ocorrência do trypanosoma conorrhini em barbeiros e em...

275Deane, M. P. Ocorrência do Trypanosoma conorrhini em barbeiros e em rato na cidade

de Belém, Pará, e seu cultivo em meio de NNN

* Publicado originalmente em Revista do Serviço Especial de Saúde Pública, Rio de Janeiro,v. 1, n. 2, p. 433 - 448, jul. 1947.

Ocorrência do Trypanosoma conorrhini embarbeiros e em rato na cidade de Belém,Pará, e seu cultivo em meio de NNN*

Deane, M. P.Laboratório Central do Programa da Amazônia, Serviço Especial de Saúde Pública

Durante os meses de julho a outubro de 1946, váriosexemplares de triatomídeo nos foram trazidos pelo dr. Pedro Rosadoque nos relatou tê-los apanhado à noite em sua residência, sôbre a mesade refeições ou de trabalho, para onde os insétos eram aparentementeatraídos pela luz elétrica. Verificamos tratar-se de Triatomarubrofasciata (De Geer, 1773), espécie de distribuição cosmopolita eque já havia sido assinalada no Estado do Pará. Mandamos umfuncionário do laboratório procurar mais exemplares do triatomídeona casa do dr. Rosado, que fica situada no bairro chamado Cidade Velha,na parte litorânea da cidade de Belém. No fôrro do telhado da casaforam capturadas, entre as vigas das paredes, mais três ninfas deTriatoma rubrofasciata, tendo o funcionário lá enviado, nos relatadoque vira muitos outros espécimens do mesmo inséto que não puderaapanhar por se terem êles refugiado nas frestas e vãos das paredes. Emdezembro de 1946 o dr. E. Serra Freire que reside no mesmo bairro epróximo ao dr. Rosado, trouxe-nos um exemplar adulto, macho, domesmo triatoma, apanhado nas mesmas condições que os primeirosque nos foram trazidos.

276 Memórias do Instituto Evandro Chagas: Parasitologia

Examinando material colhido do reto dêsses triatomídeos,verificamos em elevada proporção de exemplares, a presença de umtripanosomídeo com fórmas em critídia e muitos tripanosomas curtos,com grande blefaroplasto, semelhando fórmas metacíclicas doSchizotrypanum cruzi (Chagas) e do Trypanosoma conorrhini(Donovan), em barbeiros.

Inoculamos êsse material em camondongos brancos e emalguns obtivemos infecções relativamente intensas, por um tripanosomacom as características das fórmas sanguícolas do Trypanosomaconorrhini (Est. 2, Figs. 16 a 18; Est. 4, Figs. 1 a 8)

Visto ser o Trypanosoma conorrhini um parasita de ratos,resolvemos tentar verificar a ocorrência de infecção natural entre êssesroedores. Para isso mandamos colocar uma ratoeira no fôrro da casado dr. Rosado e, no dia 18 de novembro, foi capturado um rato fêmeaque foi trazido vivo ao laboratório, onde foi identificado como Rattusrattus alexandrinus e onde tomou o número 67. Seu sangue, examinadoa fresco repetidas vêzes, foi sempre negativo para flagelados. No dia25 do mesmo mês êsse rato foi sugado por cinco ninfas de Triatomainfestans, uma ninfa de Panstrongylus megistus e duas ninfas e umadulto de Rhodnius prolixus, todos criados em laboratório e livres deprévia infecção; no dia 17 de dezembro dissecamos e examinamos duasninfas de T. infestans, uma de P. megistus e uma ninfa e um adulto deR. prolixus, tendo encontrado critídias e alguns tripanosomassemelhando as fórmas metacíclicas do Trypanosoma conorrhini, emuma das ninfas de infestans. Êste material foi inoculado emcamondongos brancos que dois e três dias depois mostraram, no sangue,tripanosomas idênticos ao conorrhini. Os demais barbeiros que sugaramo rato nº 67 a 25.11.46, foram dissecados entre os dias 4 e 9.1.1947,tendo sido todos positivos para fórmas evolutivas do Trypanosomaconorrhini. Várias outras vêzes foram feitos xenos no mesmo rato,tendo o tripanosoma evoluido em tôdas as três espécies de triatomídeosacima referidas e ainda em Triatoma rubrofasciata criados em



laboratório. Ainda em dezembro de 1946, a rata 67 pariu seis filhotesque foram utilizados para experimentação, como se verá depois.

Vinte camondongos brancos, um rato branco e três filhotesda rata nº 67 foram inoculados com material proveniente de barbeiros(Triatoma rubrofasciata) natural ou experimentalmente infectados. Doscamondongos, 15 eram jovens, de três a quatro semanas, e cinco eramadultos; em 11 dos jovens e em dois dos adultos encontraram-se,posteriormente, tripanosomas no sangue examinado a fresco. O númerode tripanosomas vistos no sangue dos animais jovens foi sempre maior(20 ou mais por laminula), e frequentemente se poude encontrar osflagelados com facilidade em lâminas de sangue estiradas e coradas.Também o rato branco era jóvem e, tanto no seu sangue como no dosfilhotes da rata nº 67, os tripanosomas foram relativamente abundantes.Desconhecemos se essa maior riqueza estaria em relação com a idadedos animais ou si, por coincidência, tais animais foram inoculados commaterial contendo um número maior de tripanosomas metacíclicos.

Vários dos tripanosomas sanguícolas e das fórmasencontradas no intestino posterior de barbeiros, foram desenhados emcâmara-clara ou fotografados, e alguns dêsses desenhos e fotos ilustramesta nota. Por êles se verá que a morfologia do flagelado corresponde àque tem sido descrita para Trypanosoma conorrhini.

Como outros trabalhos nos prendiam mais especialmente aatenção no momento, não nos foi possível fazer observações diárias edetalhadas dos animais inoculados. Tanto quanto pudemos observar,entretanto, esses animais não apresentaram em vida ou post-mortem,sintomas ou lesões que pudessem ser atribuidas à uma ação patogênica doflagelado. Os tripanosomas, aparecendo em geral no sangue periférico nosegundo ou terceiro dia após a inoculação intraperitoneal de materialinfectante, aí se mantinham, sòmente por poucos dias, em número suficientepara que a sua presença pudesse ser evidenciada por exame de sangue afresco. Os xenos foram, porém, positivos em vários animais nos quais ainfecção sanguínea já não era aparente, ou nunca o tinha sido.


Nunca encontramos fórmas evolutivas ou de multiplicaçãodo tripanosoma em órgãos (fígado, baço, medula óssea, músculocardíaco) ou no sangue dos animais inoculados e sacrificados em temposvariáveis após a inoculação.

Afim de verificar a possibilidade da ocorrência de infecçãocongênita ou através da amamentação, fizemos repetidos exames desangue e xenos nos três filhotes da rata nº 67 que não foram inoculadose em cinco filhotes de um camondongo que pariu 24 dias após ter sidoinoculado, todos com resultados negativo.

CULTURA DO TRYPANOSOMA CONORRHINI

Em trabalho publicado em 1943, E. DIAS e CAMPOSSEABRA1 dizem que “tentativas até agora realisadas por outrospesquisadores no sentido de cultivar o Trypanosoma conorrhini a partirde sangue de animais infectados, têm sido negativas”. Nêsse trabalhoos autores não se referem a tentativas pessoais de obter culturas dotripanosoma e desconhecemos qualquer publicação posterior de autoresnacionais sôbre êsse assunto. Entretanto, quando já tínhamos quasepronta esta pequena nota, recebemos o número de fevereiro de 1947 deThe Journal of Parasitology que traz uma comunicação de ELEANORM. JOHNSON2 sôbre o cultivo do Trypanosoma conorrhini, em meiode Senekjie, a partir de sangue de animais inoculados com material deintestino de Triatoma rubrofasciata infectados e provenientes das ilhasHawaii.

Nós também conseguimos cultivar o Trypanosomaconorrhini com bastante facilidade, usando o meio de NNN e partindode sangue de camondongos e ratos infectados. Escolhemos de inícioanimais com parasitismo sanguíneo mais acentuado, os quaissangravamos a branco por punção cardíaca, semeando o sangue assimcolhido e diluido em um pouco de solução salina ou líquido de Ringer,em tubos com meio de NNN recentemente adicionados de sangue frescodesfibrinado, de coelho. Os tubos foram conservados à temperaturaambiente, depois de os termos protegidos de dessecação rápida por



pequenas capas de borracha colocadas sôbre as buchas de algodão. Empoucos dias pode-se observar abundância de flagelados em forma decritídia, muito móveis, isolados ou aglomerados em ativa multiplicação.Nesta fase as critídias são geralmente muito alongadas comblefaroplasto em bastonete colocado bem adiante do núcleo, e curtamembrana ondulante. Em regra, do 15º dia em diante já predominamcritídias mais curtas com blefaroplasto mais arredondado efrequentemente situado ao lado e mais ou menos para traz do meio donúcleo. Já se pode então vêr tripanosomas, semelhantes às fórmasmetacíclicas que aparecem no intestino posterior dos barbeiros: muitocurtas, recurvadas, com blefaroplasto bem posterior e volumoso,redondo, núcleo alongado, muitas vêzes com a extremidade posterioracolada ao blefaroplasto, flagelo acolado ao corpo do protozoário ecom curta porção livre. Estas fórmas apresentam movimentoscaracterísticos, já descritos por outros autores: não se deslocamfàcilmente como as critídias, porém executam rápidos movimentosvermiculares sur place. Culturas examinadas do 20º dia em diantemostravam tripanosomas mais frequentes, embora nunca tivessemosobservado culturas com grande predominância dessas fórmas.

Vários camondongos inoculados com material de barbeirosinfectados, e em cujo sangue nunca se encontrou tripanosomas emexames a fresco deram culturas positivas. O próprio rato nº 67, doqual, como já foi acima mencionado, repetidos exames diretos foramsempre negativos, forneceu culturas ricas, 20 dias após ter sidosacrificado e seu sangue semeado em tubos com meio de NNN.

As culturas foram várias vêzes repicadas com sucesso emostraram sempre grande vitalidade mesmo em tubos acidentalmentecontaminados por bacterias ou fungos.

Culturas de 13 dias inoculadas em camondongosproduziram infecção que não foi evidenciada por exame de sangue afresco dêsses animais, mas o foi por xenos feitos 22 e 42 dias após ainoculação. Uma cultura de 19 dias inoculada em dois outros


camondongos produziu em um dêles infecção que foi evidenciada pelapresença de tripanosomas no sangue examinado a fresco.

Na Estampa 1, damos um esquema que mostra algumasdas passagens sofridas no laboratório pela raça de T. conorrhini isoladado rato 67.

SUMÁRIO

Foram recebidos para identificação alguns exemplares detriatomídeo apanhados em residências do bairro da Cidade Velha emBelém, Pará e que verificamos serem Triatoma rubrofasciata (De Geer,1773), espécie já anteriormente assinalada no Estado. Examinandomaterial colhido do réto dêsses barbeiros verificamos a presença deflagelados que, pela morfologia apresentada no inséto e pelas fórmassanguícolas posteriormente encontradas em camondongos brancosinoculados, foram identificados como Trypanosoma conorrhini(Donovan, 1909).

Foi capturado vivo um rato fêmea no fôrro de uma dasresidências em que vários exemplares de Triatoma rubrofasciata tinhamsido apanhados; o sangue dêsse rato (Rattus rattus alexandrinus) foisempre negativo para flagelados em repetidos exames a fresco, mas oxenodiagnóstico feito com barbeiros criados em laboratório foi váriasvêzes positivo para um flagelado com fórmas metacíclicascaracterísticas do Trypanosoma conorrhini, tendo sido isso confirmadopor inoculação em camondongos e ratos brancos, das fézes dos insétosque serviram para xenos.

Partindo do sangue de animais inoculados em laboratórioe do rato encontrado com infecção natural, conseguimos cultivar comfacilidade o Trypanosoma conorrhini em meio de NNN; as culturasmostraram quase sempre grande vitalidade e subculturas teem sidomantidas com sucesso. Em geral do 15º dia em diante começam aaparecer nas culturas pequenos tripanosomas muito semelhantes àsfórmas metacíclicas encontradas nos barbeiros. Culturas inoculadasem camondongos produziram infecção.



Consideramos de certo interêsse a verificação da infecçãonatural do rato e de Triatoma rubrofasciata, em Belém, peloTrypanosoma conorrhini, por causa da facilidade com que se podeconfundir as fórmas metacíclicas dêste tripanosoma com as doSchizotrypanum cruzi. Êste fato deve ser tido em mente não só quandose está examinando barbeiros colhidos em natureza como tambémquando se pratica o xenodiagnóstico para procura de infecções pelo S.cruzi em animais silvestres ou domésticos. Não é impossível que opróprio T. conorrhini seja encontrado em outros animais, ou que outrasespécies de tripanosoma sejam transmitidas por triatomídeos eapresentem nestes insétos fórmas evolutivas também semelhantes àsdo S. cruzi.

SUMMARY

Several kissing-bugs found in houses of the Cidade Velhasection in Belém (Pará), and brought to the laboratory for identification,were found to be the cosmopolitan species Triatoma rubrofasciata (DeGeer, 1773), previously reported in the State. Examination of fecalmaterial taken from the rectum of the insects revealed infection by aTrypanosomidae which, through inoculation in white mice, proved tobe Trypanosoma conorrhini (Donovan, 1909).

One rat was caught alive in the ceiling of one of the housesin which infected Triatoma rubrofasciata had been found. This ratdesignated in the laboratory by the number 67 was identified as Rattusratus alexandrinus; although his blood was always negative by directexamination of fresh cover slip preparations, he was found to be infectedby Trypanosoma conorrhini through xenodiagnosis; not only were theflagellates seen in fecal material of bugs which had fed on the rat, butalso typical trypanosomes were found in blood of mice infected byinjection of such material.


Cultures of Trypanosoma conorrhini were easily obtainedin NNN medium, from blood of mice or rats infected in the laboratoryand from blood of rat number 67, found naturally infected. Althoughcultivation was more often attempted when the blood infection washigher, cultures were also obtained from animals in which directmicroscopic examination of blood had been always negative or hadbeen previously positive only for a few days. Cultures are beingmaintained successfully in laboratory through subculturing.

When working with Chagas’s disease, one should keep inmind not only the frequency with which Triatoma rubrofasciata is foundnaturally infected with Trypanosoma conorrhini, but also the possibilityof other species of Triatomidae being infected with the sametrypanosome. Also, when performing xenodiagnosis of wild or domesticanimal with the purpose of finding infections by Schizotrypanum cruzi,we think it would be safer to inoculate laboratory animals with theflagellates found in the intestine of the bugs, so as to be able to studythe blood trypanosomes and be sure of their identity.



REFERÊNCIAS

1 DIAS, E. e CAMPOS SEABRA, C. A. — Sôbre oTrypanosoma conorrhini, hemoparasito do rato transmitido peloTriatoma rubrofasciata. Presença do vector infectado na cidade do Riode Janeiro. Mem. Inst. O. Cruz, 39 (3), 1943.

2 JOHNSON, ELEANOR M. — The cultivation ofTrypanosoma conorrhini. The Jour. of Parasit., 33 (1), 1947.


Estampa 1

Diagrama mostrando algumas passagens sofridas emlaboratório pela amostra de Trypanosoma conorrhini isolada de umrato (n.º 67) naturalmente infectado.



Estampa 2

Desenhos em câmara-clara de fórmas evolutivas do Trypanosomaconorrhini

(legenda no verso)


Figs. 1 a 15 – Fórmas encontradas no tubo intestinal de uma ninfa do Triatomainfestans, 45 dias após ter sugado um rato (nº 67) naturalmente infectado; lâminastratadas por sôro sanguíneo após fixação e coradas pela Giemsa.

Figs. 16 a 18 – Tripanosomas encontrados no sangue periférico de um camondongo,oito dias após inoculação de fézes de dois exemplares de Triatoma rubrofasciatanaturalmente infectados. Lâmina estirada, coloração pelo Leishman.



Estampa 3

Desenhos em câmara-clara de fórmas vistas em cultura do Trypanosomaconorrhini em meio de NNN. Lâminas tratadas por sôro sanguíneoapós fixação e coradas pelo Giemsa.

(legenda no verso)


Figs. 1 a 9 – Critídias encontradas em cultura de seis dias. Notar o tamanho do flageladoe a localização do blefaroplasto, bem anterior em relação ao núcleo.

Figs. 10 a 22 – Fórmas vistas em cultura de 15 dias. Notar as fórmas de transição,com blefaroplasto situado ao lado (Figs. 15, 16, 17, 18), ou já para traz (Figs. 12, 13)do núcleo. Núcleo situado algumas vêzes muito posteriormente, como nas Figs. 11 e13. As figuras 20-22 mostram típicos tripanosomas metacíclicos, iguais aos encontradosno intestino posterior de barbeiros infectados.



Estampa 4

Microfotografias de fórmas sanguícolas do Trypanosoma conorrhini

(legenda no verso)


Fig. 1 – Tripanosoma em sangue de camondongo, no terceiro dia após inoculaçãointraperitoneal de material do réto de Triatoma rubrofasciata naturalmente infectado.(Lâmina estirada, corada pelo Leishman; aumento de cêrca de 850 x)

Figs. 2 a 8 – Tripanosomas no sangue do mesmo camondongo, no oitavo dia deinfecção. (Lâmina preparada da mesma maneira, aumento aproximadamente igual).

Fig. 9 – Tripanosoma no sangue de um rato branco, no 3º dia após inoculação defézes de uma ninfa de Triatoma rubrofasciata criada em laboratório e que havia sidoalimentada no rato nº 67, naturalmente infectado. (Gôta espêssa corada pelo Giemsa;aumento de cêrca de 1.000 x)



Estampa 5

Microfotografias de Trypanosoma conorrhini

(legenda no verso)


Figs. 1 a 6 – Fórmas em tripanosoma encontradas no intestino posterior de uma ninfade Triatoma infestans, 45 dias depois de ter sugado o rato nº 67, naturalmente infectado.Tôdas feitas com o mesmo aumento (cêrca de 720 x). Notar o diminuto tamanho dealgumas fórmas.

Fig. 7 –Aspécto de uma gôta de cultura de oito dias em meio de NNN, e obtidapartindo de sangue de um camondongo infectado com a amostra proveniente do rato67. Fotografia feita a fresco depois dos flagelados serem mortos pelo calor.



Estampa 6Microfotografias de Trypanosoma conorrhini em cultura de 20 diasem meio de NNN. Tôdas feitas com o mesmo aumento (cêrca de 720x). Preparações feitas misturando uma gôta de cultura com uma gôtade sôro sanguíneo, estendendo, secando ràpidamente, fixando peloálcool metílico e corando pelo Giemsa.

(legenda no verso)


Figs. 1, 2, 5, 10 e 11 – Critídias. Notar na Fig. 2 uma critídia com o blefaroplasto aolado do núcleo, já caminhando para uma posição posterior.

Fig. 3 – Uma forma com o blefaroplasto já bem posterior.

Figs. 4 e 12 – Tripanosomas metacíclicos ao lado de critídias.

Figs. 6 a 9 – Tripanosomas com a forma característica dos tripanosomas metacíclicos.

Notar as exíguas dimensões de alguns, como o da Fig. 8, por exemplo.

Fig. 18 – Um grupo de tripanosomas ao lado de uma critídia.

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