produÇÃo e aplicaÇÃo de anticorpos da gema do ovo … · anticorpos na gema do ovo de galinha...

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PRODUÇÃO E APLICAÇÃO DE ANTICORPOS DA GEMA DO OVO DEGALINHA

MARCO CESAR CUNEGÜNDES GUIMARÃES

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ

DEZEMBRO DE 2005

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Orientador: Prof. Marcos Fernando de Rezende Matta

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO

Campos dos Goytacazes – RJ

Dezembro de 2005

Tese apresentada ao Centro de Ciênciase Tecnologias Agropecuárias daUniversidade Estadual do NorteFluminense Darcy Ribeiro, como partedas exigências para obtenção do títulode Doutor em Produção Animal comênfase em imunogenética.

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Aprovada em 15 de dezembro de 2005.

Comissão Examinadora:

Prof. José Frederico Straggiotti Silva, PhD, Reprodução - UENF

Prof. Renato Augusto DaMatta, PhD, Biologia Celular – UENF

Prof. Antônio Carlos da Silva, PhD, Imunogenética – UERJ

Prof. Marcos Fernando de Rezende Matta, PhD, Imunogenética – UENF

(Orientador)

Tese apresentada ao Centro deCiências e TecnologiasAgropecuárias da UniversidadeEstadual do Norte Fluminense DarcyRibeiro, como parte das exigênciaspara obtenção do título de Doutor emProdução Animal com ênfase emimunogenética.

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BIOGRAFIA

MARCO CESAR CUNEGÜNDES GUIMARÃES, filho de Julio César

Guimarães e Rejane Cunegundes Guimarães, nasceu em 13 de agosto de 1973,

na cidade de Brasília-DF.

Em março de 1994 ingressou na Universidade Estadual do Norte Fluminense

para cursar Medicina Veterinária, formou-se em janeiro de 1999.

Em março de 1999 foi admitido no curso de pós-graduação do Centro de

Ciências e Tecnologias Agropecuárias, setor de imunogenética, Universidade

Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro – UENF, em Campos dos Goytacazes

– RJ, submetendo-se a defesa de dissertação para conclusão do curso em 27 de

agosto de 2001.

Em agosto de 2001, ingressou no curso de doutorado em imunogenética

desta mesma universidade, submetendo-se aos exames finais de defesa de tese

em dezembro de 2005.

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AGRADECIMENTOS

Gostaria de dedicar este manuscrito a todos os que creditam ao ensino ser a

forma mais pura de se desenvolver uma sociedade, em especial aos queridos pais

Júlio e Rejane que nunca mediram esforços para a educação de seus três filhos.

Aos simpáticos e amáveis garotinhos Bruno e Alexandre por todos os bons

momentos de descontração.

Aos queridos irmãos Junior e Patrícia pelas palavras de incentivo e carinho

nos momentos difíceis e, por terem concebido, não sozinhos é claro, meus dois

queridos sobrinhos.

A dedicada esposa Rita por ter esperado pacientemente todos esses anos.

Acreditando sempre nos resultados do trabalho, me fez nunca pensar em desistir.

A ausência do convívio fez falta e nos trouxe saudades in memorian ao

Dinho, vovô Tatão, vovô Zeca (para nunca desistir), vovó Nazaré e a vovó

Margarida, que nunca conheci mais a amei pelos seus filhos.

O companheirismo, ensinamentos e dedicação dos professores Marcos e

Frederico.

A todos os colegas do LMGA que estiveram sempre prontos a ajudar nos

experimentos.

À Lívia, ao Hugo e o Franz pela dedicação a esse projeto se tornaram uma

importante engrenagem.

vi

Grande parte deste trabalho somente foi possível de ser desenvolvido pelos

sempre sinceros e honestos ensinamentos do professor Han Shang Yoo da

Universidade Nacional de Seoul.

Não poderia deixar de agradecer a todos amigos que iniciaram essa longa

jornada juntos, compartilhando de inesquecíveis momentos (esquecendo uns

poucos) e que batalharam muito para buscar o seu espaço. Desculpem-me, mas

não posso deixar de citá-los, Leonardo Pacheco, Luciano Bravo, Rômulo Joviano,

Bruno Cruxen, Kildare, Cláudio Wermellinger, Cláudio Alberto, Daniel Iucif, Vitor

Guimarães, Renato Bernabé e Sandro Balbino.

Ao companheiro Jorge Andrade, pela constante presença desde os anos

dourados e pela certeza de sua continuidade.

Por fim me despeço da república dos Ursos que durante onze anos esteve

sempre de braços abertos recebendo a todos, especialmente pelo trabalho da

Heloísa e pela sempre simpática e alegre Buza.

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RESUMO

CUNEGÜNDES, M.C.G. DsC., Universidade Estadual do NorteFluminense Darcy Ribeiro; dezembro de 2005; Produção e aplicação deanticorpos da gema do ovo de galinha; Orientador: Marcos Fernando deRezende Matta.

Imunoglobulina Y (IgY) é o principal anticorpo encontrado em ovos degalinhas (Gallus domesticus). A IgY pode ser usada como uma alternativa aanticorpos de mamíferos normalmente usados na indústria. Comparado aosanticorpos de mamíferos, a IgY possui muitas vantagens, especialmente emrelação ao modo de obtenção não causando estresse animal. Portanto, a gema doovo de galinhas imunizadas é uma importante fonte de anticorpos policlonais.

Este trabalho é uma revisão dos diferentes métodos comerciais de extraçãodo anticorpo e diversos exemplos da sua utilização na medicina humana e animal,assim como informações básicas da sua atividade biológica e diferençasbioquímicas com anticorpos de mamíferos. Além disso, foram produzidosanticorpos na gema do ovo de galinha contra o parvovírus canino, vírus dacinomose, coronavírus canino, Staphylococcus aureus e toxóide tetânico. Osticorpos produzidos foram extraídos e tiveram sua atividade biológica mensuradaatravés do teste de ELISA.

Palavras-chave: Anticorpo de galinha, produção de IgY, IgY terapia, IgYprofilaxia, IgY diagnóstico, ELISA.

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CONTEÚDO

1 – INTRODUÇÃO ........................................................................... 1

2 – REVISÃO DE LITERATURA ...................................................... 3

2.1 – IMUNOGLOBULINAS ................................................. 3

2.1.1 – ESTRUTURA E FUNÇÃO ......................................... 3

2.1.2 – INTERAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO ............... 6

2.2 – ANTICORPOS DA GEMA DO OVO DE GALINHA........... 7

2.2.1 – SISTEMA IMUNE HUMORAL DE AVES .................... 8

2.2.2 – ESTRUTURA MOLECULAR DA IgY .......................... 11

2.2.3 – TRANSFERÊNCIA DA IgY PARA A GEMA DO OVO . 11

2.2.4 – PARÂMETROS FÍSICO-QUÍMICOS DA IgY DE

GALINHAS ............................................................................................ 13

2.2.5 – ESTABILIDADE DA IgY ............................................. 13

2.2.6 – CRIAÇÃO ANIMAL ..................................................... 14

2.2.7 – IMUNIZAÇÃO ............................................................. 15

2.2.7.1 – PROPRIEDADE DOS ANTÍGENOS .............. 16

2.2.7.2 – MODO DE APLICAÇÃO DO ANTÍGENO ...... 18

2.2.7.3 – ADJUVANTES ................................................ 19

2.2.7.4 – INTERVALO ENTRE IMUNIZAÇÕES ............ 24

2.2.7.5 – INFLUÊNCIA DA IMUNIZAÇÃO NA POSTURADE OVOS ......................................................................................... 24

ix

2.2.7.6 – DESENVOLVIMENTO DO TÍTULO DE

ANTICORPOS IgY .......................................................................... 25

2.2.7.7 – COMPARAÇÃO DAS PROPRIEDADES DE

ANTICORPOS IgY DE GALINHAS E IgG DE MAMÍFEROS ........... 26

2.2.8 – ISOLAMENTO......................................................... 29

2.2.8.1 – MÉTODOS COMERCIAIS .................................. 34

2.2.8.1.1 – GRADIPORE ..………………………………... 34

2.2.8.1.2 – VYRUSYS CORPORATION ...………………. 35

2.2.8.1.3 – ALPHA DIAGNOSTIC INTERNATIONAL..…. 35

2.2.8.1.4 – PROMEGA..……………………………….…... 35

2.2.8.1.5 – GALLUS IMMUNOTECH …………..………... 35

2.2.8.1.6 – AFFILAND .......................................…........... 35

2.2.8.1.7 – PIERCE ......................................................... 36

2.3 – USO TERAPÊUTICO DE ANTICORPOS ...................... 36

2.3.1 – APLICAÇÕES DA IgY EM PESQUISAS

BIOMÉDICAS NA MEDICINA HUMANA E ANIMAL ............................. 39

2.3.2 – IgY PARA USO PROFILÁTICO OU TERAPÊUTICO

NA MEDICINA VETERINÁRIA .............................................................. 42

2.3.3 – IgY PARA USO TERAPÊUTICO OU PROFILÁTICO

NA MEDICINA HUMANA ...................................................................... 43

2.4 – VANTAGENS E DESVANTAGENS DE ANTICORPOS

POLICLONAIS DE AVES ...................................................................... 46

2.4.1 – BEM-ESTAR ANIMAL ............................................. 46

2.4.2 – FALTA DE REAÇÃO CRUZADA COM FATORES

REUMATÓIDES .................................................................................... 47

2.4.3 – FALTA DE REAÇÃO CRUZADA COM ANTICORPOS

HUMANOS ANTI-CAMUNDONGO .............................. 47

2.4.4 – DISTÂNCIA FILOGENÉTICA ................................ 48

2.4.5 – ATIVAÇÃO DO SISTEMA COMPLEMENTO ........ 48

2.4.6 – INTERAÇÃO COM RECEPTOR Fc ...................... 49

3 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................... 50

4 – ARTIGOS CIENTÍFICOS .................................................... 79

x

4.1 – CONSIDERATIONS ON THE STABILITY OF IGY

ANTIBODIES ANTI-TETANUS TOXOID ……………………………….. 80

4.2 – EFFICIENT PRODUCTION OF CHICKEN EGG YOLK

ANTIBODIES AGAINST A CANINE DISTEMPER VIRUS ……. 96

4.3 – DETECTION OF CANINE PARVOVIRUS IN FECES BY

CHICKEN EGG YOLK ANTIBODY …………………………………….. 109

4.4- PRODUÇÃO E UTILIZAÇÃO DE ANTICORPOS IGY

ANTI-Staphylococcus aureus ................................................................ 126

4.5 – PRODUÇÃO DE ANTICORPOS POLICLONAIS EM

GALINHAS ............................................................................................. 146

4.6 - DESENVOLVIMENTO E APLICAÇÕES DE IGY ANTI-

CORONAVÍRUS CANINO ........................................................................ 164

1

1. Introdução

Anticorpos são proteínas produzidas em resposta a um antígeno e se

ligam especificamente com o antígeno que induziu a sua produção. O uso de

anticorpos para terapia teve inicio em 1890 quando Von Behring e Kitasato

descobriram a anti-toxina diftérica.

Com o passar do tempo, anticorpos específicos têm sido usados para a

imunização passiva. Por exemplo, soro hiperimune de pacientes são requeridos

para o tratamento de infecções, tais como a raiva e o tétano. A especificidade e

avidez dos anticorpos são a base para a promoção da terapia de administração de

anticorpos. Nos últimos 10 anos, os avanços na engenharia genética tem

possibilitado o aumento da especificidade de anticorpos a sítios combinatórios,

melhorando assim a sua utilidade terapêutica.

A introdução de anticorpos no tratamento de imunodeficiências e doenças

infecciosas foi um significante avanço na medicina. A preparação inicial de

gamaglobulina avaliada para uso por via endovenosa foi de anticorpos policlonais.

Anti-soro animal e humano são usados in vivo para destruir bactérias e neutralizar

vírus no sangue de indivíduos infectados.

Possivelmente a mais importante aplicação foi o uso de anticorpos para o

antígeno Rh de eritrócitos, evitando o desenvolvimento da doença hemolítica do

recém-nascido.

2

O tratamento com anticorpos policlonais é associado com muitos efeitos

colaterais não desejados. Doença do soro, anafilaxia e a natureza desses

anticorpos são considerados fatores limitantes. Isto tem motivado pesquisadores a

produzirem anticorpos bem definidos em relação a sua qualidade e especificidade.

Apesar dos problemas e dificuldades envolvidos, existem diversas

vantagens para a utilização de anticorpos policlonais ou monoclonais na medicina

humana e animal.

O maior estímulo para o desenvolvimento de pesquisas nessa área é o

rápido desenvolvimento de resistência de muitos microrganismos a agentes

antimicrobianos, principalmente aos antibióticos. O aumento do número de mortes

causadas por superbactérias na última década devido ao desenvolvimento de

mecanismos de resistência diretos e indiretos fez com que alguns grupos de

pesquisa repensassem o uso de anticorpos como importante alternativa ao uso de

antibióticos.

3

2. Revisão de literatura

2.1 Imunoglobulinas

2.1.1 Estrutura e função

As imunoglobulinas são proteínas que atuam como componentes críticos em

cada estágio da resposta imunológica humoral (Alzari, 1988). Quando expressas

nas superfícies dos linfócitos B em repouso, servem de receptores que são

capazes de detectar e distinguir a enorme variedade de antígenos cognatos

(Boyden, 1966).

As imunoglobulinas de superfície podem iniciar uma cascata de eventos

moleculares de sinalização, que podem culminar em ativação das células B,

proliferação clonal e produção de plasmócitos (Blattner, 1984). As imunoglobulinas

secretadas percorrem os líquidos teciduais à procura dos antígenos específicos que

deflagram a sua produção, ligando-se a eles (Blattner, 1984). As duas

características marcantes das imunoglobulinas são a especificidade e diversidade

(Amit, 1986). Todas as moléculas de imunoglobulinas são compostas de dois tipos

diferentes de polipeptídeos. Os polipeptídeos maiores, denominados cadeias

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pesadas (H), são aproximadamente duas vezes maiores do que as cadeias leves

(L) menores (Blattner, 1984).

Todas as imunoglobulinas contêm um número igual de cadeias

polipeptídicas pesadas e leves, que podem ser representadas pela fórmula geral

(H2L2)n (Davie, 1986). As cadeias são mantidas juntas através de forças não-

covalentes, bem como por ligações covalentes através de pontes dissulfeto

intercadeias, formando uma estrutura básica, embora algumas, sejam compostas

de mais de uma destas unidades de quatro cadeias (Davie, 1986). As cadeias

polipeptídicas pesadas e leves são compostas de domínios globulares dobrados,

cada um com 100 a 110 aminoácidos, contendo uma única ligação dissulfeto

intracadeia (Davies, 1990 b).

Todas as cadeias leves e pesadas em qualquer imunoglobulina são

idênticas. Entretanto, quando comparadas entre diferentes imunoglobulinas, às

seqüências destas cadeias variam amplamente (Colman, 1988; Helmreich, 1961).

Tanto nas cadeias pesadas quanto nas leves, esta variabilidade é mais

pronunciada no domínio N-terminal, enquanto as seqüências dos outros domínios

permanecem relativamente constantes. Por essa razão, o domínio N-terminal numa

cadeia polipeptídica pesada ou leve é denominado de região variável, abreviada

por VH ou VL, respectivamente (Helmreich, 1981). Os outros domínios são

coletivamente denominados região constante, abreviados por CH ou CL (Campbell,

1948). As cadeias polipeptídicas leves contêm apenas um domínio CL, enquanto as

regiões CH, das cadeias pesadas são constituídas de três ou mais domínios,

indicados seqüencialmente por (CH1, CH2, CH3 e CH4) (Natvig, 1973).

Todos os mamíferos normais produzem várias formas alternativas de

cadeias pesadas e leves, exibindo, cada uma, seqüências distintamente diferentes

de aminoácidos na região C (Davies, 1983). Estas formas alternativas das cadeias

de imunoglobulinas podem ser distinguidas uma das outras pelas suas

propriedades físicas (peso molecular) ou sorológicas (Kehry, 1980). As classes de

imunoglobulinas são determinadas pela cadeia H. Assim, existem cinco classes de

imunoglobulinas em mamíferos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Em aves, existem três

classes de imunoglobulinas análogas as de mamíferos, IgA, IgM, IgY (IgG) (Sugita-

konishi, 1996). O peso molecular, morfologia e mobilidade imunoeletroforética da

IgA e IgM de galinhas são similares a IgA e IgM de mamíferos (Davies, 1990 a). A

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IgY é a principal imunoglobulina de baixo peso molecular encontrada no soro de

animais ovíparos (Chen et al., 1982; Leslie et al., 1969).

As atividades biológicas das imunoglobulinas são provenientes da união

entre antígeno e anticorpo (Casali, 1996; Eisen, 1962). A porção constante é a

principal responsável pelas atividades biológicas secundárias das imunoglobulinas

(Blatner, 1984). Entre as atividades biológicas das imunoglobulinas encontram-se a

capacidade lítica pela ação direta em membranas celulares, determinando lise

celular, o poder de neutralização, pelo qual a imunoglobulina pode recobrir a porção

deletéria da substância, neutralizando seu poder antigênico, o poder de preciptação

quando unidas a substâncias solúveis, a união a antígenos, permitindo a ingestão

por fagócitos, a ativação do sistema complemento (Metzger, 1970). A

imunoglobulina M é o primeiro anticorpo a ser sintetizado mediante um processo

infeccioso, sendo muito eficiente contra bactérias gram-negativas. A IgM é a

imunoglobulina que melhor fixa complemento, além de ser aglutinadora, formando

agregados incapazes de atravessar mucosas e impedindo a penetração dos

microrganismos (Metzger, 1970). Sua capacidade é citolítica, determinando lise

direta em determinadas bactérias (Michael, 1969). A IgG tem como atividade

biológica a capacidade de atravessar a placenta e as mucosas, este mecanismo

acontece por intermédio dos receptores Fcγ existentes na placenta e nas mucosas

(Rajewsky, 1996). A IgG1 e IgG3 ativam a via clássica do complemento, enquanto

a IgG2 realiza essa ativação em pequena escala IgG4 não o faz. A IgG neutraliza

toxinas, também atuando diretamente ou por clareamento, e auxilia a fagocitose de

determinadas bactérias, principalmente aquelas encapsuladas quando in vivo como

o Streptococcus pneumoniae e o Haemophilus influenzae (Colman, 1988). Assim, a

IgG pode ser uma opsonina, revestindo tais microrganismos e permitindo que

sejam fagocitados. A atividade da IgY se assemelha a IgG de mamíferos (Metzger,

1970). A IgA é a classe de imunoglobulina responsável pela defesa de mucosas,

existindo em grandes quantidades em mucosas digestivas, brônquicas e do

aparelho genitourinário. Ademais, é secretada ainda por plasmócitos de glândulas

exócrinas, aparecendo na saliva, na lágrima e no leite materno (Adachi, 2005).

Também atua na neutralização de toxinas e como aglutinadora. Possui ação

antiviral e antibacteriana, principalmente por se ligar em pilis bacterianos

(McHeyzer-Williams, 2004). A IgE atua na defesa antiparasitária, podendo revestir

protozoários para que sejam fagocitados, atuando como opsonina ou promovendo

6

a liberação de grânulos de eosinófilos passíveis de aumentar o peristaltismo

intestinal ou degradar diretamente helmintos por ação das proteases

liberadas(Herschel, 1997). Tem ainda atuação nas reações de hipersensibilidade,

em especial nas atopias, pela união a mastócitos e basófilos (Nossal, 2002).

2.1.2 Interação antígeno-anticorpo

As imunoglobulinas ou proteínas efetoras da resposta adaptativa humoral,

são denominadas anticoorpos ao se ligarem aos antígenos. As imunoglobulinas

monoméricas apresentam dois fragmentos de união antigênica, sendo, assim,

bivalentes (Davies, 1983). Enquanto, as diméricas são tetravalentes, podendo se

unir a quatro antígenos e as pentaméricas são decavalentes (Creighton,1993).

A união entre antígenos e anticorpos é uma união reversível e não-covalente

(Davis et al., 1998). As forças envolvidas por essa interação são seqüenciais e

diretamente proporcionais à distância entre o antígeno e o anticorpo (Israelachvili et

al., 1992).

As principais forças de atração são responsáveis por mais da metade da

interação. Os antígenos e os anticorpos comportam-se como hidrofóbicos,

afastando complexos hidrofóbicos, atraindo-os entre si (Israelachvili et al., 1992).

Após essa interação, são acionadas as forças eletrostáticas, unindo grupos

ionizados com cargas eletricamente opostas (Casali, 1996). Havendo ainda maior

proximidade entre antígeno e anticorpo, podem ter seqüência as forças

hidrogeniônicas, dadas por pontes de hidrogênio entre átomos de antígeno e de

anticorpo, mas são elas mais fracas, porém importantes pela grande quantidade

com que surgem (Eisen, 1962). Por último, sete vezes proporcionais à distância,

aparecem forças de van der Walls, decorrentes da união entre nuvens de elétrons

com cargas elétricas opostas de antígeno e anticorpo (Israelachvili et al., 1992). A

afinidade é a força total resultante entre um epítopo e seu determinante de

complementaridade, mensurável pelas membranas que separam antígeno e

anticorpo (Helmreich, 1961). Uma união pode ter afinidade alta ou baixa

dependendo da dimensão das forças que sobre ela atuam (Eisen, 1962).

7

A avidez resulta da soma de todas as afinidades existentes entre antígeno e

anticorpo, ou seja, é o resultado das forças de união entre todos os epítopos de um

antígeno e seus determinantes de complementaridade, além de melhor se definir

caso uma interação seja fraca ou forte (Hoogenboom et al., 1997).

2.2 Anticorpos da gema do ovo de galinha

Inicialmente, anticorpos IgY foram descritos como semelhantes a IgG de

mamíferos, entretanto agora são considerados evolutivamente um ancestral comum

para IgG e IgE de mamíferos (McCorwack et al., 1987).

Em 1893, Klemperer descreveu um experimento na qual ele demonstrou que

a imunização de uma galinha resulta na transferência de anticorpos específicos

para a gema do ovo.

Por um longo período não existiu aplicação científica para esse

conhecimento, mas quando o bem-estar animal se tornou uma séria questão de

preocupação ética para a comunidade científica, os resultados de Klemperer

ganharam interesse. Em particular, este desenvolvimento foi iniciado pelo trabalho

de Russell e Burch e a publicação em 1959 do “Princípio da técnica experimental

humana”. Nos 20 anos subseqüentes, mais e mais pesquisadores reconheceram a

importância dos resultados de Klemperer. Desde o início da década de 80,

anticorpos da gema do ovo de galinha (IgY Abs) tem encontrado uma ampla

aplicação, possivelmente devido a sua aplicabilidade em reagentes comerciais

secundários, tais como, kits para purificação de IgY e anticorpos marcados

especificamente contra IgY. Desde 1996, a tecnologia de IgY, introduzida pelo Dr.

Claus Staak (1995) tem se tornado aceita internacionalmente (Telfef et al., 2001).

Em 1996, um workshop do centro europeu para validação de métodos alternativos

(ECVAM) recomendou o uso de IgY ao invés de IgG de mamíferos, em ordem para

minimizar a dor causada pela coleta invasiva de anticorpo (Qureshi et al., 2000).

Este workshop também forneceu informações sobre aspectos práticos da criação

de aves de postura, a imunização de galinhas, o uso de adjuvantes e os métodos

de extração da IgY.

8

Em 1999, a tecnologia de IgY foi aprovada como um método alternativo para

o bem-estar animal pelo Conselho Federal de Veterinária do governo suíço.

Enquanto isso, inúmeras publicações tem reportado muitos aspectos da tecnologia

de IgY.

2.2.1 Sistema Imune Humoral de Aves

No reino animal, vários mecanismos têm sido desenvolvidos para proteger

um organismo de microrganismos invasores, substâncias estranhas e células

malignas. O sistema de defesa inclui duas partes em vertebrados: uma é inata e

não-específica, enquanto a outra é adquirida e específica. O sistema imune

adquirido é dividido em imunidades celular e humoral.

O sistema imune de aves consiste de órgãos primários (Bursa de Fabricius e

timo) e órgãos secundários (Baço, glândulas de Harderiam, linfonodos, medula

óssea e tecidos linfóides do trato gastrointestinal). A medula óssea é a fonte de

células tronco bursal e tímica. A Bursa de Fabricius é o sítio de diferenciação das

células tronco em células B, enquanto o timo é o sítio de diferenciação de células

tronco em células T (Aitken et al., 1973; Reynaud et al., 1985; Weill et al., 1987). A

proliferação de plasmócitos ocorre no baço onde as células B estão localizadas

(Weill et al., 1987).

Três classes de imunoglobulinas, análogas a IgA, IgG e IgM de mamíferos,

são encontradas nas aves. Historicamente, IgY, a imunoglobulina de baixo peso

molecular presente no soro e na gema do ovo, foi também chamada de IgG devido

a sua função e concentração em comparação com IgG de mamíferos, incluindo o

envolvimento na resposta imune secundária. Entretanto, tem-se demonstrado

claramente que esta denominação é inapropriada, especificamente por causa das

diferenças estruturais entre as moléculas de IgG e IgY.

A IgA e IgM de galinhas se assemelham a IgA e IgG de mamíferos em peso

molecular, estrutura e mobilidade eletroforética (Aitken et al., 1973). A seqüência de

DNA dos genes codificadores para IgY são mais similares para a IgE de mamíferos

do que a IgG (Reynaud et al., 1987). Outros resultados demonstram similaridade

com a IgA (McCormack et al., 1989). Então, pode ser postulado que a IgY é um

9

progenitor filogenético da IgE, IgA e IgG de mamíferos, a teoria suportada pelo fato

de que a IgY, em contraste a IgG, pode mediar reações anafiláticas (Aitken et al.,

1973).

Teoricamente, existem 106-108 diferentes anticorpos específicos em

mamíferos (Davis et al., 1998). Desde que isso não seja viável para cada tipo de

anticorpo envolvido é codificado por um gene, outros mecanismos estão envolvidos

nessa diversidade, mas estes são diferentes entre mamíferos e aves.

Três mecanismos básicos estão envolvidos na diversidade de anticorpos

(Helmreich et al., 1961; Herschel et al., 1997):

• Rearranjo gênico: sítio específico de recombinação;

• Conversão gênica: recombinação de homólogos não-recíprocos, pelo

qual modificações em um aceptor de gene são copiados de uma

seqüência doadora específica;

• Mutação somática: Simples substituição de nucleotídeos que não é

derivado de uma seqüência pré-existente.

Em mamíferos, a diversidade de anticorpos é principalmente produzida pelo

rearranjo de vários segmentos de genes para produzir a região hipervariável do

anticorpo, e adicionalmente, pela mutação somática (Rose et al., 1974). Portanto, a

produção de milhões de anticorpos específicos é possível (figura 1).

Em galinhas, a diversidade de anticorpos é principalmente relacionada pela

conversão gênica, pela união flexível V-J, e também pela mutação somática

pontual, como em mamíferos (Zhao et al., 2000; McCormack et al., 1993). Ao

contrário de mamíferos, em galinhas existe somente um gene funcional VH ou VL,

mas em compensação existem aproximadamente 25 pseudogenes-V, os quais

precisam de uma transcrição usual regulatória e reconhecimento de seqüência

sinal. Desses pseudogenes-V, 10 ou mais 120 pares de base são transferidos para

o gene-V funcional. Este processo se inicia aproximadamente 15-17 dias após as

células B imaturas migrarem para a Bursa de Fabricius (Davies et al., 1995)

10

Figura (1) adaptada de Bezzubova e Buerstedde (1994).

a)locus da cadeia leve de murinos; b) locus da cadeia leve de galinha.

V= segmentos gênicos codificados para o domínio variável (V1-200 indicam o número

de segmentos gênicos); J= segmentos gênicos codificados para uma certa parte do

domínio-V;C=segmentos gênicos codificados para o domínio

constante;L=seqüência líder; V=Segmentos de pseudogenes-V sem a transcrição

regulatória usual e seqüência de reconhecimento sinal.

11

2.2.2 Estrutura molecular da IgY

A estrutura geral da molécula de IgY, consiste de duas cadeias leves e duas

pesadas, comparável à imunoglobulina de mamífero. A cadeia pesada é indicada

pela letra grega Y ou , e contém um domínio variável e quatro constantes, em

contraste aos três domínios constantes da cadeia pesada da IgG.

O peso molecular (PM) da IgY foi encontrado por espectrometria de massa

de aproximadamente 167.250 Da, enquanto o da IgG de mamíferos é de

aproximadamente 160.000 Da (Sun et al., 2001). A cadeia leve consiste de um

domínio variável e um constante com PM de 18.660 Da, a cadeia pesada tem PM

de 65.105 Da e o fragmento Fab tem PM de 45.359 Da. Existe alguma homologia

entre os domínios C 3 e C 4, e os domínios C 2 e C 3 da IgG de mamíferos, uma

vez que o domínio C 2 é o representante da região de dobradiça da IgG e é muito

menos desenvolvido na IgY (Shimizu et al., 1992).

A região de dobradiça menos desenvolvida na IgY pode resultar em uma

reduzida flexibilidade da região Fab, a qual, pode ser a razão para algumas

diferenças entre IgY e IgG na ligação do epítopo (Warr et al., 1995; Cser et al.,

1982; Noll et al., 1982).

Assim como para IgG, a região Fc da IgY é o sítio de maior função biológica.

Contêm duas cadeias laterais de carboidratos, em contraste a somente uma na IgG

(figura 2).

2.2.3 Transferência da IgY para a gema do ovo

De acordo com Rose (1974), poucas quantidades de IgA e IgM são

transferidas das células plasmáticas do oviduto para a clara do ovo. Lösch et al.

(1986; 1996) confirmam este resultado. Em contrapartida, Yamamoto et al. (1975)

demonstraram quantidades substanciais de IgM e IgA na gema do ovo e de IgY na

clara do ovo.

Experiências mostram que a IgY é exclusivamente transferida para a gema

por um processo mediado por receptor (Mohamed et al., 1998; Morrison et al.,

12

2001). A quantidade de IgY transferida é dependente a concentração sérica, e

parece que toda a população de IgY é transferida (Morrison et al., 2001).

Mohammed et al. (1998) e Morrison et al. (2001) mostraram que a região Fc

e de dobradiça intactas são ambas essenciais para a realização da transferência da

IgY do soro para a gema do ovo. Aparentemente, duas regiões são de particular

importância, na interface entre C 2 e C 3, resíduos 251-254 (Leu-Tyr-Ile-Ser

[LYIS]), e a posição 429-432 dentro C 3 (His-Glu-Ala-Leu [HEAL]). Todas as

imunoglobulinas transportadas para a gema têm a seqüência HEAL.

A figura (2) é adaptada de Shimizu et al.(1992).

V=Domínio variável da cadeia leve (VL) e cadeia pesada (VH); C=domínio constante

da cadeia leve (CL) e cadeia pesada (CH); HR=Região de dobradiça. Os pontos em

negrito simbolizam cadeias de carboidratos.

A passagem transovariana da IgY leva aproximadamente 5 dias (Mohamed

et al., 1998). A meia-vida da IgY circulante em aves adultas é aproximadamente de

36 a 65 horas (Patterson et al., 1962). Isto é muito mais curto do que a meia-vida

da IgG de ovinos, a qual é de aproximadamente 15 dias (Wooley et al., 1995).

13

De acordo com vários autores, anticorpos específicos do soro são

transportados para a gema com um atraso de 5-6 dias (Patterson et al., 1962) ou 3-

4 dias (Wooley et al., 1995). O retardo pode estar envolvido com ovos submetidos

ao seu processamento final, durante o qual a IgY é transferida para a gema junto

com outras proteínas selecionadas (Patterson et al., 1962). A quantidade de IgY

transferida parece ser independente do tamanho do ovo (Dohms et al., 1978; Bollen

et al., 1997).

Dependendo do ensaio usado e sua sensitividade, a concentração total de

IgY é estimada em 100-200 mg por ovo. Existe uma controvérsia a respeito da

quantidade de IgY no soro e na gema. Alguns autores não reportam diferenças

entre eles, enquanto outros detectam uma alta concentração de IgY na gema, cerca

de 1.23 vezes mais na gema do que no soro (Woolley et al., 1995).

A concentração da IgY na gema varia significativamente entre indivíduos (por

exemplo, 3-7 mg/ml; Carlander et al., 2001), linhagens genéticas e raça (por

exemplo, Leghorn Single Comb White 2.2 ± 0.4 mg/ml, Rhode Island Red 1.7 ± 0.5

mg/ml; Carlander et al., 2002; Gross et al., 1990).

2.2.4 Parâmetros físico-químicos da IgY de galinhas

O ponto isoelétrico (pI) da IgY está entre 5.7-7.6, enquanto que a IgG está

entre 6.1-8.5 (Davalos-Pantoja et al., 2000). A parte da molécula de anticorpo mais

hidrofóbica é a região Fc. O fragmento Fc da IgY é maior do que o da IgG, portanto

a molécula de IgY é mais hidrofóbica do que a IgG. Esta característica pode

conferir uma melhor adsorção da IgY a partículas de látex (Davalos-Pantoja et al.,

2001). A IgY se liga firmemente a partículas de látex em pH 8 (Davalos-Pantoja et

al., 2001).

2.2.5 Temperatura e estabilidade em pH

Para o uso oral de anticorpos IgY como componente funcional de alimentos

é necessário investigar à estabilidade da IgY em relação ao pH, bem como a

14

resistência molecular a clivagem proteolítica sobe condições alimentares durante a

condição da passagem do alimento através do estômago e intestino. A estabilidade

ao calor também é importante.

De acordo com Shimizu, a IgY é mais sensível do que a IgG de coelhos a

desnaturação ácida, a perda de atividade rápida entre pH 3 e 4. Resultados

similares foram apresentados por Lee et al. (2002), Hatta et al.(1993). A adição de

50% de sorbitol foi capaz de suprimir a inativação de IgY induzida por ácido em pH

3 (Lee et al., 2002).

Schimidt et al. (1989) e Hatta et al. (1993), investigaram extensivamente a

clivagem peptídica de IgY, encontrando uma alta perda de atividade específica

durante a passagem através do estômago devido a atividade de proteases

pancreáticas. A adição de bicarbonato de sódio ou soluções ricas em proteína

(clara e gema do ovo) aumentaram incrivelmente a resistência da IgY a inativação

ácida ou proteolítica. De acordo com Reilly (1997), a IgY é menos resistente do que

a IgG a digestão de pepsina, porém muito mais resistente para a atividade da

tripsina e quimiotripsina.

Jaradat e Marquardt (2000) demonstraram a estabilidade ao calor da IgY

acima de 60oC, a qual pode ser aumentada para 70 oC pela adição de açúcares,

tais como 30% de sucrose, trealose, lactose ou gema do ovo. De acordo com Hatta

et al. (1993), a molécula de IgY é estável a temperaturas entre 60oC e 70oC. Lösch

et al. (1986) demonstraram que ovos cozidos em água fervendo por 6 minutos, A

concentração de IgY não decresceu. Portanto, agora é possível projetar

formulações especiais de IgY afim de evitar a perda de IgY devido a baixa de pH, a

qual assegura a liberação de anticorpos no sítio de ação desejado (Shimizu et al.,

1993).

2.2.6 Criação animal

As condições para criação de galinhas diferem de acordo com o objetivo, por

exemplo, sob condições comerciais ou em laboratório. Entretanto, eles devem

permitir o mínimo de comportamento típico das espécies.

15

Até o presente, existem muitas recomendações para criação de galinhas

(Fölsch et al., 1990; Hlinak et al., 2000). O tipo de criação, soltas ou em gaiolas, vai

depender da requisição de espaço e dinheiro. Ambas as condições possuem

vantagens e desvantagens, incluindo higiene, identificação dos ovos, desordens

típicas e cuidados animais. Existe uma relação entre as condições de manutenção

e a possibilidade de monitorar o estado de higiene dos animais envolvidos.

Sob condições especiais de laboratório, o uso de unidade de gaiolas

exclusivamente desenhadas para a criação de galinhas é recomendado (Untiedt et

al., 1997). Na Europa, uma unidade consiste de quatro gaiolas separadas, cada

uma equipada com comedouro, bebedouro, puleiro e bandeja para postura de ovos

individuais.

Erhard et al. (2000) comparou o título médio de IgY e a concentração média

de galinhas imunizadas criadas em gaiolas ou soltas. O resultado deste estudo

demonstra claramente que ambos títulos de anticorpos IgY foram altos em galinhas

criadas em gaiolas.

Existe uma discussão sobre as vantagens do uso de galinhas criadas sob

condições SPF em comparação a criação convenvional. Hommel e Behn (2000)

mostraram que um esquema de imunização idêntico utilizado em dois grupos de

Leghorn branca, um criado sob condições SPF e outro criado sob condições

convencionais, resultaram em comparáveis títulos de anticorpos.

Diferenças significativas foram encontradas na quantidade de proteínas

totais da gema do ovo e a taxa de IgY específica. Até o presente, não existem

dados que demonstrem a superioridade de um ou outro tipo de criação (Acevedo et

al., 1999).

2.2.7 Imunização

O desenvolvimento e a produção de anticorpos como resultado de

imunizações não são muito previsíveis.

Galinhas podem ser usadas para produção de anticorpos a partir do

momento em que entrarem em postura. Animais que são usados para produção de

anticorpos por mais de três meses precisam receber várias imunizações com os

16

antígenos a cada mês para assegurar o alto título de anticorpo. Galinhas podem

produzir anticorpos com alta avidez logo após a primeira imunização, se comparado

com ovelhas que ocorre por volta da quarta imunização. Porém, este resultado

depende de algumas variáveis, as quais incluem o tipo de antígeno (dose e peso

molecular), o adjuvante, a via de administração, a genética do animal e o tipo de

criação.

2.2.7.1 Propriedades dos antígenos

Como mencionado anteriormente, uma resposta imune é essencialmente

influenciada pela qualidade e quantidade do antígeno usado.

Ainda em 1945 Landsteiner demonstrou que existe uma relação entre o peso

molecular e imunogenicidade. Haptenos de baixo peso molecular não são

imunogênicos, ao menos que possam ser carreados por uma molécula de alto peso

molecular.

Injeções simultâneas com o mesmo hapteno são usadas para aumentar o

título de anticorpos.

A cooperação entre células T CD4+ e células B, influencia na produção de

anticorpos hapteno-específico (Snippe e Kamp, 1975). No caso de múltiplas

imunizações, a interferência do antígeno e sua recíproca influência na resposta

imune podem ser quantificadas. Por exemplo, a resposta humoral pode diminuir a

intensidade da resposta celular.

A resposta para um antígeno pode ser maior do que uma resposta imune

seguida de aplicação de dois antígenos competidores (Dunnington, 1992). Como

em mamíferos, a imunização de galinhas contra antígenos recombinantes é

possível.

O critério para um antígeno como um bom imunógeno é a seqüência de

aminoácidos a ser reconhecida pelo sistema imune das aves como sendo estranho,

que pode ser aplicado para antígenos de origem natural e sintética. A imunização

de galinhas com proteínas resulta normalmente em uma boa produção de

anticorpos. O peso molecular mínimo necessário para obter uma resposta imune

suficiente é similar em ambos, mamíferos e aves e varia de 5 a 10 KDa.

17

É sempre discutível que galinhas somente reajam moderadamente a

imunização com peptídeos. A imunogenicidade de um peptídeo depende

largamente da seqüência de aminoácidos e da substância carreadora deste

antígeno. Portanto, a escolha do adjuvante é de relativa importância.

Concentrações de 100-250 g de peptídeo por imunização pode ser aplicada

(Alving, 1997).

Os carboidratos, semelhante a peptídeos, têm uma reduzida

imunogenicidade, dependendo da sua estrutura (puro ou em combinação com

proteínas: glicoproteínas e lipoproteínas) (Amyx, 1987). Eles induzem uma baixa

resposta imune independente de células T. Acoplados a proteínas são capazes de

induzir resposta imune dependente de células T e, portanto, aumenta a produção

de anticorpos (Bomford, 1985). Devido ao limitado espectro de determinantes

antigênicos e uma ampla distribuição em sistemas vivos os carboidratos são

envolvidos em uma série de reações cruzadas.

Segundo Schecklies (1996) a quantidade de antígeno usada não é

irrelevante para a resposta imune. Isso demonstra existir uma concentração ótima

de antígeno. Em camundongos, 0.1-0.5 mg de antígeno é suficiente para se obter

um título máximo de anticorpos. Enquanto, que um aumento para 1 mg reduz a

resposta. No entanto, em galinhas o título máximo de anticorpos pode ser obtido

utilizando uma concentração de antígenos variável de 10 g a 1 mg (Mahn, 1998).

No caso de repetidas imunizações, uma pequena quantidade de antígeno é

usada para a primeira imunização. A idéia é estimular a ligação dos antígenos com

os receptores de células B e principalmente a estimulação dos clones de linfócitos

B. Antígeno e adjuvante são injetados por via intramuscular ou subcutânea.

Outras formas de aplicações têm sido descritas (Schade et al., 1992;

Leenars et al., 1999).

Estudos semelhantes tem sido conduzidos por Larsson et al. (1998), nos

quais grupos de três galinhas foram imunizados com 100 g, 10 g, 1 g ou 0.1 g de

albumina sérica bovina ou insulina humana, com uma imunização inicial seguida de

três injeções com intervalos quinzenais. Não existiram diferenças significativas

entre o uso das diferentes concentrações de antígenos.

Rodolfo Sarmiento (resultado não publicado) demonstrou que a injeção de 5

mg ou 2.5 mg de albumina humana resultaram na supressão do desenvolvimento

18

do título de anticorpos, em contraste com a boa resposta induzida pela injeção de 1

mg ou 0.5 mg deste antígeno.

Para cada antígeno existe uma dose e um adjuvante a ser testado, não

havendo assim um programa único e geral para imunização de aves.

Resultados de investigações comparativas de títulos de anticorpos

desenvolvido em galinhas criadas convencionalmente ou sob condições SPF não

mostraram diferenças essenciais (Behn, et al., 1996). Porém, é muito interessante o

fato de que a concentração de IgY total aumenta muito mais depois da imunização

em aves SPF do que em galinhas de criação convencional, entretanto o

desenvolvimento de títulos de anticorpos é similar em ambos os casos (tabela1). A

quantidade de IgY em galinhas SPF alcança quase o mesmo nível do que em

galinhas criadas convencionalmente, mas animais SPF iniciam com baixos níveis

depois da imunização (Behn, et al., 1996) . Portanto, o uso de galinhas criadas sob

condições SPF não se justifica comercialmente pela baixa relação custo-benefício.

Criação convencional Criação SPF

Dias 5 33 100 5 33 100

Média 39,6 58,8 61,4 18,0 38,7 49,4

SD 6,6 11,2 12,0 6,4 7,1 10,8

Tabela 1. Comparação da quantidade de IgY (mg/gema de ovo) de galinhas criadas

convencionalmente e sob condição SPF. Dias de imunização: 0 e 28, dias de teste:

5, 33 e 100. (Schade et al., 2000).

2.2.7.2 Modo de aplicação do antígeno

A via mais comum para injeção de antígenos em galinhas é a via

intramuscular. Schwarzkopf et al. (2000) comparou a imunização pela via

intramuscular e subcutânea, demonstrando a produção de anticorpos maior na via

subcutânea do que na intramuscular, se for usado sem adjuvantes (Calzado et al.,

2001). A combinação de injeção do antígeno por via intramuscular com a injeção

19

final via endovenosa, freqüentemente aumenta significativamente o título de

anticorpos. Entretanto, a injeção via endovenosa (sem adjuvante) precisa ser feita

vagarosamente (aproximadamente 500 l em 15 minutos) para evitar uma reação

anafilática sistêmica. Inoculação de antígeno via intraperitonial foi usada por

Klemperer em 1893, mas hoje isto é uma via não usual (Lösch et al., 1986). Em

uma investigação recente (Hedlund et al., 2001), foi mostrado que a imunização

oral é possível. Nos dias, 1, 14 e 33 de imunização de duas galinhas por grupo

foram oralmente dados 100 g de IgG humana, junto com vários adjuvantes. Após

2 semanas foi observado um alta produção de IgY (Klipper et al., 2000).

2.2.7.3 Adjuvantes

A produção de anticorpos policlonais é suportada pelo uso de moduladores

imunoestimulantes de linfócitos B, conhecidos como adjuvantes. Entretanto, essa

estimulação independe do tipo de antígeno, e é, portanto não específica (Freund,

1937 e 1944; Glenny et al., 1926; Kaeberle, 1986; Roitt et al., 1987; Thein, 1988). O

mecanismo a qual eles funcionam não é totalmente esclarecido. Eles promovem

ambas respostas imunes humoral e celular e induzem a memória imunológica.

Os adjuvantes podem influenciar totalmente ou parcialmente a composição

dos isotipos de imunoglobulinas criados durante a resposta imune (Mallon et al.,

1991). Isto pode ser aplicado em ambas, estimulação dependente de célula T

(muramildipeptídeos) bem como para reposta independente de células T

(especialmente lipopolissacarídeos).

O muramildipeptídeos (MDP) estimulador de célula T é um constituinte da

parede celular de micobactérias com uma forte imunogenicidade (Ellouz et al.,

1974). Por outro lado, células B são ativadas fortemente por lipopolissacarídeos

(LPS) (Johnson et al., 1956; Azuma et al., 1976; Sugimoto et al., 1978; Sprick-San

José Messing, 1990; Lübke, 1990). O CD14 tem sido identificado nesta função

como um ligante LPS-proteína (Schütt et al., 1992).

O conceito de adjuvante foi criado por Ramon em 1925. Existia somente o

uso de fécula, agar e saponina como base para adjuvantes. Até mesmo hoje em dia

20

saponinas são parte de muitas vacinas veterinárias e são extraídas da casca de

uma árvore sulamericana chamada Quillaia saponaria.

Em 1926/31, Glenny et al., utilizaram hidróxido de alumínio [Al(OH)3],

enquanto o efeito do imunoestimulante depende da quantidade de antígeno

adsorvida. A taxa ótima entre o antígeno e o Al(OH)3 tem sido estudada de forma

separada em cada caso (Bomford, 1985). A demorada liberação do antígeno do

complexo prolonga a fase de apresentação a células imunocompetentes (Kellner,

1990).

Os adjuvantes mais comuns usados em experimentos animais são aplicados

como emulsões de água em óleo. Nessas emulsões os antígenos estão na fase

líquida, como por exemplo, o adjuvante completo de Freund’s (CFA) (Finger et al.,

1964; Herbert, 1974; Lösch et al., 1986; Thein, 1988). Uma grave desvantagem no

uso de adjuvantes são os efeitos locais e sistêmicos, tais como: abscessos,

granulomas, ulcerações, a qual podem levar para fístulas sistêmicas com

espalhamento metástico (Steiner et al., 1960; Bennett et al., 1992), efeito

carcinogênico facultativo e do risco de alergia no caso de uso repetido (Potter,

1977), resultado falso positivo com testes de tuberculina depois do uso de CFA,

além de efeitos adversos na qualidade da carne se usados em animais de

produção (Allinson et al., 1986). Um outro problema do efeito de adjuvantes é a

interrupção da tolerância aos auto-antígenos presentes ao mesmo tempo com

antígenos estranhos (Nakashima et al., 1979).

O modelo animal de artrite induzida pelo adjuvante pode ser usado como

exemplo (Tal e Laufer, 1969). Por esta razão, muitos adjuvantes não podem ser

usados em humanos.

Freund et al. (1937, 1942, 1951) usaram emulsão de água em óleo fazendo

um antígeno em solução líquida e óleo parafina bem como micobactérias inativadas

(adjuvante completo de Freund, CFA) para imunização. Na emulsão, o antígeno é

resistente a dispersão, como um depósito estável, tendo como efeito uma

estimulação prolongada do antígeno (Bomford, 1985). Óleos minerais igualmente

tendem a criar abscessos estéreis e, portanto, aumenta o efeito depósito (Thein,

1988).

21

O CFA é chamado de padrão ouro e é o adjuvante mais usado para

imunização. Ele é um extraordinário estimulante imune, e devido à boa resposta

imune até para antígenos fracos.

O djuvante incompleto de Freund (FIA) não contêm preparados de

micobactérias. Existem outros exemplos de adjuvantes de formulações de água em

óleo tais como adjuvante 65, specol e título máximo. Outra nova formulação de

adjuvante é o sistema adjuvante ABM. Esta forma estável de emulsão de óleo em

água de baixa viscosidade requer somente 2% de óleo.

Em galinhas, não existem abscessos devido à imunização. Os componentes

usados nesse sistema de adjuvante são trealosidimicolato (TDM), parede do

esqueleto celular (CWS), lipídio monofosforil A (MPL) bem como bactéria

patogênica inativada e Tween 80 como um auxiliar. Glicoproteínas da parede

celular de micobactérias tem um efeito estimulatório importante, por exemplo, N-

acetilglucosaminos MDP (GMDP) usados no adjuvante Gerbu.

Em vários animais, um efeito estimulatório tem sido mostrado por

lipopeptídeos sintéticos juntos com uma série de antígenos (Wiesmüller et al.,

1997). Adjuvantes comercialmente avaliados para utilização em galinhas são

mostrados na tabela 2.

Adjuvante Empresa

Specol Instituto Voor Diergezondheid (ID-DLO),

Lelystad-Netherlands

TiterMax Serva, Heidelberg, Alemanha

ABM-N, ABM-S Linaris, Bettingem, Alemanha

Adjuvante da vacina veterinária

Neoparasec®

Rhone Meriux, Laupherin, Alemanha

Adjuvante Gerbu Gerbu Biotechnik, Gaiberg, Alemanha

Lipopeptídeo PCSL Boehringer, Mannheim, Alemanha

Tabela 2. Adjuvantes comercialmente avaliados para imunização de galinhas

(Schade et al., 2000).

22

Usando adjuvantes e adaptando esquemas de imunização, aves reagem

com a produção de anticorpos a qual em título, avidez e especificidade não diferem

dos mamíferos.

Existem algumas recomendações importantes para a escolha de um bom

adjuvante (tabela 3). Geralmente usando adjuvantes CFA e SPECOL, ambos

contendo óleos minerais, altos títulos e forte avidez são alcançados. Mas, no caso

do CFA esses são acompanhados por efeitos colaterais efeitos colaterais, tais

como abscessos e alterações degenerativas do tecido muscular.

O SPECOL, semelhante ao CFA, é um adjuvante composto de óleos

minerais não metabolisados, porém não são observados efeitos indesjados. De

acordo com algumas experiências, somente o CFA induz uma boa, porém variável

resposta a antígenos de baixo peso molecular. No caso de antígeno de alto peso

molecular, o SPECOL é uma boa alternativa para imunização de galinhas, pois

forma uma imunidade longa e tardia, além de induzir metade dos efeitos colaterais,

se comparados ao CFA.

CARACTERÍSTICAS CFA SPECOL TM ABM GERBU PCSL

Alto custo X X X X

Fácil manipulação X X X X

Boa resposta imune X X X X

Efeitos colaterais mais

severos

X

Tabela 3. Comparação da relação custo/benefício e efeitos colaterais de vários

adjuvantes (Schade et al., 2000).

Devido aos efeitos colaterais, o CFA somente deve ser usado com

imunógenos fracos.

Adjuvantes comercialmente avaliados usados como alternativa são

SPECOL, PCSL e o TiterMax. O SPECOL demonstra ser imunogenicamente

efetivo, similar ao CFA. De acordo com algumas pesquisas, o sucesso do uso do

PCSL depende da manutenção de sua concentração dentro de determinados

limites (250 g/injeção sc.). Adjuvantes com uma pequena parte de óleos minerais

23

não metabolisados ou metabolizados (TiterMax, sistema ABM e Neoparasec® e

Gerbu) não possuem notáveis efeitos colaterais sob as condições experimentais

escolhidas. Usados sozinhos, eles não foram muito efetivos.

Vários fatores afetam a imunização de galinhas (Schade et al., 1992). A

primeira imunização pode ser seguida por outra 3-4 semanas depois, ou em

intervalos curtos, então a última injeção pode ser dada 1-2 meses depois. Porém,

injeções tardias (3-4 meses) do antígeno podem induzir uma ascensão drástica no

título de anticorpos.

Como uma regra a emulsão de antígeno é injetada por via subcutânea ou

intramuscular.

Experiências sugerem que uma concentração de 0.1-1 mg de antígeno é

favorável para a imunização de galinhas. Em casos particulares, uma alta ou baixa

concentração pode ser muito conveniente. Em imunizações com peptídeos

carreados com conjugados pode ser vantajoso para iniciar com alta concentração

(0.25 mg peptídeo/imunização).

Suportado por pesquisas um esquema de imunização é demonstrado na

tabela 4.

Antígeno 0.10-1.0 mg Em casos especiais 10 g

Adjuvantes FIA 0.10-0.25 ml Intramuscular ou subcutânea

SPECOL 0.5 ml Subcutânea

PCLS 250 g Preferencialmente subcutânea

CFA 0.10-0.5 ml Somente com antígenos pouco

imunogênicos

Injeções:

- Volume 0.5-1.0 ml

- Intervalo 4-8 semanas

- Número 2 (ou mais)

- Via Intramuscular ou

subcutânea

Tabela 4. Recomendações para imunização de galinhas (Schade et al., 2000).

24

2.2.7.4 Intervalo entre imunizações

O sucesso de uma imunização depende de vários fatores, incluindo o

intervalo de aplicação entre a primeira, a segunda e subseqüentes imunizações.

Muitos protocolos de imunizações são avaliados, com recomendações de

inoculações nos dias 0, 14 e 28 (Tini et al., 2002; Tu et al., 2001) ou uma vez por

semana por 7 semanas consecutivas (Calzado et al., 2003).

Muitos autores imunizam a galinha com intervalos de 10 dias (Ohnishi et al.,

2000; Pelosi et al., 1999; Gassmann et al., 1990), mas a recomendação geral é que

o intervalo entre a primeira e segunda injeções do antígeno deve ser ao menos de

4 semanas. Isto se reflete na memória imunológica, a qual deve ser dado tempo

para o seu desenvolvimento.

Msserschmid et al. (1993) também suporta este conceito, pois imunizou

galinhas no dia 0, na 10a semana e na 15a semana, encontrando altos títulos de

anticorpos (1:160.00).

Hlinak et al. (1996) e Schwarzkopf et al. (2000) reportaram resultados

similares, e recomendaram a aplicação de um estímulo tardio.

Pichler (1999) demonstrou um aumento significante do título de anticorpos

com um prolongamento do intervalo de imunização de 14 para 42 dias.

Existe evidência de que a aplicação freqüente de um mesmo imunógeno em

curtos períodos de tempo resulta em depressão do sistema imune (Calzado et al.,

2003).

2.2.7.5 Influência da imunização na postura de ovos

De acordo com Schade et al (2005) e experimentos de muitos outros grupos

de pesquisa, a performance das galinhas na postura de ovos é ligeiramente

influenciado pela simples injeção de um antígeno (Mittermeier et al., 1995).

A postura pode decrescer, dependendo do tipo de antígeno injetado. Por

exemplo, Schade et al. (Schade et al., 1994) e Schniering et al. (Schniering et al.,

1996) imunizaram galinhas com soluções contendo antígeno de um parasita

25

intestinal (Ascaris suum), observando um decréscimo e paralização na postura de

ovos por mais de 3 semanas, provavelmente por causa de substâncias tóxicas

originárias do intestino do parasita.

2.2.7.6 Desenvolvimento do título de anticorpos IgY

Depois da imunização de um mamífero, tais como os coelhos, o sistema

imune monta a primeira resposta, seguida por uma segunda resposta elicitada

depois da injeção da segunda dose do mesmo antígeno. As duas fases possuem

diferentes características.

Durante a primeira resposta, o principal anticorpo sintetizado é a IgM, e

existe somente um baixo e transiente aumento no título de anticorpos, enquanto,

durante a segunda resposta, principalmente os anticorpos IgG são encontrados

como um estável e alto título por muitas semanas.

Os anticorpos IgY aparecem no soro da galinha em aproximadamente 4 dias

depois da inoculação do antígeno, alcançando um título máximo em 6 a 8 dias, e

declinando depois disso.

O título de anticorpos pode ser fortemente aumentado por imunizações de

reforço. De acordo com os resultados de Petterson et al. (1962), algumas galinhas

respondem com uma cinética de anticorpos similar a de mamífero, enquanto outras

respondem para o mesmo protocolo de imunização com um aumento no título de

anticorpos seguindo a primeira imunização, mas falham para trazer qualquer

mudança significante depois da segunda imunização.

Após a primeira imunização em galinhas, observa-se o aumento crescente

da cinética de anticorpos, caracterizando a primeira fase. A segunda fase é

caracterizada por um aumento inicial no título de anticorpos dentro de

aproximadamente 10 dias, seguido por um platô de mais 10 dias e um declíneo

depois disso.

O desenvolvimento do titulo de anticorpos é provavelmente uma

conseqüência da relativamente curta meia-vida da IgY em comparação com a IgG.

26

A razão para as diferenças na cinética de produção de anticorpos ainda não

está esclarecida.

2.2.7.7 Comparação dos títulos de anticorpos IgY e IgG

Tu (2001) comparou tiítulos de anticorpos em coelhos e galinhas imunizadas

0, 2, 4 e 6 semanas com lactoferrina bovina. Usando um ELISA, eles puderam

demonstrar que o título de anticorpos foi de aproximadamente 1.68x108 em ambas

as espécies, em torno da oitava semana após a imunização.

O título de anticorpos permaneceu mais estável em galinhas, por um período

de 16 semanas depois da imunização inicial.

Clark (1995) demonstou que, depois da imunização com ocratoxina A, o

título de anticorpos no soro de coelhos foi 10 vezes maior do que no soro de

galinhas. Em galinhas, o título de anticorpos aumentou incrivelmente dentro de 100

dias e permaneceu estável por mais de 166 dias.

Woolley e Landon (1995) observaram resultado similar depois de imunizar

carneiros e galinhas com interleucina-6 humana (IL-6). Além disso, observaram que

seis galinhas desenvolveram uma resposta imune clássica, caracterizada por uma

resposta forte para a segunda imunização. Em contrapartida, outras quatro galinhas

desenvolveram uma forte resposta após a primeira inoculação, mas falharam mais

tarde na resposta a segunda dose.

Bollen (1996, 1998) também comparou título de anticorpos desenvolvido em

coelhos e galinhas. Títulos de anticorpos estáveis podem ser achados em ambas

as espécies por um período de 50 semanas.

Hatta (1993) comparou o desenvolvimento de anticorpos em coelhos e

galinhas contra o rotavírus humano (Wa, sorotipo 1 e Mo, sorotipo 3). Coelhos

produziram um título de neutralização anti-Wa de 1:27.000 e um título de

neutralização anti-Mo de 1:4.000. Ao contrário, as galinhas, produziram um título

anti-Wa de 1:13.000 e um título anti-Mo de 1:15.000.

O título de neutralização permaneceu constantemente alto em galinhas por

um período acima de 50 semanas. Além disso, a produtividade total de anticorpos

27

foi cerca de 15 vezes (anti-Wa) e 120 vezes (anti-Mo) mais efetiva em galinhas do

que coelhos.

Reddy (1993) produziu anticorpos em galinhas (soro) e camundongos contra

reovírus de aves (tipo S1133). O título de anticorpos produzido no ELISA pelas

galinhas foi 15 vezes maior depois da terceira imunização do que o obtido em

camundongos.

Existe um grande número de trabalhos na literatura os quais mostram, em

princípio, que não existem diferenças significativas entre a atividade e afinidade

(Perez et al., 1994) de IgY e IgG.

Ohnishi (2000) desenvolveu um ELISA para a detecção do fator de

crescimento de hepatócitos (HGF) do soro e urina humanos, utilizando

comparativamente anticorpos específicos de galinha e coelhos. O limite de

detecção usando IgG de coelhos foi de 2pg/ml, enquanto a IgY foi de 20pg/ml.

Ligação não-específica foi menor nos anticorpos de galinhas do que nos

ensaios de anticorpos de coelhos. O limite de detecção para um sistema avaliado

comercialmente é de 100pg/ml.

Di Lonardo (2001) produziu anticorpos contra a oncoproteína E7 do papiloma

vírus humano tipo 16 (HPV16) em coelhos e galinhas. As galinhas reagiram com

todos os oito epítopos revelados, enquanto os coelhos reconheceram somente

dois.

Straumann-Kunz (1991) comparou anticorpos monoclonais de camundongos

(mAbs), direcionados contra Chlamydiae, com o correspondente anticorpo de

galinhas (IgY), e encontrou que, quando utilizou IgY em ensaios

imunohistoquímicos, o background foi menor do que com os mAbs de camundongo.

Clark (1995) comparou os limites de detecção do ELISA para quantificação

de ocratoxina usando anticorpos de galinha e coelho. Com o ensaio de coelho, foi

encontrado um limite de detecção de 3 g/Kg, enquanto que nos ensaios de

galinhas foram encontrados 50 g/Kg. Para otimização do processo foi realizado

outro ELISA usando anticorpos de galinha para a detecção de outra micotoxina,

Pichler (1998) obtiveram um limite de detecção de 17 g/Kg.

28

Clark (1995) observou que a especificidade e a sensitividade dos anticorpos

de galinha são dependentes de pH (baixa especificidade a pH 6, alta especificidade

a pH 8 e máxima sensitividade a pH 7).

Doth (1996) comparou a sensitividade de dois anticorpos de dois anticorpos

de galinha, quatro mAbs de camundongo e um anticorpo comerncial de cabra, com

especifidade contra troponina I.

Em comparação aos quatro mAbs, a sensitividade dos dois anticorpos de

galinha foram significativamente maior. Anticorpos de galinha não foram tão

sensitivos quanto o anticorpo de cabra.

Cipolla (2001) produziu anticorpos contra Campylobacter fetus em galinhas e

coelhos. Ambos tipos de anticorpos foram testados pelo uso imunofluorescência

indireta em dois laboratórios. Pode ser demonstrado que nos dois laboratórios os

anticorpos tiveram uma comparável eficácia em termos da especificidade e

sensitividade.

Interessantemente, a IgY aglutina a Salmonella da mesma forma que

anticorpos de coelho o fazem.

Terezolo (1998) mostraram que IgY anti-S.enteritidis pode ser usada para

aglutinar especificamente a bactéria e esta reação é altamente específica e

comparável ao anti-soro de coelhos. Portanto, isso possibilitará no futuro, uma troca

de coelhos por galinhas para a produção de kits para a identificação de Salmonella,

de acordo com Kauffman-White.

Al-Haddad (1999) usou imunohistoquímica para demonstrar a eficacia de um

anticorpo de galinha direcionado contra um marcador tumoral, psoriasin (S100A7).

A IgY foi altamente específica e teve uma excelente performance em tecidos

embebidos com parafina. Ao contrário, um anticorpo comercial de coelho anti-

S100A7 foi menos específico.

Knech (1996) comparou a eficácia de anticorpos de coelhos e galinhas

direcionados contra peptídeos correspondente a duas seqüências de aminoácidos

de ratos e humanos. Eles concluíram que os anticorpos de galinha podem ser

considerados uma melhor alternativa ao uso de anticorpos de mamíferos.

Pelosi (1999) usou anticorpos de galinha para estudos epidemiológicos

contra o vírus de Norwalk na população de Verona, Itália.

29

Krief (2002) galinhas e camundongos imunizados com -quetacolacol, e

encontraram demonstram que o anticorpo de galinha foi especificamente capaz de

reconhecer as estruturas do hapteno.

Recentemente, Rodolfo Sarmiento (resultados não publicados) observou

uma perda de reação cruzada para uma IgY anti-albumina humana com amostras

do sangue de outros mamíferos.

Gerl (1996) comparou a especificidade de dois anticorpos de galinha, dois

mAbs de camundongos e dois anticorpos de coelho contra o pró-colageno tipo III

(PIIINP), a qual é um marcador para processos fibróticos. Pôde ser mostrado que

somente os anticorpos de galinha foram capazes de reconhecer o PIIINP.

Danielpour e Roberts (1995) desenvolveram um ELISA para a quantificação

do fator de crescimento transformante 3 (TGF- 3) usando um mAb de

camundongo direcionado contra o TGF- 3 com um anticorpo de captura e um

anticorpo de galinha como a detecção do anticorpo. A marcação foi efetuada pelo

uso de anticorpos de cabra anti-galinha. Este ensaio foi confirmado como sendo

muito específico e altamente sensitivo, com uma detecção limite de 2pg.

2.2.8 Isolamento

A gema de ovo de galinha consiste de 51,3% de matéria seca e 48,7% de

água em proporções aproximadamente iguais (Siewert and Bronch, Handbuch der

Tierernährung, 1972; Romanoff e Romanoff, The Avian Egg, 1949).

A gema pode ser vista inicialmente (tabela 5) como uma emulsão de óleo em

água com a porção aquosa contendo proteínas e uma porção dispersa chamada de

grânulos de gema e gotas de lipídios (Fischer, 1996; Fisher et al, 1996).

Proteínas 16,6%

Lipídeos e gorduras 32,6%

Carboidratos 1,0%

Matéria Inorgânica 1,1%

Tabela 5. Constituição da gema do ovo. (Schade et al., 2000).

30

As proteínas na gema podem ser divididas em quatro frações:

1. A fração vitelina ou lipovitelina (47,5%), um fósforo contendo núcleo-

albumina (400 KDa) com unidades subsidiária tendo peso molecular entre

35-140 KDa (Mehner and Hartfield, 1983);

2. A fração vitelelina (38,6%) com menos fósforo e mais lipídios do que a

fração vitelina;

3. A fração fosfovitina (4,3%), muito rica em fósforo e sem lipídeos, uma

proteína com um peso molecular de 36 KDa (Mehner and Hartfield, 1983);

4. A fração livetina (9,6%), com proteínas solúveis, tais como globulinas.

A concentração e distribuição de imunoglobulinas no soro e na gema são

demonstradas na tabela 6 (Rose et al, 1974).

IgY (IgG) mg/ml IgM mg/ml IgA mg/ml

Soro 6 1.3 0.6

Gema 25 (<0.02) (<0.03)

Clara (<0.03) 0.15 0.7

Tabela 6. Concentração de Imunoglobulinas nas aves (Schade et al., 2000). Os

valores entre parênteses são considerados resultados negativos.

Para estabelecer a presença de anticorpos específicos após uma infecção

ou imunização, não é necessário a extração e purificação da IgY, pois a gema pode

ser examinada diretamente para anticorpos sem qualquer manipulação.

Igualmente, para produzir anticorpos específicos para fins terapêuticos, não

se faz necessário a extração de IgY. Entretanto, para uso em diagnóstico é

importante que um processo de purificação seja utilizado (Erhard et al, 1996).

Vários processos são avaliados para isolar IgY da gema de ovos, e podem ser

usados sozinhos ou em combinação de acordo com os critérios que se seguem:

quantidade, pureza e atividade biológica (Bade e Stegemann, 1984).

31

O incômodo e custos envolvidos são fatores relevantes. Dado o alto nível de

atividade de anticorpos, um processo de isolamento ocasiona uma escolha entre a

quantidade e pureza, desde que o uso seqüencial de várias técnincas envolvem

uma quantidade baixa de IgY na gema.

Todo processo de extração inicia pela separação da gema e da clara (Hassl

e Aspock, 1988). Em geral, esses métodos podem ser divididos em três grupos

principais:

1. Métodos de precipitação: Envolvendo sulfato de amônio e sódio (Akita et al.,

1992; Akita et al., 1993), polietilenoglicol (PEG; Polson et al., 1980, 1985,

1990; Shafiq et al., 1997), ácido caprílico (McLaren et al., 994) e

carrageenan (Chang et al., 2000);

2. Métodos cromatográficos: Cromatografia de afinidade (Leslie et al., 1997),

cromatografia de troca iônica (Staak et al., 2000), cromatografia de interação

hidrofóbica (Hassl et al., 1988), cromatografia de interação tiofílica (Hansen

et al., 1998) e cromatografia de gel filtração (Staak et al., 2000);

3. Ultrafiltração (Kim et al., 1998).

Muitos métodos têm sido usados para o isolamento e purificação de

imunoglobulinas oriundas da gema do ovo (Jensenius et al., 1981; Polson et al.,

1985a). Entretanto, muitos desses métodos não servem para aplicações

alimentares.

O procedimento adotado para preparação de imunoglobulinas pode não

somente envolver químicos para uso alimentar, mas podem também ser simples,

de fácil uso e baixo custo (Akita e Nakai, 1992).

Akita e Nakai (1992) empregaram uma simples diluição em água para a

separação de proteínas do plasma em água solúvel de grânulos da gema de ovo.

Eles demonstraram que um dos fatores mais importantes que afetam a

recuperação de IgY é o pH.

32

A precipitação de sal (30% de pureza), ultrafiltração (>93% de pureza) e gel

filtração (>99% de pureza) é a seqüência recomendada. Mais de 100 mg de IgY

eletroforeticamente purificada foram rotineiramente obtidas de cada ovo.

Vantagens do protocolo incluem um procedimento simples e rápido, e a

habilidade para utilizar o resto de gema de ovo como um produto alimentar ou para

um fracionamento adicional de outros componentes biologicamente ativos. Isto

pode se facilmente utilizado para purificação de IgY em larga escala.

Fichtali et al. (1993) estudaram a purificação de imunoglobulina Y de gema

de ovo separada industrialmente, a qual foi diluída, e proteínas solúveis em água

separadas por sedimentação. O sobrenadante foi filtrado e aplicado para uma

coluna carregada positivimente, em um sistema de cromatografia automatizado.

Nakai (1996) desenvolveram um sistema de separação serial para isolar IgY

da gema do ovo. O primeiro passo para o isolamento de IgY envolve a e extração

de lipídios e lipoproteínas. Precipitação da gema do ovo usando polietilenoglicol,

acidificação ou métodos de diluição em água são comuns (Akita e Nakai, 1993).

O congelamento e descongelamento da gema e precipitação com gums e

solventes orgânicos também têm sido utilizados (Hatta et al., 1990). Uma vez os

lipídios tendo sido removidos da amostra, IgY é usualmente purificada pela

precipitação adicional usando polietilenoglicol ou sulfato de amônia (Polson, 1990).

Schwarzkopf (1994) comparou vários procedimentos para isolar a IgY. O

autor usou como material inicial várias gemas de ovos de uma galinhas imunizada

com imunoglobulina de cão (dog-Ig), e para cada procedimento de isolamento

(tabela 7) foram usados 40 ml de gema misturada.

Os isolados foram ajustados para volume final de 6 ml para comparar a

atividade dos anticorpos isolados em todos os métodos. Os procedimentos

analisados foram: método de diluição em água (WD) (Schwarzkopf, 1994),

precipitação com dextranfulfato (DS) (Jensenius et al., 1981), precipitação com

PEG (Polson et al., 1980) e precipitação com PEG e etanol (Polson et al., 1985).

33

Procedimento Proteína total IgY total IgY

específica

Título do ELISA antes da

cromatografia

WD 684mg/6ml

11.4%

445 mg

65%

9.7 mg

2.2%

1:128.000

DS 282mg/6ml

4.7%

278 mg

98%

6.0 mg

2.2%

1:8.000

PEG 42 mg/6ml

0.7%

32 mg

77%

0.8 mg

1.0%

1:2.000

PEG/ETANOL 258 mg/6ml

4.3%

246 mg

96%

5.4 mg

2.2%

1:32.000

Tabela 8. Comparação da eficácia de métodos usuais para o isolamento IgY da

gema do ovo de galinhas (Schade et al., 2000).

Em outra comparação entre vários procedimentos de isolamento de IgY da

gema do ovo, Akita e Nakai (1993) usaram uma mistura de gema de ovos com

anticorpos contra Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC), dividindo em 4 porções

de 20 ml como material inicial para 4 diferentes procedimentos de extração.

Foi feita uma avaliação não só do produto final, mas também do

intermediário. Os procedimentos analisados foram o método de diluição em água

modificado (WD) de Schwarzkopf (1994),

Precipitação com polietilenoglicol e etanol (PEG/ETANOL) (Polson et al.,

1985), método de Xanthan (Hatta et al., 1990) e precipitação com dextransulfato

(DS) (Jensenius et al., 1981). Os resultados foram similares aos apresentados por

Schwarkzopf, porém, foi dada uma atenção especial para o valor do pH da água

destilada, Akita e Nakai encontraram que a quantidade de IgY obtida fica em torno

de 55-60% quando o pH está neutro, enquanto que com o pH de 5.0-5.2 obtem-se

cerca de 92-96% de IgY.

Os autores de ambas investigações acreditam na simplicidade do método de

diluição em água em termos do tempo, material usado e manipulações.

34

2.2.8.1 Métodos comerciais

Baseado nos diversos métodos de extração de anticorpos, alguns métodos

são avaliados comercialmente na tabela 7.

EMPRESA KIT

Promega EGGstract®

Pharmacia Biotech gammaYolk

Clontech Protein L agarose beads

Biotez IMSORB Anti-IgY

Technogen Kaptiv-GY TM

Vyrusys corporation

Alpha Diagnostic International

Gradipore Gradiflow BF200

Pierce EggcelentTM

Affiland EGG YOLK IgY PURIFICATION KIT

Gallus Immunotech IgY EggsPress Purification Kit

Tabela 7. Kits para extração de IgY comercial.

2.2.8.1.1 Gradipore

O “gradiflow” é um instrumento de eletroforese preparativa versátil capaz de

purificar uma proteína marcada com base na sua carga e/ou peso molecular

(Horvath, 1994). A estratégia de purificação envolve a utilização de um tampão com

pH específico em conjunto com três membranas de poliacrilamida com tamanho de

poro apropriado para restringir o transporte de proteínas. O instrumento é

particularmente aplicável a anticorpos devido ao seu alto peso molecular e distinto

ponto isoelétrico (pI). O peso molecular da IgY é de 180.000 Da e seu pI de 6.5-7.5.

O instrumento é o Gradiflow BF200 (Gradipore, Sydney, Austrália).

35

2.2.8.1.2 Vyrusys corporation

A empresa purifica IgY utilizando o princípio da cromatografia de afinidade. O

princípio é requerido quando existe uma interação de imunoespecífica e,

freqüentemente somente um passo é requerido. Este método possui alta

seletividade, concentrando o anticorpo em pequenos volumes com alto índice de

pureza (99%).

2.2.8.1.3 Alpha Diagnostic International

O kit de purificação de anticorpos da gema do ovo de galinha foi

desenvolvido para extrair IgY da gema em aproximadamente 30 minutos, utilizando

1 ou 2 centrifugações. O kit pode ser usado para 6-8 ovos, um total de 70-100 mg

(6-8 mg/ml de gema) com aproximadamente 90% de IgY pura por ovo pode ser

obtida. Essa IgY pode ser testada por ELISA, Western blotting ou outros ensaios

imunológicos.

2.2.8.1.4 Promega

O sistema de purificação de IgY EGGstract® é um rápido e simples método

de isolamento da IgY total da gema do ovo de galinha. Utilizando o princípio da

precipitação e centrifugação, os anticorpos possuem uma pureza de

aproximadamente 90% e podem ser estocadas a 4oC por um ano.

2.2.8.1.5 Gallus Immunotech

Este método é baseado em dois passos. O primeiro remove a porção lipídica

e o segundo precipta a IgY. Possui 90% de pureza. Tem a expectativa de purificar

entre 4 e 7 mg/ml de gema de ovo. O processo dura em média 4 horas.

2.2.8.1.6 Affiland

O EGG YOLK IgY PURIFICATION KIT é de fácil manuseio. Baseado no

método de cromatografia de afinidade utiliza apenas quatro reagentes em um único

36

passo. Em cada ciclo podem ser usadas 5 gemas ou 20 gemas, dependendo do

tamanho da coluna, extraindo um total de 250-500 ou 1000-2000 mg/ciclo (1,5

horas).A coluna pode ser usada para aproximadamente 10 ciclos.

2.2.8.1.7 Pierce

O Pierce Eggcellent Purification Kit contém um único reagente de delipidação

que separa as proteínas do lipídio. Este reagente também pode ser usado para

estocar a gema do ovo no freezer por mais de 1 ano. Após a separação lipídica a

IgY pode ser obtida através de uma simples centrifugação.

Os kits das empresas Pharmacia Biotech, Clontech, Biotez e Technogen são

baseados no processo de cromatografia.

2.3 Uso terapêutico de anticorpos

No século XIX foi descoberto que o soro imune poderia ser usado no

tratamento de doenças infecciosas (Arturo, 1996).

No início do século XX, a soroterapia foi usada para o tratamento de uma

grande variedade de infecções bacterianas, incluindo as causadas pelo

Coryneobacterium diphtheriae, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitides,

Haemophilus influenzae, Streptococcus grupo A e Clostridium tetani (Casadavel et

al., 1994, 1995).

No início dos anos 30, a soroterapia foi largamente utilizada para pneumonia

lobar. Muitos experimentos demonstraram que a administração de soro específico

reduzia a morte de pacientes infectados com pneumococcus em aproximadamente

50% (Casadavel et al., 1994). Entretanto, quando a quimioterapia antimicrobiana foi

descoberta na metade da década de 30, a soroterapia para infecções bacterianas

foi rapidamente abandonada.

A quimioterapia antimicrobiana teve vantagens importantes sobre a

soroterapia, sendo mais efetivo e menos tóxico. Os efeitos colaterais imediatos da

soroterapia incluíam febre, resfriados e reações alérgicas (Rackmann et al., 1942;

37

Feinberg et al., 1936). Uma reação tóxica retardada da soroterapia foi denominada

“doença do soro”, a síndrome caracterizada por erupções cutâneas, proteinúria e

artralgia. Isto ocorria de 10% a 50% dos pacientes a qual recebiam soro heterólogo

e foi provavelmente causado pela formação de complexos imunes. Outras

desvantagens da soroterapia incluíam a necessidade de estabelecer um

diagnóstico preciso antes da seleção do soro e muita variação do soro. A

soroterapia pode falhar por causa da dosagem inadequada e de infecções

causadas por vários microrganismos (Colebrook et al., 1939). Produzir soros

terapêuticos foi muito caro por causa dos custos de manutenção animal, purificação

do anticorpo, armazenamento e padronização dos testes em camundongos.

Quando a quimioterapia antimicrobiana foi introduzida, foi expresso um

grande entusiasmo para combinar a soroterapia com a quimioterapia. O suporte

para a terapia combinado veio através de estudo com animais, a qual sugeriram

que a terapia combinada era mais efetiva do que qualquer uma utilizada

isoladamente contra muitos patógenos, incluindo Streptococcus do tipo A

(Colebrook et al., 1939), Pneumococcus (Branham et al., 1938) e Meningococcus

(McLeod et al., 1939), e algumas autoridades recomendaram a terapia combinada

para infecções graves (Sako et al., 1938). Entretanto, muitos estudos mostraram

que a terapia combinada não foi mais efetiva do que a quimioterapia sozinha e que

isto causava significantes efeitos colaterais (Cory et al., 1944). Conseqüentemente,

a soroterapia foi abandonada por não oferecer vantagens mensuráveis na eficácia

sobre a quimioterapia e teve substanciais desvantagens na implementação, custos

e toxicidade.

Hoje a terapia com anticorpos é indicada para algumas doenças infecciosas

em relativamente poucas situações, incluindo terapia de substituição em pacientes

imuno-deficientes, pós exposição profilática contra muitos vírus (raiva, sarampo,

hepatite A e B, varicela) e neutralização de toxina (tétano, difteria e botulismo).

Ironicamente, o abandono geral de anticorpos como agentes antimicrobianos foi

seguido pelo principal avanço na tecnologia de produção de anticorpos.

Em 1975, a tecnologia de hibridomas forneceu o significado para gerar

quantidades ilimitadas de anticorpos monoclonais (mAbs) (Kohler et al., 1975).

Atualmente, os principais avanços tem sido feitos na tecnologia usada para gerar

anticorpos humanos e Mabs humanizados (Wright et al., 1992).

38

A justaposição de três recentes desenvolvimentos marcam a reintrodução de

terapias baseadas em anticorpos uma opção para sérias considerações. Primeiro,

por causa dos avanços na tecnologia, anticorpos humanos reagentes podem ser

sintetizados, assim a toxicidade tradicionalmente associada com a soroterapia pode

ser evitada. Segundo, o surgimento de novos patógenos, a reemergência de velhos

patógenos e o aumento da incidência de microrganismos multiresistentes têm

causado a perda efetiva de opções terapêuticas. Terceiro, a dificuldade envolvida

no tratamento de infecções em pacientes imunocomprometidos.

O soro imune contém anticorpos de múltiplas especificidades e isotipos.

Problemas com o soro imune incluem, grande variação (Felton et al., 1918), pouca

quantidade de anticorpos específicos (Weisman et al., 1994) e alguns perigos na

transmissão de patógenos infecciosos (Slade et al., 1994). Preparações de

imunoglobulinas endovenosas comercialmente avaliadas obtidas de doadores

humanos diferem na sua capacidade de opsonização de patógenos comuns, tais

como Staphylococcus epidermidis, H.influenzae tipo B, S. pneumoniae,

Streptococcus grupo B e Escherichia coli. Em contrapartida, os mAbs são

imunoglobulinas homogêneas que, pela definição, reconhecem um único epítopo,

possuindo assim atividade específica maior do que anticorpos policlonais. Por

exemplo, 0.7mg de dois mAbs para toxina tetânica tem a mesma atividade do que

100 a 170mg de anticorpos policlonais (Lang et al., 1993).

A alta atividade específica do mAbs pode ser traduzida como maior eficiência

terapêutica. Formulações de mAbs são superior a de anticorpos policlonais em

homegeneidade, constância, atividade específica e possivelmente segurança. Para

algumas infecções, preparações policlonais podem ser superior a de mAbs por

causa da capacidade de reconhecer múltiplos epítopos.

As terapias baseadas em anticorpos podem, na teoria, ser desenvolvida

contra qualquer patógeno.

Anticorpos mediam funções antimicrobianas através de uma variedade de

mecanismos, incluindo inibição da fixação tecidual microbiana, aglutinação,

neutralização viral, neutralização de toxinas, citotoxidade celular mediada, ativação

de complemento e opsonização (Heinzel et al., 1995). Anticorpos são molecular

antimicrobianas extremante versáteis, alguns são ativados diretamente contra o

patógeno, alguns neutralizam a ação de produtos microbianos tóxicos e outros

39

aumentam a eficácia de células efetoras do hospedeiro (Delaet et al., 1993; Bobmer

et al., 1993). Apesar de todas as vantagens observadas o desenvolvimento de

anticorpos para uso comercial envolve sérias implicações éticas associadas ao

bem-estar animal.

2.3.1 Aplicações da IgY na medicina humana e animal

Muitas publicações tem descrito o sucesso do uso de anticorpos IgY em uma

variedade pesquisas (Blais et al., 2001; Behn et al., 2000; Yang et al., 1997;

Yamamoto et al., 1995; Williams et al., 2001). Imunoensaios baseados em IgY

estão sendo usados para medir a concentração de proteínas ou peptídeos via

ELISA, RIAs ou outros ensaios na clínica química ou pesquisa básica. Entretanto,

tem sido debatido recentemente entre pesquisadores de IgY o entendimento sobre

a imunopreciptação baseada em IgY ser difusa e não distinta como são as

baseadas em IgG. Este problema pode ser resolvido pelo uso de tampões com uma

alta concentração de sal (1.5 M NaCl com 5% PEG 6000; Behn et al., 2000) .

Anticorpos IgY são usados com muito sucesso em imunohistoquímica para a

detecção de antígenos de vírus, bactérias, plantas e animais, e também para

avaliar a incidência de parasitas intestinais em animais domésticos (Schniering et

al., 1995) e a contaminação de alimentos com toxinas ou drogas (Pichler et al.,

1998, 1999).

Durante a década passada, anticorpos IgY tem incrivelmente sido usados na

terapia ou profilaxia de doenças e também no novo conceito chamado de “alimento

funcional”. Recentes estudos tem comparado as propriedades de IgY e IgG

específicas originárias de animais imunizados identicamente. Os resultados

confirmam que os anticorpos IgY podem ser do mesmo modo que a IgG, mas

adicionalmente oferece vantagens em termos de especificidade, reatividade

cruzada, sensitividade e custo.

Tradicionalmente, as espécies de escolha para produção de anticorpos são

oriundas dos mamíferos, especialmente coelhos. Recentemente, o uso de galinhas

tem sido uma alternativa a produção de anticorpos policlonais. A IgY é o principal

40

anticorpo no soro de galinhas, mas este é transferido para a gema do ovo se

assemelhando a transferência placental ou colostral de IgG em mamíferos.

A atividade de transferência da IgY do soro para a gema induz o acúmulo de

altas concentrações do anticorpo na gema do que no soro.

Depois da inoculação das galinhas, anticorpos policlonais podem ser obtidos

de várias maneiras sem a retirada de sangue dos animais.

Algumas propriedades da IgY permitem a sua utilização em muitas reações

específicas, então esses anticorpos podem ser usados não somente para

diagnóstico, mas também para fins terapêuticos.

A imunização de aves ao invés de coelhos com antígenos de mamíferos

pode ser vantajosa, especialmente no caso antígenos conservados.

A IgY pode ser facilmente marcada com biotina, enzimas e fluorocromos.

O extrato de anticorpos IgY pode ser utilizado na imunodifusão radial

simples, no teste de imunodifusão de ágar gel duplo (Benedict e Yamaga, 1976),

imunoeletroforese (Friemel, 1991), Elisa direto e indireto (Rieger et al., 1996),

Western blotting (Nielsen, 1986), imunohistoquímica (Cuello, 1983),

imunofluorescência, radioimunoensaio (Vick, 1995) e fixação de complemento (OIE,

1996).

Schmidt et al. (1989) e Wiedemann et al. (1990) demonstraram que

anticorpos da gema, especialmente da gema crua, são protegidos do processo de

digestão.

Shimizu et al. (1988) mostrou a estabilidade de anticorpos purificados em pH

4.0.

Em animais jovens, enquanto o sistema digestivo não é totalmente funcional,

anticorpos administrados oralmente passam rapidamente e livremente pelo

intestino, então essa é a condição prévia para que o anticorpo tenha efeito local

contra a diarréia.

A vantagem deste tipo profilaxia imune ou terapia é que ações efetivas

podem ser feitas a qualquer momento. Esta reação é caracterizada por sua

velocidade e especificidade. Portanto, o uso da IgY em terapia de doenças

41

infecciosas se torna uma importante ferramenta para a indústria de saúde humana

e animal.

A administração oral de anticorpos específicos contra patógenos para o

estabelecimento de imunidade protetora pode se tornar uma importante alternativa

ao uso de antibióticos, especialmente em patógenos gastrointestinais.

O aumento do número de bactérias resistentes enfatiza essa necessidade.

Além disso, a imunoterapia pode ser usada como um tratamento complementar

contra patógenos que são dificultados para o tratamento tradicional de antibióticos.

Ovos são um componente normal da dieta e praticamente não existem riscos de

efeitos tóxicos da ingestão de IgY oral. Entretanto, é necessário ter precaução, pois

algumas pessoas são alérgicas.

Anticorpos administrados oralmente são sujeitos a desnaturação pela ação

do pH ácido do estômago e degradação de proteases, tais como pepsina e tripsina.

Estudos tem mostrado que parte dos anticorpos permanece intacta na digestão de

pepsina e tripsina, mas existe uma considerável clivagem dos anticorpos em Fab,

Fab’2 e Fc fragmentos. Entretanto, Fab’2 e Fab fragmentos ainda possuem

capacidade para se ligar aos antígenos, e conseqüentemente exibindo atividade de

neutralização.

O tempo de transição para a administração de anticorpos no trato

gastrointestinal está entre 12 e 36 horas em bebês e crianças. Em animais,

dependendo da espécie a taxa de passagem pode variar de 12 a 40 horas.

A IgY possui propriedades bioquímicas que lhe tornam uma imunoterapia

parenteral atrativa. Como mencionado anteriormente, não ativam complemento de

mamífero e não reagem com receptores Fc, isto evita o surgimento de resposta

inflamatória. Complementos ativados são potentes mediadores da inflamação.

A IgY tem sido produzida contra bactérias oportunistas, invasivas e

produtoras de toxinas (Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis e

Staphylococcus aureus) (Danielpour et al., 1995). A IgY afirmadamente interfere no

crescimento bacteriano, mas não previne o crescimento ((Bollen et al., 1998).

A administração oral de IgY tem sido desenvolvida para uma série de

microrganismos infecciosos em humanos e animais. Anticorpos IgY que passaram

pelo processo de “spray dried” específicos para Salmonella typhimurinum e

42

S.Dublin foram administrados oralmente e se demonstraram efetivos (Ebina et al.,

1990). Em humanos, existem trabalhos que demonstram a sua utilização, via oral,

para Streptococcus mutans.

Em infecções virais, os trabalhos se direcionam, principalmente, para o

rotavírus. Responáveis por gastroenterites em animais e humanos (Bartz et al.,

1980)

2.3.2 IgY para uso profilático ou terapêutico na medicina veterinária

Ovos ou gemas em liofilizadas tem sido usadas como uma alternativa

econômica para o tratamento de doenças entéricas na medicina veterinária. O mais

famoso exemplo do sucesso terapêutico/profilático usando IgY é o tratamento de

bezerros e leitões contra Escherichia coli (K88, K99 e 987P), rotavírus e

coronavírus (Amaral et al., 2002; Yokoyama et al., 1992; Mine et al., 2002). Os

grupos de Erhard (1996), Lösch (1996, 1991), Schade, Yoo, Yolken (1988) e Kuroki

(1993, 1997) tem efetuado grande parte dos estudos sobre IgY. Esses estudos

confirmaram que o tratamento de diarréia in bezerros e leitões com anticorpos IgY

específicos tem encontrado significante resultados profiláticos e terapêuticos

(Ikemori et al., 1997).

Kuroki (1993) protegeu camundongos de diarréia causada por rotavírus pela

administração de 2 l de solução de IgY por animal contendo um título de

neutralização de 1:10.240.

Pokorova (2000) usou IgY para proteger cães contra parvovírus canino, mas

acreditavam que a proteção resultava da interação entre IgY e componentes da

superfície do vírus.

Sunwoo (2002) demonstrou o efeito da inibição do crescimento da

Escherichia coli 0157:H7 pela ligação da IgY em antígenos de superfície da

bactéria, causando significantes mudanças na estrutura bacteriana. Outro efeito da

ligação da IgY em antígenos de superfície bacterianos é demonstrado através da

capacidade de impedir a fixação bacteriana no epitélio intestinal (Marquardt et al.,

1999; Lee et al., 2002). Então, administração terapêutica da IgY pode reduzir o uso

clínico de antibióticos, diminuindo o risco da formação de superbactérias.

43

Outra aplicação é o tratamento profilático de animais contra parasitas

intestinais. Devido a sérios problemas causados pela contaminação de carne com

drogas ou encefalopatia espongiforme bovina (BSE), consumidores estão

incrivelmente preocupados com a produção de alimentos sob condições biológicas

controladas.

Em sistemas de produção intensiva, animais estão em contato íntimo e direto

com outros animais, devido à alta concentração no confinamento, com isso o risco

por vias áreas e através do contato com fezes é muito alto, aumentando a

incidência, por exemplo, de infecções intestinais.

A IgY também tem sido usada para tratar algumas doenças de peixes de

criação (Salmão e Trutas), principalmente no Japão e na Escandinávia. Alguns

pesquisadores do Japão (Hatta et al., 1994) possuem grande experiência nesse

campo.

Recentemente, investigações tem sido iniciadas no uso de IgY para o

controle da “american foolbrood disease” (Terzolo et al., 2003), uma doença do

estágio larvar e pupal de abelhas (Apis mellifera), a qual é causada pela bactéria

esporulada, Paenibacillus larvae. A doença causa grandes perdas na Argentina,

com uma incidência de mais de 30%.

A maior dificuldade no controle e prevenção é com esporos da P. larvae, a

qual são resistentes para a maioria dos desinfetantes e antibióticos usados no

momento. Além disso, o uso indiscriminado de antibiótico é um sério obstáculo para

a produção e exportação de mel, por causa dos seus resíduos poderem gerar

resistência bacteriana, afetando a população humana.

Outra aplicação da tecnologia de IgY é o desenvolvimento de um ELISA para

quantificar uma proteína de 29KDa associada a gravidez (EPF) (Merkis et al., 2001,

2002). Por um ponto de vista econômico, isto é importante para saber

precocemente se houve fertilização ou não.

2.3.3 IgY para uso terapêutico ou profilático na medicina humana

A habilidade de aderência de muitos patógenos virais e bacterianos é o

principal pré-requisito para o sucesso da colonização, especialmente na mucosa

44

respiratório e intestinal, isto tem sido demonstrado através da ação de IgY contra

antígenos de Salmonella, inibindo a adesão desta bactéria as células do epitélio

(Lee et al., 2002).

Carlander (2000), Casswall (1999) e Sarker (2001) investigaram a ação do

colostro hiperimune bovino (HBC) contra rotavírus humano isolado de crianças

infectadas. A administração oral de anticorpos resultou em um significante efeito

protetor. Uma IgY anti-rotavírus humano (tipos Wa, RV5, RV3, ST3) também foi

efetiva, embora por um alcance mais baixo do que com HBC.

De acordo com outras opiniões, o uso de preparações com alto título de IgY

ou aumento da quantidade de anticorpos administrados, pode melhorar os

resultados (Yolken et al., 1988).

Proteção terapêutica através da IgY anti-Helicobacter pylori tem sido

investigada, no entanto os resultados não foram convincentes, provavelmente

devido a condições básicas desfavoráveis (Casswall et al, 1999; Shin et al., 2002).

De acordo com últimas evidências, a produção de anticorpos anti-H. pylori

usando um lisado bacteriano para imunização causou reação cruzada com outra

bactéria, isto pode ter diminuído o efeito profilático da IgY (Shin et al., 2003).

Carlander (2002a, 2002b) estudaram os beneficios da IgY contra doenças

infecciosas em pacientes com fibrose cística (CF), a doença genética comum mais

fatal da população caucasiana da Europa e E.U.A. A CF é causada por uma

mutação do gene de uma proteína canal, a qual resulta na secreção de um muco

anormalmente espesso. Isto permite o surgimento de infecções secundárias no

trato, causadas por muitas espécies de bactérias, uma das quais, Pseudomonas

aeruginosa, infecta quase todos pacientes CF.

Os pesquisadores tratam pacientes CF oralmente com uma solução aquosa

de IgY anti-P. aeruginosa (70ml, 0.7mg/ml IgY). O alto nível de anticorpos IgY

específicos pode ser demonstrado na saliva via ELISA, por aproximadamente 8

horas após o tratamento. Este tratamento foi um sucesso na redução de infecções

por P. aeruginosa em pacientes CF.

Uma proteção local efetiva contra formação de placa dentária foi feita

utilizando IgY anti-Streptococcus mutans (Chang et al., 1999; Hatta et al., 1997;

Smith et al., 2001; Otake et al., 1991). Esta proteção passiva foi claramente

45

mostrada em ambos voluntários humanos e ratos SPF. Imunização ativa contra

proteína B fixadora de glucano (GBP-B) em S. mutans, sob condições

experimentais, induziu boa proteção contra cáries dentárias. Esta proteção resulta

da continua secreção de anticorpos na saliva contra GBP-B, a qual previne a

acumulação de S. mutans no biofilme dental.

A proteção passiva da IgY é baseada no mesmo princípio. De fato, a

administração de IgY anti- S. mutans GBP-B via alimento e água de ratos

previamente infectados, causou uma significante redução na agregação de S.

mutans no biofilme dental. Em todos esses testes, uma correlação direta foi

encontrada entre a dose de IgY e a redução de cáries dentárias (Smith et al., 2001).

Além disso, o decréscimo na taxa de infecção de S. mutans não requereu contínua

administração de IgY (Cama et ali, 1991). Hatta (1997) avaliou a eficacia da

administração oral de IgY anti- S. mutans em voluntários, inibindo em 59% a

aderência da bactéria e conseqüente formação da placa.

Outra possibilidade para a aplicação oral de IgY específica pode ser com

infecções por Cryptosporidium parvums. Okhuysen (1998) observou uma

significativa proteção efetiva em voluntários oralmente tratados com HBC anti-

Cryptosporidium parvums. A administração oral da IgY correspondente pode

produzir efeitos similares (Tollemar et al., 1999).

LeClaire (2002) produziu anticorpos IgY contra a enterotoxina B

estafilocócica (SEB), para testar seu possível uso terapêutico. A SEB é considerada

um potencial agente para guerras biológicas, então existe uma necessidade para

desenvolver vacinas e agentes terapêuticos para intoxicação com SEB. Os autores

demonstram que a aplicação profilática e terapêutica de IgY anti-SEB protegeu

completamente camundongos e macacos rhesus.

Worledge (2000) demonstrou o efeito protetor após a administração oral de

IgY específica contra o fator de necrose tumoral (TNF) em um modelo experimental

de ratos. TNF é na patogênese de reações inflamatórias. O uso oral destes

anticorpos é considerada por ter menos efeitos colaterais sistêmicos do que

infusões endovenosas de anticorpos murinos humanizados anti-TNF.

O efeito protetor de IgY anti-veneno de cobra e escorpião tem sido mostrado

em camundongos (Thalley et al., 1990). Almeida (1998) encontrou resultados

similares, produzindo IgY contra veneno de Bothrops e Crotalus.

46

Investigações similares estão sendo feitas em Bangalore (Vital Mallya

Research Institute of Bengalore, Índia). O uso de IgY anti-veneno é vantajosa, por

causa dos poucos efeitos colaterais induzidos discutidos anteriormente (Devi et al.,

2002; Devi et al., 2002).

O grupo de pesquisa do professor Gómez (Universidad Nacional de La Plata,

La Plata, Argentina, resultados não publicados) tem produzido com sucesso IgY

específica contra toxina botulínica do tipo A, a qual tem sido usada para

imunoneutralização em modelos de camundongos.

2.4 Vantagens e desvantagens de anticorpos policlonais de aves

Existem diversos motivos para que os anticorpos extraídos da gema do ovo

de galinha possam ser utilizados ao invés dos anticorpos de mamíferos, alguns dos

quais podem ser discutidas nos itens que se seguem e mostrados na tabela 5.

2.4.1 Bem-estar animal

O mais importante objetivo do bem-estar animal é a redução de

manipulações dolorosas. A tecnologia de IgY para manutenção de galinhas é

usualmente menos onerosa do que a manutenção de coelhos. Além disso, a

produção de anticorpos de uma galinha corresponde a de um animal de grande

porte, tais como ovelhas ou cabras. Desta maneira, uma quantidade extraordinária

de anticorpos podem ser produzidas de uma única galinha, aproximadamente 17-

35 g do total de IgY/galinha/ano, das quais 1-10% pode ser específica par o

antígeno (tabela 10).

Esta enorme quantidade de anticorpos abrem as portas para novos campos

de aplicação da tecnologia de IgY, como por exemplo imunoterapias e em

imunoprofilaxia para muitas infecções virais e bacterianas na medicina humana e

animal. As vantagens do uso de anticorpos de galinha têm sido reconhecidas por

muitos autores (Schade et al., 1996; Carlander et al., 2002; Lösch et al., 1986;

47

Schade et al., 1991; Gasmann et al., 1990; Calzado et al., 2002; Camenish et al.,

1999; Carlander et al., 1999; Gottsein et al., 1985; Larsson et al., 1991).

2.4.2 Falta de reação cruzada com fatores reumatóides

Proteína C-reativa (CRP) pertence ao chamado grupo das proteínas de fase

aguda, a qual podem aumentar mais do que cem vezes o processo inflamatório.

O resultado de um ELISA, por exemplo, pode ser inexato devido a presença

de fatores reumatóides (RFs), a qual também são imunoglobulinas capazes de se

fixar a imunoglobulinas de outras espécies de mamíferos. Uma substancial

vantagem do uso da IgY é a inabilidade para reações cruzadas com RFs, por causa

da ausência do correspondente Fc localizado em sítios de ligação (Larsson et al.,

1991; Rieger et al., 1996).

2.4.3 Falta de reação cruzada com anticorpos humanos anti-camundongo

Anticorpos humanos anti-mouse (HAMAs) podem ser induzidos em

pacientes que receberam imunoterapia com anticorpos monoclonais de

camundongo (mABs). Conseqüentemente, existe uma interferência pelo HAMAs

em ensaios imunológicos baseados em mABs.

O desenvolvimento de outros anticorpos humanos contra outros mamíferos,

tais como, bovinos, eqüinos e caprinos, também tem sido reportados (Kricka et

al.,1999). Estes resultados em níveis significantes de interferência no diagnóstico

clínico. Por exemplo, somente fragmentos Fab são usados em alguns ensaios, para

evitar a ligação de sítios localizados no fragmento Fc.

Outro enfoque é o uso clínico de anticorpos humanizados, a qual mudam o

fragmento Fc original pelo correspondente humano. Anticorpos de galinha

específicos podem ser usados como alternativa nestes ensaios.

48

2.4.4 Distância filogenética

Como a diferença entre o antígeno e o animal imunizado aumenta, a

resposta imune usualmente também. Existe uma grande diferença filogenética

entre mamíferos e aves. Esta extensão evolucionária existente faz com que não

haja reação cruzada entre a IgY e a IgG (Mohammed et al., 1998). Como resultado,

galinhas são a melhor escolha para a produção de anticorpos policlonais.

A distância filogenética é a razão para a freqüentemente descrita diferença

entre anticorpos específicos de mamíferos e galinhas. Muitos autores têm

demonstrado que galinhas sempre produzem anticorpos contra antígenos

filogeneticamente altamente conservados de mamíferos mais eficientemente do

que coelhos (Larsson et al., 1990). Como conseqüência, um antígeno conservado

pode permanecer “oculto” para o sistema imune dos coelhos, e então causar

somente uma fraca resposta (Hau et al., 1980, 1981).

2.4.5 Ativação do sistema complemento

Em laboratórios clínicos, muitas análises são feitas em amostras de soro.

Uma amostra de soro contêm atividade do sistema complemento, mas a atividade

declina durante a estocagem e o manuseio (Carlander et al., 2002). A atividade do

sistema complemento pode variar entre diferentes pacientes e também entre

diferentes amostras do mesmo paciente.

Para evitar a ação do sistema complemento o EDTA é sempre incluída em

tubos usados para a coleta de sangue.

O EDTA previne a coagulação pelo seqüestro de íons de cálcio requeridos

para a coagulação. Muitos padrões e controles usados tem sido estocados e

contem um sistema de complemento inativo. Estas diferenças na atividade entre as

amostras e os padrões poderão causar resultados errôneos.

Anticorpos de mamíferos se fixam a fase sólida e complexos antígeno-

anticorpo contendo anticorpos de mamíferos a qual ativarão o sistema

complemento (Gross et al., 1990). O C4 ativado se liga a região Fab da IgG e pode

interferir com a fixação do antígeno (Schade et al., 1991).

49

Componentes do complemento podem também solubilizar complexos imune

precipitados (Davalos-Pantoja et al., 2000, 2001).

Anticorpos de galinha não são capazes de ativar o sistema complemento de

mamífero, portanto podem ser usadas para reduzir a interferência pela ativação do

complemento (Hatta et al., 1993).

2.4.6 Interação com receptor Fc bacteriano

Proteína A estafilocócica e a proteína G estreptocócica de bactérias são

muito usadas pela sua habilidade para fixar IgG. O Staphylococcus e Streptococcus

são freqüentemente encontrados em amostras bacterianas. Quando presentes,

eles podem se ligar a anticorpos específicos para outras bactérias causando assim

um resultado falso positivo. Anticorpos de galinha não se fixam a proteína A ou G e

podem ser usados para reduzir interferências devido aos receptores Fc de

bactérias (Calzado et al., 2001; Leenars et al., 1999; Gassmann et al., 1990).

IgG de coelho IgY de galinhas

Método de coleta Invasivo Não invasivo

Quantidade de anticorpo 200mg/40ml de

sangue

5-100mg/ovo; 5-7

ovos/semana

Quantidade de anticorpo por mês 200mg Aproximadamente 1000-

2800mg

Interferência com imunoglobulinas de

mamíferos (fator reumatóide)

Sim Não

Interferência com HAMA Sim Não

Interferência com complemento de

mamífero

Sim Não

Ligação com proteína A ou G Sim Não

Tabela 5. Características de anticorpos de mamíferos comparados com de

galinhas, adaptado de Schade et al.(2005).

HAMA, anticorpos anti-mouse humanos.

50

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ARTIGOS CIENTÍFICOS

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Considerations on the stability of IgY antibodies anti-tetanus toxoid.

1Marco Cesar Cunegündes Guimarães, 1Livia Gomes Amaral, 1Franz Viana Borges,1Hugo Paes Leme Vieira, 2Claudia Gomes Fernandes Matta, 1Marcos Fernando de

Rezende Matta

1Laboratório de Melhoramento Genético Animal, Centro de Ciências e Tecnologias

Agropecuárias, Setor de Imunogenetica, Universidade Estadual do Norte

Fluminense Darcy Ribeiro, Av. Alberto Lamego 2000, Campos dos Goytacazes, RJ,

Brazil, Zip Code 28013-620.

2HY Biotecnológica S.A., Av. Nilo Peçanha 307, Pq. Santo Amaro, Campos dos

Goytacazes, RJ, Brazil, Zip Code 28030-035.

#Corresponding author:

Marco Cesar Cunegundes Guimaraes1Laboratório de Melhoramento Genético Animal, Centro de Ciências e Tecnologias



Brazil,E-mail: [email protected]

Tel: + 55 22 2726-1544

Running title: IgY polyclonal antibodies for the measurement of tetanusantitoxin levels

mailto:[email protected]

81

Abstract

Tetanus is an acute, occasionally fatal, disease of the central nervous system,

caused by the toxin of the tetanus bacterium Clostridium tetani. The current

techniques used in the diagnosis and therapeutics of tetanus diseases employ

monoclonal antibodies produced in mouse. The use of monoclonal antibodies has

several advantages such as homogeneity and specificity. In contrast, a remarkable

characteristic of polyclonal antibodies, especially the immunoglobulin class IgY,

which is obtained from poultry, is obtained in greater amount than IgG antibodies.

Therefore, the alternative production of IgY polyclonal antibodies against tetanus

toxoid in chicken is of great interest for immunology industry in therapeutic and

diagnosis. In this work, IgY polyclonal antibodies against tetanus toxoid were

produced through immunization of chickens with isolated toxoid and measured by

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The effect of storage temperature on

the stability of chicken IgY was measured through indirect ELISA. Results showed

that the IgY antibodies were produced with success and easily isolated. Was show

that the kinetics of IgY and we observe that yolk IgY was greater than serum IgY.

The time and temperature influence was measured in both antibodies through

indirect ELISA and yolk IgY are more resistant than serum IgY. Altogether, the

results indicate the use IgY polyclonal antibodies purified from chicken as an

alternative for the detection of the tetanus toxin with potential applications in

diagnosis and treatment of infectious diseases.

Keywords: IgY antibody, tetanus toxoid, Clostridium tetani, ELISA, stability

82

Introduction

Tetanus is an acute, often fatal, disease caused by an exotoxin produced by

Clostridium tetani. The C.tetani is a slender, gram-positive, anaerobic road that may

develop a terminal spore [1]. The bacterium is sensitive to heat and cannot survive

in the presence of oxygen [2-4]. The spors, in contrast, are very resistant to heat

and the usual antiseptics [5,6]. They can survive at 121oC (249.8oF) for 10-15

minutes. The sporses are also relatively resistant to phenol and other chemical

agents. The spores are widely distributed in soil and in the intestine and feces of

horses, sheep, cattle, dogs, cats, rats, guinea pigs and chickens [5,6]. The C.tetani

produce two exotoxins, tetanolysin and tetanospasmin. The function of tetanolysin is

not known with certainty. Tetanospasmin is a neurotoxin and causes the clinical

manifestations of tetanus [7]. Tetanospasmin is one of most potent toxin know. The

stimated minimun human lethal is 2.5 nanograms per kilogram of body weight.

C.tetani usually enters the body through a wound. In the presence of anaerobic (low

oxygen) conditions, the spores germinate. Toxins are produced, and disseminated

via blood and lymphatics [8]. Toxins act in several sites within the central nervous

system, including peripheral motor and plates, spinal cord, brain and sympathetic

nervous system. The typical clinical manifestations of tetanus are caused when

tetanus toxin interferes with release neurotransmitters, blocking inhibitor impulses.

This leads to unopposed muscle contraction and spasms. Seizures may occur, and

the autonomic nervous system may also be affected [9,10]. For the treatment,

serum anti-tetanic is recommended for persons with tetanus. The serum can only

help remove unbound tetanus toxin. It cannot affect toxin bound to nerve endings. A

single intramuscular dose of 3.000-5.000 UI is generally recommended for children

and adults [11,12]. In generally, this serum is a IgG of mammals [13]. Traditionaly,

mammals such as horses, sheep, pigs and also rabbits and guinea pigs, were used

for the production of polyclonal antibodies, while mice and rats were used as a

source of spleen for the production of monoclonal antibodies. Both techonologies

also involve some steps each of wich causes distress to the animals involved [14].

Using chickens as the immunization host brings a number of advantages to antibody

production, the most apparent being the non-invasive collection of antibodies. As

described more than 100 years ago, avian maternal antibodies are transfererred

from serum to egg yolk to confer passive immunity to embryos and neonates [15].

IgY antibody production exploits this by taking the antibodies from the egg yolk,

83

hence the term immunoglobulin of egg yolk (IgY). Another advantage is the

enhanced immunogeneity conserved mammalian proteins exhibit in birds due to

their phylogenetic distance [16]. The yield of IgY antibodies can be compared to that

of IgG antibodies obtained by convetional immunization methods; 200 mg of IgG

can be obtained monthly, with approximately 5% constituting the specific antibody.

In the case of chicken, approximately 1500 mg of IgY can be harvested each month,

and between 2 and 10% is the specific IgY [17]. Taken together, chicken antibody

collection and isolation can be described as noninvasive, rapid and economical [18].

Chickens polyclonal antibodies were produced against a number of antigens and

were applied in many different methods for various purposes as a research,

diagnostic, therapeutic reagents, as a tool for purification or detection of antigens

and as a protective agent in passive immunization [19].

The present study describes the development of chicken egg yolk antibody

against tetanus toxin, as well your stability in different time and temperature.

84

Material and Methods

Cell culture and obtainment of Tetanus toxoid: Tetanus toxoid at a protein

content of 780 g/ml were kindly provided by Hertap laboratories, department of

microbiology, Juatuba-MG, Brazil. Especify the cell line for the obtainment of the

toxoid was maintained in ATCC medium number 1053 (Oxoid CM149).

Tetanus antitoxin. The tetanus antitoxin used in this study was IgY obtained

of immunized chickens. The IgY was extracted of serum and egg yolk.

Immunization of chicken. Six 12 weeks old With Leghorn hens were

immunized with tetanus toxoiD. The first immunization was conduced by

intramuscular injection with 1 ml (0.5 mg/ml) of antigens (500 l) in phosphate saline

buffer (PBS at pH 7.2) with an equal volume of adjuvant aluminum hydroxide

(61,5mg/ml 1mM). The second inoculation was conducted at a 1 week interval after

the first inoculation. Second inoculations were given through the same route with the

0.5 mg of antigen with two volumes of aluminum hydroxide (500 l) with a 2 weeks

interval after the first inoculation. After the second immunization, a booster

inoculation was conducted 4 weeks intervals after the first inoculation without

aluminum hydroxide.

Egg yolk separation and extraction of IgYThe IgY extraction procedure was performed by a method previously

described by Hatta et al [20].

Briefly, the egg yolk was separated from the white and the liquid content

inside the membrane of four eggs was pooled. The yolk content was mixed with the

same volum of distilled water and 0.1% of carrageenan solution (Sigma Chemical,

Type IV, St Louis, U.S.A) was added. The mixture was incubate for 30 minutes at

room temperature. The solution was centrifuged at 6000 rpm for 20 minutes. The

supernatant was filtrated through a 0.2 m membrane filter. A volume of the IgY

extract was used immediately and anothers stored at 41oC, –20oC and -70 oC before

use [20,21].

85

Extraction of IgY from serum

The blood was collected with EDTA and centrifuged at 1500 rpm for 10

minutes to obtain the IgY from serum.

Immunological assays. The titers of IgY were screened by indirect enzyme-

linked immunoabsorbent assay (ELISA). The ELISA was adapted of the Farzad and

Gupta [22,23]. The plate was cote with 100 l antigen in the appropriate dilution to

each well and then incubated overnight at 40C. After the incubation, the plates were

washed three times with 150 l PBST 0.05%. For blocking unspecific binding, the

plate was incubated with 0.5% gelatine in PBS, 200 l/well and then washed as

described above. The first antibody (IgY) diluted 1:1000 in PBST was added (50 µl

per well), incubated for 1h at 41oC and washed. The second antibody (anti-chicken

enzyme conjugated) diluted 1:3000 in PBST was added (50 l per well), incubated

for 1h at 41oC, washed three times with PBST and incubated with 50 l 2,2’-azino-

ethyl-benzthizoline-6-sulfonate (ABTS) substrate solution (KPL, Maryland, U.S.A.).

After 30 min incubation at room temperature, the reaction was stopped by adding

0.1% sodium dodecyl sulphate (SDS) solution and optical density (O.D.) was

measured at 490 nm.

86

Results and Discussion

Production of IgY to tetanus toxoid: Eggs were produced up to 40 weeks after

the first inoculation of chicken with tetanus toxoid. Although IgY titers were

increasing after second inoculation. The kinetics of IgY production was showed by

ELISA. The IgY antibody was extracted of the serum and yolk. The serum and egg

yolk were collected after inoculation and separated for weeks. Before the first

extraction, the serum and egg yolk were stored to 41oC, -20oC and - 70oC and

analyzed by time in this temperatures. In the figure 1 the immune response of

chickens was showed by levels of IgY antibody in the serum and egg yolk. The

antibody production in egg yolk was higher when compared to serum. The IgY from

egg yolk remained for a long time with high title and the levels of IgY from serum

decreased more intensely. This kinetics characterizes the antibody production in

chickens [14].

Effect of storage temperature on the stability of chicken IgY: IgY antibodies

have been stored for over 10 years at 4 degrees C without any significant loss in

antibody activity. Chicken antibodies have also retained their activity after 6 months

room temperature or 1 month at 37 degrees C. In the present study the effect of

storage temperature on the activity of IgY antibody was measured by indirect

ELISA. Generally, proteins are best stored at 4°C in clean, autoclaved glassware

or polypropylene tubes. There is a great relation between time and temperature. In

the graphic 2 and 3, was showed that the activity of IgY antibody of egg yolk has a

decrease proportional to the time.

In this study, we described the development of chicken egg yolk antibody

against tetanus toxoid for use in diagnosis and therapeutics. The antibody levels

were measured by indirect ELISA. The recovery of IgY activity after the freezing and

heating in –20ºC, –70ºC and 41oC, for one, two and three months was measured.

We can observe that there is the possibility to produce the IgY antibody, using your

differences above the mammals antibodies and then storage in low temperatures for

many time. These antibodies can be used in several researches.

87

Conclusion

The heat and freezing stability were evaluated by indirect ELISA after

incubation the antibodies for some time in different temperatures.

In conclusion, the results from the present study indicated that egg yolk

antibody are resistant in many different situations, and your stability under this

conditions can be due the components of the egg yolk that protected IgY against

this effects.

88

Acknowledgments

We express our sincere gratefulness to the professor Han Sang Yoo at Soul

National University and to the doctor Arinos Romualdo Viana at the Hertape Calier

Saúde Animal. We work was supported by Faperj and Uenf.

89

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92

0

0,5

1

1,5

2

1 2 3 4 5 6 7 8 9

WEEKS

OPT

ICA

L D

ENSI

TY(4

90 n

m)

SERUM YOLK CONTROL

Figure 1. Kinetics of antibody titres produced by inoculation of tetanus toxoid inlaying chickens. The IgY isolated for serum and yolk and tested by indirect ELISAusing tetanus toxoid as antigen and expressed as ELISA value (OD at 490 nm).Values are the mean of four samples. The vertical bars are due the standarddeviation. The black arrow showed the immunizations.

93

0

0,5

1

1,5

2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

WEEKS

OPT

ICA

L D

ENSI

TY (4

90nm

)41ºC (1 Month) 41ºC (2 Month) 41ºC (3 Month)

Figure 2. The recoveries of biological activity of IgY against tetanus toxoid whenstored at 410C for 1, 2 and 3 months. The values are means of four samples. Thevertical bars indicate the standard deviation.

94

0

0,5

1

1,5

2

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Weeks

Opt

ical

Den

sity

(490

nm

)

-20ºC (1 MONTH) -20ºC (2 Month) -20ºC (3 Month)

figure 3. The recoveries of biological activity of IgY against tetanus toxoid when

stored at –20 0C for 1, 2 and 3 months. The values are means of four samples. The

vertical bars indicate the standard deviation.

95

0

0,5

1

1,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Weeks

Opt

ical

Den

sity

(490

nm

)

-70ºC (1 MONTH) -70ºC (2 Month) -70ºC (3 Month)

Figure 4. The recoveries of biological activity of IgY against tetanus toxoid when

stored at –70 0C for 1, 2 and 3 months. The values are means of four samples. The

vertical bars indicate the standard deviation.

96

Efficient production of chicken egg yolk antibodies against a

canine distemper virus

1Marco Cesar Cunegundes Guimaraes, 1Livia Gomes Amaral, 1Franz Viana Borges,1Hugo Paes Leme Vieira, 1Marcos Fernando de Resende Matta

1Laboratório de Melhoramento Genético Animal, Centro de Ciências e TecnologiasAgropecuárias,Setor de Imunogenetica, Universidade Estadual do NorteFluminense Darcy Ribeiro, Av. Alberto Lamego 2000, Campos dos Goytacazes, RJ,Brazil, Zip Code 28013-620.


Marco Cesar Cunegundes Guimaraes3Laboratório de Melhoramento Genético Animal, Centro de Ciências e TecnologiasAgropecuárias,Setor de Imunogenetica, Universidade Estadual do NorteFluminense Darcy Ribeiro, Av. Alberto Lamego 2000, Campos dos Goytacazes, RJ,Brazil,E-mail: [email protected],Tel: 55 22 2726-1544

Running title: Canine distemper virus, egg yolk antibody and ELISA.


97

Abstract

The canine distemper virus (CDV) is an important ….

Immunization of chickens with CDV results in the production of antibodies

specific. However, there is relatively limited information available concerning

immune response of CDV in this species. In the present study, immune response

was examined in serum and egg yolk from laying hens injected with CDV. The

results demonstrated that the increase of antibody activity occurs first in the serum,

and then in egg yolk with a lag in time of 1 to 3 week in the chickens. However, the

time of elevated levels of antibody activity was much shorter in serum than the egg

yolk.

Keywords: Canine distemper virus, egg yolk antibody and ELISA.

98

Introduction

Canine distemper virus (CDV) is a highly contagious disease of carnivores

caused by a paramyxovirus. The virus is widespread and mortality in juveniles is

higher than in adults (Appel, 1969), is classified as morbilliviruses in the

paramyxoviridae family. The virus is enveloped and contains a negative sense

single stranded RNA and a RNA polymerase. The lipoprotein envelope is readily

destroyed by lipid solvents wich renders the virus-non infectious (James, 1999). The

CDV is very resistant to cold and the majority of distemper cases in domestic dogs

are seen in the fall and winter (Greene, 1998). Transmission occurs via an aerosol-

droplet route, direct contact, or possibly by contact with contaminated objects

(Appel, 1982). The CDV is shed in the feces and urine of infected individuals and

some evidence exists for transplacental transmission. The usual route of infection is

through the upper respiratory tract, following inhalation of infective virus (Krakowka,

1985). Occasionally infection occurs from ingestion of infective material. Following

entry into the upper respiratory tract, the virus is spread to the tonsils and lymph

nodes, where viral replication occurs (Appel, 1987). The virus then enters the blood

stream where it is transported to epithelial cells throughout the body, including the

intestinal and respiratory tract (Summers, 1984). Typical signs of canine distemper

seen in the domestic dog include respiratory and intestinal problems such as

coughing, diarrhea, vomiting, nasal and ocular discharge, anorexia, and

hyperkeratosis of the nasal planum and footpads. Central nervous system signs

may follow the above clinical signs (Vandevelde, 1982). In wild carnivores, signs of

abnormal behavior and apparent lack of fear, suggestive of rabies, may be the only

signs grossly visible. In many countries the diagnosis is based on clinical signs, but

can be made by ELISA, kits one step, immunocytochemistry, viral isolation,

Polymerase Chain Reaction (PCR) and Cerebrospinal (CSF) Analysis (Appel,

1999). Antibodies presently available for research, diagnostic and therapies are

mostly mammalian monoclonal or polyclonal antibodies. Traditionally, bigger

animals such as horses, sheep, pigs and also rabbits and guinea pigs, were used

for the production of polyclonal antibodies, while mice and rats were used as source

of spleen for the production of monoclonal antibodies (Narat, 2003). The major

problem of monoclonal antibody production is that some antigens are weakly or not

at all immunogenic for mice, moreover, both monoclonal and polyclonal antibodies

technologies involve some injury of animals involved, such as the immunization,

99

collecting of blood samples and bleeding (or sacrifying for spleen removal) (Chilow

et al., 2000). Therefore, the development of alternative methods for the production

of antibodies is necessary. In this case, the use of chickens for antibody production

represents a new way for the animal and human industry. This work showed the

alternative way for antibody produce against the canine distemper virus by using

chicken egg yolk antibody.

100


Canine distemper virus

The canine distemper virus (CDV) strain Snyder Hill (ATCC® Number: VR-526TM)

was obtained from the ATCC (The Global Bioresource Center). The viral amount

was determined by protein concentration with Bio-Rad protein assay (Bio-Rad

Laboratories) and then samples were frozen at –70oC.

Preparation of Immunogens

The viral suspension composed of 300 ng of CDV in 500 l de PBS at pH 7.2 was

mixed with 500 l of the alhydrogel (aluminum hydroxide Al(OH)3) as adjuvant

(Accurate Chemical & Scientific Co, Westbury, New York) for the first injection. The

others three inoculations were made of the same way.

Immunization of Hens

Six White Leghorn laying hens of twenty five-week-old from the North Fluminense

State University were used for this immunization. The chickens were keeping in

individual cages with water and food ad libitum. The first immunization was

conducted by injecting 1.0 ml of the mix of viral suspension and adjuvant into the

pectoral muscle. The second and third inoculation was carried out 1 and 3 weeks

after the first inoculation. The last inoculation was made at 6 weeks after the first.

Eggs and blood collection

The blood and eggs were collected all week after the first immunization. The

collected eggs were stored at 4oC for extraction of IgY. The blood was collected with

0.1% sodium citrate as anticoagulant, after this the blood was centrifuge at 1500

rpm to 15 min for separate the plasma. Both were analyzed by indirect ELISA.

Extraction of Egg Yolk Antibody

Eggs were collected from hens immunized all days after the first inoculations and

then sorted by week. Egg yolk antibodies were extracted using chloroform (Shin and

others, 2001a and 2001b). For this, the egg yolk was separated from the egg white

and homogenized after mixing with an equal volume of PBS. The homogenized egg

yolk was then mixed with two volumes of chloroform and incubated for 2 hours at

room temperature. After this incubation, the supernatant was collected and stored at

–70oC (Shin and others, 2002).

ELISA ASSAY

The chicken egg yolk antibodies (IgY) titers and the canine parvovirus in fecal

material were measured by indirect ELISA. For the IgY titers, was used the original

101

canine parvovirus of the ATCC and the canine parvovirus in fecal material. Ninety-

six well microplates (Dynatech laboratories, Inc.) were coated with 100 l of canine

parvovirus (200 ng/ml) isolated of fecal material diluted in coating buffer by

overnight incubation at 4oC. After the incubation, the plates were washed with 150 l

PBS/0.05% Tween 20 (wash buffer) three times, blocked with 0.5% gelatine in PBS

(pH 7.2), 200 l per well, 1 h at room temperature, and washed with wash buffer

three times. Then, was added 50 l IgY anti-CPV(diluted in PBST 1:1000) suitably

diluted to each well and incubated at room temperature for 1 h, washed the plate

with wash buffer three times. After the washing, 50 l (diluted in PBST 1:5000)

rabbit anti-chicken IgG conjugated with horseradish peroxidase (Biomeda

Corporation) suitably diluted was applied to each well of the plate and incubated at

room temperature for 1 h. Substrate, 2,2-azino-bis (3-ethylbenz-thiazoline-6-

sulfonic acid) (Sigma Co.) was added into each well of the plate. Optical densities at

405 nm were measured with a microplate ELISA reader after stopping of the

reaction with 2 M HCl solution.

102


Yield and purity of egg yolk IgY

The immune response of laying hens against CDV were monitored by

measuring antibody activities in serum and egg yolk by ELISA. In serum the level of

activity of anti-CDV (graphic 2) sharply increased after the first immunization,

became highest at 28 day. The level was maintained up to 7 days and decreased

therefore. The short time which the level of IgY in the serum remained high could be

due adjuvant, antigen concentration and genetic of animals (Allison et al., 1986).

However, the transport of IgY from maternal serum to the offspring is other

determinant factor (Rose et al., 1974). For this reason, the level of antibody IgY

activity in yolk stared to increased 10 days after first immunization. The lag in time

between serum and egg yolk antibody was approximately 1 week. The antibody

activity became highest at 63 day, and remained relatively constant up to 7 days.

This suggests that the activity of anti-CDV IgY can be maintained much longer in the

yolk than in the serum. Similarly, Shimizu (1988) and Sunwoo (1996) in a study of

immunized hens with lipopolysaccharide (LPS) showed that the maximum level of

anti-LPS antibody activity in the yolk persisted longer than in the serum.

103

Conclusion

In conclusion, immune response of chickens were studied with canine

distemper virus as antigen. The chickens produced antibodies and were analyzed

by ELISA. The results showed the importance of create the alternative way for the

diagnosis and therapeutic use.

104

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106

0

0,5

1

1,5

2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

WEEKS

OPT

ICA

L D

ENSI

TY(4

90 n

m)

YOLK CONTROL

Graphic 1. Antibodies titres against canine distemper vírus in the egg yolk of laying

hens immunized. The vertical bars indicate the standard deviation. Arrows indicates

the time of booster injection of CDV.

107

0

0,5

1

1,5

2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

WEEKS

OPT

ICA

L D

ENSI

TY(4

90 n

m)

SERUM CONTROL

Graphic 2. Antibodies titres against canine distemper vírus in the serum of laying

hens immunized. The values are means of four samples. The vertical bars indicate

the standard deviation. Arrows indicates the time of booster injection of CDV.

108

00,20,40,60,8

11,21,41,6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Weeks

Opt

ical

Den

sity

(490

nm

)YOLK SERUM

Graphic 3. Changes of antibody activity in chicken serum and egg yolk during the

immunization period. Anti-CDV antibody activities in serum and egg yolk were

measured by indirect ELISA using the CDV as an antigen and are expressed as

ELISA abosorbance at 490 nm for serum and egg yolk at 1:1000 dilution. The

values are means of four samples. Vertical bars indicate the standard deviation.

Arrows indicates the time of booster injection of CDV.

109

Detection of canine parvovirus in feces by chicken eggyolk antibody

1Marco Cesar Cunegündes Guimarães, 1Livia Gomes Amaral, 1Franz Viana Borges,1Hugo Paes Leme Vieira, 2Arinos Romualdo Viana, 1Marcos Fernando de Rezende

Matta





2Hertape Calier Saúde Animal S/A, Rodovia MG-050 Km 4 Distrito Industrial,

Juatuba-MG, Cep:35675-000



Running title: Canine parvovirus, egg yolk antibody and ELISA.


110

Abstract

Canine parvovirus (CPV), cause an intestinal disease characterized by bloody

diarrhea, is often fatal in puppies. The virus is transmitted by contact with infected

dogs or their feces. The virus is very stable in the environment and may survive for

several months in contaminated areas. The CPV attacks the rapidly diving cells of

the bone marrow and the small intestine. Several laboratory tests have been

developed and are available for specific viral diagnosis. Where facilities are

available, rapid diagnosis can be made by electron microscopy (EM) of fecal

material from cases with typical signs of disease. The virus also can be isolated in

several feline and canine cell lines such as canine and feline kidney cells, but

isolation is seldom used in practice since cell cultures are required and at least 1

week for results is required. Fecal hemagglutination-hemagglutination (HA-HI) tests

have provided a simple and rapid method for detecting virus in fecal and tissue

samples and are employed by several diagnostic laboratories, however the HA test

is less sensitive than EM or enzyme-linked immunoassays (ELISA). In this work, the

laying chickens are immunized with the canine parvovirus strain Cornell 780916-80

and the egg yolk antibody (IgY) isolated and characterized by indirect ELISA to

detect canine parvovirus in feces.

Keywords: Canine parvovirus, egg yolk antibody and ELISA.

111

Introduction

Canine parvovirus is a highly contagious and serious disease caused by a virus that

attacks the gastrointestinal tract of puppies, dogs, and wild canids (Pollok and

others, 1984). This family consists of small non-enveloped DNA virus (Appel and

others, 1987). Two distinct parvovirus (CPV) (Hoskins and others, 1998), are now

known to infect dogs, the pathogenic CPV-2, cause a several enteritis, which was

recognizes in 1978, and the CPV-1 (MVC) (Binn et al., 1970). The MVC, a

completely different parvovirus, had not been associated with natural disease

(Siegel and others, 1984). MVC may cause pneumonia, myocarditis and enteritis in

young pups, or transplacental infections in pregnant dams, with embryo resorptions

and fetal death (Parrish and others, 1997). CPV-2 infects dogs and other canidae.

There are two types of CPV-2 (CPV-2a and CPV-2b). Because the infection is easily

spread among susceptible animals, rapid diagnosis is essential for disease control

and proper treatment (Yoshio et al., 1984). CPV replicates in several lymphoid

tissues and the instestinal epithelium of dogs, therefore, great amounts of

parvovirus are found in the feces of infected dogs (Carmichael et al., 1981). The

diagnostic this pathology can be made by electron microscopy (EM) of fecal material

from cases with typical signs of disease, fecal hemagglutination-hemagglutination

inhibition (HA-HI) tests have provided a simple and rapid method for detecting virus

in fecal and tissue samples (Teramoto and others, 1984), however the HA test is

less sensitive than EM or enzyme-linked immunoassays (ELISA). The HA assay is

recommended test for detection of parvovirus in feces (Appel and others, 1979;

Gordon and others, 1982; Lutz and others, 1983; Rice and others, 1982), however,

can be affected by certain factors in the fecal material resulting in nonspecific

agglutination (Gordon and others, 1982; Lutz and others, 1983; Rice and others,

1982). The specificity of the agglutination should be confirmed by an HI assay

(Gordon and others, 1892).

Recently, a competitive ELISA has been described that showed very good

correlation with HA results (Yolken and others, 1983). In general, these ELISA are

made with monoclonal (mAbs) or polyclonal antibodies of mammals.

Chicken egg yolk antibody (IgY), has been extensively studied to substantiate

its effective use in diagnosis (Schade and others, 2005) and for passive

immunization (Leslie and Clem, 1969; Shimizu and others 1988; Wiedmann and

others 1991; Yokoyama and others, 1993; Rose and others, 1974 and 1981). There

112

are several advantages of using IgY. IgY can be easily isolated from egg yolk by the

water-dilution method on a large scale without using any chemicals or organic

solvents (Jensenius and others, 1981; Kwan and others, 1991; Akita and Nakai,

1993). It is relatively stable under various conditions, including heat, pressure,

alkalinity and acidity (Shimizu and others, 1988, 1992, 1994).

In this work we used the IgY for prepare a indirect ELISA for to detect the

canine parvovirus in fecal material of dogs clinically sick. The ELISA results are

compared with HA.

113


Fecal samples

Canine fecal samples were collected of the suspect animals in veterinary clinics. To

the viral extraction was used the approximately 10% suspensions of fecal material

were made by mixing the fecal samples in Hank’s medium with NaHCO3 on a vortex

apparatus. The debris was allowed to settle for 10 min, and the supernatant fluid

was tested in the ELISA indirect or treated further. Additional treatments included

testing the supernatant fraction after extraction with 0.1 volume of chloroform

followed by centrifugation at 1500 x g for 10 min (Carmichael and others, 1980).

Canine parvovirus

The canine parvovirus strain Cornell 780916-80 (ATCC® Number: VR-2017TM) was

obtained from the ATCC (The Global Bioresource Center). The viral amount was

determined by protein concentration with Bio-Rad protein assay (Bio-Rad

Laboratories) and then samples were frozen at –70oC.

Preparation of Immunogens

The viral suspension composed of 300 ng of parvovirus in 500 l de PBS at pH 7.2

was mixed with 500 l of the alhydrogel (aluminum hydroxide Al(OH)3) as adjuvant

(Accurate Chemical & Scientific Co, Westbury, New York) for the first injection. The

others three inoculations were made of the same way.

Immunization of Hens

Six White Leghorn laying hens of twenty five-week-old from the North Fluminense

State University were used for this immunization. The chickens were keeping in

individual cages with water and food ad libitum. The first immunization was

conducted by injecting 1.0 ml of the mix of viral suspension and adjvant into the

pectoral muscle. The second and third inoculation was carried out 1 and 3 weeks

after the first inoculation. The last inoculation was made at 6 weeks after the first.

114

Extraction of Egg Yolk Antibody

Eggs were collected from hens immunized all days after the first inoculations and

then sorted by week. Egg yolk antibodies were extracted using chloroform (Shin and

others, 2001a and 2001b). For this, the egg yolk was separated from the egg white

and homogenized after mixing with an equal volume of PBS. The homogenized egg

yolk was then mixed with two volumes of chloroform and incubated for 2 hours at

room temperature. After this incubation, the supernatant was collected and stored at

–70oC (Shin and others, 2002). The protein concentration was determined with Bio-

Rad protein assay (Bio-Rad Laboratories) and then samples were frozen at –70oC.

Hemagglutination (HA)

The plate was coated with 50 l of fecal samples diluted 1:10 in phosphate-buffered

saline (PBS) pH 7.2 in the first well, and then serial twofold dilutions was made.

After this, 50 l of 0.5% porcine erythrocytes in virus adjusting diluent (VAD) was

added. The plate was incubate at room temperature for 40 min. The hemagglutinant

titer of antigen is the higher dilution which the hemagglutination was complete.

Samples considered positives by HA test were confirmed by HI test (Senda and

others, 1986).

ELISA

The chicken egg yolk antibodies (IgY) titers and the canine parvovirus in fecal

material were measured by indirect ELISA. For the IgY titers, was used the original

canine parvovirus of the ATCC and the canine parvovirus in fecal material. Ninety-

six well microplates (Dynatech laboratories, Inc.) were coated with 100 l of canine

parvovirus (200 ng/ml) isolated of fecal material diluted in coating buffer by

overnight incubation at 4oC. After the incubation, the plates were washed with 150 l

PBS/0.05% Tween 20 (wash buffer) three times, blocked with 0.5% gelatine in PBS

(pH 7.2), 200 l per well, 1 h at room temperature, and washed with wash buffer

three times. Then, was added 50 l IgY anti-CPV(diluted in PBST 1:1000) suitably

diluted to each well and incubated at room temperature for 1 h, washed the plate

with wash buffer three times. After the washing, 50 l (diluted in PBST 1:5000)

rabbit anti-chicken IgG conjugated with horseradish peroxidase (Biomeda

Corporation) suitably diluted was applied to each well of the plate and incubated at

115

room temperature for 1 h. Substrate, 2,2-azino-bis (3-ethylbenz-thiazoline-6-

sulfonic acid) (Sigma Co.) was added into each well of the plate. Optical densities at

405 nm were measured with a microplate ELISA reader after stopping of the

reaction with 2 M HCl solution.

116


Immune response of hens to canine parvovirus strain Cornell 780916-80

Specific activities of IgY extracted of the egg yolk using chloroform was

measured by indirect ELISA (Graphic 1). All the chickens used in this experiments

showed a relatively strong immune response against CPV. The chickens were

immunized four times with aluminum hydroxide as adjuvant, which were sufficiently

immunogenic to induce an immune response. The kinetics of IgY followed the

principle of immunity, where the animal response with antibody production after

stimulation (Burnet, 1959).

In the first immunization the hens initiate the primary response characterized

by the log growth. After this, the response of the second immunization occurred

quickly, but doesn’t reach a greater magnitude, perhaps due the adjuvant or antigen

concentration. The antibody level remains growing after others immunizations. This

activity only can be possible because the B cell response and by the fact that

memory B cells formed during a primary response are more easily activated by the

booster immunization (Burnet, 1959). After the last booster the curve decline.

As describe for Behn and others in 1996, there are two types of curves in respect to

the development of antibody activity, which are a “mammalian-like” curve and a

“salutatory” curve. In this situation, the characteristics showed a similarity with

“mammalian-like” curve, because after the first immunization the activity increase

and remain relatively stable for several weeks or months. Therefore, the IgY

antibody isolated of egg yolk and tested for ELISA can be used in several assays

that include the canine parvovirus.

Hemagglutination test (HA)

The hemmaglutination is method is the clumping of red blood cells that can be

caused by some viruses. This process is easily visualized and so has been turned

into a method for identifying antibodies in the blood (Senda and others, 1986). The

canine parvovirus clumped (hemagglutinate) the porcine erythrocyte and this

reaction was visible, all the samples were positives.

Indirect ELISA to detect the canine parvovirus in the fecal material

117

The IgY antibody extracted from egg yolk of immunized hens with canine parvovirus

strain Cornell 780916-80 was used for to detect the canine parvovirus in the fecal

material. Excrements of dogs with characteristic acute signal of the disease were

collected and the virus was isolated utilizing a method for dilutions and

centrifugation (Carmichael and others, 1980). Before the ELISA was made the HA

test to confirm the presence of canine parvovirus in the fecal material. Eight

samples of the eight different dogs were used and in all the samples the canine

parvovirus was marked with IgY and the reaction detected by addition of the anti-

chicken peroxidase. The reaction was measured by ELISA reader at 405 nm and all

the results were greater than the control. The variation observed between animals

can be related with the amount of parvovirus in the enteric tract.

118

Conclusion

The chickens are efficient host birds that produce specific IgY to the canine

parvovirus. These antibodies can be applied in the several ways for the

immunotherapy and immunodiagnostic. In the near future, the IgY will be used in

kits diagnostic for the enteric virus.

119

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123

Figures:

00,5

11,5

22,5

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70

DAYS

OPT

ICA

L D

ENSI

TY(4

05 n

m)

YOLK CONTROL

Graphic 1. The kinetics of IgY titers in hens immunized with canine parvovirusstrain Cornell 780916-80 (CPV). The level of IgY activity in a 1000-fold dilution wasmeasured by indirect ELISA using CPV as an antigen and expressed as ELISAvalue (OD at 405 nm). Values are the mean of six samples (animals). Vertical barsindicate the standard deviation. The arrows indicate the time of immunization

124

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

1 2 3 4 5 6 7 8 Control

Samples

OD

at 4

05 n

m

Graphic 2. Determination of canine parvovirus in fecal material. The presence ofthe canine parvovirus was determinated by indirect ELISA using as antigen the virusisolated at the dogs with clinical disease and expressed as ELISA value (OD at 405nm). Values are the mean of four repetitions. Vertical bars indicate the standarddeviation.

125

Results ELISA HA Control (ELISA)* Control (HA)**

Positive 8 8 0 0Negative 0 0 1 1

Table1. Comparisons between ELISA and HA used for detection of CPV in caninefecal samples. * Negative control, feces of healthy dog; ** Negative control, feces ofhealthy dog.

126

Produção e utilização de anticorpos IgY anti-Staphylococcus aureus.

1Marco Cesar Cunegündes Guimarães, 1Livia Gomes Amaral, 1Franz Viana Borges,1Hugo Paes Leme Vieira, 1Marcos Fernando de Rezende Matta








127

Abstract:

The Staphylococcus aureus is a pathogen involved in wide infections process in

human and animals, inducing several economical losses in the animal industry,

antibiotic resistance and others. Thus, the antibiotic use is limited and actually is

consider a great problem. Therefore, the development of alternatives for the

antibiotic use is necessary. Recently, egg yolk antibodies have been found to offer

several advantages for disease control in animals and humans. The specific binding

activity of IgY against Staphylococcus aureus as determined by enzyme immuno

assay showed high levels of activity against the bacteria. The IgY binding was

further demonstrated to have an inhibitory effect on Staphylococcus aureus growth

in a culture medium. The bacteriostatic function of IgY appeared to result from the

interaction of IgY with surface components of Staphylococcus aureus.

Keywords: Staphylococcus aureus, chicken egg yolk antibody, inhibition

growth, ELISA.

128

Resumo:

O Staphylococcus aureus é uma bactéria gram positiva envolvida em diversos

processos infecciosos. Encontrada na cavidade nasal e na pele de humanos e

animais. Capaz de produzir enterotoxinas termorresistentes que causam, no

homem, a intoxicação estafilocócica. Além disso, estão envolvidos em significativas

perdas econômicas na indústria animal e principalmente no desenvolvimento da

resistência aos antibióticos. Atualmente, o uso de antibióticos é limitado e é

considerado um grande problema de saúde pública. Portanto, o desenvolvimento

de alternativas ao uso de antibióticos é necessário. Recentemente, anticorpos da

gema do ovo de galinha têm sido utilizados por oferecer vantagens para o controle

de doenças em humanos e animais. Neste trabalho, galinhas White Leghorn foram

imunizadas com Staphylococcus aureus isolados de vacas com mamites infecciosa

e desenvolveram anticorpos específicos contra a bactéria. A presença dos

anticorpos IgY no extrato purificado foi demonstrado com o teste de ELISA indireto.

A atividade biológica da IgY foi testada in vitro pela atividade bacteriostática do

Staphylococcus aureus em cultura.

Palavras-chave: Staphylococcus aureus, anticorpos da gema do ovo de

galinhas, inibição do crescimento bacteriano, ELISA.

129

Introdução:

Os estafilococos (cocos Gram-positivos) estão entre as bactérias piogênicas mais

comuns. Podem produzir abscessos locais em quase qualquer parte do corpo,

incluindo desde a pele até o osso. O gênero Staphylococcus inclui várias espécies.

A espécie menos comum, porém mais patogênica é o S. aureus. Esta bactéria está

associada a diversos quadros clínicos no homem e animais (Devriese, 1990). Uma

das infecções de maior importância em animais é a mastite bovina em gado leiteiro,

devido principalmente a prejuízos econômicos e perda da qualidade do leite

(Bramley et al., 1996). Os antibióticos são a ferramenta mais utilizada para tentar

controlar as infecções (Monnet, 1999). Porém, isso acarreta em vários problemas

para a saúde humana e animal, como a resistência bacteriana a antibióticos e os

resíduos de antibióticos encontrados no leite, podendo induzir a resistência de

forma indireta em humanos (Rowe-Magnus, 1999; Schwarz, 2001). Devido a esses

problemas o uso de alternativas que visam diminuir a utilização de antibióticos para

o controle de doenças bacterianas é fundamental para a saúde humana e animal.

Uma das alternativas utilizadas é o uso de anticorpos policlonais (Kweon et al.,

2000). Estes anticorpos podem ser obtidos em qualquer espécie animal, mamíferos

(IgG) e aves (IgY), que possua no seu sistema imunológico a imunidade humoral

(Tini et al., 2002). Além disso, é importante levar em consideração a quantidade, o

custo e o sofrimento animal para a obtenção dos anticorpos. Baseado nessas e

outras características o uso de anticorpos policlonais de galinha se tornou um

atrativo (tabela1). Esses anticorpos podem ser obtidos na gema do ovo de aves

sem que haja coleta de sangue e conseqüentemente não estressando os animais

(Woo et al., 1998). A eficácia da IgY tem sido comprovada em muitas aplicações

para o tratamento e prevenção de em muitos processos infecciosos, tais como

diarréias em suínos e bovinos, cáries dentárias, diarréia infantil, parvovirose canina,

venenos de cobras, entre outros (Almeida et al., 1998; Kim et al., 1998; Ikemori et

al., 1992; Hatta et al., 1993; Hatta et al., 1997; Yokoyama et al., 1992; Oh et al.,

1996). Portanto, o presente estudo teve como objetivo produzir de forma simples e

eficaz IgY contra S. aureus, como uma possível alternativa a antibiótico terapia. Os

anticorpos anti- S. aureus foram obtidos através da imunização de seis aves

Leghorn brancas utilizando como adjuvante o hidróxido de alumínio. O título foi

obtido através do teste de ELISA, onde observou-se uma cinética padrão para a

produção dos anticorpos no soro e na gema (Erhard et al., 2000). A IgY anti-

130

S.aureus foi testada de acordo com a sua capacidade de inbição em cultura do

crescimento de S.aureus.

131

Material e Métodos:

Staphylococcus aureus

O S. aureus utilizado para o inócuo nas aves foi obtido do Laboratório de Sanidade

Animal da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos

Goytacazes, Rio de Janeiro, Brasil. O S.aureus foi isolado de vacas com mastite

estafilocócica. As bactérias foram isoladas com swabs intramámarios, cultivadas

em meio seletivo BBL CHROMagar (BBL™ CHROMagar™) (Difco, Detroit, Mich.,

U.S.A.) para identificação de S.aureus, incubados a 37oC por 24 h. Depois da

incubação, as células foram colhidas, ressuspendidas em tampão fostato salino

estéril (pH 7.2) e centrifugadas a 5000 x g por 15 min e foram tratados com

formalina 3.7% (CH2O) “overnight”. As células inativadas foram lavadas três vezes,

suspendidos em tampão salina estéril, ajustados para uma concentração de 2,6 x

104 células/ ml, aliquotadas e estocadas a –700C.

Aves

Foram utilizadas quatro galinhas da raça White Leghorn com 12 semanas de idade

da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos

Goytacazes, Rio de Janeiro, Brasil. Todos os animais envolvidos se encontravam

em bom estado sanitário e com alimentação e água ad libitum.

Inócuo

As alíquotas de S.aureus estocadas a –700C foram descongeladas, 500 l de

solução bacteriana (2,6 x 104 células/ ml) foram adicionadas a 500 l de alhydrogel

(hidróxido de alumínio Al(OH)3)) (Accurate Chemical & Scientific Co., Westbury,

New York) como adjuvante.

Imunização das aves

A primeira imunização foi conduzida pela injeção de 1.0 ml de solução contendo

suspensão bacteriana e adjuvante no músculo peitoral. A segunda e terceira

inoculações foram feitas em 1 e 3 semanas respectivamente após o primeiro

inoculo.

Coleta de ovos e soro

Os ovos e o sangue foram coletados a partir da primeira semana de inoculação até

a oitava semana pós primeiro inócuo. Os ovos foram levados ao laboratório e

132

armazenados a 4oC para posterior extração da IgY. O sangue coletado com citrato

de sódio 0.5% como anticoagulante.

Extração de IgY da gema do ovo

Os ovos foram coletados das galinhas imunizadas todos a partir do primeiro inoculo

e separados por semana. Os anticorpos foram extraídos usando carrageenan 0.1%

(Sigma) (Hatta et al., 1990). Para isso, a gema foi separada da clara do ovo e

homogeneizada (vortex) com o mesmo volume de água destilada. Adicionou-se o

carrageenan 0.1% com quatro vezes o volume da inicial da gema. A solução

resultante foi homogeneizada e incubada por 30 min a temperatura ambiente. Após

esse período, centrifugou-se o material a 6000 rpm por 20 min. O sobrenadante foi

coletado, filtrado em filtro com 0.2 m (Millipore Corp., Bedford, Mass.) e estocado

a –70oC. A concentração de proteína foi feita com o extrato para determinar a

proteína total, IgY total e IgY específica.

Extração de IgY do plasma

O sangue foi coletado com citrato de sódio 0,5%, centrifugado a 3000 rpm por 15

minutos para obtenção do plasma e, conseqüentemente da IgY circulante. O

plasma coletado e estocado a –70oC para posterior análise.

Ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA)

O título de anticorpos foi obtido através do teste de ELISA indireto. A suspensão de

S.aureus (2,6 x 104 células/ ml) foi diluída a 1:500 em tampão

carbonato/bicarbonato pH 9,2 e, em seguida, distribuído na placa de ELISA 100

microlitros por orifício. A placa foi incubada a 4oC por uma noite. Após a incubação

a placa foi lavada cinco vezes com PBST 0,1% pH 7,2. A IgY da gema, do plasma e

o controle foram diluídos a 1:1000 em PBST 0,1% pH 7,2 e distribuídos 100

microlitros por orifício. A placa foi incubada a 37oC por quarenta e cinco minutos e

lavada cinco vezes com PBST 0,1% pH 7,2. O conjugado foi diluído a 1:12000 em

PBST 0,1% pH 7,2 e distribuído 50 microlitros por orifício. A placa foi incubada a

37oC durante trinta minutos e lavada dez vezes com PBST 0,1% pH 7,2. A placa foi

revelada com 50 microlitros de uma solução de ortofenileno diamina (OPD).

Adicionaram-se 100 microlitros por orifício de uma solução de ácido sulfúrico

133

(H2SO4), após quinze minutos de reação. A leitura da placa foi feita no

espectrofotômetro para microplaca em filtro de 405 nm.

134

Resultados

Resposta imune para S. aureus

O S. aureus foi injetado usando como adjuvante hidróxido de alumínio. Os

anticorpos IgY anti-S. aureus obtidos contra a bactéria no soro e na gema foram

analisados pelo teste de ELISA, usando o próprio S. aureus como antígeno.

Geralmente, o pico de produção de anticorpos ocorre entre quarta e sexta semanas

no soro e na gema, respectivamente, depois da primeira injeção (Erhard et al.,

2000). A cinética de produção de IgY no soro e gema é observada nos gráficos 1 e

2, respectivamente. O pico de produção dos anticorpos foi observado na quinta e

sétima semana, para o soro e a gema. O título dos animais imunizados foi em

média cinco vezes maior do que os animais não vacinados do grupo controle. Os

gráficos foram construídos baseados na leitura em densidade óptica num

comprimento de onda de 405 nm feitos por espectofotometria no leitor de ELISA.

Inibição do crescimento de Staphylococcus aureus

Muitos trabalhos demonstram resultados sobre o efeito bactericida de

anticorpos específicos na presença de fagócitos ou proteínas do sistema

complemento, a qual resultam na lise bacteriana pela opsonização de anticorpos

facilitarem a fagocitose e a ativação da cascata do sistema complemento (Sadziene

et al., 1993). Anticorpos monoclonais (mAbs) produzidos contra antígenos

bacterianos de superfície tem mostrado efeito bacteriostático in vitro (Avakian and

Ley, 1993). Esses resultados podem ser uma importante razão para o

desenvolvimento de anticorpos da gema do ovo de galinha anti-S. aureus para

avaliar a sua habilidade para exibir o mesmo efeito, embora a IgY seja um anticorpo

policlonal.

Além disso, existem outros resultados importantes para colaborar com o

desenvolvimento de anticorpos IgY. Muitos estudos demonstram que animais

infectados com Escherichia coli enterotoxigênica foram protegidos da diarréia

infecciosa pela administração oral de IgY (Ikemori et al., 1992; Yokoyama et al.,

1992; Marquardt et al., 1999). Esses resultados evidenciam a neutralização ou

inibição das atividades patogênicas da bactéria.

Após a extração da IgY. Foram realizados três tratamentos para demonstrar

a inibição do crescimento de S. aureus. O primeiro tratamento foi de IgY anti- S.

aureus, o segundo de IgY de galinhas não imunizadas (controle) e o terceiro com

135

PBS (branco). Todos os tratamentos foram iniciados com 5 unidades formadoras de

colônia (U.F.C.) e analisados após 12 horas. Após as 12 horas observou-se que

grupo tratado com IgY específica tinha em torno de 7 U.F.C, portanto, inibiu o

crescimento bacteriano se comparado com o grupo controle e o branco que

obtiveram um resultante semelhante, pois ao final da análise foram contados cerca

de 45 U.F.C, como observado no gráfico 3.

136

Discussão e conclusão:

O estudo de anticorpos IgY como alternativa para terapia e diagnóstico vem

crescendo nos últimos anos (Schade et al., 1994). Principalmente, devido a alto

nível de resistência bacteriana ao uso de antibióticos, colaborando para a formação

de superbactérias (Ricke, 2003). Essa resistência pode ser gerada de através de

vários mecanismos (Schwarz et al., 2001), diretos e indiretos, que variam desde o

contado direto com o próprio antibiótico até a ingestão de alimentos com resíduos

de antibióticos, como por exemplo, leite e carne (Aerestrup et al., 1999). Com a

crescente preocupação para impedir o desenvolvimento da resistência o uso de

antibióticos está sendo muito controlado em criações animais. Portanto, a geração

destes anticorpos (Narat et al., 2003), bem como a sua utilização em diversos

campos de pesquisa é importante. A curva de produção de IgY seguiu o padrão

observado em outros trabalhos (Shin et al., 2001), bem como a taxa de passagem

dos anticorpos do soro para a gema, permitindo que o pico de produção seja

inicialmente observado no soro e depois na gema. Os níveis de anticorpos obtidos

que foram quantificados pelo teste de ELISA se demonstraram altos em

comparação ao grupo de aves não imunizadas o que demonstra o grande potencial

de produção de anticorpos específicos desses animais.

A atividade específica da IgY anti-S.aureus pôde ser observada com a

inibição do crescimento do S.aureus em colônia. Esta atividade pode estar

relacionada com a habilidade de anticorpos inibirem a reprodução bacteriana

através da neutralização de sítios de comunicação, indispensáveis para o Quorum

Sensing (Miller et al, 2001).

Os anticorpos IgY não foram produzidos para uma proteína específica,

porém os resultados obtidos na inibição da reprodução do S.aureus se assemelham

ao de Lin et al (2001) , onde foram produzidos anticorpos monoclonais para

bloquear a enterobactina, com a finalidade de inibir o crescimento de coliformes

bacterianos derivados de infecções intramamárias em bovinos.

Desta forma os anticorpos IgY demonstram a sua capacidade de funcionar

como um importante método profilático ou até mesmo curativo de uma série de

137

processos infecciosos e, não descartando a sua utilização como método de

diagnóstico.

138

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do

Rio de Janeiro – FAPERJ.

Gostaria de agradecer ao doutor Arinos da Hertape Calier Saúde Animal; ao

professor Yoo da Universidade Nacional de Seoul pelos esclarecimentos sobre a

atividade biológica dos anticorpos IgY; ao doutor Kildare Miranda da Universidade

Federal do Rio de Janeiro pela revisão final do artigo.

139

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142

ITENS IgG IgY

Método de coleta Invasivo Não invasivo

Quantidade de Ac. 200 mg/40ml

sangue

50-100 mg/ovo

Quantidade de Ac./mês 200 mg ~ 1500 mg

Quantidade de Ac. Específico ~ 5% 2-10%


Interferência com IgG de mamífero Sim Não

Interferência com fator reumatóide Sim Não

Ativação de complemento de

mamífero

Sim Não

Tabela 1

Baseado em Schade et al (1991).

143

00,20,40,60,8

11,21,41,6

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

SEMANAS

DEN

SID

AD

E Ó

PTIC

A (4

05 n

m)

SORO CONTROLTE

Gráfico 1. Cinética de produção de IgY anti-Staphylococcus aureus no soro.

Comparando a densidade óptica a 405 nm dos animais imunizados e não

imunizados (grupo controle negativo). Estes dados são referentes a média de seis

quatro amostras durante as oito semanas. As barras verticais demonstram o desvio

padrão e as setas indicam o momento da imunização.

144

0

0,5

1

1,5

2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9SEMANAS

DEN

SID

AD

E Ó

PTIC

A(4

05 n

m)

GEMA CONTROLTE

Gráfico 2. Cinética de produção de IgY anti-Staphylococcus aureus na gema.

Comparando a densidade óptica a 405 nm dos animais imunizados e não

imunizados (grupo controle negativo). Estes dados são referentes a média de

quatro amostra durante oito semanas. As barras verticais são relativas ao desvio-

padrão. As setas são referentes às imunizações.

145

05

101520253035404550

IgYESPECÍFICA

IgY PBS

NÚ

MER

O D

E C

OLÔ

NIA

SB

AC

TER

IAN

AS

Gráfico 3. Inibição do crescimento em cultura do S. aureus, utilizando IgY

específica, IgY inespecífica como grupo controle e PBS como branco.

146

Produção de Anticorpos Policlonais em Galinhas

1Marco César Cunegundes Guimarães

1Laboratório de Melhoramento Genético Animal, Centro de Ciências e TecnologiasAgropecuárias, Setor de Imunogenetica, Universidade Estadual do NorteFluminense Darcy Ribeiro, Av. Alberto Lamego 2000, Campos dos Goytacazes, RJ,Brazil, Zip Code 28013-620.




147

Resumo

Anticorpos, também chamados de imunoglobulinas, são proteínas produzidas por

células especializadas do sistema imune para a auxiliar o organismo a destruir os

microrganismos invasores. Por causa da versatilidade dos anticorpos, terapias

baseadas no uso de anticorpos podem, em teoria, ser desenvolvidas contra

qualquer patógeno existente. O uso terapêutico dos anticorpos constitui uma

potencial opção contra novos agentes emergentes. A produção de anticorpos (Abs)

em galinhas e a extração de anticorpos específicos na gema do ovo são

incrivelmente atrativas e interessantes para a comunidade científica.

148

Introdução

Anticorpos são proteínas encontradas no plasma e fluidos extracelulares e

comp reendem um dos principais efetores do sistema imune adaptativo. São

produzidos em resposta a moléculas e organismos, a qual são capazes de

neutralizar e/ou eliminar. A habilidade do anticorpo de se fixar a um antígeno com

alto grau de afinidade e especificidade o conduziu para o seu uso ubíquo. Seu uso

em ensaios em diagnóstico e terapia tem provocado um profundo impacto na

melhoria da saúde e no bem-estar de humanos e animais.

A soroterapia teve início em 1890 quando von Bhering e Kitasato

descobriram a anti-toxina diftérica. Com o passar do tempo, anticorpos específicos

foram utilizados para o tratamento de infecções, tais como a raiva e o tétano. A

especificidade e avidez dos anticorpos são a base para a promoção da terapia de

administração de anticorpos. Nos últimos 10 anos, os avanços na engenharia

genética têm possibilitado o aumento da especificidade de anticorpos a sítios

combinados, melhorando assim a sua utilidade terapêutica.

A introdução de anticorpos no tratamento de imunodeficiências e doenças

infecciosas foi um significante avanço na medicina. O anti-soro animal e humano

são usados in vivo para destruir bactérias e neutralizar vírus no sangue de

indivíduos infectados. Possivelmente a mais importante aplicação foi o uso de

anticorpos para o antígeno Rh de eritrócitos, evitando o desenvolvimento da

doença hemolítica do recém-nascido. O tratamento com anticorpos policlonais é

associado com muitos efeitos colaterais não desejados. Doença do soro, anafilaxia

e a natureza desses anticorpos são considerados fatores limitantes. Isto tem

motivado pesquisadores a produzirem anticorpos bem definidos em relação a sua

qualidade e especificidade.

Apesar dos problemas e dificuldades envolvidos, existem diversas vantagens

para a utilização de anticorpos policlonais ou monoclonais na medicina humana e

animal. O maior estímulo para o desenvolvimento de pesquisas nessa área é rápido

desenvolvimento de resistência de muitos microrganismos a agentes microbianos,

principalmente aos antibióticos. O aumento do número de mortes causadas por

superbactérias na última década fez com que alguns grupos de pesquisa

repensassem o uso de anticorpos como importante alternativa ao uso de

antibióticos.

149

No entanto, apesar de todas as vantagens observadas, o desenvolvimento

de anticorpos para uso comercial envolve sérias implicações éticas associadas ao

bem-estar animal. Os anticorpos monoclonais são constantemente avaliados para

pesquisa, diagnóstico e terapias. O uso destes anticorpos encarece a pesquisa

clínica e causa sacrifícios dos animais envolvidos. Portanto, o desenvolvimento

alternativo de anticorpos que possam ser utilizados no diagnóstico e terapia das

doenças se faz necessário. O uso de galinhas como fonte para imunização traz um

grande número de vantagens para a produção de anticorpos (Shin et al., 2002,

2003) como, por exemplo, o método de coleta de anticorpos não invasivo e a maior

quantidade de anticorpos que podem ser encontrados na gema do ovo de galinha

(Schade et al, 1991; Gassmann et al, 1990). Estes anticorpos são chamados de

imunoglobulina Y (IgY) (Klemperer, 1893).

Este artigo fornece uma revisão sobre a estrutura, função, formas de

obtenção e utilização da imunoglobulina Y, obtida na gema do ovo de galinha. Além

de relacionar algumas diferenças entre a IgY de aves e a IgG de mamíferos.

150

Anticorpos da gema do ovo de galinha

Incialmente, anticorpos IgY foram descritos como semelhantes a IgG de

mamíferos, entretanto agora são considerados evolutivamente um ancestral comum

para IgG e IgE de mamíferos.

Em 1893, Klemperer descreveu um experimento na qual ele demonstrou que

a imunização de uma galinha resulta na transferência de anticorpos específicos

para a gema do ovo.

A IgY é exclusivamente transferida para a gema do ovo por um processo

mediado por receptor (Mohamed et al., 1998; Morrison et al., 2001). A quantidade

de IgY transferida é dependente da concentração sérica, e parece que toda a

população de IgY é transferida (Morrison et al., 2001).

A passagem transovariana da IgY leva aproximadamente 5 dias (Mohamed

et al., 1998). A meia-vida da IgY circulante em aves adultas é aproximadamente de

36 a 65 horas (Patterson et al., 1962). A quantidade de IgY transferida parece ser

independente do tamanho do ovo (Dohms et al., 1978; Bollen et al., 1997).

Por um longo período não existiu aplicação científica para esse

conhecimento, mas quando o bem-estar animal se tornou uma séria questão de

preocupação ética para a comunidade científica, os resultados de Klemperer

ganharam interesse. A partir de 1959 vários trabalhos começaram a ser publicados

(Russel et ali., 1959; Behn et al., 1969; Rose et al., 1974; Yamamoto et al., 1975;

Dohms et al., 1978; Noll et al., 1982; Schmidt et al., 1989) relacionando o uso da

IgY como anticorpo secundário para kits de diagnóstico. Na década de 1990, a

tecnologia de IgY teve reconhecimento internacional (Telfef et al., 2001) e, em

1996 o centro europeu para validação de métodos alternativos (ECVAM)

recomendou o uso da IgY ao invés da IgG de mamíferos, para minimizar o

sofrimento animal causada pela coleta invasiva de anticorpos (Schade et al., 2005).

Depois disso o Conselho Federal de Veterinária do governo suíço aprovou a

tecnologia de IgY como um método alternativo para bem-estar animal. Enquanto

isso, inúmeras publicações têm reportado muitos aspectos desta tecnologia.

151

Estrutura molecular da IgY

A estrutura geral da molécula de IgY, consiste de duas cadeias leves e duas

cadeias pesadas. Comparável à imunoglobulina de mamífero. A cadeia pesada é

indicada pela letra grega Y, e contém um domínio variável e quatro constantes, em

contraste aos três domínios constantes da cadeia pesada da IgG.

A IgY possui peso molecular (PM) de aproximadamente 167.250 Da,

enquanto o da IgG de mamífero é de aproximadamente 160.000 Da (Sun et al.,

2001). A cadeia leve consiste de um domínio variável e um constante com PM de

18.660 Da, a cadeia pesada tem PM de 65.105 Da e o fragmento Fab possui PM de

45.359 Da. Existe alguma homologia entre os domínios C 3 e C 4, e os domínios

2 e C 3 da IgG de mamíferos, uma vez que o domínio C 2 é o representante da

região de dobradiça da IgG e é muito menos desenvolvido na IgY (Shimizu et al.,

1992). A região de dobradiça menos desenvolvida na IgY pode resultar em uma

reduzida flexibilidade da região Fab, a qual, pode ser a razão para algumas

diferenças entre IgY e IgG no reconhecimento do epítopo (Warr et al., 1995; Cser et

al., 1982; Noll et al., 1982).

Assim como para IgG, a região Fc da IgY é o sítio de maiores funções

biológicas desenvolvidas. Contêm duas cadeias laterais de carboidratos, em

contraste a somente uma na IgG (figura 2).

152

Diferenças entre IgY de aves e IgG de mamíferos

Existem diversos motivos para que os anticorpos extraídos da gema do ovo

de galinha possam ser utilizados ao invés dos anticorpos de mamíferos.

As vantagens do uso de IgY vem sendo reportada por diversos autores ao

longo dos anos (Schade et al., 1996; Carlander et al., 2002; Gasmann et al., 1990;

Calzado et al., 2002; Camenish et al., 1999), as quais algumas são reportadas na

tabela 1.

O mais importante objetivo do bem-estar animal é a redução de

manipulações dolorosas. A tecnologia de IgY para a manutenção de galinhas é

usualmente menos onerosa do que a manutenção do que a manutenção de

coelhos para a obtenção de anticorpos policlonais. Além disso, a produção de

anticorpos de uma galinha corresponde a de um animal de grande porte. Desta

maneira, uma quantidade extraordinária de anticorpos podem ser produzidas em

uma galinha, aproximadamente 17 a 35 g de IgY total/galinha/ano, dos quais 1-10%

pode ser específico para o antígeno.

A proteína C-reativa (CRP) pertence ao chamado grupo das proteínas de

fase aguda, a qual podem aumentar mais de cem vezes o processo inflamatório. O

resultado de um teste de ELISA, por exemplo, pode ser inexato devido a presença

de fatores reumatóides (RFs), a qual são capazes de se fixar a imunoglobulinas de

mamíferos. Uma substancial vantagem do uso de IgY é a inabilidade para reações

cruzadas com RFs, por causa da ausência dos sítios de ligação no Fc

correspondente (Larsson et al., 1991; Rieger et al., 1996).

Anticorpos humanos “anti-mouse” (HAMAs) podem ser induzidos em

pacientes que receberam imunoterapia com anticorpos monoclonais de

camundongo (mABs). Conseqüentemente, existe uma interferência pelo HAMAs

em ensaios imunológicos baseados em mABs. Anticorpos de galinha podem ser

usados como alternativa nestes ensaios.

Como a diferença entre o antígeno e o animal imunizado aumenta, a

resposta imune usualmente também. Existe uma grande diferença filogenética

entre mamíferos e aves. Esta extensão evolucionária existente faz com que não

haja reação cruzada entre a IgY e a IgG (Mohammed et al., 1998). Como resultado

galinhas, são a melhor escolha para a produção de anticorpos policlonais.

Anticorpos de galinha não são capazes de ativar o sistema complemento de

153

mamíferos, portanto podem ser usadas para reduzir a interferência pela ativação do

complemento (Hatta et al., 1993).

A proteína A estafilocócica e a proteína G estreptocócica são muito utilizadas

pela sua habilidade para fixar IgG. O Staphylococcus e Streptococcus são

freqüentemente encontrados em amostras bacterianas. Quando presentes, eles

podem se ligar a anticorpos específicos para outras bactérias causando assim um

resultado falso positivo. Anticorpos de galinha não se fixam a proteína A ou G e

podem ser usados para reduzir interferências. (Calzado et al., 2001; Leenars et al.,

1999; Gassmann et al., 1990).

IgG de coelho IgY de galinhasMétodo de coleta Invasivo Não invasivo

Quantidade de anticorpo 200mg/40ml de sangue 5-100mg/ovo; 5-7 ovos/semana

Quantidade de anticorpo por mês 200mg Aproximadamente 1000-2800mg

Interferência com imunoglobulinas de

mamíferos (fator reumatóide)

Sim Não

Interferência com HAMA Sim Não

Interferência com complemento de

mamífero

Sim Não


Tabela 1. Características de anticorpos de mamíferos comparados com de galinhas, adaptado de

Schade et al.(2005).

HAMA, anticorpos anti-mouse humanos.

154

Formas de obtenção da IgY

O desenvolvimento e a produção de anticorpos como um resultado de

imunização não são muito previsíveis.

Galinhas podem ser usadas para a produção de anticorpos a partir do

momento em que entrarem em postura. Animais que são usados para a produção

de anticorpos por mais de três meses precisam receber várias imunizações com os

antígenos a cada mês para assegurar o alto nível de produção. Galinhas podem

produzir anticorpos com alta avidez logo após a primeira imunização. Porém, este

resultado depende de algumas variáveis, as quais incluem o tipo de antígeno (dose

e peso molecular), o adjuvante, a via de administração, a genética do animal e o

tipo de criação. Em 2000 Schade e alguns colaboradores fizeram algumas

recomendações para a imunização de galinhas. A variação do antígeno pode variar

entre 0.10-1.0 mg, em casos especiais 10 g, variando com o tipo de adjuvante a

ser utilizado. O volume das injeções varia entre 0.5-1.0 ml e a via usual de

aplicação é a intramuscular, preferencialmente no peito das aves. O intervalo pode

ser de 4-8 semanas e o número de imunizações dependente do interesse da

produção de anticorpos.

Após o primeiro inoculo as aves iniciam a produção de anticorpos e dentro

de poucos dias os mesmos já podem ser encontrados na gema do ovo das

galinhas.

Vários processos são avaliados para isolar IgY da gema de ovos, e podem

ser usados sozinhos ou em combinação, de acordo com a quantidade, pureza e

atividade biológica (Bade e Stegemann, 1984) desejada. O incômodo e os custos

envolvidos são fatores relevantes. Dado o alto nível de atividade de anticorpos, um

processo de isolamento ocasiona uma escolha entre a quantidade e pureza, desde

que vários estágios de purificação principalmente envolvem uma quantidade baixa

de IgY na gema. Todo processo de extração se inicia pela separação da gema e da

clara (Hassl e Aspock, 1988).

Em geral, estes métodos podem ser divididos em três grupos principais:

4. Métodos de precipitação: Envolvendo sulfato de amônio e sódio (Akita et al.,

1992; Akita et al., 1993), polietilenoglicol (PEG; Polson et al., 1980, 1985,

1990; Shafiq et al., 1997), ácido caprílico (McLaren et al., 1994) e

carrageenan (Chang et al., 2000);

155

5. Métodos cromatográficos: Cromatografia de afinidade (Leslie et al., 1997),

cromatografia de troca iônica (Staak et al., 2000), cromatografia de interação

hidrofóbica (Hassl et al., 1988), cromatografia de interação tiofílica (Hansen

et al., 1998) e cromatografia de gel filtração (Staak et al., 2000);

6. Ultrafiltração (Kim et al., 1998).

156

Utilização da IgY

Devido as diferenças bioquímicas com a IgG de mamíferos a IgY possui

diversas vantagens em relação a sua utilização desde o diagnóstico até como

terápico.

Muitas publicações tem descrito o sucesso do uso da IgY em uma variedade

de pesquisas (Blais et al., 2001; Behn et al., 2000; Yang et al., 1997; Yamamoto et

al., 1995; Williams et al., 2001).

O uso da IgY em imunoterapias é mais recente. O seu desenvolvimento para

ingestão oral de humanos e animais vem se tornando muito comum. A

administração oral de IgY específica pode prevenir infecções com Pseudomonas

aeruginosa em pacientes com fibrose cística (Kolberg et al., 2003), a formação de

placas bacterianas por Streptococcus mutans (Chi et al., 2004), o desenvolvimento

de úlcera gástricas por Helicobacter pylori (Shin et al., 2004), enterites por

Escherichia coli em leitões (Ribeiro et al., 2005) e rotavírus humano (Hatta et al.,

1993). Além disso, o efeito protetor de IgY anti-veneno de cobra e escorpião tem

sido mostrado em camundongos (Thalley et al., 1990). Almeida (1998) encontrou

resultados similares, produzindo IgY contra veneno de Bothrops e Crotalus.

Investigações similares estão sendo feitas em Bangalore (Vital Mallya Research

Institute of Bengalore, India). O uso de anti-veneno é vantajoso, por causa dos

poucos efeitos colaterais induzidos (Devi et al., 2002).

157

Conclusão

Apesar de todos os trabalhos e da ampla utilização da IgY, o seu uso como

terápico precisa ser explorado.

A IgY pode ser facilmente obtida e não causa muito estresse animal para ser

extraída, no entanto, a obtenção pode ser dificultada pelo alto custo e aumento das

etapas para extração da gema.

Uma das grandes aplicações deste anticorpo pode estar relacionada ao

controle de infecções bacterianas, pois a partir de janeiro de 2007, através de uma

recomendação da “FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED

NATIONS”, a utilização de antibióticos em ração animal será proibida, fazendo com

que alternativas sejam rapidamente desenvolvidas.

Outra proposta de desenvolvimento se dá através do aumento do conceito

de “comida funcional” na última década, onde a IgY pode ser administrada como

aditivo alimentar, sem necessariamente ser purificada.

158

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164

Desenvolvimento e Aplicações de IgY anti-coronavírus canino

1Marco Cesar Cunegundes Guimaraes, 2Livia Gomes Amaral, 1Franz Viana Borges,1Hugo 1Paes Leme Vieira, 1Marcos Fernando de Rezende Matta

3Laboratório de Melhoramento Genético Animal, Centro de Ciências e TecnologiasAgropecuárias,Setor de Imunogenetica, Universidade Estadual do NorteFluminense Darcy Ribeiro, Av. Alberto Lamego 2000, Campos dos Goytacazes, RJ,Brazil,

2Laboratório de Biotecnologia, Centro de Biociências e Biotecnologia, UniversidadeEstadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Brazil.


Marco Cesar Cunegundes Guimaraes3Laboratório de Melhoramento Genético Animal, Centro de Ciências e TecnologiasAgropecuárias,Setor de Imunogenetica, Universidade Estadual do NorteFluminense Darcy Ribeiro, Av. Alberto Lamego 2000, Campos dos Goytacazes, RJ,Brazil,E-mail: [email protected],Tel: +55 22 2726-1544


165

Abstract

Canine coronavirus tipo 1-71 (ATCC® Number: VR-809TM) specific antibodies

(immunoglobulin Y) were isolated by the water dilution method using carrageenan

from the egg yolk of chickens that were immunized with the coronavirus. The

specific binding activity of IgY against the virus as determined by enzyme immuno

assay (ELISA) showed high levels of activity against virus. The protein and IgY

concentration was determined by protein assay and ELISA respectively, as well the

amount of specific IgY.

Keywords: Canine coronavirus, IgY, ELISA.

166

Introdução

Coranavírus canino é um dos mais importantes agentes virais que afetam o sistema

gastrointestinal de cães. Este vírus, classificado na família coronaviridae incluem

três grupos antigeneticamente distintos (Wesseling et al., 1994), a qual somente

infectam mamíferos geneticamente relatados, tais como coronavírus canino

(CCoVs), coronavírus felino (FCoVs), coronavírus de porcos e humanos 229E

(Appel et al., 1987). Infecção por coranavírus foi primeiramente descrita em diarréia

de cães em 1974 (Cavanagh et al., 1990). Em cães jovens, isoladamente ou em

combinações com outros patógenos, o CCoV é responsável por diarréia, vômito,

desidratação, perda de apetite e morte ocasional. Isto tem sido observado pela

presença do CCoV no material fecal de animais doentes (Tennant et al., 1993).

Pratelli et al (2001) tem detectado CCoV em fezes de cães jovens naturalmente

infectados por um período de 180 dias. Portanto, cães assintomáticos podem servir

como uma continua fonte de vírus e podem induzir uma resposta imune em

populações criadas em canil. Os coronavírus infectam uma ampla variedade de

mamíferos e aves (Pratelli, 2003). Exibem tropismo acentuado por células epiteliais

do sistema respiratório e entérico. Além dessas infecções, outras doenças

causadas por coronavírus incluem hepatite, doença neurológica, peritonite

infecciosa, nefrite, pancreatite, baixo desenvolvimento corporal e adenite (Paul,

2003). Os vírus causadores dessas patologias são divididos em três grupos

antigênicos, o grupo 1 é constituído pelo vírus da gastroenterite suína transmissível,

pelo coronavírus canino e felino e pelo vírus da peritonite infecciosa felina (Lai,

2001). Do grupo 2 fazem parte o vírus da encefalomielite hemaglutinante de suínos,

o coronavírus bovino e o coronavírus dos perus, enquanto, no grupo 3 encontram-

se os vírus da bronquite infecciosa. O coronavírus possui aparência morfológica

única. O tamanho do virion alcança de 75-160 nm de diâmetro, e o genoma

consiste em uma molécula única de RNA fita simples, no sentido positivo (Pratelli,

2004). Duas glicoproteínas estruturais específicas do vírus (S e M) são encontradas

no envoltório. A glicoproteína S é a mais externa ao perímetro. Esta glicoproteína

contêm epítopos aos quais anticorpos neutralizantes e citotoxicidade celular são

direcionados, sendo responsáveis pela união do vírion com as membranas

celulares do hospedeiro (Decaro, 2004). A glicoproteína M é uma molécula

transmembrana que se apresenta mais profundamente inserida no envoltório (Elia,

2003). Anticorpos direcionados contra a glicoproteína M podem neutralizar o vírus

167

na presença de complemento (Elia, 2003). A terceira maior proteína estrutural é

uma fosfoproteína básica (N) que forma um nucleocapsídeo longo, flexível e

helicoidal que engloba o RNA genômico (Risco, 1995).

A importância desta virose no Brasil pode ser caracterizada por vários

aspectos, que incluem o uso de kits diagnóstico importados e produzidos com

anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais são constantemente avaliados

para pesquisa, diagnóstico e terapias. O uso destes anticorpos encarece a

pesquisa clínica e causa sacrifícios dos animais envolvidos. Portanto, o

desenvolvimento alternativo de anticorpos que possam ser utilizados no diagnóstico

e terapia das doenças se faz necessário. O uso de galinhas como fonte para

imunização trás um grande número de vantagens para a produção de anticorpos

(Shin et al., 2001) como, por exemplo, o método de coleta de anticorpos não

invasivo e a maior quantidade de anticorpos que podem ser encontrados na gema

do ovo de galinha (Schade et al, 1992; Gassmann et al, 1990). Estes anticorpos

são chamados de imunoglobulina Y (IgY) (Klemperer, 1893). Neste estudo foram

produzidos anticorpos policlonais da gema do ovo de galinha anti-CCoV com o

objetivo de testa-los como possível método diagnóstico e terapêutico.

168

Material e Métodos

Coronavírus canino

O coronavírus canino tipo 1-71 (ATCC® Number: VR-809TM) foi obtido da ATCC

(The Global Bioresource Center). The viral amount was determined by protein

concentration with Bio-Rad protein assay (Bio-Rad Laboratories) and then samples

were frozen at –70oC.

Preparação do imunógeno

A suspensão viral foi compsta de 300 ng de parvovírus em 500 l de tampão fosfato

salina PBS (pH7.2) foi misturado com 500 l de alhydrogel (hidróxido de alumínio

Al(OH)3)) (Accurate Chemical & Scientific Co., Westbury, New York) como

adjuvante.

Imunização das galinhas

Seis galinhas White Leghorn de 25 semanas de idade da Universidade Estadual do

Norte Fluminense Darcy Ribeiro foram usadas para essa imunização. As galinhas

foram criadas em boxes coletivos com água e comida ad libitum. A primeira

imunização foi conduzida pela injeção de 1.0 ml da suspensão viral com adjuvante

no músculo peitoral. A segunda e terceira inoculações foram feitas em 1 e 3

semanas respectivamente após o primeiro inoculo. A última inoculação foi feita 6

semanas após a primeira e foi somente com 1.0 ml da suspensão viral.

Extração da IgY da gema do ovo

Os ovos foram coletados das galinhas imunizadas todos a partir do primeiro inoculo

e separados por semana. Os anticorpos foram extraídos usando carrageenan 0.1%

(Sigma) (Hatta et al., 1990). Para isso, a gema foi separada da clara do ovo e

homogeneizada (vortex) com o mesmo volume de água destilada. Adicionou-se o

carrageenan 0.1% com quatro vezes o volume da inicial da gema. A solução

resultante foi homogeneizada e incubada por 30 min a temperatura ambiente. Após

esse período, centrifugou-se o material a 6000 rpm por 20 min. O sobrenadante foi

coletado, filtrado em filtro com 0.2 m (Millipore Corp., Bedford, Mass.) e estocado

a –70oC. A concentração de proteína foi feita com o extrato para determinar a

proteína total, IgY total e IgY específica.

Quantificação de proteína

O ensaio de proteína da Bio-Rad (protocolo para microplacas) (Bio-Rad,

Hercules, Calif., U.S.A.), baseado no método de Bradford, foi realizado usando IgG

de galinha purificada (1mg de proteína/ml) (Serotec) como proteína de referência. O

169

extrato de IgY (diluída 1:100 em PBS a pH 7.2) e a diluição seriada em log2 da

proteína de referência em PBS (0.5 para 0.0625 mg/ml) foram realizadas em

microplacas (Dynatech laboratories, Inc.). Após 5 min de reação a absorbância a

595 nm foi medida pelo leitor de microplacas (Molecular Devices UV Max,

Sunnyvale, Calif., U.S.A.).

A concentração de IgY específica e não específica também foi determinada

pelo mesmo processo. (Sunwoo et al., 2002)

Teste de ELISA

Atividade específica da IgY (adaptado de Soma et al., 2001). Uma

microplaca de 96 orifícios (Costar, Corning, N.Y., U.S.A.) foi sensibilizada com 100

l de CCoV (2x105 PFU) (10 g de proteína/ml) (originalmente obtido da ATCC) em

tampão carbonato-bicarbonato (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., U.S.A.) (0.05

M pH 9.6) por poço e incubada por 37oC por 90 min. A placa foi lavada 4 vezes com

200 l de PBS contendo 0.05% de Teween 20 (PBST) (solução de lavagem). Após

ser lavada, a placa foi bloqueda com 200 l da solução de bloqueio (56 ml de

KH2PO4 0,5 M, 144 ml de K2HPO4 0,5 M, 10 g de BSA, 15 g de glicina, 40 g de

sacarose e 1.000 ml de água destilada). Após ser incubada por 45 min a 37oC a

placa foi lavada 4 vezes com 200 l da solução de lavagem. O extrato de IgY

(diluída 1:1000 em PBS) oriundo dos animais imunizados com CCoV e de animais

não imunizados como controle negativo, foram adicionados 150 l nos poços e

incubado a 37oC por 90 min. Depois a placa foi lavada 4 vezes com a solução de

lavagem, 150 l de IgG de coelho anti-galinha conjugado com peroxidase

horseradish (diluída 1:5000 em PBS) (Sigma Chemical Co.) foi adicionado para

cada poço e incubado por 90 min a 37oC. A placa foi lavada quatro vezes por com a

solução de lavagem, seguido pela adição de 50 l de uma solução de ortofenileno

diamina (OPD). A reação foi parada pela adição de 100 l por poço de uma solução

de ácido sulfúrico (H2SO4), após quinze minutos de reação. A absorbância foi lida a

405 nm usando o leitor de microplacas (Molecular Devices UV Max, Sunnyvale,

Calif., U.S.A.). A atividade do anticorpo em questão (valor do ELISA) foi

determinado pela subtração da absorbância do controle negativo do anticorpo

específico.

170

Concentração total de IgY.

O ELISA foi feito como descrito acima, exceto pela sensibilização

diferenciada da microplaca com 150 l de IgG de coelho anti-galinha (Sigma

Chemical Co.) a concentração final de 3.75 g/ml. Amostras do extrato de IgY

foram diluídas serialmente com PBS. Diluições em log2 da IgG purificada (1mg/ml)

(Sigma Chemical Co.) foi usada como anticorpo referência para preparar a curva

padrão. A curva padrão foi então comparada para fornecer uma medida relativa da

concentração total de IgY.

Concentração específica de IgY

A concentração de IgY específica para CCoV foi medida usando o método

de ELISA descrito por Sunwoo e outros (2000). A placa de 96 poços (Costar,

Corning, N.Y., U.S.A.) foi revestida com 150 l de IgG de coelho anti-galinha

(sigma) e CCoV em uma concentração de 10 g/ml em tampão carbonato-

bicarbonato (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., U.S.A.) (0.05 M pH 9.6). Depois

da incubação a 37oC por 90 min, a placa foi lavada 4 vezes com solução de

lavagem. Então, 200 l da solução de bloqueio foi adicionada por 45 min a 37oC.

Depois da placa ser lavada, 3 diluições do extrato com anticorpos específicos (6.5,

3.5 e 2 g/ml) e do extrato sem anticorpos específicos (controle negativo) (6.5, 3.5

e 2 g/ml) foram adicionados nos poços revestidos com CCoV (150 l). Os poços

revestidos com a IgG de coelho anti-galinha foram preenchidos com diluições

seriadas em log2 de IgG de galinha específica (1 mg/ml) (Sigma) em PBS. A placa

foi subsenqüentemente incubada a 37oC por 90 min e lavada 4 vezes com a

solução de lavagem. O anticorpo secundário, substrato e a medida da absorbância

foram idênticos como descrito anteriormente. A densidade óptica a 405 nm foi

convertida para microgramas de IgY específica pelo uso quantitativo da curva

padrão determinada pela titulação entre IgG de coelho anti-galinha e IgG de galinha

purificada.

171

Resultados e DiscussãoConcetração de proteína e IgY total

O método de extração protéica usando carrageenan 0.1% foi usado para

isolar a IgY obtida através da imunização de galinhas com CCoV. A gema do ovo é

uma mistura de lipídios, lipoproteínas e proteínas solúveis em água que incluem -,

- e -livetinas (IgY) (Burley e Cook, 1961; MaCully e outros, 1962).

Conseqüentemente, a fração solúvel em água contendo -livetina (IgY) pode ser

extraída da gema através da precipitação dos lipídios (Akita e Nakai, 1992). A

concentração de proteína e IgY total do extrato da gema foram analisados pelo

método de ELISA e pelo ensaio de proteína descritos acima.

Como mostrados no gráfico 2, tanto a concentração de proteína total quanto

a IgY total foram relativamente constantes ao longo das semanas de análise e o

período de imunização, Este resultado foi anteriormente observado (Sunwoo et al.,

1996; Li et al, 1998; Sunwoo, 2002). O maior média de concentração de proteína

total e IgY total foi observado na quinta semana e nona semana respectivamente. A

variação observado entre as amostras pode estar relacionada a genética dos

animais envolvidos no experimento, apesar da produção de anticorpo variar de

acordo com o antígeno, o adjuvante e a genética animal (Woo et al., 1996; Erhard

et al., 1997).

O método de extração para obtenção de IgY da gema de galinhas

imunizadas é de fundamental importância para a utilização futura desses

anticorpos. Desta forma, a pureza da IgY é fundamental. Neste estudo, a pureza da

IgY total no extrato purificado foi de 37.77%, enquanto que 62.23% foi de outras

livetinas e lipoproteínas. Sunwoo (2002) realizando um trabalho para a produção de

IgY anti-Escherichia coli obteve uma pureza de 38.1% de IgY.

A escolha do método de purificação é fundamental e uma das características

mais importantes além da pureza é a simplicidade e economia do método.

Concentração de proteína específica

A concentração de proteínas específicas obtidas através da adaptação do

método de ELISA (Sunwoo et al., 1996) demonstrou que as aves imunizadas com

CCoV produziram aproximadamente 8.9% de IgY específica do total encontrado na

gema do ovo. Este resultado comparado com o grupo controle negativo pode ser

172

confirmado (<0.1). Schade (2005) descreveu que a quantidade de IgY específica na

gema poderia variar de 2-10%.

Atividade específica da IgY contra CCoV

A atividade específica da IgY anti-CCoV foi monitorada pelo teste de ELISA.

A quantidade de vírus inoculada nas aves foi suficientemente capaz de induzir uma

resposta ativa através da produção de anticorpos pelos animais imunizados. A

imunogenicidade do antígeno pode ser um dos fatores que mais influenciam na

resposta humoral. Estes resultados demonstram que galinhas podem produzir

anticorpos específicos contra CCoV.

A imunização inicial (gráfico 1) das galinhas gerou uma resposta primária

caracterizada por uma curva logarítimica de crescimento contínuo de anticorpos,

além da formação das células B de memória (Kuby et al., 1997). Após o primeiro

inócuo observou-se um aumento gradativo do título de anticorpos na gema, este

aumento atingiu maiores níveis sempre após as imunizações. Entretanto, as aves

não foram capazes manter o crescimento regular após as imunizações e a

tendência da curva era sempre decrescente. A possível explicação para esse fato

pode estar relacionada a tipo de adjuvante utilizado ou a concentração do antígeno

em questão.

Os maiores títulos de anticorpos foram observados entre a oitava e nona

semana, cerca de 6 a 7 semanas após a primeira imunização das galinhas.

Como resultado, anticorpos IgY específicos para CCoV foram reativos.

Demonstrando o potencial para a produção alternativa para a produção de

anticorpos de forma simples e eficiente.

173

Conclusões

As aves possuem ótima relação custo-benefício na produção de anticorpos

se comparados com mamíferos, se tornando assim uma excelente fonte de

pesquisa para anticorpos policlonais. Portanto, a produção de anticorpos na gema

do ovo de galinha parece ser uma alternativa viável e alternativa para a indústria de

kits de diagnóstico e para a imunoterapia de animais infectados.

Anticorpos da gema do ovo de galinha (IgY) foram obtidos através da

imunização de galinhas White Leghorn. A atividade específica dos anticorpos, bem

como a quantidade total e específica de IgY foram demonstradas através do teste

de ELISA, fazendo com que a sua utilização in vivo siga critérios de interesse

clínico.

174

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Semanas

Den

sidad

e op

tica

(405

nm

)

Gráfico 1. A cinética do desenvolvimento da atividade específica da IgY da gema do

ovo de galinhas imunizadas com CCoV. O nível da atividade da IgY foi medido

através do teste de ELISA. Os resultados obtidos foram expressos em densidade

óptica a 405 nm. Os valores são referentes a média de três amostras. Barras

verticais indicam o desvio padrão. As setas indicam o momento da imunizaão.

175

05

10152025303540

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Semanas

Con

cent

raçã

o em

(mg/

ml)

Concentração de proteína Concentração total de IgY

Gráfico 2. A concentração de proteína e da IgY total no extrato obtido de galinhas

imunizadas com CCoV. Os valores são relativos a média de três amostras. Barras

verticais indicam o desvio padrão. As setas demonstram o momento da imunização.

176

Concentração (mg/g)

Extrato de IgY Proteína IgY total IgY específica

Galinhas imunizadas 489 ± 42 123 ± 18 11 ± 3.9

Galinhas não imunizadas 398 ± 54 89 ± 25 < 0.1

Tabela 1. A concentração de proteína, da IgY total e IgY específica do extratosobtidos através do método de purificação com carrageenan 0.1% de aves

imunizadas e não imunizadas (controle negativo). Valores foram obtidos através damédia de 3 amostras associados com os seus respectivos desvios padrão.

177

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