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LISIANE DE SANTANA SOUZA

PADRONIZAÇÃO DE TESTES PARA AVALIAÇÃO DO ESTADO DE MANIA

E POTENCIAL ANTI-MANÍACO DE UM AGONISTA DO RECEPTOR NOP

Dissertação apresentada à Universidade

Federal do Rio Grande do Norte, para

obtenção do título de Mestre em

Psicobiologia.

Natal

2015

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LISIANE DE SANTANA SOUZA



Dissertação apresentada à Universidade

Federal do Rio Grande do Norte, para

obtenção do título de Mestre em

Psicobiologia.

Orientador: Prof.ª Dr.ª Elaine C. Gavioli

Natal

2015

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Lisiane de Santana Souza

Data da Defesa: ____/____/____

Banca Examinadora:

___________________________________

Prof.ª Dr.ª Alianda Maira Cornélio da Silva

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN

___________________________________

Prof.ª Dr.ª Elaine Cristina Gavioli

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN

___________________________________

Prof. Dr. Pablo Pandolfo

Universidade Federal Fluminense, RJ

5

O que prevemos raramente ocorre; o

que menos esperamos geralmente

acontece.

(Benjamin Disraeli)

Porém,

Eu sou brasileira e não desisto nunca!

(Autor desconhecido)

6

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, minha fonte de força desde sempre, especialmente

quando tudo deu errado e eu não consegui passar na primeira seleção do mestrado,

assim como no período em que, pra variar, os experimentos demoraram a funcionar.

À minha orientadora, Elaine Gavioli, por todo o conhecimento repassado,

além de ajuda, conselhos, carinho e paciência, assim como por nunca ter se negado a

ouvir minhas lamúrias e indecisões sobre o que fazer da vida. Serei eternamente grata,

principalmente pelo suporte dado no período em que não pude estar presente no

laboratório. “Xô uruca” pra nós!

À minha família, por todo o amor dado, pelos muitos sacrifícios que fizeram

por mim, e por sempre terem me dado liberdade pra ir de encontro ao que me fizesse

mais feliz, embora, muitas vezes, não entendam os caminhos que eu prefiro trilhar

(mamãe que o diga!).

Aos colegas de laboratório, pela ajuda, risadas, apoio, piadas, semanas de

limpeza do biotério e falhas de experimentos compartilhadas durante os últimos 5 anos.

Cada um de vocês tem algo que agrega vida ao laboratório. Aos que tomaram outro

rumo: Manara e as reclamações de que seus experimentos supostamente não

funcionam; Luana e suas doidices que nos fazem falta; e Maíra, que virou minha

companheira de viagens ao Rio e águas de coco em Copacabana: “É nóis na Tijuca!”.

Aos que permanecem: Laila, a “matutina extrema” que me fazia acordar mais cedo que

o usual; Iris e seu jeito fashion e alegre; Julia, detentora de cadeira cativa no Thomas;

Victor e as suas fontes quentíssimas; Décio e Adriana, os melhores organizadores de

festas do laboratório; Nataly, que me assumiu como dupla da semana da limpeza; e

Epifanio, também conhecido como “Antonio Pãozinho”, que sabota minha dieta todos

os dias. Você subiu de nível, mas será sempre meu aluno de IC, e todo mundo na feira

sabe: Gláucia, D. Ana, Ana Rita... Aos demais, que não citei, mas que com certeza tem

um lugarzinho reservado aqui dentro: muito obrigada!

Aos amigos que o mestrado me deu: Ariela, Lu Rocha e Jaqueiuto, vulgo

“galerinha do mal”, amo vocês! O mestrado também não teria sido o mesmo sem a

presença das ladies: Ceci, Lu Varella, Mari e May. Eu tenho fé que um dia a gente

consegue reunir todas pro nosso chá! Aos demais colegas do PPG Psicobiologia, mais

próximos ou um pouco mais distantes, obrigada por terem feito esses últimos 2 anos

serem mais felizes.

Às minhas “amigas lindas”, as cajazeiras: Aldi, Anassely, Ju, Candy, também

agradeço a vocês o suporte e amizade que vocês me dão desde a graduação. Somos cada

uma diferente das outras, mas juntas, nos completamos!

Aos professores do PPG Psicobiologia, que me repassaram conhecimentos

valiosos durante esta jornada.

7

Aos professores Pablo e Alianda, por aceitarem fazer parte da banca de

avaliação deste trabalho.

À CAPES e ao CNPq, pelo apoio financeiro imprescindível para a

viabilização deste projeto.

Aos demais que não foram citados, mas que tiveram participação na realização

deste trabalho (ou na manutenção da minha sanidade mental), muito obrigada!

8

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 17

1.1 Transtorno bipolar ............................................................................................. 17

1.2 Tratamento do Transtorno Bipolar .................................................................. 19

1.3 Sistema da Nociceptina/Orfanina FQ – Receptor NOP .................................. 21

1.4 Sistema da Nociceptina/Orfanina FQ – Receptor NOP e transtornos

afetivos ....................................................................................................................... 24

1.5 Modelos Animais de Mania ................................................................................ 26

METODOLOGIA ......................................................................................................... 31

2.1 Animais ................................................................................................................ 31

2.2 Drogas e tratamentos .......................................................................................... 31

2.3 Cirurgia para a implantação da cânula intracerebroventricular em

camundongos ............................................................................................................. 32

2.4 Testes comportamentais ..................................................................................... 34

2.4.1 Campo aberto ................................................................................................. 34

2.4.2 Hole board...................................................................................................... 34

2.5 Desenho experimental ......................................................................................... 35

2.5.1.Etapa I – Indução de um estado similar ao de mania induzido pela

administração de ouabaína em camundongos ........................................................ 35

2.5.2 Etapa II – Padronização do hole board como um modelo para se avaliar a

mania ....................................................................................................................... 36

2.5.3 Etapa III – Avaliação dos efeitos comportamentais de um agonista do

receptor NOP em camundongos submetidos ao modelo animal de mania induzido

por metilfenidato no hole board .............................................................................. 37

9

2.6 Análise estatística ................................................................................................ 38

RESULTADOS ............................................................................................................. 39

3.1 Etapa I – Indução de um estado similar ao de mania promovido pela

administração de ouabaína em camundongos ........................................................ 39

3.2 Etapa II – Padronização do hole board como um teste para se avaliar a

mania .......................................................................................................................... 40

3.3 Etapa III – Avaliação dos efeitos comportamentais de um agonista do

receptor NOP em camundongos submetidos ao modelo animal de mania

induzido por metilfenidato no hole board .............................................................. 49

DISCUSSÃO ................................................................................................................. 56

CONCLUSÕES ............................................................................................................. 64

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 65

10

RESUMO

O transtorno bipolar é caracterizado pela disfunção do humor, alternando entre

episódios de mania/hipomania e depressão, e sua fisiopatologia exata ainda continua

indeterminada. A farmacoterapia do transtorno bipolar baseia-se na prevenção dos

episódios de mania e depressão através do uso de estabilizadores do humor. A

nociceptina/orfanina FQ (N/OFQ) é um heptadecapeptídeo endógeno e agonista do

receptor NOP, um receptor acoplado à proteína G do tipo inibitória. A N/OFQ e seu

receptor desempenham uma série de papéis funcionais no organismo, e, entre eles, está

a modulação de processos emocionais. Sabe-se que há alteração na concentração

plasmática de N/OFQ em pacientes na fase depressiva e maníaca do transtorno bipolar

e, por isso, presume-se que esse sistema teria algum papel na etiologia deste transtorno.

Com relação à mania, os modelos animais utilizados na pesquisa tendem a focar em

apenas um aspecto do quadro maníaco, como a hiperatividade ou agressividade. Nos

anos 60, foi proposto o teste do hole board, aparato provido de furos onde

prioritariamente se mede nos animais um comportamento conhecido como “imersão de

cabeça” (head-dipping). Altos níveis de head-dippings podem ser indicativos de

neofilia, enquanto baixos níveis poderiam ser reflexo de um comportamento do tipo

ansioso. Como o aumento do comportamento exploratório e direcionado a objetivos são

sintomas característicos dos quadros maníacos, este teste poderia oferecer subsídios

para a pesquisa deste transtorno. Deste modo, o presente trabalho foi dividido em 3

etapas e visa apresentar (1) a indução de um estado similar ao de mania promovido pela

administração de ouabaína, um inibidor da enzima Na+/K

+-ATPase, em camundongos

no campo aberto; (2) a padronização do hole board como um teste para mensuração de

comportamentos do tipo maníacos; e (3) a investigação do efeito da N/OFQ na

prevenção destes comportamentos no hole board. Para o desenvolvimento deste estudo,

foram usados camundongos Swiss machos que participaram de apenas uma das etapas

descritas acima e receberam um ou mais dos seguintes tratamentos, de acordo com a

etapa: (1) ouabaína, nas doses de 10-6

, 10-5

, 10-4

, 10-3

ou 10-2

M, intracerebroventricular

(icv); (2) valproato de sódio 300 mg/kg, intraperitoneal (ip); (3) valproato de sódio 400

mg/kg, ip; (4) diazepam 1 mg/kg, ip; (5) metilfenidato 10 mg/kg, ip; e (6) N/OFQ nas

doses de 0,1 ou 1 nmol, icv. Os resultados sugerem que o hole board é um teste que

pode ser usado para a avaliação de quadros maníacos, através da análise de vários

comportamentos do animal. Entretanto, não foi possível padronizar o modelo da

disfunção da enzima Na+/K

+-ATPase induzido pela administração de ouabaína usando

camundongos como sujeitos experimentais. Ainda, os dados sugerem que a N/OFQ, nas

doses testadas, não é eficaz na prevenção de um quadro de mania. Tomados em

conjunto, os resultados apontam para uma nova abordagem na pesquisa da mania,

através do uso do hole board. Entretanto, mais estudos precisam ser feitos a fim de

comprovar o envolvimento do sistema da nociceptina/orfanina FQ na ocorrência do

transtorno bipolar.

Palavras-chave: transtorno bipolar, nociceptina/orfanina FQ, hole board, ouabaína.

11

ABSTRACT

Bipolar disorder is characterized by mood impairment, alternating between

mania/hypomania and depression, and its exact pathophysiology is already unknown.

The treatment of bipolar disorder is based on prevention of the manic and depressive

episodes using mood stabilizers. Nociceptin/orfanin FQ (N/OFQ) is an endogenous

heptadecapeptide which binds as an agonist to NOP receptor, which is a G-coupled

inhibitory receptor. N/OFQ and its receptor modulate a lot of functions in the organism,

including emotional processes. It is known that the plasmatic concentration of N/OFQ is

altered in patients in both phases depressive and manic of bipolar disorder and it is

assumed that this system has a role on the etiology of this disorder. Concerning mania,

the animal models used in research tend to focus in an unique aspect of the manic

behavior, as hyperactivity or agressivity. In the 60’s, the hole board test was proposed,

and it consists of an apparatus with holes where a behavior known as head-dippings is

measured. High levels of head-dippings are suggestive of neophilia, while low levels

can be characteristic of an anxious-like behavior. As the increase of exploratory and

goal-directed behavior are characteristics of manic behavior, this test could help in

mania research. Thus, this work was organized in 3 steps and aims to: (1) investigate the

induction of a manic-like state promoted by ouabain, a Na+/K+-ATPase inhibitor, in the

mouse open field test; (2) set up the hole board as a test to measure manic-like

behaviors; and (3) investigate the N/OFQ effects in prevention of this kind of behavior

on hole board. Male Swiss mice were used in this study, and they take part of only one

of the described steps. Depending on the step performed, mice received one or more of

the following treatments: (1) ouabain 10-6

, 10-5

, 10-4

, 10-3

or 10-2

M,

intracerebroventricular (icv); (2) sodium valproate 300 mg/kg, intraperitoneal (ip); (3)

sodium valproate 400 mg/kg, ip; (4) diazepam 1 mg/kg, ip; (5) methylphenidate 10

mg/kg, ip; and (6) N/OFQ 0,1 or 1 nmol, icv. The results suggest that hole board can be

used to evaluate a manic state, through analysis of different animal behaviors. However,

it was not possible to standard the model of Na+/K

+-ATPase dysfunction through

ouabain administration in mice. Moreover, the data suggest that N/OFQ, at the doses

tested, has not affected the methylphenidate-induced mania-like behavior. Taken

together, the results point to a new approach of manic research, through the hole board

using. However, more studies are necessary in order to verify the role of N/OFQ system

on bipolar disorder.

Keywords: bipolar disorder, nociceptin/orfanin FQ, hole board, ouabain.

12

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Esquema de tratamento adotado na etapa I......................................... 36

Tabela 2. Esquema de tratamento adotado na etapa II....................................... 36

Tabela 3. Esquema de tratamento adotado na etapa III...................................... 37

Tabela 4. Efeito do tratamento com valproato nas doses de 300 e 400 mg/kg e

metilfenidato na dose de 10 mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal, na

distância percorrida por camundongos no teste do campo aberto durante 30

minutos de observação.........................................................................................

40

Tabela 5. Resumo dos efeitos das substâncias testadas no hole board............... 55

13

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estrutura da prepro-N/OFQ (ppN/OFQ), da nocistatina e da N/OFQ

em rato, camundongo e humano (Adaptado de Mogil e Pasternak, 2001)..............

22

Figura 2. Foto de camundongo durante o teste do hole board............................... 35

Figura 3. Efeito do tratamento com ouabaína nas doses de 10-4

, 10-5

e 10-6

M,

por via intracerebroventricular, na distância percorrida por camundongos no

teste do campo aberto durante 30 minutos de observação.......................................

39

Figura 4. Efeito do tratamento com metilfenidato na dose de 10 mg/kg (0,1

ml/10g), por via intraperitoneal, na quantidade de interações com os furos do

centro (A) e da periferia (B), a distância total percorrida (C), quantidade de

rearings (D), distância percorrida no centro (E) e tempo no centro (F) do

tabuleiro durante os 10 minutos de observação.......................................................

41

Figura 5. Efeito do tratamento com valproato nas doses de 300 e 400 mg/kg (0,1

ml/10g), por via intraperitoneal, na quantidade de interações com os furos do

centro (A) e da periferia (B), a distância total percorrida (C), quantidade de

rearings (D), distância percorrida no centro (E) e tempo no centro (F) do

tabuleiro durante os 10 minutos de observação no hole

board........................................................................................................................

43

Figura 6. Efeito do tratamento com metilfenidato 10 mg/kg associado com

valproato nas doses de 300 e 400 mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal, na

interação com os furos centrais (A) e periféricos (B) do tabuleiro efetuado por

camundongos durante 10 minutos de observação no hole board............................

44



distância total percorrida (A) e no número de rearings efetuados (B) por

camundongos no teste do hole board durante 10 minutos de observação...............

45



distância percorrida (A) e no tempo gasto (B) no centro do tabuleiro por

camundongos no teste do hole board durante 10 minutos de observação...............

47

14

Figura 9. Efeito do tratamento com diazepam na dose de 1 mg/kg (0,1 ml/10g),

por via intraperitoneal, nas interações com os furos do centro (A) e da periferia

(B) do aparato durante os 10 minutos de observação no teste do hole

board........................................................................................................................

48

Figura 10. Efeito do tratamento com N/OFQ nas doses de 0.1 e 1 nmol, por via

intracerebroventricular, na quantidade de interações com os furos no centro (A) e

periferia (B) do tabuleiro no teste do hole board durante 10 minutos de

observação................................................................................................................

50

Figura 11. Efeito do tratamento com metilfenidato 10 mg/kg (0,1 ml/10g)

associado com N/OFQ nas doses de 0,1 e 1 nmol (2µl), por via

intracerebroventricular, na quantidade de interações dos camundongos com os

furos no centro (A) e periferia (B) do tabuleiro no teste do hole board durante 10

minutos de observação.............................................................................................

51



intracerebroventricular, na distância total percorrida (A) e quantidade de

rearings (B) no teste do hole board durante 10 minutos de observação.................

52



intracerebroventricular, na distância percorrida (A) e tempo gasto (B) no centro

do tabuleiro por camundongos submetidos ao hole board durante 10 minutos de

observação................................................................................................................

53

15

LISTA DE ABREVIATURAS

µl – microlitros

5-HT – serotonina

AMPc – adenosina 3’,5’-monofosfato cíclico

AP – ântero-posterior

Ca2+

- íons cálcio

CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais

DV – dorso-ventral

GABA – ácido gama-aminobutírico

icv – intracerebroventricular

ip – intraperitoneal

K+ - íons potássio

M – molar

ML – médio-lateral

N/OFQ – nociceptina/orfanina FQ

nmol – nanomolar

NOP – receptor da nociceptina/orfanina FQ

ppn/OFQ - prepro-N/OFQ

sc – subcutânea

16

SNC – sistema nervoso central

VL – ventrículo lateral

17

INTRODUÇÃO

1.1 Transtorno bipolar

Os transtornos mentais, uma das classes de doenças mais prevalentes no

mundo, são caracterizados pela presença de um padrão mental ou comportamental

anormal que leva a estados de sofrimento e/ou incapacidade de realizar adequadamente

algumas funções neurais, levando a prejuízos na vida social e no bem-estar. Uma

pesquisa publicada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) em 2001 revelou que

aproximadamente 450 milhões de pessoas ao redor do mundo sofrem de algum tipo de

transtorno mental, e que uma em cada quatro pessoas desenvolve alguma desordem do

tipo durante a vida (World Health Organization 2001). Uma revisão de estudos feitos

em 16 países da Europa e incluindo 150.000 sujeitos estimou que aproximadamente

27% da população adulta da União Europeia têm ou teve pelo menos um quadro de

desordem mental nos 12 meses anteriores à pesquisa, e 1/3 apresenta mais de um

transtorno. Os mais frequentes foram: transtornos de ansiedade, depressão e

dependência de substâncias psicoativas (Wittchen & Jacobi 2005). Hoje em dia,

presume-se que, em geral, os transtornos mentais seriam fruto da interação entre os

sistemas neurotransmissores, componentes genéticos e o ambiente, como sugerido em

vários estudos (Dani & Harris 2005; Strous & Shoenfeld 2006; Cannon & Keller 2006;

Repetti et al. 2002).

O transtorno bipolar é caracterizado pela disfunção do humor, alternando entre

episódios de mania/hipomania e depressão. Nos episódios de mania/hipomania, o

humor é anormal, persistentemente elevado, expansivo ou irritável. Nos episódios

depressivos do transtorno bipolar, o quadro clínico é semelhante ao do transtorno

depressivo maior, caracterizado por humor depressivo ou perda de interesse em quase

18

todas as atividades diárias, além de sintomas como: alterações no apetite ou peso, sono

e atividade psicomotora; diminuição da energia, sentimentos de desvalorização pessoal

ou culpa, dificuldades em pensar, concentrar-se ou tomar decisões; pensamentos

recorrentes de morte e planos ou tentativas suicidas (MacQueen et al. 2001; Townsend

& Altshuler 2012, DSM-V, 2013). De acordo com o Manual Diagnóstico e Estatístico

de Transtornos Mentais em sua 5ª edição (DSM-V) (DSM-V, 2013), um episódio

maníaco é caracterizado por humor eufórico ou irritável que ocorre concomitante com

outros sintomas, como diminuição da necessidade de sono, loquacidade, sentimento de

grandiosidade, distrabilidade, aumento de atividades direcionadas a um objetivo claro e

envolvimento em comportamentos de risco (como promiscuidade, impulsividade, etc.).

Estima-se que a prevalência do transtorno bipolar durante a vida seja de

aproximadamente 3,9%, com idade média de início aos 25 anos (Flaisher-Grinberg &

Einat 2010). Em pessoas acima de 18 anos, a Organização Mundial da Saúde estimou a

prevalência nos Estados Unidos para o transtorno bipolar de 0,8% para homens e 1%

para mulheres (Ayuso-Mateos 2002; World Health Organization 2004).

Apesar dos esforços empregados para o entendimento da neurobiologia do

transtorno bipolar, sua fisiopatologia exata ainda continua indeterminada, mas

evidências sugerem que este transtorno decorre de um complexo quadro de interação

entre os múltiplos genes que causam suscetibilidade ao seu desenvolvimento, bem como

a relação destes com fatores ambientais. Além da genética, variáveis relacionadas às

vias neurohormonais, à neurotransmissão, às vias de transdução de sinal e à regulação

da expressão gênica parecem participar da neurobiologia do transtorno (Frey et al.

2009).

19

1.2 Tratamento do Transtorno Bipolar

O paciente com diagnóstico de transtorno bipolar tem sua qualidade de vida

afetada, em virtude dos impedimentos funcionais resultantes das alterações nos

componentes afetivos, cognitivos, comportamentais e físicos. A capacidade de trabalho

e socialização é reduzida ou até anulada. Por causa dessas alterações, existe um alto

grau de morbidade para este transtorno, o que leva à necessidade de intervenção através

da farmacoterapia (Barge-Schaapveld et al. 1999). A escolha do medicamento nos

transtornos afetivos deve basear-se na apresentação mínima de efeitos adversos, para

que ocorra boa adesão ao tratamento (Lam et al. 2009).

No caso do transtorno bipolar, a farmacoterapia baseia-se na prevenção dos

episódios de mania e depressão através do uso de estabilizadores do humor,

principalmente pela administração do cátion monovalente lítio ou de fármacos

anticonvulsivantes, como ácido valpróico ou carbamazepina. Já com relação às crises,

sejam elas maníacas ou depressivas, a politerapia é preconizada e são prescritos

fármacos das seguintes classes: antipsicóticos atípicos, antidepressivos e

benzodiazepínicos (Lafer et al., 2009; Matson et al. 2006; Sanches et al. 2010).

Vários sistemas de transdução de sinal e de receptores parecem estar

envolvidos no mecanismo de ação do lítio. Sabe-se que a administração de lítio causa

inibição das inositol monofosfatases, modulação de proteínas G e inibição de cascatas

de transdução de sinal, como a da glicogênio sintetase quinase 3 (GSK3), mas nenhum

dos mecanismos supracitados ainda foi totalmente creditado aos efeitos antimaníacos da

droga (Stahl, 2008).

Apesar de ser considerado o “padrão ouro” para o tratamento da mania, uma

característica deste fármaco é que ele possui faixa terapêutica estreita com variações na

20

excreção, o que leva à necessidade de monitoramento periódico dos níveis séricos, mais

frequentemente no início do tratamento ou quando as doses forem alteradas, ou ainda a

qualquer momento, desde que haja indícios ou suspeita de intoxicação. Em decorrência

dessa característica, a farmacoterapia com o lítio produz uma variedade de efeitos

adversos, em especial relacionados ao sistema endócrino e renal (Lydiard & Gelenberg,

1982; Matson et al. 2006). Além disso, o lítio apresenta início de ação lento, efeito

antimaníaco limitado e potencial teratogênico. Assim, a busca para substituir o uso do

lítio tornou-se tema comum, e a utilização de outros medicamentos estabilizadores do

humor tem sido colocada em prática pela comunidade científica. Dentre eles, estão a

carbamazepina, cujo efeito antimaníaco é creditado ao bloqueio da atividade de canais

de Na+ sensíveis à voltagem, e o ácido valpróico, que além do bloqueio de canais de

Na+, também pode exercer ações através da facilitação da neurotransmissão

GABAérgica e da inibição da atividade de segundos mensageiros (Stahl, 2008). Tanto a

carbamazepina quanto o ácido valpróico são medicamentos originalmente usados para

epilepsia, e que, em relação à mania, são menos eficazes que o lítio, além de

compartilharem de seu perfil teratogênico. Outros aspectos destes medicamentos é que

ambos levam à alteração do metabolismo de medicamentos em geral: a carbamazepina é

um potente indutor de enzimas hepáticas, enquanto que o valproato atua como inibidor

de algumas enzimas do citocromo P450, o que gera inúmeras interações

medicamentosas (Rosa et al. 2009; Wilson et al. 1998).

Os sistemas peptidérgicos, devido ao seu papel modulatório exercido sobre

sistemas clássicos de neurotransmissão central, têm se mostrado como alvos

terapêuticos inovadores no tratamento de transtornos psiquiátricos. Os neuropeptídeos

são neurotransmissores compostos por 3 a 100 resíduos de aminoácidos, cujo tamanho

pode ser 50 vezes maior que a molécula de um neurotransmissor clássico. Apesar de sua

21

natureza protéica, eles são menores que a maioria das proteínas, e sua estrutura terciária

é menos complexa. Eles são providos de muito mais informações químicas e sítios de

reconhecimento para os receptores que os neurotransmissores clássicos, o que leva a

uma afinidade e seletividade ao receptor muito maior quando comparado a estes – os

neuropeptídeos têm afinidade de ligação até 1000 vezes maior com o seu receptor que o

visto para os neurotransmissores clássicos e seus respectivos receptores. Como

conseqüência disso, apenas uma pequena quantidade de peptídeos é suficiente pra

promover efeitos no organismo. Os neuropeptídeos se difundem através do organismo e

ligam mais lentamente - porém mais fortemente - ao seu receptor que os

neurotransmissores clássicos, e o complexo neuropeptídeo-receptor pode ser

internalizado pelas células para causar dessenssibilização (Hökfelt et al. 2003).

1.3 Sistema da Nociceptina/Orfanina FQ – Receptor NOP

A nociceptina/orfanina FQ (N/OFQ) é um heptadecapeptídeo que apresenta

estrutura similar ao peptídeo opioide dinorfina A (Houtani et al. 1996). Entretanto, a

despeito desta similaridade estrutural, ambos os peptídeos são funcionalmente distintos,

já que a N/OFQ não apresenta afinidade pelos receptores opioides clássicos (Mogil &

Pasternak 2001). Parece que tal falta de afinidade deve-se à presença do aminoácido

fenilananina na posição 1 da sua estrutura aminoacídica, visto que a substituição deste

aminoácido pode aumentar a afinidade aos receptores opioides tradicionais (Champion

& Kadowitz 1997). Em 1995, dois grupos relataram o isolamento da N/OFQ

simultaneamente. Meunier et al. (1995) isolaram este neuropeptídeo de extratos de

cérebro de rato e o denominaram de nociceptina, pois quando injetado no cérebro de

camundongos promovia hiperalgesia no teste da placa quente e no teste de retirada da

22

cauda. Reinscheid et al. (1995) isolaram este ligante endógeno de extrato de cérebro de

porco e o denominaram de orfanina FQ, pois foi mostrado que este peptídeo interagia

com um receptor órfão, por isso orfanina. Além disso, eles perceberam que na sequência

aminoacídica deste peptídeo, os aminoácidos fenilalanina e glicina (abreviados pelas

letras F e Q), estão localizados nas extremidades carboxi e amino terminal,

respectivamente, daí o peptídeo se chamar orfanina FQ (figura 1).

A N/OFQ, assim como a maioria dos neuropeptídeos, é derivada da clivagem

de um precursor maior, a prepro-N/OFQ (ppN/OFQ), o qual já foi clonado a partir de

ratos, camundongos e humanos (Meunier et al. 1995; Pan et al. 1996; Reinscheid et al.

2000) e cujo gene, nesta última espécie, foi localizado no cromossomo 8 (8p21)

(Mollereau et al. 1996). A ppN/OFQ apresenta alta homologia entre as espécies animais

supracitadas, com similaridade estrutural superior a 80%, e sua clivagem, além da

N/OFQ, dá origem também a outros peptídeos bioativos, como por exemplo a

nocistatina (Mogil & Pasternak 2001).

Figura 1. Estrutura da prepro-N/OFQ (ppN/OFQ), da nocistatina e da N/OFQ em rato, camundongo e

humano (Adaptado de Mogil & Pasternak, 2001).

A partir da comprovação da interação do receptor órfão (na época denominado

ORL1) com a N/OFQ, este receptor foi denominado de receptor da nociceptina/orfanina

FQ (receptor NOP) (Snyder & Pasternak 2003). O receptor NOP é um receptor

acoplado à proteína G do tipo inibitória, que ao ser ativado aumenta o efluxo de K+,

Figura 1. Estrutura da prepro-N/OFQ (ppN/OFQ), da nocistatina e da N/OFQ em rato,

camundongo e humano (Adaptado de Mogil e Pasternak, 2001).

23

reduz a entrada de Ca+2

e diminui a produção de AMPc (Connor et al. 1996; Vaughan &

Christie 1996; Wu et al. 1997). Mesmo fazendo parte da família dos receptores

opioides, devido inclusive à grande similaridade estrutural, o receptor NOP difere, do

ponto de vista farmacológico, dos sistemas opioides clássicos. Nem os opioides, nem os

seus antagonistas se ligam com alta afinidade ao receptor NOP (Mogil & Pasternak

2001). O receptor NOP possui alta expressão em diversas áreas do sistema nervoso

central, em particular no prosencéfalo, sistema límbico e na medula espinhal, nos cornos

dorsal e ventral. É densamente localizado nos núcleos serotoninérgicos, noradrenégicos

e dopaminérgicos, como nos núcleos da rafe, locus coeruleus, núcleo do trato solitário,

área tegmental ventral e substância nigra (Mollereau et al. 1994; Neal et al. 1999). Já o

precursor da N/OFQ, a proteína pronociceptina, possui distribuição mais limitada em

comparação ao receptor NOP. No cérebro de rato, transcritos do gene da pronociceptina

foram encontrados em áreas envolvidas na transmissão ou modulação de estímulos

nociceptivos, em núcleos pertencentes a outras vias sensoriais, incluindo aferências

visuais e auditivas, no sistema límbico e núcleos hipotalâmicos (Boom et al. 1999). A

N/OFQ e o seu receptor estão bem distribuídos em estruturas do sistema límbico

envolvidas no processamento de estímulos emocionais, como: hipocampo, septo, núcleo

do leito da estria terminal, banda diagonal de Broca, a habênula, o complexo

amigdalóide e formação hipocampal (Mollereau & Mouledous 2000), o que dá suporte

ao papel deste sistema na modulação de estados emocionais, como a ansiedade e

depressão (Gavioli & Calo' 2006).

A N/OFQ e seu receptor desempenham uma série de papéis funcionais, como

processamento de estímulos nociceptivos, controle das funções neuroendócrinas,

balanço hídrico, controle motor, resposta ao estresse, modulação dos processos

emocionais, comportamento sexual e regulação da pressão arterial, entre outras funções

24

(Lambert 2008). A disponibilidade de ligantes seletivos do receptor NOP, sejam eles

peptidérgicos (Calo’ et al. 2000; Calo' et al. 2002) ou não-peptidérgicos (Ozaki et al.

2000; Zaratin et al. 2004), permite a investigação do papel desempenhado pelo sistema

endógeno N/OFQ-receptor NOP no controle de diferentes funções biológicas.

1.4 Sistema da Nociceptina/Orfanina FQ – Receptor NOP e transtornos afetivos

Estudos pré-clínicos mostram que antagonistas do receptor NOP, incluindo

[Nphe1]N/OFQ(1-13)-NH2, J-113397, UFP-101 e SB-612111 possuem atividade do

tipo antidepressiva em animais experimentais (Gavioli & Calo' 2006). De fato, estudos

realizados em roedores tratados com antagonistas peptídicos do receptor NOP, como

[Nphe1]N/OFQ(1-13)-NH2 e UFP-101, por via intracerebroventricular (icv) e

submetidos a testes de desespero comportamental, como o teste de natação forçada e o

teste de suspensão pela cauda, mostraram diminuição do tempo de imobilidade dos

animais (Redrobe et al. 2002; Gavioli et al. 2003; Gavioli et al. 2004), mas a N/OFQ ou

o agonista do receptor NOP Ro64-6198 (icv), não foram capazes de afetar o tempo de

imobilidade nestes mesmos testes comportamentais (Gavioli et al. 2004; Goeldner et al.

2012). O antagonista UFP-101 também mostrou atividade do tipo antidepressiva em

tratamento crônico por 21 dias (icv) no modelo de estresse crônico variável, restaurando

o consumo de solução de sacarose, o equilíbrio na concentração de serotonina (5-HT) e

nos níveis de cortisol sérico (Vitale et al. 2009). O trabalho de Vitale e colaboradores

(2009) foi o único que conseguiu demonstrar que o bloqueio dos receptores NOP

reverte parâmetros comportamentais, neuroquímicos e endócrinos relacionados à

depressão experimental.

Em ratos e camundongos knockout para o receptor NOP, estudos mostraram

que, quando submetidos aos testes de desespero comportamental, os animais

25

apresentavam comportamento do tipo antidepressivo, reforçando o papel exercido pelo

sistema peptidérgico N/OFQ-receptor NOP na mediação da depressão experimental

(Gavioli et al. 2003; Gavioli et al. 2004; Rizzi et al. 2011).

Já é sabido que a N/OFQ causa hipolocomoção em roedores de forma dose-

dependente (Reinscheid et al. 1995). No entanto, em relação aos antagonistas NOP, não

foi observada nenhuma alteração na locomoção espontânea. As doses administradas dos

antagonistas que levavam à diminuição do tempo de imobilidade na natação forçada e

teste de suspensão pela cauda não mostraram alteração de mobilidade no teste do campo

aberto (Nishi et al. 1997; Redrobe et al. 2002; Gavioli et al. 2004), o que confere um

comportamento genuíno do tipo antidepressivo induzido por antagonistas NOP.

Considerando o transtorno bipolar, há apenas um estudo clínico relacionando

esta psicopatologia ao sistema peptidérgico N/OFQ-receptor NOP. Wang e

colaboradores (2009) demonstraram haver alteração na concentração plasmática de

N/OFQ em pacientes na fase depressiva e maníaca do transtorno bipolar. Amostras de

sangue periférico foram coletadas de 78 adultos, sendo 21 de pacientes diagnosticados

com depressão bipolar, 26 de pacientes com mania bipolar e 31 de adultos saudáveis

(grupo controle). O nível plasmático de N/OFQ do grupo com depressão bipolar foi

significativamente maior do que o do grupo controle, e o nível de N/OFQ do grupo com

mania bipolar foi significativamente menor quando comparado ao do grupo controle.

Estes resultados sugerem o envolvimento do sistema peptidérgico da N/OFQ na

etiologia do transtorno bipolar (Wang et al. 2009). Entretanto, não há atualmente

nenhuma evidência pré-clínica que possa sustentar a hipótese do emprego de agonistas

ou antagonistas do receptor NOP no tratamento deste transtorno e, devido a isso, existe

a necessidade de mais estudos, principalmente em nível pré-clínico, com o auxílio de

26

modelos animais do transtorno bipolar, para investigar o potencial terapêutico dos

ligantes do receptor NOP nesta psicopatologia.

1.5 Modelos Animais de Mania

Os modelos animais já provaram ser uma ferramenta vital para o estudo da

neurobiologia e tratamento de vários transtornos neuropsiquiátricos. Contudo, o

desenvolvimento de parâmetros a serem avaliados continua sendo um desafio. Como

em todos os modelos animais de doenças psiquiátricas, é difícil inferir estados afetivos

em roedores que mimetizem os sintomas clínicos e déficits cognitivos que caracterizam

a psicopatologia em humanos. O modelo animal ideal para o estudo do transtorno

bipolar seria aquele que incluiria comportamentos espontâneos e progressivos que

oscilariam entre a manifestação de aumento e a redução de determinada conduta,

mimetizando, assim, o comportamento humano nos episódios maníacos e depressivos.

Este quadro observado nos animais deveria também normalizar por meio do tratamento

crônico, porém não agudo, com estabilizadores do humor (Gavioli et al. 2009).

Infelizmente, um modelo animal como o descrito acima, com alta validade aparente,

preditiva e de construto, é muito difícil de reproduzir em laboratório.

Atualmente, os modelos disponíveis tendem a focar apenas um dos pólos do

transtorno, utilizando alguma especulação e estudos empíricos, identificando, nos

animais, comportamentos similares à depressão e mania (Potash & DePaulo 2000;

Nestler & Hyman 2010). Os modelos mais utilizados para o estudo da depressão bipolar

são: estresse moderado crônico, modelo do desamparo aprendido, modelo de separação,

bulbectomia e testes do desespero comportamental (como a natação forçada e a

suspensão pela cauda). Esses modelos, mesmo sendo úteis para mimetizar alguns

27

aspectos da depressão, contribuem pouco para a natureza recorrente do transtorno

bipolar (Redrobe & Bourin 1999; Prica et al. 2008).

Os modelos de mania atualmente disponíveis foram desenvolvidos baseando-

se, principalmente, em três abordagens: farmacológica, comportamental e genética. Os

modelos de mania com abordagem farmacológica baseiam-se no fato de que o aumento

da concentração sináptica de dopamina, decorrente da administração de fármacos

psicoestimulantes, causa aumento da atividade locomotora, que é revertida pela

administração de fármacos estabilizadores do humor. Já a abordagem comportamental

envolve a análise do comportamento espontâneo do animal ou, ainda, após manipulação

experimental, a qual promove alteração no comportamento de base, como no caso dos

animais privados de sono. Finalmente, os modelos com abordagem genética visam à

criação de animais com traços específicos de determinada patologia ou que sofreram

manipulação genética em genes tidos como responsáveis pela etiologia do transtorno

(para revisão: Gavioli et al., 2009), como, por exemplo, o caso dos camundongos que

não expressam os genes clock (Mukherjee et al. 2010). Atualmente, os modelos mais

utilizados para estudar a mania são: modelo de hiperatividade induzida por

psicoestimulantes, modelo da disfunção da enzima Na+/K

+-ATPase, utilizando um

inibidor específico dessa enzima, como a ouabaína; e modelo da privação do sono

(Herman et al. 2007; Young et al. 2011).

O modelo da disfunção da enzima Na+/K

+-ATPase já é um modelo consagrado

para a indução de mania, devido a um dos correlatos biológicos da mania ser a

desregulação de íons (El-Mallakh et al. 2003). Estudos mostram que pacientes em

episódios de mania apresentam aumento de cálcio (Dubovsky et al. 1989; Dubovsky et

al. 1991; Dubovsky et al. 1992; Emamghoreishi et al. 2000; Emamghoreishi et al. 1997;

Hough et al. 1999) e sódio (Coppen et al. 1966; Shaw 1966) intracelular e decréscimo

28

na atividade da bomba de sódio (Looney & El-Mallakh 1997). Além disso, os cérebros

de indivíduos portadores de transtorno bipolar podem expressar menores níveis da

subunidade alfa-2 da bomba de sódio (Rose et al. 1998).

A ouabaína, um potente inibidor da bomba de sódio, é uma substância já

consolidada como indutora de um estado similar ao de mania em ratos, tendo sido

empregada em vários estudos (El-Mallakh et al. 2003; Herman et al. 2007; Riegel et al.

2009). Contudo, ainda não existe um protocolo para a indução de um estado de mania

induzido por ouabaína em camundongos. Do ponto de vista da pesquisa, o uso de

camundongos é mais viável para alguns laboratórios, pois apresentam menor custo de

manutenção, sendo animais muito prolíferos e que não ocupam tanto espaço quanto os

ratos, daí a importância de se padronizar um modelo experimental utilizando esse

animal.

Os episódios de mania são também marcados por uma variedade de sintomas,

incluindo grandiosidade e verborragia, que são extremamente difíceis de inferir a partir

do comportamento de roedores. Por isso, o aumento da atividade motora continua sendo

o parâmetro comportamental mais avaliado pelos modelos animais. Contudo, cabe

ressaltar que a hiperlocomoção dos roedores não é exclusividade dos modelos de mania,

sendo este mesmo comportamento também aferido em modelos animais para outros

transtornos psiquiátricos, como esquizofrenia e transtorno de déficit de atenção e

hiperatividade (TDAH) (Young et al. 2011). Portanto, a busca por modelos de mania

que avaliam comportamentos específicos e que apresentem validade aparente, preditiva

e de construto são imprescindíveis para o estudo da fisiopatologia do transtorno bipolar.

Considerando que a hiperatividade é um sintoma característico e está presente

em quase todos os estados maníacos (90%), seguido pela irritabilidade (ocorrendo em

71% dos pacientes), diminuída necessidade de sono e hiperverbosidade, espera-se que

29

um modelo ideal de mania seja baseado na avaliação de comportamentos relacionados a

estes sintomas. Já sintomas como hipersexualidade e religiosidade são menos frequentes

nos pacientes em mania (40-50% dos casos) (Goodwin & Jamison 2007).

Um outro sintoma encontrado nos quadros de mania é o aumento do vigor e

dos comportamentos direcionados a um objetivo específico (socialmente, no trabalho,

na escola ou sexualmente) (DSM-V, 2013), e tem-se sugerido que a sua ocorrência

estaria associada a uma hiperatividade do sistema dopaminérgico (Cousins et al. 2009).

Dada a variedade de sintomas apresentados pelos pacientes na fase de mania e

a dificuldade de se obter um modelo que englobe todos os aspectos da doença, uma

possível abordagem a ser utilizada na pesquisa seria o uso de vários modelos em uma

bateria de testes, de modo a avaliar os diversos comportamentos indicativos de mania

para que, assim, se consiga fazer uma completa caracterização deste quadro em animais.

Deste modo, modelos que apresentam validade aparente de maneira parcial (como o

modelo de hiperlocomoção induzida por psicoestimulantes ou o modelo do residente-

intruso, por exemplo), quando combinados, podem levar a uma caracterização muito

mais confiável do real estado do animal.

Nos anos 60, foi proposto o teste do hole board, aparato que consiste em uma

arena com buracos no piso, nos quais o animal pode introduzir a cabeça,

comportamento conhecido como “imersão de cabeça” (head-dipping) (File & Wardill

1975b; File & Wardill 1975a). A frequência e duração dos head-dippings são tidas

como medidas de neofilia ou exploração direcionada que são independentes da

atividade locomotora geral do animal (File & Wardill 1975b; Ljungberg & Ungerstedt

1976) e, de fato, existem estudos mostrando que a locomoção e a quantidade de head-

dippings podem variar independentemente entre si (Abel 1995; Durcan & Lister 1989).

Em geral, altos níveis de head-dippings são interpretados como indicativos de neofilia,

30

enquanto baixos níveis podem ser resultado de falta de neofilia ou, ainda, reflexo de um

comportamento do tipo ansioso por parte do animal (Crawley 1985; Takeda et al.

1998), motivo pelo qual este teste tem sido usado largamente na pesquisa de substâncias

ansiolíticas.

Como o aumento do comportamento exploratório e direcionado a objetivos são

sintomas característicos dos quadros maníacos, o uso do hole board poderia ser cotado

como um novo modelo animal para a pesquisa de mania, fornecendo informações sobre

esses tipos de comportamentos através da medida da interação do animal com os furos

do aparato que, em conjunto com outros aspectos demonstrados durante o teste,

formassem um quadro característico de mania que poderia ser prevenido pelo

tratamento com estabilizadores do humor.

Em suma, não existe um modelo animal apropriado para o estudo do transtorno

bipolar, nem mesmo para os episódios maníacos. Portanto, o desenvolvimento de novos

modelos é de grande importância para o estudo da fisiopatologia do transtorno bipolar,

do ponto de vista molecular, comportamental e funcional (Gavioli et al., 2009), além de

propiciar o desenvolvimento de medicamentos melhores aos utilizados atualmente na

clínica. Deste modo, o presente trabalho visa apresentar modelos de mania alternativos

aos já existentes, através da padronização do modelo de hiperatividade produzido pela


+-ATPase, já empregado com sucesso em ratos, usando

camundongos como sujeitos experimentais. Além disso, iremos apresentar uma nova

abordagem do já conhecido hole board como um modelo para a mensuração de

comportamentos do tipo maníacos. Ainda, visando avaliar a participação do receptor

NOP na modulação de estados de mania, este estudo objetivou investigar o efeito do

agonista endógeno do receptor NOP, a N/OFQ, em comportamentos do tipo maníacos

em camundongos.

31

METODOLOGIA

2.1 Animais

Foram empregados camundongos Swiss machos (25-30 g) provenientes do

biotério do Departamento de Biofísica e Farmacologia da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte. Os animais foram alojados em, no máximo, quinze por caixa (40 x 33

x 17 cm), com livre acesso a comida e água, e mantidos em um ciclo claro-escuro de 12

horas (6:00-18:00 h), a uma temperatura ambiente de 23°C 1oC. Todos os

procedimentos experimentais foram executados de acordo com as recomendações da

Lei nº 11.794 de 08/10/2008 (Lei Arouca) e foram aprovados pela Comissão de Ética no

Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Protocolo

nº 040/2012; 041/2014).

2.2 Drogas e tratamentos

Para este estudo, foi utilizado o agonista peptídico do receptor NOP, a N/OFQ,

doado pelo Prof. R. Guerrini (Dept. of Biotechnology and Pharmaceutical Chemistry,

University of Ferrara, Itália). O peptídeo foi diluído em solução salina e mantido a -

20ºC em solução estoque. Imediatamente antes do teste, uma alíquota de solução

estoque foi diluída em salina para se chegar à dose desejada, que foi administrada por

via icv no volume de 2µl.

Na etapa que objetivou verificar o efeito de um ansiolítico clássico no hole

board, foi usado o diazepam em solução injetável (Compaz®, Cristália) na dose de 1

32

mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal, diluído em solução salina. O grupo controle

recebeu apenas solução salina pela mesma via de administração.

Para a indução de um estado similar ao de mania induzido por ouabaína em

camundongos, foram avaliados os efeitos comportamentais das seguintes concentrações:

10-2

, 10-3

, 10-4

, 10-5

e 10-6

M de ouabaína (Sigma-Aldrich), diluída em solução salina e

injetada por via intracerebroventricular (icv), no volume de 2 µl. Os animais controle

foram tratados com solução salina pela mesma via de administração.

Para a padronização do modelo do hole board, foi feita a indução de um estado

de mania nos animais através da administração de metilfenidato (Ritalina®

, Novartis) na

dose de 10 mg/kg, 15 minutos antes do teste. A escolha desta droga justifica-se pelo fato

de que a hiperatividade induzida por anfetamínicos é considerada o padrão-ouro para

indução de mania em roedores (Berggren et al. 1978; Gould et al. 2001), ainda que as

alterações comportamentais induzidas em animais não sejam exatamente as mesmas

apresentadas por humanos quando na fase de mania (Silverstone et al. 1998). Para a

avaliação da prevenção dos sintomas de mania, foi utilizado o valproato de sódio

(Valpakine®, Sanofi Aventis) na dose de 300 mg/kg, e o mesmo foi administrado 45

minutos antes do teste (30 minutos previamente à administração de metilfenidato) por

via intraperitoneal. Solução salina foi usada como controle, assim como meio de

diluição de ambas as drogas.

2.3 Cirurgia para a implantação da cânula intracerebroventricular em

camundongos

Os animais foram anestesiados com ketamina 100 mg/kg e xilazina 10 mg/kg

ip (intraperitoneal) para a implantação de uma cânula no cérebro através do emprego de

33

um aparelho estereotáxico. A pele da região craniana foi removida para facilitar a

visualização do bregma, que serviu de ponto de partida para a orientação das

coordenadas. Uma cânula-guia de 8 mm foi implantada unilateralmente no ventrículo

lateral (VL) de acordo com as seguintes coordenadas: AP -0.6 mm; ML ±1.1 mm; DV -

1.0 mm. A cânula foi fixada com acrílico e pontos foram aplicados a fim de fechar a

incisão. Todo o procedimento foi executado sob condições de higiene e o local da

incisão foi tratado com o agente antisséptico iodo-povidine. Logo após o procedimento

cirúrgico, os animais receberam uma injeção do anti-inflamatório diclofenaco sódico

(10 mg/kg, uma dose por via subcutânea) e do antibiótico oxitetraciclina (2 mg/kg,

intramuscular), a fim de evitar infecções e atenuar a dor causada pelo procedimento.

Três a cinco dias após a cirurgia, os camundongos foram submetidos aos testes

comportamentais conforme descrição abaixo. Para a administração de ouabaína e da

N/OFQ, os animais foram manualmente imobilizados e receberam as soluções pela via

intracerebroventricular (icv) com o auxílio de uma agulha (cujo comprimento excede 1

mm a cânula-guia) ligada a um tubo de polietileno, que por sua vez era conectado a uma

microseringa de Hamilton, através da cânula-guia anteriormente implantada. Foram

injetados 0,5µl da substância a ser testada a cada 30 segundos (volume total: 2µl) e,

após a injeção completa, foi dado um tempo mínimo de 15 segundos antes de retirar a

agulha injetora de dentro da cânula, de modo a garantir que todo o conteúdo injetado

fosse difundido. Após o tratamento, os camundongos foram submetidos à análise

comportamental no campo aberto ou no hole board.

34

2.4 Testes comportamentais

2.4.1 Campo aberto

Os camundongos foram submetidos ao teste do campo aberto 5 minutos após a

administração da ouabaína, por via icv, e permaneceram no aparelho por 30 minutos,

sendo este período dividido em blocos de 5 minutos cada. Este teste foi realizado em

uma caixa de fórmica quadrada medindo 40 cm x 40 cm e cercada por paredes de 40 cm

de altura. Os animais foram submetidos individualmente a 30 minutos de exploração do

aparelho e, durante este período, foram avaliados pelo video tracking AnyMaze

(Stoelting Co., Wood Dale, IL, USA) quanto aos seguintes parâmetros

comportamentais: distância percorrida pelo animal (em metros) e tempo de imobilidade

(em segundos).

2.4.2 Hole board

Os animais foram postos no centro de um tabuleiro medindo 40 cm x 40 cm e

cercado por paredes de 35 cm de altura. O tabuleiro conta com 16 furos de 3 cm de

diâmetro, sendo 4 centrais e 12 periféricos, e está suspenso a 5 cm do chão. Para a

execução deste teste, os animais foram avaliados por 10 minutos. Durante esse tempo,

foram medidos parâmetros como a distância total percorrida, distância percorrida no

centro e tempo no centro através do software AnyMaze (Stoelting Co., Wood Dale, IL,

USA). Após os experimentos, os vídeos foram avaliados por um observador quanto ao

número de interações com os furos no tabuleiro e cálculo da porcentagem da distância

percorrida no centro em relação à distância total percorrida (dividiu-se a distância

35

percorrida no centro dividida pela distância total percorrida e o resultado foi

multiplicado por 100). Considera-se interação tanto quando o animal examina o furo,

quanto quando ele imerge a cabeça dentro deste pelo tempo mínimo de

aproximadamente 1 segundo. Foi registrado o número de interações com os furos

centrais e periféricos. Nas situações em que o animal interagiu com um furo, retirou a

cabeça e voltou a interagir com o mesmo em até 3 segundos, registrou-se apenas uma

interação. Além disso, foi medida a frequência de levantamento de patas dianteiras

(rearings), tanto no tabuleiro quanto nas paredes do aparato. Os animais que porventura

acessaram a parte de baixo do tabuleiro por algum buraco e passaram mais de 2 minutos

fora do alcance da câmera foram excluídos do teste (aproximadamente 7% dos animais

testados).

2.5 Desenho experimental

2.5.1.Etapa I – Indução de um estado similar ao de mania induzido pela

administração de ouabaína em camundongos

A ouabaína foi administrada nas seguintes concentrações: 10-2

, 10-3

, 10-4

, 10-5

e

10-6

M, por via intracerebroventricular (2 µl). A administração foi feita através da

cânula previamente implantada no ventrículo lateral. Cinco minutos após a

Figura 2. Foto de camundongo

durante o teste do hole board.

Figura 2. Foto de camundongo

durante o teste do hole board.

36

administração da ouabaína, a atividade locomotora do animal foi medida no teste do

campo aberto por 30 minutos. A tabela abaixo ilustra os tratamentos da etapa I:

Tabela 1 – Esquema de tratamento adotado na etapa I

Grupo Número de

animais

Tratamento icv

Volume

A 6-12 Salina

2 μL

B 6-12 Ouabaína 10-2

M

C 6-12 Ouabaína 10-3

M

D 6-12 Ouabaína 10-4

M

E 6-12 Ouabaína 10-5

M

F 6-12 Ouabaína 10-6

M

2.5.2 Etapa II – Padronização do hole board como um modelo para se avaliar

a mania

Quinze minutos após a administração de salina ou metilfenidato na dose de 10

mg/kg, os animais foram submetidos ao hole board por 10 minutos. Após a

caracterização do comportamento animal decorrente da administração de metilfenidato

neste modelo, o mesmo foi validado através da utilização de valproato de sódio (300 ou

400 mg/kg, ip), um estabilizador do humor. Para isso, os animais foram pré-tratados

com valproato de sódio e, após 30 minutos, foi administrado o metilfenidato, ambos por

via intraperitoneal. Após 15 minutos, os animais foram submetidos ao hole board, onde

ficaram por 10 minutos. A tabela abaixo ilustra os tratamentos da etapa 2:

Tabela 2 – Esquema de tratamento adotado na etapa II:

Grupo Número de

animais

Pré-tratamento

ip

Dose

(volume)

Tratamento

ip

Dose

(volume)

A 6-12

Controle

(0,1 ml/10 g)

Controle (0,1

ml/10 g)

37

B 6-12

Controle

(0,1 ml/10 g)

Metilfenidato

10

mg/kg

(0,1

ml/10 g)

C 6-12

Valproato de

sódio

300 mg/kg

(0,1 ml/10 g)

Controle (0,1

ml/10 g)

D 6-12

Valproato de

sódio

300 mg/kg

(0,1 ml/10 g)

Metilfenidato

10

mg/kg

(0,1

ml/10 g)

E 6-12

Valproato de

sódio

400 mg/kg

(0,1 ml/10 g)

Controle (0,1

ml/10 g)

F 6-12

Valproato de

sódio

400 mg/kg

(0,1 ml/10 g)

Metilfenidato

10

mg/kg

(0,1

ml/10 g)

2.5.3 Etapa III – Avaliação dos efeitos comportamentais de um agonista do

receptor NOP em camundongos submetidos ao modelo animal de mania

induzido por metilfenidato no hole board

Visando avaliar o efeito do tratamento com o agonista do receptor NOP, a

N/OFQ, no comportamento de camundongos no hole board, uma cânula foi implantada

no ventrículo lateral dos animais. Após 3 a 5 dias, os mesmos foram pré-tratados com

salina ou N/OFQ nas doses de 0,1 ou 1 nmol (2 μL) e, 5 minutos depois, tratados com

metilfenidato (10 mg/kg) ou salina. Após 15 minutos, os animais foram expostos ao

teste do hole board durante 10 min. O desenho experimental se desenvolveu de acordo

com a tabela abaixo:

Tabela 3 – Esquema de tratamento adotado na etapa III:

Grupo Número de

animais

Pré-tratamento

icv

Dose

(volume)

Tratamento

ip

Dose

(volume)

A 6-12

Controle

(2 μL)

Controle (0,1

ml/10 g)

38

B 6-12

Controle

(2 μL)

Metilfenidato

10

mg/kg

(0,1

ml/10 g)

C 6-12

N/OFQ 0,1 ou 1 nmol

(2 μL)

Controle (0,1

ml/10 g)

D 6-12

N/OFQ

0,1 ou 1 nmol

(2 μL)

Metilfenidato

10

mg/kg

(0,1

ml/10 g)

2.6 Análise estatística

Todos os dados foram apresentados como média erro padrão da média.

Dependendo da etapa experimental analisada, as diferenças entre os grupos

experimentais foram determinadas por ANOVA de uma via seguida pelo teste de

Newman-Keuls para comparações múltiplas ou ANOVA de duas vias (considerando os

seguintes fatores: [1] pré-tratamento com valproato e [2] tratamento com metilfenidato)

e análise pós-hoc usando o teste de LSD. O nível de significância assumido neste estudo

foi para valores de P≤0,05. Para a realização das análises estatísticas empregadas neste

estudo, foram utilizados os softwares Prism 5 (Graphpad) e Statistica 7.0 (Statsoft,

USA).

39

RESULTADOS

3.1 Etapa I – Indução de um estado similar ao de mania promovido pela

administração de ouabaína em camundongos

A figura 3 ilustra o efeito do tratamento icv com ouabaína, em concentrações

crescentes, no desempenho locomotor de camundongos submetidos ao teste do campo

aberto durante 30 minutos de observação.

Ouabaína icv

0-5

min

5-10

min

10-1

5 m

in

15-2

0 m

in

20-2

5 m

in

25-3

0 m

in

5

10

15

20

25

ouabaína 10-6 M

ouabaína 10-5 M

salina

ouabaína 10-4 M

Dis

tân

cia

(m

)

Figura 3. Efeito do tratamento com ouabaína nas concentrações de 10-6

, 10-5

e 10-4

M, por via

intracerebroventricular, na distância percorrida por camundongos no teste do campo aberto durante 30

minutos de observação. A dose de 10-2

M causou morte dos animais, enquanto a de 10-3

M causou um

estado de pré-convulsão (dados não mostrados). As barras representam a média erro padrão da média.

Cada grupo é constituído por 6-12 animais.

Como se pode observar, nenhuma das concentrações testadas promoveu um

aumento significativo na distância total percorrida por camundongos, efeito que seria

característico de um estado similar ao de mania. Deste modo, não foi possível

prosseguir com a padronização do modelo de indução de um estado similar ao de mania

através da injeção icv de ouabaína em camundongos.

40

3.2 Etapa II – Padronização do hole board como um teste para se avaliar a mania

Como um estágio prévio a esta etapa, foi realizada uma análise da atividade

locomotora espontânea dos animais, de modo a mensurar se os tratamentos, per se,

produziam algum efeito nesta função. Para isso, os animais passaram pelo teste do

campo aberto por 30 minutos, onde foram avaliados os parâmetros distância percorrida

e tempo de imobilidade. Os resultados encontram-se na tabela abaixo:

Tabela 4. Efeito do tratamento com valproato nas doses de 300 e 400 mg/kg e metilfenidato na dose de

10 mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal, na distância percorrida por camundongos no teste do

campo aberto durante 30 minutos de observação. Cada grupo é constituído por 6-12 animais. *p≤0,05 vs.

controle e #p≤0,05 vs. metilfenidato 10 mg/kg. ANOVA de uma via seguida do teste de Newman-Keuls.

Grupos

(0,1 ml/10g – via i.p.)

Distância percorrida (m)

Média±erro padrão

Tempo de imobilidade (s)

Média±erro padrão

Controle 46,74±5,67 1045,17±64,49

Valproato 300 mg/kg 70,08±14,37* 1095,38±137,58

Valproato 400 mg/kg 43,66±5,73 1161,28±117,04*

Metilfenidato 10 mg/kg 175,04±19,69* 231,28±50,33

*

Valproato 300 mg/kg +

Metilfenidato 10 mg/kg

242,36±13,69*#

129,98±46,10*#

Valproato 400 mg/kg +

Metilfenidato 10 mg/kg

104,75±11,05*#

810,12±109,41*#

Como demonstrado na tabela acima, apenas a dose de 400 mg/kg de valproato

foi capaz de prevenir o efeito hiperlocomotor causado pela administração de

metilfenidato 10 mg/kg. Contrariamente, o valproato na dose 300 mg/kg potencializou o

efeito do metilfenidato na hiperlocomoção e redução do tempo de imobilidade dos

animais.

Posteriomente, foi feita a caracterização do efeito do metilfenidato 10 mg/kg

no teste do hole board, a fim de avaliar quais comportamentos foram afetados com o

tratamento.

41

A figura 4 mostra a quantidade de interações dos animais nos furos do centro

(A) e na periferia (B), a distância total percorrida (C), quantidade de rearings (D),

distância percorrida no centro (E) e tempo no centro (F) durante os 10 minutos de teste.

O grupo tratado com metilfenidato 10 mg/kg apresentou uma quantidade

significativamente maior de interações com os furos centrais e periféricos que o

controle.

0

10

20

30

40

controle

metilfenidato 10 mg/kg

*

Nº

de in

tera

çõ

es n

o c

en

tro

0-1

0 m

in

0

20

40

60

80

100*

Nº

de in

tera

çõ

es n

a p

eri

feri

a

0-1

0 m

in

0

10

20

30

40

***

Dis

tân

cia

to

tal p

erc

orr

ida (

m)

0-1

0 m

in

0

10

20

30

*

Nº

de r

eari

ng

s

0-1

0 m

in

0

5

10

15

20

Dis

tân

cia

pe

rco

rrid

a n

o c

en

tro

(%

)

0-1

0 m

in

0

10

20

30

40

50

60

Tem

po

gasto

no

cen

tro

(s)

0-1

0 m

in

A) B)

C) D)

F) E)

42

Figura 4. Efeito do tratamento com metilfenidato na dose de 10 mg/kg (0,1 ml/10g), por via

intraperitoneal, na quantidade de interações com os furos do centro (A) e da periferia (B), a distância total

percorrida (C), quantidade de rearings (D), distância percorrida no centro (E) e tempo no centro (F) do

tabuleiro durante os 10 minutos de observação. As barras representam a média erro padrão da média.

Cada grupo é constituído por 6-12 animais. ***

p≤0,001 vs. controle; *p≤0,05 vs. controle. Student teste T

independente.

Observando os gráficos, podemos inferir que o grupo tratado com

metilfenidato 10 mg/kg apresentou uma quantidade significativamente maior de

interações com os furos centrais (A) e periféricos (B) que o controle. Com relação à

distância total percorrida (C), o metilfenidato foi capaz de aumentar significativamente

a locomoção dos animais, enquanto reduziu significativamente a quantidade de rearings

(D), sinalizando que, ao contrário da atividade exploratória horizontal, o metilfenidato

provoca uma diminuição da atividade exploratória vertical. Em (E), podemos ver a

porcentagem da distância percorrida no centro em relação à distância total percorrida

pelos animais dos grupos controle e metilfenidato e em (F), o tempo gasto no centro

pelos animais. Nos dois parâmetros, a diferença entre os grupos não foi significativa,

embora haja uma tendência ao aumento no tempo gasto no centro pelos animais tratados

com metilfenidato (p=0,09).

Após a padronização dos comportamentos induzidos pelo metilfenidato,

investigou-se o perfil de ação do valproato, nas doses de 300 e 400 mg/kg, no

comportamento dos animais submetidos ao hole board. A figura 5 mostra a quantidade

de interações dos animais com os furos do centro (A) e periferia (B), a distância total

percorrida (C), quantidade de rearings (D), distância percorrida no centro (E) e tempo

no centro (F) durante os 10 minutos de teste.

43

0

10

20

30

salina

valproato 300 mg/kg

valproato 400 mg/kg

*

Nº

de in

tera

çõ

es n

o c

en

tro

0-1

0 m

in

0

20

40

60

80

100

*

Nº

de in

tera

çõ

es n

a p

eri

feri

a

0-1

0 m

in

0

10

20

30

40*

DIs

tân

cia

to

tal p

erc

orr

ida

(m)

0-1

0 m

in

0

10

20

30

40

50

*

Nº

de r

eari

ng

s

0-1

0 m

in

0

5

10

15

Dis

tân

cia

pe

rco

rrid

a n

o c

en

tro

(%

)

0-1

0 m

in

0

20

40

60

*

Tem

po

gasto

no

cen

tro

(s

)

0-1

0 m

in

Figura 5. Efeito do tratamento com valproato nas doses de 300 e 400 mg/kg (0,1 ml/10g), por via

intraperitoneal, na quantidade de interações com os furos do centro (A) e da periferia (B), a distância total

percorrida (C), quantidade de rearings (D), distância percorrida no centro (E) e tempo no centro (F) do

tabuleiro durante os 10 minutos de observação no hole board. As barras representam a média erro

padrão da média. Cada grupo é constituído por 6-12 animais. *p≤0,05 vs. controle. ANOVA de uma via

seguida do teste de Newman-Keuls.

Podemos notar que a dose de 400 mg/kg reduziu significativamente as

interações com os furos (A) centrais (F(2,37) = 5,29) e (B) periféricos (F(2,37) = 6,88) do

tabuleiro. Assim como demonstrado no teste do campo aberto, o valproato na dose de

A) B)

C) D)

F) E)

44

300 mg/kg aumentou significativamente a locomoção total (C) dos animais no hole

board (F(2,37) = 16,48). Também houve um aumento significativo com relação ao

número de rearings efetuados (D) pelos animais (F(2,37) = 76,00). Não foram

encontradas diferenças entre os grupos com relação à porcentagem da distância

percorrida no centro em relação à distância total (E), porém, com relação ao tempo

gasto no centro (F), tal parâmetro foi significativamente reduzido pelo tratamento com

valproato 400 mg/kg (F(2,37) = 3,80).

Feitas as caracterizações do perfil do metilfenidato e valproato no hole board, a

próxima etapa foi testar o efeito da associação entre essas duas substâncias, a fim de

saber se a administração prévia de valproato ao metilfenidato seria capaz de prevenir as

alterações comportamentais causadas pelo mesmo nos animais.

A figura 6 mostra a quantidade de interações com os furos do centro (A) e da

periferia (B) do tabuleiro durante os 10 minutos de observação. A associação do

metilfenidato 10 mg/kg com o valproato, nas duas doses, foi capaz de prevenir o

aumento na interação com os furos centrais provocados pelo metilfenidato (ANOVA de

duas vias, pré-tratamento com valproato: F(2,64) = 5,01, p≤0,05; tratamento com

metilfenidato: F(1,64) = 5,72, p≤0,05). Ao contrário, com relação à quantidade de

interações com os furos periféricos, a associação do metilfenidato 10 mg/kg com o

valproato, nas duas doses, apresentou resultado semelhante ao grupo metilfenidato 10

mg/kg + controle.

controle valproato 300 mg/kg valproato 400 mg/kg0

10

20

30

40

50controle

metilfenidato 10 mg/kg*

##

Pré-tratamentos

Nº

de in

tera

çõ

es n

o c

en

tro

0-1

0 m

in

A)

45


20

40

60

80

100

controle


Pré-tratamentos

Nº

de in

tera

çõ

es n

a p

eri

feri

a

0-1

0 m

in

Figura 6. Efeito do tratamento com metilfenidato 10 mg/kg associado com valproato nas doses de 300 e

400 mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal, na interação com os furos centrais (A) e periféricos (B)

do tabuleiro efetuado por camundongos durante 10 minutos de observação no hole board. As barras

representam a média erro padrão da média. Cada grupo é constituído por 6-12 animais. *p≤0,05 vs.

controle + controle e #p≤0,05 vs. metilfenidato + controle. ANOVA de duas vias seguida do teste de LSD.

A figura 7 mostra a distância total percorrida (A) e o número de rearings (B)

efetuados pelos animais no hole board durante os 10 minutos de teste. Em (A),

percebe-se que a associação metilfenidato 10 mg/kg + valproato, nas duas doses

testadas, tem resultado significativamente maior do que a associação metilfenidato 10

mg/kg + controle.

Já quanto ao número de rearings, o grupo tratado com a dose de 10 mg/kg de

metilfenidato não demonstrou uma redução significativa na quantidade destes, enquanto

que o tratamento com valproato, nas duas doses, foi capaz de restabelecer a atividade

exploratória vertical dos animais reduzida pelo tratamento com metilfenidato (ANOVA

de duas vias, pré-tratamento com valproato: F(2,64) = 10,44, p≤0,05).


20

40

60

80

controle


###

###

***

Pré-tratamentos

DIs

tân

cia

to

tal p

erc

orr

ida

(m)

0-1

0 m

in

B)

A)

46


20

40

60 controle


# #

Pré-tratamentos

Nº

de r

eari

ng

s

0-1

0 m

in


400 mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal, na distância total percorrida (A) e no número de rearings

efetuados (B) por camundongos no teste do hole board durante 10 minutos de observação. As barras

representam a média erro padrão da média. Cada grupo é constituído por 6-12 animais. ***

p≤0,001 vs.

controle + controle; ###

p≤0,001 vs. metilfenidato + controle; #p≤0,05 vs. metilfenidato + controle.

ANOVA de duas vias seguida do teste de LSD.

A figura 8 mostra a porcentagem da distância percorrida no centro em relação à

distância total percorrida (A) e o tempo gasto no centro do tabuleiro (B) pelos animais

no hole board durante os 10 minutos de teste. O metilfenidato aumentou

significativamente a distância percorrida no centro do aparato. O pré-tratamento com

valproato na dose de 300 mg/kg preveniu significativamente o aumento da porcentagem

de tempo gasto no centro induzido pelo metilfenidato (ANOVA de duas vias, pré-

tratamento com valproato: F(2,64) = 3,08, p≤0,05), e tal efeito também tende a ser

prevenido pelo pré-tratamento com a dose de 400 mg/kg (p=0,07).

Quanto ao tempo gasto no centro do tabuleiro, não houve diferença entre

nenhum dos grupos testados, embora haja uma tendência, novamente, que o grupo

controle + metilfenidato seja significativamente diferente do grupo controle + controle

(p=0,06).

B)

47


5

10

15

20

25controle


#*

*

Pré-tratamentos

Dis

tân

cia

pe

rco

rrid

a n

o c

en

tro

(%

)

0-1

0 m

in


20

40

60

80

100controle


Pré-tratamentos

Tem

po

gasto

no

cen

tro

(s)

0-1

0 m

in


400 mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal, na distância percorrida (A) e no tempo gasto (B) no

centro do tabuleiro por camundongos no teste do hole board durante 10 minutos de observação. As barras

representam a média erro padrão da média. Cada grupo é constituído por 6-12 animais. *p≤0,05 vs.

controle + controle e #p≤0,05 vs. metilfenidato + controle. ANOVA de duas vias seguida do teste de LSD.

Devido a um efeito ansiolítico já descrito na literatura para o valproato, e

levando em conta os resultados encontrados, onde a dose de 300 mg/kg foi capaz de

aumentar a atividade exploratória tanto horizontal quanto vertical dos animais sem

afetar o número de interações com os buracos do tabuleiro, foi incluído no estudo um

grupo experimental tratado com diazepam 1 mg/kg (0,1 ml/10g), um fármaco ansiolítico

clássico, a fim de avaliar o efeito deste tratamento no comportamento dos animais no

hole board e servir de comparação para os demais grupos aqui estudados.

A figura 9 mostra a quantidade de interações dos animais nos furos do centro

(A) e periferia (B), a distância total percorrida (C), quantidade de rearings (D), distância

A)

B)

48

percorrida no centro (E) e tempo no centro (F) durante os 10 minutos de teste pelos

animais tratados com diazepam em comparação ao grupo controle.

0

5

10

15

20

25

salina

diazepam 1 mg/kg

Nº

de in

tera

çõ

es n

o c

en

tro

0-1

0 m

in

0

20

40

60

80

100

*

Nº

de in

tera

çõ

es n

a p

eri

feri

a

0-1

0 m

in

0

5

10

15

20

25

*

Dis

tân

cia

to

tal p

erc

orr

ida (

m)

0-1

0 m

in

0

5

10

15

Nº

de r

eari

ng

s

0-1

0 m

in

0

5

10

15

20

Dis

tân

cia

pe

rco

rrid

a n

o c

en

tro

(%

)

0-1

0 m

in

0

10

20

30

40

50

60**

Tem

po

gasto

no

cen

tro

(s)

0-1

0 m

in

Figura 9. Efeito do tratamento com diazepam na dose de 1 mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal,

nas interações com os furos do centro (A) e da periferia (B) do aparato durante os 10 minutos de

observação no teste do hole board. As barras representam a média erro padrão da média. Cada grupo é

constituído por 6-12 animais. *p≤0,05 vs. controle;

**p≤0,01 vs. controle. Student teste T independente.

Como podemos ver no gráfico, o tratamento com diazepam foi incapaz de

modificar a quantidade de interações com os furos centrais (A), ao passo que aumentou

A) B)

C) D)

F) E)

49

significativamente a quantidade de interações com os furos da periferia (B). Em (C),

podemos ver a atividade exploratória horizontal, mensurada pela distância total

percorrida e em (D), a vertical, mensurada pela quantidade de rearings. Como já

esperado, devido ao seu efeito ansiolítico, o diazepam foi capaz de aumentar

significativamente a locomoção dos animais, enquanto que, com relação ao número de

rearings, não houve diferenças entre os grupos. Em (E), podemos ver a porcentagem da

distância percorrida no centro em relação à distância total percorrida, onde nota-se que

não houve mudança de perfil do animal em decorrência da administração de diazepam

e, em (F), o tempo gasto no centro do tabuleiro do hole board pelos animais, que foi

significativamente aumentado no grupo que recebeu diazepam em relação ao controle.

3.3 Etapa III – Avaliação dos efeitos comportamentais de um agonista do receptor

NOP em camundongos submetidos ao modelo animal de mania induzido por

metilfenidato no hole board

Para a avaliação dos efeitos do peptídeo nociceptina/orfanina FQ (N/OFQ) em

animais submetidos ao hole board, foi seguido o mesmo protocolo da etapa II, apenas

substituindo-se a administração ip de valproato pela administração icv do peptídeo nas

doses testadas.

Primeiramente foi feita a caracterização do perfil apresentado pelos animais

após a injeção da N/OFQ. As doses testadas foram as de 1 e 0,1 nmol, por via icv (2µl).

A figura 10 mostra o padrão de exploração dos furos do tabuleiro no centro

(A) e na periferia (B) a distância total percorrida (C), quantidade de rearings (D),

distância percorrida no centro (E) e tempo no centro (F) durante os 10 minutos de teste

50

pelos animais que receberam as diferentes doses de N/OFQ. Não houve diferença entre

os grupos testados em nenhum dos parâmetros mensurados.

0

10

20

30

controle

N/OFQ 0,1 nmol

N/OFQ 1 nmol

Nº

de in

tera

çõ

es n

o c

en

tro

0-1

0 m

in

0

20

40

60

80

100

Nº

de in

tera

çõ

es n

a p

eri

feri

a

0-1

0 m

in

0

5

10

15

20

25

DIs

tân

cia

to

tal p

erc

orr

ida

(m)

0-1

0 m

in

0

10

20

30

Nº

de r

eari

ng

s

0-1

0 m

in

0

5

10

15

20

Dis

tân

cia

pe

rco

rrid

a n

o c

en

tro

(%

)

0-1

0 m

in

0

20

40

60

80

Tem

po

gasto

no

cen

tro

(s)

0-1

0 m

in

Figura 10. Efeito do tratamento com N/OFQ nas doses de 0.1 e 1 nmol, por via intracerebroventricular,

na quantidade de interações com os furos no centro (A) e periferia (B) do tabuleiro no teste do hole board

durante 10 minutos de observação. As barras representam a média erro padrão da média. Cada grupo é

constituído por 6-12 animais. ANOVA de uma via.

A) B)

C) D)

F) E)

51

Após a caracterização do perfil apresentado pelos animais que receberam o

peptídeo nas duas doses, a próxima etapa foi testar a associação deste com o

metilfenidato a fim de verificar se a sua administração prévia, assim como a do

valproato na etapa anterior, também seria capaz de prevenir as alterações causadas pelo

metilfenidato nos animais.

Na figura 11, são apresentados os resultados da avaliação da quantidade de

interações com os furos no centro (A) e periferia (B) do tabuleiro pelos animais durante

os 10 minutos de teste. Não foram encontradas diferenças entre os grupos pré-tratados

com N/OFQ que posteriormente receberam metilfenidato e o grupo controle +

metilfenidato em nenhum dos dois parâmetros (ANOVA de duas vias, tratamento com

metilfenidato: F(1,64) = 10,51, p≤0,05).

controle N/OFQ 0.1 nmol N/OFQ 1 nmol0

10

20

30

40

50controle

metilfenidato 10 mg/kg***

Nº

de in

tera

çõ

es n

o c

en

tro

0-1

0 m

in


30

60

90

120

controle


Pré-tratamentos

Nº

de in

tera

çõ

es n

a p

eri

feri

a

0-1

0 m

in

A)

B)

52

Figura 11. Efeito do tratamento com metilfenidato 10 mg/kg (0,1 ml/10g) associado com N/OFQ nas

doses de 0,1 e 1 nmol (2µl), por via intracerebroventricular, na quantidade de interações dos

camundongos com os furos no centro (A) e periferia (B) do tabuleiro no teste do hole board durante 10

minutos de observação. As barras representam a média erro padrão da média. Cada grupo é constituído

por 6-12 animais. ***

p≤0,001 vs. controle + controle. ANOVA de duas vias seguida do teste de LSD.

A figura 12 mostra a distância total percorrida (A) e a quantidade de rearings

efetuados (B) pelos grupos analisados no hole board durante os 10 minutos de teste.

Percebe-se que a N/OFQ, nas duas doses, não foi capaz de prevenir o aumento da

locomoção total induzido pelo metilfenidato, como podemos ver em comparação com o

grupo controle + metilfenidato (ANOVA de duas vias, tratamento com metilfenidato:

F(1,64) = 24,86, p≤0,05). Quanto ao número de rearings, também não houve diferença

entre ambos os grupos que receberam N/OFQ e metilfenidato e o grupo controle +

metilfenidato (ANOVA de duas vias, tratamento com metilfenidato: F(1,64) = 7,18,

p≤0,05).


10

20

30

40

salina


***

**

Pré-tratamentos

DIs

tân

cia

to

tal p

erc

orr

ida

(m)

0-1

0 m

in


10

20

30salina


**

Pré-tratamentos

Nº

de r

eari

ng

s

0-1

0 m

in


doses de 0,1 e 1 nmol (2µl), por via intracerebroventricular, na distância total percorrida (A) e quantidade

A)

B)

53

de rearings (B) no teste do hole board durante 10 minutos de observação. As barras representam a média

erro padrão da média. Cada grupo é constituído por 6-12 animais. *p≤0,05 vs. controle + controle e

**p≤0,01 vs. controle + controle. ANOVA de duas vias seguida do teste de LSD.

A figura 13 mostra a porcentagem da distância percorrida no centro em relação

à distância total percorrida (A) e o tempo gasto no centro do tabuleiro (B) pelos animais

durante os 10 minutos de teste. A administração de metilfenidato conseguiu induzir um

aumento significativo na distância percorrida no centro em comparação ao grupo

controle (ANOVA de duas vias, tratamento com metilfenidato: F(1,48) = 12,73, p≤0,05).

Já com relação ao tempo gasto no centro, não houve diferenças entre os grupos N/OFQ

+ metilfenidato, nas duas doses, e o grupo controle + metilfenidato.


5

10

15

20

25

***


controle

*

Pré-tratamentos

Dis

tân

cia

pe

rco

rrid

a n

o c

en

tro

(%

)

0-1

0 m

in


20

40

60

80

100controle


Pré-tratamentos

Tem

po

gasto

no

cen

tro

(s)

0-1

0 m

in


doses de 0,1 e 1 nmol (2µl), por via intracerebroventricular, na distância percorrida (A) e tempo gasto

(B) no centro do tabuleiro por camundongos submetidos ao hole board durante 10 minutos de

observação. As barras representam a média erro padrão da média. Cada grupo é constituído por 6-12

animais. *p≤0,05 vs. controle + controle e

***p≤0,001 vs. controle + controle. ANOVA de duas vias

seguida do teste de LSD.

A)

B)

54

A tabela 5 apresenta um resumo dos resultados encontrados em todos os

experimentos. As comparações da tabela são feitas com o grupo controle, exceto nos

tratamentos que envolveram associações de fármacos, onde a comparação é feita em

relação ao grupo controle + metilfenidato 10 mg/kg.

55

Tabela 5: Resumo dos efeitos das substâncias testadas no hole board.

Interações Locomoção Exposição ao risco

Tratamento Interações

centrais

Interações

periféricas

Horizontal

total

Vertical

(rearings)

Distância

no centro

(%)

Tempo

no

centro

Metilfenidato

10 mg/kg

Valproato

300 mg/kg

Valproato

400 mg/kg

Diazepam 1

mg/kg

N/OFQ 0,1

nmol

N/OFQ 1

nmol

Valproato

300 mg/kg +

metilfenidato

Preveniu as

alterações

causadas

pelo metil-

fenidato

Não

preveniu as

alterações

causadas

pelo metil-

fenidato

Não

preveniu as

alterações

causadas

pelo metil-

fenidato

Preveniu as

alterações

causadas

pelo metil-

fenidato

Preveniu as

alterações

causadas

pelo metil-

fenidato

Preveniu as

alterações

causadas

pelo

metil-

fenidato

Valproato

400 mg/kg +

metilfenidato

Preveniu as

alterações

causadas

pelo metil-

fenidato

Não

preveniu as

alterações

causadas

pelo metil-

fenidato

Não

preveniu as

alterações

causadas

pelo metil-

fenidato

Preveniu as

alterações

causadas

pelo metil-

fenidato

Preveniu as

alterações

causadas

pelo metil-

fenidato

Preveniu as

alterações

causadas

pelo

metil-

fenidato

N/OFQ 0,1

nmol +

metilfenidato

Não

preveniu as

alterações

causadas

pelo metil-

fenidato

Não

preveniu as

alterações

causadas

pelo metil-

fenidato

Não

preveniu as

alterações

causadas

pelo metil-

fenidato

Não

preveniu

as

alterações

causadas

pelo metil-

fenidato

Não

preveniu

as

alterações

causadas

pelo metil-

fenidato

Não

preveniu

as

alterações

causadas

pelo

metilfe-

nidato

N/OFQ 1

nmol +

metilfenidato

Não

preveniu as

alterações

causadas

pelo metil-

fenidato

Não

preveniu as

alterações

causadas

pelo metil-

fenidato

Não

preveniu as

alterações

causadas

pelo metil-

fenidato

Não

preveniu

as

alterações

causadas

pelo metil-

fenidato

Não

preveniu

as

alterações

causadas

pelo metil-

fenidato

Não

preveniu

as

alterações

causadas

pelo

metil-

fenidato

56

DISCUSSÃO

O presente estudo objetivou propor novos testes para avaliar o comportamento

do tipo maníaco em camundongos e, também, verificar se o sistema peptidérgico da

N/OFQ estaria, de alguma maneira, envolvido na mediação deste comportamento. Os

resultados aqui apresentados sugerem que o hole board é um teste que, além de ser

usado para a avaliação de comportamentos ansiosos, também pode ser usado para a

avaliação de comportamentos maníacos. Entretanto, não foi possível padronizar o

modelo da disfunção da enzima Na+/K

+-ATPase através da administração de ouabaína

usando camundongos como sujeitos experimentais.

A indução de um estado de mania em animais usando a ouabaína foi descrita

inicialmente em 2003 por El-Mallakh e colaboradores. Tal modelo baseia-se na


+-ATPase, a qual é fortemente inibida pela administração

desta substância (El-Mallakh et al. 2003). Este estudo, assim como vários subsequentes

que reproduziram este modelo (Riegel et al. 2009; Herman et al. 2007), usou ratos como

sujeitos experimentais. O motivo pelo qual não foi possível transpor o modelo para o

camundongo pode ser devido ao fato deste comportamento (hiperlocomoção induzida

por ouabaína) ser replicável apenas em ratos, como já descrito para outros modelos

animais (para revisão: Anders & Vielhauer 2007). Estudos anteriores mostram um

efeito hiperlocomotor em ratos nas concentrações de 10-2

M e 10-3

M (El-Mallakh et al.

2003; Riegel et al. 2009). Enquanto isso, em camundongos, a concentração de 10-2

M

promoveu morte dos animais e a de 10-3

M levou a um estado de pré-convulsão, o que

mostra que este é um efeito variável entre espécies e não pode ser extrapolado.

Antes de iniciar os testes com o hole board, a fim de assegurar que as doses de

metilfenidato e valproato utilizadas neste estudo eram capazes de, respectivamente,

57

mimetizar e prevenir um estado do tipo maníaco, foi utilizado o teste do campo aberto

para avaliar a hiperlocomoção induzida por metilfenidato. Como já esperado por seu

efeito estimulante descrito na literatura (Young et al. 2011; Barbosa et al. 2011), o

metilfenidato foi capaz de aumentar a locomoção total e diminuir o tempo de

imobilidade dos animais. No entanto, o pré-tratamento com valproato, apenas na dose

de 400 mg/kg, preveniu o efeito hiperlocomotor induzido pelo metilfenidato no teste do

campo aberto, enquanto que a dose de 300 mg/kg pareceu potencializar seu efeito

estimulante, resultado anteriormente descrito por Barbosa et al. (2011).

Interessantemente, este estudo também mostrou que a administração repetida (14 dias)

de valproato na dose 300 mg/kg, ao contrário da administração aguda, foi capaz de

prevenir o efeito hiperlocomotor causado pelo metilfenidato (Barbosa et al. 2011). Per

se, o tratamento com valproato, na dose de 300 mg/kg, levou a um aumento da distância

modificou a distância percorrida, mas, em contrapartida, aumentou significativamente o

tempo de imobilidade dos animais. Não podemos descartar que o valproato esteja

exercendo algum tipo de efeito psicoestimulante, resultado que seria similar ao já

observado em outros estudos usando drogas como a morfina, por exemplo, que apesar

de produzir efeitos sedativos em humanos, causa efeito hiperlocomotor em

camundongos (ver: Villareal et al., 1973), o que reforça a necessidade de validação

deste modelo com outros estabilizadores do humor, de modo a retirar este viés do

estudo. No entanto, já é sabido que o valproato, além de suas ações como

anticonvulsivante, também apresenta potencial ansiolítico, conforme demonstrado em

vários modelos (de Angelis 1995; Dombrowski et al. 2006), e que sua administração

leva a um aumento de 15 a 45% nos níveis cerebrais de GABA, que pode ser mais ou

menos pronunciado dependendo da região cerebral. Esta alteração deve-se à modulação

de enzimas envolvidas no metabolismo do GABA pelo valproato (Johannessen 2000) e

58

explicaria o aumento na locomoção promovido pela dose de 300 mg/kg. Porém, como

qualquer substância ansiolítica que atua potencializando a neurotransmissão

GABAérgica, altas doses de valproato podem promover efeito sedativo, o que

contribuiria para explicar o aumento do tempo de imobilidade dos animais tratados com

a dose de 400 mg/kg.

Nos anos 60, foi proposto o teste do hole board, onde, em geral, altos níveis de

head-dippings (imersão de cabeça no buraco do tabuleiro) são vistos como indicativos

de neofilia ou de um comportamento secundário a um efeito do tipo ansiolítico

(Crawley 1985; Takeda et al. 1998). Por conta desta observação, o hole board vem

sendo extensivamente usado para a pesquisa de compostos que apresentam potencial

ansiolítico através do registro de comportamentos relacionados à exploração do aparato,

como a atividade locomotora total e no centro, assim como as imersões de cabeça.

Sendo um ansiolítico clássico, já é esperado que o diazepam promova um

aumento na quantidade de interações com os furos do tabuleiro, como já demonstrado

em outros trabalhos onde essa substância, em doses similares, foi capaz de aumentar a

quantidade de head-dippings (Crawley 1985; Takeda et al. 1998). Ademais, a dose

utilizada promoveu efeito ansiolítico sem sedação nos animais, como foi evidenciado

pelo aumento na locomoção total.

Neste estudo, feito usando camundongos expostos ao hole board, podemos ver

que o metilfenidato foi capaz de aumentar a distância percorrida total, um indicativo de

hiperatividade; aumentar o tempo gasto no centro, o que pode ser interpretado como

aumento do comportamento de risco; aumentar a interação com os furos centrais e

periféricos do aparato, o que não parece estar relacionado a um efeito ansiolítico e, sim

à exacerbação de um comportamento dirigido a um objetivo específico; e diminuir a

59

quantidade de rearings, o que poderia ser interpretado como prejuízo no julgamento

daquela situação, visto que o animal deixa de explorar as paredes do aparato, local de

onde poderia surgir alguma situação aversiva, para se focar na exploração dos furos,

principalmente centrais, potencialmente perigosos. Pode-se sugerir que as alterações

comportamentais induzidas pelo metilfenidato no hole board estão relacionadas ao

efeito psicoestimulante da droga.

Com relação aos resultados obtidos pelos grupos submetidos ao tratamento

com valproato, pode-se ver, principalmente na dose de 300 mg/kg, um potencial

ansiolítico, e um certo potencial sedativo no grupo tratado com a dose de 400 mg/kg,

exatamente como encontrado no campo aberto. Para se comprovar que os efeitos

encontrados no grupo que recebeu valproato 300 mg/kg eram de fato devido a um certo

grau de ansiólise, foi feita a comparação com diazepam 1 mg/kg, porém, limitada

similaridade foi observada entre os grupos. Deste modo, não podemos descartar que os

efeitos induzidos pelo valproato per se sejam de caráter estimulatório.

A associação de valproato com metilfenidato, em ambas as concentrações

testadas, foi capaz de prevenir diversos efeitos causados pela administração de

metilfenidato em camundongos, com destaque para a quantidade de interações com os

furos centrais, de rearings e na porcentagem da distância percorrida no centro. Todavia,

os demais parâmetros, apesar de não serem seletivamente afetados por metilfenidato,

podem ajudar a dar um maior suporte ao quadro de mania, já que representam sintomas

que se assemelham aos experimentados por pacientes maníacos.

Este teste permitiu registrar um parâmetro que pode estar relacionado com um

comportamento comum nos estados de mania, que é o comportamento “dirigido a um

alvo”, como é o caso da interação com os furos centrais do tabuleiro. Este estudo

60

concluiu que o aumento das interações com os furos centrais e a diminuição na

quantidade de rearings são os principais aspectos que permitem diferenciar um

comportamento do tipo ansiolítico de um comportamento maníaco neste teste, já que,

conforme demonstrado, a administração de diazepam foi incapaz de aumentar a

quantidade de interações dos animais com os furos centrais e não teve efeito sobre a

quantidade de rearings. Quanto ao uso do hole board como um teste para avaliação do

comportamento exploratório, alguns trabalhos já o utilizaram com este intuito, inclusive

com o uso de estabilizadores do humor como o lítio e o valproato. Tais trabalhos

mostraram que ambas as drogas per se, dependendo da dose, diminuem a quantidade de

head-dippings por parte do animal (Rao et al. 1991; O’Brien et al. 2004). Entretanto,

nenhum trabalho até hoje testou o uso destas substâncias no hole board após a indução

de um estado de mania. Nosso trabalho é inovador por propor um novo teste para o

estudo de um comportamento relacionado ao estado de mania e demonstrar a sua

prevenção com o uso de um estabilizador do humor.

A padronização do uso do hole board para o estudo da mania é de grande

importância, visto que a maioria dos modelos foca em um ou outro aspecto deste estado,

como, por exemplo, o modelo da hiperlocomoção induzida por psicoestimulantes ou o

modelo do residente-intruso (usado para visualizar a ocorrência de comportamentos

agressivos). O uso do hole board, contudo, permite a avaliação de diversos

comportamentos que, juntos, permitem traçar um quadro semelhante ao de mania em

animais. Os comportamentos avaliados podem ser divididos em 3 grandes classes:

comportamentos dirigidos a um alvo específico (mensurado pela quantidade de

interações com os furos), comportamento locomotor (locomoção horizontal e vertical) e

exposição ao risco (tempo gasto e porcentagem da distância percorrida no centro). Os

resultados obtidos com a administração de metilfenidato remetem aos sintomas

61

apresentados pelos pacientes num estado de mania, de acordo com a classificação do

DSM-V, visto que o animal apresenta um aumento das interações com os furos, tanto

centrais como periféricos (aumento da atividade dirigida a objetivos); aumento da

locomoção horizontal (agitação psicomotora); diminuição da locomoção vertical

(prejuízo no julgamento); e aumento da porcentagem de distância percorrida e do tempo

no centro (exposição a situações de risco) (DSM-V, 2013). Além disso, o estudo

permitiu inferir que alguns comportamentos foram seletivamente prevenidos (aumento

das interações com os furos no centro, diminuição na quantidade de rearings e aumento

da porcentagem de distância percorrida no centro) pela administração prévia de

valproato, um estabilizador de humor largamente usado na clínica e, portanto, tais

comportamentos podem ser considerados o “carro-chefe” deste teste.

Sendo assim, este estudo deu as primeiras evidências de que o hole board é um

teste potencialmente apto a apresentar validade aparente (mostra semelhança com os

sintomas observados na mania), preditiva (o teste responde a um fármaco usado no

tratamento da mania) e de construto (reproduz a etiologia e a fisiopatologia da doença).

Além disso, é um teste barato e de fácil execução, podendo ser adotado sem problemas

pela maioria dos laboratórios. Cabe ressaltar, no entanto, que os nossos estudos ainda

necessitam ser expandidos e é necessário verificar o perfil de outras substâncias usadas

no tratamento da mania (por exemplo: antipsicóticos atípicos, lítio, carbamazepina) para

que se possa estender a validação preditiva deste teste. Apesar das suas vantagens,

entretanto, o nosso teste ainda conta com a limitação comum aos demais modelos

disponíveis até hoje, que é a de conseguir focar apenas em um dos polos do transtorno

bipolar, não sendo apto para avaliar o quadro de depressão. Mais esforços precisam ser

empregados neste sentido, de modo a promover a descoberta de um modelo ideal para a

pesquisa do transtorno bipolar nas suas duas fases.

62

O presente estudo também avaliou o potencial da N/OFQ em prevenir os

efeitos do tipo maníacos induzidos pelo metilfenidato no hole board. Os dados sugerem

que a N/OFQ, nas doses testadas, não é capaz de modificar o quadro induzido pela

administração de metilfenidato em animais e, por isso, não é eficaz na prevenção de um

quadro de mania.

Das várias ações causadas pela administração de N/OFQ em animais, uma das

que mais se destacam é o seu potencial ansiolítico, como demonstrado em vários

estudos, inclusive nas doses de 0,1 e 1 nmol (Mogil & Pasternak 2001; Gavioli & Calo';

2006). Não obstante, no nosso estudo, essas doses foram incapazes de modificar o

comportamento dos animais no hole board. Corroborando nossos resultados, um estudo

de 2004, objetivando avaliar os efeitos da N/OFQ no comportamento exploratório de

animais no hole board, encontrou efeito ansiolítico apenas na dose de 0,01 nmol do

peptídeo, que estaria relacionado ao aumento do turnover de serotonina no hipocampo

(Kamei et al. 2004). Deste modo, pode-se considerar que o teste do hole board não

parece ser sensível o suficiente para detectar o efeito ansiolítico já descrito para a

N/OFQ.

Referente aos resultados da associação N/OFQ e metilfenidato, nosso estudo

mostrou que ambas as doses testadas do peptídeo são incapazes de prevenir os efeitos

causados pelo metilfenidato.

De acordo com os resultados encontrados, um possível direcionamento para

esta pesquisa seria o teste com um antagonista do sistema da N/OFQ, de forma a

verificar definitivamente o seu papel na mediação de um estado de mania.

Em vários trabalhos anteriores, mostrou-se que o sistema da N/OFQ está

envolvido na depressão e ansiedade (Gavioli et al., 2003, 2004; Gavioli & Calo', 2006;

63

Redrobe, Calo', Regoli, & Quirion, 2002; Vitale et al., 2009). Porém, até o presente

momento, nenhum trabalho havia pesquisado o efeito deste sistema em modelos de

mania. A pesquisa sobre o papel dos peptídeos como alvos terapêuticos para doenças é

de suma importância para o desenvolvimento de novos fármacos que permitam um

melhor controle das doenças ainda sem um fármaco que trate todas as suas fases, como

no caso do transtorno bipolar, e também pelas vantagens com relação à afinidade e

seletividade de ligação ao receptor quando comparados com os sistemas de

neurotransmissores clássicos, que são os alvos de praticamente todos os fármacos

utilizados na clínica até hoje.

64

CONCLUSÃO

Por fim, tomados em conjunto, os resultados deste trabalho apontam para uma

nova abordagem na pesquisa da mania, através do uso do hole board, e potencialmente

descarta o efeito anti-maníaco da nociceptina/orfanina FQ, um agonista do receptor

NOP. Porém, mais estudos necessitam ser feitos, com outros fármacos estabilizadores

do humor, a fim de expandir a validação deste teste. Outro ponto que necessita de mais

estudos é o da avaliação do potencial anti-maníaco do sistema da N/OFQ, através do

teste com antagonistas do receptor NOP, de modo a elucidar completamente a

participação deste sistema na fisiopatologia da mania.

65

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