caracterização molecular dos parvovírus associados aos casos de
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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
CENTRO DE CIÊNCIAS MÉDICAS
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA – CLÍNICA E REPRODUÇÃO
ANIMAL
“CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS PARVOVÍRUS ASSOCIADOS AOS
CASOS DE GASTRENTERITE EM FILHOTES DE CÃES E GATOS NO ESTADO
DO RIO DE JANEIRO”
TATIANA XAVIER DE CASTRO
Orientadoras:
Norma Vollmer Labarthe
Rita de Cássia N.C.Garcia
Niterói 2010
III
TATIANA XAVIER DE CASTRO
“CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS PARVOVÍRUS ASSOCIADOS AOS
CASOS DE GASTRENTERITE EM FILHOTES DE CÃES E GATOS NO ESTADO
DO RIO DE JANEIRO”
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito para a obtenção do Grau de Doutor. Área de Concentração: Cirurgia e Clínica Médica Veterinária, Sub- Área: Clínica Veterinária.
Orientadoras:
Norma Vollmer Labarthe
Rita de Cássia N.C.Garcia
Niterói 2010
TATIANA XAVIER DE CASTRO
“CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS PARVOVÍRUS ASSOCIADOS AOS CASOS DE
GASTRENTERITE EM FILHOTES DE CÃES E GATOS NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO”
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito para a obtenção do Grau de Doutor. Área de Concentração: Cirurgia e Clínica Médica Veterinária, Sub- Área: Clínica Veterinária.
BANCA EXAMINADORA
Dra Norma Vollmer Labarthe (UFF) – Orientadora
Dra Rita de Cássia Nasser Cubel Garcia (UFF) – Orientadora
Dr. Aloysio de Mello F. Cerqueira (UFF)
Dr. Marcelo de Lima (UFF)
Dr. José Paulo Gagliardi Leite (FIOCRUZ)
Dr. Jonimar Pereira Paiva (Universidade Castelo Branco)
Dra Flavya Mendes-de-Almeida (UFF - Suplente Interna)
Dr. Eduardo de Mello Volotão (FIOCRUZ - Suplente Externo)
Niterói
2010
V
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO – PROPP
Este trabalho foi realizado no Departamento de Microbiologia e Parasitologia do Instituto Biomédico –
UFF, em cooperação com o Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental, Instituto Oswaldo Cruz
(IOC) por Tatiana Xavier de Castro, sob orientação da Dra
. Norma Vollmer Labarthe e Dra
.Rita de
Cássia Nasser Cubel Garcia.
C355 Castro, Tatiana Xavier de Caracterização molecular dos parvovírus
associados aos casos de gastrenterite em
filhotes de cães e gatos no Estado do Rio de
Janeiro/ Tatiana Xavier de Castro; orientadora
Norma Vollmer Labarthe. – 2010.
124 f.
Dissertação (Mestrado em Cirurgia e Clínica
Médica Veterinária)- Universidade Federal
Fluminense,2010.
Orientadora: Norma Vollmer Labarthe
1.Parvovírus canino. 2.Gastroenterite
3.Diagnóstico. 4. Vírus da panleucopenia felina.
I. Título.
CDD 636.08960194
VI
Aos meus pais e irmã, pelo apoio incondicional
durante esta etapa da minha vida.
VII
AGRADECIMENTOS
A Deus pela força de superar todos os obstáculos e continuar sempre buscando
meus objetivos.
À minha família por todo o amor, carinho e compreensão ao longo desta etapa da
minha vida.
À Profa Dra Rita de Cássia Nasser Cubel Garcia pelo apoio e presença marcante
nestes 11 anos de convivência.
À Dra Norma Labarthe pelo apoio e orientação não somente neste projeto, mas ao
longo de todo o meu desenvolvimento profissional.
Ao Dr. José Paulo Gagliardi Leite pela oportunidade oferecida de desenvolver a
etapa determinante deste projeto no Instituto Oswaldo Cruz.
Aos colegas do laboratório de Virologia da Universidade Federal Fluminense por
todos os bons momentos compartilhados no laboratório.
Aos colegas do laboratório de Virologia Comparada e Ambiental do Instituto Oswaldo
Cruz pela paciência e boa vontade em transmitir os ensinamentos que
permitiram a realização deste projeto.
À todos os médicos veterinários que gentilmente nos enviaram amostras fecais de
casos de gastrenterite, possibilitando a realização deste estudo.
Ao Curso de Pós-Graduação em Cirurgia e Clínica Médica Veterinária da Faculdade
de Medicina Veterinária, por esta oportunidade de crescimento profissional e
pessoal.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), ao
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ)
pelo auxílio financeiro durante a elaboração do projeto.
VIII
“Ora Lege Lege Lege Relege Labora et Invenies".
"Reza, lê, lê, lê, relê, trabalha e encontrarás"
Gaston Bachelard, livro mudo da alquimia, 1677.
IX
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA, f. VI
AGRADECIMENTOS f. VII
EPÍGRAFE f.VIII
SUMÁRIO, f. XI
LISTA DE FIGURAS, f. XII
LISTA DE QUADROS, f. XIII
LISTA DE TABELAS, f. XIV
LISTA DE APÊNDICE, f. XV
LISTA DE ANEXOS, f.XVI
RESUMO, f. XVII
ABSTRACT, f. XIX
1 INTRODUÇÃO, f.20
2 HIPÓTESE, f. 24
3 OBJETIVOS, f.25
3.1- OBJETIVO GERAL, f.25
3.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS, f.25
4 REVISÃO DA LITERATURA, f.26
4.1.– CLASSIFICAÇÃO, f.26
4.2 – MORFOLOGIA DO VÍRUS, f.26
4.3 – REPLICAÇÃO DO VÍRUS, f.28
4.4 – EVOLUÇÃO DO VÍRUS E SURGIMENTO DOS TIPOS ANTIGÊNICOS, f. 30
4.5 – ANÁLISE DE HOMOLOGIA DE NT E AA DOS PARVOVÍRUS CANINOS(CPV) f.35
X
4.6 – TRANSMISSÃO, PATOGENIA E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS, f.40
4.7 – IMUNIDADE E PROFILAXIA, f. 43
4.8- DIAGNÓSTICO LABORATORIAL f. 45
5-MATERIAL E MÉTODOS, f.49
5.1- AMOSTRAS CLÍNICAS, f.49
5.2- REAGENTES E SOLUÇÕES, f.50
5.2.1- TAMPÃO TRIS-CA++ 0,01M PH 7,2, f.50
5.2.2- TAMPÃO SALINA-BORATO (BABS) PH 9.0, f.50
5.2.3- TAMPÃO VAD PH 6.0, f.51
5.2.4- CAOLIM 25%, f.51
5.2.5- TAMPÃO L2 PH 6,4, f.51
5.2.6- TAMPÃO TRIS-HCL 0,1 M PH 6,4, f.52
5.2.7- TAMPÃO NAOH 10N, f.52
5.2.8- SÍLICA, f.52
5.2.9- ETANOL 70%, f.53
5.2.10- EDTA 0,5M PH 8,8, f.53
5.2.11- TAMPÃO TRIS-BORO-EDTA (TBE) 10 X PH 8,4, f.53
5.2.12- AGAROSE A 1,5%, f.54
5.2.13- SOLUÇÃO DE BROMETO DE ETÍDIO, f.54
5.2.14- TAMPÃO CORANTE AZUL DE BROMOFENOL , f.54
5.3- INICIADORES DE CADEIA UTILIZADOS NA PCR PARA CARACTERIZAÇÃO GENÔMICA,
F.55
5.4 - MÉTODOS, f.56
5.4.1- SUSPENSÃO FECAL A 10%, f.56
XI
5.4.2 - REAÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO E INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO (HA/HI), f.56
5.4.3 - REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (PCR) PARA A DETECÇÃO DO GENOMA DO PARVOVÍRUS
CANINO. f.57
5.4.3.1. - EXTRAÇÃO DO ÁCIDO NUCLEICO. f.57
5.4.3.2- REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (PCR). f.58
5.4.4- SEQUENCIAMENTO PARCIAL DO GENE QUE CODIFICA PARA A PROTEÍNA DE CAPSÍDEO VP2 DOS
PARVOVÍRUS CANINO E FELINO. f.59
5.4.5- ANÁLISE FILOGENÉTICA DAS AMOSTRAS DOS PARVOVÍRUS CANINO E FELINO. f.61
6- RESULTADOS. f.63
6.1- TRIAGEM DE AMOSTRAS CPV POSITIVAS PARA SEQUENCIAMENTO. f.63
6.2- CARACTERIZAÇÃO DOS TIPOS DE CPV EM AMOSTRAS FECAIS DE CÃES NÃO VACINADOS COM
GASTRENTERITE, f.65
6.3- MONITORAMENTO DOS TIPOS DE PARVOVIRUS CANINO (CPV) EM FILHOTES DE CÃES VACINADOS
COM GASTRENTERITE NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO. f.70
6.4 -CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS PARVOVÍRUS EM AMOSTRAS DE FELINOS DOMÉSTICOS NO
ESTADO DO RIO DE JANEIRO E COMPARAÇÃO COM OS TIPOS DE CPV DE AMOSTRAS CANINAS. f.77
7- DISCUSSÃO. f.81
8- CONCLUSÕES. f.89
9- OBRAS CITADAS. f.90
10- APÊNDICES. f.104
11-ANEXOS. f.108
XII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Fotomicrografia eletrônica de partículas de parvovírus canino (CPV) em amostra fecal de um
cão com gastrenterite (WILLI, 1998); B- Modelo da partícula viral; C- Modelo dinâmico da
montagem do capsídeo icosaédrico do CPV (www. people.brandeis.edu). f.27
Figura 2 Etapas da expressão gênica e replicação dos parvovírus autônomos (MORAES & COSTA,
2007). f.29
Figura 3 Organização genômica e mapa de transcrição do parvovírus canino (REED; JONES;
MILLER, 1988) f.30
Figura 4 Representação do capsídeo viral com os AA que alteraram durante a evolução do CPV.
Resíduos que variaram entre FPV e CPV estão em azul, resíduos que variaram entre CPV-2
e CPV-2a estão em verde e em amarelo os resíduos que ainda continuam variando
(PARRISH & KAWAOKA, 2005). f.32
Figura 5 Análise genética e os hospedeiros do vírus da panleucopenia felina (FPLV) e parvovirus
canino (CPV) desde a sua origem no final da década de 70, até os dias atuais (HOELZER&
PARRISH, 2010). f.34
Figura 6 Relação filogenética entre os parvovírus de carnívoros, baseada no gene que codifica para
a proteína de capsídeo VP2. FPLV (vírus da panleucopenia felina); BFPV (parvovírus da
raposa azul); RPV (parvovírus do racoon) (HOELZER& PARRISH, 2010). f.39
Figura 7 Fluxograma da patogenia da infecção pelo parvovírus canino (CPV) (MACARTNEY;
MCCANDLISH; THOMPSON, 1984; POLLOCK; COYNE, 1993; SMITH-CARR et al., 1997).
f.41
Figura 8 Localização da seqüência dos iniciadores de cadeia utilizados neste estudo f.55
Figura 9 Fluxograma de detecção, caracterização e análise de homologia de nt e AA das amostras
de parvovírus canino e felino utilizadas neste estudo. f.43
Figura 10 Comparação entre as sequências nucleotídicas dos isolados de CPV-2c detectados na
América do Sul. Em destaque as mutações pontuais detectadas nos diferentes isolados.
f.68
Figura 11 Dendograma construído a partir da análise de um fragmento (563 pb) do gene que codifica
para a proteína de capsideo VP2 das amostras de CPV de cães não vacinados e amostras
de CPV no GenBank. A barra na parte inferior da figura é proporcional à distância genética.
f.69
Figura 12 Sequências nucleotídicas da amostra caracterizada como CPV-2b selvagem (RJ901/08) e
amostra CPV-2b vacinal (vacina Duramune® Max5) Em destaque a mutação pontual no nt
XIII
4494, presente na cepa vacinal. f.74
Figura 13 Dendograma elaborado a partir das análise de um fragmento (563 pb) do gene que codifica
para a proteína de capsideo VP2 de 37 cães vacinados, quatro vacinas para CPV e
amostras padrão e recombinantes de CPV obtidas no GenBank. A barra na parte inferior da
Figura é proporcional à distância genética. f. 76
Figura 14 Dendograma elaborado a partir das análise de um fragmento (1171 pb) do gene que
codifica para a proteína de capsideo VP2 das seis amostras felinas deste estudo junto com
as amostras caninas e isolados felinos e caninos obtidos no Genbank. Em destaque as
amostras caninas que apresentaram mutações de AA importantes na determinação do
espectro de hospedeiro dos parvovirus. A barra na parte inferior da Figura é proporcional à
distância genética. f. 80
XIV
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Principais mutações descritas no genoma do parvovírus canino (CPV) durante sua
evolução (TRUYEN et al., 1998; BUONAVOGLIA et al., 2001; MOON et al., 2008;
HOELZER& PARRISH, 2010). f.38
Quadro 2 Descrição dos iniciadores utilizados na reação em cadeia pela polimerase (PCR) neste
estudo, com o tamanho em pares de base (pb) de seus respectivos produtos. f.56
15
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Distribuição das 69 amostras fecais caninas positivas por HA/HI e PCR analisadas neste
estudo conforme o sexo, faixa etária, raça, condição vacinal dos cães e tipo de CPV (CPV-
2a, 2b e 2c) caracterizado na amostra fecal. f.64
Tabela 2 Diferenças de nucleotídeos e aminoácidos encontradas no produto amplificado de 563
bp de VP2 nas 32 amostras de parvovirus canino de cães não vacinados apresentando
gastrenterite e isolados obtidos no GenBank. f.66
Tabela 3 Idade e condição vacinal dos cães e tipo de parvovírus canino detectado nas 37
amostras fecais coletadas de cães vacinados no Rio de Janeiro no período de 1995-
2009. f.70
Tabela 4 Caracterização genômica dos parvovirus caninos detectados nas 37 amostras de cães
vacinados e nas quatro amostras de vacinas a partir da análise da sequência parcial do
gene que codifica para a proteína de capsídeo VP2. f. 72
Tabela 5 Diferenças de nucleotídeos e aminoácidos encontradas no fragmento de 1171 pb do
gene que codifica para a proteína de capsídeo VP2 em seis amostras felinas e quatro
amostras caninas coletadas em 2004-2005. f. 78
16
LISTA DE APÊNDICES
Apêndice 1 Ficha de identificação do animal. f. 105
Apêndice 2 Tabela de aminoácidos. f.106
Apêndice 3 Aprovação do COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ANIMAL (PRÓ-REITORIA DE
PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO), f. 107
17
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1 Número de acesso do GenBank das amostras de parvovírus canino (CPV) e felino
(FPLV) caracterizadas neste estudo. f.109
Anexo 2 Distribuição cronológica dos tipos de CPV no Brasil de 1980 a 2009. A tabela oi
formulada tendo como base o estudo atual e estudos anteriores (PEREIRA et al., 2007;
STRECK et al., 2009). A linha contínua indica predominância do tipo. A linha tracejada
indica uma menor circulação do tipo. f.110
Anexo 3 Carta de aceite e trabalho submetido para publicação no periódico Brazilian Journal of
Mirobiology: “Partial VP2 sequencing of canine parvovirus (CPV) strains circulating in
the State of Rio de Janeiro, Brazil: detection of the new variant CPV-2c”. f.111
Anexo 4 Carta de aceite e trabalho submetido para publicação no periódico Research in
Veterinary Science: “Monitoring of canine parvovirus (CPV) strains detected in
vaccinated puppies in Brazil”.f. 118
Anexo 5 Carta de submissão e trabalho “First Characterization of parvovirus strains from
domestic cats in Brazil.” para publicação no periódico Journal of Veterinary Diagnostic
Investigation. f. 124
18
RESUMO
A infecção pelo Parvovírus Canino (CPV) é a principal causa de gastrenterite viral em filhotes de cães e novos tipos antigênicos vem sendo descritos substituindo os tipos antigos destes vírus. A circulação do CPV e do vírus da Panleucopenia Felina (FPLV) em cães e gatos no Estado do Rio de Janeiro, bem como a descrição de casos de gastrenterite em felinos associados aos novos tipo de CPV torna necessária uma avaliação contínua das amostras de parvovírus (FPLV e CPV) circulantes nestas espécies. Portanto, este trabalho teve como objetivo realizar a caracterização molecular dos parvovírus detectados em amostras fecais de cães e gatos com até um ano de idade com gastrenterite no Estado do Rio de Janeiro no período de 1995-2009. Após confirmação laboratorial da infecção pelo parvovírus por hemaglutinação/ inibição da hemaglutinação (HA/HI), 69 amostras fecais de cães foram submetidas à reação em cadeia pela polimerase (PCR) e sequenciamento parcial do gene que codifica para a proteína de capsídeo VP2 para caracterização dos tipos de CPV. Seis amostras fecais de felinos domésticos, também foram submetidas ao sequenciamento parcial da mesma região para caracterização dos parvovírus associadas à infecção nesta espécie. A análise de dois aminoácidos (AA) 426 e 555 do CPV em 32 amostras fecais de cães não vacinados coletadas no período de 1995-2009 demonstrou uma substituição do tipo CPV-2a pelo tipo 2b e a primeira descrição do tipo CPV-2c na população canina no Rio de Janeiro. Para monitoramento dos tipos de CPV em 37 cães vacinados, a análise dos AA 297, 300, 305, 426 e 555 permitiu a caracterização dos tipos CPV-2a em 23 amostras e CPV-2b em 14 amostras. Mutações sinônimas foram detectadas nos AA 440 e 574. As mutações detectadas nos tipos estudados aparentemente não afetaram os AA relacionados a antigenicidade do vírus e não parecem comprometer a capacidade global das vacinas em proteger os filhotes contra os tipos em circulação. Os parvovírus detectados em seis amostras felinas foram caracterizadas com FPLV por sequenciamento, porém a detecção de mutações não-sinônimas em resíduos importantes para a determinação do espectro de hospederio em duas amostras felinas e uma canina indica que os CPV e FPLV estão sujeitos a importantes eventos evolutivos e enfatizam a importância do monitoramento contínuo e da caracterização molecular desse parvovírus de maneira a permitir a identificação de possíveis mudanças genéticas e antigênicas que possam interferir na eficácia das vacinas para CPV. Estes resultados também reforçam a idéia de que somente o sequenciamento oferece ampla informação sobre a caracterização e análise filogenética dos parvovírus em circulação na população canina e felina.
Palavras–chave: Parvovírus Canino (CPV); Vírus da Panleucopenia felina (FPLV); Gastrenterite; Caracterização Molecular; Sinais clínicos.
19
ABSTRACT
Canine Parvovirus (CPV) infection is the major cause of viral enteritis in puppies and new antigenic types have been described in substitution of the old types of these viruses. The aim of this study was to realize the genomic analysis of CPV strains in enteritis puppies in the State of Rio de Janeiro. The circulation of CPV and FPLV in dogs and cats in Rio de Janeiro, and the description of cases of enteritis in cats associated with the new types of CPV requires a continuous evaluation of parvovirus (FPLV and CPV) circulating in these species. Therefore, the aim of this study was to perform the molecular characterization of parvovirus detected in fecal samples of dogs and cats up to one year of age with enteritis in the State of Rio de Janeiro. After laboratory confirmation of CPV infection by hemagglutination/ hemagglutination inhibition tests (HA/HI), 69 fecal samples from dogs with one year of age were submitted to polymerase chain reaction (PCR) and partial sequencing of the gene coding for VP2 capsid protein for characterization of the types of CPV in clinical samples. Six fecal samples from domestic cats up to six months old were also subjected to partial sequencing of the same region for characterization of parvovirus infection associated with this species. The analysis of two amino acids (AA) 426 and 555 of CPV in 32 fecal samples collected from unvaccinated puppies collected during 1995-2009 showed a progressive replacement of CPV type-2a by the 2b type and the first description of CPV-2c in the canine population in Rio de Janeiro. In order to investigate CPV types in 37 puppies with parvoviral infection despite vaccination, the analysis of residues 297, 300, 305, 426 e 555 allowed the characterization of CPV-2a in 23 samples and CPV-2b in another 14. Synonymous substitutions in the AA 440 and 574 were detected. All CPV-2a showed a non-synonymous mutation in residue 297
(SerAla). The mutations detected in CPV strains collected from vaccinated puppies apparently did not affect the amino acid residues related to antigenicity of CPV, and did not compromise the overall ability of current vaccines in protect puppies against the circulating types. The parvovirus strains detected in six cat samples were confirmed by sequencing as FPLV but the detection of non-synonymous mutations in feline and canine parvovirus strains indicate that CPV and FPLV are subject to important evolutionary events and emphasize the importance of continuous surveillance and genetic characterization of these parvovirus in order to detect possible genetic and antigenic changes with potential effect on CPV vaccine effectiveness. These results also reinforce that only sequence analysis provides full information for characterization and phylogenetic analysis of parvovirus circulating in dog and cat population.
Key-words: Canine Parvovirus (CPV); Feline Panleukopenia Virus (FPLV); Enteritis; Molecular Characterization; Clinical Signs.
20
1- INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, a emergência de novos vírus deixou de ser um tema
apenas do meio científico e acadêmico e passou a ser discutido também pela
população leiga mundial. Um dos mecanismos responsáveis pelo aparecimento de
uma virose emergente resulta da capacidade de determinados vírus em ampliar
seu espectro de hospedeiros (transposição da barreira de espécie), adquirindo a
habilidade de se replicar e disseminar eficientemente em outras espécies de
hospedeiro (PARRISH& KAWAOKA, 2005).
Entre os vírus com genoma DNA de fita simples, os parvovírus de
carnívoros constituem-se em importante modelo para explicar como múltiplas
mudanças de aminoácidos na proteína de capsídeo podem contribuir para a
emergência de um novo patógeno (PARRISH & KAWAOKA, 2005). O parvovírus
canino (CPV) é um exemplo de sucesso na transposição da barreira de
hospedeiro (PARRISH & KAWAOKA, 2005; HOELZER; PARRISH, 2010), já que é
considerado uma variante do vírus da panleucopenia felina (FPLV) que adquiriu a
capacidade de replicação em cães após a passagem em um hospedeiro carnívoro
selvagem (HORIUCHI et al., 1998; TRUYEN et al., 1998; STEINEL et al., 2001;
IKEDA et al., 2002).
Desde 1920, o FPLV já era conhecido como agente de doença em gatos
domésticos (Felis catus) (VERGE; CHRISTOFORI, 1928). Após o aparecimento
do CPV em 1978, a doença entérica associada a infecção pelo CPV em cães foi
considerada patologicamente semelhante a doença causadas pela vírus da
panleucopenia felina vírus (FPLV) em gatos e anticorpos policlonais e estudos de
“in vivo” proteção cruzada logo mostrou que o CPV e FPV estavam estreitamente
relacionados antigenicamente (PARRISH, 1999). Neste período, PARRISH et al.
21
(1985) observaram que as amostras de CPV que circularam nos Estados Unidos
da América (EUA) entre 1978 a 1980 eram de um único tipo, atualmente
denominadas de “tipo antigo” ou CPV-2. Um novo tipo, CPV-2a, rapidamente
substituiu o tipo “antigo” em circulação e passou a prevalecer na população canina
logo após 1980. A partir de 1984 um novo tipo CPV-2b surgiu (PARRISH, 1988;
PARRISH, 1995-a) e estes tipos 2a e 2b co-existiram em várias populações no
mundo em diferentes proporções não sendo observada vantagem evolutiva de um
tipo em relação ao outro (STEINEL et al., 1998).
Em 2001, um terceiro tipo de CPV (CPV-2c) foi descrito na Itália
(BUONAVOGLIA et al., 2001) e já existem relatos da circulação deste tipo na
população canina em diferentes países, incluindo na América do Sul (DECARO et
al., 2006, 2007; HONG et al., 2007; MEERS et al., 2007; PÉREZ et al., 2007;
VIEIRA et al., 2008; CALDERON et al., 2009). Na Itália, o tipo 2c está substituindo
o tipo 2b na população canina e tal disseminação sugere que esse tipo apresenta
uma vantagem evolutiva, em comparação com os demais (DECARO et al., 2006-
b, 2007-a).
A manifestação clínica da infecção pelo CPV e a intensidade dos sinais
clínicos podem variar, mas a gravidade do quadro clínico (vômito, anorexia, apatia,
diarréia hemorrágica líquida) faz com que o proprietário do filhote procure o
atendimento de um médico veterinário (CASTRO et al., 2007, DESARIO et al.,
2005; MOON et al., 2007).
Os estudos que investigaram o potencial patogênico do CPV-2c
apresentaram resultados discordantes. Enquanto os primeiros relatos sugeríam
uma baixa patogenicidade, nos casos mais recentes tem-se observado sinais
clínicos mais graves (DECARO et al., 2006; KAPIL et al., 2008; DECARO et al.,
2009). Portanto, a circulação de novos tipos de CPV, bem como a descrição de
uma diversidade de sinais clínicos relacionados à infecção pelos diferentes tipos
(CASTRO et al., 2007; MOON et al., 2007; PÉREZ et al., 2007), torna necessário
não somente o diagnóstico laboratorial da infecção por CPV, mas também o
estudo dos sinais clínicos associados a infecção pelos novos tipos.
Desde os primeiros surtos de enterite por CPV, houve uma evolução gradual
na profilaxia da parvovirose canina, e atualmente vacinas de vírus vivo modificado
22
ou “Modified Live Virus“ (MLV), constituídas de CPV-2 (tipo antigo) ou CPV-2b são
amplamente utilizadas em vários países, inclusive no Brasil. A detecção de CPV
em animais vacinados através das metodologias usadas na rotina como a reação
de hemaglutinação (HA) e o ensaio imunoenzimático (EIA) é um complicador no
diagnóstico, pois o vírus vacinal é eliminado nas fezes de 3 a 9 dias pós
vacinação e pode ser detectado por estas técnicas, que não distinguem o CPV
vacinal do selvagem (DECARO et al., 2006-a).
Além disso, com a emergência do novo tipo 2c em vários países, alguns
trabalhos sugerem que as vacinas disponíveis não conferiam proteção à infecção
por este tipo, uma vez que surtos de enterite em filhotes vacinados foram
associados à presença do CPV-2c (DECARO et al., 2006-b, 2008-a). Portanto, o
monitoramento das amostras de CPV circulantes, principalmente naqueles casos
em que os animais apresentam enterite por CPV apesar da vacinação, é essencial
para a avaliação da eficácia das vacinas frente ao desafio com os novos tipos do
vírus.
Estudos realizados após 1996 têm demonstrado que vários de surtos
panleucopenia felina não não foram associados ao FPLV e sim aos novos tipos de
CPV em circulação (CPV-2a 2b e 2c) (TRUYEN et al., 1996; NAKAMURA;
SAKAMOTO; IKEDA, 2001; GAMOH et al., 2003-b; DECARO et al., 2010). Estes
estudos sugerem que, embora o CPV-2 tenha perdido a capacidade de se replicar
em células de origem felina, os novos tipos de CPV voltaram a causar doença em
gatos domésticos, com sinais clínicos semelhantes aos causados pelo FPLV.
Entretanto, o potencial patogênico do CPV nestes hospedeiros não está claro
(NAKAMURA; SAKAMOTO; IKEDA, 2001; GAMOH et al., 2003-b).
Em estudos conduzidos por um período de 15 anos (1995 a 2009), o CPV
foi associado a 32 a 55% dos casos de diarréia em filhotes de cães com até 6
meses de idade no Estado do Rio de Janeiro (CASTRO et al., 2007; SILVA, 2010).
Da mesma forma, um estudo realizado em 2006 com 159 amostras fecais de
felinos domésticos confirmou a circulação do FPLV associado a casos de enterite
nesta mesma região (MIRANDA, 2006).
A co-circulação do FPLV e CPV na população canina e felina neste Estado,
bem como a recente descrição de casos graves de enterite em felinos domésticos
23
associados ao tipo novo CPV-2c na Itália (DECARO et al., 2010) torna necessária
uma avaliação contínua das amostras de parvovírus (FPLV e CPV) circulantes na
população felina para determinação do padrão de evolução destes parvovírus no
Rio de Janeiro e da sua importância epidemiológica.
Neste estudo os parvovírus detectados em amostras fecais coletadas de
filhotes de cães com enterite no período de 15 anos (1995-2009) e de gatos
domésticos foram caracterizados através do sequenciamento parcial da proteína
de capsídeo VP2 evidenciando a circulação dos novos tipos CPV-2a e 2b e a
primeira descrição do novo tipo 2c na população canina do Estado do Rio de
Janeiro.
As amostras obtidas de cães que apresentaram enterite por CPV apesar da
vacinação também foram caracterizadas em busca de alterações no gene que
codifica para a proteína VP2 que pudessem resultar em alterações antigênicas
capazes de interferir na eficácia das vacinas constituídas pelos tipo antigo (CPV-
2). Os tipos de CPV caracterizados nas amostras fecais de cães vacinados e não
vacinados foram relacionados aos sinais clínicos apresentados pelos cães,
buscando a associação entre o tipo de CPV e a gravidade do quadro clínico.
Seis amostras felinas coletadas em 2004 foram estudadas juntamente com
quatro amostras caninas coletadas no mesmo ano em busca de CPV associado a
infecção em gatos, bem como possíveis mutações nos parvovírus detectados em
felinos.
24
2- HIPÓTESE
As mudanças de nucleotídeos (nt) e aminoácidos (AA) observadas na
proteína de capsídeo VP2 do parvovírus canino (CPV) favorecem o surgimento de
novos tipos de CPV no Estado do Rio de Janeiro.
A ocorrência de mutações em AA importantes na deteminação do espectro
de hospedeiro no CPV faz com que o CPV readquira a capacidade de se replicar
em felinos.
25
3- OBJETIVOS
3.1- Objetivo Geral:
Realizar a caracterização molecular dos parvovírus detectados em
amostras fecais de filhotes de cães e gatos (até um ano de idade)
portadores de gastrenterite no Estado do Rio de Janeiro.
3.2- Objetivos específicos:
Realizar o diagnóstico laboratorial dos casos de gastrenterite associados ao
parvovírus canino.
Caracterizar através do sequenciamento parcial da proteína de capsídeo
VP2, os tipos de parvovírus canino associados a casos de gastrenterite em
amostras fecais de filhotes de cães no Estado do Rio de Janeiro no período
de 1995 a 2009.
Caracterizar os tipos de parvovírus canino detectados em amostras fecais
de filhotes de cães vacinados apresentando sinais clínicos de gastrenterite
no Estado do Rio de Janeiro no mesmo período.
Realizar a caracterização molecular das amostras de parvovírus detectadas
em felinos domésticos no Estado do Rio de Janeiro.
26
4- REVISÃO DA LITERATURA
4.1– Classificação
Os parvovírus patogênicos de animais estão classificados na família
Parvoviridae, sub-família Parvovirinae, gênero Parvovirus, sendo que o vírus da
panleucopenia felina (FPLV), vírus da enterite do mink (MEV) e parvovírus canino
(CPV), juntamente com o parvovírus da raposa azul (blue fox parvovirus-BFPLV),
raccoon parvovirus (RPV) e raccoon dog parvovirus (RDPV) formam o Subgrupo
dos Parvovírus Felinos (VAN REGENMORTEL et al., 2000; MORAES & COSTA,
2007).
4.2 – Morfologia do vírus
As partículas de CPV quando visualizadas pela microscopia eletrônica
(ME) são esféricas, não envelopadas, com diâmetro variando de 18 a 26 nm e
capsídeo de simetria icosaédrica (Figura 1). A massa molecular da partícula viral
completa é de 5,0 a 6,2 X 106 daltons e a densidade do vírion em gradiente de
cloreto de césio é de 1,39 a 1,42 g/cm3 (SIEGL , 1984).
O capsídeo é constituído pelas proteínas VP1 (84 kDa) e VP2 (67 kDa),
sendo 5-6 cópias de VP1 e 54–55 cópias de VP2. A VP1 é muito semelhante à
VP2, com a adição de 154 aminoácidos na região amino terminal. Nas partículas
infecciosas de CPV, a clivagem de 15-20 aminoácidos na região amino terminal de
VP2 gera a proteína VP3 de 63 kDa (PARADISE; RHODE; SINGER, 1982; TSAO;
CHAPMAN; AGBANDJE, 1991). Esta clivagem parece ser essencial à
infectividade do vírus porque expõe sequências ricas em Glicina, importantes na
interação com a membrana celular (WU & ROSSMAN, 1993). A proteína VP2
além de ser o sítio de ligação ao receptor, confere ao vírus a propriedade
27
hemaglutinante e contém os epítopos responsáveis pela indução de anticorpos
neutralizantes (LOPEZ DE TURIZO et al., 1991).
O genoma viral consiste de um único filamento de ácido
desoxiribonucleico (DNA), linear e de aproximadamente 5.150 nucleotídeos (nt),
contendo nas extremidades 3’ e 5’ sequências palindrômicas de aproximadamente
150 nt (REED; JONES; MILLER,1988).
A B C
Figura 1. Fotomicrografia eletrônica de partículas de parvovírus canino
(CPV) em amostra fecal de um cão com gastrenterite (WILLI, 1998); B-
Modelo da partícula viral; C- Modelo dinâmico da montagem do capsídeo
icosaédrico do CPV (www. people.brandeis.edu).
Como consequência de sua estrutura simples, os parvovírus são resistentes
à inativação, sendo estáveis a variações de pH (3,0-9,0), a temperatura de 56oC/
60 minutos e ao tratamento com solventes orgânicos (SIEGL, 1984). GORDON &
ANGRICK (1986) demonstraram que o CPV pode manter-se infeccioso por até
cinco meses no ambiente. Os parvovírus são sensíveis à formalina (0,2%),
hipoclorito de sódio (1:30) e radiação ultravioleta (SIEGL, 1984).
28
4.3 – Replicação viral
A infecção pelos CPV e FPLV está associada à habilidade do capsídeo viral
adsorver-se ao receptor de transferrina (Tf), uma glicoproteína de superfície
celular expressa na maioria das células do organismo, responsável pelo transporte
de ferro para o interior da célula (HUEFFER& PARRISH, 2003; PARRISH &
KAWAOKA, 2005).
Em células com intensa atividade mitótica tais como da cripta do epitélio
intestinal e do tecido hematopoético, estes receptores podem ser encontrados em
níveis elevados, representando os principais alvos do CPV e FPLV nos animais.
Após a ligação destes vírus ao receptor de Tf ocorre a formação de um complexo
(vírus-receptor) que é rapidamente transportado para um sistema endossomal no
interior da célula. Os tipos novos de CPV são capazes de se ligarem tanto ao
receptor de Tf canino como felino, enquanto o FPLV liga-se apenas a receptores
de Tf felinos. Por essa razão o FPLV não é capaz de infectar cães e de se replicar
em cultura de células caninas (HUEFFER& PARRISH, 2003; PARRISH&
KAWAOKA, 2005).
O genoma dos parvovírus não codifica a enzima necessária para a etapa
inicial da replicação do DNA, a DNA polimerase, que é responsável pela síntese
da fita de DNA complementar ao DNA viral fita simples. Como a DNA polimerase
celular é somente expressa durante a mitose, a primeira e crucial etapa da
replicação viral, portanto, requer a divisão celular (fase S tardia ou G2 do ciclo
mitótico). Em animais jovens o tecido linfóide e particularmente o epitélio do
intestino delgado apresentam intensa proliferação celular (STEINEL et al., 2001).
A replicação do genoma dos parvovírus ocorre no núcleo da célula
infectada, onde as sequências palindrômicas terminais dobram sobre si mesmas,
formando uma estrutura semelhante a um grampo (“hairpin”), que atuam como
iniciadores para a DNA polimerase celular. Nestas regiões de DNA de fita dupla
tem início a replicação com a formação de uma fita complementar. A replicação
continua com a formação de intermediários de dupla fita que, posteriormente, são
enzimaticamente clivados gerando DNA de fita simples. A fita negativa por
29
convenção, dá origem a duas fitas positivas e duas fitas negativas (YOUNG, 1988)
(Figura 2).
Figura 2. Etapas da expressão gênica e replicação dos parvovírus
autônomos (MORAES; COSTA, 2007).
O genoma dos parvovírus canino e felino contém dois promotores (P4 e
P38), que dirigem a síntese das proteínas não estruturais (NS1 e NS2) e
estruturais (VP1 e VP2), respectivamente (REED; JONES; MILLER, 1988). Dois
ácidos ribonucleicos (RNAm) transcritos a partir da extremidade 3` do genoma
codificam a síntese das proteínas NS1 e NS2, importantes para a replicação do
DNA viral. Dois outros RNAm transcritos a partir da extremidade 5´ do genoma
dirigem a síntese das proteínas estruturais. Estas proteínas são codificadas por
sequências de leitura aberta (ORF) que se sobrepõem: nucleotídeo (nt) 2285-4786
para VP1 e nt 2786-4786 para VP2 (REED; JONES; MILLER, 1988; AGBANDJE;
PARRISH; ROSSMANN, 1995) (Figura 3).
30
Figura 3. Organização genômica e mapa de transcrição do parvovírus canino
(REED; JONES; MILLER, 1988)
A síntese das proteínas estruturais ocorre no citoplasma da célula, porém
a montagem de novas partículas virais acontece no núcleo e a liberação por lise
celular. A replicação viral em cultura de células pode ser observada pela presença
de corpúsculos de inclusão intranucleares corados pelo método de May Grunwald
Giemsa (APPEL; SCOTT; CARMICHAEL,1979).
Alguns aspectos do processo de replicação do vírus, incluindo a ausência
de algumas subunidades da DNA polimerase da célula hospedeira, a rápida
replicação do genoma e a natureza fita simples do genoma viral resultam em
uma baixa fidelidade de replicação dos parvovírus caninos, facilitando o
aparecimento de mutações (HOELZER; SHACKELTON; PARRISH, 2008;
HOELZER & PARRISH, 2010).
4.4- Evolução do vírus e surgimento dos tipos antigênicos
O CPV é um exemplo de sucesso na transposição da barreira de hospedeiro
(PARRISH & KAWAOKA, 2005), já que é considerado uma variante do FPLV
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
VP1 VP2 P4 P38
3’ 5’
NS-1 NS-2 VP-1
VP-2
mRNA
4.9Kb
3.3Kb
3.0Kb
3.0Kb
31
(HORIUCHI et al., 1998; TRUYEN et al., 1998; STEINEL et al., 2001; IKEDA et al.,
2002). O CPV e FPLV são geneticamente idênticos em 98% do seu genoma e
diferem em cerca de 8-10 aminoácidos (PARRISH, 1988; 1990; 1995).
Durante os anos de 1978 e 1979, surtos de uma doença fatal em cães,
caracterizada por causar miocardite em animais entre 3 e 16 semanas de idade ou
gastrenterite hemorrágica em animais mais velhos, foram descritos na América do
Norte, Europa e Austrália. Os vírus isolados dos casos de miocardite neonatal
causaram gastrenterite em cães após infecções experimentais, indicando que as
duas síndromes eram causadas pelo mesmo tipo de vírus (ROBINSON; WILCOX;
FLOWER,1980; PARRISH et al.,1995). Em 1980, esta doença já tinha uma
distribuição mundial (SIEGL, 1984; APPEL & PARRISH, 1987).
Os sinais clínicos e patológicos da gastrenterite em cães eram similares
aos observados na infecção pelo FPLV em gatos e do vírus da enterite do Vison
(Mink enteritis vírus ou MEV). Poucos meses após a descrição da doença,
partículas semelhante aos parvovírus foram observadas por ME em amostras
fecais de cães com as formas miocárdica e entérica da doença, respectivamente.
Naquela época, o novo vírus foi denominado parvovírus canino tipo 2 (CPV-2) a
fim de diferenciá-lo do vírus mínimo do cão (CPV-1), descrito anteriormente (BINN
et al., 1970).
A hipótese mais aceita é que o CPV tenha surgido de uma mutação do
FPLV ou de outro parvovírus estritamente relacionado após a passagem em um
hospedeiro carnívoro, tal como sub-espécies de Neovison vison (Schreber,1777),
(visons e doninhas), Alopex lagopus (Linnaeus, 1758) (raposas do Ártico) ou
Vulpes lagopus (Huxley,1880) (raposas vermelha) (HORIUCHI et al., 1998;
TRUYEN et al., 1998; IKEDA et al., 2002).
No Brasil, os primeiros casos de gastrenterite hemorrágica foram
observados em São Paulo em 1979, mas a disseminação do vírus na população
canina ocorreu a partir de 1980 (ANGELO et al., 1980; HAGIWARA et al., 1980).
Quanto as mudanças no espectro de hospedeiro de felinos para caninos,
mudanças nos AA nas posições 80 (Lys→Arg), 93 (Lys→Asn), 103 (Val→Ala),
323 (Asp→Asn), 564 (Asn→Ser) e 568 (Ala→Gly) de VP2 conferiram ao CPV a
capacidade de se ligar ao receptor de Tf canino e com isso replicar e infectar
32
células caninas, mas o vírus perdeu a capacidade de infectar células felinas
(PARRISH et al., 1991; TRUYEN; PARRISH, 1992; CHANG; SGRO; PARRISH,
1992; AGBANDJE; PARRISH; ROSSMANN, 1995; HUEFFER; PARRISH, 2003;
PARRISH; KAWAOKA, 2005) (Figura 4).
Logo após o aparecimento do CPV em 1978, PARRISH et al. (1985)
observaram que as amostras que circularam nos Estados Unidos da América
(EUA) entre 1978 e 1980 eram de um único tipo (denominadas de “tipo antigo” ou
CPV-2). Entretanto, as amostras obtidas após 1980 podiam ser distinguidas das
anteriores pela reatividade com anticorpos monoclonais e diferenças no perfil
genômico após digeridas com endonucleases de restrição. Este novo tipo (CPV-
2a) rapidamente substituiu o tipo “antigo” em circulação e passou a prevalecer na
população canina (Figura 4).
Figura 4. Representação do capsídeo viral com os aminoácidos (AA) que
alteraram durante a evolução do do parvovírus canino (CPV). AA que
variaram entre o vírus da panleucopenia felina (FPLV) e CPV estão em azul,
AA que variaram entre CPV-2 e CPV-2a estão em verde e em amarelo os AA
que continuam variando (PARRISH& KAWAOKA, 2005)
33
A partir de 1984 um novo tipo surgiu (CPV-2b) (PARRISH, 1988; 1995).
Substituições nos AA 87 (Met→Leu), 300 (Gly→Ala), 305 (Tyr→Asp) e 555
(Val→Ile) ocorreram na evolução do parvovírus canino tipo antigo (CPV-2) para o
tipo novo (CPV-2a), e 426 (Asn→Asp) e 555 (Ile →Val) na emergência do tipo 2b
a partir do 2a (TRUYEN, 1999).
Estes novos tipos (CPV-2a e CPV-2b) tem sido detectados em vários
países (PARRISH et al., 1995). A co-existência destes tipos em várias populações
no mundo em diferentes proporções mostra que não houve uma vantagem
evolutiva de um tipo em relação ao outro (STEINEL et al., 1998). Além disso, estes
novos tipos extenderam o espectro de hospedeiro do CPV que adquiriu também a
capacidade de infectar a espécie felina (PARKER & PARRISH, 1997) (Figura 5).
Desde o final da década de 1980, os tipos novos de CPV (2a e 2b) têm sido
isolados de felinos domésticos e selvagens no Japão, Alemanha, EUA, Taiwan,
Vietnã e Itália, demonstrando que estes têm a capacidade de se replicar em
tecidos felinos, ao contrário do tipo antigo que não era capaz de se replicar nestes
tecidos (MOCHIZUKI et al.,1993; MOCHIZUKI et al., 1996; TRUYEN et al., 1996-a;
TRUYEN; PLATZER; PARRISH, 1996; IKEDA et al., 1999; IKEDA et al., 2000;
STEINEL et al., 2000; GAMOH et al., 2003; BATINALLI et al., 2006; DECARO et
al., 2010).
A primeira descrição de um parvovírus canino infectando gatos ocorreu em
1996 (TRUYEN et al., 1996-b) e atualmente 5% dos parvovírus isolados de gatos
com gastrenterite detectados na Alemanha e EUA e 3% dos isolados no Japão
foram form caracterizados como tipos 2a ou 2b (TRUYEN et al., 1996-b; TRUYEN;
PLATZER; PARRISH,1996; GAMOH et al., 2003).
Em 2001, mais um tipo de CPV (CPV-2c) foi relatado na Itália e já existem
trabalhos descrevendo sua circulação na população canina da Espanha, Reino
Unido, Vietnã, Austrália, Tunísia, Índia e América do Sul. (MARTELLA et al., 2004;
DECARO et al., 2006-b; MEERS et al., 2007; PERES et al., 2007; TOUIHRI et al.,
2009; CALDERON et al., 2009; NANDI et al., 2010).
O CPV-2c apresenta uma mudança de AA na posição 426 (Asp→Glu) da
proteína de capsídeo VP2, região importante para o estabelecimento das
34
propriedades antigênicas do CPV (BUONAVOGLIA et al., 2001). Na Itália, o tipo
2c está substituindo o tipo 2b na população canina e tal disseminação sugere que
a mudança de AA na posição 426 tenha dado ao vírus uma maior adaptação ao
hospedeiro canino, em comparação com as outros tipos (DECARO et al., 2006-b,
2007-a; DECARO et al., 2009-a). Este tipo 2c também já foi associado à infecção
em felinos, que desenvolveram quadro clínico grave de gastrenterite e
panleucopenia (DECARO et al., 2010) (Figura 5).
Figura 5. Análise genética e hospedeiros do vírus da panleucopenia felina
(FPLV) e parvovirus canino (CPV) desde a sua origem no final da década de
70, até os dias atuais (HOELZER& PARRISH, 2010).
35
A infecção por CPV-2c já foi descrita na Argentina (CALDERON et al.,
2009) e no Uruguai (PÉREZ et al., 2007) em cães com gastrenterite hemorrágica
e foi detectada em casos de gastrenterite em filhotes de cães no Rio Grande do
Sul, (STRECK et al., 2009). Até o momento, infecções relacionadas ao tipo CPV-
2c ainda não foram descritas no Estado do Rio de Janeiro.
Várias mudanças continuam ocorrendo nas amostras de CPV-2a e 2b que
circulam na população canina em todo o mundo desde a década de 1980, embora
nem todas estejam associadas à variações antigênicas (TRUYEN et al., 2000;
BATILLANI et al., 2001; MARTELLA et al., 2004; PARRISH & KAWAOKA, 2005;
WANG et al., 2005; BUONAVOGLIA, C. 2006; DECARO et al., 2007).
Casos de co-infecção por diferentes tipos de parvovírus em um mesmo
hospedeiro também foram anteriormente descritos. URL et al. (2003) detectatam
pela PCR o tipo antigo CPV-2 e FPLV simultaneamente em uma amostra de
tecido nervoso de um felino apresentando hipoplasia cerebelar e panleucopenia.
Em 2006, em Portugal, os tipos novos CPV-2b e 2c foram detectados em uma
amostra fecal de um cão com gastrenterite não vacinado (VIEIRA et al., 2008-b) e
na Itália, BATINALLI et al. (2007) detectaram em duas amostras fecais de filhotes
(um cão e um gato) com sinais clínicos de gastrenterite a presença simultânea dos
tipos CPV-2a e 2c.
4.5 - Análise de homologia de nt e AA dos parvovírus caninos (CPV).
Por técnicas de mapeamento de nucleotídeo e sequênciamento, o acúmulo
de mutações pontuais tem sido observado em isolados de CPV desde a década
de 1980. Algumas destas mutações podem ser silenciosas, não provocando
mudança na sequência de AA (mutações sinônimas) ou podem levar a alteração
do AA (mutações não-sinônimas) (PARRISH et al.,1991; BATINALLI et al., 2002).
Após 1990, os novos tipos em circulação (CPV-2a e 2b) passaram a
apresentar uma mutação no gene que codifica para a proteína de capsídeo VP2
(AA 297 Ser→Ala). Esta mutação representou uma vantagem evolutiva, e se fez
presente em mais de 90% dos isolados de CPV até o ano de 2000 (TRUYEN,
1999; HOELZER; PARRISH, 2010). Estas variantes (297 Ser→Ala) foram
36
inicialmente denominadas de “Novo CPV-2a” e “Novo CPV-2b” , entretanto esta
nova nomenclatura não é adotada por todos os autores.
Uma outra variante de CPV-2a, apresentando uma alteração no gene que
codifica para a proteína de capsídeo VP2 na posição 4449 (AA 555 Ile→Val) foi
descrita em 2001 (BUONAVOGLIA et al., 2001; DESARIO et al., 2005; MEERS et
al., 2007), e também substituiu o tipo anterior CPV-2a (AA 555 Ile) em circulação
(DECARO et al., 2009-a). O resíduo 555 se localiza em um sítio antigênico da
proteína de capsídeo VP2, e esta mudança Ile→Val 555 representa uma reversão
à sequência original do vírus (CPV-2) (Quadro 1). (BUONAVOGLIA et al., 2001;
MARTELLA et al., 2005-a).
As diferentes mutações que ocorreram no genoma do CPV de 1978 até
hoje estão descritas no Quadro 1.
O acúmulo de mutações também permite o agrupamento das amostras em
diferentes grupos. Os isolados de CPV são normalmente divididos em dois grupos
maiores, sendo o primeiro composto pelo tipo CPV-2 e o segundo, claramente
distinto, contendo outros isolados CPV-like que se originaram de um ancestral
comum CPV-2a (HOELZER;PARRISH, 2010) (Figura 6).
Algumas características do genoma viral dos parvovírus como tamanho e
tipo do genoma viral (único filamento de DNA), ocorrência de metilação em
algumas regiões do genoma (DUFFY; SHACKLETON; HOLMES, 2008; HOELZER;
SHACKELTON; PARRISH, 2008), a co-circulação de diferentes tipos de parvovírus
em uma mesma população canina e felina (STEINEL et al., 1998; HOELZER;
PARRISH, 2010) e a co-infecção de diferentes tipos em um mesmo indivíduo
(BATINALLI et al., 2007; VIEIRA et al., 2008-b) são fatores que podem favorecer o
aparecimento de mutações.
Estudos demostram que o CPV apresenta taxas de mutação dos genes que
codificam para as proteínas de capsídeo VP1/ VP2 de 2x 10-4 e 8x10-5
substituições/ sítio/ ano respectivamente (HOELZER; PARRISH, 2010), valores
comparáveis aos observados em vírus de genoma RNA e valores superiores ao
FPLV (PARRISH; KAWAOKA, 2005; DUFFY,S.; SHACKLETON, A.; HOLMES,E.
2008).
37
Um estudo realizado com isolados brasileiros de CPV-2a e 2b apresentou
valores ainda maiores, de 2,4x 104 substituições/ sítio/ ano para os genes que
codificam para as proteínas de capsídeo VP1 e VP2 (PEREIRA; LEAL; DURIGON,
2007).
Para outras proteínas não estruturais (NS1 e NS2) as taxas de mutações do
CPV e FPLV são idênticas (7,9 x 10-5 substituições/ sítio/ ano), sugerindo que os
genes que codificam para estas proteínas estão sujeitos a uma menor pressão
seletiva (SHACKELTON et al., 2005).
38
Quadro 1. Principais mutações descritas no genoma do parvovírus canino
(CPV) durante sua evolução (TRUYEN et al., 1998; BUONAVOGLIA et al.,
2001; MOON et al., 2008; HOELZER; PARRISH, 2010).
Aminoácido e tipo
de substituição
Nome do vírus mutante Ano da
primeira
descrição
Importância e prevalência
relativa na população
80 Arg→ Lys FPLV para CPV-2 1978 Mudança de espectro de hospedeiro de felinos para caninos. Habilidade de se replicar somente em cães. Alterações na ligação com o receptor celular de transferrina (TRUYEN et al., 1998; HOELZER; PARRISH, 2010)
93 Lys→Asn
103 Val→ Ala
323 Asp→ Asn
564 Asn→Ser
568 Ala→ Gly
87 Met→ Leu CPV-2 para CPV-2a 1979 100% a partir de 1980. Novo tipo antigênico Habilidade de se replicar em felinos (TRUYEN et al., 1998; HOELZER; PARRISH, 2010)
101 Ile →Thr
300 Ala →Gly
305 Asp →Tyr
426 Asn →Asp CPV-2a para CPV-2b 1984 30 a 80% entre 1984 e 2005 Novo tipo antigênico Habilidade de se replicar em felinos. (TRUYEN et al., 1998; HOELZER; PARRISH, 2010)
297 Ser →Ala CPV-2a e 2b 1990 Superior a 90% até 2000 (TRUYEN et al., 1998; HOELZER; PARRISH, 2010)
555 Ile → Val CPV-2a e 2b 2001 Reversão à sequência original do vírus (CPV-2) Prevalência não estimada (BUONAVOGLIA et al., 2001; HOELZER; PARRISH, 2010)
426 Asp →Glu CPV-2c 2001 Prevalência não estimada Novo tipo antigênico. Habilidade de se replicar em felinos. (BUONAVOGLIA et al., 2001; HOELZER; PARRISH, 2010)
440 Thr→Ala CPV-2a 2008 Associado à sinais clínicos mais graves.Prevalência não estimada (MOON et al., 2008)
39
Figura 6. Relação filogenética entre os parvovírus de carnívoros, baseada no
gene que codifica para a proteína de capsídeo VP2. FPLV (vírus da
panleucopenia felina); BFPLV (parvovírus da raposa azul); RPV (parvovírus
do racoon) (HOELZER; PARRISH, 2010).
40
4.6 – Transmissão, patogenia e manifestações clínicas
Estudos de infecção experimental em filhotes de cães demostraram que a
infecção natural ocorre pela via oral, com replicação inicial do vírus nos tecidos
linfóides da orofaringe dois dias após a infecção (PI). A seguir, uma intensa
viremia é observada 3-5 dias PI, disseminando o vírus para outros tecidos: medula
óssea, tecido linfóide e intestino delgado (MACARTNEY; MCCANDLISH;
THOMPSON, 1984). Embora geralmente se manifeste como uma doença entérica,
a infecção pelo CPV é uma enfermidade com disseminação sistêmica, com as
manifestações clínicas surgindo 5 dias PI (POLLOCK; CARMICHAEL, 1990;
POLLOCK; COYNE, 1993).
No trato intestinal, a replicação viral nas células do epitélio germinativo das
criptas do intestino delgado resulta em morte celular, levando à destruição do
epitélio e, consequentemente, achatamento das vilosidades intestinais. Quando
ocorre a atrofia das vilosidades, o intestino delgado perde a capacidade de
absorção, pois o epitélio germinativo responsável por substituir o epitélio maduro
foi destruído. Devido à reposição celular, que ocorre de 1-3 dias, esta perda
normalmente é limitada (POLLOCK; COYNE, 1993) (Figura 7).
41
Figura 7. Fluxograma da patogenia da infecção pelo parvovírus canino (CPV)
(MACARTNEY; MCCANDLISH; THOMPSON, 1984; POLLOCK; COYNE, 1993;
SMITH-CARR et al., 1997).
O vírus pode ser detectado nas fezes a partir do 3o e 4o dias pós infecção
(PI), antes do aparecimento dos sinais clínicos. A maior concentração do vírus nas
fezes é observada entre o 4o e 6o dias PI (APPEL; PARRISH, 1987; POLLOCK;
COYNE, 1993). A transmissão fecal-oral ocorre quando animais infectados liberam
partículas virais nas fezes que permanecem no ambiente por longos períodos e
que contaminam animais saudáveis pela ingestão de água ou alimentos
contaminados (MURPHY et al., 1999).
Pela necessidade de células em atividade mitótica para a replicação, o CPV
apresenta tropismo por tecidos de animais jovens ou recém-nascidos, ou tecidos
de animais adultos com intensa proliferação (TSAO; CHAPMAN; AGBANDJE,
1991). Os tipos de CPV-2a, 2b e 2c apresentam patogenia e distribuição tecidual
semelhante, sugerindo um mesmo comportamento biológico desses tipos no
hospedeiro (DECARO et al., 2007).
Os filhotes de cães entre seis semanas e seis meses de vida são os mais
Transmissão oral
Replicação viral em nódulos linfáticos
(orofaringe) 1-2 dias pós infecção (PI)
Viremia 3-5 dias PI
6-10 dias PI
Linfonodos e
Medula óssea Intestino
Necrose de Células Linfóides
e Linfopenia
Necrose do epitélio germinativo
e diarréia
Infecção secundária, septicemia e morte Recuperação
42
suscetíveis e a forma clínica predominante da infecção pelo CPV é a gastrenterite,
que se caracteriza pela eliminação de fezes de consistência diminuída com ou
sem melena. A diarréia hemorrágica em filhotes de cães pode ser considerada um
indicativo da infecção por CPV (CARMICHAEL; BINN, 1981; PARRISH, 1995-b;
GUILFORD; STROMBECK, 1996; McCAW; HOSKINS, 1998). Em estudo anterior
realizado em nosso laboratório, foram observados os sinais clássicos em 70% dos
animais infectados por CPV. Os demais animais apresentaram sinais entéricos de
gravidade variada (CASTRO et al., 2007).
Os primeiros sinais clínicos geralmente são inespecíficos, observados entre
o 4º e 5º dias PI e incluem anorexia, apatia e febre (MCARTNEY et al., 1984;
MARTIN et al., 2002; PRITTIE, 2004). Vômito e diarréia ocorrem após 24 a 48
horas e levam a desidratação rapidamente, além de serem associados com a
rápida destruição de células em mitose do intestino e medula óssea (SHERDING,
1989; POLLOCK; COYNE, 1993).
A leucopenia, que ocorre comumente nas infecções pelo CPV tem sua
intensidade associada à gravidade dos sintomas clínicos, o que costuma ocorrer
entre o 5° e o 8° dias da infecção. Observa-se uma redução de moderada a
acentuada nesses tipos celulares em decorrência da destruição das células
precurssoras na medula óssea e em outros órgãos e tecidos com função
linfoproliferativa como timo, linfonodos e baço (GODDARD et al., 2008).
Quando a infecção pelo CPV evolui favoravelmente, a recuperação
hematológica ocorre entre 1 a 6 dias após o início do tratamento quando observa-
se frequentemente leucocitose reativa (LATIMER, 1995). Após o período das
manifestações clínicas, que geralmente dura de seis a sete dias, o animal
recupera o seu estado geral.
Os sinais clínicos observados após a infecção pelo FPLV estão associados
a duas síndromes típicas. Quando o FPLV infectava fetos ou felinos recém-natos
ocorria hipoplasia cerebelar, com manifestação clínica de ataxia (JOHNSON;
MARGOLIS; KILHAM, 1967; KILHAM; MARGOLIS; COLBY,1971). Contudo,
quando a infecção ocorria em filhotes com mais de 15 dias de idade, a doença
43
caracterizava-se por anorexia, febre, vômito, diarréia hemorrágica e leucopenia
(JOHNSON; MARGOLIS; KILHAM,1967; CARPENTER, 1971).
Apesar dos tipos CPV-2a e CPV-2b terem sido isolados de gatos com
sintomatologia clínica compatível com parvovirose, a patogenicidade destes vírus
em felinos domésticos ainda é discutida (MOCHIZUKI et al., 1993; MOCHIZUKI et
al., 1996). Enquanto alguns estudos de infecção experimental demonstraram que
CPV-2a e 2b eram capazes de infectar felinos mas não causavam manifestações
clínicas claras, apenas uma leucopenia transitória (CHALMERS et al. 1999;
SAKAMOTO; ISHIGURO; MOCHIZUKI, 1999); outros observaram óbito em 2/3
animais inoculados com uma amostra de CPV-2b isolada de um gato com
infecção pelo parvovírus (GAMOH et al., 2003).
Da mesma forma, DECARO et al. (2010) foram capazes de detectar CPV-
2c em uma amostra fecal de um filhote de gato que veio a óbito após um quadro
grave de gastrenterite hemorrágica. Por esta razão, a circulação dos novos tipos
de CPV em felinos domésticos, principalmente associada a doença clínica deve
ser monitorada.
4.7 – Imunidade e profilaxia
Vacinas contra FPLV estão disponíveis no mercado desde a década de
1950 e devido a similaridade antigênica entre o CPV-2 e o FPLV, vacinas com
FPLV inativado chegaram a ser utilizadas em cães no início da década de 80. A
primeira vacina contra CPV (CPV-2) foi disponibilizada no mercado em 1979,
aproximadamente um ano após a emergência deste agente na população canina
(HOELZER; PARRISH, 2010) e ficou comprovado que a vacina inativada
constituída por CPV apresentou melhores resultados que a vacina produzida com
FPLV (MOORE, 1983; BURTONBOY et al., 1991).
No fim da década de 1980, uma vacina atenuada foi desenvolvida com o
tipo CPV-2a e permaneceu no mercado por 10 anos, Durante este período,
nenhuma vantagem imunológica foi observada com o uso da vacina constituída
44
por este tipo em relação a vacina constituída pelo tipo antigo (CPV-2) (LARSON;
SHULTZ, 2008).
A presença de anticorpos maternos é considerada a causa mais comum de
falha vacinal em filhotes de cães e gatos (SCHULTZ, 2009). Vários estudos
mostraram que títulos de anticorpos séricos > 80 pela reação de inibição da
hemaglutinação (HI) são considerados protetores e títulos > 10 já interferem na
imunização com vacinas inativadas para CPV-2 (POLLOCK; COYNE, 1993). Os
filhotes que nascem de cadelas com baixos títulos de anticorpos podem tornar-se
suscetíveis ao vírus selvagem após quatro a seis semanas de vida, enquanto
filhotes de cadelas com altos títulos de anticorpos podem permanecer imunes à
infecção por até 12-20 semanas após o nascimento (MURPHY et al., 1999). Este
intervalo pode durar algumas semanas, durante as quais os cães não respondem
a imunização ativa mas estão vulneráveis a infecção (BUONAVOGLIA et al.,
1992; LARSON; SHULTZ,1997).
Na tentativa de reduzir este período de suscetibilidade, quatro anos após o
surgimento do CPV-2, vacinas constituídas pelo vírus atenuado (MLV ou Modified
Live Virus) foram elaboradas a partir de amostras isoladas no início da década de
80. Na década de 1990, vacinas constituídas por vírus modificado e com alto
título (107 TCID50/dose) e baixa passagem (HTLP) foram desenvolvidas com o
mesmo objetivo (BURTONBOY et al., 1991; BUONOVOGLIA et al., 1992).
A primeira vacina constituída pelo tipo CPV-2b foi desenvolvida no final da
década de 90. Sabe-se que os CPV-2a e 2b podem ser eliminados nas fezes a
títulos muito superiores que o CPV-2 (CARMICHAEL, 1994), provavelmente como
uma conseqüência da adaptação dos tipos de CPV ao hospedeiro canino o que
explicaria porque a tipo 2b foi mais eficiente em superar o bloqueio dos anticorpos
maternos (DECARO et al., 2005-a).
Atualmente, vacinas constituídas pelo tipo antigo do vírus (CPV-2) ou pelo
tipo CPV-2b estão disponíveis no mercado para a prevenção da parvovirose
canina. Não existem até o momento vacinas licenciadas constituídas pelos tipos
2a ou 2c (LARSON; SHULTZ, 2008).
45
Em 2006, um surto de gastrenterite em filhotes nascidos de cadelas
imunizadas com o tipo CPV-2 foi associado à presença do CPV-2c (DECARO et
al., 2006-b). Em 2007, um novo surto por CPV-2c com alta mortalidade foi relatado
por DECARO et al. (2008-a) desta vez acometendo adultos jovens (com idade de
seis meses a dois anos), que haviam recebido múltiplas doses de vacina MLV
constituída pelo tipo antigo CPV-2. Na mesma época, estudos baseados em
infecção experimental demostraram que as vacinas constituídas por CPV-2 e 2b
protegeram os filhotes frente ao desafio com o tipo 2c (LARSON; SHULTZ, 2008;
SPILBEY et al., 2008). Um estudo realizado por SCHULTZ et al. (2010) também
demonstrou que a vacinação com os tipos CPV-2 e 2b conferem proteção contra
os tipos novos circulantes (CPV-2a, 2b e 2c).
4.8 – Diagnóstico Laboratorial
De modo a confirmar o diagnóstico clínico destes animais e acompanhar a
circulação dos tipos de CPV, faz-se necessário a realização do diagnóstico
laboratorial. Este consiste principalmente na detecção direta do vírus a partir de
amostras fecais coletadas dos casos agudos da infecção, pois nesta fase, a
quantidade de vírus eliminada pelo animal doente pode alcançar até 109 TCID50/g
de fezes (POLLOCK; COYNE, 1993).
Os métodos utilizados para o diagnóstico são: a) observação das partículas
virais pela ME, b) reação de HA seguida pela reação de HI c) ensaios
imunoenzimáticos (EIE), d) isolamento em cultura de células e e)PCR
(TERRAMOTO et al., 1984; APPEL; PARRISH, 1987; DURIGON et al., 1987;
MOCHIZUKI; HASHIMOTO; ISHIDA, 1993; MOCHIZUKI, 2006; DECARO et. al.,
2009-b; SCHIMITZ et al., 2009).
Devido a propriedade de aglutinar hemácias de suínos e macaco Rhesus
(Macaca mulatta), o teste de HA é um dos mais utilizados rotineiramente para o
diagnóstico rápido da parvovirose canina. Entretanto o resultado positivo pelo HA
deve ser confirmado pelo HI, com um soro imune específico. Ainda, a reação de
46
HI com anticorpos monoclonais permite a diferenciação antigênica das amostras
de CPV (CARMICHAEL; JOUBERT; POLLOCK, 1980; DURIGON et al., 1987).
O diagnóstico também pode ser realizado através do isolamento viral em
cultura de células, tanto de origem canina (Madin-Darby canine kidney - MDCK)
quanto felina (Crandell feline kidney – CRFK) (CARMICHAEL; JOUBERT;
POLLOCK, 1980; MOCHIZUKI et al., 1984; DURIGON et al., 1987). Atualmente,
testes comerciais baseados em EIE e imunocromatográficos estão disponíveis no
mercado para a rápida detecção do CPV nas fezes, o que facilita o diagnóstico em
clínicas e hospitais veterinários (DESARIO et al., 2005; DECARO et al.,2009-b;
SCHIMITZ et al., 2009).
Técnicas baseadas na amplificação do genoma viral mostraram ser
altamente sensíveis e a PCR além de permitir a detecção do genoma do CPV em
amostras de fezes, possibilita a distinção entre o tipo antigo (CPV-2) presente em
algumas vacinas e os novos tipos (CPV-2a, 2b e 2c) em circulação (SENDA et al.,
1995; PEREIRA et al., 2000; BUONAVOGLIA et al., 2001; COSTA et al., 2005;
DESARIO et al., 2005; PEREIRA; LEAL; DURIGON, 2007). Metodologias de PCR
quantitativa também tem sido utilizada no diagnóstico, para a detecção, tipagem e
quantificação de DNA do CPV em fezes de cães com diarréia. Estas metodologias
possibiltam determinar o número de cópias do genoma viral durante o período de
eliminação do vírus nas fezes, o que é importante para a avaliação da eficácia de
vacinas (DECARO et al., 2006-a; 2007-a).
Os primeiros estudos realizados para diferenciação dos tipos de CPV
circulantes em CPV-2, CPV-2a e CPV-2b, utilizavam anticorpos monoclonais e
mapeamento com enzimas de restrição (PARRISH et al., 1985; 1988). A análise
das mudanças de nucleotídeos responsáveis pelas substituições de aminoácidos
na proteína VP2 do capsídeo viral (PARRISH et al.,1988) permitiu a elaboração de
pares de iniciadores específicos para tipagem das amostras de CPV através da
PCR (P2For/P2Rev e P2abFor/P2abRev) que foram então utilizados para a
distinção entre o tipo antigo (CPV-2) e novos de CPV (2a e 2b) (MOCHIZUKI et
al., 1993; SENDA et al., 1995; COSTA et al., 2005).
47
Posteriormente, PEREIRA et al. (2000) desenharam um novo par de
iniciadores para a tipagem do CPV-2b, baseado nas duas mudanças pontuais do
genoma viral que correspondem aos AA 426 e 555 e que permitem a
diferenciação dos tipos 2a e 2b. A PCR com estes pares de iniciadores
(P2abFor/P2abRev e P2bFor/P2bRev) foi amplamente utilizada no laboratório de
virologia (Universidade Federal Fluminense) e por outros grupos de pesquisa para
tipagem molecular das amostras de CPV em circulação até a implementação do
sequenciamento genômico (BUONAVOGLIA et al 2001; COSTA et al., 2005;
PÉREZ et al.,2007; CALDERON et al., 2009).
BUONAVOGLIA et al. (2001) detectaram por sequenciamento uma
mutação no AA426 (Asp-Glu) em duas amostras fecais de cães com gastrenterite
por CPV. Estas amostras foram inicialmente tipadas como 2b pela reação com
anticorpos monoclonais e PCR, mas apresentavam um perfil atípico após digestão
do produto de PCR com enzimas de restrição. Este mutante, detectado na Itália,
foi denominado de CPV-2c (426-Glu) e já se disseminou na população canina em
vários países (MARTELLA et al., 2004; DECARO et al., 2006-b; MEERS et al.,
2007; PÉRES et al., 2007; TOUIHRI et al., 2009; CALDERON et al., 2009; NANDI
et al., 2010).
A caracterização molecular dos CPV por de técnicas de sequenciamento foi
então difundida e estudos que compararam a tipagem pela PCR convencional e a
caracterização por sequenciamento demonstraram que a PCR não foi capaz de
identificar a mutação no resíduo 426 que caracteriza o novo tipo 2c
(BUONAVOGLIA et al., 2001) e as amostras 2c foram erroneamente tipadas como
CPV-2b por esta metodologia (DESARIO et al., 2005; MEERS et al., 2007).
Através do sequenciamento, BUONAVOGLIA et al. (2001) detectaram pela
primeira vez uma variante do tipo CPV-2a (555 Ile→Val). Estudos retrospectivos
em diferentes países evidenciaram que esta variante CPV-2a (555 -Val) já
circulava na população canina desde o início da década de 1990 (TRUYEN, 1999;
DESARIO et al., 2005; MEERS et al., 2007; HOELZER; PARRISH, 2010) e que
esta variante também era amplificada pelo par de iniciadores P2b, o qual se
pensava ser específico para o CPV-2b.
48
Com a descrição do CPV-2c e da variante CPV-2a (555 Val) ficou claro que
somente o sequenciamento do gene que codifica para a proteína de capsídeo VP2
permitiria a identificação dos tipos de CPV em circulação (DESARIO et al., 2005;
MEERS et al., 2007).
O sequênciamento genômico é considerado o método mais fidedigno para a
caracterização das amostras de parvovírus canino e felino e se baseia na
determinação da seqüência de nucleotídeos do gene que codifica para as
proteínas de capsídeo VP2 permitindo definir com precisão o tipo de parvovírus
presente na amostra e a análise da relação de homologia de nt e AA do recente
isolado com as amostras de parvovírus disponíveis em bancos de dados
(GenBank) (IKEDA et al., 2000; STEINEL et al., 2000; BATTILANI et al., 2002;
NAKAMURA et al., 2004; SHACKELTON et al., 2005; WANG et al., 2005;
DECARO et al., 2008-b; DECARO et al., 2009-a; DECARO et al., 2010)
Para a diferenciação dos tipos novos de CPV (2a, 2b e 2c), a análise da
região do genoma que codifica para a proteína de capsídeo VP2, contendo os AA
426 e 555 vem sendo amplamente utilizada (BUONAVOGLIA et al., 2001; PÉRES
et al., 2007; VIEIRA et al., 2008-a; CALDERON et al., 2009). Uma vez que o tipo
antigo do vírus (CPV-2) ainda é amplamente utilizado na preparação de vacinas
atenuadas, a análise de outros AA informativos (297, 300 e 305) da proteína VP2
pode ser necessária para a determinação do tipo do vírus.
49
5- MATERIAL E MÉTODOS
5.1- Amostras clínicas:
Para a realização deste estudo, foram incluidas 51 amostras fecais diarréicas
de cães com até um ano de idade pertencentes a coleção do Laboratório de
Virologia, Depatamento de Microbiologia e Parasitologa, Universidade Federal
Fluminense, obtidas de 1995 a 2007 cujas fichas apresentavam dados clínicos
completos e que foram consideradas positivas para CPV por HA/HI (título de HA >
512).
Além destas, foram incluídas amostras de fezes diarréicas obtidas de cães
com até um ano de idade obtidas durante a realização deste estudo ( 2008-2009).
As amostras foram coletadas de diferentes clínicas e Hospitais veterinários das
cidades de Niterói, Rio de Janeiro e município de Duque de Caxias. As amostras
foram coletadas após defecação espontânea e mantidas a –20ºC até o envio ao
laboratório onde ficavam estocadas nas mesmas condições até o processamento.
Cada amostra foi acompanhada de uma ficha preenchida pelo responsável pela
coleta, contendo dados de identificação do animal, data de coleta da amostras,
sinais clínicos e histórico das vacinas que recebeu (Anexo 1).
50
Seis amostras de gatos domésticos (cinco com gastrenterite e um
assintomático) com até seis meses de idade coletadas no ano de 2004 de um
abrigo para felinos na cidade do Rio de Janeiro e previamente confirmadas como
positivas para parvovírus por HA/HI e PCR (MIRANDA, 2006) também foram
incluidas neste estudo.
Este projeto obteve a aprovação do COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
ANIMAL (PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO) sob o número
0081/09 (Apêndice 2).
5.2- Reagentes e Soluções
5.2.1- Tampão Tris-Ca++ 0,01M pH 7,2
Tris-base (Invitrogen®).............................................................................. 1,21 g
Cloreto de Cálcio (Vetec®) 0,0015M......................................................... 0,02 g
Água Milli-Q q.s.p....................................................................................... 1000,00 mL
Em um béquer de 2000mL os reagentes foram adicionados e homogeneizados com
agitador magnético. O pH 7,2 foi ajustado com ácido clorídrico P.A. (Merck®) antes de
completar o volume final em proveta de 1000mL. A solução foi transferida para frasco
com vedação, autoclavada a 121ºC por 20 min e foi estocada em geladeira a 4ºC.
5.2.2- Tampão salina-borato (BABS) pH 9.0
Cloreto de sódio (Vetec)1,5M.............................................................. 80,0 mL
Ácido bórico (Merck) 0,5 M................................................................... 100,0 mL
Hidróxido de Sódio (Merck) 1,0 M....................................................... 24,0 mL
Soroalbumina bovina (BSA) (Sigma®).................................................... 2,0 g
H2O destilada q.s.p. ............................................................................... 1000,0 mL
As três soluções foram preparadas separadamente. Antes de adicionar a
51
soroalbumina bovina, esta foi dissolvida em banho-maria a 37ºC. A solução foi
estocada a 4ºC.
5.2.3-Tampão VAD pH 6.0
Solução A:
Cloreto de sódio (Vetec)...................................................................... 8,77 g
Fosfato de sódio dibásico P.A. (Vetec)................................................. 80,40 g
H2O destilada q.s.p................................................................................. 1000,00mL
Solução B:
Cloreto de sódio (Vetec)...................................................................... 8,77 g
Fosfato de sódio monobásico P.A. (Vetec) ......................................... 41,40 g
H2O destilada q.s.p ................................................................................ 1000,00mL
As soluções foram preparadas separadamente e estocadas a 4oC. Para pH 6,0,
125 mL da solução A foi misturado a 875 mL da solução B.
5.2.4- Caolim 25%
Caolim P.A (Vetec)................................................................................ 2,5 g
Água destilada q.s.p................................................................................ 10,0 ml
Os reagentes foram homogeneizados e acondicionado em tubo Falcon® em
geladeira a 4ºC até sua utilização.
5.2.5- Tampão L2 pH 6,4
Isotiocianato de guanidina (Invitrogen®) ............................................... 120,0 g
Tris-HCl 0,1 M pH 6,4.............................…………………...................… 100,0 mL
Em um béquer de 250 ml foram adicionados os reagentes e homogeneizados em
52
agitador magnético. O conteúdo foi transferido para proveta de 250 ml e o volume
final completado com Tris-HCl 0,1 M pH 6,4. O tampão foi acondicionado em
frasco âmbar e conservado em tempeatua ambiente. Esta solução é estável por 1
semana.
5.2.6- Tampão Tris-HCl 0,1 M pH 6,4
Tris-base (Invitrogen®)............................................................................... 12,11g
Água destilada q.s.p................................................................................... 1000,00mL
Em um béquer de 1000 mL, foram dicionados os reagentes e homogeinezados em
agitador magnético. O conteúdo foi transferido para proveta de 2000mL e o volume
final completado. O pH foi ajustado a pH 6,4 com ácido clorídrico P.A. (Merck ),
antes de completar o volume final. A solução foi autoclavada a 121ºC por 20 min e
estocada a 4o C.
5.2.7- NaOH 10N
Hidróxido de Sódio (Merck)……………………….................................. 10,0 g
Água destilada q.s.p................................................................................ 200,0 mL
5.2.8- Sílica
Dióxido de Sílica...................................................................................... 60,0 g
Água destilada q.s.p. .............................................................................. 500,0 mL
O reagente foi homogeneizado e mantido em repouso para sedmentação por 24 h.
Após este período, 430 mL da solução foram aspirados por sucção e
desprezados. O volume foi completado para 500 mL com água destilada,
homogeneizado e mantido em repouso para sedmentação por 5 h. 440 mL da
solução foram aspirados por sucção e desprezados. O sedmento foi ajustado a pH
2,0 pela adição de 600 L de ácido clorídrico 37% (Merck) e aliquotado 10 mL da
53
solução em frascos de cor âmbar. Os frascos foram autoclavados e estocados à
temperatura ambiente.
5.2.9- Etanol 70%
Etanol P.A. (Merck®) ............................. ................................................ 70,0 mL
Água destilada q.s.p. .............................................................................. 30,0 mL
Os regentes foram homogeneizados em béquer de 250mL. O volume final foi
ajustado em proveta de 250 mL. A solução foi mantida a -20ºC.
5.2.10- EDTA 0,5M pH 8,8
Ácido etilenodiamino tetra-acético (Sigma®) ......................................... 146,1g
Água destilada q.s.p. ............................................................................. 1000,0mL
Em um béquer de 1000 ml foram adicionados EDTA e 300 mL de água destilada.
O pH 8,8 foi ajustado com hidróxido de Sódio (Merck) e a solução foi
homogeneizada com agitador magnético. A solução foi transferida para proveta de
1000 mL e o volume final ajustado. A solução foi aliquotada em frascos com tampa
e autoclavado a 121ºC por 20 min. Os frascos foram mantidos em geladeira a 4ºC.
5.2.11- Tampão Tris-Boro-EDTA (TBE) 10 X pH 8,4
Tris-base (Invitrogen®) .......................................................................... 108,0 g
Ácido Bórico (Merck).......................................................................... 5,5 g
EDTA 0,5M pH 8,8 (Sigma®) ..........................…………....................... 40,0 mL
H2O destilada q.s.p............................................................................... 1000,0 mL
Em um béquer de 2000 mL foram adicionados os reagentes e homogeneizados
com agitador magnético. O conteúdo foi transferido para uma proveta de 1000 mL,
completado o volume final e transferido para frasco com vedação. A solução final
54
foi conservada a 4ºC e diluída para 0,5 X no momento do uso.
5.2.12- Agarose a 1,5%
Agarose ................................................................................................... 1,5 g
Tampão TBE 0,5 X pH 8,4 ..................................................................... 100,0 mL
A agarose foi pesada, colocada em erlenmeyer. Foram adicionados 100 mL de
tampão TBE 0,5X. O erlenmeyer foi levado ao forno de microondas. A mistura foi
resfriada a 50ºC e colocada na cuba de eletroforese, evitando a formação de
bolhas.
5.2.13- Solução de brometo de etídio
Brometo de etídio 10 mg/mL (Invitrogen®).............................................. 15,0 µL
Água destilada q.s.p................................................................................ 300,0 mL
5.2.14- Tampão corante azul de Bromofenol
Azul de Bromofenol (Shandom So)......................................................... 0,1 g
Xylene Cyanol FF (Sigma®).................................................................... 0,1 g
EDTA 0,2 M pH 8 (Sigma®).................................................................... 10,0 mL
Glicerol P.A. (Sigma®)............................................................................. 50,0 mL
Água destilada q.s.p. ............................................................................. 100,0 mL
Os reagentes foram gentilmente homogeneizados em um béquer de 250 mL até a
completa dissolução. Alíquotas de 10 ml foram acondicionadas em frascos âmbar
e mantidas em temperatura ambiente.
55
5.3 Iniciadores de cadeia utilizados na reação de PCR para caracterização
genômica
Para a caracterização genômica das amostras de CPV e FPLV foram
selecionados quatro pares de iniciadores, descritos na Figura 8 e Quadro 2.
Para a distinção entre os tipos antigo e novos de CPV foram usados os
seguintes iniciadores específicos: P2: tipo antigo (CPV-2); P2ab: tipos novos (2a,
2b e 2c) (SENDA et al., 1995) (Figura 8 e Quadro 2).
Para sequenciamento, foram escolhidos pares de iniciadores já descritos
em literatura (BUONAVOGLIA et al., 2001), que amplificam dois fragmentos do
gene que codifica para a proteína de capsídeo VP2. O par de iniciadores
555For/555Rev amplifica uma região do gene que codifica dois resíduos
importantes para a caracterização dos novos tipos do CPV (AA 426 e AA 555). O
par de iniciadores HFor/HRev, amplifica uma outra região do genoma que codifica
para três resíduos importantes (AA297, AA300 e AA305) (BUONAVOGLIA et al.,
2001).
Figura 8. Localização da sequência dos iniciadores de cadeia utilizados
neste estudo.
HFor/HRev
P2For/ P2Rev 3025 3706
P2abFor/P2abRev 3025
3706
3556 4166
555For/555Rev 4003 4561
5’ 3’
0 1000 2000 3000 4000 5000
56
Quadro 2. Descrição dos iniciadores utilizados na reação de PCR utilizados
neste estudo, com o tamanho em pares de base (pb) de seus respectivos
produtos.
Iniciador Sequencia Posição Tamanho do amplicon
Especificidade
P2For *
P2Rev
GAAGAGTGGTTGTAAATAATA CCTATATCACCAAAGTTAGTAG
(3025-3045)
(3685-3706)
681 pb FPLV
CPV-2
P2abFor *
P2abRev
GAAGAGTGGTTGTAAATAATT
CCTATATAACCAAAGTTAGTAC (3025-3045)
(3685-3706)
681 pb CPV-2a, CPV-2b
CPV-2c
H For **
H Rev
CAGGTGATGAATTTGCTACA
CATTTGGATAAACTG GTGGT
3556-3575
4183-4166
608 pb
555 For **
555 Rev
CAGGAAGATATCCAGAAGGA
GTGCTAGTTGATATGTAATAAACA
4003-4022
4585-4561
563 pb
* SENDA et al., 1995, * * BUONAVOGLIA et al., 2001
5.4 – Métodos
5.4.1- Suspensão fecal a 10%:
Inicialmente foi preparada uma suspensão a 10% de cada amostra fecal em
solução Tris-Ca++ 0,01M pH 7,2. A seguir adicionou-se igual volume de
clorofórmio e após agitação em vortex por 1 minuto, as suspensões foram
centrifigadas a 1000 rpm por 15 minutos, e os sobrenadantes acondicionados em
tubo plástico de 1,5 ml1 até o momento da análise (CARMICHAEL; JOUBERT;
POLLOCK, 1980).
5.4.2 - Reação de Hemaglutinação e Inibição da Hemaglutinação:
Para triagem das 100 amostras coletadas no decorrer do estudo (2008-
2009), o teste de hemaglutinação (HA) foi utilizado para a detecção direta de
parvovírus canino nas suspensões fecais, de acordo com o descrito em SANTOS
et al. (1997). As suspensões fecais foram diluídas em microplacas de 96
1 Eppendorf®
57
cavidades, utilizando-se diluições seriadas em tampão BABS pH 9,0. Após as
diluições, adicionou-se 50 l de suspensão de hemácias de suínos a 0,5% em
tampão VAD (pH 6,0). A mistura foi incubada por 18 horas a 4ºC e o título da
reação foi determinado como sendo o inverso da maior diluição da suspensão
fecal capaz de causar a aglutinação total das hemácias. Amostras com títulos
menores ou iguais a oito foram consideradas negativas, enquanto amostras com
títulos maiores ou iguais a 16 foram analisadas pelo HI para confirmação do
diagnóstico.
O teste de (HI) foi utilizado para confirmar as amostras positivas por HA. O
soro imune de coelho ou cobaio foi previamente inativado a 56ºC por 30 minutos,
tratado com suspensão de caolim a 25% em BABS e suspensão de hemácias a
50% em VAD (SANTOS et al., 1997). A seguir foram feitas diluições seriadas do
soro de cobaio (25l) em BABS (pH 9,0) na microplaca de 96 cavidades.
Adicionou-se igual volume de suspensão fecal diluída para conter 8
UHA/ 50l do vírus. Após incubação a 37ºC por duas horas, adicionou-se em
todas as cavidades da microplaca 50l de suspensão de hemácias a 0,5%. As
placas foram incubadas a 4ºC por 18 horas para posterior leitura. Cada microplaca
continha controles de soro, vírus e hemácia.
5.4.3 - Reação em cadeia pela polimerase para a detecção do
genoma do parvovírus canino:
A fim de confirmar os resultados positivos no HA/HI de todas as amostras
fecais de cães incluidas, a PCR foi realizada com dois pares de iniciadores para
distinguir entre o tipo antigo (P2For/P2Rev) e tipos novos de CPV
(P2abFor/P2abRev).
5.4.3.1. - Extração do ácido nucleico:
Após o preparo da suspensão fecal a 10%, procedeu-se a extração do
genoma viral através do método de Boom que utiliza isotiocianato de guanidina e
58
sílica (BOOM; SOL; SALIMANS, 1990) com algumas modificações (COSTA et al.,
2005).
Em tubo plástico de 1,5 mL2, a 200 L da suspensão fecal a 10% foi
adicionado 200 L de fenol/clorofórmio3, seguido de homogeneização em vórtex.
Após centrifugação por 2 minutos, transferiu-se o sobrenadante para um outro
tubo e em seguida foram adicionados 15 L de sílica e 1 mL de tampão L2 pH 6,4.
Os reagentes foram homogeneizados em vórtex e mantidos à temperatura
ambiente por 30 minutos com agitação constante.
A seguir, as amostras foram centrifugadas a 14.000 x g/ 20 segundos e os
sobrenadantes decantados. As amostras foram sucessivamente lavadas em
500L de etanol 70% (2x) e acetona P.A. (1x) mantidos a –20ºC. Os tubos foram
incubados a 56ºC/15 minutos para a secagem completa dos sedimentos e, então,
adicionou-se a cada tubo 50L de água estéril4. Após nova centrifugação a
14.000 x g/3 minutos, os eluatos foram coletados em tubos plásticos tipo
Eppendorf e estocados a -20ºC para posterior uso na PCR.
Cada reação de extração de DNA foi realizada com um controle positivo
(vacina CPV-2b disponível comercialmente no Brasil 5) e um negativo (água
estéril6).
5.4.3.2- Reação em cadeia pela polimerase
Após extração do genoma a reação de PCR foi realizada em termociclador
automático7. Inicialmente, 10L do extrato foi incubado com 1L de cada par de
iniciador (20 picomol) a 94ºC/2 minutos, seguido de rápido resfriamento a 4ºC por
2 minutos. A reação de amplificação foi realizada em um volume final de 50L
2 Eppendorf® 3 Invitrogen®
4 Milli-Q®
5 Duramune®
Max5 FortDodge 6 Milli-Q®
7 Perkin Elmer
59
contendo 50 mM KCl2, 10mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5mM MgCl2 8, 200µM de cada
dNTP 9 e 0,5U de Taq DNA Polimerase Platinum II10. A PCR consistiu de 30 ciclos
de incubação a 94ºC por 30 segundos, 55ºC por 2 minutos e 72ºC por 2 minutos e
extensão final de 10 minutos a 72ºC. Cada reação de PCR foi realizada com um
controle positivo (vacina CPV-2b disponível comercialmente no Brasil11) e um
negativo (água estéril12).
A cada produto da reação de PCR (amplicon) foi adicionado 1µL de corante
azul de bromofenol e os mesmos foram submetidos a eletroforese em gel de
agarose a 1,5% em tampão TBE 0,5 % por 50 minutos a 84 volts. Utilizou-se como
padrão de corrida o DNA Ladder de 100 pb13. O gel foi corado em solução de
brometo de etídio a 0,5 g/mL, os produtos amplificados visualizados em
transiluminador (UV)14.
5.4.4- Sequenciamento parcial do gene que codifica para a
proteína de capsídeo VP2 dos parvovírus canino e felino:
Todas as amostras de 1995-2007 cujos resultados foram confirmados pela
PCR; as seis amostras felinas coletadas em 2004; e as amostras fecais obtidas no
período de 2008-2009 (HA>512; HI> 40 e confirmadas pela PCR) com dados
clínicos completos foram submetidas ao sequenciamento parcial do gene que
codifica para a proteína de capsídeo VP2.
A reação de amplificação com os iniciadores 555For/555Rev foi realizada
em um volume final de 50L, com a mistura de reagentes15: PCR buffer 1x (50 mM
KCl2, 10mM Tris-HCl pH 8,3), 1,5mM MgCl2 , 200µM de cada dNTP16, 1L de cada
8 Invitrogen 9 Invitrogen 10 Invitrogen 11 Duramune®
Max5 FortDodge 12 Milli-Q®
13 Invitrogen 14 Labnet 15 Invitrogen 16 Invitrogen
60
par de iniciador (20 picomol) e 0,5U de Taq DNA Polimerase Platinum II17. A PCR
foi realizada em termociclador automático e consistiu de uma etapa inicial de
incubação a 94ºC por 10 minutos, 40 ciclos de a 94ºC por 30 segundos, 50ºC por
1 minuto e 72ºC por 1 minuto seguido por extensão final de 10 minutos a 72ºC.
A reação de amplificação com os iniciadores HFor/HRev foi realizada em
um volume final de 50L, com a mistura de reagentes18: PCR buffer 1x (50mM
KCl2, 10mM Tris-HCl pH 8,3), 1,5mM MgCl2, 200µM de cada dNTP, 1L de cada
par de iniciador (20 picomol) e 0,5U de Taq DNA Polimerase Platinum II. A PCR
foi realizada em termociclador automático e consistiu de uma etapa inicial de
incubação a 94ºC por 10 minutos, 40 ciclos de a 94ºC por 30 segundos, 52oC por
1 minuto e 72oC por 1 minutos seguido por extensão final de 10 minutos a 72oC.
Para análise dos produto amplificado nas reações com os iniciadores
555For/555Rev e HFor/HRev, 1µL de corante azul de bromofenol foi adicionado a
10 µL de cada amostra e as mesmas foram submetidas a eletroforese em gel de
agarose a 1,5% em tampão TBE 0,5 % por 50 minutos a 84 volts. Os produtos
amplificados foram visualizados em transiluminador UV 19 e a quantificação do
DNA nas amostras foi realizada utilizando “Low DNA Mass”20.
Para a purificação do produto amplificado pela técnica de PCR, foi utilizado o
Kit comercial QIAQuick PCR purification kit 21. Para o sequenciamento direto dos
produtos amplificados e purificados foi utilizado o kit comercial “Big Dye
Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit”22 conforme orientação do fabricante. Foram
usados os mesmos iniciadores de cadeia utilizados na reação de PCR. Os
produtos da reação de sequência foram purificados com as colunas CENTRI-SEP
23 conforme orientação do fabricante.
17 Invitrogen 18 Invitrogen 19 Labnet 20 Invitrogen 21 QIAGEN®
22 Applied Biosystems®, CA, USA 23 Princeton Separations®, CA, USA
61
Os cromatogramas das sequências foram obtidos a partir do sequenciador
automático de 48 capilares ”ABI Prism 3730 Genetic Analyzer” 24 do serviço da
“Plataforma de Sequenciamento de DNA PDTIS/FIOCRUZ” conforme OTTO et al.,
(2008).
Todas as amostras foram sequenciadas nas duas direções (5’→ 3’e 3’→ 5’).
Após o alinhamento com as sequências padrões, as regiões correspondentes aos
iniciadores foram retiradas.
Todas as sequências obtidas neste trabalho foram depositadas no
GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank) e cada amostra sequenciada foi
identificada com a sigla do Estado de origem (RJ), seguido pelo número da
amostra no laboratório e pelo ano de coleta.
5.4.5-Análise da homologia de nt e AA entre as amostras dos parvovírus
canino e felino:
As sequências nucleotídicas (e as aminoacídicas deduzidas a partir das
mesmas) foram alinhadas utilizando o método CLUSTAL W, contido no programa
Bio Edit (HALL et al., 1999). As sequências protótipos representantes dos
diferentes tipos de CPV e FPLV, descritas em diferentes países, foram resgatadas
no site do NCBI (National Center for Biotechnology Information)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) através dos seus números de acesso ou mediante a
utilização da ferramenta BLAST (Basic Local Aligment Search Tool), disponível no
GenBank.
As relações de homologia de nt e AAs entre as diferentes sequências foram
determinadas mediante a utilização do programa MEGA v.4.0 (TAMURA et al.,
2007) através do método de reconstrução filogenética Neighbor-Joining. A
distância genética entre as diferentes amostras foi calculada mediante o modelo
Kimura-dois-parâmetros como modelo de substituição nucleotídica. A significância
estatística das diferentes filogenias obtidas foi estimada através de 2.000 réplicas
de bootstrap.
24 Applied Biosystems, Foster City, CA, USA
62
Todas as etapas de detecção, caracterização e análise de homologia de nt e
AA das amostras de CPV e FPLV utilizadas neste estudo estão demostradas na
Figura 9.
Figura 9. Fluxograma de detecção, caracterização e análise de homologia de
nt e AA das amostras de parvovírus canino e felino utilizadas neste estudo.
Suspensão fecal 10% (-20°C)
HA
< 8
> 16
POSITIVO
PCR com pares de iniciadores P2For/P2Rev e P2abFor/P2abRev
Extração do Genoma Isotiocianato de Guanidina e Sílica
PCR para Sequenciamento com pares de iniciadores 555For/555Rev e HFor/HRev
Sequenciamento (Plataforma de Sequenciamento de
DNA PDTIS/ FIOCRUZ)
Análise de homologia de nt e AA
Amostras fecais caninas (2008-2009)
NEGATIVO HI
HI< 20 HI>40
51 amostras caninas 1995-2007
HA>512 HI> 40
6 amostras felinas 2004
HA>512 HI> 40
63
6- RESULTADOS
6.1- Triagem de amostras CPV positivas para sequenciamento
Das 100 amostras fecais de cães coletadas no período de 2008-2009, 43
foram positivas por HA/HI e PCR e destas, 18 amostras foram incluidas para
caracterização por sequenciamento (HA > 512 e dados clínicos completos).
Portanto, um total de 69 amostras fecais de cães foram analisadas: 51
coletadas entre 1995-2007 e 18 de 2008-2009. A distribuição das 69 amostras
caracterizadas neste estudo de acordo com o sexo, faixa etária e histórico de
vacinação está demonstrada na Tabela 1.
Todas as 69 amostras apresentaram amplificação somente com o par de
iniciador P2ab, específico para os tipos novos de CPV.
64
Tabela 1. Distribuição das 69 amostras fecais caninas, positivas por HA/HI e
PCR analisadas neste estudo conforme o sexo, faixa etária, raça, condição
vacinal dos cães e tipo de CPV (CPV-2a, 2b ou 2c) caracterizado na amostra
fecal.
Amostras fecais caninas
CPV-2a CPV-2b CPV-2c Total (%)
Sexo
Macho 15 6 0 21 (30%)
Fêmea 26 21 1 48 (60%)
Faixa etária (meses)
< 2 12 6 0 18 (26%)
>2 - <4 21 15 1 37 (54%)
> 4 8 6 0 14 (20%)
Raça
SRD 12 7 1 20 (29%)
Labrador Retriever 4 4 0 8 (12%)
Poodle 4 4 0 8 (12%)
Cocker Spaniel 2 4 0 6 (8%)
Rottweiler 6 0 0 6 (8%)
Pastor Alemão 5 0 0 5 (8%)
Outras raças 8 8 0 16 (23%)
Vacinação
Sim 22 15 0 37 (54%)
Não 19 12 1 32 (46%)
SRD: Sem Raça Definida
Outras Raças: Fila Brasileiro (2); Golden Retriever de Labrador (2); Pit Bull (2); Teckel (2);
Yorkshire Terrier (2) Bull Terrier (2); Bulldog Francês (2); Dálmata (1); Shit-zu (1).
65
6.2- Caracterização dos tipos de parvovírus canino (CPV) em amostras fecais
de cães não vacinados apresentando gastrenterite.
Um total de 32 amostras fecais de filhotes de cães não vacinados
apresentando quadro clínico de gastrenterite (16 machos e 16 fêmeas), coletadas
no período de 1995 a 2009, foram amplificadas pela PCR com os iniciadores
555For/ 555Rev para realização do sequênciamento parcial do gene que codifica
para a proteína de capsídeo VP2.
As sequências obtidas de amostras de cães não vacinados foram
depositadas no GenBank (número de acesso: FJ977046-FJ977077) e
comparadas com amostras protótipos de CPV: CPV-2, 1978 (M38245), CPV-2a,
1983 (M24000), CPV-2a, 2007, BR (DQ340434), CPV-2b, 2008, BR (FJ236068),
CPV-2c, 2007, URU (EF375482), CPV-2c, 2008, ARG (FJ349322), CPV-2c, 2008,
BR (EU797727).
As principais diferenças observadas entre as sequências parciais do gene
que codifica para a proteína de capsídeo VP2 geradas neste estudo e as
sequências obtidas a partir das amostras protótipos de diferentes locais, estão
descritas na Tabela 2.
A análise por sequênciamento do fragmento de 563 pb do gene que codifica
para a proteína VP2, que abrange as regiões 426 e 555, permitiu a caracterização
dos novos tipos de CPV nas 32 amostras estudadas. Todas as 12 amostras
coletadas de 1995 a 2003 foram caracterizadas como CPV-2a. De 2004 a 2006,
tanto CPV-2a (4) quanto CPV- 2b (4) foram detectados. A partir de 2006, nove das
12 amostras foram caracterizadas como CPV-2b (Tabela 2).
Todas as amostras caracterizadas como CPV-2a apresentaram mutação
Guanina (G) no nucleotídeo 4449 do gene que codifica para VP2, o que resulta em
uma alteração não sinônima no resíduo 555 (Ile→Val) (Tabela 2).
Aproximadamente 59% das amostras estudadas (19/32) apresentaram uma
substituição sinônima de adenosina (A) por guanina (G) no nt 4508, resíduo 574.
Outras 12 amostras (nove CPV-2b, duas CPV-2a e uma CPV-2c) apresentaram
66
outra mutação sinônima, uma inserção de adenosina (A) no nt 4104 – resíduo
440. (Tabela 2).
Tabela 2. Diferenças de nucleotídeos e aminoácidos encontradas no produto
amplificado de 563 bp do gene que codifica para VP2 nas 32 amostras de
parvovirus canino de cães não vacinados apresentando gastrenterite e
isolados obtidos no GenBank.
Sequencias GenBank
(Protótipo)
tipo AA 426
(nt 4062)
AA 440
(nt4104)
AA 555
(nt 4449)
AA 574
(nt4508)
M38245 (EUA) 1978 CPV-2 AAT (Asn) - GTA (Val) A
M24000 (EUA) 1983 CPV-2a AAT (Asn) - ATA (Ile) A
DQ340434 (BR) 2007 CPV-2a AAT (Asn) - GTA (Val) A
FJ236068 (BR) 2008 CPV-2b GAT(Asp) - GTA (Val) A
EF375482 (URU) 2007 CPV-2c GAA (Glu) - GTA (Val) A
EU797727 (BR) 2008 CPV-2c GAA (Glu) - GTA (Val) A
FJ349322 (ARG) 2008 CPV-2c GAA (Glu) - GTA (Val) -
Amostra tipo 426
(nt 4062)
440
(nt4104)
555
(nt 4449)
574
(nt4508)
RJ004/95 CPV-2a AAT (Asn) - GTA (Val) G
RJ083/96 CPV-2a AAT (Asn) - GTA (Val) G
RJ126/97 CPV-2a AAT (Asn) - GTA (Val) G
RJ129/97 CPV-2a AAT (Asn) - GTA (Val) G
RJ164/98 CPV-2a AAT (Asn) - GTA (Val) G
RJ167/98 CPV-2a AAT (Asn) - GTA (Val) A
RJ183/99 CPV-2a AAT (Asn) - GTA (Val) A
RJ223/99 CPV-2a AAT (Asn) - GTA (Val) G
RJ251/00 CPV-2a AAT (Asn) - GTA (Val) A
RJ305/01 CPV-2a AAT (Asn) - GTA (Val) A
RJ369/02 CPV-2a AAT (Asn) - GTA (Val) A
RJ426/03 CPV-2a AAT (Asn) - GTA (Val) A
RJ542/04 CPV-2b GAT (Asp) A GTA (Val) A
RJ596/04 CPV-2b GAT (Asp) A GTA (Val) A
RJ630/05 CPV-2b GAT (Asp) A GTA (Val) A
RJ708/06 CPV-2a AAT (Asn) - GTA (Val) A
RJ736/06 CPV-2a AAT (Asn) - GTA (Val) A
RJ738/06 CPV-2a AAT (Asn) - GTA (Val) G
RJ803/06 CPV-2a AAT (Asn) - GTA (Val) G
RJ814/06 CPV-2b GAT (Asp) - GTA (Val) A
RJ815/07 CPV-2b GAT (Asp) - GTA (Val) A
67
RJ818/07 CPV-2b GAT (Asp) A GTA (Val) A
RJ825/07 CPV-2b GAT (Asp) - GTA (Val) A
RJ868/08 CPV-2a AAT (Asn) A GTA (Val) G
RJ893/08 CPV-2a AAT (Asn) A GTA (Val) G
RJ898/08 CPV-2b GAT (Asp) A GTA (Val) A
RJ913/08 CPV-2b GAT (Asp) - GTA (Val) G
RJ925/08 CPV-2b GAT (Asp) A GTA (Val) A
RJ926/08 CPV-2b GAT (Asp) A GTA (Val) A
RJ933/08 CPV-2b GAT (Asp) A GTA (Val) G
RJ934/08 CPV-2c GAA (Glu) A GTA (Val) A
RJ944/09 CPV-2b GAT (Asp) A GTA (Val) G
Uma amostra coletada no fim de 2008 (RJ934/08) apresentou o códon GAA
no AA 426 da proteína de capsídeo VP2. A presença do códon para Ácido
Glutâmico caracterizou a amostra como CPV-2c (Glu-426). A comparação desta
amostra 2c (RJ934/08) com os demais tipos de CPV-2c descritos na América do
Sul demonstrou 100% de similaridade em aminoácidos na região sequenciada
(Figura 10).
A análise de homologia de nt e AA realizada a partir das sequências
parciais de VP2, das amostra de cães não vacinados (Figura 11) demonstrou que
a amostra 2c deste estudo (RJ934/08) e os demais isolados CPV-2c da América
do Sul se agruparam. Estas amostras se inseriram em um grupo maior com
outras dez amostras CPV-2b deste estudo (coletadas de 2004 a 2008), uma
amostra CPV-2b de 2007 do Rio Grande do Sul (FJ23608) e o isolado CPV-2
(M38245).
Das 18 amostras caracterizadas como CPV-2a neste estudo (Tabela 2), 13
agruparam-se com demais isolados de CPV-2a (M240000, DQ340434,
DQ340408) (Figura 11). A única amostra de cão não vacinado coletada em 2009
(RJ944/09) permaneceu isolada filogeneticamente das demais (Figura 11).
68
Figura 10. Comparação entre as sequências nucleotídicas dos isolados de
parvovírus canino tipo 2c detectados na América do Sul. Em destaque em
vermelho as mutações pontuais detectadas nos diferentes isolados.
69
RJ004/95
RJ369/02
RJ164/98
RJ736/06
CPV-2A (DQ340408)
RJ305/01
RJ223/99
RJ251/00
RJ183/99
RJ893/08
RJ129/97
CPV-2A (M24000)
RJ083/96
RJ167/98
CPV-2 (EU659116)
CPV-2A (DQ340434)
RJ126/97
CPV-2 (M38245)
RJ818/07
RJ926/08
RJ815/07
CPV-2C (EU797727)
CPV-2C (EF375482)
RJ934/08
CPV-2C (FJ349322)
RJ814/06
CPV-2B (FJ236068)
RJ825/07
RJ596/04
RJ925/08
RJ630/05
RJ542/04
RJ898/08
RJ426/03
RJ708/06
RJ933/08
RJ913/08
RJ738/06
RJ803/06
RJ868/08
RJ944/09
82
40
64
27
61
35
7
4451
17
7
25
0.005
Figura 11. Dendograma construído a partir das análise de um fragmento (563
pb) do gene que codifica para a proteína de capsideo VP2 das amostras de
parvovírus canino de cães não vacinados e amostras de CPV no GenBank. A
barra na parte inferior da figura é proporcional à distância genética.
70
6.3 - Monitoramento dos tipos de Parvovirus Canino (CPV) em filhotes de
cães vacinados apresentando gastrenterite no Estado do Rio de Janeiro
Para a realização deste estudo, 37 amostras de cães vacinados
consideradas positivas para CPV pelas técnicas de HA/HI e PCR foram
analisadas.
As amostras foram coletadas de filhotes com idade entre dois e 10 meses
que haviam recebido uma (20), duas (12) ou três (5) doses de vacina. Dos cinco
filhotes que receberam três doses de vacina, três apresentavam idade inferior a
quatro meses no momento da última dose, um apresentava mais de quatro meses
e para o último, este dado não estava disponível (Tabela 3).
Em relação ao tipo de CPV utilizado na preparação da vacina, verificou-se
que 20 filhotes receberam vacina mono ou polivalente constituída com CPV-2.
Outros três receberam vacina constituída pelo tipo CPV-2b. Para 14 filhotes, este
dado não estava disponível (Tabela 3).
Dos 27 filhotes cuja data da última vacinação era conhecida, para cinco o
intervalo entre a vacinação e o aparecimento dos sinais clínicos foi de três a nove
dias. Para outros 22 animais este intervalo foi superior a 10 dias (Tabela 3).
Tabela 3. Idade e condição vacinal dos cães e tipo de parvovírus canino
detectado nas 37 amostras fecais coletadas de cães vacinados no Rio de
Janeiro no período de 1995-2009.
Amostra Idade
(Meses)
Tipo de CPV da vacina
Número de doses de
vacina
Intervalo entre vacinação e
aparecimento dos sintomas
Tipo de CPV detectado
RJ304/01 2 CPV-2b 1 3- 9 dias CPV-2a
RJ006/95 2 CPV-2 1 > 9 dias CPV-2a
RJ353/01 2 CPV-2 1 > 9 dias CPV-2a
RJ735/06 2 ND* 1 > 9 dias CPV-2b
RJ833/07 2 CPV-2 1 > 9 dias CPV-2b
RJ834/07 2 CPV-2 1 > 9 dias CPV-2a
RJ936/08 2 ND 1 > 9 dias CPV-2b
71
RJ905/08 2 ND 1 ND CPV-2a
RJ302/01 2 CPV-2 2 > 9 dias CPV-2a
RJ688/06 3 CPV-2 1 3- 9 dias CPV-2b
RJ089/96 3 CPV-2 1 > 9 dias CPV-2a
RJ705/06 3 CPV-2 1 > 9 dias CPV-2b
RJ840/07 3 ND 1 > 9 dias CPV-2b
RJ914/08 3 ND 1 > 9 dias CPV-2b
RJ948/09 3 CPV-2 1 > 9 dias CPV-2b
RJ242/00 3 CPV-2 1 ND CPV-2a
RJ741/06 3 ND 1 ND CPV-2a
RJ349/01 3 ND 2 3- 9 dias CPV-2a
RJ835/07 3 CPV-2 2 3- 9 dias CPV-2b
RJ107/97 3 CPV-2 2 > 9 dias CPV-2a
RJ928/08 3 ND 2 ND CPV-2b
RJ001/95 3 CPV-2 3 > 9 dias CPV-2a
RJ159/98 4 ND 1 > 9 dias CPV-2a
RJ339/01 4 ND 1 > 9 dias CPV-2a
RJ371/02 4 ND 2 ND CPV-2a
RJ951/09 4 CPV-2b 2 ND CPV-2a
RJ209/99 4 CPV-2 3 3- 9 dias CPV-2a
RJ014/95 4 CPV-2 3 > 9 dias CPV-2a
RJ892/08 4 ND 3 ND CPV-2a
RJ83/07 6 CPV-2 1 > 9 dias CPV-2b
RJ355/02 6 CPV-2 2 > 9 dias CPV-2a
RJ706/06 6 CPV-2 2 > 9 dias CPV-2b
RJ931/08 6 CPV-2 2 > 9 dias CPV-2b
RJ336/01 6 ND 2 ND CPV-2a
RJ446/04 6 ND 2 ND CPV-2a
RJ901/08 7 CPV-2b 1 ND CPV-2b
RJ422/03 10 CPV-2 3 > 9 dias CPV-2a
*ND- Informação não disponível
Inicialmente, para a caracterização dos novos tipos de CPV nas amostras, as
diferenças nos AA 426 e 555 foram analisadas após PCR e sequenciamento com
o par de iniciadores 555For/555Rev para o gene que codifica para VP2.
As sequências obtidas a partir de amostras de cães vacinados foram
depositadas no GenBank (número de acesso:FJ998133-FJ998169). Quatro
72
vacinas constituídas de duas diferentes cepas de CPV e utilizadas no Brasil foram
também submetidas a amplificação com o par de iniciadores 555For/555Rev e
sequenciadas: Octa-Cino-Vacin®, Biovet (CPV-2); Recombitec®, Merial (CPV-2);
Vanguard®, Pfizer (CPV-2) and Duramune® Max5 FortDodge (CPV-2b) (Tabela 4).
As principais alterações nucleotídicas observadas entre as sequências
parciais de VP2 geradas neste estudo a partir das 37 amostras clínicas, quatro
amostras vacinais e os isolados obtidos no GenBank, estão descritas na Tabela 4.
Tabela 4. Caracterização genômica dos parvovírus caninos detectados nas
37 amostras de cães vacinados e nas quatro amostras de vacinas a partir da
análise da sequência parcial do gene que codifica para a proteína de
capsídeo VP2 .
Sequências de CPV
obtidas do GenBank
Tipo AA 297
nt 3675
AA 300
nt 3685
AA 305
nt 3699
AA 426
nt 4062
AA 555
nt 4449
AA 574
nt 4458
M38245 CPV-2 T (Ser) C (Ala) G (Asp) AAT(Asn) GTA(Val) A
M24000 CPV-2a T (Ser) G (Gly) T (Tyr) AAT(Asn) ATA (Ile) A
DQ340434 CPV-2a G (Ala) G (Gly) T (Tyr) AAT Asn) GTA(Val) A
DQ340409 CPV-2b G (Ala) G (Gly) T (Tyr) GAT(Asp) GTA(Val) A
Ab437433 (Recombinante)
CPV-2/CPV-2a G (Ala) G (Gly) T (Tyr) AAT Asn) GTA(Val) A
Ab437434 (Recombinante)
CPV-2/CPV-2b G (Ala) G (Gly) T (Tyr) GAT(Asp) GTA(Val) A
Octa-Cino-Vacin®,
Biovet CPV-2 NR** NR NR AAT(Asn) GTA(Val) A
Recombitec®,
Merial
CPV-2 NR NR NR AAT(Asn) GTA(Val) A
Vanguard®,
Pfizer
CPV-2 NR NR NR AAT(Asn) GTA(Val) A
Duramune® Max5
FortDodge CPV-2b* G (Ala) G (Gly) T (Tyr) GAT(Asp) GTA(Val) A
Amostras
Tipo detectado
297
nt 3675
300
nt 3685
305
nt 3699
426
nt 4062
555
nt 4449
574
nt 4508
RJ001/95 CPV-2a G (Ala) G (Gly) T (Tyr) AAT (Asn) GTA(Val) G
RJ006/95 CPV-2a G (Ala) G (Gly) T (Tyr) AAT (Asn) GTA(Val) G
RJ014/95 CPV-2a G (Ala) G (Gly) T (Tyr) AAT (Asn) GTA(Val) G
RJ089/96 CPV-2a G (Ala) G (Gly) T (Tyr) AAT (Asn) GTA(Val) G
RJ107/97 CPV-2a G (Ala) G (Gly) T (Tyr) AAT (Asn) GTA(Val) G
RJ159/98 CPV-2a G (Ala) G (Gly) T (Tyr) AAT (Asn) GTA(Val) G
73
RJ209/99 CPV-2a G (Ala) G (Gly) T (Tyr) AAT (Asn) GTA(Val) G
RJ242/00 CPV-2a G (Ala) G (Gly) T (Tyr) AAT (Asn) GTA(Val) G
RJ302/01 CPV-2a G (Ala) G (Gly) T (Tyr) AAT (Asn) GTA(Val) G
RJ304/01 CPV-2a G (Ala) G (Gly) T (Tyr) AAT (Asn) GTA(Val) A
RJ336/01 CPV-2a G (Ala) G (Gly) T (Tyr) AAT (Asn) GTA(Val) A
RJ339/01 CPV-2a G (Ala) G (Gly) T (Tyr) AAT (Asn) GTA(Val) G
RJ349/01 CPV-2a G (Ala) G (Gly) T (Tyr) AAT (Asn) GTA(Val) A
RJ353/01 CPV-2a G (Ala) G (Gly) T (Tyr) AAT (Asn) GTA(Val) A
RJ355/02 CPV-2a G (Ala) G (Gly) T (Tyr) AAT (Asn) GTA(Val) G
RJ371/02 CPV-2a G (Ala) G (Gly) T (Tyr) AAT (Asn) GTA(Val) G
RJ422/03 CPV-2a G (Ala) G (Gly) T (Tyr) AAT (Asn) GTA(Val) G
RJ446/04 CPV-2a G (Ala) G (Gly) T (Tyr) AAT (Asn) GTA(Val) A
RJ688/06 CPV-2b NR NR NR GAT (Asp) GTA(Val) A
RJ705/06 CPV-2b NR NR NR GAT (Asp) GTA(Val) A
RJ706/06 CPV-2b NR NR NR GAT (Asp) GTA(Val) A
RJ735/06 CPV-2b NR NR NR GAT (Asp) GTA(Val) G
RJ741/06 CPV-2a G (Ala) G (Gly) T (Tyr) AAT (Asn) GTA(Val) A
RJ833/07 CPV-2b NR NR NR GAT (Asp) GTA(Val) A
RJ834/07 CPV-2a G (Ala) G (Gly) T (Tyr) AAT (Asn) GTA(Val) G
RJ835/07 CPV-2b NR NR NR GAT (Asp) GTA(Val) A
RJ837/07 CPV-2b NR NR NR GAT (Asp) GTA(Val) A
RJ840/07 CPV-2b NR NR NR GAT (Asp) GTA(Val) A
RJ892/08 CPV-2a G (Ala) G (Gly) T (Tyr) AAT (Asn) GTA(Val) A
RJ901/08 CPV-2b NR NR NR GAT (Asp) GTA(Val) A
RJ905/08 CPV-2a G (Ala) G (Gly) T (Tyr) AAT (Asn) GTA(Val) A
RJ914/08 CPV-2b NR NR NR GAT (Asp) GTA(Val) A
RJ928/08 CPV-2b NR NR NR GAT (Asp) GTA(Val) A
RJ931/08 CPV-2b NR NR NR GAT (Asp) GTA(Val) A
RJ936/08 CPV-2b NR NR NR GAT (Asp) GTA(Val) A
RJ948/09 CPV-2b NR NR NR GAT (Asp) GTA(Val) A
RJ951/09 CPV-2a G (Ala) G (Gly) T (Tyr) AAT (Asn) GTA(Val) G
* Substituição A→G no nucleotídeo 4494 (AA570)
** NR = não realizado
Dos 20 cães que receberam vacina constituída por CPV-2, oito apresentaram
Asp-426 e Val-555 e foram caracterizadas como CPV-2b. Doze amostras
apresentaram Asn-426 e Val-555 e a análise destes dois resíduos não foi
74
suficiente para a caracterização do tipo de CPV na amostra. Para as três amostras
de animais que receberam vacina constituída de CPV-2b, duas foram
caracterizadas como CPV-2a. Para o outro filhote que recebeu vacina constituída
por CPV-2b, a infecção pelo 2b selvagem foi confirmada através da análise do
resíduo 570 (nt 4494), já que o tipo 2b utilizado nesta vacina (Duramune® CPV-2b)
possui uma mutação característica neste AA (nt 4494 A-G) (Figura 12).
Figura 12. Sequências nucleotídicas da amostra caracterizada como
parvovírus canino 2b selvagem (RJ901/08) e amostra CPV-2b vacinal (vacina
Duramune® Max5) Em destaque a mutação pontual no nt 4494, presente na
amostra vacinal.
Para os 14 filhotes cuja informação sobre o tipo da vacina não estava
disponível, cinco foram caracterizados como CPV-2b selvagem pela análise do
resíduo 570 (nt 4494). Nove amostras apresentaram Asn-426 e Val-555 e também
não puderam ser caracterizadas pela análise dos resíduos 426 e 555.
75
Portanto, para 21 amostras (12 de animais vacinados com o tipo CPV-2 e
nove de filhotes sem informação sobre o tipo da vacina) uma segunda região do
genoma da VP2 foi sequenciada a partir dos iniciadores HFor/Hrev. Pela análise
desta região todas as amostras foram caracterizadas como CPV-2a (Tabela 4).
Nas 18 amostras coletadas de 1995 a 2004, somente o tipo CPV-2a foi
detectado. De 2006 a 2009, ambos CPV-2a (5) e CPV-2b (14) foram detectados,
sendo o tipo 2b predominante.
Todas as amostras caracterizadas como CPV-2a em filhotes vacinados
apresentaram uma mutação não sinônima no resíduo 297 (Ser→Ala) e no residuo
555 (Ile→Val) (Tabela 4).
Uma mutação sinônima no nt 5408 (A→G), resíduo 574 também foi
observada em 15/37 amostras (14 CPV-2a e uma CPV-2b) (Tabela 4).
O dendograma das sequências parciais de VP2 em 37 amostras de cães
vacinados, quatro vacinas para CPV e isolados obtido no GenBank demonstrou
que todas as amostras CPV-2b agruparam-se junto com a vacina CPV-2b 25,
outras amostras CPV-2b e CPV-2c da América do Sul. As vacinas constituídas
por CPV-2 26 se mantiveram distantes filogeneticamente das demais amostras
clínicas e protótipos de CPV (Figura 13).
As amostras de CPV-2b e CPV-2c, coletadas após 2006, agruparam
juntamente com variantes recombinantes descritas recentemente em animais
vacinados (CPV-2/CPV-2a e CPV-2/2b) (MOCHIZUCK et al., 2008) (Figura 13).
25 Duramune®Max 26 Vanguard® Octa-cino-vac® e Recombitec®
76
CPV-2C (EF375482)
CPV-2C (FJ349322)
CPV-2C (EU797727)
RJ835/07
RJ706/06
RJ936/08
RJ833/07
RJ840/07
Duramune Max5 FortDodge
CPV-2B (FJ236068)
CPV-2 (M38245)
RJ735/06
RJ837/07
CPV recombinante AB437433
CPV recombinante AB437434
RJ688/06
RJ928/08
RJ901/08
RJ948/09
RJ914/08
RJ931/08
RJ705/06
RJ339/01
CPV-2 (EU659116)
RJ107/97
RJ355/02
RJ446/04
RJ905/08
RJ741/06
RJ001/95
RJ242/00
RJ892/07
RJ834/07
RJ951/09
RJ422/03
CPV-2A (M24000)
RJ336/01
CPV-2A (DQ340434)
RJ014/95
RJ371/02
RJ302/01
RJ353/01
RJ089/06
RJ304/01
RJ159/98
CPV-2A (DQ340408)
RJ349/01
RJ209/99
RJ006/05
Vanguard Pfizer
Octa-Cino-Vacin Biovet
Recombitec Merial
86
65
65
41
64
64
64
3
64
3
64
2
0.005
Figura 13. Dendograma elaborado a partir das análise de um
fragmento (563 pb) do gene que codifica para a proteína de capsideo VP2 de
37 cães vacinados, quatro vacinas para parvovírus canino e amostras
padrão e recombinantes de CPV obtidas no GenBank. A barra na parte
inferior da figura é proporcional à distância genética.
77
6.4 – Caracterização molecular dos parvovírus em amostras de gatos
domésticos no Estado do Rio de Janeiro e comparação com os tipos de
parvovírus encontrados em amostras caninas.
As sequências obtidas a partir das seis amostras fecais de felinos domésticos
(cinco com sinais clínicos de gastrenterite e um assintomático) coletadas em 2004
na cidade do Rio de Janeiro foram comparadas com outras amostras de CPV
obtidas de cães no ano de 2004-2005 e com isolados felinos e caninos obtidos no
GenBank de diferentes países: FPLV EUA (M38246), FPLV Japão (AB000064),
FPLV Argentina (EU018145), FPLV França (AY606131), FPLV Itália (EU498693),
FPLV Alemanha (AY742937), CPV-2 M38245, CPV-2A M24000, CPV-2a
(F306449), CPV-2b (FJ236068), CPV-2c (EU797727).
As sequências foram comparadas também com isolados recombinantes
recentemente descritos em felinos (OHSHIMA; MOCHIZUKI, 2008) (EF988660) e
primatas (FJ231389) (YANG, 2009) (Tabela 5).
As amostras felinas foram caracterizadas FPLV através da análise das
regiões 300, 305, 323, 564 e 568. Entretanto, duas amostras apresentaram
mutações não-sinônimas em resíduos importantes para a caracterização dos tipos
de parvovírus caninos: a amostra felina RJ620/04 apresentou uma substituição de
nt (3909 G→A) que gerou uma mudança na região 375 (Asp→ Asn), semelhante
às amostras de CPV-2; a amostra RJ606/04 apresentou uma substituição de nt
(4062 A→G) que gerou uma mudança na região 426 (Asn→Asp), semelhante ao
tipo CPV-2b.
As quatro amostras caninas foram caracterizadas pela análise dos resíduos
426 e 555 como CPV-2a (1) e CPV-2b (3). Duas amostras caninas apresentaram
uma mutação não-sinônima no resíduo 297 (Ser→Asn). A amostra canina
RJ596/04 apresentou também duas mutações não-sinônimas em AA importantes
para definição do espectro de hospedeiro entre FPLV e CPV: resíduos 564
(Ser→Asn) e 568 (Gly→Ala), normalmente observados nos FPLV.
78
Tabela 5. Diferenças de nucleotídeos e aminoácidos encontradas no
fragmento de 1171 pb do gene que codifica para a proteína de capsídeo VP2
dos parvovírus detectados em seis amostras felinas e quatro amostras
caninas coletadas em 2004-2005.
297 300 305 323 375 426 555 564 568
Número de
Acesso GenBank
nt
3675
T-Ser
A-Asn
3685
C-Ala
G-Gly
3699
G-Asp
T-Tyr
3753
G-Asp
A-Asn
3909
G-Asp
A-Asn
4062-64
AAT-Asn
GAT-Asp
GAA-Glu
4449
G-Val
4477
A-Asn
G-Ser
4489
C-Ala
G-Gly
FPLV M38246 EUA Ser Ala Asp Asp Asp Asn Val Asn Ala
FPLV AB000064 JAP Ser Ala Asp Asp Asp Asn Val Asn Ala
FPLV EU018145 ARG Ser Ala Asp Asp Asp Asn Val Asn Ala
FPLV AY606131 FRA Ser Ala Asp Asp Asp Asn Val Asn Ala
FPLV EU498693 ITA Ser Ala Asp Asp Asp Asn Val Asn Ala
FPLV AY742937 GER Ser Ala Asp Asp Asp Asn Val Asn Ala
FPLV FJ231389 Recombinante Primata
Ser Ala Asp Asn Asp Asn Val Ser Ala
FPLV EF988660 Recombinante Felino
Ser Ala Asp Asp Asp Asn Val Asn Ala
CPV-2 M38245 Ser Ser Asp Asn Asn Asn Val Ser Gly
CPV-2a M24000 Ser Gly Tyr Asn Asp Asn Ile Ser Gly
CPV-2a F306449 Ser Gly Tyr Asn Asp Asn Val Ser Gly
CPV-2b FJ236068 Ser Gly Tyr Asn Asp Asp Val Ser Gly
CPV-2c EU797727 Ser Gly Tyr Asn Asp Glu Val Ser Gly
Amostra
297
300
305
323
375
426
555
564
568
Tipo
RJ606/04 Ser Ala Asp Asp Asp Asp Val Asn Ala FPLV
RJ616/04 Ser Ala Asp Asp Asp Asn Val Asn Ala FPLV
RJ617/04 Ser Ala Asp Asp Asp Asn Val Asn Ala FPLV
RJ618/04 Ser Ala Asp Asp Asp Asn Val Asn Ala FPLV
RJ620/04 Ser Ala Asp Asp Asn Asn Val Asn Ala FPLV
RJ628/04 Ser Ala Asp Asp Asp Asn Val Asn Ala FPLV
RJ446/04 Ser Gly Tyr Asn Asp Asn Val Ser Gly CPV-2a
RJ542/04 Asn Gly Tyr Asn Asp Asp Val Ser Gly CPV-2b
RJ596/04 Asn Gly Tyr Asn Asp Asp Val Asn Ala CPV-2b
RJ630/05 Ser Gly Tyr Asn Asp Asp Val Ser Gly CPV-2b
79
A análise de homologia de nt e AA foi realizada a partir do gene que
codifica para VP2 com as amostras felinas, caninas e isolados felinos e caninos de
outros países obtidos no GenBank. Todas as seis amostras felinas sequenciadas
formaram juntas um grupo distante dos demais isolados felinos de outros países e
dos tipos caninos. As amostras RJC542, que apresentou uma mutação não
sinônima no AA 297 e a RJC596/04 que apresentou três mutações não sinônimas
(AAs 297, 564 e 568), permaneceram distantes das demais amostras e isolados
de CPV e FPLV. O dendograma das sequências parciais de VP2 de felinos é
descrito na Figura 14.
80
RJF616/04
RJF617/04
RJF618/04
RJF620/04
RJF606/04
RJF628/04
FPV EU018145 ARG
FPV M38246
FPV M38246 USA
FPV AB000064 JAP
FPV EU498693 ITA
FPV REC EF988660
FPV AY606131 FRA
FPV AY742937 GER
RJC542/04
RJC596/04
RJc446/04
FPV REC MONKEY FJ231389
RJC630/05
CPV-2c EF599098
CPV-2a M24000
cpv-2 M38245
CPV-2b DQ340409
CPV REC AB437433
CPV REC AB437434
96
88
53
40
80
69
37
63
56
47
83
34
49
64
92
59
49
61
40
32
48
0.002
Figura 14. Dendograma elaborado a partir das análise de um
fragmento (1171 pb) do gene que codifica para a proteína de capsideo VP2
das seis amostras felinas e quatro amostras caninas deste estudo e isolados
felinos e caninos obtidos no GenBank. Em destaque as amostras caninas
que apresentaram mutações em AA importantes na determinação do
espectro de hospedeiro dos parvovírus. A barra na parte inferior da figura é
proporcional à distância genética.
81
7- DISCUSSÃO
Desde que emergiu em 1978 como um novo patógeno de cães, o CPV
apresenta um modelo contínuo de evolução, com o aparecimento e circulação de
novos tipos e variantes na população canina (TRUYEN, 1999; HOELZER;
PARRISH, 2010).
Neste estudo, ao comparar os resultados obtidos na PCR com os pares de
iniciadores P2For/P2Rev e P2abFor/P2abRev com a caracterização dos tipos
através do sequenciamento neste estudo observou-se que a PCR foi capaz de
diferenciar com sucesso os tipos antigo (CPV-2) e novos (CPV-2a, 2b e 2c) do
vírus, o que é importante para a confirmação do diagnóstico da infecção por CPV
em animais que receberam vacinas constituídas pelo tipo antigo. Entretanto,
somente o sequenciamento parcial do gene que codifica para VP2 permitiu a
observação de mutações sinônimas e não-sinônimas, essenciais para
caracterização dos tipos novos e para o estudo filogenético das amostras.
Este é o primeiro estudo de caracterização molecular dos tipos e variantes
de parvovírus em circulação no Estado do Rio de Janeiro por sequenciamento e
através da análise do fragmento do gene que codifica para a proteína VP2, foi
possível detectar os três tipos de CPV (2a, 2b e 2c), além da variante CPV-2a
(555-Val).
Neste trabalho, a caracterização de amostras de CPV coletadas no período
de 1995 a 2009 evidenciou o ressurgimento do tipo 2b na população canina após
82
2004, sua co-circulação com o tipo 2a até 2008 e a descrição do tipo 2c em 2008.
Sabe-se que o tipo 2b foi descrito no período de 1980 a 2000 em co-circulação
com o tipo 2a no Brasil até 1986. Após este período ocorreu uma substituição
gradual do tipo 2b pelo 2a, até que em 1990 o tipo 2b não foi mais detectado
(PEREIRA; LEAL; DURIGON, 2007). (Anexo 2).
Em vários aspectos, a história epidemiológica do CPV no Brasil se
assemelha ao de outros países, evidenciando um processo de substituição de
variantes por outras mais adaptadas e evolução de novos tipos. A razão desta
substituição está relacionada à vantagens replicativas adquiridas por estas
mutações e uma disseminação mais eficiente do vírus no ambiente (PEREIRA;
LEAL; DURIGON, 2007; OHSHIMA et al., 2008).
Os resultados deste trabalho também representam a primeira descrição do
tipo CPV-2c no Estado do Rio de Janeiro. Este tipo foi detectado pela primeira vez
na Argentina em 2003 (CALDERON et al., 2009), Uruguai em 2007 (PÉRES et al.,
2007) e no Rio Grande do Sul no início de 2008 (STRECK et al., 2008). A
proximidade geográfica destas regiões e a observação deste novo tipo no Rio de
Janeiro no final de 2008 evidencia a expansão do CPV-2c pelo país e sua
circulação com os demais novos tipos antigênicos 2a e 2b.
Além das mutações já descritas e utilizadas na caracterização dos tipos,
duas mutações sinônimas foram observadas nas amostras estudadas (resíduos
440 e 574). O resíduo 440 se localiza na região de loop GH da proteína VP2, que
apresenta maior variabilidade entre os parvovírus de carnívoros (BATTILANI et al.,
2002). Estas mutações não foram correlacionadas ao tipo do CPV detectado (2a,
2b ou 2c) e a consequência fenotípica destas mutações ainda não está clara, mas
sua permanência na população canina estudada pode representar uma adaptação
local destas variantes.
Ao realizar a análise de homologia de nt e AA das amostras de cães não
vacinados, o tipo CPV-2c detectado no Rio de Janeiro formou com os demais 2c
da América do Sul um grupo independente, que pode ser explicado pelas poucas
diferenças de nucleotídeos observadas entre esses isolados. Este grupo se inseriu
em um grupo maior de amostras 2b. As mutações pontuais, mesmo as sinônimas
83
(AA 440 e 574), são provavelmente responsáveis pela formação do grupo maior
que agregou as variantes de CPV-2b mais recentes.
A ocorrência de mutações aleatórias, selecionadas pela pressão
imunológica parece ser o principal mecanismo de evolução dos parvovírus
(SHACKELTON et al., 2005; HOELTZER; PARRISH, 2010).
Em um ambiente com alta taxa de mutação e condições termodinâmicas
instáveis, a entidade auto-replicante chega a um máximo de aptidão replicativa.
Esta entidade auto-replicante não é representada por uma única partícula viral
mas por um conjunto de varias partículas virais que irão se destacar de acordo
com as vantagens adaptativas que o seu fenótipo traga em relação ao ambiente
ou com a sua capacidade de produzir progênies (MAS et al., 2010).
A diversidade genética viral que surge a partir destas mutações é
importante para a sobrevivência da população viral como um todo. A presença de
pressões seletivas, como a pressão imunológica favorecem o aparecimento de
mutações com benefícios em seus fenótipos. Esses mutantes são esperados para
sobreviver e agir como os fundadores para a próxima geração (MAS et al., 2010).
Antes da descrição de variantes recombinantes de CPV na natureza,
somente a alta taxa de mutação do genoma DNA e a seleção positiva das
mutações foram os mecanismos associados ao surgimento e evolução da CPV
(SHACKELTON et al., 2005)
Em 2008 foi descrito pela primeira vez a ocorrência de amostras
recombinantes de CPV (CPV-2/2a e CPV-2/2b) provenientes de amostras clinicas
de cães diarréicos que haviam recebido vacinas atenuadas constituídas por CPV-
2 (MOCHIZUKI et al., 2008). Para que ocorra o evento de recombinação é
fundamental que a célula intestinal seja co-infectada pelos tipos selvagens e pelo
tipo vacinal e a administração da vacina provavelmente ocorreu durante o período
de incubação da infecção (MOCHIZUKI et al., 2008) e este é um risco potencial
geral do uso de vacinas atenuadas que não se limita ao CPV.
Com a co-circulação dos novos tipos (2a, 2b e 2c) no Brasil, existe a
discussão se as possíveis mudanças antigênicas decorrentes de mutações
genéticas que levaram ao aparecimento destes tipos poderiam ou não alterar de
forma significativa as propriedades antigênicas dos vírus interferindo na eficácia
84
das vacinas constituídas pelo tipo antigo (CPV-2) (DECARO et al., 2006-a; 2008;
MEERS et al., 2007; PÉRES et al., 2007; LARSON; SCHULTZ, 2008;
CALDERON et al., 2009; SCHULTZ et al., 2010). Além disso, não se sabe se as
vacinas atualmente disponíveis poderiam proteger os cães contra a infecção por
variantes recombinantes, o que torna ainda mais importante o monitoramento
genômico dos tipos de CPV em cães vacinados (MOCHIZUKI et al., 2008).
Os tipos vacinais não foram detectados em nenhuma das amostras
estudadas, mesmo naquelas cinco coletadas de três a nove dias após a
vacinação, período no qual é possível se detectar o vírus vacinal nas fezes por HA
(CARMICHAEL; JOUBERT; POLLOCK, 1981) não evidenciando a ocorrência de
reversão à virulência nos casos de enterite pós vacinação nesse estudo.
Resultados similares foram descritos por DECARO et al. (2006), que
demonstraram a alta estabilidade e baixo risco de reversão à virulência das
vacinas atenuadas atualmente disponíveis.
A mutação no AA 297 (297 Ser→Ala), observada em todas as amostras de
CPV-2a nos cães vacinados vem sido descrita desde 1990 e se tornou
predominante nos tipos 2a e 2b em diferentes países (BATINALLI et al., 2002;
MARTELLA et al., 2005-a), incluindo Brasil (PEREIRA; LEAL; DURIGON, 2007).
Apesar da observação de mutações pontuais ao longo do fragmento
genômico sequenciado, estas alterações aparentemente não afetaram os AA
importantes relacionados à antigenicidade do vírus e não parecem comprometer
a capacidade das vacinas em proteger os filhotes contra os tipos de CPV em
circulação.
Entretanto, a análise de homologia de nt e AA das amostras fecais de cães
vacinados e das vacinas demonstrou que a vacina constituída com o tipo novo do
vírus (CPV-2b) se localizou filogeneticamente mais próxima dos tipos de CPV em
circulação do que as vacinas constituídas pelo tipo antigo do vírus (CPV-2). As
vacinas constituídas pelo CPV tipo antigo são produzidas com cepas isoladas no
início da década de 80, o que explica a distância de homologia de nt e AA
observada.
85
Analisando os dados clínicos dos animais, foi possível observar que a
maioria das amostras (37 amostras ou 54%) foi coletada de filhotes com dois a
quatro meses de idade. Nesta faixa etária, muitos animais ainda não completaram
o protocolo de vacinação sugerido de três doses com intervalos de 21 a 30 dias
(MOORE, 1983; DAVIS-WURZLER, 2006).
Além disso, durante o período de suscetibilidade os anticorpos maternos
adquiridos via colostro nos primeiros dias de vida do filhote são capazes de
bloquear o vírus vacinal mas não são capazes de proteger o cão da infecção pelo
vírus selvagem (MOORE, 1983; DAVIS-WURZLER, 2006). Estes anticorpos
permanecem em circulação no cão até no máximo os quatro meses de vida,
quando decrescem à níveis indetectáveis. Portanto nesta idade (quatro meses) os
casos de “falha vacinal” podem ocorrer a despeito do protocolo de vacinação
adotado pelo clínico (CHAPPUIS, 1998). Por esta razão, os filhotes devem
receber múltiplas doses de vacina para CPV, iniciando com dois meses de idade
e, uma vez que os anticorpos maternos podem persistir até o 4º mês de vida, o
protocolo vacinal não deve ser interrompido antes desta idade (MOORE, 1983;
DAVIS-WURZLER, 2006).
De fato, dos cinco cães que receberam três doses de vacina para CPV,
somente um possuía idade superior a quatro meses no momento da terceira
dose. Uma vez que este cão era um filhote da raça Rottweiller, esta aparente
falha vacinal pode estar relacionada a uma maior suscetibilidade em cães desta
raça, que parecem ser refratários à imunização, apesar da adoção do protocolo
vacinal recomendado (MOORE, 1983; DAVIS-WURZLER, 2006).
Os cães vacinados podem eliminar vírus vacinal nas fezes, acompanhado
ou não de uma variante selvagem (DECARO et al., 2006-a). A maioria dos testes
utilizados rotineiramente no diagnóstico da infecção pelo CPV (HA/HI, EIE e
testes imunocromatográficos) não são capazes de distinguir o tipo vacinal do
selvagem e casos de gastrenterite logo após a vacinação podem ser
diagnosticados erroneamente como infecção pelo CPV (CARMICHAEL;
JOUBERT; POLLOCK, 1980; DECARO et al., 2006-a).
86
Conforme observado, somente o sequenciamento parcial do gene que
codifica para a proteína de capsídeo VP2 permitiu realizar a distinção entre o
CPV-2b selvagem e vacinal (DESARIO et al., 2005, MEERS et al., 2007).
Os casos de infecção por CPV nos animais vacinados neste estudo não
foram relacionados a mutações nos tipos dos vírus em circulação, mas podem ser
atribuídos a um protocolo vacinal incompleto, com a administração da última dose
antes do 4º mês de vida do filhote.
Devido a alta resistência do vírus no ambiente, principalmente em abrigos e
canis (SIELG, 1984) é essencial que os proprietários minimizem a exposição dos
filhotes a locais contaminados, principalmente filhotes da raça Rottweiller
(MOORE,1983; DAVIS-WURZLER,2006), até o término do esquema de vacinação
e a infecção pelo CPV em animais vacinados deve ser continuamente monitorada
a fim de acompanhar o potencial efeito das possíveis mudanças antigênicas
decorrentes de mutações genéticas sobre a eficácia das vacinas.
Embora os FPLV e CPV sejam altamente relacionados a nível genético,
apresentam um padrão de evolução completamente diferente. Enquanto o FPLV,
desde a sua primeira identificação em 1920 não sofreu mudanças significativas
nas propriedades antigênicas e biológicas e evolui mantendo sua especificidade
de hospedeiro, o CPV, desde o seu aparecimento no final de 1970, tem vindo
evoluído progressivamente sob pressão seletiva, dando origem a variantes
antigênicas que substituiram o CPV-2 original e readquiriram a capacidade de se
replicar em felinos (DECARO et al., 2008).
Um estudo anterior realizado com 159 amostras fecais de felinos
domésticos confirmou por HA/HI e PCR, a presença de parvovírus associados a
casos de gastrenterite no Rio de Janeiro em seis amostras fecais de gatos
domésticos (MIRANDA et al., 2006).
Apesar da recente descrição de casos graves de gastrenterite em felinos
domésticos associados ao CPV-2c (DECARO et al., 2010), neste estudo não foi
evidenciada a infecção por CPV em gatos e todas as seis amostras felinas foram
caracterizadas como FPLV.
87
Entetanto em três amostras fecais foram caracterizados tipos de CPV e
FPLV com mudanças em AA importantes inesperadas: duas amostras felinas
apresentaram alterações em regiões importantes para a determinação do espectro
de hospedeiro (375 e 426), observadas somente nos CPV-2 e CPV-2b
respectivamente. Da mesma forma, uma amostra canina coletada em 2004
(RJC596/04) também apresentou duas mutações, nos resíduos 564 e 568,
esperadas somente em amostras de FPLV, e a análise de homologia de nt e AA
mostrou que esta amostra se localizou mais próxima dos isolados felinos que as
demais amostras caninas.
Como o FPLV e CPV circulam na população canina e felina no Rio de
Janeiro (MIRANDA, 2006; CASTRO et al., 2007; SILVA, 2010), uma das
explicações para o aparecimento destas mutações é a ocorrência de
recombinação entre os parvovírus.
O surgimento de variantes recombinantes de CPV em amostras selvagens
foi observado pela primeira vez em 2008 por Mochizuki et al. em cães vacinados
com CPV-2 e os tipos detectados foram caracterizados como recombinantes CPV-
2/2a e CPV-2/2b.
Posteriormente foi descrito a partir de uma amostra diarréica de um felino
doméstico, o primeiro recombinante FPLV/CPV constituído por uma combinação
do gene que codifica para NS1/NS2 do CPV-2b e do gene que codifica para VP2
do FPLV (OSHIMA; MOCHIZUKI, 2008).
Em 2009, foi um parvovírus felino recombinante (FPLV) foi associado a um
surto de enterite hemorrágica em primatas jovens e as mutações observadas em
AA importantes para determinação de espectro de hospedeiro nestes isolados
provavelmente permitiram que esta variante recombinante cruzasse a barreira
inter-espécie causando surto de doença grave em primatas (YANG et al., 2009).
A frequência com que foram observadas mutações nas amostras felinas
deste estudo (2/6) reforçam a idéia de que os FPLV da mesma forma que os CPV
também estão sujeitos a importantes eventos evolutivos.
88
A importância dessas mutações deve ser evidenciada através de futuras
análises moleculares de outras regiões do genoma, assim como pelo estudo de
infectividade destes vírus em cultivo celular de origem canina e felina.
Portanto, o contínuo monitoramento e caracterização molecular das
amostras de CPV e FPLV são necessários não somente para a identificação de
possíveis mudanças genéticas e antigênicas que possam interferir na eficácia das
vacinas, mas também para trazer uma melhor compreensão sobre os mecanismos
que impulsionam a evolução dos parvovírus no Brasil.
89
8-CONCLUSÕES
A infecção pelo CPV foi confirmada pelas técnicas de HA/HI e PCR em 43%
(43/100) das amostras fecais diarreicas analisadas entre 2008-2009.
Pela PCR foi possível diferenciar os tipos antigo (CPV-2) e novos (CPV-2a, 2b
e 2c), porém somente o sequenciamento parcial do gene que codifica para a
proteína VP2 permitiu a caracterização dos novos tipos de CPV e a detecção
de mutações sinônimas e não-sinônimas nas amostras.
Foi evidenciada a co-circulação dos tipos 2a e 2b e descrito pela primeira vez
o tipo CPV-2c na população canina do Estado do Rio de Janeiro.
As mutações observadas nos parvovírus (CPV) detectados nas amostras
fecais de cães vacinados não afetaram os AA relacionados à antigenicidade
do vírus e não comprometeram a capacidade global das vacinas em proteger
os filhotes contra os tipos em circulação.
Todas as amostras fecais de gatos domésticos deste estudo foram
caracterizadas como FPLV.
Duas amostras caracterizadas como FPLV e uma amostra canina coletadas no
mesmo período das felinas (2004) apresentaram mutações não-sinônimas em
resíduos importantes para a determinação do espectro de hospedeiro.
90
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104
10- APÊNDICES
105
APÊNDICE 1 - Ficha de identificação do animal UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE INSTITUTO BIOMÉDICO DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
PROTOCOLO DE PARVOVIROSE CANINA
Registro Data de coleta
/ /
1 – CLÍNICA Nome: ______________________________________ Local: ______________________ 2 – PROPRIETÁRIO DO ANIMAL Nome: __________________________________________________________________ Endereço: _________________________________________ Bairro: ______________ Cidade: _______________________ Estado: _____ Telefone: ___________________ 3 – ANIMAL Nome: _________________ Idade (meses): ______ Sexo: ____ Raça_____________ Moradia: ( ) casa ( )apto Finalidade do cão: ( ) guarda ( ) companhia ( ) outros Local predominante de passeio do cão: ( )rua ( )praia ( )praça ( )outros ( )Não passeia 4– VACINAÇÃO
Nome da vacina Data Nome da vacina Data
/ / / /
/ / / /
/ / / /
/ / / /
5– SINAIS CLÍNICOS
OCORRÊNCIA EM DIAS: TEMPERATURA: OC
VÔMITO ANOREXIA APATIA ( ) sim ( ) não ( ) sim ( ) não ( ) sim ( ) não
DIARRÉIA CONSISTÊNCIA DAS FEZES ( ) Ausente ( ) Hemorrágica ( ) Outra ( ) Líquida ( ) Pastosa
6– RESULTADO
Data: / / ( ) negativo ( ) positivo Título de HA:
7 – OBSERVAÇÕES
106
APÊNDICE 2 – Tabela de aminoácidos
Aminoácido abreviação
Valina Val
Leucina Leu
Triptofano Trp
Prolina Pro
Isoleocina Leu
Metionina Met
Fenilalanina Fen
Alanina Ala
Treonina Ter
Glicina Gli
Asparagina Asn
Glutamina Gln
Cisteína Cis
Serina Ser
Tirosina Tir
Arginina Arg
Histidina His
Lisina Lis
Ácido Glutâmico Glu
Ácido Aspártico Asp
107
APÊNDICE 3 – Aprovação do COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ANIMAL
(PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO)
108
11- ANEXOS
109
ANEXO 1- Número de acesso do GenBank das amostras de parvovírus
canino (CPV) e felino (FPLV) caracterizadas nesse estudo.
Amostra Acesso
GenBank
RJ001/95 (FJ998133)
RJ004/95 (FJ977046)
RJ006/95 (FJ998134)
RJ014/95 (FJ998135)
RJ083/96 (FJ977047)
RJ089/96 (FJ998136)
RJ107/97 (FJ998137)
RJ126/97 (FJ977048)
RJ129/97 (FJ977049)
RJ159/98 (FJ998138)
RJ164/98 (FJ977050)
RJ167/98 (FJ977051)
RJ183/99 (FJ977052)
RJ209/99 (FJ998139)
RJ223/99 (FJ977053)
RJ242/00 (FJ998140)
RJ251/00 (FJ977054)
RJ302/01 (FJ998141)
RJ304/01 (FJ998142)
RJ305/01 (FJ977055)
RJ336/01 (FJ998143)
RJ339/01 (FJ998144)
RJ349/01 (FJ998145)
RJ353/01 (FJ998146)
RJ355/02 (FJ998147)
RJ369/02 (FJ977056)
RJ371/02 (FJ998148)
RJ422/03 (FJ998149)
RJ426/03 (FJ977057)
RJ446/04 (FJ998150)
RJ542/04 (FJ977058)
Amostra Acesso
GenBank
RJ596/04 (FJ977059)
RJ606/04 (DQ658146, GQ415003)
RJ616/04 (DQ658147, GQ415004)
RJ617/04 (DQ658151, GQ415008)
RJ618/04 (DQ658148, GQ415005)
RJ620/04 (DQ658149, GQ415006)
RJ628/04 (DQ658150, GQ415007)
RJ630/05 (FJ977060)
RJ688/06 (FJ998151)
RJ705/06 (FJ998152)
RJ706/06 (FJ998153)
RJ708/06 (FJ977061)
RJ735/06 (FJ998154)
RJ736/06 (FJ977062)
RJ738/06 (FJ977063)
RJ741/06 (FJ998155)
RJ803/06 (FJ977064)
RJ814/06 (FJ977065)
RJ815/07 (FJ977066)
RJ818/07 (FJ977067)
RJ825/07 (FJ977068)
RJ833/07 (FJ998156)
RJ834/07 (FJ998157)
RJ835/07 (FJ998158)
RJ837/07 (FJ998159)
RJ840/07 (FJ998160)
RJ868/08 (FJ977069)
Amostra Acesso
GenBank
RJ892/07 (FJ998161)
RJ893/08 (FJ977070)
RJ898/08 (FJ977071)
RJ901/08 (FJ998162)
RJ905/08 (FJ998163)
RJ913/08 (FJ977072)
RJ914/08 (FJ998164)
RJ925/08 (FJ977073)
RJ926/08 (FJ977074)
RJ928/08 (FJ998165)
RJ931/08 (FJ998166)
RJ933/08 (FJ977075)
RJ934/08 (FJ977076)
RJ936/08 (FJ998167)
RJ944/09 (FJ977077)
RJ948/09 (FJ998168)
RJ951/09 (FJ998169)
110
ANEXO 2- Distribuição cronológica dos tipos de CPV no Brasil de 1980 a 2009. A tabela foi formulada tendo como
base o estudo atual e estudos anteriores (PEREIRA et al., 2007; STRECK et al., 2009). A linha contínua indica
predominância do tipo. A linha tracejada indica uma menor circulação do tipo.
Período estudado em anos
Tipo de
CPV
19
8
0
19
8
1 19
8
2 19
8
3 19
8
4 19
8
5 19
8
6 19
8
7 19
8
8 19
8
9 19
9
0 19
9
1 19
9
2 19
9
3 19
9
4 19
9
5 19
9
6 19
9
7 19
9
8 19
9
9 20
0
0 20
0
1 20
0
2 20
0
3 20
0
4 20
0
5 20
0
6 20
0
7 20
0
8 20
0
9 CPV- 2
CPV-2a
CPV-2a
Val-555 CPV-2b
CPV-2c
?
111
ANEXO 3 - Carta de aceite e trabalho: “Partial VP2 sequencing of canine
parvovirus (CPV) strains circulating in the State of Rio de Janeiro, Brazil:
detection of the new variant CPV-2c”.
[BJM] Editorial Review of Article - Accept
Quinta-feira, 4 de Fevereiro de 2010 9:52
De:
"Silvio Arruda Vasconcellos" <[email protected]>
Para:
"Tatiana Xavier de Castro" [email protected]
Tatiana:
We have now completed the review of your submission "BJM-1001 – PARTIAL VP2
SEQUENCING OF CANINE PARVOVIRUS (CPV) STRAINS CIRCULATING IN THE
STATE OF RIO DE JANEIRO: DETECTION OF THE NEW VARIANT CPV-2c."
Our decision is to accept.
Additional comments on the paper, based on the editorial and peer review, are found by
logging in to the journal web site:
Submission URL:
http://submission.scielo.br/index.php/bjm/author/submission/20989
Brazilian Journal of Microbiology
?
112
113
114
115
116
117
118
ANEXO 4 - Carta de aceite e trabalho submetido para publicação no
periódico Research in Veterinary Science: “Monitoring of canine parvovirus
(CPV) strains detected in vaccinated puppies in Brazil”.
RVSC-09-544R1 Decision
Sexta-feira, 4 de Junho de 2010 6:59
De: "Research in Veterinary Science" [email protected] Para: [email protected]
Research in Veterinary Science
Ms. No. RVSC-09-544R1, "MONITORING OF CANINE PARVOVIRUS (CPV)
STRAINS DETECTED IN VACCINATED PUPPIES IN BRAZIL"
Dear Ms Castro,
I am pleased to be able to inform you that your manuscript
has been accepted as Research Paper for publication in
Research in Veterinary Science.
The manuscript will be transferred to our Production
Department. Proofs will be sent to you in due course.
With kind regards,
Carmel Mathew Maria Jude
Journal Manager
Research in Veterinary Science
119
120
121
122
123
ANEXO 6- Carta de submissão do trabalho “First Characterization of
124
ANEXO 5- Carta de submissão e artigo científico “First characterization of
parvovirus strains from domestic cats in Brazil.” para publicação no
periódico Journal of Veterinary Diagnostic Investigation.
Journal of Veterinary Diagnostic Investigation - Manuscript ID 10-0214
Segunda-feira, 7 de Junho de 2010 17:35
De: "[email protected]" <[email protected]> Para: [email protected]
07-Jun-2010
Dear Mrs. Castro:
Your manuscript entitled "FIRST CHARACTERIZATION OF
PARVOVIRUS STRAINS FROM DOMESTIC CATS IN BRAZIL" has been
successfully submitted online and is presently being given
full consideration for publication in the Journal of
Veterinary Diagnostic Investigation in chronological order.
Your manuscript number is 10-0214.
Please mention the above manuscript number in all future
correspondence or when contacting the Editorial Office for
questions. If there are any changes in your street address or
e-mail address, please log in to Manuscript Central at
http://mc.manuscriptcentral.com/jvdi and edit your user
information as appropriate.
You can also view the status of your manuscript at any time
by checking your Author Center after logging in to
http://mc.manuscriptcentral.com/jvdi.
Thank you for submitting your manuscript to the Journal of
Veterinary Diagnostic Investigation.
Sincerely,
Journal of Veterinary Diagnostic Investigation Editorial
Office
125
“First Characterization of parvovirus strains from domestic cats in Brazil.”
Rita de Cássia Nasser Cubel Garcia1*;
* Corresponding Author
E-mail address: [email protected]
Running Title: Parvovirus from cats in Brazil
Suzana Carvalho de Miranda1;
Tatiana Xavier de Castro1;
Gláucio Lopes Júnior1;
Norma Vollmer Labarthe3
;
José Paulo Gagliardi Leite2
1 Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Instituto Biomédico, Universidade
Federal Fluminense, Rua Prof. Ernani Pires de Melo, 101 24210-130 – Niterói, Rio de
Janeiro, Brazil. Tel 55 21 2629-2432 2
Programa de Biodiversidade e Saúde and
3Laboratorio de Virologia Comparada e Ambiental, IOC, Fundação Oswaldo Cruz. Av
Brasil, 4365 - 21040-360, Manguinhos, Rio de Janeiro, Brazil.
ABSTRACT
The aim of this study was to characterize parvovirus strains from domestic cats in
Brazil. Fifty-one kittens fecal samples were initaially submitted to hemagglutination/
hemagglutination-inhibiton (HA/HI) tests. The parvovirus strains detected in 6/51 samples
were then tested by HA in a range of different pH conditions and temperature, submitted to
126
a PCR genotyping by using four sets of primers, and to partial sequencing of capsid protein
VP1/VP2 gene. In addition, the phylogeny carried on a fragment of VP2 protein gene was
analyzed. The pH dependence of HA was observed in only one sample and for all the six
samples the HA titers remained constant at 4oC and 37
oC. A PCR typing approach was
unable to distinguish FPLV from CPV as four samples were amplified by all set of primers,
including those considered specific for the new types of CPV. Six samples were confirmed
as FPLV strains by sequencing but two samples showed amino acid changes in residues
which have been described in CPV strains. An additional 11 synonymous and six non
synonymous substitutions were also detected in brazilian FPLV strains. Phylogenetic
analysis based on nucleotide sequences showed that Brazilian feline samples form a cluster
distinct from the other FPLV or CPV isolates in other countries. The detection of
anomalous FPLV strains might indicate a direction in which evolution is leading FPLV.
Our findings also reinforce that only sequence analyses give ample information for FPLV
characterization.
KEYWORDS
Brazil; Characterization; Feline Parvovirus, Phylogenetic analysis.
INTRODUCTION
Feline panleukopenia virus (FPLV) and canine parvovirus (CPV) are responsible for a
highly contagious gastro enteric disease mainly in puppies and kittens. FPLV-induced
disease in cats has been known since before 1920’s. CPV, a host-range variant of FPLV,
emerged as a new virus of dogs in the late 1970’s. Soon after the appearance, the original
127
CPV-2, was subsequently replaced by new variants, termed CPV-2a and CPV-2b. In the
early 2000’s a novel CPV mutant (CPV-2c) emerged in Italy 2,18
.
FPLV and CPV are more than 98% identical in nucleotide and amino acid
sequences18
. There are six amino acid changes between FPLV and CPV in the open read
framing encoding structural proteins (residues 80, 93, 103, 323, 564 and 568) 6, 12
. Another
five or six amino acid changes differ the new variants CPV2a/2b/2c (residues 87, 300,305,
426 and 555) from the original CPV-2 18
.
FPLV and CPV isolates may also differ in the pH and temperature dependence of the
hemagglutination (HA). FPLV-like isolates hemagglutinate only in buffers with pHs below
6.8 while CPV isolates hemagglutinate at all pH value between 6,0 and 8,0. CPV isolates
are also able to HA at 4oC or 37
oC
6, 18, 23.
Although the original CPV had lost the ability to replicate in feline cells, several
reports have demonstrated that these new CPV variants have gained the ability to infect,
replicate and cause disease in domestic cats with clinical signs similar to feline
panleukopenia 1,10, 16, 30
.
Natural infections of domestic and wild felines with CPV like viruses have been
described 10, 13, 16, 26
, but FPLV has remained the more prevalent parvovirus casing disease
in cats 11
.
Despite of widespread vaccination, CPV is responsible for approximately 46% of
the enteritis cases among young dogs in the state of Rio de Janeiro, Brazil 4,8
. Data
regarding parvovirus infection in feline population has not been reported in Brazil yet. The
purpose of this study was to perform the characterization of parvovirus strains from
domestic cats.
128
MATERIALS AND METHODS
A total of 51 fecal samples from unvaccinated domestic cats up to one year old (46
diarrheic and five asymptomatic) were collected at Rio de Janeiro city during 2004-2005.
The samples were screened for the presence of parvovirus by hemagglutination (HA) test
using borate-buffered saline (BBS) and “virus-adjusting-diluent” pH6.0 as diluents for
antigen and swine erythrocytes respectively. The positive samples were also tested by HA
at different pHs (6.0 and 7,4) with incubation at 4oC and 37
oC
23.
For genome detection, viral DNA was extracted from 10% fecal suspensions in Tris-
Ca2+
using a combination of phenol/chloroform/isoamyl-alcohol (Invitrogen®) and
silica/guanidin thyocianate 7.
A PCR genotyping approach based on four sets of primers was used. Initially, the
primer set VPF/VPR (2285-4530), which amplifies FPLV as also the old and new types of
CPV was used for the first amplification 15
. The amplicon was submitted to a nested-PCR
assay using a differential set of primers in order to distinguish FPLV from the old and new
types of CPV: FMF/FMR (3113-3810), P2 (3025-3706) and P2ab (3025-3706) 16,24
. While
the primer set FMF/FMR was used for identifying FPLV, the primer set P2 was used for
CPV-2 and primer set P2ab was used for both CPV-2a and CPV-2b.
For sequencing analysis, two regions of VP1/VP2 protein gene were amplified using three
different sets of primers: M1 (2949-2960) & M2 (3128-3150), M13 (3629-3658) & M14
(4082-4111)26
and 555F (4003-4022) & 555R (4585-4561)2. The PCR products were then
purified using the QIAQuick® PCR purification kit (QIAGENTM
, Valencia, CA, USA) and
subjected to direct sequencing in both directions by using BigDye terminator® v1.1 Cycle
Sequencing kit (Applied Biosystems, CA, USA)17
.
129
A partial consensus sequence of VP2, obtained by the assembling of the nucleotide
sequences of different amplicons was aligned and analyzed by BioEdit Sequence
Alignment Editor 7.0.1 ( bioedit.html). For comparison, sequences of FPLV and CPV
strains were selected from GenBank as listed in Table 1.
The unrooted phylogenetic tree was generated from a 1170 bp fragment of the VP2
gene according to Neighbor-Joining method and subjected to 2000 bootstrap samplings.
The nucleotide sequences generated in this study have been deposited in GenBank
under accession numbers: RJF606/04 (DQ507872, DQ658146, GQ415003), RJF616/04
(DQ507873, DQ658147, GQ415004), RJF617 (DQ507874, DQ658148, GQ415008)
RJF618/04 (DQ507875, DQ658148, GQ415005), RJF620/04 (DQ507876, DQ658149,
GQ415006), RJF628/04 (DQ507877, DQ658150, GQ415007).
RESULTS
Six feline fecal samples (from a total of 51) initially screened by HA were
confirmed as positive by HI test. These positive samples were tested by HA at different pHs
and temperatures. The pH dependence of HA was observed in only one sample, BRF618,
which HA titer decreased 32-fold at pH 7.4 than at pH 6.0.
In order to identify and differentiate the parvovirus strains detected in fecal samples, a
PCR genotyping approach was used. All samples examined were amplified with the
primers set FMF/FMR. While two feline samples (RJF617/04 and RJF628/04) were
amplified with the primers set VPF/VPR and P2, other four samples (RJF606/04,
RJF616/04, RJF618/04 and RJF620/04) were also amplified with the primers set P2ab
which are specifically for detection of the new types of CPV.
130
Sequencing analysys showed that most amino acids residues which allow
differentiation between feline and canine parvovirus were conserved including 80-Val, 93-
Lys, 103-Val, 323-Asp, 564-Asn and 568-Ala. All these samples were characterized as
FPLV. In addition, only one sample (RJF616/94) had an amino acid change on residue 93
(LysAsn) as described in CPV strains (Table 1).
Considering the nucleotide changes observed in the sequence, two non synonymous
substitutions were found in all FPLV isolates: residues 91 (Ala→Ser) and 101 (Ile→Thr).
Other two synonymous substitutions at residues 363 (A→G) and 368 (A→G) were also
observed. An additional 11 synonymous substitutions and seven non synonymous
substitutions were also detected. One sample (RJF620/04) displayed the amino acid change
AspAsn at residue 375, which has been considered typical of CPV strains (Table 1).
The phylogenetic tree based on nucleotide sequence showed that Brazilian feline
samples form a cluster distinct from the other FPLV or CPV isolates (Figure 1).
DISCUSSION
This is the first study on sequence analysis of FPLV strains in Brazil. Since its first
identification in 1920, FPLV has not undergone significant changes in its antigenic and
biological properties 25
. It is known that FPLV strains display a pH and temperature
dependence of the hemagglutination (HA) which allows its distinction from CPV isolates
3,22,23,28. However, in this study we used more recent isolates of FPLV and the pH-
dependence and requirement for low temperature of FPLV HA, as reported by other
authors, were not observed.
These results suggest that differences in HA pattern should not be used as a single
parameter to characterize FPLV strains. Likewise, a PCR typing approach was also unable
131
to distinguish FPLV from CPV. Four samples showed amplification with all set of primers
including those considered specific for detection of the new types of CPV.
To confirm the genomic identity of these FPLV isolates from cats, we performed the
sequencing of two regions of the VP2 genome involved in controlling canine and feline
host range (residues 93 and 323) as also the pH difference of HA (residues 323 and 375)
12,18,20.
Non-synonymous substitutions detected in residues 91 (Ala →Ser) and 101 (Ile→Thr)
were also reported in FPLV isolates after 2006 from Italy and Argentina 9. This change in
AA 101 is also present in the new CPV variants 5,11,14
. The exact phenotypic consequence
of these mutations is not clear yet, and it may represent a host-adaptation of FPLV strains.
Although CPV infection in puppies is widespread in Brazil 4,21,27
, the sequences
analyzed in this study showed no evidence of CPV infection in kittens. Nevertheless,
changes at residues 93, 101 and 375 could be observed and it is well known that these AA
changes affect parvovirus host range and hemagglutination 19,29,30
.
The phylogenetic analysis using reference strains of both FPLV and CPV showed
that all Brazilian strains form a distinct cluster which may reflect their geographic origin.
This study demonstrate that although FPLV showed a certain degree of genetic
stability1, the detection of anomalous strains with mutations at residues that affect
parvovirus host range might indicate a direction in which evolution is leading FPLV. Our
findings also reinforce that only sequence analyses give ample information for FPLV
characterization. The continued epidemiological surveillance of the distribution of these
parvoviruses is may provide new insights into the mechanisms that drive FPLV evolution
in Brazil.
132
ACKNOWLEDGMENTS
This study was supported by the “Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico” (CNPq), by the “Universidade Federal Fluminense- Pró-Reitoria
de Pesquisa e Pós-Graduação” (UFF-PROPP), by the “Fundação de Amparo à Pesquisa
Carlos Chagas Filho” (Faperj), and “Instituto Oswaldo Cruz - Fundação Oswaldo Cruz”
(IOC-FIOCRUZ). Suzana C. Miranda and Tatiana X. Castro were fellowship recipients of
“Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior” (CAPES). We also thank
Dr. Marcelo de Lima for the critical revision and helpful discussion of the manuscript.
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30. Truyen U; Evermann J; Vieler E; Parrish C: 1996, Evolution of canine parvovirus
involved loss and gain of feline host range. Virology 215:186-189.
136
Amostra Nt 2981 3032 3057 3065 3087 3679 3705 3782 3787 3827 3836 3837 3875 3878 3890 3909 3968
AA 65 82 91 93 101 298 307 332 334 347 350 351 363 364 368 375 395
FPLV-b
M38246 (USA,
1967)
TCA
Ser
GTA
Val
GCA
Ala
AAA
Lys
ATT
Ile
GAA
Glu
GGA
Gly
AGA
Arg
GCT
Ala
GCG
Ala
CAA
Gln
GGG
Gly
GGA
Gly
GCG
Ala
GAA
Glu
GAT
Asp
ACA
Thr
FPLV
AB000070
(JAP, 1996)
─ ─ ─ ─ ACT
Thr
─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─
FPLV
AY606131
(FRA,2004)
─ ─ ─ ─ ACT
Thr
─ ─ ─ ─ GCA
Ala
─ ─ ─ ─ ─ ─ ─
FPLV
AY742937
(GER, 2005)
─ ─ ─ ─ ACT
Thr
─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ GCA
Ala
─ ─ ─
FPLV
EU018145
(ARG, 2008)
─ ─ TCA
Ser
─ ACT
Thr
─ ─ ─ ─ GCA
Ala
─ ─ ─ ─ ─ ─ ─
FPLV
EU498693
(ITA, 2008)
─ ─ ─ ─ ACT
Thr
─ ─ ─ ─ GCA
Ala
─ ─ ─ ─ ─ ─ ─
RJF606/04 TCC
Ser
─ TCA
Ser
─ ACT
Thr
─ ─ AGC Ser ─ ─ ─ ─ GGG
Gly
GCA
Ala
GAG
Glu
─ ─
RJF616/04 ─ GTG
Val
TCA
Ser
AAC
Asn
ACT
Thr
─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ GGG
Gly
GCA
Ala
GAG
Glu
─ ─
RJF617/04 ─ ─ TCA
Ser
─ ACT
Thr
─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ GGG
Gly
GCA
Ala
GAG
Glu
─ ─
RJF618/04 ─ ─ TCA
Ser
─ ACT
Thr
GCA
Ala
AGA
Arg
─ GAT
Asp
─ ─ CCG
Pro
GGG
Gly
GCA
Ala
GAG
Glu
─ ACC
Thr
RJF620/04 ─ ─ TCA
Ser
─ ACT
Thr
─ ─ AGG
Arg
─ GCT
Ala
CAG
Gln
─ GGG
Gly
GCA
Ala
GAG
Glu
AAT
Asn
─
RJF628/04 ─ ─ TCA
Ser
─ ACT
Thr
─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ GGG
Gly
─ GAG
Glu
─ ─
Table 1: Synonymus and non- synonymus substitution detected in the partial VP2 sequences of FPLV strains generated in this study and other sequences
obtained from the GenBank database. Accession numbers of reference strains are showed. ( ─ ) indicate identical nucleotide and amino acid.
1
RJ606
RJ628
RJ616
RJ617
RJ618
RJ620
FPV EU018145 ARG
FPV M38246 USA
FPV AB000064 JAP
FPV AY606131 FRA
FPV EU498693 ITA
FPV AY742937 GER
CPV-2a M24000
CPV-2c EF599098
CPV-2 M38245
CPV-2b DQ340409
96
75
51
45
92
66
63
53
52
99
63
73
0.002
Figure 1: Phylogenetic tree constructed from a 1170 bp fragment of the VP2 gene nucleotide sequence of the
Brazilian FPLV strains generated in this study and other sequences obtained from the GenBank database.
Accession numbers of reference strains are indicated. Principal bootstrap values are shown.