UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

PESQUISA DE PARVOVÍRUS SUÍNO E Mycoplasma

hyopneumoniae EM SUÍNOS COM CIRCOVIROSE SUÍNA DO

ESTADO DE GOIÁS

Thales Coelho de Alvarenga

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Wilia Marta Elsner Diederichsen de Brito

GOIÂNIA

2013

ii

iii

THALES COELHO DE ALVARENGA

PESQUISA DE PARVOVÍRUS SUÍNO E Mycoplasma

hyopneumoniae EM SUÍNOS COM CIRCOVIROSE SUÍNA DO

ESTADO DE GOIÁS

Dissertação apresentada para obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal

junto à Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás

Área de Concentração:

Sanidade Animal, Higiene e Tecnologia de Alimentos

Orientador (a):

Prof.ª Dr.ª Wilia Marta Elsner Diederichsen de Brito

Comitê de Orientação:

Profª. Drª Moema Pacheco Chediak Matos EVZ/UFG

Prof. Dr Jürij Sobestiansky EVZ/UFG

GOIÂNIA

2013

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vi

AGRADECIMENTOS

Meus sinceros agradecimentos à minha família, especialmente à

minha mãe, Maria Célia Alvarenga, por todos os anos de convívio ao meu lado,

e pelos constantes incentivos e apoio na árdua luta para o alcance dos meus

projetos de vida. À minha irmã, Tatiany Coelho Alvarenga, e meu sobrinho,

Pedro Fernandes Gatti, por fazerem despertar em mim o sabor do amor

incondicional.

À minha orientadora, Wilia Marta Elsner Diederichsen de Brito, que,

além da brilhante orientação, revelou-se uma mão amiga em muitos momentos,

tendo sido, inclusive, minha confidente em circunstância notadamente

tormentosa da minha vida pessoal. Agradeço-lhe pelo carinho, compreensão,

disponibilidade, e, também, pelas “chamadas”, as quais se deram, tenho

consciência, no único intuito de me fazer crescer.

À Patrícia Soares e à Tatyane Penha Sales, sem as quais, eu não

teria tantas informações acerca dos animais, ora aqui estudados.

À minha querida professora de Bioquímica, Maria de Lourdes

Breseghelo, a qual, durante a graduação, figurou como uma verdadeira mãe de

espírito em minha vida acadêmica, tendo sido uma das primeiras pessoas a

acreditar no meu potencial intelectual, despertando em mim a vontade de

vencer.

A Escola de Veterinária e Zootecnia (EVZ) da UFG, por todo o

conhecimento a mim ofertado, e aos valorosos professores Cíntia Silva Minafra

e Resende, Iolanda Aparecida Nunes, José Henrique Stringhini, Maria

Auxiliadora Andrade e Marcos Barcellos Café, dos quais tive a oportunidade de

ser aluno nesta instituição de ensino. De modo particular minha gratidão eterna

à nobre professora Valéria de Sá Jayme, fonte substanciosa de sabedoria e

inspiração nos momentos de aprendizado, e base de sustentação para o

encorajamento da arte de viver, me faltam palavras para descrever minha

admiração e gratidão a ela, obrigado por fazer parte da minha história.

Aos meus amigos Lindomar Marques de Oliveira e Ênio Eduardo

Basílio por me suportarem e me incentivarem, à minha amiga de seminários

Micaela Guidotti Takeuchi e, em especial, ao Ricardo Luiz Clemente.

vii

Aos colaboradores do Instituto Biológico de São Paulo, Vera Lettice

de Azevedo Ruiz, Alessandra Figueiredo de Castro Nassar, Josete Garcia

Bersano e Renato Akio Ogata, que contriburiam sobremaneira à consecução

desta Dissertação.

À Andréia Oliveria de Santana, servidora administrativa do setor da

pós graduação da EVZ da UFG, pela paciência, presteza e atenção nos

atendimentos de minhas requisições.

Aos meus cães, Suzy, Branca, Brenda e Bruce pelo companheirismo

e momentos de felicidade.

Ao CNPQ, CAPES e UFG por fomentarem a pesquisa neste País. A

todos, que de alguma forma, contribuíram para a realização deste trabalho.

viii

"Que eu não perca a vontade de

ser grande, mesmo sabendo que o

mundo é pequeno..."

Francisco Cândido Xavier

ix

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 1

2 REVISÃO DE LITERATURA 3

2.1 Circovirus suino 3

2.1.1 Histórico 3

2.1.2 Etiologia 4

2.1.3 Epidemiologia e formas de transmissão 5

2.1.4 Patogenia e manifestações clínicas 7

2.1.5 Imunologia 8

2.1.6 Diagnóstico, controle e prevenção 9

2.2 Parvovirus suino 11

2.2.1 Histórico 11

2.2.2 Etiologia 11

2.2.3 Epidemiologia e formas de transmissão 12

2.2.4 Patogenia e manifestações clínicas 13

2.2.5 Imunologia 15

2.2.6 Diagnóstico 15

2.2.7 Controle e prevenção 16

2.3 Mycoplasma hyopneumoniae 17

2.3.1 Histórico 17

2.3.2 Etiologia 17

2.3.3 Epidemiologia e formas de transmissão 18

2.3.4 Patogenia e manifestações clínicas 19

2.3.5 Diagnóstico 20

2.3.6 Controle e prevenção 21

x

3 OBJETIVO 22

3.1.1 Objetivo geral 22

3.1.2 Objetivos específicos 22

4 MATERIAL e MÉTODOS 23

4.1 Região estudada 23

4.2 Amostragem 24

4.3 Análise molecular dos fragmentos de órgãos 25

4.3.1 Extração do DNA de órgãos 25

4.3.2 Amplificação de DNA de parvovirus suino 25

4.4 Análise molecular das fezes 26

4.4.1 Extração do DNA das fezes 26

4.4.2 Amplificação de DNA de parvovirus suino 27

4.5 Análise molecular da secreção nasal 28

4.5.1 Extração do DNA da secreção nasal 28

4.5.2 Amplificação de DNA de Mycoplasma hyopneumoniae 28

4.6 Pesquisa e titulação de anticorpos para parvovirus suino 29

5 RESULTADOS 31

6 DISCUSSÃO 34

7 CONCLUSÕES 38

8 CONSIDERAÇÕES FINAIS 39

REFERÊNCIAS 40

xi

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Mapa do Estado de Goiás dividido em regiões e microrregiões.

Cruzes pretas marcam a localização das granjas. Fonte:

www.seplan.go.gov.br/sepin (SEPLAN/ SEPIN, 2005).

23

FIGURA 2 Eletroforese em gel de agarose 1,5%. Reação de PCR para PPV a

partir do pool dos fragmentos de tecidos obtidos de suíno de sistema

intensivo de produção reagentes para PCV2. (PM) Peso molecular

100pb; (CN1; CN2) Controle negativo; (CP1; CP2) Controle positivo;

(1G1 - 9G1) amostras dos 20 animais

31

FIGURA 3 Eletroforese em gel de agarose 1,5%. Reação de PCR para M.

hyopneumoniae a partir das secreções nasais. (PM) Peso molecular

100pb; (CP) Controle positivo; (CN) Controle negativo; (2G1 – 2G)

amostras de 17 animais; (4G1, 7G1, 8G1) amostras positivas

33

FIGURA 4 Eletroforese em gel de agarose 1,5%. Reação de PCR para M.

hyopneumoniae a partir das secroções nasais. (PM) Peso molecular

100pb; (CP) Controle positivo; (CN) Controle negativo; (2G4 – 12 G6)

amostras de 17 animais; (3G4, 1G5, 3G5) amostras positivas

33

xii

LISTA DE QUADROS

QUADRO 1 Número de animais, idade em semanas e fase de criação dos

animais diagnosticados como positivos para PCVAD, cujas

amostras foram analisadas para identificação de PPV e M.

hyopneumoniae

24

QUADRO 2 Descrição da sequência de nucleotídeos dos oligonucleotídeos

utilizados nas reações de nPCR para detecção de DNA de PPV

26

QUADRO 3 Descrição da sequência de nucleotídeos dos oligonucleotídeos

utilizados na reação de PCR para detecção de DNA de PPV das

amostras de fezes

27

QUADRO 4 Descrição da seqüência de nucleotídeos dos oligonucleotídeos

utilizados na reação de PCR para detecção de DNA de M.

hyopneumoniae das amostras das secreções nasais

29

QUADRO 5 Resultado da titulação de anticorpos anti PPV realizada pela técnica

de HI em soro de 37 animais

32

xiii

RESUMO

A síndrome circovirose suína e doenças associadas (PCVAD) tem sido descrita em diversas regiões do mundo. Seu agente primário, o circovírus suíno tipo 2 (PCV2), está associado a elevados índices de refugagem nas granjas e a vultuosos prejuízos econômicos. Diversos fatores de risco estão relacionados à manifestação dos quadros clínicos da síndrome, nomeadamente deficiências de manejo, presença de coinfecções, imunização frente ao agente e imunoestimulação. Entre os agentes frequentemente relatados associados ao PCV2 estão o parvovírus suíno (PPV) e o Mycoplasma hyopneumoniae. Este estudo teve como objetivo verificar a ocorrência de PPV e M. hyopneumoniae ou a coinfecção por ambos, em animais diagnosticados estarem acometidos pela PCVAD, em sistemas intensivos de produção de suínos do Estado de Goiás. Amostras de soro e de fezes de 47 animais, previamente confirmados estarem acometidos pela PCVAD, foram testadas respectivamente para identificação de anticorpos e de DNA de PPV. Amostras de secreção nasal de 40 animais foram analisadas para a pesquisa do DNA de Mycoplasma hyopneumoniae. Do total de animais, 20 foram eutanasiados e amostras de baço, fígado, pulmões, rins, tonsilas, intestino e linfonodos foram analisadas em pool para pesquisa de PPV. Foi observada soropositividade para PPV em todos os soros analisados, mas não foi encontrado material genético deste mesmo vírus nas amostras de fezes e no pool de órgãos analisados. Do total das amostras de secreção nasal, seis (15,0%) foram positivas na PCR para o Mycoplasma hyopneumoniae. Os resultados relacionados à presença de micoplasma foram de acordo com os achados clínicos dos animais analisados que apresentavam sintomatologia de patologias respiratórias e lesões relacionadas ao trato respiratório. Este foi o primeiro relato da associação de PCV2 com M. hyopneumoniae em suínos identificados com PCVAD no Estado de Goiás e, ao nosso conhecimento no Brasil. Palavras-chave: Doenças multifatoriais, micoplasmose, parvovirose

xiv

ABSTRACT

Porcine circovirus associated diseases (PCVAD) have been reported worldwide. Its primary agent, porcine circovirus type 2 (PCV2), is associated with high culling rates and heavy economic losses. Several risk factors are related to the clinical syndrome manifestation, including management deficiencies, presence of co-infections, immunization against the agent and immunostimulation. Porcine parvovirus (PPV) and Mycoplasma hyopneumoniae are frequently reported as agents associated to PCV2 infections. The aim of this study was verify the occurrence of either PPV or M. hyopneumoniae infection, or co-infection with both, in affected PCVAD diagnosed animals from intensive pig farming systems in Goiás. Brazil. Serum and feces samples from 47 animals previously diagnosed with PCVAD were screened for PPV antibodies and acid nucleic detection. Out of those, 20 animals were euthanized and tissue fragments (spleen, liver, lungs, kidneys, tonsils, intestines and lymph nodes) were pool harvested for PPV DNA detection. Forty nasal secretion samples were collected for Mycoplasma hyopneumoniae DNA detection. PPV seropositivity was observed in all sera tested, but PPV DNA was not found in stool and organ pool samples analyzed. Six (15,0%) nasal secretion samples were positive for Mycoplasma hyopneumoniae by PCR. Mycoplasma was detected in animals that showed clinical signs and lesions of respiratory diseases. To our knowledge, this was the first report of the association of PCV2 with M. hyopneumoniae in pigs with PCVAD identified in the State of Goiás, and even in Brazil. Keywords: Multifactorial diseases, mycoplasmosis, parvovirosis

1. INTRODUÇÃO

O Brasil ocupa uma posição de destaque no âmbito do agronegócio

mundial. Os baixos custos de produção e a melhoria nos índices zootécnicos

são fatores preponderantes para a manutenção desse estatus.

A suinocultura brasileira vem ampliando a sua participação no

cenário global em razão da intensificação dos sistemas de produção que

conferem ao setor maior rentabilidade e uma acentuação da eficácia produtiva.

Entretanto, os desafios sanitários continuam atuando como entraves à

otimização dos resultados zootécnicos, diminuindo a competitividade do

mercado brasileiro.

As doenças mais impactantes na suinocultura são as que causam

redução no desempenho dos suínos, pois estes ficam mais tempo na granja

para atingirem o peso de abate. Além disso, os gastos com medicamentos e a

depreciação e ou condenação de carcaças nos abatedouros também devem

ser computados.

Entre os principais desafios, a síndrome circovirose suína e doenças

associadas ou “porcine circovirus associated diseases” (PCVAD) tem sido

descrita em vários países (SEGALES et al., 2005). O seu agente primário, o

circovírus suíno tipo 2 (PCV2), está associado ao aumento da mortalidade,

diminuição do desempenho dos animais e elevados índices de refugagem

(LÓPEZ-SORIA et al., 2005), além de falhas reprodutivas em suínos

(SANCHEZ et al., 2001; LEFEBVRE et al., 2008).

Na maioria dos casos clínicos, pode-se comprovar que o PCV2 é

necessário, mas não exclusivo para causar a síndrome circovirose, sendo que

coinfecções (outros microrganismos) e outros fatores (genética, estresse,

nutrição e manejo) são importantes para a manifestação do quadro clínico

(ELLIS et al., 2003; PESCADOR et al., 2003; CIACCI-ZANELLA et al., 2009).

Nesse cenário, os agentes que predispõem à ocorrência de síndromes

associadas ao circovírus suíno devem ser considerados. Dentre eles, no Brasil,

os patógenos mais frequentemente relatados são o parvovírus suíno (PPV) e o

Mycoplasma hyopneumoniae.

2

O PPV é endêmico nas populações suínas em todo o mundo e está

frequentemente associado a perdas fetais. A infecção pelo PPV geralmente é

inaparente com desenvolvimento de imunidade, estando raramente associada

a sinais clínicos em suínos adultos.

O Mycoplasma hyopneumoniae é o principal agente causador da

pneumonia enzoótica suína (PES), uma doença caracterizada por elevada

morbidade e baixa letalidade. Devido a sua patogenia, o M. hyopneumoniae

predispõe seu hospedeiro a agentes patogênicos secundários, dentre eles o

PCV2, sendo que ambos os agentes estão envolvidos no complexo de doenças

respiratórias dos suínos (PRDC).

Diante da endemicidade do PCV2 e do M. hyopneumoniae em

diversas granjas produtoras de suínos no Brasil, a avaliação da interação entre

os agentes em animais acometidos pela PCVAD deve ser analisada.

A maior parte das granjas brasileiras apresenta resultados positivos

nos testes para a detecção de PCV2 em exames diagnósticos. Estudos

comprovam a associação entre PCV2 e PPV, principalmente em fetos

abortados e natimortos (PESCADOR et al., 2007; ROCHA et al., 2010), e entre

M. hyopneumoniae e PCV2 (CARRIJO, 2012). Todavia, devido à escassez de

dados a respeito da coinfecção entre esses agentes em suínos no Brasil,

outros estudos devem ser realizados (PESCADOR et al., 2007).

Ante o exposto, objetivou-se, neste estudo, identificar a presença do

PPV e do M. hyopneumoniae em amostras clínicas de suínos diagnosticados

com circovirose em sistemas intensivos de produção de suínos no Estado de

Goiás, visando fornecer informações acerca da ocorrência e associação entre

esses agentes.

3

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Circovírus suíno

2.1.1 Histórico

O circovírus suíno (PCV) foi relatado, primeiramente, por Tischer et

al. (1974), mediante microscopia eletrônica, ao observarem um vírus

morfologicamente semelhante a um picornavírus, o qual causava infecção

persistente em cultivo celular de rim suíno (PK-15), sem induzir efeito

citopático. Posteriormente, foi demonstrado que esse vírus possuía o genoma

composto por um filamento único de DNA, circular e fechado, razão pela qual

denominaram-o de circovírus suíno (TISCHER et al., 1982).

Infecções experimentais com o vírus descrito por Tischer e

colaboradores em suínos permitiram verificar a eliminação do agente nas fezes

e na secreção nasal dos animais, porém, estes não apresentaram sinal clínico

de doença (TISCHER et al., 1986). Diante destes resultados, estudos com o

agente tornaram-se irrelevantes.

Em 1991, no Canadá, foi observado um grupo de animais com

emagrecimento progressivo, dificuldade respiratória, palidez, e com índice de

letalidade de aproximadamente 10%. No exame histopatológico foram

observadas lesões no sistema linfóide, tais como depleção linfocitária e

infiltração granulomatosa (SEGALES, 2007).

Em 1994, outro surto de enfermidade cursando com caquexia

progressiva, elevados índices de letalidade, afetando principalmente leitões da

fase de creche, e com evolução subaguda a crônica foi descrito em suínos,

também no Canadá (SEGALES, 2007).

Em 1998, a sequência genômica do agente causal dos surtos

descritos foi avaliada e comparada ao vírus não patogênico anteriormente

isolado na linhagem PK-15, descrito por Tischer e colaboradores em 1974. Foi

observada uma homologia de 68%. Dessa forma, o circovírus patogênico,

associado aos sinais clínicos relatados, foi denominado de circovírus suíno tipo

4

2 (PCV2), enquanto que o circovírus não patogênico passou a ser conhecido

como circovírus suíno tipo 1 (PCV1) (MEEHAN et al., 1998; SEGALES, 2007).

A partir da confirmação do PCV2 como um agente causador de

enfermidades, o vírus passou a ser identificado em vários países, sendo que, já

há alguns anos, ele é considerado ubíquo (CAPRIOLI et al., 2006).

No Brasil, a circovirose suína foi diagnosticada pela primeira vez em

2000. Desde então, numerosos casos com indícios de suspeita clínica da

doença e posterior confirmação laboratorial foram identificados, estando a

síndrome circovirose, atualmente, disseminada em todo o território nacional,

provocando elevadas perdas econômicas para a suinocultura brasileira

(ZANELLA et al., 2001; PESCADOR et al., 2007).

2.1.2 Etiologia

O PCV pertence à família Circoviridae, que se subdivide em dois

gêneros: Circovirus e Gyrovirus. Vírus pertencentes à família Circoviridae tem

em comum a simetria icosaédrica e ausência de envelope. O genoma é

covalentemente fechado, medindo de 15 a 17 nm, sendo composto por uma fita

circular simples de DNA, característica exclusiva dessa família de vírus, o que

permite distingui-la das demais famílias de vírus conhecidas (TODD et al.,

2001).

A família Circoviridae é estritamente relacionada à família

Nanoviridae que acomete as plantas, em razão do que cogita-se que um

ancestral do PCV1 pode ter sido um nanovírus de planta, que infectou um

hospedeiro vertebrado e recombinou com um RNA vírus, provavelmente um

calicivírus (GIBBS & WEILLER, 1999).

Várias pequenas inserções e deleções localizadas em toda a

extensão do genoma do DNA viral parecem ser responsáveis pelas diferenças

de patogenicidade entre PCV1 e PCV2. Ambos possuem dois principais

quadros de leitura aberta (“open reading frames” – ORFs), denominados ORF1

e ORF2. A ORF1 codifica duas proteínas de replicação (rep e rep’) e a ORF2

codifica a proteína do capsídeo - cap (LIU et al., 2006).

5

Além destas, já foram mapeadas outras dez ORFs (3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,

10, 11 e 12), e algumas regiões genômicas do PCV2 já foram identificadas

(WEN, et al., 2012; YANG et al., 2012).

Uma sequência de 501 nucleotídeos da ORF2 foi analisada e

permitiu dividir o PCV2 em dois subgrupos. A nomenclatura adotada na

América do Norte divide os genótipos em PCV2a e PCV2b. Estudos

demonstram que o PCV2b é mais virulento que o PCV2a. No Brasil, existem os

dois genótipos. Um terceiro genótipo denominado PCV2c já foi identificado e

isolado, sendo relatado no território da Dinamarca (ROWLAND & HESSE,

2009; XU et al., 2012).

2.1.3. Epidemiologia e formas de transmissão

O PCV2 acomete exclusivamente os suínos. Outras espécies de

interesse pecuário (bovinos, caprinos e ovinos) não revelaram nenhum sinal de

infecção pelo vírus (ELLIS et al., 2003; RODRIGUEZ-ARRIOGA et al., 2003).

A ausência do envelope externo faz com que o PCV2 seja resistente

aos desinfetantes à base de álcool, clorexidina, iodo e fenol. De outra forma, o

vírus pode ser inativado por desinfetantes alcalinos (hidróxido de sódio),

agentes oxidantes (hipoclorito de sódio) e por compostos de amônio

quaternário (MARTIN et al., 2008). O PCV2 possui elevada resistência térmica,

mantendo sua infectividade quando exposto a aquecimento em temperatura de

75ºC pelo período de 15 minutos, sendo, contudo, inativado quando submetido

a aquecimento em temperatura de 80ºC por mais de 15 minutos (O’DEA et a l.,

2008).

O vírus é eliminado do organismo nas secreções nasais, orais, urina

e fezes de animais infectados. Suínos doentes eliminam vírus em maior

quantidade em comparação com animais infectados que apresentam-se,

todavia, clinicamente saudáveis (HA et al., 2009). Estudos em que os leitões

foram monitorados a partir da primeira semana de vida até o momento em que

surgiu a doença, evidenciaram uma maior prevalência de PCV2 em secreções

nasais do que em retais, embasando a idéia de que a via oro-nasal é,

6

provavelmente, a principal via de transmissão horizontal (GRAU-ROMA et al.,

2008).

O PCV2 foi, igualmente, detectado no leite de fêmeas suínas,

incluindo colostro, e em sêmen de cachaços, sendo que, neste caso, não

ocorreram alterações na morfologia ou viabilidade dos espermatozóides (HA et

al., 2009). Apesar da presença do vírus no sêmen, as informações sobre a

possibilidade de transmissão através deste espécime são conflitantes. López-

Soria et al. (2011) observaram que matrizes inseminadas com sêmen infectado

pelo PCV2 não manifestaram viremia não tendo sido, também, detectados

anticorpos contra o vírus em seus organismos, situação idêntica à verificada

em relação aos fetos das matrizes avaliadas. Em outro estudo, porém, em que

marrãs provenientes de granjas livres de patógenos (SPF) foram inseminadas

com sêmen contendo elevada concentração de PCV2, houve falhas

reprodutivas, tendo sido isolado PCV2 dos leitões abortados. Não foi

comprovada se a concentração de PCV2 contida no sêmen em infecções

naturais é suficiente para infectar as fêmeas e os leitões (MADSON et al.,

2009).

Existem evidências de que é possível ocorrer transmissão vertical,

infecção do embrião ou do feto in útero, como identificado pelo isolamento de

PCV2 em fetos abortados, com lesões características no miocárdio (LÓPEZ-

SORIA et al., 2008).

Alguns autores, como Krakowka et al. (2001), sugerem que, para o

desenvolvimento das síndromes associadas ao circovírus suíno (PCVAD), há

necessidade de coinfecções ou cofatores estimulatórios do sistema imune. A

sustentar essa linha de raciocínio, sobressaem duas hipóteses: uma primeira

no sentido de que as coinfecções facilitam a expressão do PCV2, e a segunda

relativa a circunstância de que a imunossupressão causada pelo PCV2 facilite

a expressão de patógenos secundários induzindo, por conseguinte, à

ocorrência da doença clínica.

Estudos epidemiológicos descreveram a presença de um maior

número de outras infecções ou doenças em explorações afetadas pelo PCV2,

tais como a parvovirose suína, pneumonia por micoplasmas, salmoneloses,

doença de Aujeszky, doença de Glasser, meningite por Streptococcus,

colibacilose pós-desmame e pleuropneumonia (LÓPEZ-SORIA et al., 2008).

7

2.1.4 Patogenia e manifestações clínicas

O PCV2 possui a capacidade de infectar células de origem epitelial,

endotelial e mielóide. In vitro, o vírus pode se replicar em algumas linhagens

celulares suínas, e é dependente de proteínas celulares expressas durante a

fase S do ciclo celular. Dessa forma, a replicação vírica in vivo é mais eficiente

em tecidos com acentuada atividade mitótica. Após chegar ao sistema linfático,

o vírus entra na corrente sanguínea e é distribuído aos órgãos alvos (CASTRO,

2005).

No grupo da PCVAD, estão incluídas a síndrome multissistêmica do

definhamento dos suínos (SMDS), síndrome de nefropatia e dermatite suína

(PDNS), falhas reprodutivas, enterite associada ao PCV2, pneumonia

necrosante proliferativa (PNP) e tremores congênitos (OPRIESSNIG et al.,

2007).

A SMDS é a doença mais frequentemente associada ao PCV2.

Embora haja alguns sinais inespecíficos, seis parecem predominar: caquexia,

dispnéia, linfoadenopatia, diarréia, palidez e icterícia (SEGALES et al., 2004).

Os suínos com PDNS apresentam anorexia, depressão, prostração,

relutância em se movimentar e temperatura normal ou alterada. No entanto, a

característica mais evidente da doença relaciona-se à presença de lesões de

pele caracterizadas por máculas e pápulas irregulares, de cor vermelha a

púrpura, que, ocasionalmente, coalescem para formar grandes manchas e

placas irregulares (CASTRO, 2005).

A PNP é uma forma severa de pneumonia intersticial, caracterizada

por hipertrofia e proliferação de pneumócitos tipo 2, e pela presença de células

necróticas no interior do alvéolo (GRAU-ROMA et al., 2008). Na enterite

causada por PCV2, a mucosa intestinal apresenta-se muito espessada e os

linfonodos mesentéricos hipertrofiados (KIM et al., 2001).

As granjas acometidas pelo PCV2 apresentam elevados índices de

abortamento, fetos mumificados e leitões natimortos. O ácido nucléico do PCV2

foi detectado em tecido neural e em fígado de animais com tremores

8

congênitos, circunstância que permite a associação do agente com a

enfermidade (SEGALES et al., 2004).

2.1.5 Imunologia

As alterações observadas nas doenças associadas ao PCV2, tais

como hipertrofia dos linfonodos, extensas lesões linfóides e alteração nos

padrões de citocinas liberadas no sangue e tecidos linfóides, frequentes em

animais clinicamente afetados, sugerem uma disfunção imunológica e a

consequente incapacidade dos animais em elaborar uma resposta imunológica

adequada (BATISTA, 2009).

A principal lesão histológica observada consiste em depleção de

linfócitos em grau variável, com perda de folículos e presença de células

multinucleares gigantes nos órgãos linfoides, com distribuição multifocal a

difusa. As lesões relacionam-se à diminuição dos linfócitos B e T e ao aumento

de monócitos e macrófagos no sangue e tecidos (ALLAN, 2007).

O PCV2 tem como principal alvo as células apresentadoras de

antígenos: macrófagos e células dendríticas (CDs). Apesar da função de

apresentar antígenos aos linfócitos ser mantida, sua capacidade de

reconhecimento antigênica se encontra alterada (FRANÇA et al., 2005).

Uma característica muito importante para a manifestação das

coinfecções refere-se à capacidade que o PCV2 tem de interferir na produção

dos fatores de maturação por parte das CDs plasmocíticas, impedindo, dessa

forma, a ativação dos linfócitos T pelas CDs mielóides maduras, tendo como

consequência a ausência de respostas imunológicas específicas contra outros

agentes patogênicos (MCCULLOUGH et al., 2009).

O PCV2 induz a expressão de fatores quimiotáticos para macrófagos

e outras células inflamatórias nos linfonodos afetados, atraindo, assim, mais

células mononucleares, as quais serão responsáveis pela formação dos

macrófagos epitelióides e por células gigantes, que, por sua vez, são

iniciadores do processo inflamatório granulomatoso encontrado também, nos

animais acometidos pela PCVAD (FRANÇA et al., 2005).

9

2.1.6 Diagnóstico, controle e prevenção

Devido à elevada disseminação do PCV2 na população de suínos, é

difícil avaliar o estatus sanitário de uma granja. Por essa razão, métodos de

diagnóstico, os quais evidenciam apenas a presença do agente, indicam a

infecção, não sendo, porém, em nenhum caso, indicativo de doença (CASTRO,

2005).

Para um diagnóstico individual de circovirose suína, há de se

analisar conjuntamente a presença de sinais clínicos, lesões macro e

microscópicas características em órgãos linfóides (linfadenopatias e marcada

depleção linfocitária com infiltração histiocitária) e a presença do DNA de PCV2

ou antígenos virais. No diagnóstico do rebanho, deve-se considerar a análise

individual e os dados epidemiológicos da exploração (ALLAN, 2007).

Para análise e correlação da presença do PCV2 nos tecidos e nas

lesões histológicas encontradas, técnicas como a imunohistoquímica (IHQ) e a

hibridização in situ (ISH) têm sido empregadas (CHAE, 2004). Apesar de o

PCV2 ser cultivado em algumas linhagens celulares, ele não produz efeito

citopático, portanto, os métodos de identificação do agente visam à detecção

de conteúdo genético viral. Devido às elevadas sensibilidade e especificidade,

a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) tem sido adotada para

examinar fragmentos específicos de DNA de PCV2 (ALLAN & ELLIS, 2000;

FERNANDES et al., 2006).

Em geral, propriedades acometidas por PCV2 apresentam muitas

falhas de manejo, e a adoção de medidas corretivas auxilia no controle das

causas que levam ao aparecimento da PCVAD. Na tentativa de eliminar tais

práticas inadequadas, foi proposto um conjunto de medidas que visa melhorias

na higiene das instalações e redução do estresse dos animais. Esse conjunto

de medidas ficou conhecido por “20 pontos de Madec”, e inclui, dentre outras

práticas: manejo do tipo “todos dentro, todos fora”, desinfecção, contato

limitado entre os animais, não mistura de lotes, e isolamento ou a eutanásia de

animais doentes, entre outras (MADEC et al., 2000).

Por tratar-se de uma síndrome multifatorial, a circovirose ocorre

também em propriedades que seguem as boas práticas de produção, em razão

10

do que deve-se atentar ao controle de enfermidades concomitantes, à

estimulação do sistema imune, à observância do estado de infecção e do nível

de anticorpos da fêmea frente ao PCV2 no momento do parto, além de se

promover a prática constante da vacinação (SEGALÉS et al., 2005; ALLAN,

2007; BATISTA, 2009).

Anteriormente ao uso das vacinas, cujo emprego se deu a partir de

2006, o controle da circovirose suína estava centrado nas boas práticas de

produção. Opriessnig et al. (2007) observaram uma maior mortalidade de

leitões nascidos de fêmeas que apresentavam viremia e também daquelas com

baixo título de anticorpos para PCV2, o que significa que esse déficit de

anticorpos estava diretamente relacionado à mortalidade dos leitões. Os leitões

que ingerem o colostro e possuem anticorpos de origem maternal tem menores

chances de desenvolver PCVAD, apresentado menores índices de letalidade

(LOPÉZ-SÓRIA et al., 2008).

Os anticorpos maternos, porém, apenas limitam a circulação e

excreção viral, não sendo totalmente eficazes na prevenção da infecção pelo

PCV2. O animal torna-se mais susceptível a contrair a doença no lapso de

tempo entre a verificação do declínio dos anticorpos adquiridos via colostro e o

completo desenvolvimento da imunidade ativa, a qual ocorre por volta da quinta

à oitava semana de vida (MADEC et al., 2008).

Como a PCVAD está associada à forte estimulação do sistema

imune, Radostitis et al. (2007) levantaram a hipótese de que as vacinas e seus

adjuvantes teriam a capacidade de agravar as manifestações clínicas do PCV2,

baseando-se na circunstância de as vacinas conterem antígenos que atuariam

como agentes virais, bacterianos, ou, ainda como imuno-estimulantes.

Os autores sobreditos observaram, também, que todos os

adjuvantes utilizados, num período precoce da infecção, aumentaram a

depleção linfocitária, a duração da viremia e os níveis de PCV2 no soro

(RADOSTITIS et al., 2007).

O aparecimento das vacinas para PCV2 revolucionou os aspectos

referentes ao controle da PCVAD, demonstrando resultados positivos em

relação à diminuição das lesões e da letalidade (LOPÉZ-SÓRIA et al., 2008).

Embora a vacinação das matrizes garanta que os leitões recebam

grande concentração de anticorpos maternos, estudos feitos por Madson et al.

11

(2008) indicaram ser possível a transmissão vertical de PCV2 de

fêmeas vacinadas aos seus leitões.

2.2 Parvovirus suino

2.2.1 Histórico

Até a década de 60, as perdas reprodutivas em suínos

eram associadas a fatores desconhecidos. Fatores ambientais,

genéticos, nutricionais e agentes tóxicos eram considerados os

responsáveis pelos baixos índices da produção suinícola (LAWSON,

1961, citado por ROCHA, 2008).

Apesar de alguns agentes bacterianos e, com o advento e o

incremento de técnicas de identificação de vírus, muitos agentes virais foram

correlacionados com as falhas reprodutivas. Dentre eles, o parvovírus suíno

tem sido identificado mundialmente com elevada freqüência. Este agente foi

descrito em suínos pela primeira vez no ano de 1967, sendo relatado em fetos

abortados nos anos subseqüentes. É apontado como causando enfermidades

em suínos em diversos países (CARTWRIGHT & HUCK, 1967; RIVERA et al.,

1995; ORAVAINEN et al., 2005).

O PPV é o agente mais comumente relacionado às reabsorções

embrionárias, abortamentos, natimortalidades, retorno ao estro e infertilidade.

O vírus encontra-se amplamente distribuído na população suína mundial,

sendo raras as granjas livres da doença (LIMA, 2010).

2.2.2 Etiologia

A designação parvovírus foi proposta pelo Comitê Internacional de

Taxonomia Viral (ICTV) com base na palavra latina parvus, que significa

pequeno, uma alusão à circunstância de ser este um dos menores vírus

identificados até então (ANDREWS, 1970; ICTV, 2011).

O PPV está enquadrado na família Parvoviridae, no gênero

Parvovirus, o qual possui 12 espécies, todas elas antigenicamente diferentes

12

entre si. São vírus pequenos, de 18 a 26 nm de diâmetro, esféricos, com

capsídeo icosaédrico e ausência de envelope (MUZYCZKA & BERNS, 2001).

Nos suínos, apenas um gênero de parvovírus era conhecido, porém,

técnicas moleculares possibilitaram a identificação de outro parvovírus. Durante

uma suspeita de infecção pelo vírus da hepatite E, foi identificado,

acidentalmente, um novo parvovírus em soro de suínos, denominado de

parvovírus suíno 2 (PPV2) (HIJIKATA et al., 2001).

Em 2007, outro vírus semelhante ao parvovírus foi identificado em

soro suíno, sendo denominado de hokovírus suíno (PHoV). Este último e o

PPV2 apresentam genomas filogeneticamente distantes do parvovírus suíno

anteriormente conhecido, tendo sido o PHoV e o PPV2 considerados

representantes de outro gênero da família Parvoviridae, que, possivelmente,

não se originou do PPV (LAU et al., 2008).

O genoma do PPV é composto por uma molécula de DNA de fita

simples, possui somente quatro genes e duas grandes fases abertas de leituras

(ORF). A ORF1 codifica três proteínas não estruturais NS-1, NS-2 e NS-3, as

quais estão relacionadas à replicação viral e ao controle da expressão gênica

(BERGERON et al., 1993). A proteína NS-1 tem atividade de helicase e

nickase e é importante na replicação e empacotamento viral, podendo, ainda,

induzir lise celular e apoptose. NS-2 e NS-3 parecem estar envolvidas na

replicação viral (DAEFFLER et al., 2003; SHANGJIN et al., 2009).

A ORF2 codifica as três proteínas do capsídeo VP-1, VP-2 e VP-3,

responsáveis pela estrutura do capsídeo e pela adsorção do vírus na célula

hospedeira. A substituição de poucos aminoácidos na VP-2 do capsídeo viral

pode ser responsável pela diferença de patogenicidade entre os genótipos

(BERGERON et al., 1993; SIMPSON et al., 2002; SHANGJIN et al., 2009).

2.2.3 Epidemiologia e formas de transmissão

A infecção natural pelo PPV é restrita ao suíno. O vírus tem

afinidade por células com elevada atividade mitótica e depende de células na

fase S do ciclo celular para a replicação. Esta ocorre no núcleo das células

infectadas durante a multiplicação celular, uma vez que o vírus não tem

13

habilidade de estimular ou iniciar a síntese de DNA em células em

repouso (ROEHE et al., 2007).

A infecção por esse vírus ocorre principalmente em

tecidos que apresentam células com elevada capacidade de

multiplicação, tais como tecidos linfóides em adultos, células

embrionárias em fêmeas prenhes e células precursoras do epitélio

intestinal em fetos (MENGELING et al., 1999).

Devido à sua estrutura simples, o vírus é extremamente

resistente às condições ambientais, aos solventes orgânicos, às

alterações de pH entre 3,0 e 9,0 e ao aquecimento em temperatura

de 60ºC por duas horas. Podem resistir, ainda, no ambiente por até

quatro meses. São sensíveis, porém, ao hipoclorito de sódio e à

formalina a 3% (ROEHE et al., 2007).

Devido à capacidade viral de persistir no ambiente, as

instalações contendo secreções e excreções contaminadas

constituem a principal fonte de infecção. A transmissão horizontal

ocorre, principalmente, pelo contato oronasal, através de fezes e

excreções, a partir do sêmen e mediante as secreções vaginais de

animais infectados. A transmissão vertical ocorre através da fêmea

suína gestante para a leitegada (WHITTEMORE, 1993).

2.2.4 Patogenia e manifestações clínicas

Após a penetração do vírus no organismo, principalmente por via

oronasal, ele alcança a corrente sanguínea e se replica nas criptas intestinais,

na medula óssea, nos tecidos linfoides, sobretudo nas amígdalas. A viremia

ocorre de dois a quatro dias após a infecção, persistindo por dois a três dias.

Em matrizes, o PPV provoca uma infecção na fase aguda, clinicamente

inaparente na maior parte dos casos, e induz a uma forte imunidade.

Persistindo a infecção, haverá a replicação do vírus em células intestinais e

ocorrerá a excreção do agente nas fezes dos animais infectados por longos

períodos, o que contribui sobremaneira para a contaminação ambiental

(MENGELING et al., 1999; MORAES & COSTA, 2007).

14

De forma semelhante ao PCV2, o PPV tem predileção por tecidos

linfóides, em virtude do que a replicação destes agentes em conjunto pode ter

consequências imunomoduladoras, predispondo a infecções secundárias. O

PPV também tem como alvos os epitélios pulmonar e renal, os hepatócitos e o

endotélio. Importante registrar que diferenças na virulência dos genótipos virais

estão relacionadas ao tropismo de tecidos (ELLIS et al., 2000).

Como o PPV tem afinidade por células em multiplicação, os fetos e

os envoltórios fetais podem ser infectados, tornando-se, também, fontes de

infecção (ROEHE et al., 2007). Nos suínos, a barreira placentária é composta

de seis camadas e não há transposição de anticorpos da mãe para o feto. De

outro modo, há possibilidade de que, no caso de infecção transplacentária, o

PPV seja carreado através de fluidos sanguíneos e linfáticos, por linfócitos e

macrófagos infectados, ou, então, por replicação progressiva mediante os

tecidos que isolam o feto (MORAES & COSTA, 2007; ROEHE et al., 2007).

A doença clínica ocorre principalmente em fêmeas de primeiro parto,

as quais não possuem imunidade para o vírus, e apresentam maior risco de

infecção seguida de problemas reprodutivos. Em fêmeas pluríparas, que já

tenham tido prévio contato com o agente, o efeito do vírus passa a ser reduzido

ou nulo, devido ao desenvolvimento da imunidade ativa (MORAES & COSTA,

2007).

A difusão do vírus é lenta, ocorrendo a infecção embrionária ou fetal

no prazo de dez a 15 dias após a infecção da fêmea gestante. Os graves

efeitos da infecção sobre o organismo do animal infectado estão diretamente

relacionados com o momento temporal da gestação em que se contrai o vírus

(ROEHE et al., 2007).

Quando fêmeas que possuem baixo título de anticorpos adquirem o

vírus durante a gestação, o embrião e os envoltórios fetais podem ser

infectados, predispondo à ocorrência de reabsorção e aborto. Leitões que

ingerem o colostro são raramente afetados justamente por adquirirem

anticorpos protetores contra o PPV. A imunidade passiva, entretanto, diminui

progressivamente até que os animais atinjam um tempo de vida compreendido

entre quatro e seis meses, a partir de quando se tornam susceptíveis à

infecção (MENGELING et al., 2000).

15

As fêmeas infectadas podem apresentar estro irregular, mumificação

fetal, parição de número menor de leitões, falsa gestação, diminuição do ganho

de peso no terço final do período gestacional e menor volume abdominal

durante a gestação (MORAES & COSTA, 2007).

Na fase inicial da gestação, a infecção geralmente provoca morte

embrionária e reabsorção. Se a maioria dos embriões morrer, poderá haver

retorno ao estro, porém, se a maioria dos embriões persistir, a gestação poderá

ser mantida e haverá o nascimento de uma leitegada pequena. Após a

ossificação, a infecção do feto pelo PPV também ocasiona a morte, mas a

reabsorção é impedida pelo esqueleto fetal, resultando em mumificação

(MORAES & COSTA, 2007).

Por volta dos 70 dias de gestação, o feto torna-se imunocompetente,

produzindo seus próprios anticorpos, sobrevivendo, assim, à infecção. Nem

todos os fetos se infectam através da placenta durante a viremia manifestada

pela gestante, pois que alguns se infectam intra-uterinamente a partir de fetos

adjacentes, circunstância que evidencia uma característica clássica da doença:

a morte fetal em diferentes estágios de desenvolvimento (ROEHE et al., 2007).

2.2.5 Imunologia

A primeira forma de defesa utilizada pelo sistema imune contra o

PPV ocorre mediante barreiras físicas, químicas e biológicas. Possivelmente

por apresentar um capsídeo simples e compacto, capaz de suportar alterações

extremas de ambiente, o vírus pode conseguir escapar facilmente dessa

primeira barreira (TIZARD, 2002).

A forma mais conhecida de defesa do sistema imune contra o PPV

se dá através do desenvolvimento de anticorpos específicos para o vírus. Essa

imunidade ativa é associada a elevados e duradouros títulos de anticorpos para

o PPV, os quais podem ser utilizados para o monitoramento de rebanhos

(JONHSON et al., 1976, citado por SOUZA, 2011).

2.2.6 Diagnóstico

16

A mensuração de títulos de anticorpos para PPV com finalidade de

diagnóstico passou a ser utilizada a partir dos anos 70, com a padronização da

técnica de inibição de hemaglutinação (HI) (JOO et al., 1976). A distinção entre

títulos de anticorpos vacinais e os oriundos da resposta imunológica

estabelecida contra o PPV a campo, pode ser realizada por quantificação do

nível de anticorpos, porque a estimulação humoral realizada pelas vacinas

geralmente não excede títulos de 512 em HI (ORAVAINEN et al., 2006).

Entretanto, a falta de uniformização das técnicas sorológicas

provoca falhas de diagnóstico, tendo se passado a utilizar, cada vez mais,

métodos de detecção direta viral (ORAVAINEN et al., 2005).

Devido ao efeito citopático (ECP) causado pelo PPV, o isolamento

viral constitui uma técnica utilizada no diagnóstico. Como ECP, são observadas

inclusões intranucleares, núcleo picnótico, irregularidade nos contornos,

vacúolos citoplasmáticos e morte celular. No entanto, essa é uma técnica que

necessita de bastante tempo de cultivo, o que, não raro, a torna inviável

(MENGELING et al., 1999).

A detecção do DNA viral pode ser feita a partir da análise de tecidos

de diversos órgãos das matrizes infectadas, ou através de tecidos fetais dos

natimortos, mediante a técnica de PCR com iniciadores para a região

codificadora de VP2 do PPV. Além dessa técnica, foi elaborada,

posteriormente, a nested-PCR, desenvolvida com iniciadores direcionados para

a amplificação do gene da proteína NS1, que é mais conservada entre as

diferentes linhagens de PPV (SOARES et al., 1999).

A técnica de PCR em tempo real tem sido descrita como uma forma

eficiente de diagnóstico para PPV, pois associa a sensibilidade e especificidade

da PCR convencional à possibilidade vantajosa de quantificação viral

(MCKILLEN, 2007).

2.2.7 Controle e prevenção

Não há um tratamento específico para PPV. Medidas gerais de

manejo devem ser adotadas a fim de promover um bom estado sanitário para o

rebanho. A vacinação é a principal medida preventiva adotada, pois objetiva

17

estimular a imunidade do plantel, principalmente das nulíparas, evitando a

infecção de embriões e fetos (ROEHE et al., 2007).

As vacinas utilizadas no Brasil são todas com vírus

inativados. A vacinação deve ser realizada em todos os reprodutores

da granja e variam de acordo com a categoria animal (leitoas de

reposição, matrizes em produção e reprodutores machos) (MORAES

& COSTA, 2007).

O colostro constitui a única fonte de anticorpos para os

leitões, em virtude da estrutura placentária da fêmea suína, que não

permite a transmissão transplacentária de anticorpos contra o PPV.

Alguns autores relatam que estes anticorpos adquiridos

passivamente podem resistir até que os suínos atinjam os cinco

meses de idade (MENGELING et al., 1999; FENATI et al., 2009).

Entretanto, as imunoglobulinas responsáveis por essa proteção são

da classe IgG, e sua meia vida dura, em média, cerca de 15 dias,

motivo pelo qual Stojonac et al. (2012) acreditam que, após 30 dias

de vida do animal, os anticorpos encontrados nos soros suínos

sejam oriundos de imunização ativa contra o PPV.

2.3 Micoplasma hyopneumoniae

2.3.1 Histórico

Os primeiros isolamentos de Mycoplasma hyopneumoniae foram

feitos na década de 1960, a partir de tecido pulmonar de suínos acometidos

com pneumonia (GOODWIN et al., 1965, citado por VILLARREAL, 2010).

O M. hyopneumoniae é o principal patógeno da pneumonia

enzoótica suína (PES) e, na maioria dos eventos clínicos, está associado a

agentes bacterianos secundários e ou vírus, dentre eles o PCV2. Estima-se

que, em 93% dos rebanhos mundiais, nos quais há baixos índices de

desempenho, o M. hyopneumoniae esteja presente (CONCEIÇÃO &

DELLAGOSTIN, 2006).

18

2.3.2 Etiologia

Os micoplasmas pertencem à classe Mollicutes, termo que, no latim,

significa pele mole. São os menores microrganismos (0,2 µm) de vida livre

autoreplicantes conhecidos e possuem genomas pequenos (893-920 kpb).

Devido à ausência de parede celular, possuem uma morfologia pleomórfica,

podendo assumir forma esférica, bacilar, helicoidal ou filamentosa (WALKER,

2003).

Possuem uma membrana trilaminar simples composta de proteínas,

glicoproteínas, glicolipídeos, fosfolipídeos e colesterol, sendo este último

responsável pela rigidez e pela estabilidade osmótica da membrana. Ao

contrário dos micoplasmas patogênicos para o homem, que são intracelulares,

o M. hyopneumoniae é um microrganismo extracelular, sendo difícil seu

isolamento e o seu cultivo em função de sua natureza específica (ROSS,

1999).

Três grupos de isolados de M. hyopneumoniae foram obtidos, tendo

sido denominados de baixa, média e elevada virulência, com base no escore

de lesão pulmonar do hospedeiro, na histopatologia, na imunofluorescência e

na sorologia (VICCA et al., 2003).

M. hyopneumoniae é um agente bastante sensível às condições

ambientais, não sendo capaz de sobreviver por longos períodos fora de seu

hospedeiro. Em tecido pulmonar infectado, ele permanece infeccioso pelo

prazo de três a sete dias, numa faixa de temperatura compreendida entre 17 e

25ºC. Já em água, o agente sobrevive por até 17 dias, num patamar de

temperatura variável entre 2ºC e 7ºC. Por outro lado, seu tempo de

sobrevivência aumenta em aerossóis (SOBESTIANSKY et al., 2007).

2.3.3 Epidemiologia e formas de transmissão

M. hyopneumoniae é um parasita específico de suínos. Os leitões

com tempo de vida entre três e 12 semanas são mais susceptíveis a contrair a

infecção. A ocorrência da forma clínica da doença é mais comum nos animais

nas fases de crescimento e de terminação, sendo que, em rebanhos

19

desprovidos de imunidade, a doença pode afetar leitões já a partir de

duas semanas de idade, bem como animais em fase de reprodução

(STÄRK, 2000).

A transmissão entre os animais ocorre de forma horizontal, mediante

o contato direto entre um animal infectado e um suíno susceptível, e também

indiretamente a partir de aerossóis provenientes de perdigotos da tosse de um

animal portador. Foram comprovadas, ainda, a transmissão vertical intra-

uterina e a infecção por meio da lactação, esta segunda a partir do consumo de

leite contaminado com o agente (STÄRK, 2000; FANO et al., 2005).

M. hyopneumoniae pode, também, ser transmitido através

de fômites e mediante vetores mecânicos. Estas duas hipóteses de

transmissão, contudo, tem importância limitada por ocorrerem em

menor frequência. Há maiores chances de transmissão no período

de inverno, em razão de as condições climáticas típicas dessa

estação do ano favorecerem a manutenção do agente no ambiente

(BATISTA et al. 2004).

2.3.4 Patogenia e manifestações clínicas

Após penetrar o organismo hospedeiro, principalmente pela via

nasal, o M. hyopneumoniae adere e coloniza o epitélio ciliado da traquéia, os

brônquios e os bronquíolos. Isso provoca aglutinação e perda de cílios, com

produção excessiva de muco, prejudicando, por conseguinte, o sistema de

depuração mucociliar, e tornando o trato respiratório mais susceptível a

infecções oportunistas (JACQUES et al., 1992; SORENSEN et al., 1997).

Micoplasmas patogênicos utilizam um mecanismo de patogenicidade

bastante complexo, envolvendo a adesão/colonização, citotoxicidade,

competição por substratos, evasão e ou modulação da resposta imune do

hospedeiro, efeito clastrogênico e oncogênico (ROSS, 1999).

Nos suínos, os danos causados pelas infecções por micoplasmas se

devem mais à respostas imune e inflamatória elicitadas pelo organismo do

que ao efeito tóxico direto causado pelos componentes celulares destes

microrganismos (RAZIN et al., 1998). O M. hyopneumoniae interage com

macrófagos alveolares e linfócitos, estimulando-os a produzir citocinas pró-

20

inflamatórias TNF-α, IL-1 e IL-6, responsáveis pelas lesões pulmonares e pela

hiperplasia linfóide perivascular e peribrônquica características da PES

(RODRÍGUEZ et al., 2004).

Os micoplasmas são, ainda, capazes de ativar a mitose de linfócitos

B e T, colaborando para a formação da hiperplasia linfóide, em razão da qual

ocorre a obstrução das vias aéreas, com a consequente formação de lesões

atelectásicas nos pulmões. Essas lesões apresentam aspectos de

consolidação e coloração que varia do roxo ao cinza (SOBESTIANSKY et al.,

2007).

A severidade dos sinais clínicos causados pelo M. hyopneumoniae

depende das coinfecções, bem como de fatores ambientais e de manejo. Nas

propriedades acometidas pela doença, é comum a ocorrência de disparidades

de desenvolvimento entre leitões da mesma faixa etária (PIFFER, 1998).

Em infecções isoladas, o M. hyopneumoniae pode causar

pneumonia crônica, acompanhada dos seguintes sinais característicos como

tosse não produtiva, pêlos arrepiados, maior conversão alimentar e

crescimento reduzido. Quando acompanhado de outros agentes, poderá haver,

também, dispnéia, hipertermia e prostração (LENEVEU et al., 2005).

2.3.5 Diagnóstico

Os sinais clínicos e a presença de lesões pulmonares podem ser

tomados como dados indicativos de PES causada pelo M. hyopneumoniae.

Embora não seja patognomônica, a tosse crônica não produtiva é o sinal mais

frequentemente relatado nos animais acometidos. Lesões pulmonares com

consistência carnosa e de coloração que varia do tom cinza ao roxo, via de

regra verificadas na região crânio-ventral dos pulmões, são frequentemente

observadas durante a necropsia. (THACKER, 2004).

O método da cultura bacteriológica é o mais preciso para a

identificação de M. hyopneumoniae. Entretanto é raramente utilizado por ser

um processo lento, trabalhoso e pouco prático (VILLARREAL, 2010).

O teste imunoenzimático é utilizado para detecção de anticorpos,

sendo seu uso, porém, limitado, uma vez que os anticorpos podem estar

21

presentes no organismo do animal contaminado apenas nas primeiras seis

semanas após a infecção (THACKER et al., 2001).

A PCR possibilita a identificação do DNA do M. hyopneumoniae a

partir de amostras biológicas de lavado traqueal, de secreção nasal, bem como

de fragmentos de pulmão. Esta técnica apresenta elevadas sensibilidade e

especificidade, tornando a identificação do agente mais rápida e precisa

(CALSAMIGLIA et al., 1999; THACKER, 2004; STRAIT et al., 2008).

2.3.6 Controle e prevenção

A prevenção da PES depende principalmente das boas práticas de

manejo. O ambiente deve ser adequado, merecendo atenção especial a

qualidade do ar, a ventilação, a temperatura e a densidade animal. A

separação de animais por idade nas dependências da granja e o método

sanitário de “todos dentro todos fora”, constituem, também, fatores de grande

relevância (LENEVEU et al., 2005).

Os antibióticos são utilizados no tratamento e na prevenção de

infecções por M. hyopneumoniae, porém, o seu uso precoce ou tardio por

ocasião da infecção pode tornar o tratamento ineficaz. Por outro lado, a

necessidade do emprego de antiobióticos por período prolongado de tempo em

determinadas situações, torna o custo do tratamento extremamente oneroso

(TIMMERMAN et al., 2006).

A vacinação é um método amplamente utilizado e, embora não seja

totalmente eficaz na prevenção da infecção. Seu uso promove a redução do

número de micoplasmas no trato respiratório dos suínos, o que,

consequentemente, acaba por levar ao abrandamento dos danos causados

pelo agente (MEYNS et al., 2007).

Diante do exposto e, considerando a relevância dos impactos

negativos causados pela PCVAD no rebanho suíno brasileiro, este estudo teve

como objetivos elucidar sobre a ocorrência concomitante de outros agentes de

importância na suinocultura, associados ao PCV2.

22

3. OBJETIVO

3.1 Objetivo Geral

Avaliar a ocorrência de coinfecção por parvovírus suíno e/ou M.

hyopneumoniae em suínos de granjas acometidas pela síndrome

circovirose suína.

3.2 Objetivos específicos

Identificar a presença do DNA de PPV em amostras de suínos com

PCV2 em casos de circovirose suína.

Identificar a presença de anticorpos para o PPV nos suínos acometidos

com circovirose suína.

Identificar a presença do DNA de Mycoplasma hyopneumoniae em

amostras de suínos com PCV2 em casos de circovirose suína.

23

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Região estudada

As amostras utilizadas no presente estudo foram

provenientes de suínos de seis granjas tecnificadas de ciclo

completo com diagnóstico de circovirose suína, identificadas como

A, B, C, D, E e F (SALES, 2011; SOARES, 2011), localizadas na

região centro sul do Estado de Goiás, especificamente nos

municípios de Silvânia (A), Paraúna (B), Morrinhos (C),

Cristianópolis (D), Inhumas (E) e Senador Canedo (F) (Figura 1). O

estudo foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa

da Universidade Federal de Goiás (protocolo 259/2010).

Figura 1: Mapa do Estado de Goiás dividido em regiões e microrregiões. Cruzes pretas marcam a localização das granjas. Fonte: www.seplan.go.gov.br/sepin (SEPLAN/ SEPIN, 2005).

24

4.2 Amostragem

Como já citado, as amostras foram oriundas de suínos com suspeita

clínica de PCVAD, provenientes de granjas com elevados índices de

mortalidade e refugagem, e todos os animais, após as devidas análises, foram

diagnosticados com a síndrome da PCVAD, confirmando-se o quadro de

suspeita prévia (SALES, 2011; SOARES, 2011).

No total, foram coletadas e analisadas amostras de sangue, de

fezes e de secreção nasal de 47 animais, sendo 26 suínos oriundos da fase de

creche e os outros 21 procedentes da fase de recria/terminação (Quadro 1).

Vinte animais (nove provenientes da creche e 11 originários da fase de

recria/terminação) foram necropsiados, tendo sido coletados fragmentos dos

seguintes órgãos: linfonodos mediastínicos, mesentéricos e inguinais, baço,

rins, fígado, pulmões, tonsilas e intestinos.

QUADRO 1 - Número de animais, idade em semanas e fase de criação dos animais diagnosticados como positivos para PCVAD, cujas amostras foram analisadas para identificação de PPV e M. hyopneumoniae

Granjas Animais Idade (semanas) Fase

A 1, 2, 3, 4 e 5 6 a 15 2 creche 3 recria

B 6, 7, 8 e 9 4 a 8 1 creche 3 recria

C 10 e 11 4 a 16 2 recria

D 12, 13 e 14 4 a 7 3 creche

E 15, 16 e 17 8 a 9 2 creche 1 recria

F 18, 19 e 20 7 a 10 1 creche 2 recria

TOTAL 6 20 4 a 16 9 creche 11 recria

Para a colheita dos espécimes clínicos, foi utilizada a metodologia

descrita por Sobestiansky et al. (2005). A eutanásia dos animais submetidos à

necropsia foi realizada mediante a utilização das substâncias tiopentato de

sódio (10 mg/Kg) e cloreto de potássio 10%, aplicadas por via endovenosa, em

conformidade com a Resolução nº 1000 de 17 de maio de 2012 do Conselho

Federal de Medicina Veterinária (CFMV, 2012).

25

4.3 Análise molecular dos fragmentos de órgãos

4.3.1 Extração do DNA de órgãos

Para a extração do DNA dos tecidos, foi feita inicialmente

uma suspensão dos órgãos macerados de cada animal em água

ultrapura tratada com dietil pirocarbonato (DEPC), e após, uma

alíquota da suspensão de células foi submetido à extração do DNA

por meio do kit comercial (DNAzol®), de acordo com as instruções

do fabricante (Life Technologies™).

4.3.2 Amplificação de DNA de parvovírus suíno

Para amplificação do DNA de PPV foi utilizado protocolo

elaborado por Soares et al. (1999), que utiliza uma nested-PCR

(nPCR) para amplificar parte do gene codificador da proteína não

estrutural NS-1 do PPV.

A amplificação enzimática foi conduzida em 50 µl de solução

contendo 0,5 µM de oligonucleotídeos externos P1 e P6 (Quadro 2); 2,5 U de

Platinum® Taq DNA polimerase; 0,2 mM de cada base nitrogenada; 5,0 µl de

tampão de reação (500 mM KCl, 15 mM MgCl2, 10 mM Tris–HCl pH 8.0); 5,0 µl

de DNA extraído e, como diluente, água ultrapura tratada com

dietilpirocarbonato (DEPC). Levada ao termociclador, a solução referida foi

aquecida inicialmente a uma temperatura de 95ºC, por cinco minutos, tendo

sido submetida, na sequência, a 35 ciclos (95ºC por 45 segundos, 55ºC por 60

segundos e 72ºC por 90 segundos) e de 72ºC, ao final, por dez minutos, para a

extensão.

Na segunda etapa, uma nested-PCR (nPCR) foi realizada para

amplificar a região interna do fragmento. Nesta reação foram utilizados os

oligonucleotídeos internos P2 e P5 (Quadro 2), em 25 ciclos de amplificação

nas mesmas condições anteriormente descritas.

26

27

QUADRO 2 – Descrição das seqüências de nucleotídeos dos oligonucleotídeos utilizados nas reações de nPCR para detecção de DNA de PPV

Reação Primer Sequência dos Oligonucleotídeos

Tamanho do

fragmento (pb)

Autor

PCR P1 5’-ATACAATTCTATTTCATGGGCCAGC-3’

330 Soares et al., 1999 P6 5’-TATGTTCTGGTCTTTCCTCGCATC-3’

nPCR P2 5’-TTGGTAATGTTGGTTGCTACAATGC-3’

137 Soares et al., 1999 P5 5’-ACCTGAACGTATGGCTTTGAATTGG-3’

Como controle positivo padrão de amplificação para o PPV, foi

utilizada a amostra NADL-2, isolada em linhagem PK-15 no Laboratório de

Doenças de Suínos Washington Sugay, do Instituto Biológico, localizado na

cidade de São Paulo. Como controle negativo, utilizou-se água ultrapura, à qual

foi adicionada DEPC esterilizada.

Os produtos das reações da nPCR foram submetidos a eletroforese

em cuba horizontal, em gel de agarose a 1,5% com corante SYBR® Safe (Life

Technologies™, concentração 10-3), imerso em tampão Tris-borato-EDTA

(TBE) 0,5X (0,045 M Tris-Borato, 1,0 mM EDTA), com voltagem adequada às

dimensões do gel (1 a 10 V/cm de gel).

A visualização dos fragmentos amplificados foi realizada através de

transiluminação do gel em luz ultravioleta. As dimensões dos fragmentos

amplificados foram comparadas a um padrão de tamanho molecular (100 pb

DNA Ladder, Life Technologies™), disposto no gel juntamente com as

amostras analisadas, tendo-se realizado os controles necessários a cada

corrida eletroforética.

4.4 Análise molecular das fezes

4.4.1 Extração do DNA das fezes

Um volume de 100 μL de amostra foi adicionado em microtubos

contendo 500 μL de solução de lise (Tris-HCl pH 8,0 a 10 mM; NaCl 100 mM;

EDTA 2 mM, pH 8,0; duodecil sulfato de sódio 1% e 10 μL de proteinase K a 20

mg/mL). O material foi homogeneizado e incubado a uma temperatura de 56°C

por duas horas. Em seguida, foram adicionados 250 μL de fenol e 250 μL de

28

clorofórmio à mistura, a qual foi novamente homogeneizada, e, na sequência,

centrifugada a 12.000 x g por dez minutos a 4°C.

O sobrenadante foi, após, transferido para outro microtubo, de 1,5

mL de volume, contendo 400 μL de propanol. Após a homogeneização, as

amostras foram mantidas em temperatura de -20°C pelo prazo de 12 horas.

Após este período, as amostras foram centrifugadas a 12.000 x g, por 25

minutos, a uma temperatura de 4°C.

Desprezado o sobrenadante, o sedimento foi suspenso em 700 μL

de etanol a 70%, e, novamente, centrifugado a 12.000 x g, por dez minutos, a

4°C. O sobrenadante foi descartado por inversão e o sedimento seco foi

submetido a banho-seco, a uma temperatura de 56°C, por dez minutos. O DNA

foi suspenso em 30 μL de Tris-EDTA (TE) e incubado em banho-seco a 56°C,

por 15 minutos. As amostras de DNA extraído foram armazenadas a uma

temperatura de –20°C até serem efetivamente utilizadas.

4.4.2 Amplificação de DNA de parvovírus suíno

A amplificação do DNA do PPV foi realizada a partir da utilização

adaptada do protocolo de McKillen et al. (2007). Os primers utilizados estão

descritos no Quadro 3. As reações foram realizadas nas seguintes etapas:

aquecimento da amostra a uma temperatura de 94ºC, por 15 minutos; 35 ciclos

(94ºC por 30 segundos, 57ºC por 30 segundos e 72ºC por 30 segundos) e a

uma extensão final, por cinco minutos, a 72ºC. O controle positivo foi

direcionado para o gene da beta actina, conforme protocolo descrito por Hui et

al. (2004).

QUADRO 3 – Descrição da seqüência de nucleotídeos dos oligonucleotídeos utilizados na reação de PCR para detecção de DNA de PPV das amostras de fezes

Reação Primer Sequência dos Oligonucleotídeos Tamanho do

fragmento (pb) Autor

PCR F 5’-AAGAGCCTGCTTTGGTGAAA -3’

414 Mckillen et al., 2007 R 5’-AGAGTTTTGGAGCAAAGGCA -3’

29

4.5 Análise molecular da secreção nasal

4.5.1 Extração do DNA da secreção nasal

Em microtubos, foram adicionados 500 µL de solução de lise (Tris-

HCl pH 8,0 a 10 mM; NaCl 100 mM; EDTA 25 mM, pH 8,0; duodecil sulfato de

sódio 1% e 10 µL de proteinase K a 20 mg/mL) a 100 µL de amostra. O

material foi homogeneizado e incubado a uma temperatura de 56°C, por duas

horas. Em seguida, foram adicionados 250 µL de fenol e 250 µL de clorofórmio

à solução, a qual foi, então, na sequência, homogeneizada e centrifugada a

12.000 x g, por dez minutos, a 4°C. O sobrenadante foi transferido para outro

microtubo, de 1,5 mL de volume, contendo 400 µL de propanol. Após a

homogeneização, as amostras foram mantidas a uma temperatura de -20°C,

por duas horas.

Após este período, as amostras foram centrifugadas a 12.000 x g,

por 25 minutos, a 4°C. O sedimento foi suspenso em 900 µL de etanol a 70%,

centrifugado a 12.000 x g, por dez minutos, a 4°C. O sobrenadante foi

descartado por inversão, e o sedimento seco submetido a banho-seco a uma

temperatura de 56°C, por dez minutos. Por fim, o DNA foi ressuspenso em 30

µL de solução TE (10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA, pH 8,0), e incubado em

banho-seco a 56°C, por 15 minutos. As amostras com DNA extraído foram

armazenadas a –20°C até a sua utilização.

4.5.2 Amplificação de DNA de Mycoplasma hyopneumoniae

A amplificação foi realizada utilizando o protocolo de Artiushin et al.

(1993). Os primers utilizados estão descritos no Quadro 4. Um volume de 2,5

μL de DNA extraído foi adicionado a uma reação com volume final de 25 μL,

contendo 12,5 μL de DreamTaq™ Green PCR Master Mix (2X), 0,4 μM de cada

primer e água DNAse free q.s.p..

30

QUADRO 4 – Descrição da seqüência de nucleotídeos dos oligonucleotídeos utilizados na reação de PCR para detecção de DNA de M. hyopneumoniae das amostras das secreções nasais

Reação Primer Sequência dos Oligonucleotídeos Tamanho do

fragmento (pb) Autor

PCR F 5’- AAGTTCATTCGCGCTAGCCC -3’

483 Artiushin et al., 1993 R 5’- GCTCCTACTCCATATTGCCC -3’

As reações desenvolveram-se cronologicamente na seguinte ordem:

aquecimento inicial da amostra em uma temperatura de 94°C, por dez minutos,

tendo sido submetida, na sequência, a 39 ciclos (94°C por 30 segundos, 57°C

por 30 segundos e 72°C por 60 segundos) e, por fim, foi submetida a uma

extensão final a 72°C, por sete minutos.

As amostras de secreção nasal foram testadas para o gene da β-

actina, pelo método da PCR, com o intuito de descartar falso negativo,

conforme protocolo descrito por Hui et al. (2004).

A visualização dos fragmentos amplificados foi realizada através de

transiluminação do gel de agarose a 1,5% em luz ultravioleta, após sua

coloração com GelRed Nucleic Acid Gel Stain TM (Biotium, California, EUA),

conforme as instruções do fabricante. Os fragmentos amplificados foram

comparados a um marcador de 100 pb.

4.6. Pesquisa e titulação de anticorpos para parvovírus suíno

A identificação de anticorpos para o PPV foi realizada através da

técnica de inibição da hemaglutinação (HI), de acordo com o descrito por Joo et

al. (1976). O antígeno utilizado foi previamente titulado através de reação de

hemaglutinaçao utilizando hemácias de cobaia e ajustado para um título de 4

unidades hemaglutinantes (UH).

Previamente à pesquisa dos anticorpos, as amostras de soro foram

inativadas em banho maria por 30 minutos, em uma temperatura de 56ºC, e

tratadas posteriormente com solução de kaolim 25% e com hemácias de

cobaia com o objetivo de se promover a retirada de inibidores inespecíficos. O

soro tratado foi, então, na sequência, analisado frente ao antígeno de PPV com

4 UH . O soro foi considerado positivo se inibiu a aglutinação das hemácias ao

31

antígeno de PPV. O título de anticorpos foi considerado como a maior diluição

do soro que inibiu a hemaglutinação.

32

5. RESULTADOS

Após a realização da PCR no pool de fragmentos de órgãos e nas

fezes dos animais estudados, nenhuma amostra amplificou fragmento de PPV

(Figura 2).

FIGURA 2- Eletroforese em gel de agarose 1,5%. Reação de PCR para PPV a partir do pool dos fragmentos de tecidos obtidos de suíno de sistema intensivo de produção reagentes para PCV2. (PM) Peso molecular 100pb; (CN1; CN2) Controle negativo; (CP1; CP2) Controle positivo; (1G1 - 9G1) amostras dos 20 animais.

Dos 47 animais estudados, amostras de soro de 37 deles foram

testadas pela HI. Todas (100%) demonstraram a presença de anticorpos anti

PPV. O título das amostras variou de 1:2 a maior ou igual a 1:256 (Quadro 5).

33

QUADRO 5 – Resultado da titulação de anticorpos anti PPV realizada pela técnica de HI em soro de 37 animais

Animal Titulação Resultado Animal Titulação Resultado

1G1 >1:256 POSITIVO 4G3 1:32 POSITIVO

2G1 1:32 POSITIVO 5G3 >1:256 POSITIVO

3G1 >1:256 POSITIVO 6G3 1:32 POSITIVO

4G1 1:64 POSITIVO 1G4 1:64 POSITIVO

5G1 1:4 POSITIVO 2G4 >1:256 POSITIVO

6G1 1:128 POSITIVO 3G4 1:128 POSITIVO

7G1 >1:256 POSITIVO 2G5 1:8 POSITIVO

8G1 1:4 POSITIVO 1G6 1:4 POSITIVO

9G1 1:2 POSITIVO 2G6 1:2 POSITIVO

2G2 >1:256 POSITIVO 4G6 >1:256 POSITIVO

3G2 1:128 POSITIVO 5G6 1:64 POSITIVO

4G2 >1:256 POSITIVO 6G6 1:64 POSITIVO

5G2 >1:256 POSITIVO 7G6 >1:256 POSITIVO

6G2 >1:256 POSITIVO 8G6 1:16 POSITIVO

7G2 >1:256 POSITIVO 9G6 1:64 POSITIVO

8G2 1:128 POSITIVO 10G6 1:32 POSITIVO

1G3 1:8 POSITIVO 11G6 1:8 POSITIVO

2G3 >1:256 POSITIVO 12G6 1:128 POSITIVO

3G3 1:16 POSITIVO

Das 47 amostras de secreção nasal coletadas, sete não

apresentaram condições adequadas de extração, razão pela qual foram

descartadas. Do total de 40 amostras testadas pela técnica de PCR, seis (15%)

(4G1, 7G1, 8G1, 3G4, 1G5 e 3G5) amplificaram o fragmento de M.

hyopneumoniae (Figura 3 e 4) e foram consideradas positivas no teste

diagnóstico.

As seis amostras positivas eram provenientes de três das seis

granjas estudadas (granja A: amostras 4G1, 7G1 e 8G1/ granja D: amostra

3G4 / granja E: amostras 1G5 e 3G5). Das seis amostras referidas, três eram

oriundas de animais da fase de creche (amostras 4G1, 1G5 e 3G5) e as outras

três provenientes de animais da fase de recria/terminação (amostras 7G1, 8G1

e 3G4).

34

2G1 3G1 4G1 5G1 6G1 7G1 8G1 9G1 1G2 2G2 4G2 PM 5G2 6G2 7G2 8G2 1G3 2G3 CN CP

FIGURA 3- Eletroforese em gel de agarose 1,5%. Reação de PCR para M. hyopneumoniae a partir da secreções nasais. (PM) Peso molecular 100pb; (CP) Controle positivo; (CN) Controle negativo; (2G1 – 2G) amostras de 17 animais; (4G1, 7G1, 8G1) amostras positivas. 2G4 3G4 4G4 5G4 6G4 1G5 2G5 3G5 5G5 1G6 3G6 PM 4G6 5G6 9G6 10G6 11G6 12G6 CN CP

FIGURA 4- Eletroforese em gel de agarose 1,5%. Reação de PCR para M. hyopneumoniae a partir das secreções nasais. (PM) Peso molecular 100pb; (CP) Controle positivo; (CN) Controle negativo; (2G4 – 12 G6) amostras de 17 animais; (3G4, 1G5, 3G5) amostras positivas.

437 pb

437 pb

35

6. DISCUSSÃO

A ocorrência de coinfecções do PCV2 com outros agentes virais ou

bacterianos é bem estabelecida, e tem sido relatada em diversos estudos

(CARRASCO et al., 2000; PALLARES et al., 2002; ALLAN et al., 2004; GRAU-

ROMA et al., 2011). Dentre os agentes virais que, com maior frequência, são

associados ao PCV2 para manifestações clínicas da PCVAD, está o PPV. No

presente estudo, nenhuma das amostras analisadas demonstrou a presença do

DNA de PPV.

As amostras aqui analisadas eram de suínos provenientes das fases

de creche (20 a 63 dias de vida) e de recria (63 a 150 dias de vida). Quando

analisado o histórico dos rebanhos em que foram coletadas as amostras

(SOARES, 2011), com exceção dos animais da granja D, foi constatada a

aplicação de vacina para o PPV em todas as fêmeas gestantes antes da

parição. Segundo Mengeling et al. (1999) e Fenati et al. (2009), a imunidade

colostral para parvovírus pode perdurar até que o animal atinja um tempo de

vida compreendido entre 20 a 24 semanas da data do nascimento,

circunstância que pode justificar a soropositividade dos leitões em estudo.

Indubitavelmente, nas condições do presente estudo, a imunidade em comento

pode ter contribuído para que os animais não apresentassem infecção pelo

PPV.

No caso da granja D, cujas matrizes não receberam vacina, foram

analisados apenas três dos seis soros coletados, e todos eles apresentaram

anticorpos. Nesse caso, infere-se que a soropositividade seja proveniente de

imunidade materna em virtude de infecção prévia.

A ausência de DNA de PPV e a presença de anticorpos anti-PPV

nos animais deste estudo, acometidos pela PCVAD, são circunstâncias que

vão ao encontro dos resultados observados por Ostanello et al. (2005), os

quais inocularam, experimentalmente, PCV2 e PPV em leitões que ingeriram

colostro contendo anticorpos para ambos os vírus. Os autores, posteriormente,

apesar de terem identificado material genético de PCV2 em cinco dos oito

animais inoculados, não detectaram o DNA do PPV em nenhum dos oito

animais, o que demonstra a importância da vacinação materna como meio de

propiciar a transferência de anticorpos via colostro para a prole. Este fato tem

36

importância especial no que se refere ao desenvolvimento de infecções

associadas ao PCV2 em animais que estejam nas fases de creche e de recria,

como aqui observado.

A ausência de PPV nos órgãos dos animais analisados neste

estudo, entretanto, não descarta a possibilidade de participação do agente de

forma associada ao PCV2, dada a frequência da parvovirose no território

brasileiro (BERSANO et al., 1993; BARTHASSON, 2006; STRECK, 2009;

LIMA, 2010). Dessa forma, a pesquisa de PPV em evento com suspeita de

PCVAD não deve ser relegada.

Em estudo realizado nos EUA durante os anos de 2001 e 2002, foi

diagnosticado que 19,0% dos suínos com SMDS analisados estavam

coinfectados com M. hyopneumoniae, antecedido em número de casos apenas

pelo vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRSV) (PALLARES

et al., 2002). No Brasil, não há, ainda, registro de doença clínica provocada

pelo PRRSV, sendo frequente, todavia, a ocorrência de enfermidade pelo M.

hyopneumoniae (SOBESTIANSKY et al., 2007). Apesar de a infecção

concomitante de micoplasma com PCV2 já ter sido descrita na literatura sob a

forma experimental (OPRIESSNIG et al., 2004) e natural (PALLARES et al.,

2002), até o presente momento, entretanto, ela não foi relatada no Brasil.

A frequência de 15,0% de animais positivos para micoplasma

observada neste estudo é maior do que a observada por Sibila et al. (2008) e

Nathues et al. (2010), mas semelhante à descrita por Moorkamp et al. (2009) e

Villareal (2010). Diferenças nos níveis de frequência podem estar relacionadas

com a prevalência do micoplasma nas populações suínas, de acordo com

Marois et al. (2008), os fluidos traqueo-brônquicos constituem a amostra mais

adequada para identificação de micoplasma, uma vez que o M.

hyopneumoniae ataca o epitélio ciliado do trato respiratório. Todavia, em razão

da praticidade do procedimento de coleta, é mais frequentemente utilizada a

colheita de secreção nasal por meio de suabes (PIETERS et al., 2009;

VILLAREAL, 2010). Dessa forma, a frequência observada neste trabalho pode

estar subestimada.

No presente estudo, seis dos animais analisados demonstraram a

presença de DNA de M. hyopneumoniae. Destes seis, três eram da granja A,

clinicamente diagnosticada com surto de pneumonia enzoótica (dados não

37

mostrados). Os outros três animais positivos eram oriundos das granjas D e E.

Das seis granjas analisadas, as designadas pelas letras “A”, “D” e “E” não

relataram a prática de vacinação para micoplasma, diferentemente das outras

três granjas, (B, C e F), para as quais houve registro de vacinação para o

referido agente (SOARES, 2011). Dessa forma, os resultados aqui obtidos

estão em conformidade com o status imunológico dos animais. Deve ser

ressaltado que à semelhança do observado para o PPV, a prática da vacinação

constitui uma grande aliada no âmbito das medidas de proteção dos animais,

não apenas em face do micoplasma, como também em relação à ocorrência de

PCVAD.

Avaliando as caracteristicas clínicas e patológicas dos animais

utilizados no presente estudo por Sales (2011) e Soares (2011), ficou evidente

a ocorrência de sinais respiratórios em elevada frequência (65%), sobretudo

nos animais provenientes das granjas A, D, E e F. Traçando um comparativo

entre os resultados obtidos no presente estudo e os dados observados em

ambos os trabalhos, com excessão de um animal oriundo da granja E (amostra

1G5), todos os outros cinco suínos (amostras 4G1, 7G1, 8G1, 3G4 e 3G5)

apresentaram sinais respiratórios, notadamente, tosse (dados não mostrados).

De acordo com Opriessnig et al. (2004), a tosse é um evento clínico presente

em animais experimentalmente infectados com M. hyopneumoniae, ou, ainda,

coinfectados com PCV2, mas não em animais infectados apenas com PCV2.

Além disso, dentre os órgãos avaliados macroscopicamente, o

pulmão foi o que mais apresentou alterações no grupo dos animais analisados

(SALES, 2011; SOARES, 2011). Áreas de hepatização vermelha e o não

colabamento pulmonar, lesões descritas com maior frequência em animais com

infecção por M. hyopneumoniae do que naqueles infectados com PCV2

(MORÉS et al., 2007), foram observadas em 75% dos animais, constatação

que sugere a presença do micoplasma nas granjas analisadas (SALES, 2011;

SOARES, 2011). Considerando os achados de necropsia dos animais

eutanasiados (dados nao mostrados) e positivos para micoplasma identificados

neste estudo, todos eles apresentavam as lesões pulmonares características

acima descritas.

A linfoadenopatia, outro achado macroscópico, ausente em suínos

infectados somente com M. hyopneumoniae, mas evidente em animais

38

contaminados apenas por PCV2 ou com infecção concomitante com

micoplasma (OPRIESSNIG et al., 2004), também foi observada nos animais

avaliados no presente estudo (SALES, 2011; SOARES, 2011).

As evidências clínicas e patológicas verificadas nos animais

analisados são compatíveis com a presença de infecção concomitante com os

agentes avaliados, tal como identificado neste estudo, de forma que aquelas

evidências devem ser tomadas como indícios da presença de micoplasma em

plantéis com PCVAD, que não tenham, porém, sido imunizados para esse

agente.

Dessa forma, e reforçando o proposto por Soares (2011), os

resultados obtidos permitem sugerir que as enfermidades respiratórias,

especialmente aquelas associadas com M. hyopneumoniae, tal como

identificado neste estudo, podem representar as manifestações clínicas mais

frequentes em suínos acometidos pela PCVAD no âmbito dos plantéis do

Estado de Goiás estudados.

39

7. CONCLUSÕES

Nas condições do presente estudo, no âmbito da população analisada, o

PPV não foi associado ao PCV2, sendo que a presença de anticorpos nos

leitões em decorrência de vacinação ou a infecção prévia das matrizes

pode, ao que parece, ter desempenhado um papel determinante à

ocorrência dessa situação;

O presente estudo reforça o inicialmente postulado de que as enfermidades

respiratórias, especialmente aquelas associadas ao M. hyopneumoniae, são

as patogenias mais frequentemente observadas em animais com PCVAD

nas granjas de produção intensiva de suínos em Goiás;

Esse foi o primeiro estudo que identificou Mycoplasma hyopneumoniae em

amostras de suínos diagnosticados com a PCVAD no Estado de Goiás e,

ao nosso conhecimento, no Brasil.

40

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Os dados obtidos neste estudo estão em consonância com os

resultados relatados em animais acometidos pela PCVAD em diversos países e

reforçam o conhecimento epidemiológico sobre o PCV2.

Outros agentes, até então pouco estudados, têm sido relatados

associados ao PCV2, como é o caso do torque teno vírus tipos 1 e 2 (TTV), os

quais, inclusive, foram diagnosticados coinfectando alguns dos animais objeto

do presente trabalho (SOARES, 2011).

Outros vírus têm sido descritos coinfectando animais com a

síndrome circovirose e doenças associadas, como descrito por Souza (2011)

que fez o primeiro relato de parvovírus suíno tipo 2 (PPV2) e hokovírus suíno

(PHoV) em suínos com SMDS e por Cibulski (2012) que relatou pela primeira

vez a presença dos bocavírus suínos (PBoV1, PBoV2, PBoV3 e PBoV4) no

Brasil associados com PCV2 em animais acometidos pela PCVAD.

Todavia, poucos são os dados disponíveis acerca de outros agentes,

como é o caso do M. hyopneumoniae, descrito neste estudo, cuja presença nos

rebanhos suínos brasileiros é evidente. Assim sendo, o presente trabalho

representa uma contribuição científica para a montagem de um complexo

cenário, que, mediante outros estudos, há de ser definitivamente equacionado.

É importante uma investigação diagnóstica detalhada das granjas

em que há ocorrência da PCVAD, com vistas à adoção de estratégias de

intervenção mais eficientes. Como existem muitos agentes patogênicos

envolvidos na transmissão da PCVAD, o mecanismo de ação de cada um deles

não foi, ainda, devidamente elucidado, pelo que novos estudos, mais

aprofundados, afiguram-se necessários para o completo entendimento da

síndrome.

Uma condição que restou devidamente clara, no presente estudo,

refere-se à necessidade da adoção da prática da vacinação para enfermidades

passíveis de prevenção, como é o caso da parvovirose e da micoplasmose.

41

REFERÊNCIAS

1. ALLAN, G. Advances in PCV2 research – Results of the european Project nº 513928: control of porcine circovirus diseases (PCVDS): Towards improved food quality and safety. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE VETERINÁRIOS ESPECIALISTAS EM SUÍNOS, 13., 2007, Florianópolis. Resumos... Florianópolis: Associação Brasileira dos Veterinários Especialistas em Suínos, p. 125-138, 2007. 2. ALLAN, G.M.; ELLIS, J. Porcine circovirus: A review. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, Columbia, v.12, p.3-14, 2000. 3. ALLAN, G.M.; MCNEILLY, F.; ELLIS, J.; KRAKOWKA, S.; BOTNER, A.; MCCULLOUGH, K.; NAUWYNCK, H.; KENNEDY, S.; MEEHAN, B.; CHARREYRE, C. PMWS: experimental model and co-infections. Veterinary Microbiology, Amsterdam, v.98, p.165-168, 2004.

4. ANDREWS, C. H. Generic names of viruses of vertebrates. Virology,

New York, v.40, p.1070-1071, 1970. 5. ARTIUSHIN, S.; STIPKOVITS, L.; MINION, F.C. Development of polymerase chain reaction primers to detect Mycoplasma hyopneumoniae. Molecular and Cellular Probes, London, v.7, p. 101-105, 1993. 6. BARTHASSON, D. L. Identificação molecular do circovírus suíno tipo 2 e vírus da hepatite E em suínos de criações extensivas de Goiás.

2006. 90f. Tese (Doutorado em Ciência Animal) – Escola de Veterinária, Universidade Federal de Goiás, Goiânia. 7. BATISTA, L. Uma revision breve de la circovirosis porcina. Solocerdos,

Barcelona: La columna Del investigador, n. 16, p. 3, 2009. 8. BATISTA, L.; PIJOAN, C.; RUIZ, A.; UTRERA, V.; DEE, S. Assessment of transmission of Mycoplasma hyopneumoniae by personnel. Journal of Swine Health and Production, Perry, Iowa, v.12, p.75–77, 2004. 9. BERGERON, J.; MENEZES, J.; TIJSSEN, P. Genomic organization and mapping of transcription and translation products of the NADL-2 strain of porcine parvovirus. Virology, New York, v.197, p. 86 – 98, 1993. 10. BERSANO, J.G.; SCHOTTEN, M.H.S.; KROEF, S.S.; BASTOS, G.M. Dados preliminares sobre a ocorrência de anticorpos para o parvovírus suíno no Estado de São Paulo. In: VII Reunião Anual do Instituto Biológico, Anais…, São Paulo, v.30, p.17, 1993. 11. CALSAMIGLIA, M.; PIJOAN, C.; TRIGO, A. Application of a nested polymerase chain reaction assay to detect Mycoplasma hyopneumoniae from

42

nasal swabs. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, Columbia, v.11,

p.246-251, 1999. 12. CAPRIOLI, A.; MCNEILLY, F.; MCNAIR, I.; LAGAN-TREGASKIS, P.; ELLIS, J.; KRAKOWKA, S.; MCKILLEN, J.; OSTANELLO, F.; ALLAN, G. PCR detection of porcine circovirus type 2 (PCV2) DNA in blood, tonsillar and faecal suabes from experimentally infected pigs. Research in Veterinary Science,

London, v. 81, pg. 287-292, 2006. 13. CARRASCO, L.; SEGALES, J.; BAUTISTA, M.J.; GOMEZ-VILLAMANDOS, J.C.; ROSELL, C.; RUIZ-VILLAMOR, E.; SIERRA, M.A. Instestinal chamydial infection concurrent with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs. Veterinary Research, Paris, v.146, n.1, p. 21-23,

2000. 14. CARRIJO, K.F. Diagnóstico de Mycoplasma hyopneumoniae e Circovírus suíno tipo 2 em tecido pulmonar, renal e linfóide e de Leptospira spp. em suínos abatidos sob inspeção sanitária. 2012. 155f. Tese (Doutora em Higiene Veterinária e Processamento Tecnológico de Produtos de Origem Animal) – Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ. 15. CARTWRIGHT, S.F.; HUCK, R.A. Viruses isolated in association with herd infertility, abortions and stillbirths in pigs. Veterinary Record, London,

v.81, p. 196 – 197, 1967. 16. CASTRO, A.M.M.G. Caracterização genética de amostras brasileiras de Circovírus suíno tipo 2 (PCV-2). 2005. 120f. Tese (Doutorado em

Medicina Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo. 17. CFMV - CONSELHO FEDERAL DE MEDICINA VETERINÁRIA. Resolução Nº 1000, de 11 de maio de 2012. Dispõe sobre procedimentos e métodos de eutanásia em animais, e dá outras providências. Diário Oficial da União, Brasília, 17 maio 2012. 18. CHAE, C. A review of porcine circovirus-2 associated syndromes and diseases. Veterinary Journal, London, v.169, n.3, p. 326-336, 2004.

19. CIACCI-ZANELLA, J.R.; SIMON, N.L.; PINTO, L.S.; VIANCELLI, A.; FERNANDES, L.T.; HAYASHI, M.; DELLAGOSTIN, O.A.; ESTEVES, P.A. Detection of porcine Circovirus type 2 (PCV2) variants PCV2-1 and PCV2-2 in Brazilian pig population. Research in Veterinary Science, London, v. 87, p. 157–160, 2009. 20. CIBULSKI, S.P. Agentes virais potencialmente associados à síndrome multissistêmica do definhamento dos suínos. 2012. 160f.

Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias), Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre.

43

21. CONCEIÇÃO, F.R.; DELLAGOSTIN, O.A. Etiopatogenia e Imunoprofilaxia da peumonia enzoótica suína. Ciência Rural, Santa Maria, v.36, n.3, p. 1034 – 1042, 2006. 22. DAEFFLER, L.; HORLEIN, R.; ROMMELAERE, J.; NUESCH, J.P. Modulation of minute virus of mice cytotoxic activities through site-directed mutagenesis within the NS coding region. Journal of Virology, Washington,

v.77, p.12466-12478, 2003. 23. ELLIS, J.A.; BRATANICH, A.; CLARK, E.G.; ALLAN, G.; MEEHAN, B.; HAINES, D.M.; HARDING, J.; WEST, K.H.; KRAKOWKA, S.; KONOBY, C.; HASSARD, L.; MARTIN, K; MCNEILLY, F. Co-infection by porcine circoviruses and porcine parvovirus in pigs with naturally acquired postweaning multisystemic wasting syndrome. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, Columbia, v.12, p.21-27, 2000.

24. ELLIS, J.; SPINATO, M.; YONG, C.; WEST, K.; MCNEILLY, F.; MEEHAN, B.; KENNEDY, S.; CLARK, E.; KRAKOWKA, S.; ALLAN, G. Porcine Circovirus 2–associated disease in Eurasian wild boar. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, Columbia, v.15, p.364–368, 2003. 25. FANO, E.; PIJOAN, C.; DEE, S. Mycoplasma hyopneumoniae prevalence at weaning as a predictor of the groups' subsequent Mycoplasma status. In: Proceedings of Allen D. Leman Swine Conference, Minnesota, USA, p. 109-113, 2005. 26. FENATI, M.; ARMAROLI, E.; CORRAIN, R.; GUBERTI, V. Indirect estimation of porcine parvovirus maternal immunity decay in free-living wild boar (Sus scrofa) piglets by capture-recapture data. The Veterinary Journal,

London, v. 180, p. 262-264, 2009. 27. FERNANDES, L. T.; CIACCI-ZANELLA, J. R.; SOBESTIANSKY, J.; SCHIOCHET, M. F.; TROMBETTA, C. Coinfecção experimental de circovírus suíno tipo 2 isolado no Brasil e parvovírus suíno em suínos SPF. Arquivos Brasileiros de Medicina Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte, v.58, n.1, p.

1-8, 2006. 28. FRANÇA, T. N.; PEIXOTO, P. V.; BRITO, M. F.; MORÉS, N.; CIACCI-ZANELLA, J. R. Surto de circovirose (síndrome definhante multissistêmica de suínos desmamados) no Estado do Rio de Janeiro. Pesquisa Veterinária Brasileira, Seropédica, v.25, n.1, p.39-53, 2005.

29. GIBBS M.; WEILLER G. Evidence that a plant virus switched hosts to infect a vertebrate and then recombined with a vertebrate-infecting virus. Proceedings of the National Academy of Sciences, Washington, v.96 p. 8022 – 8027, 1999. 30. GRAU-ROMA, L.; CRISCI, E.; SIBILA, M.; LOPEZ-SORIA, S.; NOFRARIAS, M.; CORTEY, M.; FRAILE, L.; OLIVERA, A.; SEGALES, J. A proposal on porcine circovirus type 2 (PCV2) genotype definition and their

44

relation with postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) occurrence. Veterinary Microbiology, Amsterdam, v.128, p.23-35, 2008. 31. GRAU-ROMA, L.; FRAILE, L.; SEGALES, J. Recent advances in the epidemiology, diagnosis and control of diseases caused by porcine circovirus type 2. The Veterinary Journal, London, v.187, p.23–32, 2011. 32. HA, Y.; AHN, K.K.; KIM, B.; CHO, K.-D.; LEE, B.H.; OH, Y.-S.; KIM, S.-H.; CHAE., C. Evidence of shedding of porcine circovirus type 2 in milk from experimentally infected sows. Research in Veterinary Science, London, v.86, p. 108–110, 2009. 33. HIJIKATA, M.; ABE, K.; WIN, K.; SHIMIZU, Y.K.; KEICHO, N.; YOSHIKURA, H. Identification of new parvovirus DNA sequence in swine sera from Myanmar. Japanese Journal of Infectious Diseases, Tokyo, v.54, p. 244

– 245, 2001. 34. HUI, R.K.H.; ZENG, F.; CHAN, C.M.N.; YUEN, K.Y.; PEIRIS, J.S.M.; LEUNG, F.C.C. Reverse transcriptase PCR diagnostic assay for the coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. Journal of Clinical Microbiology, Washington, v.42, p.1994-1999, 2004.

35. ICTV. International Committe on Taxonomy of Viruses, 2011. Dispõe sobre a taxonomia viral. Disponível em http://ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?version=2011&bhcp=1. Acesso em: 09 nov 2012. 36. JACQUES, M.; BLANCHARD, B.; FOIRY, B.; GIRARD, C.; KOBISCH, M. In vitro colonization of porcine trachea by Mycoplasma hyopneumoniae. Annales de Recherches Veterinaires, Paris, n. 23, p.239–247, 1992. 37. JOO, H.S.; DONALDSON-WOOD, C.O.R.; JOHNSON R.H. A standardised haemagglutination inhibition test for porcine parvovirus antibody. Australian Veterinary Journal, Victoria, v.52, p.422-424, 1976. 38. KIM, J.; HAN, D.U.; CHOI, C.; CHAE, C. Diferentiation of porcine circovirus (PCV)-1 and PCV-2 in boar semen using a multiplex nested polymerase chain reaction. Journal of Virological Methods, Amsterdam, v.98, p.25–31, 2001. 39. KRAKOWKA, S.; ELLIS, J.; MCNEILLY, F.; RIGLER, S.; RIGS, D. M.; ALLAN, G. Activation of the immune system is the pivotal event in production of wasting disease in pigs infected with PCV2. Veterinary Pathology, Basel, v.38, n.1, p.31-42, 2001. 40. LAU, S. K.; WOO, P. C.; TSE, H.; FU, C. T.; AU, W. K.; CHEN, X. C.; TSOI, H. W.; TSANG, T. H.; CHAN, J. S.; TSANG, D.N.G.; LI, K.S.M.; TSE, C.W.S.; NG, T.; TSANG, O.T.Y.; ZHENG, B.; TAM, S.; SHAN, K.; ZHOU, B.; YUEN, K. Identification of novel porcine and bovine parvoviruses closely related

45

to human parvovirus 4. Journal of General Virology, London, v.89, p.1840–

1848, 2008. 41. LEFEBVRE, D.; BARBE, F.; ATANASOVA, K.; NAUWYNCK, H., 2008. Inoculation of porcine foetuses with different genotypes and doses of PCV2. In: INTERNATIONAL PIG VETERINARY SOCIETY CONGRESS, 20, 2008, Durban, África do Sul. Anais… Durban: IPVS, 2008.

42. LENEVEU, P.; ROBERT, N.; KEÏTA, A.; PAGOT, E.; POMMIER P.; TESSIER, P. Lung lesions in pigs at slaughter: a 2-year epidemiological study in France. International Journal of Applied Research in Veterinary Medicine, Apopka, v.3, p.259–265, 2005. 43. LIMA, E.S. Diagnóstico sorológico de doenças infecciosas causadoras de falhas reprodutivas em suínos. 2010. 113f. Dissertação

(Mestrado em Ciência Animal). Centro de Ciências Agroveterinárias, Universidade do Estado de Santa Catarina, Lages. 44. LIU, J.; CHEN, I.; DU, Q.; CHUA, H.; KWANG, J. The ORF3 protein of porcine circovirustype 2 is involved in viral pathogenesis in vivo. Journal of Virology, Washington, v.80, p. 5065-5073, 2006.

45. LÓPEZ-SORIA S.; SEGALES J.; ROSE N.; VINAS M.J.; BLANCHARD P.; MADEC F.; JESTIN A.; CASAL J.; DOMINGO, M. Exploratory study on risk factors for postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in Spain. Preventive Veterinary Medicine, Amsterdam, v.69, p. 97-107, 2005. 46. LÓPEZ-SORIA, S.; GRAU-ROMA, L.; SEGALES, J. Epidemiologia de la circovirosis porcina. Suis, Zaragoza, v.49, p.14-23, 2008.

47. LÓPEZ-SORIA, S.; NOFRAIAS, M.; CALSAMIGLIA, M.; ESPINAL, A.; VALERO, O.; RAMIREZ-MENDOZA, H.; MÍNGUEZ, A.; SERRANO, J.M.; CALLÉN, A.; SEGALES, J. Post-weaning multisystem wasting syndrome (PMWS) clinical expression under field conditions is modulated by the pig genetic background. Veterinary Microbiology, Amsterdam, v,149, p.352-357,

2011. 48. MADEC, F.; EVENO, E.; MORVAN, P.; HAMON, L.; BLANCHARD, P.; CARIOLET, R.; A MENNA, N.; MORVAN, H.; TRUONG, C.; M AHÉ, D.; ALBINA, E.; JESTIN, A. Post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in pigs in France: clinical observation from follow-up studies on affected farms. Livestock Production Science, Amsterdam, v. 63, p. 223-233, 2000. 49. MADEC, F.; ROSE, N.; GRASLAND, B.; CARIOLET, R.; JESTIN, A. Post-weaning multisystemic wasting syndrome and other PCV2-related problems in pigs: a 12-year experience. Transboundary and Emerging Diseases, Surrey, v.55, p.273-283, 2008.

46

50. MADSON, D.M.; PATTERSON, A.R.; RAMAMOORTHY, S.; PAL, N.; MENG, X.J.; OPRIESSNIG,T. Effect of porcine circovirus type 2 (PCV2) vaccination of the dam on PCV2 replication in utero. Clinical Vaccine Immunology, Washington, v.16, p.830 – 834, 2008. 51. MADSON, D.; PATTERSON, A.; RAMAMOORTHY, S.; PAL, N.; MENG, X.J.; OPRIESSNIG, T. Reproductive failure experimentally induced in sows via artificial inseminationwith semen spiked with porcine circovirus type 2 (PCV2). Veterinary Pathology, Basel, v.46, p.707–716, 2009.

52. MARTIN, H.; POTIER, M.F.; MARIS, P. Virucidal efficacy of nine commercial disinfectants against porcine circovirus type 2. Veterinary Journal, London, v.177, p. 388–393, 2008. 53. MAROIS, C.; CARIOLET, R.; MORVAN, H.; KOBISCH, M. Transmission of pathogenic respiratory bacteria to specific pathogen free pigs at slaughter. Veterinary Microbiology, Amsterdam, v.129, p.325-332, 2008.

54. MCCULLOUGH, K. C.; RUGGLI, N.; SUMMERFIELD, A. Dendritic cells—At the front-line of pathogen attack. Veterinary Immunology and Immunopathology, Amsterdam, v.128, p.7-15, 2009.

55. MCKILLEN, J.; HJERTNER, B.; MILLAR, A.; MCNEILLY, F.; BELÁK, S.; ADAIR, B.; ALLAN, G. Molecular beacon real-time PCR detection of swine viruses. Journal of Virological Methods, Amsterdam, v.140, p.155-165, 2007.

56. MEEHAN, B.M.; MCNEILLY, F.; TODD, D.; KENNEDY, S.; JEWHURST, V.A.; ELLIS, J.A.; HASSARD, L.E.; CLARK, E.G.; HAINES, D.M.; ALLAN, G.M. Characterization of novel circovirus DNAs associated with wasting syndromes in pigs. Journal of General Virology, London, v.79, p. 2171–2179, 1998. 57. MENGELING, W.L.; B.E.; D’ALLAIRE, S.; TAYLOR, D.J. Porcine Parvovirus. Diseases of Swine, Ames, 8.ed. Cap.8, p. 119-124, 1999.

58. MENGELING, W.L.; LAGER, K.M.; VORWALD, A.C. The effect of porcine parvovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus on porcine reproductive performance. Animal Reproduction Science,

Amsterdam, v.60 - 61, p. 199-210, 2000. 59. MEYNS, T.; MAES, D.; CALUS, D.; RIBBENS, S.; DEWULF, J.; CHIERS, K.; KRUIF, A.; COX, E.; DECOSTERE, A.; HAESEBROUCK, F. Interactions of highly and low virulent Mycoplasma hyopneumoniae isolates with the respiratory tract of pigs. Veterinary Microbiology, Amsterdam, v.20, p.87-95, 2007. 60. MOORKAMP, L.; HEWICKER-TRAUTWEIN, M.; BEILAGE, E.B. Occurrence of Mycoplasma hyopneumoniae in coughing piglets (3-6 weeks of age) from 50 herds with a history of endemic respiratory disease. Transboundary and Emerging Diseases, v.56, p.54-56, 2009.

47

61. MORAES M.P.; COSTA, P.R.S. Parvoviridae. In: FLORES, E. (Org.). Virologia Veterinária, Santa Maria, p. 275-296, 2007. 62. MORÉS, N.; BARCELLOS, D.; ZANELLA, J.C. Circovirose suína. In: SOBESTIANSKY, J.; BARCELLOS, D. Doenças dos Suínos. Cânone editorial,

768p, Goiânia, p. 213-226, 2007. 63. MUZYCZKA, N.; BERNS, K.I. Parvoviridae: the viruses and their replication. In: GRIFFIN, D.M.; MARTIN, M.A.; ROIZMAN, B.; STRAUS, S.E. Fields Virology, San Francisco, v.2, 4 ed, Lippincott Williams & Wilkins, p. 2327-2359, 2001. 64. NATHUES, H.; STRUTZBERG-MINDER, K.; KREIENBROCK, L.; GROSSE, E.B. Occurrence of Mycoplasma hyopneumoniae infections in suckling and nursery pigs in a region of high pig density. Veterinary Record,

London, v.13, p.194-198, 2010. 65. O’DEA, M.A.; HUGHES, A.P.; DAVIES, L.J.; MUHLING, J.; BUDDLE, R.; WILCOX, G.E. Thermal stability of porcine circovirus type 2 in cell culture. Journal of Virological Methods, Amsterdam, v.147, p. 61–66, 2008. 66. OPRIESSNIG, T.; MENG, X. J.; HALBUR, P. G. Porcine circovirus type 2–associated disease: Update on current terminology, clinical manifestations, pathogenesis,diagnosis, and intervention strategies. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, Columbia, v.19, p.591–615, 2007.

67. OPRIESSNIG, T.; THACKER, E. L.; YU, S.; FENAUX, M.; MENG, X.J.; HALBUR, P. G. Experimental Reproduction of Postweaning multisystemic Wasting Syndrome in Pigs by Dual Infection with Mycoplasma hyopneumoniae and Porcine Circovirus Type 2. Veterinary Pathology, Basel, v. 45, p. 253 – 255, 2004. 68. ORAVAINEN, J.; HEINONEN, M.; TAST, A.; VIROLAINEN, J.V.; PELTONIEMI, O.A.T. High Porcine parvovirus antibodies in sow herds: prevalence and associated factores. Reproduction in Domestic Animals,

Berlin, v. 40, p. 57-61, 2005. 69. ORAVAINEN, J.; HAKALA, M.; RAUTIAINEN, E.; VEIJALAINEN, P.; HEINONEN, M.; TAST, A.; VIROLAINEN, J.V.; PELTONIEMI, O.A.T. Parvovirus antibodies in vaccinated gilts in fields conditions – results with HI and ELISA tests. Reproduction in Domestic Animals, Berlin, v. 41, p. 91 - 93,

2006. 70. OSTANELLO, F.; CAPRIOLI, A.; FRANCESCO, A.; BATTILANI, M.; SALA, G.; SARLI, G.; MANDRIOLI, L.; MCNEILLY, F.; ALLAN, G.M.; PROSPERI, S. Experimental infection of 3-week-old conventional colostrum-fed pigs with porcine circovirus type 2 and porcine parvovirus. Veterinary Microbiology, Amsterdam, v. 108, p.179-186, 2005.

48

71. PALLARES, F.J.; HALBUR, P.G.; OPRIESSNIG, T.; SORDEN, S.D.; VILLAR, D.; JANKE, B.H.; YAEGER, M.J.; LARSON, D.J.; SCHWARTZ, K.J.; YOON, K.J.; HOFFMAN, L.J. Porcine circovirus type 2 (PCV2) coinfections in US field cases of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). Journal of Veterinary Investigation, Columbia, v.14, n.6, p.515-519, 2002.

72. PESCADOR, C.; ROZZA, D. B.; ZLOTOWSKI, P.; BOROWISK, S. M.; BARCELLOS, D. E. S. N.; DRIEMEIER, D. Principais lesões histológicas associadas a circovirose em suínos das fases de crescimento e terminação em rebanhos do Rio Grande do Sul. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE VETERINÁRIOS ESPECIALISTAS EM SUÍNOS, 11. 2003, Goiânia. Resumos... Goiânia: ABRAVES, p.105-106, 2003. 73. PESCADOR, C.A.; BANDARRA, P.M.; CASTRO, L.A.; ANTONIASSI, N.A.B.; RAVAZZOLO, A.P.; SONNE, L.; CRUZ, C.E.F.; DRIEMEIER, D. Co-infection by porcine circovirus type 2 and porcine parvovirus in aborted fetuses and stillborn piglets in southern Brazil. Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de

Janeiro, v.27, p. 425 - 429, 2007. 74. PIETERS, M.; PIJOAN, C.; FANO, E.; DEE, S. An assessment of the duration of Mycoplasma hyopneumoniae infection in an experimentally infected population of pigs. Veterinary Microbiology, Amsterdam, v.134, p.261-266, 2009. 75. PIFFER, I. A.; PERDOMO, C. C.; SOBESTIANSKY, Y. Efeito de fatores ambientais na ocorrência de doenças. In: SOBESTIANSKY, Y.; WENTZ, I.; SILVEIRA, P. R. S. Suinocultura Intensiva: Produção, Manejo e Saúde do Rebanho. Brasília: Embrapa-CNPSA, p.257-274, 1998. 76. RADOSTITS, O.M.; GAY, C.C.; HINCHCLIFF, K.W.; CONSTABLE, P.D. Disease associated with viruses and Chlamydia – I. In Veterinary Medicine

(pg. 1185-1193). Espanha: Saunders Elsevier, 2007. 77. RAZIN, S.; YOGEV, D.; NAOT, Y. Molecular biology and pathogenicity of Mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology Reviews, Washington,

v.62, p.1094-1156, 1998. 78. RIVERA, E.; SJOLAND, L.; KARLSSON, K.A. A solid phase fluorescent immunoassay for the rapid detection of virus antigens or antibodie in fetuses infected by porcine parvovirus. Archives of Virology, Wien, v.88, p. 19-26, 1986. 79. ROCHA, D.L. Identificação do circovírus suíno tipo 2 e do parvovírus suíno em fetos suínos natimortos e mumificados provenientes de granjas no Brasil. 2008. 41f. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) – Universidade Federal do Paraná, Curitiba. 80. ROCHA, D.L.; ALBERTON, G.C.; SANTOS, J.L. Identification of porcine circovirus type 2 and porcine parvovirus in porcine stillbirths and mummified

49

fetuses from swine farms in Brazil. Ciência Animal Brasileira, Goiânia, v.11,

n.3, p. 600 – 606, 2010. 81. RODRIGUEZ-ARRIOGA G.M.; SEGALES, J.; ROSELL, C.; ROVIRA, A.; PUJOLS, J.; PLANA-DURAN, J.; DOMINGO, M. Retrospective study on porcine circovirus type 2 infection in pigs from 1985 to 1997 in Spain. Journal of Medicine Veterinary, Berlin, v.50, p.99-101, 2003.

82. RODRIGUEZ, F.; RAMIREZ, G.A.; SARRADELL, J.; ANDRADA, M.; LORENZO, H.; Immunohistochemical labelling of cytokines in lung lesions of pigs naturally infected with Mycoplasma hyopneumoniae. Journal of Comparative Pathology, Liverpool, v.130, p.306-312, 2004. 83. ROEHE, P.; SOBESTIANSKY, J.; BARCELLOS, D. Parvovirose. In: SOBESTIANSKY J. & BARCELLOS D.E.S.N. (Org.). Doenças dos Suínos,

768 p. Goiânia, ed: Canône, p. 286-293, 2007. 84. ROSS, R.F. Mycoplasmal diseases. In: STRAW, B.E. et al. Diseases of swine. 8.ed. Ames, Iowa: Iowa State University, p.495-510, 1999.

85. ROWLAND, R.; HESSE, R. PCV-2 nomenclature: How molecular differences translate to the field. In: ANNUAL MEETING OF AMERICAN ASSOCIATION OF SWINE VETERINARIANS, 40., 2009. Iowa. Proceedings…

[CD-ROOM], Perry: American Associaton of Swine Veterinarians, p.485-486, 2009. 86. SALES, T.P. Diagnóstico da circovirose suína em criações intensivas no estado de Goiás. 2011. 54f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) – Escola de Veterinária, Universidade Federal de Goiás, Goiânia. 87. SANCHEZ, R.E.; NAUWYNCK, H., MCNEILLY, F. et al. Porcine circovirus 2 infection in swine fetuses inoculated at different stages of gestation. Veterinary Microbiology, Amsterdam, v.83, p.169-176, 2001.

88. SEGALES, J. (2007). Historia y controversia de la enfermedad

(online) Disponível em http://www.3tres3.com/buscador/noti.php?sec=circovirosis_porcina&id=2040&palabra_clave=historia%20y%20controversia%20de%20la%20enfermedad&b_seccion=todo&ajax=2. Acessado em 12 de setembro de 2012.

89. SEGALES, J.; ROSELL, C.; DOMINGO, M. Pathological findings associated with naturally adquired porcine circovirus type 2 associated diseases. Veterinary Microbiology, Amsterdam, v.98, p.137-149, 2004.

90. SEGALES, J.; ALLAN, G.M.; DOMINGO, M. Porcine circovirus diseases. Animal Health Research Reviews, London, v.6 (2), p.119-142, 2005. 91. SEPLAN. Secretaria de Estado de gestão e planejamento. Disponível em: http://www.seplan.go.gov.br/sepin/. Acessado em: 22 janeiro 2013.

50

92. SHANGJIN, C.; CORTEY, M.; SEGALES, J. Phylogeny and evolution of the NS1 and VP1/VP2 gene sequences from porcine parvovirus. Virus Research, Amsterdam, v.140, p. 209-215, 2009.

93. SIBILA, M.; BERNAL, R.; TORRENTS, D.; RIERA, P.; LLOPART, D.; CALSAMIGLIA, M.; SEGALES, J. Effect of sow vaccination against Mycoplasma hyopneumoniae on sow and piglet colonization and seroconversion, and pig lung lesions at slaughter. Veterinary Microbiology, v.127, p.165-170, 2008. 94. SIMPSON, A.A.; HEBERT, B.; SULLIVAN, G.M.; PARRISH, C.R.; ZADORI, Z.; TIJSSEN, P.; ROSSMANN, M. The structure of porcine parvovirus: comparison of related viruses. Journal of Molecular Biology, London, v. 315,

p. 1189 – 1198, 2002. 95. SOARES, R.M.; DURIGON, E.L.; BERSANO, J.G.; RICHTZENHAIN, L.J. Detection of porcine parvovirus DNA by the polymerase chain reaction assay using primers to the highly conserved nonstructural protein gene, NS-1. Journal of Virological Methods, Amsterdam, v. 78, p.191-198, 1999.

96. SOARES, P. Identificação do circovirus suino tipo 2 e do torque teno virus em suínos de criação intensiva do Estado de Goiás. 2011.112f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) – Escola de Veterinária, Universidade Federal de Goiás, Goiânia. 97. SOBESTIANSKY, J.; BARCELLOS, D.; MORENO, A. M.; SOBESTIANSKY, A.; POLEZE, E. Suínos: coleta e remessa de material para laboratórios para fins de diagnóstico. Goiânia: Art 3, p. 122, 2005. 98. SOBESTIANSKY, J.; RISTOW, L.E.; MATOS, M.P.C.; BARCELLOS, D. Micoplasmoses. In: SOBESTIANSKY J. & BARCELLOS D. Doenças dos Suínos, 768 p. Goiânia, ed: Canône, p. 159-169, 2007. 99. SORENSEN, V.; AHRENS, P.; BARFOD, K.; FEENSTRA, A.A.; FELD, N.C.; FRIIS, N.F.; BILLE-HANSEN, V.; JENSEN, N.E.; PEDERSEN, M.W. Mycoplasma hyopneumoniae infection in pigs: Duration of the disease and evaluation of four diagnostic assays. Veterinary Microbiology, Amsterdam, v.

54, p. 23-34, 1997. 100. SOUZA, C.K. Diagnóstico de parovirus e estudo de co-infecções por vírus de suínos. 2011. 102f. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias)

– Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre. 101. STÄRK, K. Epidemiological investigation of the influence of environmental risk factors on respiratory diseases in swine — A literature review. Veterinary Journal, London, v.159, p.37–56, 2000.

102. STOJONAC, N.; GAGRCIN, M.; STEVANCEVIC, O.; STANCIC, I.; POTKONJAK, A. Passive and active immunity against parvovirus infections in piglets. African Journal of Biotechnology, Nairobi, v.11, p.7771-7774, 2012.

51

103. STRAIT, E.L.; MADSEN, M.L.; MINION, F.C.; CHRISTOPHER-HENNINGS, J.; DAMMEN, M.; JONES, K.R.; THACKER, E.L. Real-time PCR assays to address genetic diversity among strains of Mycoplasma hyopneumoniae. Journal of Clinical Microbiology, Washington, v.46, p.2491-

2498, 2008. 104. STRECK, A.F. Detecção e caracterização de amostras de parvovírus suíno. 2009. 116f. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) –

Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre. 105. THACKER, E.L. Diagnosis of Mycoplasma hyopneumoniae. Animal Health Research Reviews, London, v.5, n.2, p.317-320, 2004.

106. THACKER, E.L., THACKER, B.J., JANKE, B.H. Interaction between Mycoplasma hyopneumoniae and swine influenza virus. Journal of Clinical Microbiology, Washington, v.39, p,2525-2530, 2001.

107. TIMMERMAN, T.; DEWULF, J.; CATRY, B.; FEYEN, B. G.; KRUIF A.; MAES, D. Quantification and evaluation of antimicrobial-drug use in group treatments for fattening pigs in Belgium. Preventive Veterinary Medicine,

Amsterdam, v.74, p.251–263, 2006. 108. TISCHER, I.; RASCH, R.; TOCHTERMANN, G. Characterization of papovavirus and picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines. Zentralblatt fur Bakteriologie, Stuttgart, Abt.1 Originale A, v.226, p.153-167, 1974. 109. TISCHER, I.; GELDERBLOM, H.; VETTERMANN, W.; KOCH, M. A. A very small porcine virus with a circular singlestranded DNA. Nature, London, v.295, p.64-66, 1982. 110. TISCHER, I.; MIELDS, W.; WOLFF, D.; VAGT, M.; GRIEM, W. Studies on Epidemiology and Pathogenicity of Porcine Circovirus. Archives of Virology, Wien, v.91, p.271-276, 1986.

111. TIZARD, I.R. Imunologia veterinária – uma introdução. 6ª edição. Ed.

Rocca, São Paulo, 532 p., 2002. 112. TODD, D.; WESTON, J.H.; SOIKE, D.; SMYTH, J.A. Genome sequence determinations and analyses of novelcircoviruses from goose and pigeon. Virology, New York, v.286, n.2, p.354-362, 2001. 113. VICCA, J.; STAKENBORG, T.; MAES, D.; BUTAYE, P.; PEETERS, J.; DE K.A.; HAESEBROUCK, F. Evaluation of virulence of Mycoplasma hyopneumoniae field isolates. Veterinary Microbiology, Amsterdam, v.97,

177-190, 2003.

52

114. VILLARREAL, I. Epidemiology of M. hyopneumoniae infections and effect of control measures. 2010. 221f. Tese (Doctor of Veterinary Science) – Faculty of Veterinary Medicine, Ghent University. 115. XU, S.; LI, J.; YUAN, X. WANG, G.; SHI, J.; WU, J.; CONG, X.; SUN, W.; DU, Y.; CHAI, T.; WANG, J. Complete Genome Sequence of Porcine Circovirus 2b Strain Shandong. Journal of Virology, Washington,

v.86(24):13885, 2012. 116. ZANELLA, C.J.R.; MORÉS, N.; SCHIOCHET, M.F.; TROMBETTA, C. Diagnóstico molecular e caracterização do circovirus suíno tipo 2 isolados no Brasil. Anais da Abraves, Porto Alegre, RS, p.97-98, 2001. 117. WALKER, R.L. Mollicutes. In: HIRSH, D.C., ZEE, Y.C. Microbiologia veterinária. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p.155-162, 2003.

118. WEN, L.; HE, K.; YU, Z.; MAO, A.; NI, Y.; Zhang, X.; GUO, R.; LI, B.; WANG, X.; ZHOU, J.; LV, L. Complete Genome Sequence of a Novel Porcine Circovirus-Like Agent. Journal of Virology, Washington, v.86 (1):639, 2012.

119. WHITEMORE, C.; Ciencia y práctica de la producción porcina.

Espanha, Ed. Acribia, 1993. 120. YANG, X.; CHEN, F.; CAO, Y.; PANG, D.; OUYANG, H.; REN, L. Complete Genome Sequence of Porcine Circovirus 2b Strain CC1. Journal of Virology, Washington, v.86 (17):9536, 2012.