optimizando el cultivo in vitro · a) sólo para observar fecundación y en el momento de la...
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Optimizando el cultivo in vitro
M.ª José Moyano Gallego
LABCLIN2019
Proceso reproductivo
Posibilidad de perpetuarse a través de sus descendientes
Acercamiento físico entre gametos
Participación
Ovocito, eje hipotálamo-hipófisis-ovario; espermatozoide; aparato genital femenino hasta la porción ampular de la trompa. FECUNDACIÓN.
Formación del embrión + Recorrido por la trompa hasta útero. IMPLANTACIÓN Y PLACENTACIÓN.
Alteraciones de la fertilidad durante la edad reproductiva. ESTERILIDAD E INFERTILIDAD
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15% de la población
Varón: 25-30%
Edad avanzada mujer: principal causa actual
>50% inician “edad reproductiva social” pasada “edad reproductiva biológica”
70% mujeres de 35 años no tienen hijos
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Primeras técnicas de reproducción
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Unida a la historia de la Humanidad
Finales del siglo XIX- principios del XX salto exponencial
Finales del XIX primeras inseminaciones
1868: “The microscope as an Aid in the diagnosis and Treatment of Sterility” (Sims)
1884: Primer caso confirmado de IADLABCLIN2019
1944: ASRM y primeras FIV experimentales (sin transferencia)
1950: primeros embarazos con semen criopreservado
1958: primeras inducciones ováricas satisfactorias
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1966: obtención de primeros ovocitos por laparoscopia, monitorización de la ovulación y primeros procedimientos de micromanipulación de gametos en animales
25 de julio de 1978: nacimiento de Louise Brown (1984 en España)
1983: primeras ovodonaciones
1988: SUZI y PZD
1992: ICSI y primer nacido libre de Fibrosis Quística gracias al DGP
La enfermera experta en embriología Jean Marian Purdy en plena faena en el laboratorio.
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Breve descripcion de las TRA
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Recursos de tratamiento de los trastornos de la fertilidad.
Conjunto amplio de procedimientos caracterizados por la actuación directa sobre los gametos
Colaboración estrecha de profesionales con formación clínica (ginecólogos, andrólogos), especialistas en técnicas de laboratorio destinadas a evaluación y tratamiento de espermatozoides, ovocitos y embriones (Embriólogos clínicos)
Personal de apoyo: psicólogos y personal de enfermeríaLABCLIN2019
Modalidad más adecuada a cada caso.
Diagnóstico, características particulares (mujeres sin pareja masculina, pacientes sin función ovárica): alternativas terapéuticas: relación más adecuada entre beneficios, complejidad, costes y riesgos.
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1. Inseminación artificial con semen de la pareja (IAC)
2. Inseminación artificial con semen de donante (IAD)
3. Fecundación in vitro (FIV) y microinyección espermática (ICSI)
4. Diagnóstico genético preimplantacional (DGP)
5. Extracción espermática
6. Donación de ovocitos
7. Preservación de la fertilidadLABCLIN2019
La fecundación in vitro revolucionó el enfoque del tratamiento de la esterilidad
propició el desarrollo de varias técnicas derivadas y complementarias
han mejorado la eficacia de la fecundación in vitro convencional
han permitido ampliar extraordinariamente el conocimiento sobre las causas de la esterilidad humana
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Permite fecundar un óvulo con un espermatozoide fuera del útero.
Fecundación in vitro (FIV)
Microinyección intracitoplasmática espermática (ICSI)
Cuando se consigue fecundación y desarrollo in vitro de los embriones obtenidos, se selecciona el más adecuado de éstos para ser transferido al útero, con el objeto de conseguir una gestación evolutiva.
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MEDIOS DE CULTIVO
¿Cuál es la función de un buen sistema de cultivo?
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Imitar lo más aproximadamente posible el entorno natural de los embriones en cada estadio.
Favorecer el desarrollo embrionario.
Proteger a los embriones de infecciones: antibiótico de amplio espectro no embriotóxico.
Permitir que se pueda seleccionar de forma más precisa el embrión con mayor potencial de implantación.
Evitar la formación excesiva de ROS y con ellos la oxidación y los posibles efectos deletéreos exógenos.
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Un medio de cultivo subóptimo puede producir un desarrollo disfuncional del embrión o incluso un bloqueo total del mismo.
Las necesidades nutritivas varían durante todo este tiempo
Fuente de energía: lactato, piruvato,glutamina, glucosa
Aminoácidos: síntesis de proteínas, sustratos energéticos, regulación del pH (esenciales y no esenciales)
Macromoléculas: HSA
EDTA: – disminuye el bloqueo en el
estadio de dos células – facilita el desarrollo a
blastocisto– se une a cationes
divalentes contaminantes – purifica el medio de cultivo – mantiene la actividad de la
adenilciclasa, (formación del blastocele).
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1-8 células Más de 8 células
Baja actividad metabólica Alta actividad metabólca
Piruvato fuente de energía Glucosa fuente de energía
Aminácidos no esenciales Aminácidos no esenciales y esenciales
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Evolución de medios de cultivo
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Hasta los anos 80 los embriologos fabricaban los medios de cultivo de forma casera.
Limitados controles de calidad.
En los años 80: sencillos: una solución salina y una fuente de energía (HTF médium), o bien suplementado con aminoácido adicionales (a.a), vitaminas y precursores de ácidos nucleicos (Menezo et al., 1984; Quinn et al., 1985; Quinn, 1995; Paolo et al., 2004; Patrick, 2004; Tomas et al., 2004).
A finales de 1990, Gardner y Lane (Gardner; Lane, 2002): importancia de los aminoácidos esenciales y no esenciales junto con las vitaminas en la fase de postcompactación para el desarrollo hasta blastocisto. LABCLIN2019
2. MEDIOS DE CULTIVOA. FORMULACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVOMedios simplesi) Human tubal fluid (HTF)ii) HTF modificadoiii) Earle's balanced salt solution (EBSS)iv) P1 (preimplantation stage one)Medios compuestosi) Ham's F-10ii) Minimal essential medium (MEM)iii) Menezzo B2
B. PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVOi) Ham's F-10 o MEM
C. MEDIOS PREPARADOS DE FABRICA
D. NUEVOS MEDIOS DE CULTIVO PARA SUSTENTAR EL DESARROLLO IN VITRO
E. PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS PARA LAS DISTINTAS ETAPAS DE UN PROCEDIMIENTO DE REPRODUCCION ASISTIDA.i) aspiraciónii) inseminacióniii)crecimientoiv)transferencia
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Primer medio de cultivo comercial: Medicult® (Dinamarca)
No han dejado de producirse distintos medios de cultivo especificos
para cada tecnica.
La comercializacion de los medios de cultivo ha creado un mercado de gran competencia.
Estrictos controles de calidad, minimizando las diferencias entre lotes y la contaminacion (Karamalegos y Bolton, 1999; Quinn, 2004).
Desde 2013 todos los medios de cultivo producidos en la Union Europea (UE): marcado CE (ConformiteEuropeene) y se testa su embriotoxicidad pasando ensayos de tipo MEA (Mouse embryo assay). .
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Tipos de cultivo in vitro
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CocultivoLABCLIN2019
Cultivar zigotos o embriones de 2-4 blastómeras, sobre una monocapa de células, hasta el estadio de blastocisto.
Dos tipos celulares diferentes para formar la monocapa:
tejido embrionario (trofoblasto), para ayudar al embrión a través de un efecto autocrino
células del tracto genital femenino (epitelio endometrial), para asistir al embrión mediante un efecto paracrino (hormonas)
Gran difusión hasta el año 2000 aprox.
Basado en la interacción recíproca entre el embrión y la monocapa de células soporte.
– Las células del co-cultivo producen sustancias beneficiosas que son liberadas al medio
– Eliminan sustancias embriotóxicas del mismo, producidas por el metabolismo del embrión a lo largo de su desarrollo (Juan, 1999).
Permite unas buenas tasas de desarrollo hasta blastocisto pero técnicamente es de difícil adaptación a la rutina del laboratorio de reproducción asistida.
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Cultivo secuencial
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Cultivar los embriones en dos medios comerciales químicamente definidos
Basado en las necesidades metabólicas, nutricionales y distintas concentraciones de metabolitos que hay a lo largo del recorrido que realiza el embrión in vivo (Gardner et al., 2002a; Paolo et al., 2004)
Adecuan su formulación a las necesidades nutritivas que presenta el embrión en su desarrollo.
Se basa en el cambio de piruvato por glucosa para incrementar la demanda de energía para el desarrollo hasta blastocisto (Macklon et al 2002).
El primer medio está diseñado para el desarrollo del zigoto hasta el estadio de 8 células, mientras que el segundo soporta el desarrollo desde el embrión de 8 células hasta el estadio de blastocisto.
Otra tendencia: todos los posibles nutrientes deben estar en el medio sin grandes alteraciones o cambios en su concentración; los gametos y los embriones van utilizando los metabolitos a medida que los van necesitando,
para lo que se utiliza los llamados “medios únicos”.
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¿Es el medio secuencial es superior al medio unico?
A) Los medios únicos aún no han alcanzado los resultados obtenidos con los secuenciales.
B) Los medios únicos pueden hoy día sustituir completamente a los secuenciales.
C) Los medios únicos son igual de efectivos que los secuenciales pero cambiando los embriones igual que si se tratara de secuenciales.
D) Sólo debemos usar los medios únicos con sistema Time-Lapse y en hipoxia
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¿Es el medio secuencial es superior al medio unico?
A) Los medios únicos aún no han alcanzado los resultados obtenidos con los secuenciales.
B) Los medios únicos pueden hoy día sustituir completamente a los secuenciales.
C) Los medios únicos son igual de efectivos que los secuenciales pero cambiando los embriones igual que si se tratara de secuenciales.
D) Sólo debemos usar los medios únicos con sistema Time-Lapse y en hipoxia
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Aunque los medios secuenciales son suficientes para soportar el desarrollo preimplantacional de un embrion hasta estadio de blastocisto no es necesario su empleo y pueden reemplazarse por un protocolo con medio unico sin renovacion del mismo.
La unica justificacion de la renovacion del medio seria para eliminar las sustancias toxicas acumuladas en el medio y derivadas de los plasticosempleados.
Otros equipos argumentan que los cambios en las condiciones de cultivo crean un estres adicional al embrion.
No existe una evidencia solida a dia de hoy sobre la superioridad del medio secuencial (Basile et al., 2012; Quinn, 2012).
Actualmente esta adquiriendo popularidad el medio unico gracias a la tecnologia time-lapse cuyo fundamento no se entiende sin el uso de este tipo de medio.
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Cultivo en condiciones de hipoxia
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Tradicionalmente, los embriones se han cultivado bajo concentraciones de oxígeno atmosférico (20%) (Thompson, 1990), probablemente porque el cultivo a concentraciones bajas necesita gastos adicionales.
Más recientemente se ha producido un cambio hacia el uso de concentraciones bajas de oxígeno (5%) ya que estas concentraciones tienen una mayor semejanza con la concentración de oxígeno en condiciones naturales (2% al 8%). (6% CO2, 5% de O2 y 90% de N2)
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Incubadores
Louise Brown sostiene el contenedor donde fue incubado su embrión después que el óvulo de la madre se fertilizara con el esperma del padre en un “Petri Dish”, o platillo de Petri.
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TRIGASLABCLIN2019
¿Cuántas veces al día debemos mirar los embriones durante su desarrollo?
A) Sólo para observar fecundación y en el momento de la transferencia o vitrificación.
B) Varias veces al día para ver cómo van evolucionando.
C) Todos los días de cultivo para así ir informando a la pareja.
D) Se puede todos los días, pero cada laboratorio puede establecer sus protocolos según cada caso.
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¿Cuántas veces al día debemos mirar los embriones durante su desarrollo?
A) Sólo para observar fecundación y en el momento de la transferencia o vitrificación.
B) Varias veces al día para ver cómo van evolucionando.
C) Todos los días de cultivo para así ir informando a la pareja.
D) Se puede todos los días, pero cada laboratorio puede establecer sus protocolos según cada caso.
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Menos manipulaciones:
Menos estrés
Más observaciones:Mejora la selección
No manipulación delcultivo bajo estrictocontrol ambiental
Observación contínua
¿Solución?
DILEMA
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Time lapse
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Tecnologia Time-Lapse: los incubadores llevan incorporado un microscopio con una camara de fotos de alta resolucion que posibilita la valoracion del desarrollo del embrion sin tener que sacarlo del incubador.
Permite detectar el momento en el que suceden diferentes cambios en el embrion: aparicion y desaparicion de los pronucleos, tiempo transcurrido entre las diferentes divisiones celulares. ..
Estos datos pueden relacionarse con la calidad del embrion, su capacidad de implantacion y desarrollo evolutivo. (Parámetros morfocinéticos)
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Todo lo descrito en la literatura habla de resultados con
patrones de división y los distintos estudios que validan esos
modelos, pero ninguno nombra en profundidad las
especificaciones propias de cada sistema
La eleccion de la plataforma queda sujeta al usuario, ya que todas tienen ventajas y desventajas, y se debe elegir aquella que mejor se adapte a la estructura del laboratorio.
Rev Iberoam Fert Rep Hum ⁄ Vol. 32 no 4 Octubre-Noviembre-Diciembre 2015 LABCLIN2019
No todo son ventajas a la hora de hablar del método de Time-Lapse:
El embrión es una estructura móvil que se desplaza dentro del medio que lo contiene, por lo que se puede hacer difícil mantener el embrión continuamente en la misma posición, dentro del campo de visión del microscopio.
¿Burbujas?
Otro de los problemas asociados a esta técnica es que los embriones son también muy sensibles a la luz pudiendo causar daños en el DNA, liberación de radicales libres o sobrecalentamiento del embrión en determinadas zonas.
No se ha observado aun que esta técnica aporte diferencias significativas en el porcentaje de embriones de buena calidad comparándola con el método de clasificación tradicionalLABCLIN2019
¿Mejor opción?
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Actualmente, a nivel mundial más de 3.500000 neonatos han nacido por medio de los procedimientos de las técnicas de fecundación in vitro.
Uno de los principales retos de las investigaciones en medicina reproductiva es optimizar el éxito del tratamiento con estos procedimientos y una de estas áreas se ha centrado en la mejoría del ambiente in vitro al cual se exponen los embriones humanos antes de la implantación en el útero.
Cada laboratorio debe elegir los medios y la tecnología que más se adecuen a sus protocolos de trabajo, tipo de pacientes, tipo de laboratorio, número de ciclos….
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MUCHAS GRACIAS...
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