozoários, os GAGs foram detectados

em todos os animais estudados, tanto vertebrados quanto invertebrados, estando

presentes em todos os tecidos desses organismos (MEDEIROS et al., 2000;

CHAVANTE et al., 2000; SANTOS et al., 2003). Isto sugere que o aparecimento dos

GAGs seja concomitante à emergência da organização tissular (DIETRICH et al., 1998).

Os HS são componentes ubíquos de tecidos animais (DIETRICH et al., 1998;

BERNFIELD et al., 1999). O padrão de sulfatação do HS varia de acordo com o tecido e

situação fisiológica ou patofisiológica na MEC desde que essas moléculas estejam

estrategicamente posicionadas para regular as interações entre as células e o seu meio

ambiente, que são de importância fundamental para o crescimento e desenvolvimento

normal e para a manutenção de funções celulares (MOLIST, 1998). Diversas evidências

sugerem que o HS tem um importante papel no reconhecimento celular, adesão celular,

controle do crescimento, metabolismo de lipídios, angiogênese, produção de citocinas e

quimiocinas, fatores de crescimento e outros componentes da matriz extracelular.

(BERNFIELD, 1999; ORI, 2011; LOPES, DIETRICH & NADER, 2006). Além disso, os

HS estão ligados a diferentes estruturas proteicas e encontram-se na superfície celular

19

e matriz extracelular, como a membrana basal. Os proteoglicanos de HS da superfície

celular podem ser ancorados às proteínas transmembranares ou através da proteína do

núcleo de glicosilfosfatidilinositol. Os HS também desempenham um papel na

sinalização celular quer como receptor ou co-receptor para diferentes ligantes (TANTRAVAHI et al., 1986; TKACHENKO et al., 2005).

No rim, proteoglicanos de HS são uma classe de biomoléculas com funções

estrutural e regulatória. Presentes na membrana basal glomerular desempenham um

importante papel na permeabilidade seletiva de cargas no glomérulo. HS é o GAG mais

abundante, principalmente presente na matriz extracelular glomerular, que é formado

pelo mesângio e membrana basal dos capilares glomerulares. Quando mediados por

ligações de quimiocinas, citocinas, enzimas, fatores de crescimento ou outras

moléculas envolvem-se em processos biológicos assim como filtração glomerular,

adesão celular, migração, proliferação e diferenciação (JACKSON, 1991; CAREY, 1997;

IOZZO,1998; BERNFIELD,1999; RAATS, 2000). Além disso, a carga aniônica (SO4-2)

de sua estrutura limita o acesso de proteínas do plasma para a membrana basal

glomerular, evitando assim o acúmulo destas moléculas. Também apresenta a

capacidade de se ligar a outros componentes da matriz extracelular glomerular,

especialmente laminina e colágeno, ajudando a manter a arquitetura molecular desta

matriz, mantendo a seletiva permeabilidade glomerular (KANWAR & ROSENZWEIG,

1982). As alterações a esta seletividade pode ser responsável por proteinúria (PTN), o

qual tem sido considerado o principal marcador de lesão glomerular e está diretamente

correlacionada com a perda da função renal (REMUZZI & BERTANI, 1990; BURTON & HARRIS, 1996; REMUZZI et al., 2006).

Evidências mais recentes mostram que CS juntamente com HA desempenham

papel igualmente importante em seletividade de carga da membrana glomerular

(JEANSSON & HARALDSSON, 2003).

No rim de rato adulto, os GAGs compreendem cerca de 86% de HS e 14% de

CS/DS entre os GAGs sulfatados em adultos, enquanto no rim embrionário 75% de CS

(STEER et al., 2004).

20

Além dos GAGs acima, há a heparina que é, estruturalmente, semelhante ao

HS e restringe-se à grânulos citoplasmáticos de algumas céllas sanguíneas e

mastócitos. É um GAG formado por unidades dissacarídicas (GalN2S6S 14 IdoA2S)

(KIM & SALTON, 1996).

O CS é o componente básico de todos os tecidos conjuntivos (BARNHILL,

2006; DU SOUICH, 2014; RONCA, 1998). O CS comercialmente disponível é extraído

da cartilagem de tubarão e existe, geralmente, sob a forma de sal de sódio. O grau de

sulfatação e o comprimento da cadeia de CS extraído variam de diferentes espécies e

teores (TAT, 2010). Além disso, esse polissacarídeo é antiinflamatório, benéfico na

produção de colágeno e no equilíbrio anabólico / catabólico de condrócitos (RONCA,

1998). Sendo, portanto, atualmente amplamente adotado no tratamento farmacológico

para osteoartrite. É relatado como sendo capaz de aliviar eficazmente a dor, melhorar a

função da articulação e abrandar a progressão radiológica da patologia (ROUBILLE,

2015; GROVER & SAMSON, 2016; MA, 2017).

DS é formado por unidades dissacarídicas de GlcA ou IdoA com uma GalNAc e

é encontrado em todos os vertebrados. A cadeia do DS pode ser delineada por

modificações na cadeia de CS. E estas modificações podem ocorrer no GlcA, onde uma

reação de epimerização pode ocorrer para formar IdoA (BANDTLOW, 2000; RHODES,

2004). Variações de sulfatação sobre ambos ácido urônico (2-O-) e GalNAc (4-O- e/ou

6-O-) são responsáveis pela extensiva heterogeneidade deste polissacarídeo (RUDD,

2010). A acumulação de DS / CS na matriz extracelular ocorre em processos tais como

cicatrização de feridas ou fibrose (KOZMA, 2005; WISOWSKI, 2017).

O KS não contém ácidos urônicos, e sua unidade de dissacarídeo de repetição

é constituída por Gal e resíduo de GlcNAc. KS é uma cadeia de polilactosamina

sulfatada e contém uma mistura de dissacarídeos não sulfatados, monosulfatados e

disulfatados. Ele pode ser sulfatado no carbono 6 de ambos monossacarídeos Gal e

GlcNAc. O KS foi inicialmente identificado em córnea de bovinos como o esqueleto de

poli-N-acetil-lactosamina de Galβ(1-4)GlcNAcβ(1-3) com porções sulfatadas (MEYER,

1953). Na córnea, KS está presente em três PG: lumincan, keratocan e mimecan

21

(TAKEDA-UCHIMURA, 2015).

1.5. BIOENGENHARIA TECIDUAL

A bioengenharia tecidual é então uma alternativa promissora ao transplante de

órgãos, com enorme potencial em processos de regeneração e reparo de tecidos,

fornecendo soluções para as condições em que o tecido nativo está comprometido (LU

et al., 2011; HE e CALLANAN, 2013; TEODORI et al., 2014). Sendo assim, é uma área

emergente que visa à substituição terapêutica de estruturas multicelulares, teciduais ou

equivalentes a órgãos. Ela pode ser denominada medicina regenerativa (MR), pois visa

o reparo de tecidos lesados ou degenerados por substitutos funcional e estruturalmente

equivalentes a fim de restaurar ou restabelecer função normal. Ela abrange os

processos que usam as células vivas autólogas, alogênicas ou xenogênicas como

agentes terapêuticos (ATALA, 2006; MASON & DUNNILL, 2008).

A regeneração de sistemas e estruturas fisiológicas (por exemplo, órgãos) pode

ocorrer in vivo ou ex vivo. Este processo pode exigir células, materiais de suporte

naturais ou artificiais ou uma combinação desses elementos (ORLANDO et al., 2011). A

medicina regenerativa tem mostrado imenso potencial no transplante de órgãos se

tornando um campo de grande interesse e investimento de pesquisa para a

comunidade científica (ORLANDO et al., 2013; ORLANDO & WALKER, 2014), bem

como para especialidades relacionadas de ciências da saúde como nefrologia

(MORALES et al., 2014).

A tríade de engenharia de tecidos consiste em três fatores principais: as

células, as moléculas de sinalização e o suporte (matriz extracelular de rim acelular em

3D), que apoiam e dependem uns dos outros. Especificamente, o suporte, juntamente

com moléculas de sinalização integradas, fornecem pistas estruturais, bioquímicas e

biomecânicas para orientar e regular o comportamento das células e o desenvolvimento

de tecidos (GILPIN & YANG, 2017).

Devido à alta complexidade da estrutura anatômica e composição do rim, o

suporte renal foi proposto como uma estratégia promissora para a reconstrução do rim.

22

No entanto, a obtenção de uma matriz extracelular de rim viável é extremamente difícil

por sua composição complexa, incluindo aminoácidos, proteínas, glicoproteínas e GAGs e microestruturas necessárias para filtração (BADYLAK, 2004; GAGLIARDINI et

al., 2010).

A implantação de suporte renal mostrou benefício na promoção da

angiogênese, recrutamento de células progenitoras e minimização de reações imunogênicas (VAVKEN et al., 2009). Portanto, a decelularização de um órgão inteiro

surge como uma nova abordagem vantajosa para a geração da arquitetura 3D natural (DESTEFANI et al., 2017).

Uma alternativa para a falta de órgãos seria o xenotransplante usando órgãos de animais (YOKOO & KAWAMURA, 2009; WANG et al., 2014), através de uma

estratégia que combina decelularização de órgão e inserção das células do paciente para evitar risco de reações imunológicas adversas (BARAKAT et al., 2012). O uso de

rins de porco para engenharia de tecidos é uma abordagem atrativa, principalmente

porque o tamanho dos órgãos dos suínos é semelhante ao de humanos e os suportes

dos rins de porco podem permitir uma melhor adesão, sobrevivência, e manutenção de

células humanas do que os suportes obtidos a partir de rins de cães ou macacos

(NAKAYAMA et al., 2010; SONG e OTT, 2011; FAULK et al., 2014a, b; HABKA et al.,

2015; MOINI et al., 2015; LIH et al., 2016; MCKEE & WINGERT, 2016; RANA et al.,

2017).

Os suportes podem ser preparados através de uma variedade de métodos e

materiais, tanto sintéticos como naturais. Os suportes naturais são obtidos de animais

(incluindo humanos) através de um processo chamado decelularização, pelo qual o

compartimento celular do órgão em questão é destruído e os restos de células são

removidos do suporte de matriz extracelular (MEC) restante. A justificativa para o uso

de suportes naturais reside na evidência de que a MEC não é elemento negociável para

a vida de animais multicelulares, pois define as interações físicas e químicas que

controlam a fisiologia celular e o destino das células, e fornece suporte mecânico e

estrutural às células e tecidos (HYNES, 2009). Já os suportes sintéticos são benéficos,

23

pois sua estrutura e propriedades mecânicas podem ser usadas e controladas com o

objetivo de produzir um ótimo ambiente para um tipo celular ou um conjunto particular

de células, que apresentam uma taxa de biocompatibilidade e boa ação biológica. Entre

estas propriedades, a rigidez e topografia da matriz mostram profundas influências no

crescimento e na diferenciação celular (GILPIN & YANG, 2017).

1.6. AGENTES DECELULARIZANTES: VISÃO GERAL

A decelularização emprega detergentes e/ou sais e/ou enzimas e/ou meios

físicos para remover células de tecidos e/ou órgãos, preservando a composição,

arquitetura e bioatividade da MEC. Existe uma infinidade de métodos de decelularização para diferentes aplicações (GILBERT et al., 2006; BADYLAK et al.,

2011; GILBERT, 2012). Sendo assim, a variação nos métodos de decelularização

obscurece comparações de dados e determinar um ótimo método de decelularização é

um tanto enigmático. No entanto, com uma crescente lista de novas publicações, a viabilidade do órgão a decelularização é indiscutível (KAWECKI et al., 2017).

Qualquer procedimento de decelularização de órgão destina-se a remover as

células sem alterar a arquitetura tridimensional nativa da MEC mantendo as

propriedades mecânicas e biológicas. Os métodos mais comumente utilizados envolvem uma combinação de tratamentos químicos, físicos e biológicos (KAWECKI et

al., 2017.

O desenvolvimento de novas técnicas de decelularização e o advento da

decelularização tridimensional do órgão inteiro é contínuo e torna-se cada vez mais complexo e eficiente (BORNSTEIN e SAGE, 2002; KOLKER et al., 2005).

Deve ser enfatizado que todos os métodos de decelularização propostos até

hoje podem afetar a estrutura da MEC. Assim, os processos de decelularização exigem

métodos sensíveis devido à fragilidade dos órgãos e sua complexidade estrutural

interna. Portanto, é necessário desenvolver técnicas de decelularização e remoção

residual de ácido desoxirribonucleico (DNA) simultaneamente para preservar a

24

integridade da MEC. Existem vários fatores que influenciam o processo de

decelularização, como densidade celular, peso corporal, conteúdo lipídico, a espessura

do órgão e as propriedades intrínsecas das substâncias empregadas para remover as

células (ROSS et al., 2009). Além disso, é necessário considerar as forças mecânicas

envolvidas no processo, como a pressão e o fluxo da perfusão e possibilidade de uso

de infusão retrógrada de fluidos (LIN et al., 2016).

1.6.1 MÉTODOS FÍSICOS (MECÂNICOS)

Os tratamentos físicos podem incluir agitação ou ultrassom, massagem

mecânica ou alta pressão hidrostática ou dióxido de carbono supercrítico (CO2), ou

congelamento-descongelamento para remover completamente as células constituintes

de um tecido e materiais genéticos. Embora cada método específico seja único, cada

protocolo mecânico de decelularização envolve um processo de lavagem posterior e a

remoção do conteúdo da célula a partir da MEC. Em muitos casos, o passo de lavagem

é crítico na determinação de eficácia do procedimento. Esses tratamentos físicos são

eficazes e causam o mínimo de alteração para a arquitetura tridimensional da MEC,

mas, geralmente, insuficientes para alcançar completa decelularização e devem ser

combinados com um produto químico e/ou enzimático (GILPIN & YANG, 2017). Embora

os procedimentos de congelamento-descongelamento sejam benéficos na sua retenção

de componentes bioquímicos e propriedades biomecânicas, eles podem potencialmente

levar a imunorrejeição devido à remoção insuficiente de materiais genéticos (GILPIN &

YANG, 2017).

Estudos anteriores já revelaram que embora o tratamento com alta pressão

superior a 600 MP seja benéfico em seu curto período de tratamento e seja capaz de

esterilizar o tecido através da destruição de bactérias e membranas virais, requer um

extenso processo de lavagem e pode alterar as propriedades estruturais e mecânicas

do tecido (TAM et al., 2015).

A principal vantagem da decelularização de tecidos por meio de métodos físicos

sobre métodos químicos é a não introdução de produtos químicos potencialmente

25

tóxicos para o tecido. Mas isto não significa a falta de ocorrência de efeitos colaterais

adversos (TAM et al., 2015).

1.6.2 MÉTODOS QUÍMICOS

Entre os métodos químicos de decelularização, os detergentes são mais

frequentemente mencionados.

Os detergentes são compostos orgânicos classificados como surfactantes (=

agentes que atuam na superfície) usados para romper a membrana das células (lise

celular) e liberar o material intracelular na forma solúvel. Suas principais aplicações são:

na quebra das interações proteína-proteína, proteína-lipídio e lipídio-lipídio; na

desnaturação da estrutura proteica e na cristalização de proteínas. Existem vários tipos

de detergentes agrupados de acordo com suas propriedades (LINKE, 2009).

Os detergentes são constituídos de uma porção carbônica hidrofóbica e um

grupo hidrofílico carregado em sua extremidade (Figura 9). O tamanho da porção

hidrofóbica do detergente é diretamente proporcional ao grau de hidrofobicidade,

(costuma ser constante entre os detergentes), enquanto o grupamento carregado é

variável. Baseada em suas características, essas substâncias podem ser divididas de

acordo com as propriedades da solução: iônico, não-iônico e detergentes zwitteriônicos

(tanto iônicos quanto não-iônicos) (LUCHE et al., 2003).

Figura 9 Estrutura geral de um monômero de detergente. Adaptado de https://www. anatrace.com. Acesso em 29/06/17.

Detergentes iônicos são compostos de uma cadeia hidrofóbica e um grupo

26

carregado em sua extremidade, podendo ser aniônico ou catiônico. Já os detergentes

não-iônicos diferem dos iônicos em relação ao grupamento na extremidade da cadeia,

que não possui carga e é hidrofílico. São considerados surfactantes suaves, pois

quebram interações proteína-lipídio e lipídio-lipídio, porém não quebram interações

proteína-proteína, e a maioria desses detergentes não desnaturam as proteínas. Dessa

forma, as proteínas são solubilizadas e isoladas, porém mantém sua forma nativa. Por

apresentar esta vantagem, estes detergentes são escolhidos quando se quer isolar as

proteínas de membrana (LUCHE et al., 2003).

Todos eles são capazes de solubilizar as membranas celulares e dissociar o

DNA. No entanto, esses agentes também podem dissociar componentes da MEC (por exemplo, proteínas, lipídios) o que inevitavelmente afeta a sua ultraestrutura (GILPIN et

al., 2014; ROOSENS et al., 2016; ZAVAROVA et al., 2016).

Detergentes iônicos e não-iônicos são eficazes para solubilizar tanto

membranas celulares, nucleares e citoplasmáticas, mas tendem a desnaturar proteínas por interações proteína-proteína por desregulação (GRAUSS et al., 2003). Os mais

utilizados são o dodecilsulfato de sódio (SDS), o desoxicolato de sódio (NaDOC) e triton x-100 (CHEN et al., 1999; GRAUSS et al., 2003; KETCHEDJIAN et al., 2005; GILBERT

et al., 2008; FLYNN et al., 2010).

O SDS é o tensioativo aniônico mais comumente usado nos procedimentos de

decelularização. O SDS é muito eficaz para a remoção dos componentes celulares a

partir do tecido reduzindo a tensão superficial da solução aquosa e destruindo

interações não covalentes da proteína nativa (BALLAL et al., 2013). Em comparação

com outros detergentes, SDS tende a perturbar a estrutura do tecido, e causa uma

diminuição na concentração de GAGs e uma perda de integridade de colágeno, mas não parece que SDS remove colágeno do tecido (CHEN et al., 1999; KETCHEDJIAN et

al., 2005; GILBERT et al., 2008; FLYNN et al., 2010).

O NaDOC também é muito eficaz para a remoção de restos celulares mas

tende a provocar uma maior perturbação da arquitetura do tecido nativo, quando

comparado com o SDS (GILBERT et al., 2008).

27

Detergentes não-iônicos têm sido utilizados extensivamente em protocolos de

decelularização por causa de seus efeitos brandos sobre a estrutura do tecido. Estes

agem em interações lipídio-lipídio e lipídio-proteína, mas não em interações proteína-

proteína de modo que as proteínas em um tecido após o tratamento com esses tipos de detergentes permanecem com sua conformação funcional (GILBERT et al., 2008;

FLYNN et al., 2010).

Triton x-100 é o mais estudado tipo de detergente não-iônico para protocolos de

decelularização. A exposição de tecido a triton x-100 pode variar de várias horas a 14

dias mostrando resultados variados. Tem sido descrito que o uso desse detergente é

acompanhando de uma mudança na estrutura e composição da MEC (CHEN et al.,

1999; GRAUSS et al., 2003).

Outro detergente proposto para decelularização é 3- [(3-colamidopropil)

dimetilammonio] -1-propanossulfonato] (CHAPS). CHAPS exibe propriedades tanto

não-iônicas quanto iônicas. É um agente de decelularização eficaz, mas comparado ao SDS, este último dá melhores resultados (GILPIN et al., 2014; FAULK, 2015).

SDS parece ser mais eficaz do que triton x-100 para remover núcleos de tecidos densos de órgãos como o rim (NAKAYAMA et al., 2010), mas tem a

desvantagem associada à perturbação da ultra-estrutura (OTT et al., 2010) e a

eliminação do fator de crescimento de forma geral (REING et al., 2010). Para

deslipidação do tecido, detergentes não-iônicos tais como triton x-100 são mais eficazes do que os detergentes iônicos tais como NaDOC (CEBORATI et al., 2010).

A remoção das proteínas da MEC e DNA por detergentes aumentam com o

tempo de exposição e variam com o órgão, tipo de tecido e a idade. A combinação de

vários detergentes aumenta a perda de proteínas da MEC (NAKAYAMA et al., 2010).

Ácidos e bases são usados em protocolos de decelularização para solubilizar

componente citoplasmático das células, bem como eliminar os ácidos nucleicos, tais

como o RNA e DNA. Por exemplo, o ácido paracético (PAA) é um agente de

desinfecção comum que funciona como um agente decelularizante sobre os ácidos

28

nucleicos com um efeito mínimo sobre a composição e estrutura da MEC. No entanto,

esses produtos químicos também podem dissociar moléculas importantes como os

GAGs. Tratamento com PAA preserva a estrutura e função de muitos dos fatores de

crescimento que residem na MEC. O principal mecanismo pelo qual bases, tais como

hidróxido de sódio reduzem as propriedades mecânicas, é a clivagem do colágeno. A

remoção de vestígios de DNA a partir do tecido pode ser particularmente difícil devido à

natureza “pegajoso” de DNA e a sua tendência de aderir a proteínas da MEC (GILBERT

et al., 2008).

Álcoois como o glicerol agem no processo de decelularização provocando

desidratação do tecido e lise das células. Isopropanol, etanol, metanol e acetona são

mais eficazes do que lipases na remoção de lipídios a partir de tecido. Mistura de

metanol e clorofórmio tem sido usada durante deslipidação de tecidos (PRASERTSUNG et al., 2008).

Por outro lado, um possível efeito citotóxico é atribuído principalmente a agente

de decelularização química. Está provado que a remoção confiável dos detergentes

residuais é altamente desejável (ZAVAROVA et al., 2016). Foi comprovado que esse

tipo de decelularização frequentemente pode desnaturar a estrutura do colágeno em

tecidos decelularizados, diminuindo assim a resistência mecânica do suporte obtido.

Também foi demonstrado que a maioria dos detergentes causa pelo menos alguma

remoção de GAG do suporte, um efeito que tem causado impacto negativo nas características viscoelásticas do suporte (AKHMANOVA et al., 2015; KEZWO et al.,

2016).

1.6.3 MÉTODOS BIOLÓGICOS

Alguns protocolos de decelularização utilizam enzimas que incluem nucleases,

tripsina, colagenase, lipase, dispase e termolisina. Enzimas podem proporcionar uma

elevada especificidade para a remoção de resíduos de células ou componentes

indesejáveis na MEC. No entanto, a remoção completa das células por tratamento

enzimático é difícil e os restos de enzima podem prejudicar a recelularização ou

29

provocar uma resposta imunitária adversa (PRASERTSUNG et al., 2008; YANG et al.,

2009).

As proteínas da MEC tais como colágeno têm limitada resistência à clivagem

de tripsina. Em comparação a detergentes, tripsina é mais pertubadora para elastina e

colágeno e mais lenta para remover as células, mas mostra melhor preservação do

conteúdo de GAG (PRASERTSUNG et al., 2008; YANG et al., 2009).

A colagenase pode ser utilizada durante a decelularização, mas apenas

quando a preservação da ultraestrutura e a retenção do colágeno não são críticas para o trabalho (PRASERTSUNG et al., 2008; YANG et al., 2009).

1.6.4 MÉTODOS COMBINADOS

As abordagens químicas e físicas podem ser melhoradas combinando-as com

tratamentos enzimáticos que podem remover os componentes celulares e genéticos

indesejados da MEC. No entanto, sua eficácia é, em última instância, dependente da

manutenção dos recursos da MEC que são críticos na regeneração da função desejada

do tecido (GILPIN & YANG, 2017).

Cada técnica acima mencionada tem suas vantagens e desvantagens. Por

exemplo, os métodos mecânicos são geralmente menos prejudiciais a estrutura do

tecido. Por outro lado, os surfactantes em baixas concentrações ou enzimas usadas

isoladamente podem não remover completamente todos os detritos celulares. A este

respeito, o método combinado pode exigir mais produtos químicos e um tempo de

processamento mais longo do que o tratamento com protocolos isolados. A utilização

de um controle de qualidade da matriz decelularizada poderia indicar quais moléculas

foram removidas de forma mais proeminente, que poderiam ser adicionados à matriz,

pelo menos com relação aos proteoglicanos. (GILPIN & YANG, 2017).

1.7 RECELULARIZAÇÃO

Após os protocolos de decelularização renal, várias pesquisas têm se dedicado

30

a tentar recelularizar a MER a fim de produzir um tecido ou órgão funcional. Para os

métodos de recelularização é plausível que diferentes tamanhos de órgãos requerem

diferentes números de células, métodos de repopulação e dependam de diferentes

condições, como a taxa de perfusão de recelularização, temperatura, concentrações de

CO2, fatores de crescimento e nutrientes. E a repopulação celular ocorre de forma

diferenciada dentro dos túbulos renais e capilares peritubulares. (ROSINES et al., 2007;

SULLIVAN et al., 2012; ORLANDO et al., 2013; ZAMBON et al., 2014; CARALT, 2015;

KIM et al., 2015).

Um método de recelularização 3D bastante utilizado é o através da artéria, que

pode alcançar uma distribuição equilibrada de células (CARALT et al., 2015).

Metodologias através da artéria e ureter já foram comparadas e parece que a

combinação destas duas vias é mais eficiente com relação à retenção de células (ROSS et al., 2009). Linhagem imortalizada de células epiteliais de tubo cortical renal

humano foi semeada através da artéria renal dentro de um biorreator e pode-se observar formação de estruturas tubulares (CARALT et al., 2015). Células endoteliais

venosas de cordão umbilical humano (HUVECs) também já foram infundidas através da

artéria renal e uma combinação de células renais neonatais de rato (NKCs) através do

ureter é uma estratégia promissora que está em estudo (SONG et al., 2013).

As aplicações clínicas da MEC decelularizada estão se tornando mais

prevalente. No entanto, elas foram limitadas a tecidos menos complexos que funcionam

principalmente em estruturas ou papéis reconstrutivos. Vários produtos xenogênicos ou

alogênicos derivados de MEC decelularizadas já aprovados no exterior estão no

mercado internacional e são destinados à regeneração e substituição de tecidos.

Dentre eles a matriz de tecidos regenerativa AlloDerm da LifeCell´s (Enxerto dérmico

humano) e SynerGraft da CryoLife (Válvula cardíaca pulmonar humana). O primeiro

suporte serve para facilitar a proliferação celular, enquanto que o último serve como um

substituto para a estrutura existente. Além disso, foram realizados ensaios clínicos para

estruturas mais complexas. Por exemplo, a primeira traquéia bioengenheirada a ser

implantada em um paciente foi gerada usando decelularização (MACCHIARINI et al.,

31

2008).

Os fatores exploradores que afetam a decelularização como: pH, temperatura,

detergentes, etc e a recelularização como: tipo celular, número de células, pressão, etc

são fundamentais para a aplicação clínica potencial (Figura 10).

32

Figura 10 Fatores resumidos baseados em estudos recentes que associaram decelularização renal e recelularização. Adaptado (Y.-Q. LIN et al., 2016).

A bioengenharia de um rim completamente repovoado ainda não é possível.

Ainda há um longo caminho a percorrer porque um rim totalmente funcional requer

componentes tubulares e glomerulares juntamente com uma rede de vasos funcionais

capazes de suportar o fluxo de fluidos (GILPIN & YANG, 2017).

33

Mas uma tecnologia inovadora chamada impressão tridimensional que usa

biomateriais para imprimir o rim de acordo com o posicionamento anatômico específico está sendo estudada (PELOSO et al., 2015). Embora ainda haja um longo caminho a

percorrer antes da construção de um rim 3D funcional e viável, métodos de

fibrilogênese de colágeno em um meio líquido para construir redes vasculares 3D

usando hidrogel já permitiu a difusão de nutrientes e oxigênio em um néfron (MU et al.,

2013).

34

2 JUSTIFICATIVA

Apesar de o número de transplantes renal ter aumentado significativamente nos

últimos anos, esse procedimento ainda é bastante custoso e necessita, infelizmente, de

doadores vivos ou falecidos compatíveis com o paciente receptor daquele órgão.

Uma alternativa efetiva ao transplante de órgãos tradicional é necessária para

aumentar o número de órgãos disponíveis para transplante, diminuir os tempos de

espera de pacientes e melhorar resultados em longo prazo. Em um esforço para

resolver esta necessidade, pesquisa focado em engenharia de tecido de órgãos inteiros

foram intensificadas durante o últimos 5 anos.

O estudo da matriz de rim decelularizado pode possibilitar melhor entendimento

de como as moléculas ali presentes podem contribuir para um possível e futuro

processo de recelularização. Logo, por considerar que a preservação das proteínas

colagenosa e carboidratos complexos (GAGs) são de fundamental importância para

futuro processo de recelularização, este trabalho foi direcionado a verificar o nível de

preservação destas moléculas na matriz extracelular renal após o processo de

decelularização por detergentes e avaliar a recelularização renal com células de

linhagem renal.

Assim, este trabalho se propõe a colaborar com o avanço de novas pesquisas

para a utilização de órgãos decelularizados e sua posterior recelularização como um

novo caminho para minimizar os problemas relacionados à rejeição,

histocompatibilidade e oferta de órgãos.

35

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

O presente estudo visa avaliar a eficiência de diferentes detergentes sobre os

componentes da matriz extracelular além de analisar a recelularização de matriz 2D por

linhagem de células renais.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Estabelecer protocolo de decelularização eficiente para obtenção de

matriz extracelular renal (MER);

• Extrair e quantificar glicosaminoglicanos (GAGs) na MER;

• Localizar o GAG Heparam Sulfato na MER;

• Viabilizar a matriz extracelular renal para o processo de recelularização;

• Avaliar o processo de recelularização com células renais em cortes

transversais da MER;

36

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 REMOÇÃO DO RIM

Os animais utilizados no desenvolvimento do trabalho experimental foram indivíduos fêmeas da espécie Rattus novergicus da linhagem Wistar com idade entre 12

a 30 semanas e peso entre 250-400 g. Para o desenvolvimento deste trabalho foram

utilizadas ratas Wistar pela sua oferta de disponibilidade à época. O protocolo desse

estudo foi aprovado pela CEUA-CCS/UFRJ sob o número de processo

01200.001568/2013-87 e nº de protocolo 146/15.

Os animais foram mantidos no biotério de Experimentação do Núcleo em

Ecologia e Desenvolvimento Socioambiental de Macaé (NUPEM/UFRJ), em ambiente

com ciclo claro-escuro de 12/12 horas, com temperatura em torno de 22ºC e com livre

acesso à água e à comida. Não mais que 2 animais foram mantidos por gaiola.

Os animais foram pesados, sedados e anestesiados intraperitonealmente com 2

mL de uma mistura de ketamina 100 mg/kg, xilasina 10 mg/kg e solução salina. Para

evitar a coagulação sanguínea foi utilizada heparina 10 Ul/ml que foi misturada ao

anestésico. Depois de constatada a anestesia e sedação profunda, o animal foi

submetido à laparotomia total com o intuito de realizar a punção da veia renal esquerda

com escalpe de 24 G. Uma vez a veia sendo puncionada, a artéria e o ureter foram

cortados e foi realizada perfusão com solução salina cloreto de sódio (NaCl) 0,9% e

ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) 50 mM por 15 minutos à temperatura

ambiente. Posteriormente, o conjunto escalpe e rim foi removido, pesado e, com auxílio

de um paquímetro, as medidas de comprimento, diâmetro e espessura do órgão foram

realizadas. O peso do escalpe foi descontado para obtenção real do peso do rim.

Imediatamente depois, o escalpe foi conectado a um sistema de perfusão peristáltico de

fabricação artesanal conectado a uma bomba peristáltica modelo Miniplus 3 e

fabricante Gilson para iniciar o processo de decelularização. O rim direito foi utilizado

como controle. O mesmo foi submetido aos mesmos passos de perfusão com solução

37

salina, pesagem e realização de medidas de comprimento, diâmetro e espessura.

O sistema de perfusão consistiu em uma bomba peristáltica com controle do

fluxo da solução bombeada (1 mL/min) o mais próximo da fisiológica. Este sistema teve

um recipiente para a solução de perfusão e outro para solução de escape e canalículos

de plástico para foram os condutores das soluções (Figura 11).

Figura 11 Sistema de perfusão para o processo de decelularização. A cânula foi introduzida na veia renal por onde foi feito a perfusão para remoção das células. A bomba peristáltica teve o controle do fluxo da solução bombeada, este sistema teve um recipiente para a solução de perfusão e outro para solução de escape e canalículos de plástico para serem os condutores das soluções.

4.2 PROCESSO DE DECELULARIZAÇÃO

O processo de decelularização renal foi realizado à temperatura ambiente com

fluxo de 1 mL/min e monitoramento constantes, em que, iniciou-se com perfusão de

38

solução salina (NaCl 0,9% + EDTA 50mM) por 15 minutos. Em seguida foi utilizado 1%

ou 0,5% de cada um dos detergentes. Foram testados, individualmente, três tipos de

detergentes com propriedades químicas diferentes: SDS (Sigma); Triton x-100 (Impex);

Tween 20 (Sigma) (CARALT M et al., 2015). Para cada concentração (1% ou 0,5%) do

SDS, foram utilizados cinco animais (n=5). Já para cada concentração (1% ou 0,5%)

de Triton x-100 e Tween 20 foram utilizados três animais (n=3). Tentou-se estabelecer o

tempo médio de remoção total das células do órgão para cada concentração e tipo de

detergente (SULLIVAN, 2012).

Durante o período de perfusão do detergente, o órgão foi observado e foi

acompanhada a mudança da sua coloração. O seu branqueamento indicava a

distribuição uniforme da perfusão e eficiência do detergente para o processo de

decelularização.

Finalizado o período de decelularização com o detergente, o órgão foi

perfundido com água ultra-pura por 90 minutos para remoção do detergente.

Posteriormente, o conjunto escalpe e rim foi removido, pesado e, com auxílio de

um paquímetro, as medidas de comprimento, diâmetro e espessura do órgão foram

realizadas.

4.3 CARACTERIZAÇÃO DA MATRIZ RENAL DECELULARIZADA

Os rins decelularizados foram nomeados de matriz extracelular renal (MER) e

foram processados para microscopia óptica; reservados para extração, identificação,

localização e quantificação dos GAGs; para avaliar a eficiência do protocolo de

remoção das células, preservação dos GAGs, como descritos a seguir:

4.3.1 PROCESSAMENTO PARA MICROSCOPIA ÓPTICA

A MER foi seccionada frontalmente e transferida para recipiente contendo

aproximadamente 30 ml da solução fixadora 4% paraformaldeído (Sigma) em tampão

fosfato salino (15 mM NaCl; 0,1 M NaH2PO4xH2O; 0,2 M Na2HPO4) (pH 7,4)

permanecendo à temperatura ambiente até o dia seguinte quando foi transferida para

39

4ºC. A fixação do tecido foi feita por imersão durante o período médio de 24 a 96 horas.

Posteriormente, as secções foram lavadas em PBS para retirada do excesso de

fixador e então foram submetidas à desidratação por gradiente crescente de etanol (70,

80, 90 e 3x100%) por 30 minutos de permanência em cada concentração. Após a

desidratação as secções foram clarificadas em 3 banhos de 40 minutos cada de xilol e

depois impregnadas em 3 banhos de 60 minutos cada de paraplast (Sigma) a 56-60ºC.

Após impregnação, as fatias foram incluídas em paraplast para corte a 5 µm em

micrótomo semiautomático modelo RM 2245 fabricante Leica.

Os rins controles também foram submetidos às mesmas etapas de

processamento descritas anteriormente.

Os procedimentos de coloração foram realizados após desparafinização e re-

hidratação das lâminas histológicas através da bateria inversa de xilol, gradiente

decrescente de etanol (100, 90, 80 e 70%) por 2 minutos de permanência em cada

concentração e, posterior hidratação em água destilada. Em seguida, as lâminas foram

coradas com Hematoxilina e Eosina (H&E) por 7 minutos em cada solução para

visualização geral do tecido, avaliação do grau de remoção das células e preservação

da arquitetura da matriz extracelular.

Além disso, as lâminas também foram coradas com PAS (Ácido Periódico de

Schiff; 1% ácido periódico e 0,5% reativo de Schiff) por 20 minutos para identificação

dos carboidratos (açúcares) neutros. Também foram coradas com SiriusRed modificado

(0,2% ácido fosfomolíbdico; 13 mM ácido pícrico; 0,14 mM Sirius red F3 BA) por 90

minutos para identificação do colágeno e para orceína (0,84% orceína; 10 mL álcool

absoluto; 5 gotas de HCl) por 7 minutos para identificação da proteína elastina. Após os

tempos nos corantes, as lâminas foram novamente desidratadas seguindo gradiente

crescente de etanol (70, 80, 90 e 100%) por 1 minuto de permanência em cada

concentração e bateria de xilol com posterior utilização do meio de montagem Entellan

(Merck) para montagem das lâminas histológicas.

As lâminas foram observadas em microscópio óptico Olympus modelo Bx51

40

acoplado à câmera Olympus DP71 de 12,5 mega pixels e fotomicrografias foram

obtidas nos aumentos de 200 e 400X para análise dos resultados.

4.3.2 EXTRAÇÃO DOS GAGs

A extração dos GAGs a partir de amostras de tecido renal controle e

decelularizado foi realizada de acordo com protocolo publicado anteriormente

(DIETRICH E DIETRICH, 1976; BELMIRO et al., 2005). Os rins foram cortados em

pedaços menores e colocados em acetona P.A para a deslipidação. Posteriormente,

secos em estufa a 60ºC, pesados e agrupados em tubo sendo utilizado cerca de 6 g

para cada extração (n = 6) sendo denominado de pó cetônico. Ao pó cetônico foi

acrescido de papaína (Merck) correspondente a 10% do valor da massa das amostras

em tampão de digestão (0,5 M acetato de sódio; 25 mM cisteína; 34 mM EDTA

dissódico; pH 5,0) na proporção de 10 mL de tampão para 1 g de tecido seco, sendo a

mistura incubada em banho-maria (Kacil) a 60°C por 24 h. Após incubação, o material

foi centrifugado a 5000 rpm (=2300 g) por 10 min e, em seguida, o sobrenadante foi

reservado. O precipitado foi submetido mais 2 vezes à nova incubação com papaína,

sob as mesmas condições descritas anteriormente e os sobrenadantes reservados.

Para o fracionamento foi adicionada isoladamente a cada sobrenadante, uma

solução de CPC (cloreto de cetilpiridínio) 10 % numa proporção de 5 µL para 1 mL de

sobrenadante e deixado em repouso por 24 h. O precipitado foi lavado 3 vezes com 100

µL de 0,05% CPC e depois dissolvido em uma solução de 2 M NaCl: etanol comercial

(15 : 100; v/v) e submetido a uma nova precipitação pela adição de 2 volumes de etanol

comercial por 24 h a 4°C (Figura 12). Logo após o material foi seco à temperatura

ambiente (CARDOSO, 1992). E, sujeito a eletroforese em gel de agarose antes e após

o tratamento com 2 U/mL DNase (Ambion) à 37º C por 24 h.

41

Figura 12 Esquema representativo das etapas envolvidas no processo de extração dos GAGs.

42

Para a eletroforese, alíquotas dos polissacarídeos sulfatados contendo,

aproximadamente, 7,8 μg foram aplicadas em um gel de agarose 1,2% em tampão 1,3

diaminopropano pH 9,0. Uma mistura padrão de GAGs (4 μL + 1 μL de vermelho de

cresol), contendo CS e Hep, na concentração de 1 mg/mL cada, foi aplicada à lâmina

como controle. Em seguida, os compostos foram submetidos à eletroforese (100 V), em

cuba refrigerada em gelo, por aproximadamente uma hora. Após a corrida, os GAGs

foram precipitados no gel com uma solução de 0,1% de cetavlon (brometo de

cetiltrimetilamônio) por 12 h. Em seguida, o gel foi seco sob fonte de calor e corado com

azul de toluidina 1% contendo ácido acético em 1% etanol 50% (v/v) e descorado em

uma solução de ácido acético 1% em etanol 50% (v/v). Vale destacar que essa

coloração, que é azul, cora os grupamentos sulfatos em roxo, devido à metacromasia.

Esse fenômeno químico foi descrito por Lison (1936), que ocorre quando o corante azul

de toluidina interage com uma grande quantidade de ésteres de sulfato. Assim, como

os GAGs são sulfatados estes grupamentos químicos são os responsáveis por esta

coloração roxa ou púrpura. A lâmina de eletroforese foi então digitalizada em scanner

de mesa. A identificação das bandas na lâmina foi feita com base na comparação com a migração dos padrões de GAG (BELMIRO et al., 2005).

4.3.3 DOSAGEM DE ÁCIDO URÔNICO

A dosagem de ácido urônico foi utilizado para quantificar os GAGs totais das

amostras e consiste da reação de carbazol, conforme metodologia descrita por DISCHE

(1947). O experimento foi realizado em triplicata para cada amostra de extração de

GAG (EXT 1, EXT 2 e EXT 3) dos rins (n=6). Aos tubos de ensaio contendo as

amostras diluídas em água foram adicionados, lentamente, 1,0 mL do reagente ácido

sulfúrico + borato (0,095% tetraborato de sódio (m/v) em ácido sulfúrico). A seguir, os

tubos foram agitados em vórtex e aquecidos em banho seco por 12 minutos a 100ºC.

Sendo logo em seguida colocados em banho de gelo. Após resfriamento, foram

adicionados 40 μL de reagente carbazol (0,2% (m/v) em etanol absoluto) e novamente

aquecidos em banho seco por 10 minutos a 100ºC. Após resfriamento dos tubos, foi

realizada a leitura na absorbância a 525 nm no espectrofotômetro modelo UV mini-1240

43

(Shimadzu). A curva padrão foi obtida utilizando-se diferentes concentrações (0 a 20

μg/mL), de glucurono-lactona (0,025 mg/mL) (Sigma) realizada nas mesmas condições.

A concentração de GAG nos tecidos foi expressa µg de GAG/mg de tecido deslipidado

e seco (BITTER et al., 1962).

4.3.4 LOCALIZAÇÃO DE HEPARAM SULFATO

Para técnica de imunofluorescência, os cortes das lâminas controle e

decelularização com 0,5% SDS foram desparafinizados e re-hidratados conforme

descrito anteriormente. Os cortes, depois de hidratados, foram cobertos com metanol

por 15 minutos para exposição dos sítios de reação. Após o período, o excesso do

álcool foi retirado e os cortes foram incubados com PBS + 0,3% triton x-100 por 10

minutos. Em seguida, os cortes foram lavados 2 vezes com PBS por 5 minutos cada

lavagem. Após essas lavagens, os cortes foram incubados com 10% soro de coelho por

1 hora para bloqueio dos sítios inespecíficos. Depois de retirado o excesso de soro, os

cortes foram incubados com o anticorpo primário (anti-HS contra o GAG, fabricante

Seikagaku na concentração de 1:100 diluído em 10% soro de coelho) por 24 horas a

4ºC.

Para retirar anticorpos primários não-ligantes, os cortes foram lavados com 5

vezes com PBS por 5 minutos cada lavagem. Em seguida, os cortes foram incubados

novamente com 10% soro de coelho por 15 minutos. Depois de retirado do excesso de

soro, os cortes foram incubados com o anticorpo secundário (Alexa 546 anti-

camundongo fabricante Invitrogen na concentração 1:500 diluído em 10% soro de

coelho) por 1h à temperatura ambiente. Posteriormente, os cortes foram lavados 9

vezes com PBS por 5 minutos cada lavagem. Em seguida, os cortes foram marcados

com DAPI (4',6-diamidino-2-fenilidone), marcador nuclear na concentração 1:10000 por

5 minutos e, depois, lavados 5 vezes com água destilada. Depois de retirado o excesso

do marcador nuclear não ligante, as lâminas foram montadas com fluoromount (Sigma)

e observadas no microscópio de fluorescência Olympus modelo Bx51 acoplado à

câmera Olympus DP71 de 12,5 mega pixels e as fotomicrografias foram obtidas nos

aumentos de 200, 400X e 1000x para análise dos resultados.

44

Os controles negativos das reações de imunomarcação foram submetidos aos

mesmos passos anteriores, apenas suprimindo o anticorpo primário. Além disso,

algumas lâminas decelularizadas foram marcadas apenas com DAPI a fim de

comprovar e remoção das células após o processo de decelularização.

Lâminas controle negativo e experimental (rim decelularizado) das

imunofluorescências foram fotografadas com o mesmo tempo de exposição e com os

mesmos ajustes do programa computacional Olympus DP Controller.

4.4 RECELULARIZAÇÃO DA MATRIZ EXTRACELULAR RENAL (MER)

Após o processo de decelularização com 0,5% SDS, a MER (n=5) foi

mergulhada em solução fungicida – bactericida (25 µg/mL Anfotericina B, 10 mg/mL

Streptomicina e 10.000 U/mL penicilina) para descontaminação e mantida por 7 dias a

4ºC.

Após o protocolo de descontaminação foram feitos secções frontais de 1 mm de

espessura com o auxílio micrótomo de acrílico (Stadie-Riggs Tissue Slicer – Thomas

Scientific).

Para a recelularização foi utilizada uma linhagem de célula renal epitelial suína

(do inglês Lewis-lung cancer porcine kidney-1- LLCPK-1) é uma linhagem celular bem

estabelecida com característica de túbulo proximal. Sob cada secção foram plaqueadas

5 x 105 células/mL. Essas células foram cultivadas sobre a matriz em meio de cultura

Dulbecco modificado Eagle (DMEM, concentração de glicose, 400 mg/dL; GIBCO)

suplementado com 5% de soro fetal bovino (Cultilab) e 100 U/ml de Penicilina e 100

mg/ml de Estreptomicina (GIBCO) e mantidas em incubadora (Sanyo) a 37°C com

atmosfera de 5% CO2. Foram feitas trocas de meio de cultura a cada dois dias até o

término do protocolo nos dias estabelecidos de 7, 14 e 21 dias (Figura 13). A MER

recelularizada foi submetida às mesmas etapas descritas anteriormente de

processamento para microscopia óptica. Além disso, algumas lâminas recelularizadas

foram marcadas apenas com DAPI a fim de avaliar a presença das células após o

45

processo de recelularização.

Figura 13 Esquema representativo do cultivo de células sobre a MER. Abaixo segue resumo das etapas de decelularização e recelularização deste trabalho.

46

Figura 14 Representação esquemática das etapas de decelularização e recelularização deste trabalho. Rins nativos providos de rato foram decelularizados através de métodos químicos com o objetivo de obter um suporte com preservação da integridade estrutural, retenção de proteínas da MEC e GAGs. A linhagem celular LLCPK-1 foi utilizada para os processos de recelularização. Adaptado (DESTEFANI et al., 2017).

4.5 MORFOMETRIA

Para a morfometria foi utilizado o programa de análise de imagens

computadorizadas Image J versão 1.50i pelo qual a área do glomérulo, área do espaço

urinário, área do tufo glomerular e diâmetro do tufo glomerular foram estimados pela

coloração de H&E. A área do espaço urinário foi calculada a partir da diferença entre as

áreas do glomérulo e do tufo glomerular (Figura 15).

47

Figura 15 Esquema representativo da análise da morfologia glomerular. A área delimitada pela linha amarela corresponde à área do glomérulo; a área delimitada pela linha vermelha corresponde à área do tufo glomerular; a área delimitada pelos asteriscos (*) corresponde à área do espaço urinário.

As variáveis histomorfométricas foram obtidas pela mensuração de 30

glomérulos de cada animal (n=5) controle e 30 glomérulos de cada animal (n=5)

decelularizado. Foram mensurados aleatoriamente com objetiva de 40X aqueles com

secção na porção equatorial do glomérulo.

Além disso, as medidas macroscópicas de massa úmida, eixo longitudinal, eixo

antero-posterior e eixo transversal dos rins antes (n=5) e após a decelularização (n=5)

foram adquiridas com auxílio de um paquímetro, e, posteriormente, analisadas.

4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA

As comparações estatísticas das medidas foram analisadas através de teste-t

Student's para valores não pareados e amostras independentes entre os grupos

decelularizado e controle. Os resultados foram expressos através da média ± erro

padrão da média, sendo as diferenças consideradas significativas quando (p<0,05). O

programa utilizado foi o GraphPad Prism versão 5.0 Project para Windows de Software

GraphPad.

48

5 RESULTADOS

5.1 DECELULARIZAÇÃO RENAL

5.1.1 COMPARAÇÃO DE DETERGENTES

A primeira questão abordada no trabalho foi verificar a eficiência de

decelularização do órgão a partir da utilização de três agentes com propriedades

químicas diferentes. O órgão isolado foi perfundido inicialmente com cada um dos

detergentes a 1% (isoladamente) (n=3) (Figuras 16 e 17). Além disso, a partir de outros

autores, resolveu-se também realizar os experimentos utilizando os detergentes a 0,5%

(n=5) (Figuras 16 e 17).

Na Figura 16, foi possível observar que, macroscopicamente, nas imagens B e

F, o SDS promoveu melhor decelularização quando comparado com os outros

detergentes já que após o período de decelularização foi observado órgão

uniformemente translúcido independentemente da sua concentração. Vale destacar que

ao diminuir a concentração do detergente SDS, o tempo de decelularização aumentou.

Nas imagens C e G ao utilizar o detergente Triton x-100 pode ser observado

que não houve decelularização do órgão independentemente da concentração e/ou do

tempo de perfusão. Assim como para as imagens D e H, ao utilizar o detergente Tween

20 não houve decelularização do órgão independentemente da sua concentração e/ou

do tempo de perfusão.

Ao fatiar os órgãos, nas imagens L e M foi possível observar perfusão não

homogênea dos detergentes utilizados.

Para uma análise microscópica, a MER foi processada para microscopia óptica

(Figura 17).

49

Figura 16 Imagens macroscópicas do órgão antes e após o processo de decelularização com detergentes. (A, E, I) Rins controles (B) Rim após 14h de tratamento com 1% SDS (C) Rim após 44h de tratamento com 1% Triton x-100 (D) Rim após 26h de tratamento com 1% Tween 20 (F, J) Rim após 20h de tratamento com 0,5% SDS (G, L) Rim após 30h de tratamento com 0,5% Triton x-100 (H, M) Rim após 30h de tratamento com 0,5% Tween 20. Barra 5 mm.

50

Figura 17 Histologia renal após decelularização com diferentes detergentes. (A-Q) coloração com Hematoxilina & Eosina. (A, E, I, N) Rim controle. (A-D, I-M) Córtex renal. (E-H, N-Q) Medula renal.(B, F) Rim após 14h de tratamento com 1% SDS. (C, G) Rim após 44h de tratamento com 1% Triton x-100 (D, H) Rim após 26h de tratamento com 1% Tween 20 (J, O) Rim após 20h de tratamento com 0,5% SDS (L, P) Rim após 30h de tratamento com 0,5% Triton x-100 (M, Q) Rim após 30h de tratamento com 0,5% Tween 20. Setas indicam o tufo glomerular. Quadrados exemplificam túbulos renais. Barra 100 µm.

51

Os dados apresentados nas Figuras 16, 17 e 18 mostram que é possível

decelularizar o rim utilizando o protocolo descrito e manter o arcabouço de matriz

extracelular renal.

Na Figura 17, ao analisar as imagens B, F, J e O foi possível observar que pela

coloração de H&E demonstrou-se que o sistema citoplasmático e

materiais nucleares do córtex e da medula foram removidos com a utilização do

detergente SDS independentemente da sua concentração. E, aparentemente, esses

dados indicam que a concentração dessa solução decelularizante não interfere na

estrutura do órgão apesar de alterar o tempo do tratamento.

Contrariamente, ao analisar as imagens C, G, L, P da Figura 17 foi possível

observar que não houve completa decelularização com a utilização do detergente Triton

x-100 independentemente da sua concentração. Podendo ser demonstrada pela

observação de núcleos (pontos roxos) e restos celulares tanto em córtex quanto em

medula. O mesmo pode-se observar nas imagens D, H, M e Q da figura 17

representativas de córtex e medula que foram decelularizadas com Tween 20 em

ambas as concentrações de estudo.

Além dessa análise histológica, foi realizada marcação dos tecidos com DAPI a

fim de verificar a ausência de resíduos nucleares após os tratamentos em ambas as

concentrações de SDS (Figura 18).

52

Figura 18 Marcação nuclear com DAPI após decelularização com SDS. (A, B, E F) Rim controle. (C, D, G, H) Rim decelularizado. (A, C, E, G) Córtex renal. (B, D, F, H) Medula renal. (C, D) Rim após 14h de tratamento com 1% SDS. (G, H) Rim após 20h de tratamento com 0,5% SDS. Barra 100 µm.

Os resultados na Figura 18 demonstraram qualitativamente que, comparando

as imagens decelularizadas de córtex (C e D) e medula (G e H) com as imagens do

controle de córtex (A e E) e medula (B e F), as regiões do rim decelularizado não

53

apresentam resíduos nucleares visíveis. Evidenciando, mais uma vez, que

independentemente da concentração da solução decelularizante o tratamento com SDS

foi eficiente para o método de decelularização.

5.1.2 COMPARAÇÃO DE CONCENTRAÇÕES DE SDS

Neste trabalho, partindo do princípio que o SDS evidenciou ser o melhor agente

decelularizante optou-se em realizar algumas colorações histológicas com o objetivo de

comparação qualitativa entre as duas concentrações utilizadas no tratamento (Fig).

Nas Figuras 19 e 20 foram utilizados 1% SDS para a decelularização. Para a

coloração de HE, comparando as imagens de controle de córtex (A) e medula (B) com

as imagens decelularizadas também de córtex (C) e medula (D), foi possível observar

que não havia resíduos celulares e/ou citoplasmáticos no tecido decelularizado. E o

mesmo foi observado nas imagens C e D das Figuras 20 e 21 em que foi utilizado 0,5%

SDS para os processos de decelularização. Esses resultados microscópicos

corroboram com as observações macroscópicas do órgão perfundido com o SDS e

indicam, conforme já descrito, que a decelularização com SDS é mais eficiente

independentemente da sua concentração.

E considerando que a distribuição de componentes também desempenha um

papel importante na localização e na diferenciação das células, foram realizadas

colorações com Picrosirius, PAS e Orceína.

Nas Figuras 19 e 20, para a coloração de PCR, comparando as imagens de

controle de córtex (E) e medula (F) com as imagens decelularizadas também de córtex

(G) e medula (H), as mesmas mostraram preservação parcial da proteína colágeno

através da coloração avermelhada após o método de decelularização. O mesmo pode

ser observado nas imagens G e H das Figuras 21 e 22.

Para a coloração de PAS, também nas Figuras 20 e 21, comparando as

imagens de controle de córtex (I) e medula (J) com as imagens decelularizadas também

de córtex (L) e medula (M), as mesmas mostraram preservação parcial de carboidratos

no geral. Foi possível observar a retenção da membrana basal corada em púrpura

54

através dessa coloração. O mesmo pode ser observado nas imagens L e M das Figura

21 e Figura 22.

Além dessas, também foi realizada a coloração com orceína. Onde nas Figura

19 e Figura 20, comparando as imagens de controle de córtex (N) e medula (M) com as

imagens decelularizadas também de córtex (P) e medula (Q), as mesmas mostraram

preservação parcial com a coloração marrom da proteína elastina após o método de

decelularização.

55

Figura 19 Histologia renal após decelularização com 1% SDS. (A-D) Coloração com Hematoxilina & Eosina. (E-H) Coloração com Picrosirius (PCR). (I-M) Coloração com Ácido periódico de Schiff (PAS). (N-Q) Coloração com Orceína.(A, E, I, N) Córtex rim controle. (B, F, J, O) Medula rim controle. (C, G, L, P) Córtex rim decelularizado. (D, H, M, Q) Medula rim decelularizado. Barra 100 µm. Aumento de 200x

56

Figura 20 Histologia renal após decelularização com 1,0% SDS. (A-D) Coloração com Hematoxilina & Eosina. (E-H) Coloração com Picrosirius (PCR). (I-M) Coloração com Ácido periódico de Schiff (PAS). (N-Q) Coloração com Orceína.(A, E, I, N) Córtex rim controle. (B, F, J, O) Medula rim controle. (C, G, L, P) Córtex rim decelularizado. (D, H, M, Q) Medula rim decelularizado. Barra 100 µm. Aumento de 400x

57


58


59

5.2 MORFOMETRIA

A segunda questão abordada por este trabalho foi verificar o tempo de

decelularização, os parâmetros morfométricos macroscópicos do órgão e os parâmetros

morfométricos microscópicos dos glomérulos.

Como, aparentemente, não foram observadas diferenças nos tratamentos

utilizando 1 ou 0,5% SDS, todos os resultados seguintes foram obtidos utilizando a

solução menos concentrada.

5.2.1 MORFOMETRIA MACROSCÓPICA

O dado apresentado na Figura 23 mostra que o tempo médio de

decelularização do rim (n=5) foi de 25,4 ± 2,462 h.

Figura 23 Representação gráfica da média do tempo (h) de decelularização do rim após tratamento com 0,5% SDS.

Os dados apresentados na Figura 24 mostram que não houve diferença

significativa na média da massa úmida do rim entre os grupos CTRL (1,021 ± 0,051 g) e

DECEL (0,995 ± 0,063 g).

60

Figura 24 Representação gráfica da média da massa úmida renal após tratamento com 0,5% SDS. CTRL (n=5), DECEL (n=5). CTRL= controle, DECEL= decelularizado. No gráfico, a ausência de asteriscos indica que os valores não diferem significativamente entre si.

Os dados apresentados na Figura 25, mostram que não houve diferença

significativa na média do eixo longitudinal do rim entre os grupos CTRL (17,59 ± 0,50

mm) e DECEL (18,70 ± 0,84 mm).

Figura 25 Representação gráfica do eixo longitudinal renal após tratamento com 0,5% SDS. CTRL (n=5), DECEL (n=5). CTRL= controle, DECEL= decelularizado. No gráfico, a ausência de asteriscos indica que os valores não diferem significativamente entre si.

61

Os dados apresentados na Figura 26, mostram que não houve diferença

significativa na média do eixo antero-posterior do rim entre os grupos CTRL (8,370 ±

0,150 mm) e DECEL (9,020 ± 0,225 mm).

Figura 26 Representação gráfica da média do eixo antero-posterior renal após tratamento com 0,5% SDS. CTRL (n=5), DECEL (n=5). CTRL= controle, DECEL= decelularizado. No gráfico, a ausência de asteriscos indica que os valores não diferem significativamente entre si.

Já os dados apresentados na Figura 27 mostram que houve diferença

significativa no eixo tranversal renal entre os grupos CTRL (11,45 ± 0,22 mm) e DECEL

(10,86 ± 0,19 mm) e p=0,006.

62

Figura 27 Representação gráfica do eixo transversal renal após tratamento com 0,5% SDS. CTRL (n=5), DECEL (n=5). CTRL= controle, DECEL= decelularizado. No gráfico, a presença de asterisco indica que os valores diferem significativamente entre si.

5.2.2 MORFOMETRIA GLOMERULAR

Para a análise da morfologia glomerular dos animais dos grupos experimentais

foi realizada a coloração de Hematoxilina & Eosina em cortes histológicos.

Foram avaliadas, individualmente, a área do glomérulo, a área do tufo

glomerular, a área do espaço urinário e o diâmetro do tufo glomerular, descritos

anteriormente em material e métodos.

Os dados apresentados na Figura 28 mostram que houve diferença

significativa na média da área do glomérulo entre os grupos CTRL (9,3x103 ± 2,2 x103

µm2) e DECEL (3,3x103 ± 8,5 x102 µm2).

63

Figura 28 Representação gráfica da média da área do glomérulo após tratamento com 0,5% SDS. CTRL (n=5), DECEL (n=5). CTRL= controle, DECEL= decelularizado. No gráfico, a presença de asterisco indica que os valores diferem significativamente entre si.

Além disso, os dados na Figura 29 também mostram que houve diferença

significativa na média da área do tufo glomerular entre os grupos CTRL (7,7x103 ± 2,2

x103 µm2) e DECEL (2,1x103 ± 3,7 x102 µm2).

Figura 29 Representação gráfica da média da área do tufo glomerular após tratamento com 0,5% SDS. CTRL (n=5), DECEL (n=5). CTRL= controle, DECEL= decelularizado. No gráfico, a presença de asterisco indica que os valores diferem significativamente entre si.

Já os dados apresentados na Figura 30 mostram que não houve diferença

significativa na média da área do espaço urinário entre os grupos CTRL (1,6x103 ± 4,6

x102 µm2) e DECEL (1,2x103 ± 5,0 x102 µm2).

64

Figura 30 Representação gráfica da média da área do espaço urinário após tratamento com 0,5% SDS. CTRL (n=5), DECEL (n=5). CTRL= controle, DECEL= decelularizado. No gráfico, a ausência de asterisco indica que os valores não diferem significativamente entre si.

O processo de decelularização promoveu a diminuição da área do glomérulo e

do tufo glomerular dos rins decelularizados, mas não alterou a área do espaço urinário.

5.3 ANÁLISE DOS GAGS

A terceira questão do trabalho foi realizar a extração e quantificação dos GAGs

entre os grupos experimentais.

5.3.1 COMPARAÇÃO DOS GAGS

Como primeira abordagem com relação aos GAGs, buscou-se verificar quais os

tipos de GAGs presentes no rim antes e após o tratamento com SDS. Para isso, os

polissacarídeos sulfatados foram extraídos após digestão proteolítica consecutiva

utilizando-se a enzima papaína, e, posteriormente precipitados com CPC e submetidos

à eletrofeorese em gel de agarose (Figura 31).

65

Figura 31 Eletroforese em gel de agarose dos GAGs de rins controle e decelularizado. (A) Rim controle (n=6) 7,8 µg de GAG total submetido ou não à digestão com DNase; Rim decel (n=6) 7,8 µg de GAG total não submetido à digestão com DNase. (B) Rim decel (n=6) 7,8 µg de GAG total submetido à digestão com DNase; padrão de CS e Hep CS=Condroitim sulfato, Hep= Heparina, origem= ponto de aplicação da amostra e início da corrida. CTRL=controle, decel =decelularizado

As amostras foram identificadas pela coloração com azul de toluidina e baseado

com estudos anteriores de caracterização dos GAGs de rim de ratos. Vale destacar que

essa coloração em tom de azul reflete a presença de DNA para as amostras de rim ctrl

e decel ambas S/ DNase, e que a metacromasia reflete a presença de GAGs.

Na Figura 32, foi possível observar que o protocolo de extração dos GAGs foi

bem sucedido conseguindo isolar os GAGs presentes nos rins CTRL, mas o mesmo

não foi possível afirmar para os rins DECEL. Na Figura 32 (A), a observação dos GAGs

do material controle só foi possível após a utilização de 0,018 U de enzima específica

para a degradação de DNA. Sendo assim, a análise por eletroforese em gel de agarose

revelou a presença de duas bandas metacromáticas que migram como Hep e outra que

migra como CS. Além disso, foi possível observar que a amostra de rim decelularizado

ainda continha DNA. Na Figura 32 (B) após tratamento enzimático com 0,032 U de

DNase, a mesma utilizada para o material ctrl, observou-se degradação do DNA.

66

Quanto aos GAGs do rim decelularizado, foi observada a presença de uma única banda

que comigra com CS padrão. Além disso, a banda apresentou coloração em tom de

azul perdendo a característica metacromática.

5.3.2 QUANTIFICAÇÃO DOS GAGS

Como segunda abordagem em relação aos GAGs, buscou-se verificar a preservação do

quantitativo de GAG através da dosagem de ácido urônico em rim controle (n=6) e rim

decelularizado (n=6) (Tabela 7).

Tabela 7 Dosagem de ácido urônico antes e após o processo de decelularização.

Tecido Gag µg/mg tecido seco

Gag %/rim

CTRL 0,406 0,0068 DECEL 0,057 0,00095

Pela metodologia de extração empregada, houve redução de 94% na massa do

pó cetônico do DECEL (67,5 mg) em comparação a massa do CTRL (1.067,5 mg)

indicando rendimento 15X menor no rim DECEL do que no CTRL. Além disso, através

da dosagem de ácido urônico pelo método de carbazol, houve redução em 86% na

massa total de gag do DECEL (57,27 µg) quando comparado à massa do CTRL

(406,07 µg).

Ao observar os valores na Tabela 7, a relação da massa de gag (µg) / massa

de tecido seco (=pó cetônico) (mg) do DECEL (0,057) é menor que a do CTRL (0,406).

O mesmo pode-se dizer para os valores observados para o rendimento em que foi

detectada a presença de 0,00095% de gag por rim DECEL e de 0,0068% de GAG por

rim controle estudado.

67

5.4 RECELULARIZAÇÃO

A quarta questão do trabalho foi realizar o cultivo das células renais epiteliais

suína (LLCPK-1) sobre cortes frontais de 1 mm da MER por 7, 14 e 21 dias e observar

o padrão de crescimento dessas células após tratamento com 0,5% SDS.

Na Figura 32 Histologia de córtex renal após recelularização com células

LLCPK-1 e decelularização com 0,5% SDS. e Figura 33, pela coloração H&E, foi

possível observar à adesão celular na MER na periferia para as imagens de córtex e

interior para as imagens de medula para todos os períodos de cultivo celular.

A avaliação das seções histológicas na Figura 32 demonstrou que as células

presentes em amostras tratadas com SDS foram geralmente localizadas

ao longo da periferia do tecido. Esta observação pode sugerir que as células em tecido

tratado com SDS não estavam interagindo com a matriz da mesma maneira observada

em tecido normal. Mas foi possível observar que as células LLCPK-1 conseguiram

aderir ao tecido.

Ao observar as imagens na Figura 33, foi possível notar a presença de células

no interior do tecido medular nos três períodos de recelularização, o que pode indicar

uma maior afinidade dessas células por essas regiões tubulares.

Nas Figuras 34 e 35, pela marcação das células com DAPI, foi também possível

observar à adesão celular na periferia e interior da MER para todos os períodos de

cultivo celular. A partir de uma observação qualitativa, foi possível notar que,

aparentemente, as células LLCPK-1 estavam migrando para o interior do tecido com o

passar dos dias de cultivo.

68

Figura 32 Histologia de córtex renal após recelularização com células LLCPK-1 e decelularização com 0,5% SDS. (A-I) Coloração com Hematoxilina & Eosina (H&E). (A, D, G) Após 7 dias de cultivo com as células. (B, E, H) Após 14 dias de cultivo com as células. (C, F, I) Após 21 dias de cultivo com as células. (A-F) Barra 100 µm. (G-I) Barra 50 µm

69

Figura 33 Histologia de medula renal após recelularização com células LLCPK-1 e decelularização com 0,5% SDS. (A-I) Coloração com Hematoxilina & Eosina. (A, D, G) Após 7 dias de cultivo com as células. (B, E, H) Após 14 dias de cultivo com as células. (C, F, I) Após 21 dias de cultivo com as células. (A-F) Barra 100 µm. (G-I) Barra 50 µm.

70

Figura 34 Marcação nuclear com DAPI de córtex renal após recelularização com células LLCPK-1 e decelularização com 0,5% SDS. (A, D, G) Após 7 dias de cultivo com as células. (B, E, H) Após 14 dias de cultivo com as células. (C, F, I) Após 21 dias de cultivo com as células. (A-F) Barra 100 µm. (G-I) Barra 50 µm.

71

Figura 35 Marcação nuclear com DAPI de medula renal após recelularização com células LLCPK-1 e decelularização com 0,5% SDS. (A, D, G) Após 7 dias de cultivo com as células. (B, E, H) Após 14 dias de cultivo com as células. (C, F, I) Após 21 dias de cultivo com as células. (A-F) Barra 100 µm. (G-I) Barra 50 µm.

72

5.5 IMUNOFLUORESCÊNCIA

A quinta questão do nosso trabalho foi realizar ensaios para localizar o HS na

MER após tratamento com 0,5% SDS.

5.6 LOCALIZAÇÃO DE HEPARAM SULFATO (HS)

Como já comentado anteriormente, o HS já foi descrito como sendo o GAG de

maior importância e quantidade encontrado no rim. Sendo assim, resolveu-se analisar a

localização do mesmo na MER (Figuras 36 e 37).

Na Figura 36, na imagem B de região de córtex controle foi possível observar

fraca marcação de HS no tecido. As marcações nucleares em azul devem-se ao DAPI.

Na imagem D de tecido decelularizado não foi observado marcação com DAPI. O que

era de se esperar já que não havia a presença de células. Na imagem E, não foi

observada marcação de HS.

73

Figura 36 Imunofluorescência de córtex renal para Heparam Sulfato (HS) após decelularização com 0,5% SDS. (A-C) Rim controle. (D-F) Rim decelularizado. (A, D) Marcação com DAPI. (B, E) Marcação com HS. (C, F) Sobreposição de imagens. Barra 100 µm.

Na Figura 37, na imagem E foi possível observar intensa marcação de HS na

medula decelularizada. No rim controle (B) não visualizou-se marcação de HS.

Acredita-se que, no caso do controle, a presença das células e de outras estruturas

pode ter inviabilizado a ligação do anticorpo nos sítios específicos de ligação e,

portanto, não se conseguiu observar marcação.

74

Figura 37 Imunofluorescência de medula renal para Heparam Sulfato (HS) após decelularização com 0,5% SDS. (A-C) Rim controle. (D-F) Rim decelularizado. (A, D) Marcação com DAPI. (B, E) Marcação com HS. (C, F) Sobreposição de imagens. Barra 100 µm.

Pelos resultados, foi possível observar intensa marcação de HS na medula

decelularizada. No rim controle não se visualizou marcação. No caso do controle, a

presença das células e de outras estruturas podem ter inviabilizado a ligação do

anticorpo nos sítios específicos de ligação e, portanto, não foi possível observar

marcação.

Até o momento, não foram encontrados trabalhos na literatura que tenham

realizado esse tipo de marcação nos tecidos decelularizados.

75

5.7 DISCUSSÃO

Neste trabalho foi possível observar que o detergente SDS foi o melhor agente

decelularizante, aparentemente, houve parcial preservação de proteínas e carboidratos

no tecido renal, apesar de alguns parâmetros morfométricos foram alterados, GAGs

foram extraídos e quantificados do tecido renal e as células LLCPK-1 aderiram ao

tecido decelularizado. Esses pontos foram abaixo discutidos.

Quanto ao método de decelularização utilizado neste trabalho, conforme Caralt

et al., o órgão isolado foi perfundido inicialmente com cada um dos detergentes a 1%

(isoladamente). Alguns outros autores também utilizaram essas concentrações.

Posteriormente, conforme Burgkat et al. , e Guan et al., a fim de tentar otimizar o

processo de decelularização e comparar a eficiência de decelularização com a variação

de concentração da solução, resolveu-se também realizar os experimentos utilizando os detergentes a 0,5%. Segundo Caralt et al., em seu trabalho foram testadas estratégias

de decelularização baseadas em 1% Triton x-100 isolado ou em combinação com 0,1%

SDS ou 0,02% Tripsina-EGTA. Estes mostraram que a estratégia de decelularização

afeta muito o grau de remoção das células, a presença de DNA residual e preservação dos fatores de crescimento. Nesse estudo de Caralt et al., a utilização isolada de 1%

Triton x-100 foi ineficiente para remover as células, assim como no presente trabalho, já

que resíduos celulares foram encontrados dentro de glomérulos e túbulos. Porém,

segundo Caralt et al., a utilização de Triton x-100 combinado com SDS ou Tripsina-

EGTA demonstrou menor quantidade de DNA residual com remoção de

aproximadamente 95% do DNA. Em conjunto, esse grupo identificou uma estratégia de

decelularização otimizada usando Triton x-100 / SDS como uma estratégia efetiva e

eficiente em termos de tempo para desenvolver suportes de MER. Corroborando com o presente trabalho, Nakayama et al., e Orlando et al. também relataram decelularização

incompleta de rins suínos usando Triton x-100 isolado.

Sullivan et al. também decelularizaram rins suínos inteiros com 0,5% SDS,

0,25% SDS e 1% Triton X-100 e sugeriram 0,5% SDS como solução ideal para manter

76

a MER intacta e remover materiais celulares. Wang et al. também relataram 1%

SDS como o método mais eficiente para criar uma MER acelular intacta em

comparação com 1% Triton X-100, 1% ácido peracético e 1% desoxicolato de sódio. Já

Bonandrini et al., perfundiram rins de rato utilizando apenas solução a 1% SDS por 17h.

Verificaram que as células foram completamente removidas, originando um suporte

acelular que mantinha sua estrutura 3D complexa. E como já descrito na literatura, o

SDS é um detergente aniônico que permite rápida depuração de resíduos nucleares e

citoplasmáticos (WOODS e GRATZER, 2005; GILBERT et al., 2006). Esse estudo

indica que a decelularização completa de rins de ratos pode ser alcançada com

segurança usando SDS isolado conforme confirmaram pelo método histológico e

imunofluorescência que mostraram remoção completa de células sem perda de

proteínas estruturais. Neste presente trabalho, também foi observado que o SDS foi o

agente mais eficiente para o processo de decelularização já que não foi verificado

resíduos nucleares após coloração histológica com H&E e marcação de DNA, e que

entre as concentrações de 0,5% e 1% SDS não foram observadas diferenças

qualitativas na morfologia do tecido renal. Guan et al., também utilizaram 0,5% SDS e

conseguiram produzir, com sucesso, suporte de MER de ratos mostrando preservação

da arquitetura tridimensional, árvore vascular intacta, preservação bioquímica e de

alguns tipos de citocinas como HGF (Fator de Crescimento de Hepatócitos), TGF-β

(Fator de Transformação do Crescimento Beta) e VEGF (Fator de Crescimento Endotelial Vascular). No entanto, segundo Samouillan et al., em altas concentrações e

longos períodos de incubação, o SDS também pode levar à destruição da MER sendo

potencialmente prejudicial para os elementos microestruturais do tecido renal e pode

influenciar negativamente fatores de crescimento e sinalização endógena.

Além disso, após levantamento bibliográfico, apenas O´Neil et al. utilizaram 3%

Tween 20 combinado a 0,02% Tripsina e 4% NaDOC em seu protocolo de

decelularização que não foi eficiente. Ao contrário deles, no presente estudo resolveu-

se testar 1% Tween 20 isolado e também não foi observado eficiência de

decelularização.

77

No presente estudo foi possível observar que o SDS foi o agente

decelularizante mais eficiente em comparação com o Triton x-100 e Tween 20. Apesar

de a dosagem de DNA não ter sido realizada após os processos de decelularização, foi

realizado o experimento de eletroforese em gel de agarose em que o conteúdo total de

GAG de rim decelularizado foi submetido à digestão enzimática com DNase. Com isso,

foi comprovado que o método de decelularização utilizado não foi completamente eficiente para a total remoção dos resíduos celulares. Nos estudos de Nagata et al. e

Zhang et al., foi comprovado que as técnicas de decelularização desenvolvidas até o

presente momento não conseguiram remover 100% dos componentes celulares nativos

sem danificar a estrutura e composição da MER e que o conteúdo residual de DNA pode causar problemas de citocompatibilidade in vitro e eventos adversos em

hospedeiros durante a reintrodução de células in vivo.

No presente trabalho, partindo do princípio que o SDS evidenciou ser o melhor

agente decelularizante optou-se em realizar algumas colorações histológicas com o

objetivo de comparação qualitativa entre as duas concentrações utilizadas no

tratamento. Assim como Guan et al., as colorações aqui realizadas mostraram

preservação parcial de carboidratos no geral. E foi possível observar a retenção da

membrana basal e preservação parcial de elastina e do colágeno após o método de

decelularização.

Já o tempo médio de decelularização conforme mostrado na Figura 23 parece

ter sido relativamente, um pouco mais eficiente com relação ao tempo de

decelularização apresentado por Guan et al . Estes autores utilizaram 0,5% SDS a um

fluxo de perfusão de, aproximadamente, 2 mL/min via artéria renal e ureter e

conseguiram decelularizar rins de ratos Wistar machos em 24-48 horas. Porém, o

tratamento descrito neste trabalho utilizou um fluxo menor (1 mL/min) de SDS nos rins

de ratos Wistar fêmeas canulados via veia renal perfazendo uma média de tempo de

25-28h de decelularização indicando maior eficiência pela utilização do método de

decelularização adotado neste trabalho.

Para os dados de morfometria macroscópica apresentados na Figura 27 foi

78

possível observar que houve diferença significativa apenas no eixo transversal renal em

relação aos animais do grupo controle. Esses resultados demonstram que o método de

decelularização com 0,5% SDS não altera os parâmetros macroscópicos do órgão,

exceto com relação a esse eixo que apresenta uma diferença quando comparado com

o controle e não foram comparados a outros trabalhos por não terem sido descritos, até

o momento, na literatura. Além disso, a partir da morfometria microscópica, foi possível

constatar que o processo de decelularização promoveu a diminuição da área do

glomérulo e do tufo glomerular dos rins decelularizados, mas não alterou a área do

espaço urinário. E isto sugere que a matriz extracelular foi pouco danificada.

Como outra estratégia de análise tecidual, observando a corrida eletroforética

dos GAGs isolados de rins controles na Figura 31 (A), os dados desse trabalho estão

em concordância com os dados de Kanwar e Farquhar que isolaram em 1979, pela

primeira vez, HS de MBG. No presente trabalho, também foi observado à presença de

duas bandas que migraram como Hep e CS quando comparado com o padrão utilizado

no experimento o que corrobora com os dados apresentados pelos autores

referenciados aqui como Pecly et al.. Vale ressaltar que a quantidade de DNase

utilizada para este ensaio foi, aproximadamente, 44% maior que a quantidade utilizada

para o material ctrl. Mas, mesmo assim, não se observou a completa degradação do

que poderia ser DNA. E isso levou-se a sugerir que, baseado no trabalho descrito por

Lison (1936) sobre o fenômeno químico da metacromasia que ocorre quando o corante

azul de toluidina interage com uma grande quantidade de ésteres de sulfato e estes são

os responsáveis pela coloração roxa ou púrpura observada, foi possível sugerir que o

material de rim decel apresentou GAGs dessulfatados total ou parcial. Além disso, foi

observado a presença de uma única banda eletroforética que migra como CS

comparado ao controle com a presença de duas bandas. Levando-se em consideração

que, segundo Tkachenko et al., o HS pode estar ligado a diferentes estruturas proteicas

e encontrar-se na superfície celular e matriz extracelular, os resultados do presente

trabalho podem sugerir que o processo de decelularização além de retirar grande parte

dos GAGs da matriz ele também promoveu a quebra da estrutura dos GAGs restantes,

fragmentando-os e, assim, não foi possível observar duas bandas no gel de agarose

79

analisado.

Atualmente, os trabalhos disponíveis na literatura como dos grupos Wang Y et

al. e Peloso A et al. apenas quantificaram, de forma generalizada a partir de kit de

dosagem de grupos sulfatos, os GAGs antes e após os processos de decelularização.

Já no presente trabalho, teve-se o interesse de analisar os principais GAGs a fim de

compará-los antes e após os tratamentos com SDS. O que foi possível perceber que há

uma significativa redução qualitativa de coloração e quantidade de bandas

correspondente ao material decelularizado quando aplicada a mesma massa de GAGs

total no gel quando comparado com o material controle.

Além da análise qualitativa foi realizada a quantificação dos GAGs antes e após a decelularização e conforme Poornejad et al., os dados de dosagem de ácido urônico

foram normalizados para o peso seco dos rins CTRL. E corroborando com os resultados descritos na tabela 7, Poornejad et al. também decelularizaram rins suínos

com 0,5% SDS e detectaram preservação de apenas 30,5% do conteúdo de GAGs

após o processo de decelularização. Assim como este trabalho que detectou

preservação de apenas 14%. Além desses autores, Wang et al. demonstraram que

houve redução de mais de 60% do conteúdo de GAG após decelularização com SDS-

Triton x-100 em modelo experimental de rins suínos. Segundo Gilbert et al., a

quantidade de GAGs presentes em um tecido após a decelularização depende muito

do método de decelularização. Por exemplo, detergentes iônicos são frequentemente

utilizados no processo de decelularização e podem remover GAGs da MEC. Segundo

estes mesmos autores, apesar do SDS ser eficaz para remoção de componentes

celulares de tecido ele tende a interromper a estrutura nativa do tecido, e causa uma

diminuição na concentração do GAG e perda de integridade do colágeno. Em estudos de Lovekamp et al. foi demonstrado que a remoção de GAGs da MER pode ter um

efeito negativo no comportamento viscoelástico dessa matriz, o que não é

surpreendente, uma vez que a retenção de água é uma das principais características

funcionais dos GAGs dentro de um tecido.

Nas Figuras 33 e 34, ao realizar o processo de recelularização com as células

80

LLCPK-1 sob cortes frontais de MER , foi possível observar que estas células foram

capazes de aderir a matriz, porém não houve efetiva recelularização tecidual. Segundo Poornejad et al., cultura de células em MER, formam uma monocamada no plástico e

não se espalham para a MER. As células iniciam apoptose programada em 3-5 dias após atingir confluência. Foi sugerido por Rieder et al. e Cartmell e Dunn que a

presença de SDS residual pode ser responsável pelo desencorajamento do crescimento celular. Segundo Brown et al., estudos de crescimento celular em tecidos

de bexiga decelularizados mostraram células empilhadas na superfície do tecido ao

invés de infiltrá-los, e também no tendão patelar decelularizado por Cartmel e Dunn.

Esses achados corroboram com o presente trabalho com relação à relutância de células

para migrar pelo tecido tratado com SDS. O protocolo de decelularização neste estudo

também pode ter desempenhado um papel nas alterações observadas nas

propriedades da MER. Contudo, também foi demonstrado que menores concentrações

de SDS têm um efeito negativo sobre o repovoamento celular. No estudo de Rieder et

al., válvulas cardíacas suínas decelularizadas com 0,1% (p / v) de SDS teve uma

influência tóxica nas células do endotélio e miofibroblastos após a semeadura de

superfície. Embora os autores especularam que o SDS residual foi a fonte de toxicidade

neste estudo, a possibilidade de que mesmo baixas concentrações de SDS possam ter

efeitos deletérios sobre as propriedades dos tecidos e as interações célula-matriz

também deve ser considerado. Assim, o presente trabalho sugere fortemente que as

alterações na bioquímica ou estrutura da matriz como resultado da decelularização

usando SDS são responsáveis pelo baixo repovoamento celular. Além disso, a provável

quebra da estrutura dos GAGs (como sugerido a partir da eletroforese), principalmente

HS, e/ou remoção quase total desses possa ter influenciado diretamente na baixa

eficiência do processo de recelularização. Além disso, há a possibilidade de que o meio

de descontaminação em que as fatias decelularizadas foram mergulhadas possa ter, de

alguma forma, influenciado na baixa aderência celular a matriz. Pelos atuais relatos na

literatura, para a MER, não existe publicação sobre o impacto do tempo de exposição

ao detergente sobre propriedades in vivo de células cultivadas, que é o fator prominente

a considerar para avaliação de características da MER.

81

Recentemente, Poornejad et al. também realizaram recelularização em secções

de rins suínos a partir de células de epitélio tubular cortical renal humano por 4 dias de

cultivo após a decelularização com diferentes agentes decelularizantes (NaOH, PAA,

SDS, Triton x-100, Tripsina/EDTA). Após avaliações de propriedades físico-químicas,

relataram que a MER mostrou potencial de suporte à adesão significativamente maior

para produzir crescimento de células saudáveis quando foi tratada com 0,1N NaOH e

1% PAA. Acredita-se que semear as células através da perfusão de órgão inteiro

conforme Boandrini et al., será uma grande vantagem às estratégias alternativas de

protocolo. Se as células são apenas semeadas na superfície do tecido decelularizado,

elas precisam migrar de lá para colonizar a matriz e isso pode dificultar o processo de

recelularização.

82

5.8 CONCLUSÃO

O significado desse trabalho reside no potencial desenvolvimento futuro de

biomateriais ou aplicações em reparo e regeneração de rim usando biomateriais MER

específicos para direcionar a diferenciação de células reparadoras para abordar

patologias renais como diabetes ou insuficiência renal.

Manter a arquitetura e a composição da MER é o maior desafio para o processo

de decelularização. Outros agentes decelularizantes relevantes para o tipo de tecido em

questão e suas combinações, processos adicionais de congelamento e

descongelamento, aumento do fluxo com pressão constante, aplicações de choque

osmótico, uso de agentes adicionais e métodos de esterilização pós-processamento

podem afetar inevitavelmente a qualidade do suporte de MER em maior ou menor grau.

Embora os rins decelularizados usando SDS tenham tido as células

adequadamente removidas e componentes proteicos da MER tenham, aparentemente,

sido parcialmente preservados, os seus conteúdos de GAGs foram reduzidos. Portanto,

encontrar um equilíbrio entre remoção de células, preservação da MER e de GAGs é

vital para obtenção de protocolo ideal de decelularização. É importante notar que o

procedimento ideal pode ser diferente para cada órgão devido à sua anatomia única.

Mediante ao exposto, pode-se sugerir que o método de decelularização com

0,5% SDS utilizado neste trabalho foi ineficiente na preservação dos GAGs.

Os resultados do presente trabalho demonstram a importância do tema

proposto e conclui que:

• Estabeleceu-se protocolo de decelularização eficiente para obtenção da MER;

• Quantificou-se os GAGs na MER;

• Localizou-se o GAG Heparam Sulfato na MER;

• Viabilizou-se a matriz extracelular renal para o processo de recelularização;

• Avaliou-se o processo de recelularização com células renais em cortes

transversais da MER;

83

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