parvovírus

Mestrado em Engenharia Biomédica: Especialização em EBTOVirologia e Terapia Génica

2º ANO (1º Semestre )

Kevin Sales & Sónia VazAno lectivo 2012-2013

Parvovírus: terapia génica

Parvovírus

Vírus mais pequenos ( = 18-26 nm)

Parvoviridae

Parvovirinae(vertebrados)

Dependovirus

Parvovírus autónomos

Densovirinae(invertebrados)

Dependovirus

Nem todos requerem a ajuda do adenovírus (exemplo:

herpesvírus, alguns retrovírus);

Alguns podem replicar na ausência do vírus ajudante;

Usados como vectores de genes: Produção em massa de determinadas proteínas;

Tratamento de várias doenças genéticas.

Não está associado a qualquer doença;

Parvovirus autónomo

Não necessita de vírus ajudante;

Vírus B19: Foi descoberto no soro de um dador de sangue saudável;

Infecta os precusores dos glóbulos vermelhos;

Infecção assintomática;

Doenças associadas: - artrite aguda;

- anemia aplástica;

- quinta doença.

Fonte:Carter, J. and Sauders, V. (2007). Virology: principles and applications. England: John Wiley & Sons, Ltd

PARVOVÍRUS: Virião

Simetria icosaédrica;

Formada a partir de 60 moléculas proteicas;

Uma espécie de proteína forma a maioria da estrutura da

cápside;

Aproximadamente esférica;

Cada vértice apresenta uma saliência com um poro no centro;

CÁPSIDE

ssDNA linear (4-6 kb);

Existência de pequenas sequências complementares no final da

molécula de DNA (dsDNA -> Base Pairing);

GENOMA

Fonte: Carter, J. and Sauders, V. (2007). Virology: principles and applications. England: John Wiley & Sons, Ltd

PARVOVÍRUS: Replicação

Depende de proteínas da célula hospedeira;

Apenas disponíveis durante a fase S do ciclo celular (síntese de

DNA);

Ocorre apenas durante a fase S (ao contrário de outros vírus de

DNA).


LIGAÇÃO E ENTRADA:



Conversão ssDNA para dsDNA e Replicação DNA:

Conversão mediada por DNA polimerase celular;

Extremidade 3’-terminal actua como primer (local onde a enzima

polimerase se liga);

Ocorre por replicação rolling-hairpin;



TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO:


PARVOVÍRUS: Ciclo de Replicação


AAV: Caracterização

Adaptado de: Buning H., Perabo L., Coutelle O., Quadt-Humme S. & Hallek M. (2008). Recent developments in adeno-associated virus vector technology. The journal of gene medicine 10: 717-733.

≈ 5kb Primer da replicação Integração do genoma viral e

sua desintegração

Proteínas funcionais

Proteínas estruturais (VP1,

VP2, VP3)

14 serotipos → pequenas diferenças na sequência das proteínas da cápside

Especificidade para diferentes tecidos

AAV: Infecção

Etapas da infecção

Ligação ao receptor celular

Entrada na célula

Transporte endossomal

Libertação do endossoma

Desencapsulação e entrada no núcleo

1

2

3

4

5

AAV-2

1

2

3

4

Adaptado de: Ortolano S., Spuch C. & Navarro C. (2012). Present and future of adeno associated vírus based gene therapy approaches. Recent patents on endocrine, metabolic & immune drug discovery 6: 47-66.

5

E o que acontece depois de entrar no núcleo?

AAV: Ciclo Lítico vs Latência

Vírus auxiliar

Ciclo lítico

PRESENTE

Replicação do genoma do AAV

Expressão de genes

Produção de viriões

Ciclo latência

AUSENTE

Expressão das proteínas Rep

Ligam-se às ITR e ao AAVS1

Integração do genoma viral

Locus: 19q13.4

AAV: Estratégias de terapia génica

1. Colheita e cultivo in vitro das células do paciente

2. Transdução com AAV com transgene

3. Selecção e expansão das células com transgene

4. Reintrodução dessas células no paciente

Ex vivo

1. Formulação do vector AAV com o transgene

2. Injecção directa do vector no tecido alvo do paciente

In vivo

Adaptado de: Menck C. F. M. & Ventura A. M. (2007). Manipulando genes em busca de cura: o futuro da terapia génica. Revista USP 75: 50-61.

AAV: Produção de vectores

Adaptado de: Buning H., Perabo L., Coutelle O., Quadt-Humme S. & Hallek M. (2008). Recent developments in adeno-associated virus vector technology. The journal of gene medicine 10: 717-733.

Alternativa:Células de insectos (produção 5 vezes superior)

Cápside: poderá ser de diferentes serotipos

Purificação

Centrifugação por gradiente de

densidade

Colunas de cromatografia

AAV: Terapia génica

Características vector ideal

Fácil produção

Não gerar resposta imune

Expressão do transgene

eficiente e a longo prazo

Especificidade para o tecido

alvo

Vector AAV

Não patológico Pouca estimulação do

sistema imune Larga escala de

infecciosidade particulas virais/ml Especificidade para

determinados tecidos

Vantagens Difícil produção e

purificação a larga escala

Espaço limitado para o transgene

Estimulação das células T citotóxicas

Inicio lento da expressão do transgene

Desvantagens

Cápside AAV-2

Aplicação de AAV em terapia génica: Doenças

Doença Tecido alvo Serotipo(s)

Amaurose Congénito de Leber Olho AAV-2

Parkinson CNS AAV-2

Hemofilia B Fígado, músculo esquelético AAV-2

Distrofia muscular de Ducheme Músculo esquelético AAV-1/2

Falha cardíaca severa Coração AAV-1; AAV-6

Artrite reumatóide Junções AAV-2

Fibrose cística Pulmão AAV-2

Cancro → expressão do factor de necrose tumoral para induzir apoptose


HEMOFILIA B: Doença genética associada ao cromossoma X; Consiste numa deficiência no factor de coagulação IX (FIX);

Tratamento actual: Injecções intravenosas do factor de coagulação concentrado (2 a 3 vezes

por semana); Carácter profilático; Extremamente dispendioso.

Alternativa:

TERAPIA GÉNICA


HEMOFILIA B: Terapia Génica

Transferência do gene mediada pelo vector AAV;

Permite a restauração da actividade de coagulação;

AAV-2

- a produção do factor diminui progressivamente;

- torna-se indetectável 14 semanas após o

tratamento.

O hospedeiro desenvolve uma resposta imunitária contra as proteínas da cápside do vector AAV-2.

COMO RESOLVER O PROBLEMA?


HEMOFILIA B: Terapia Génica (cont.)

Modificação da cápside para impedir resposta do SI:- Inserção de ligandos;- Uso da cápside do AAV-8 ou de outros AAV (requerimento: < seroprevalência);

Fonte:Buning H., Perabo L., Coutelle O., Quadt-Humme S. & Hallek M. (2008). Recent developments in adeno-associated virus vector technology. The journal of gene medicine 10: 717-733.

Exemplo de um estudo clínico:Nathwani, A.C. et al.

HEMOFILIA B: Métodos

AAV2/8 Transporta consigo o gene que

codifica o FIX

Administração intravenosa

(diferentes concentrações)

Monitorização overnight

AAV-2 ITRAAV-8 Cápside +


HEMOFILIA B: Características dos pacientes antes e após transferência do gene

Nathwani A.C. et al. (2011). Adenovirus-Associated Virus Vector–Mediated Gene Transfer in Hemophilia B. The New England Journal of Medicine 365 (25): 2357-2365.


HEMOFILIA B: Resultados e Discussão

Quanto maior a dose administrada -> maiores os níveis de FIX;

4 (dos 6 pacientes) pararam de receber o tratamento profilático (injecção de

FIX concentrado) -> retomando as actividades que estavam impedidos de

realizar devido à doença;

2 pacientes diminuíram o número de injecções de FIX concentrado

necessárias; (solução possível: aumentar a dose de administração do

transgene -> aumento da expressão de FIX);


HEMOFILIA B: Resultados e Discussão (cont.)

Nenhum paciente apresenta uma resposta imunológica contra o transgene FIX;

A administração do transgene FIX provoca um aumento dos níveis de

aminotransferase (solução: administração de glucocorticóides, que não

afectam a expressão do FIX);

Esta estratégia permite assim a expressão, a longo prazo, do transgene FIX (a

níveis terapêuticos) -> sem apresentar uma toxicidade aguda e a longo prazo;

MAS . . . Está associada ao risco de disfunção hepática;

Conclusões

É necessário conhecer e compreender melhor o processo

infeccioso de modo a superar as limitações e optimizar a

eficiência e segurança dos vectores virais

Continua por resolver o problema associado à resposta

imunitária…

Bibliografia

Buning H., Perabo L., Coutelle O., Quadt-Humme S. & Hallek M. (2008). Recent developments in adeno-associated virus vector technology. The journal of gene medicine 10: 717-733.

Carter, J. & Sauders, V. (2007). Virology: principles and applications. England: John Wiley & Sons, Ltd.

Giacca M. & Zacchigna S. (2012). Virus-mediated gene delivery for human gene therapy. Journal of controlled release 161: 377-388.

Menck C. F. M. & Ventura A. M. (2007). Manipulando genes em busca de cura: o futuro da terapia génica. Revista USP 75: 50-61.

Nathwani A.C. et al. (2011). Adenovirus-Associated Virus Vector–Mediated Gene Transfer in Hemophilia B. The New England Journal of Medicine 365 (25): 2357-2365.

Ortolano S., Spuch C. & Navarro C. (2012). Present and future of adeno associated vírus based gene therapy approaches. Recent patents on endocrine, metabolic & immune drug discovery 6: 47-66.

Qiu Y., Yang B., Lan X., Li X., Yin X. & Liu J. (2012). Advances in studies on recombinant adeno-associated virus vector. Asian journal of animal and veterinary advances 7: 1255-1260.

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