FFI0776�FFI0776��� Modelagem�e�Modelagem�e�ggEngenharia�de�ProteínasEngenharia�de�Proteínas

Prof.�Rafael�V.�C.�GuidoProf.�Rafael�V.�C.�Guidoid @if bid @if brvcguido@ifsc.usp.brrvcguido@ifsc.usp.br

Bacharelado em Ciências Físicas e BiomolecularesBacharelado em Ciências Físicas e BiomolecularesBacharelado�em�Ciências�Físicas�e�BiomolecularesBacharelado�em�Ciências�Físicas�e�BiomolecularesInstituto�de�Física�de�São�Carlos�Instituto�de�Física�de�São�Carlos��� USPUSP

ObjetivosObjetivos

• Mecanismo�de�Inibição�de�EnzimasP ã d Mi M lé l• Preparação�de�Micro�e�Macromoléculas

• Docagem�Molecular• Exemplo�de�Aplicação

modelagem molecularmodelagem molecularMecanismoMecanismo dede inibiçãoinibiçãoçç

modelagem molecularmodelagem molecularSítioSítio dede ligaçãoligação –– InibidorInibidor competitivocompetitivo

GAPDHLeishmania mexicana

g çg ç pp

Leishmania mexicana

IC50 = 4 µM

Suresh et al J Mol Biol 2001 309 423 435

inibidor competitivo

modelagem molecularmodelagem molecularSítioSítio dede ligaçãoligação –– InibidorInibidor nãonão--competitivocompetitivo

RNA Polimeraseí h tit Cvírus hepatite C Sítio

catalítico

Sítio de ligaçãoligação

IC = 0 93 µMIC50 = 0,93 µM

L t l J Vi l 2003 77 7575 7581

inibidor não competitivo

modelagem molecularmodelagem molecularMecanismoMecanismo dede inibiçãoinibiçãoçç

[I] = 9 µM== VVmaxmax

�� KK

1/V [I] = 5 µM

�� KKMM

[I] = 0 µM

[I] = 3 µM

[I] = 0 µM

1/[substrato]

Inibidor competitivoInibidor competitivo

ééPreparação�de�macro�e�micromoléculas�Preparação�de�macro�e�micromoléculas�para docagem molecularpara docagem molecularpara�docagem�molecularpara�docagem�molecular

IdentificaçãoIdentificação dada cavidadecavidade dede ligaçãoligaçãoçç g çg ç

A áli d l i t l áfi• Análise de complexos cristalográficos– Ligante-macromolécula

A áli t t l ti• Análise estrutural comparativa– membro conhecido da superfamília da macromolécula em

complexo com um ligantecomplexo com um ligante

SeleçãoSeleção dada geometriageometriaçç gg

• Macromoléculas possuem alto grau de liberdadep ginterno

• Flexibilidade determina o fenômeno conhecidoFlexibilidade determina o fenômeno conhecidocomo mudança conformacional– Local– Local

• envolvem apenas as cadeias laterais de resíduos de aminoácidos (e.g., rotâmeros estruturais)( g )

MudançaMudança conformacionalconformacional

Global - rearranjo conformacional da estrutura terciária da macromoléculaGAPDH�� tetrâmero GAPDH�� monômero

Domínio de ligação do NADDomínio de ligação do NAD++GAPDH

Domínio de ligação do substratoDomínio de ligação do substratoGAPDH

MoléculasMoléculas dede águaáguagg

Moléc las de ág a poss em papel importante em• Moléculas de água possuem papel importante emsistemas macromoleculares, estando presentes emaproximadamente 70% dos complexos cristalográficosaproximadamente 70% dos complexos cristalográficos

PreparaçãoPreparação dede ligantesligantesp çp ç gg• Ligantes

é– moléculas pequenas que se ligam nas cavidades de interação de macromoléculas

E t t 3D d li t d b tid• Estruturas 3D dos ligantes devem ser submetidas a um processo de minimização de energia conformacional

ValidaçãoValidação dosdos resultadosresultadosçç• Estruturas cristalográficas de receptores alvo em

l li t d dcomplexo com ligantes podem ser empregadas noprocesso de validação do modo de interação propostopelo método de docagem molecularpelo método de docagem molecular

• Valores de rmsd menores que 2 Å são consideradossatisfatóriossatisfatórios

��������������������������

DocagemDocagem molecularmoleculargg

MétodoMétodo queque consisteconsiste nana prediçãopredição dodo modomodo dedeMétodoMétodo queque consisteconsiste nana prediçãopredição dodo modomodo dedeligaçãoligação dede pequenaspequenas moléculasmoléculas nono sítiosítio dede ligaçãoligaçãodede macromoléculasmacromoléculas alvoalvo comcom subseqüentesubseqüentedede macromoléculasmacromoléculas alvoalvo comcom subseqüentesubseqüenteavaliaçãoavaliação ee classificaçãoclassificação dosdos modosmodos dede ligaçãoligaçãopropostospropostospropostospropostos..

DocagemDocagem molecularmoleculargg

• A docagem molecular foi introduzida no início da década de 80, e d d tã t t d l li ã í i di i ldesde então tem encontrado ampla aplicação em química medicinale biologia estrutural, sendo, portanto, uma ferramenta de grande valor em projetos de planejamento de fármacos

Kuntz, I. D.; Blaney, J. M.; Oatley, S. J.; Langridge, R.; Ferrin, T. E. A geometric approach to macromolecule–ligand interactions. J. Mol. Biol., 161, 269–288, 1982

DocagemDocagem molecularmoleculargg

• Criação de modelos de interação entre o compostos líder e ç ç po receptor

• Otimização de compostos líderes cujo modo de interação é conhecidoconhecido

• Identificação de novos compostos (Triagem virtual)

ProgramasProgramas parapara docagemdocagem molecularmoleculargg pp gg

• Uma das etapas mais importantes desta estratégia deUma das etapas mais importantes desta estratégia demodelagem molecular é a escolha do programa de docagemg

• ~ 30 programas disponíveis

U dê i li ê• Uso acadêmico livre:DOCK 6.0Autodock

• Uso acadêmico pago;GOLDFlexXAutodock

FTDOCK (MULTIDOCK)ZDOCK

FlexXFlexEDockVisionZDOCK DockVision

DocagemDocagem molecularmoleculargg

• O processo de docagem molecular pode ser p g pdividido em duas etapas fundamentais– determinação do modo de ligação– predição da afinidade do ligante pelo sítio de interação

predição da afinidadepredição da afinidade

modo de ligação

DocagemDocagem molecularmolecularggAmostragemAmostragemPontuaçãoPontuaçãoClassificaçãoClassificação ComplementaridadeComplementaridade

11°° 22°°Estéreo

66°° Química55°°

33°° 44°°

sítio de ligação

ligante

sítio de ligação

DeterminaçãoDeterminação dodo modomodo dede ligaçãoligaçãoçç g çg ç

Métodos de gerar “todos” os

complexos possíveisModo de interação

amostragem

çatribuem flexibilidade

as moléculas

• (i) métodos sistemáticos– construção incremental, amostragem conformacional

• (ii) métodos aleatórios ou estocásticos– Monte Carlo, algoritmo genético

• (iii) métodos de simulação( ) ç– dinâmica molecular e minimização de energia

FunçãoFunção dede buscabuscaçç

O d d l l l id• Os programas de docagem molecular, em geral, consideram que amolécula do receptor é rígida, enquanto que a molécula do ligantepode ter uma flexibilidade parcial;

• Essa flexibilidade é traduzida através da variação dos ângulostorsionais do ligante;

ângulos torsionais docagem

minimizada “biotiva”

modelagem molecularmodelagem molecularFunçãoFunção dede buscabuscaFunçãoFunção dede buscabusca

• O processo de reconhecimento• O processo de reconhecimentomolecular é um processo tridimensionaltridimensional

Mínimaenergia

bioativa

FunçãoFunção dede buscabuscaçç

PrediçãoPredição dada afinidadeafinidade dede ligaçãoligaçãoçç g çg ç

avaliam e classificamavaliam e classificamos modos de ligação

propostosFunções de pontuação propostos

• (i) campos de força– métodos de mecânica molecular capazes de quantificar

i i t d i t õ li t ta energia proveniente das interações ligante-receptor• (ii) empíricas

– ajuste teórico de equações (regressão linear) que reproduzem dados experimentais

• (iii) com base no conhecimento– funções que utilizam dados estatísticos dos potenciais

d tô i d i t ãde pares atômicos de interação

modelagem molecularmodelagem molecularMecânicaMecânica molecularmolecular

F õ d t ã l t i t õ• Funções de pontuação que levam em conta as interaçõesintermoleculares descritas por termos clássicos da mecânica molecularmolecular

�� ���

distância de ligação

�

��

�

ligação

ângulo de ligação

ângulo torsional

Interação de Interaçãovan der Waals eletrostática

modelagem molecularmodelagem molecularMétodosMétodos empíricosempíricospp

• Dados ajustados a partir de um conjunto de complexos cristalográficos cujo Ki foi determinado experimentalmente;– ligante-enzima– proteína-proteínap p– antígeno-anticorpo

�G= �Gvdw�(Aij/rij12 – Bij/Rij

6) + �Ghbond�E(t) (Cij/rij12 – Dij/rij

10) +

G / ( ) G N G ( V V ) ( /2 )�Gelet� qiqj/�(rij)rij + �GtorNtor + �Gsol�(SiVj + SjVi)e(-r/2 )

f ã d i b d d f AMBERfunção de energia baseada no campo de força AMBER (AUTODOCK)

modelagem molecularmodelagem molecularComCom basebase nono conhecimentoconhecimento

• Funções que utilizam dados estatísticos dos potenciais de ç q ppares atômicos de interação, os quais são derivados de conjuntos de dados provenientes de complexos cristalográficos entre ligantes e proteínas

modelagem molecularmodelagem molecularValidaçãoValidação dosdos resultadosresultadosçç

• Estruturas cristalográficas de receptores alvo eml li t d dcomplexo com ligantes podem ser empregadas no

processo de validação do modo de interação propostopelo método de docagem molecularpelo método de docagem molecular

• Valores de rmsd menores que 2 Å são consideradossatisfatóriossatisfatórios

TuberculoseTuberculose

TuberculoseTuberculose

DistribuiçãoImpacto Global çGlobal

pMortes: 2 milhões/ano

H3COCO

HO

OH O

Agente EtiológicoMicobacterium tuberculosis

rifampicina

NH

OH

H3CO

3cobacte u tube cu os s

TratamentoN

N

NOH

O

OO

(a)

• Parcialmente eficaz;• Diversas limitações:

N

O O

NH2

(a)Diversas limitações:• falta de adesão do paciente • longos regimes prescritos N

N

NH2

N

NNH2

H

(b) (c)

longos regimes prescritos• resistência• toxicidade ( ) ( )• toxicidade

pirazinamida isoniazida

Proteína�Tirosina�Proteína�Tirosina�FosfataseFosfatase A�(A�(PtPAPtPA))

• Fator�de�virulência�do�M.�tuberculosisM lé l i l• Molécula�essencial�para�o�desenvolvimento�intracelular

• A�inibição�da�PtpA�determina�redução significativa na taxa deredução�significativa�na�taxa�de�crescimento�do�M.�tuberculosisMM�=�18�kDa

Identificação�de�InibidoresIdentificação�de�Inibidores

Ki = 3 µM Ki = 5 µM Ki = 15 µMi µ

Ki = 10 µMKi =13 µM

Mecanismo�de�InibiçãoMecanismo�de�Inibição

Ki = 3 µM

InibidoresInibidores Competitivos

Mascarello et al Bioorg Med Chem 2010 18 3783-3789

Modelagem�MolecularModelagem�Molecular

5aKi =�3�μM

4aKi =�15�μM

Mascarello et al Bioorg Med Chem 2010 18 3783-3789

Atividade�Atividade�in�vitroin�vitro

Macrófagos THP-1 infectados com a cepa de M tuberculosis H37RvMacrófagos THP 1 infectados com a cepa de M. tuberculosis H37Rv

Mascarello et al Bioorg Med Chem 2010 18 3783-3789