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- 1 - NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA

FARIAS, M. P. A.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA

Maria Patrícia Albuquerque de Farias

Recife, 2006

LABSINFA-UFPEFA-UFPE


FARIAS, M. P. A.

NOVOS DERIVADOS DA NITROFURAZONA: SÍNTESE, AVALIAÇÃO

DA TOXICIDADE AGUDA E ESTUDO DAS ATIVIDADES

ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA Aluna: Maria Patrícia Albuquerque de Farias Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Ciências Farmacêuticas do Departamento

de Ciências Farmacêuticas da Universidade

Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos

à obtenção do título de Mestre em Ciências

Farmacêuticas.

Área de concentração: Fármacos e Medicamentos.

Departamento de Ciências Farmacêuticas (UFPE)

Orientador: Prof. Dr. Dalci José Brondani Co-Orientador: Prfa. Dra. Ana Cristina Lima Leite

Recife, 2006


FARIAS, M. P. A.


FARIAS, M. P. A.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

REITOR

Dr. Amaro Henrique Pessoa Lins

VICE-REITOR

Dr. Gilson Edmar Gonçalves e Silva

PRÓ-REITORIA PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

Dr. Celso Pinto de Melo

VICE DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

Dr. Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros

CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Dra. Jane Sheila Higino

VICE-CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Samuel Daniel Sousa filho

COORDENADOR DO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

Dra. Miracy Muniz de Albuquerque

VICE-COORDENADOR DO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

Dr. Pedro José Rolim Neto


FARIAS, M. P. A.

O caráter e o destino de uma pessoa não é criado somente com base no

serviço que ela faz, mas com base em um coração verdadeiro e honesto.

Aqueles que fazem algo apenas intelectualmente ganham um nome.

Aqueles que fazem algo com seus corações ganham bênçãos.

Brahma Kumaris


FARIAS, M. P. A.

Dedico este trabalho

A Deus por sempre se fazer presente em mim, nas mais diversas formas de

força, perseverança e otimismo, Colocando sempre pessoas especiais e

importantes em minha vida, e como não poderia ser diferente, em um

momento

decisivo e final deste trabalho fez-se força em forma de criança: esta linda

criança que concebida em meu ventre, hoje soma alegria comigo: meu

primeiro filho (a).


FARIAS, M. P. A.

AGRADECIMENTOS

A Deus, que permite o somar de tantas vitórias ao longo de minha vida, sendo Ele força principal em cada nova conquista. Ao Prof. Dr. Dalci José Brondani, pela oportunidade de desenvolver este trabalho, por sua orientação, compreensão, confiança e amizade. A Profa. Dra. Ana Cristina Lima Leite, pelo apoio, amizade, companheirismo e incentivo em todos os momentos. A Profa. Dra. Ivone Antônia de Souza, pela realização dos testes de toxicidade aguda, além do carinho, grande incentivo, apoio e amizade. Aos companheiros de mestrado Elisangela e Aldo pela disposição na realização dos testes de toxicidade aguda, além do apoio e amizade. A Profa. Dra Milena B. P. Soares da Fiocruz Salvador-Ba, pela realização dos testes antichagásicos. Ao Prof Dr. Frederico C. L. Maia do Departamento de Medicina Veterinária da da UFRPE, pelas análises histopatológicas de diversos órgãos. A Profa. Dra. Maria Nely Caetano pela realização dos ensaios de atividade antimicrobiana frente às cepas de Staphylococcus aureus muti droga resistentes. A Rogério Ribeiro Soares pela execução dos ensaios de atividade antimicrobiana frente às cepas de Staphylococcus aureus muti droga resistentes. A Profa. Dra. Janete Magali, pela realização dos ensaios de atividade antimicrobiana. As mestrandas Vânia T. Lima e Rosa E. de A. da Silva, do departamento de antibióticos, pela execução dos ensaios de atividade antimicrobiana.


FARIAS, M. P. A.

Aos colegas do LabSinfa Diogo Moreira, Ana Célia, Cristiane Souza, Victor Hugo, Marcos Veríssimo, Fábio Fernandes, Flávio Ricardo, Lucas oliveira, Marcos Moraes pela convivência e incentivo. Ao mestrando Diogo Moreira, do Labsinfa, por toda dedicação, disposição, companheirismo e pelo grande incentivo profissional e emocional, no decorrer deste trabalho. Aos colegas do curso de mestrado e em especial a Cinthia Meireles, Sandra Guimarães, Ana Flávia, Kristiana Mousinho, companheiras de estudo, pela amizade e incentivo. Aos professores e funcionários do departamento de farmácia pela dedicação, amizade, convívio. A Ricardo Oliveira e Eliete Barros da central de química analítica pela realização dos espectros de infravermelho e ressonância magnética nuclear de hidrogênio e carbono. Aos meus pais, Seu céu e Dona Carminha, por serem sempre os primeiros incentivadores e torcedores de meus sonhos e conquistas. Aos meus amigos Ricardo O. de Moura e Diana J. N. Malta, pela fiel amizade cultivada desde o início de nossa graduação, que de tantos risos e choro partilhado juntos, nos tornou irmãos. Aos queridos amigos de graduação Diana, Ricardo, Andréa, Rebeka, Sandra, Victor, Bonifácio e George pelo convívio e amizade. A Dra Ádila Freitas pelo apoio incondicional, por ser instrumento da palavra e vontade de Deus em minha vida. A Profa. Dra Maria do Carmo Alves de Lima, a querida Nena, pela disposição num momento determinante da realização deste trabalho, pela dedicação, carinho e amizade.


FARIAS, M. P. A.

Ao meu irmão Pedro Farias, e toda minha família por todo apoio, carinho e incentivo em todos os momentos. A Marcos Rogério, meu fiel companheiro por tantos momentos difíceis, de puro descontrole emocional, que com muita sabedoria e amor soube contornar e transformar em força e apoio, cruciais para realização deste trabalho. A equipe da Pharma Face, farmácia de manipulação, dos bairros de Boa Viagem e Tacaruna, pelo respeito, apoio e carinho. A todos que diretamente ou indiretamente muito contribuíram para mais esta conquista em minha vida. A coordenação de aperfeiçoamento ao ensino superior-CAPES DF, pelo apoio financeiro, de grande contribuição no desenvolvimento deste trabalho.


FARIAS, M. P. A.

SUMÁRIO

Pág.

LISTA DE SIMBOLOGIA E ABREVIAÇÕES

RESUMO

ABSTRACT

CAPÍTULO 1 – Introdução, Revisão da Literatura e Objetivos

1. INTRODUÇÃO 16

1.1. Das Crenças a Ciência na Descoberta de Novas Drogas 17

1.2. Doenças Tropicais: Tripanossomíase Americana 22

1.2.1. Doenças Tropicais 22

1.2.2. Distribuição Geográfica e Epidemiológica da Doença de Chagas 23

1.2.3 Doença de Chagas no Brasil 23

1.2.4. Aspectos Morfológicos / Ciclo Biológico do Parasito 24

1.2.5. Fisiopatologia da Doença de Chagas / Sintomas 25

1.2.6. Patogenia da Doença de Chagas 28

1.2.7. Mecanismo de Transmissão / Diagnóstico 28

2. REVISAO DA LITERATURA 30

2.1. Nitrofurazona: Origem Sintética e Terapêutica 30

2.2. Otimização do Método de Síntese da Nitrofurazona 31

2.3. Síntese de Análogos da Nitrofurazona 32

2.4. Nitrofurazona e Derivados: Potentes Agentes Antimicrobianos 35


FARIAS, M. P. A.

2.5. Síntese e Avaliação de Agentes Tripanomicidas 38

2.5.1. Obtenção de Novos Fármacos através da Síntese Orgânica 38

2.6. O Grupo Nitro e sua Importância na Química Medicinal 41

3. OBJETIVOS 45

3.1. Objetivo Geral 45

3.2. Objetivos Específicos 45

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 46

CAPÍTULO 2 - Artigo 1

Synthesis and biological activities of N-alkyl nitrofurazone analogues 50

CAPÍTULO 3 - Artigo 2

Evaluation of Nitrofurazone and N 2 - alkyl- derivatives against

methicillin resistant Staphylococcus areus (MRSA) multi-drug resistance

70

CAPÍTULO 4

Conclusões e Perspectivas 78

CAPÍTULO 5

(anexos) 81


FARIAS, M. P. A.

LISTA DE SIMBOLOGIA E ABREVIAÇÕES

T. cruzi - Tripanossoma cruzi

IVTF – Espectrometria de Infravermelho com Transformada de Fourier

1 H-RMN – Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

13 C-RMN - Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13

Rf – Referência de Fase

TR – Tripanotiona Redutase

PQ – Primaquina

LLC-MK2 – célula epitelial renal de macaco Rhesus (Macaca mulata)

EOR – Espécies Oxigenadas Reativas

DL50 – Dose letal para 50%

IC50 – Concentração que inibe 50%

MRSA – Cepas de Staphylococcus aureus meticilina resistentes

VISA – Cepas de Staphylococcus aureus vancomicina intermediário

resistentes

DMF – Dimetilformamida


FARIAS, M. P. A.

NF – Nitrofurazona

SAR – Relação Estrutura Atividade

KBr – Brometo de Potássio

UV – Ultravioleta

NF01 – Derivado N 2 butil nitrofurânico

NF02 – Derivado N 2 pentil nitrofurânico

K2CO3 – Carbonato de potássio

Na2SO4 – Sulfato de sódio

p.f. – (ponto de fusão)

DMSO – Dimetilsufoxido

MIC – concentração mínima inibitória


FARIAS, M. P. A.

RESUMO

As infecções parasitárias causadas por protozoários patogênicos afetam mais de 3 bilhões

de pessoas em todo o mundo e representam um importante fardo de saúde e econômico.

Apesar do empenho no desenvolvimento de vacinas, a quimioterapia permanece o meio

isolado mais efetivo e barato de controlar a maioria das infecções microbianas e

parasitarias. Um derivado nitrofurano, a Nitrofurazona (5-nitro-2-

furfurilidenosemicarbazona) estudado inicialmente na década de 40, tem merecido destaque

por se tratar de um composto que possui atividade antimicrobiana de largo espectro de ação

contra microorganismos Gram-positivos e Gram-negativos, como também potente ação

para a forma aguda da doença de Chagas. Entretanto, este composto apresenta efeitos

tóxicos, além de baixa lipossolubilidade, o que requer maiores concentrações para obter

efeitos terapêuticos desejáveis. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi sintetizar,

mediante emprego da modificação molecular, fundamentada na homologação do protótipo

(Nitrofurazona), a obtenção e caracterização de novos derivados mais potentes e menos

tóxicos. Os novos derivados da Nitrofurazona foram sintetizados mediante a inédita

alquilação em meio aprótico, na posição N2 e N2,N4 da porção semicarbazona, com bons

rendimentos e grau de pureza. Os derivados N2-monoalquilados foram os mais ativos da

série, quanto à atividade antimicrobiana em ensaio in vitro frente a microorganismos

patogénos, revelando-se mais potente que o protótipo, principalmente para bactérias Gram-

positivos, incluindo cepas de S. aureus multi-resistentes (MRSA). A atividade

antichagásica foi determinada in vitro frente a forma epimastigota do T. cruzi, cepas Y, nos

quais os derivados N2,N4-dialquilados foram mais potentes que o protótipo. A toxicidade

aguda preliminar in vivo foi realizada para o derivado N2-monobutil (mais potente derivado

antimicrobiano), com DL50 = 186mg/kg, se revelando ligeiramente mais tóxico que o

protótipo; no entanto por ser este derivado mais lipossolúvel, seu transporte é facilitado

com maior poder de penetração celular. Os resultados obtidos foram bons, tanto no método

desenvolvido e rendimentos obtidos aos novos derivados, como também o aumento da

lipofília e a potencialização destes, frente a microrganismos e ao parasita T. cruzi.


FARIAS, M. P. A.

ABSTRACT

The parasitic infections caused by protozoary affect more than 3 billion people in the

worldwide and represent an important pack for economic and health. Despite the

persistence in the vaccine development, the chemotherapy it remains the more effective

isolated way and cheap to control the majority of the microbial and parasitic infections. The

nitrofuran derivative, Nitrofurazone (5-nitro-2-furfurilidenosemicarbazone) studied initially

in the decade of 40, has deserved prominence for dealing with a compound that possess

biological activity such as antimicrobials wide-specter of action against Gram-positives and

Gram-negative microorganisms, as also powerful action for the acute form of the Chagas’

disease. However, this compound presents severe collateral effect and weak liposolubility,

requiring great concentrations to get therapeutically effect. In this view, the objective of

this work was obtain, by principles of the molecular modification, based on the

homologation of the prototype (Nitrofurazone), the attainment and characterization of

compound more liposoluble, and consequently, more active and less toxic. The new

derivatives of the Nitrofurazone had been prepared by means of the new alkylation way in

aprotic solvents, in the position N2 and N2, N4 of the semicarbazone, with good yields and

degree of purity. The derivatives N2-monoalkylated had been most active of serie for

antimicrobial activity in assay in vitro against several microorganisms, showing more

potent than prototype, mainly for Gram-positives strains, including multi-drug resistant S.

aureus (MRSA). The antichagasic activity was determined in vitro against epimastigote

form of the T. cruzi, Y strain, in which the derivatives N2, N4-dialkylated had been more

active than the prototype. The preliminary toxic activity in vivo was carried through for the

N2-monobutyl derivative (more potent antimicrobial derivative), with LD50 = 186 mg/kg,

showing slightly more toxic than the prototype, however, more liposoluble, facilitating the

transport of this drug with larger power of crossing-cell. The gotten results had been good,

as much in the developed method and incomes gotten to the new derivatives, as well as the

increase of the lipofilia and the potencialization of this, against the microorganisms and to

parasite T. cruzi


FARIAS, M. P. A.

Capítulo 1

Introdução e Revisão da Literatura


FARIAS, M. P. A.

1. INTRODUÇÃO

1.1. Das Crenças a Ciência na Descoberta de Novas Drogas

As atividades terapêuticas têm, provavelmente a idade do sofrimento do homem

numa estreita relação com sua própria biologia. A capacidade do curador de prover alívio

das dores e dos desconfortos, assim como a cura das doenças era motivo de fascinação e

respeito entre os membros do seu grupo social. A ele atribuíam-se poderes místicos e

mágicos, a capacidade de confidenciar com os deuses, procurando através de sucessivas

experimentações empíricas, o sopro das inspirações divinas que pudessem aumentar a sua

capacidade de curar e obviamente de influenciar profundamente todos os membros do

grupo1 .

A evolução das buscas terapêuticas vem dos primórdios onde a observação casual e

as reflexões analógicas foram certamente as bases dos primitivos ensaios clínicos,

necessariamente simples e criativos 1 .

No século passado, com o desenvolvimento da química e ciências afins seu interesse

se voltou para o isolamento dos princípios ativos de plantas ou animais, responsáveis pela

atividade biológica neles observada. Os avanços sobretudo da química orgânica sintética e

da química analítica tornaram possível a síntese de moléculas antes provenientes de fontes

naturais e especialmente vegetais. Estima-se que tenham sido identificados até o presente,

mais de cinco milhões de substâncias químicas das quais cerca de 63.000 são de uso

corrente e dessas, aproximadamente 6.000 são fármacos 1 . O emprego crescente da

computação no planejamento de novos fármacos se constitui em perspectiva promissora na


FARIAS, M. P. A.

busca de alternativas terapêuticas especialmente para doenças cujos fármacos disponíveis

são ainda inadequados 1 .

No último século os dois grandes avanços da medicina e da farmacologia, que

inclusive mudaram de modo significativo o padrão de distribuição das doenças e da

mortalidade, são representados pelo desenvolvimento dos antibióticos e das vacinas. No

início do século XX, existiam poucos tratamentos eficazes ou medidas preventivas para as

doenças infecciosas 1 .

No final do século XIX, a busca para encontrar medicamentos menos tóxicos do que

aqueles baseados em fontes naturais resultaram na introdução de substâncias sintéticas que

atuam como fármacos e seu uso foi ampliado no século XX. O trabalho inclui o

desenvolvimento de análogos mais eficazes, menos tóxicos e mais seguros que os

compostos protótipos existentes, como os anestésicos locais benzocaína e procaína a partir

da cocaína (figura 1) 2 .

NCH3

COO CH3

O

CO

H2N

OO

CH3

H2N

OCH2CH2N(CH2CH3)2

O

Figura 1: Estrutura dos anestésicos locais: cocaína (A), e derivados sintéticos: benzocaína (B) e procaína (C)

Estima-se atualmente que para cada 10.000 compostos sintetizados, somente um é

comercializado 2 . O primeiro desenvolvimento racional de fármacos sintéticos foi

A B C


FARIAS, M. P. A.

realizado por Paul Ehrlich e Sacachiro Hata, que produziram a arsfenamina em 1910,

combinando a síntese com uma triagem biológica e processos de avaliação confiáveis. No

início do século XIX, Ehrlich reconhecera que tanto as propriedades benéficas como as

tóxicas de um fármaco eram de grande importância para a sua avaliação 2 .

Na década de 30 a descoberta do primeiro antibiótico representou um marco na

busca de novos fármacos e estimulou a pesquisa intensiva de substâncias com atividade

antibiótica. Mais de 6.000 antibióticos já foram isolados e identificados e a cada ano 100

novas alternativas são introduzidas no mercado 1 .

De maneira geral, os fármacos disponíveis na terapêutica moderna são em sua

ampla maioria de origem sintética (85%), considerando também aqueles oriundos de

processos de heme-sínteses como muitos antibióticos provenientes de intermediários

homoquirais preparados em processos fermentativos. Em 1999 o mercado mundial

totalizava 354 bilhões de dólares, sendo apenas 13 bilhões a fatia nacional 3 .

O Ácido Acetil Salicílico (Aspiririna), representou o primeiro fármaco sintético

desenvolvido em 1889; a partir de então muitos outros compostos foram desenvolvidos até

o presente momento 3 .

A química medicinal, área interdisciplinar do conhecimento, baseada na química,

mas também envolvendo princípios de biologia, medicina e ciências farmacêuticas,

preocupa-se no planejamento, identificação e preparação de compostos biologicamente

ativos, bem como o estudo de seu metabolismo. Assim, a química medicinal figura-se com

grande desafio para os pesquisadores que almejam contribuir para o avanço dessa área

multidisciplinar 2 .


FARIAS, M. P. A.

Apesar de todo arsenal terapêutico existente, pesquisadores do mundo inteiro se

unem na perspectiva constante de novas descobertas no que tange a cura ou melhoria das

enfermidades que atingem o Homem e sua existência.

Neste arsenal, destaca-se o estudo de fármacos relacionados a doenças causadas por

microorganismos e parasitas, devido a alta incidência de doenças microbianas como

também a crescente resistência destas aos fármacos existentes.

Mediante estes relatos, a incessante busca de novos e melhores medicamentos

antimicrobianos e antiparasitários são pesquisas incansáveis de renomados grupos de

estudo da microbiologia e parasitologia agregados a química medicinal, em grandes

laboratórios públicos e privados em todo o mundo.

A obtenção de novos fármacos se utilizando de técnicas de modificação molecular a

partir de protótipos é exemplificada segundo o fluxograma a seguinte (figura 2) 4

.

Figura 2: Fluxograma para obtenção de novos fármacos a partir de protótipos já estudados.

PROTÓTIPOS DE ATIVIDADE TERAPÊUTICA COMPROVADA

MODIFICAÇÃO ESTRUTURAL

SÍNTESE DE ANÁLOGOS

TESTES BIOLÓGICOS

RELAÇÃO ESTRUTURA - ATIVIDADE

TESTES BIOLÓGICOS


FARIAS, M. P. A.

Neste universo de candidatos a fármacos, os compostos heterocíclicos têm se

destacado por apresentarem propriedades biológicas diversas tais como: antimicrobiana 5 ,

tuberculostática in vivo 6, 7, antimicótica 8, virostática in vitro 9, analgésica 10, antipirética 10,

imunossupressora 11 dentre outras.

Dentro deste grupo merecem destaque os compostos sintéticos derivados dos

nitrofuranos (figura 3); heterocíclicos de cinco membros contendo o átomo de oxigênio em

seu anel; apresentam um largo espectro de ação antimicrobiana (contra bactérias Gram

positivas, Gram negativas, além de fungos leviduriformes e filamentosos) 12. Também muito

estudados como agentes antiparasitários de grande importância na erradicação da

tripanossomíase americana ou doença de Chagas no inicio do século XX 13 .

ONO2

Figura 3: Nitrofurano, núcleo protótipo para vários fármacos.

Tem sido evidenciado o efeito tóxico de alguns nitrofuranos, como a Nitrofurazona

(figura 4), porém sua estrutura química tem despertado interesse de pesquisadores em

química medicinal, por sua notável atividade antimicrobiana e antiparasitária 14 .

Devido as importantes ações biológicas e a ocorrência da toxicidade elevada, a

utilização de técnicas racionais de modificação moleculares se mostra como alternativa

para a otimização deste fármaco.


FARIAS, M. P. A.

CO NH2NHNO CHO2N

Figura 4: Estrutura da Nitrofurazona.

1.2. Doenças Tropicais: Tripanossomíase Americana

1.2.1. Doenças Tropicais

As doenças tropicais estão geralmente associadas a condições de temperatura e

umidade, responsáveis pela proliferação de insetos vetores onde aspectos socioeconômicos

decorrentes das condições de subdesenvolvimento também fazem parte deste conceito 15 .

As doenças tropicais acometem milhões de pessoas que vivem em determinadas

áreas dos trópicos. Países em desenvolvimento são afetados por doenças tropicais como a

malária, esquistossomose, filariose, tripanossomíases, hanseníase, entre outras 15 .

Dentre as doenças tropicais conhecidas, merece destaque à doença de Chagas,

descoberta em 1909 por Carlos Chagas, doença causada pelo Tripanossoma cruzi 16 .


FARIAS, M. P. A.

1.2.2. Distribuição Geográfica e Epidemiológica da Doença de Chagas

A infecção por T.cruzi em humanos se estende do México até o sul da Argentina.

Atualmente, a doença afeta entre 16 a 18 milhões de pessoas e aproximadamente 25% da

população da América Latina (cerca de 100 milhões) correm o risco de adquirir a doença de

Chagas (Figura 5) 17 .

Figura 5: Países afetados pela doença de Chagas 17 .

1.2.3. Doença de Chagas no Brasil

No Brasil, a doença de Chagas está associada, historicamente, aos movimentos de

interiorização de populações colonizadoras que se iniciou no século XVII, onde o pico de

incidência está entre os anos de 1850 a 1950, através da consolidação de colônias

agropastoris no Sul, Sudeste e Nordeste do Brasil. Atualmente atinge uma área endêmica


FARIAS, M. P. A.

de cerca de 3.600.000 Km 2 , representando 44,5% da área do País, incluindo 2.400

municípios dos Estados de Alagoas, Bahia, Ceará, Espírito Santo, Goiás, Maranhão, Mato

Grosso do Sul, Minas Gerais, Paraíba, Paraná, Pernambuco, Piauí, Rio de Janeiro, Rio

Grande do Norte, Rio Grande do Sul, São Paulo, Sergipe e o Destrito Federal 18 .

1.2.4. Aspectos Morfológicos / Ciclo Biológico do Parasito

O ciclo de vida do T. cruzi é complexo e compreende três formas principais, dotadas

de características morfológicas e biológicas distintas (no vetor e no hospedeiro). Estas

formas são: amastigota (Leishimania), epimastigota e tripomastigota 19 . A característica

morfológica utilizada como base para a diferenciação é a posição do flagelo em relação ao

cinetoplasto e seu ponto de emergência do corpo do parasito 20. Nos hospedeiros

vertebrados ocorrem os tripomastigotas do tipo sanguícola e os amastigotas intracelulares,

enquanto nos hospedeiros invertebrados e em meios de cultura predominam as formas

epimastigotas, que passam depois à tripomastigotas metacílicas 21.

As formas tripomastigotas metaciclicas lembram as formas delgadas dos

tripomastigotas (que não podem evoluir se não penetrarem em hospedeiro vertebrado), e

que exibem capacidade invasiva para atravessar mucosas e conjuntivas e não são

suscetíveis ao soro humano, podendo sobreviver a temperaturas mais elevadas 22.

A forma tripomastigota se encontra no lúmem do reto do inseto, sendo depositados

juntamente com as fezes próximo ao local da picada (Figura 6) 21.

Os epimastigotas apresentam dimensões e formas variáveis, com citoplasma

abundante e cinetoplasto justaposto ao núcleo; a base do flagelo é próxima ao cinetoplasto,


FARIAS, M. P. A.

sendo que o flagelo emerge de um lado do corpo do parasito. Os epimastigotas são

originários da diferenciação de tripomastigotas sanguícolas ingeridos pelo vetor durante a

picada e multiplicam-se por divisão binária longitudinal no lúmem do tubo intestinal do

inseto (figura 6) 22.

A forma amastigota intracelular, mede aproximadamente 4 mm e é desprovida de

flagelo externo, sendo o aparelho locomotor reduzido ao segmento contido no bolso

flagelar. É encontrada no interior da célula do homem e a característica mais importante

dos amastigotas é a recuperação da capacidade de multiplicação, que se manifesta cerca de

35 horas após a invasão celular (figura 6) 21, 22.

Figura 6: Formas tripomastigota (A), epimastigota (B) e amastigota (C) do T. cruzi 23.

1.2.5. Fisiopatologia da Doença de Chagas / Sintomas

A doença causada pelo Tripanosoma cruzi, popularmente conhecida como doença

de Chagas, é uma importante doença endêmica, há muito reconhecida como um problema

de saúde pública 24.

A B C


FARIAS, M. P. A.

A doença começa com uma febre simples e invade cada órgão do corpo em um

período dos anos, causando finalmente danos ao coração, cérebro e destruição do sistema

digestivo. Este fato é uma realidade para milhares dos povos americanos, africanos e

latinos 25.

O vetor principal que causa a doença de Chagas é o inseto Triatomideo, conhecido

por barbeiro e encontrado principalmente em casas de barro (figura 7). O excremento

deste, contém o parasita, que penetra no corpo através das membranas da mucosa, olhos, e

em ferimentos abertos 26.

Figura 7: Inseto triatomídeo (A) e uma típica casa de barro (B). 26

A doença de Chagas tem uma fase aguda, indeterminada e uma crônica. A fase

aguda aparece imediatamente depois da infecção inicial, no geral com sinais inespecíficos:

somente uma proporção muito pequena é reconhecida pelo olho fechado por causa do

inchamento das eyelids (sinal de Romaña) que se expressa em aproximadamente 5% dos

casos 26. (figura 8) .

A B


FARIAS, M. P. A.

Figura 8: Triatomídeo, vetor causador da doença de Chagas (A) 27. Chagoma da inoculação

(B) 27 . Inchamento dos eyelids (sinal de Romaña) (C) 26 .

Após a infecção aguda, ocorre um período intermediário longo sem manifestações

clínicas. Na maioria destes casos, os pacientes apresentam a fase indeterminada com uma

expectativa de vida normal. Finalmente, em um terço da população infectada os ferimentos

do período crônico são desenvolvidos: miocardiopatía (figura 9) ou patologias do sistema

digestivo de diferentes graus de severidade. A manifestação pode estar na incapacidade

física parcial ou total, que reduz a sobrevida destes pacientes em 10% pelos 10 anos

seguintes, com medidas alternativas terapêuticas não satisfatórias 26 .

Figura 9: Coração de paciente chagásico crônico global ampliado (vista externa anterior) 27

A B C


FARIAS, M. P. A.

1.2.6. Patogenia da Doença de Chagas

Na doença de Chagas são inúmeros os fatores que atuam direta ou indiretamente no

aparecimento das lesões produzidas pelo Tripanossoma cruzi. Alguns são devido ao

parasito (eventos iniciais na relação parasito-hospedeiro, polimorfismo, tropismo celular,

virulência do clone, cepa ou raça do parasito, reinfecção, infecções mistas, seleção clonal,

etc.,) e outros fatores são inerentes ao hospedeiro (constituição genética, sexo, idade, raça,

resposta imunitária, nutrição, tipos de células que interagem com o parasito, tais como

macrófagos e células musculares). Isto demonstra, a exemplo de outras doenças

parasitárias, que também na doença de Chagas os mecanismos pelos quais o T. cruzi

determina as lesões devem ser multifatoriais e deles depende o aparecimento ou não das

formas anatomoclínicas da doença, ou seja, a forma indeterminada, a cardíaca sintomática

ou não, a digestiva (megaesôfago e megacólon) ou a nervosa, além, é claro, das formas

mistas 16 .

1.2.7. Mecanismo de Transmissão/ Diagnóstico

Segundo Neves e colaboradores, existem vários tipos de transmissão, sendo cinco as

de maior importância epidemiológica: transmissão pelo vetor, transfusão sanguínea,

transmissão congênita, transmissão oral, transplante, além de acidentes de laboratório e

coito. Todas estas formas citadas representam meios importantes de disseminação da

doença e, portanto o controle destas se torna crucial para a diminuição da infecção

parasitária 16.

O diagnóstico por sua vez, pode ser realizado através de métodos clínicos e

laboratoriais de acordo com a fase em que se encontre a doença. O método clínico se detém

a pesquisar a origem do paciente e a presença dos primeiros sinais visíveis da doença que

são o sinal de Romaña e o chagoma, decorrentes da fase primária ou aguda da patologia, já


FARIAS, M. P. A.

na fase crônica o ensaio clínico investiga as alterações cardíacas acompanhadas de sinais

de insuficiência cardíaca confirmados pelo eletrocardiograma e as alterações digestivas, do

esôfago e do cólon, revelados em raio X 16.

Os métodos investigativos laboratoriais por sua vez passam pelo diagnóstico de

pesquisa do parasito, através do exame de sangue em gota espessa, xenodiagnósticos,

dentre outros. Além disso, o diagnóstico sorológico é um outro método muito usado para o

diagnóstico da doença de Chagas 16.


FARIAS, M. P. A.

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Nitrofurazona: Origem Sintética e Terapêutica

Partindo-se do conhecimento de que o ácido furóico, derivados alquilícos e 2-furano

mercuriais deste ácido apresentavam atividade bacteriostática, Dood e Stilman sintetizaram

o nitrofural, conhecido como Nitrofurazona. Este composto se mostrou eficaz tanto contra

bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas, sendo menos ativo contra Pseudomonas

pyocynea 28.

A Nitrofurazona, quimicamente corresponde a semicarbazona do 5-nitro-furfural,

preparada originalmente segundo o esquema abaixo (figura 10).

O C

(I )

O CH (O AC )2O

H

O C H =N -N HO 2N N H 2

O

(I I )

H (OAC )2O CO 2N

(I I I ) N it rof urazona (IV)

Figura 10: Esquema da primeira síntese da Nitrofurazona.

O furfural (I), protegido sob a forma de diacetato (II), é nitrado (na posição 5 do

anel), obtendo-se o 5-nitro derivado (III) e posterior condensação com semicarbazida em

ácido sulfúrico diluído, resulta na Nitrofurazona (IV) 28.

A Nitrofurazona foi primeiramente empregada no tratamento de queimaduras e

outras infecções durante a II Guerra Mundial. A essa época, foi observada atividade

antimicrobiana de amplo espectro e baixa incidência de sensibilização. Entretanto, o


FARIAS, M. P. A.

espectro antibacteriano foi se modificando ao longo dos 20 anos da primeira utilização.

Atualmente algumas cepas de bactérias Gram-negativas são resistentes a este fármaco 29.

Em 1969, Andrade e Brener estudando os efeitos deste fármaco contra T. cruzi,

observaram que o nitrofurano em questão provocava extensa destruição parasitária. Por

outro lado, em 1988, Henderson e colaboradores, estudando a tripanotiona redutase (TR),

observaram que derivados de naftoquinonas e nitrofuranos, incluindo a Nitrofurazona,

apresentavam capacidade de inibir esta enzima 30.

Gonçalves e colaboradores observaram que a Nitrofurazona potencia os efeitos

tripanomicidas provocados pela Primaquina (PQ), em cultura de células LLC-MK2

infectadas com formas tripomastigotas de T. cruzi 31.

A Nitrofurazona é tóxica quando administrada por via oral, causando hemólise e

neuropatia periférica grave 29. Por isso, foi retirado do mercado de alguns países e, em

outros como no Brasil, seu uso é permitido apenas por via tópica (em baixas doses, de 2 à

5%). É quimioterápico de escolha para o tratamento de infecções estafiloccócicas da pele

resistentes a outros fármacos, sendo utilizado no tratamento, por aplicação local, de

infecções de feridas, queimaduras e ulcerações da pele, como também, no preparo de

superfícies de enxerto de pele. Topicamente, pode provocar dermatite de contato 29.

2.2. Otimização do Método de Síntese da Nitrofurazona

Após sua origem e comercialização, a síntese da Nitrofurazona passou a ser

pesquisada a fim de se obter um método de otimização de produção para a indústria

farmacêutica. Para a síntese da Nitrofurazona, vários métodos têm sido usados. O material

de partida usado na síntese pode ser: 5-nitro-furfuraldiacetato, 5-nitro-furaldeído, 2-


FARIAS, M. P. A.

furaldeído ou nitrofurfuraloxime. Desde que 2-furaldeído seja uma substância econômica e

possa ser usado para produção de Nitrofurazona em escala industrial. O 2-furaldeído foi

utilizado como substância de partida, aplicado a condições variadas de tempo, temperatura,

pH e catalisadores de provas para obtenção de produtos com qualidade adequada,

rendimento e produção suficientemente boa para ser alcançada industrialmente. De acordo

com Tehrani e colaboradores, dos oito métodos testados, chegou-se apenas a obtenção de

um método plausível como procedimento otimizado para preparação piloto para a indústria,

segundo o esquema a seguir (figura 13) 32.

O CHO

1) HNO3, H2SO4

2) (CH3CO)2O O CH(OCOCH3)2O2N

NH2NHCNH2 Cl-O

O CHO2N NNHCNH2

O

Figura 13: Preparação piloto para produção industrial da Nitrofurazona 32.

2.3. Síntese de Análogos da Nitrofurazona

As regras que controlam o desenvolvimento de novos fármacos evoluíram no último

século para garantir a segurança e eficácia de novos medicamentos para a população 33 .

Qualquer fármaco, não importa quão banal sejam suas ações terapêuticas, tem o

potencial de causar dano. As reações adversas são o preço da terapêutica clínica moderna 33

. As substâncias químicas transformadas em fármacos devem ter eficácia terapêutica e ser

seguras. Infelizmente, todas as substâncias químicas têm potencial para causar efeitos

indesejáveis. Por esta razão, durante o desenvolvimento dos fármacos é essencial escolher


FARIAS, M. P. A.

compostos químicos que tenham larga margem de segurança entre a dose que produz o

efeito desejado (terapêutico) e a que causa efeitos indesejáveis (tóxicos) 33 .

A modificação molecular, fundamentada no bioisosterismo, latenciação e

homologação, têm permitido a identificação de novos derivados terapeuticamente úteis, por

otimização de um composto protótipo 3 .

A homologação tem se mostrado uma importante estratégia de obtenção de novos

fármacos, na otimização de compostos já existentes 34 .

Dentre as centenas de derivados nitrofurânicos que já foram sintetizados e testados,

alguns ingressaram no arsenal terapêutico e foram mais tarde oficializados, a saber 13 .

• Nitrofurazona (figura 14): foi o primeiro nitrofurano introduzido na

terapêutica no ano de 1946. Suas propriedades antibacterianas foram

descobertas em 1943 por Stilmam e colaboradores, sendo, portanto,

conhecido comercialmente pelo nome de Furacim® (Schering-ploug) 13 ,

sendo mais tarde também comercializada pelos laboratórios Brasmedica

e Lafepe.

Figura 14: Estrutura da Nitrofurazona

• Nitrofurantoína (figura 15): foi introduzido na terapêutica em 1953, é

conhecida comercialmente pelo nome de Furadantin; corresponde

quimicamente à N-(5-Nitro-2-furfuriliena)-1-amino-hidantoína;

O CH=N-NH-C-NH2O2NO


FARIAS, M. P. A.

apresenta atividade contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas;

sendo bacteriostática e bactericida contra a maioria de espécies de

estafilococos e estreptococos. Tem a mesma ação contra a Escherichia

coli e Aerobacter aerogenes. É inativa contra fungos e vírus. Também é

utilizada no tratamento das infecções bacterianas das vias urinárias por

via oral 13 .

Figura 15: Estrutura da Nitrofurantoína

• Furazolidona (figura 16): conhecida comercialmente com o nome de

Furoxana, foi introduzida na terapêutica em 1958. Quimicamente

corresponde à 3-(5-Nitro-2-furfurilideno)-2-oxazolidiona, sua síntese foi

descrita por Gever e colaboradores em 1955 e é ativa contra vários

microorganismos entéricos Gram-positivos e Gram-negativos, inclusive

espécies de Salmonella, Shigella, Escherichia, Proteus, Estreptococcus

e Estafilococos; apresenta, outrossim, atividade contra protozoários. É

administrada por via oral, no tratamento de diarréias de origem

bacteriana e de enterites. Sob o nome oficial de furaldatona e nome

comercial de Altafur . Indicado como antibacteriano para uso oral, tal

composto provocou freqüentes acidentes tóxicos; por esse motivo, foi

retirado do comércio em novembro de 1961 13 .

ONO2N N

NHO

O


FARIAS, M. P. A.

Figura 16: Estrutura da Furazolidona

• Nifurtimox (figura 17): corresponde a porção (3-metil-4-(5’̉̉-nitro-

furfurilidenoamina-tetrahidro-4H-1,4-tiazina-1,1-dioxido) e com o nome

comercial de Lampit . É bastante eficiente no tratamento da doença de

Chagas, fase aguda, nas doses de 8 ou 10 mg 13 .

Figura 17: Estrutura do Nifurtimox

2.4. Nitrofurazona e Derivados: Potentes Agentes Antimicrobianos

A Nitrofurazona é um importante composto dos derivados nitrofurânicos, sendo um

potente agente antimicrobiano 12 .

O mecanismo de ação dos nitrofuranos ainda não está totalmente esclarecido. Eles

inibem muitos sistemas enzimáticos bacterianos, a maioria provavelmente por dano ao

DNA. Uma enzima bacteriana, a nitrorredutase, converte os compostos em intermediários

de vida curta, incluindo radicais oxigenados livres, que interagem com o DNA causando

quebras e posterior dano às bactérias. A resistência bacteriana destes compostos não é

ONO2N N

O

O

ONO2N N

SO

O


FARIAS, M. P. A.

medida por plasmídios, mas parece ser causada por uma mutação associada à perda de

atividade da nitrorredutase bacteriana 35 .

Ainda sobre o mecanismo de ação dos nitrofuranos, Paul e colaboradores (1954)

afirmam que a atividade antimicrobiana dos nitrofuranos no geral é devida a interferência

nas fases precoces do ciclo de Krebs, precisamente pela inibição que se processa na

formação anaeróbica da acetil-coenzima A, com conseqüente bloqueio do metabolismo

glicídico das células bacterianas 13 .

Em 1943, as propriedades antibacterianas dos nitrofuranos foram descobertas e

estudadas por Stillman e colaboradores. A presença do grupo nitro é essencial, porquanto

os compostos análogos não nitrados (ou com o grupo nitro reduzido) são inativos. A

Nitrofurazona é ativa tanto in vitro quanto in vivo contra bactérias Gram-positivas e Gram-

negativas e que conforme a concentração, age como bacteriostático ou como bactericida 28.

Dentre as várias atividades atribuídas aos derivados nitrofuranos, alguns trabalhos

apontam a atividade destes compostos frente ao crescimento e estágio de latência do bacilo

Mycobacterium bovis, sendo o Metronidazol (figura 11) o primeiro composto que possui

atividade frente ao estágio latente deste bacilo, embora o crescimento bacteriano não seja

afetado por este fármaco, atuando como uma pró-droga que requer a redução do seu grupo

nitro para um intermediário reativo que então causa danos para o DNA e subseqüentemente

morte celular. Assim, vários nitrofuranos se mostram ativos frente ao Micobaterium bovis,

uma vez que esta bactéria em condições de hipóxia, encontra-se sensível à ação do oxigênio

radicalar proveniente da redução destes nitrofuranos 36 .


FARIAS, M. P. A.

Figura 11: Estrutura do Metronidazol

Em 1995, foram sintetizados derivados da tiossemicarbazona, contendo grupos

cíclicos ou heterocíclicos, como o 1-ciclohexilidino-N(1,2-diidro-2-oxo-3H-indol-3-

ilideno) semicarbazona, N-substituídos com morfina ou piperidina (figura 12),

apresentando boa atividade frente aos microorganismos: E. coli, S. typhimurium, V.

cholerae, Enterobacter, Poteus sp. Mirabilis, Pseudomonas Aeruginosa, S. typhi, S.

paratyphi e Klebsiella. Os melhores resultados foram frente ao V. cholerae e S. typhi, com

diâmetro de halo de inibição na dose de 2,5 mg/mL para 18 e 17 mm respectivamente,

sendo portanto o microorganismo V. cholerae o mais sensível ao derivado substituído com

piperidina 37 .

N O

N C

S

NH NR2

CH2 NH R1

figura 12: Estrutura do 1-ciclohexilidino-N-(1,2-diidro-2-oxo-3H-indol-3-ilideno) semicarbazona, N- substituídos com morfina ou piperidina.

N

N

CH3

CH2CH2OHO2N


FARIAS, M. P. A.

2.5. Síntese e Avaliação de Agentes Tripanomicidas

2.5.1. Obtenção de Novos Fármacos através da Síntese Orgânica

A quimioterapia atual frente a doença de Chagas ainda está muito inadequada, pois

as duas principais drogas em uso são: Nifurtimox ®, cujo mecanismo de ação envolve a

produção do ânion superóxido que é altamente tóxico para o parasita. E também o

Benznidazol ®, que atua sobre o sistema respiratório do parasita e também inibe a síntese

de DNA. Ambas as drogas apresentam efeitos colaterais indesejáveis e são ineficientes para

o tratamento crônico da doença de Chagas que pode ser considerada como uma doença

ainda sem cura 38 .

O desenvolvimento de novas drogas frente a esta infecção parasitária onde as

pesquisas são geralmente direcionadas para as diferenças chaves entre o metabolismo do

hospedeiro mamífero e no parasito, o metabolismo da tripanotiona redutase (TR) pode ser

observado como alvo para o desenvolvimento de agentes contra as tripanossomatides 38 .

Messeder e colaboradores 39, sintetizaram uma série de compostos guanil hidrazona

e avaliaram frente a forma tripomastigota do T. cruzi. Dentre os compostos sintetizados, o

derivado guanil hidrazona contendo o grupo nitro (figura 18), apresentou melhor atividade

frente ao ensaio, com IC50 = 17,1 µM e cerca de 100 vezes mais potente que o derivado

contendo o grupo amino como substituinte, com IC50 = 220,6 µM.


FARIAS, M. P. A.

O

O R

N

H

NH

N H 2

N H 2

C l

R = N O 2, N H 2, H

Figura 18: Derivados guanil-hidrazonas com atividade antitripanossomal.

Cerecetto e colaboradores sintetizaram uma série de 5-nitro-2-furaldeído e 5-nitro-

tiofeno-2-carboxialdeído semicarbazona, na qual a porção N-4 da semicarbazona é

substituída por cadeias alifáticas, arílicas e aminas heterocíclicas (figura 19). Estes

compostos foram planejados pela mimetização da porção espermidine da enzima

tripanotiona redutase (TR), com potencial atividade tripanocida. Os compostos foram

testados in vitro pela sua capacidade em inibir o crescimento das formas epimastigotas do

T. cruzi. Os resultados mostraram que os compostos contendo os substituintes butil e 2-

metox-etil na posição N-4 da semicarbazona foram os mais ativos da série, com boa

correlação entre as propriedades lipofílica-hidrofílica e seus potenciais de redução (Epc1).

Isto sugere que neste quadro de compostos a atividade é mais dependente do comprimento

da cadeia que sobre os efeitos trazidos pela presença do heteroátomo 38 .


FARIAS, M. P. A.

Figura 19: Derivados 5-nitro-2-furaldeído e 5-nitro-tiofeno-2-carboxialdeído semicarbazona, substituídos na posição N-4 da semicarbazona por cadeias alifáticas,

arílicas e aminas heterocíclicas.

Uma série de compostos planejados a partir do Megazol [1-metil-2-(5-amino-1,3,4-

tiazol)-5-nitroimidazol], um importante composto-líder com atividade antiparasitária e

antibacteriana e que tem sido empregada em fase experimental na doença de Chagas,

quando esta se apresenta resistente ao Nifurtimox e Benznidazol ( figura 24) 40. Baseado na

estrutura do Megazol, novos bioisostéros, derivados nitrofuranos e nitrotiofênicos foram

obtidos e avaliados em ensaios in vitro frente ao T. cruzi, com resultados satisfatórios,

sendo mais potente que o Megazol, principalmente para os derivados tiofênicos, com

inibição de 100% frente ao T. cruzi e 95% para o T. brucei, na concentração de 1,5µM

(figura 20) 40 .

N

N

NO2

CH3N N

S NH2

Megazol Bioisósteros do Megazol

XNO2N N

S NH2

X = S, O

Figura 20: Novos bioisostéros do Megazol, contendo o anel nitrofurano ou tiofeno 50.

XNO2N

NH NH

O

R

X = O, SFragmentos mimeticos da porção Espermidina (TR)


FARIAS, M. P. A.

Chung e colaboradores41, obtiveram e avaliaram in vitro o derivado da

Nitrofurazona, o hidroximetilnitrofurazona (NFOH-121), (figura 21), sintetizado em meio

alcalino de acordo com o método de Yananoaka e colaboradores 42 .

A atividade do NFOH-121 foi evidente tanto nas tripomastigotas quanto nas

amastigotas quando comparadas ao Benznidazol, usado como droga padrão. Com as

amastigotas, o Benznidazol apresentou um percentual de 81,1% de inibição do crescimento,

enquanto que com o derivado NFOH-121 foi de 99,6 e 100%, nas doses de 5 e 10 µM.

Neste mesmo ensaio, na dose de 5 µM, a Nitrofurazona inibe 97,2%. Estes mesmos autores

revelaram que o composto NFOH-121 atua como um pró-fármaco da Nitrofurazona,

apresentando menor potencial mutagênico em relação a Nitrofurazona 41 .

ONO2N NH NH2

O

ONO2N NH NH

O

OH

K2CO3/ H2O, H2CHO 70ºC, 48 hs

NFOH-121

Figura 21: Rota sintética do derivado NFOH-121, pró-fármaco da Nitrofurazona 41

2.6. O Grupo Nitro e Sua Importância na Química Medicinal

Entre os diversos métodos de preparação de pró-fármacos, a adição do grupo nitro é

uma das mais empregadas na obtenção de pró-fármacos nos quais depende da

biotransformação enzimática. Este método é exaustivamente utilizado na obtenção de

quimioterápicos, destacando-se os anti-maláricos e anti-chagásicos 43, 44.


FARIAS, M. P. A.

O grupo nitro, numa molécula, proporciona diversos efeitos, dentre os quais

podemos destacar: efeitos físico-químicos, que modifica profundamente a solubilidade e a

lipofilicidade da molécula; efeitos bioquímicos, que se caracterizam pelo metabolismo

específico dos nitroderivados; e efeitos farmacológicos, que se devem a ação indutiva

elétron-atraente do substituinte nitro 14. A ele é atribuído o conceito de grupo parasitóforo

por excelência 14 . A redução do grupo nitro, com geração de espécies oxigenadas reativas

(EOR) é essencial para a maioria das atividades biológicas de nitrocompostos 45. Sua

completa redução envolve a adição de 6 elétrons, formando aminas via intermediários

nitrosos (etapa de 2 elétrons) e hidroxiaminas (etapas de 4 elétrons), como esquematizado

na Figura 22 46.

Figura 22: Esquema simplificado da redução de nitrocompostos, adaptado da referencia 46.

O número de compostos nitrados na natureza é relativamente pequeno. Um clássico

exemplo é o antibiótico cloranfenicol (figura 23), bastante utilizado na quimioterapia

antimicrobiana. Entretanto, a classe de nitrocompostos sintéticos engloba uma variedade

maior de substâncias com larga aplicabilidade terapêutica.

RNO2 RNO2 RNO2HH+

1e-

RNO RNHOH RNH2

DNA

quebras das fitas

1e-, H+

desproporcionamento hidroxilamina amina

RNO2H RNO2

H2O

2e-, 2H+ 2e-, 2H+, -H2O

nitroso


FARIAS, M. P. A.

figura 23 : D(1)-treo-1-p-nitrofenil-2-dicloroacetamido-1,3-propanodiol (Cloranfenicol).

Os nitrocompostos exibem toxicidade seletiva para os microorganismos

anaeróbicos. A ação antimicrobiana de nitrofuranos foi primeira descoberta em 1940 e

desde então tem sido aplicado como importantes agentes antimicrobianos, principalmente

para infecções do trato intestinal e urinário 47. Em 1960, o 5-metroimidazol Metronidazol

(figura 11) foi comercializado para o tratamento de vaginites tricomonal e desde então um

grande número de derivados do Metronidazol tornou-se importantes agentes para o

tratamento de doenças protozoárias causadas por Tricomonas vaginalis, Entamoeba

histolytica, Giárdia intestinalis e uma variedade de outras infecções 48. Mais recentemente,

o Metronidazol tem sido efetivo em terapias de úlceras gastroduodenal, envolvendo

infecções por H. pilory 49.

Muitos compostos sintéticos nitrados exibem ação anti-parasitária e entre eles,

talvez os mais importantes sejam os nitrofuranos e nitroimidazois (figura 24).

figura 24: Nitrocompostos de interesse biológicos.

O2N CH C CH2OH

OH H

NH COCHCl2

OO2NN

N SO2

Nifurtimox Benznidazol

N

N

NO2

NH

O


FARIAS, M. P. A.

O principal parâmetro físico-químico que determina a efetividade dos

nitrocompostos é o potencial de redução Epc do grupo nitro 49. O potencial de redução

quantifica a energia de reações de transferências de elétrons (um elétron é fisicamente

transferido entre duas espécies, resultando em uma mudança química). A relativa facilidade

na redução de muitos nitrofuranos (ou seja, valores positivos de Epc) facilita a sua redução

(e conseqüentemente, ação citotóxica) tanto em células em condições anaeróbicas (parasita)

como também nas células em condições aeróbicas (mamíferos), respondendo assim pela

recorrente toxicidade elevada e severos efeitos colaterais desta classe de drogas 14 .


FARIAS, M. P. A.

3. Objetivos

3.1. Objetivo Geral

Síntese de derivados do composto Nitrofurazona, com a finalidade de otimizar os

efeitos farmacológicos frente a diversos microorganismos e parasitas e diminuição dos

efeitos tóxicos, com base em estudos detalhados nas estratégias racionais de modificação

molecular.

3.2. Objetivos Específicos

• Sintetizar novos derivados N2 e N2 - N 4-alquilados da Nitrofurazona, por meio da

inédita alquilação regioseletiva em meio aprótico.

• Caracterizar a estrutura química dos compostos sintetizados através de

Espectroscopia de Infravermelho (IVTF) e Ressonância Magnética Nuclear de

Prótons (1H-RMN) e Carbono (13C-RMN), Ponto de Fusão e Rf.

• Avaliar a atividade antimicrobiana in vitro dos novos produtos frente a bactérias

Gram-positivas, Gram-negativas, fungos filamentosos e leveduras.

• Avaliar a atividade antichagásica, em ensaio in vitro frente a forma epimastigota,

com determinação da IC 50.

• Realizar estudos farmacológicos com determinação da DL 50.


FARIAS, M. P. A.

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FARIAS, M. P. A.

Enviado para: Biorganic Medicinal Chemistry

Capítulo 2

Artigo 1 – Synthesis and biological activities of N-alkyl-Nitrofurazone

analogues


FARIAS, M. P. A.

Synthesis and biological activities of N-alkyl nitrofurazones analogues

Dalci J. Brondani1 *, Maria Patrícia A. de Farias1 , Vânia T. Lima2, Rosa E. de A. da Silva2,

Janete Magali de Araújo2, Ivone Antonia de Souza3, Milena B. P. Soares4, Alice C. Kiperstok4 , Frederico , C. L. Maia5 and Ana Cristina L. Leite1

1LABSINFA – Laboratório de Planejamento, Avaliação e Síntese de Fármacos, Depto de Ciências

Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal de Pernambuco - Rua Prof. Artur Sá S/N, CDU, 50740-520, Recife. PE - Brazil

2Laboratório de Genética de Microorganismos, Depto de Antibióticos- CCB, Universidade Federal de Pernambuco - Rua Prof. Artur Sá S/N, CDU, 50740-520, Recife. PE - Brazil

3Laboratório de Cancerologia Experimental, Depto de Antibióticos- CCB, Universidade Federal de Pernambuco - Rua Prof. Artur Sá S/N, CDU, 50740-520, Recife. PE - Brazil

4LETI- Laboratório de Engenharia Tecidual e Imunofarmacologia, Centro de Pesquisa Gonçalo Muniz, Salvador- BA, Brazil. [email protected]

5Área de Patologia Animal do Departamento de Medicina Veterinária-Universidade Federal Rural de Pernambuco-UFRPE

Abstract In the present study, synthesis, physical and analytical properties of N2-alkyl and N2,N4-dialkyl-nitrofurazone derivatives are described. These new compounds were obtained by regioselectivity N-alkylation in mild conditions, polar aprotic solvent, and characterised by IR, 1H-NMR, 13C-NMR and elemental analysis. The compounds were screened for antibacterial activities against Gram-negative, Gram-positive bacteria, mycobacteria and fungi and as potential antitrypanosomal agents. The N2-butyl and pentyl derivatives have the highest antimicrobial activities against Gram-positive bacteria, mycobacteria and fungi with minimum inhibitory concentrations in the range of less of 10µg/ml. The N2,N4-dialkyl derivatives displayed the highest in vitro activity antitrypanosomal agents. The preliminary toxic activity in vivo was carried through for the N2-monobutyl derivative (more potent antimicrobial derivative), with LD50 = 186mg/kg, showing slightly more toxic than the prototype. Keywords: nitrofurazone derivatives/ alkyl derivatives/ antibacterial activities/ antitrypanosomal activity Corresponding author:

Departamento de Ciências Farmacêuticas

Universidade Federal de Pernambuco

Av. Moraes Rego, s/n Cidade Universitária, Recife- PE, Brasil

Phone/Fax: (+55) 81 2126 8511 E-mail: [email protected]


FARIAS, M. P. A.

1. Introduction

In recent years, the number of life-threatening infections caused multi-drug resistant

Gran-positive and Gran-negative pathogen bacteria have reached an alarming level in many

countries around the world [1,2]. A number of clinic reports in worldwide have

independently described the emergence of vancomicine intermediate-resistence in

Staphylococcus aureus (VISA) and methicilin-resistence Staphylococcus aureus (MRSA)

isolates and other human pathogen Gran-positives isolates [3]. Infections caused by these

microorganisms pose a serious challenge to the community and need for an effective

therapy has led to a search for novel antibacterial agents.

The flagellate protozoa trypanosomes are the causative parasites of several tropical

diseases, as African sleeping sickness (Trypanosoma gambiense and Trypanosoma

rhodiense) and Chagas’ disease (Trypanosoma cruzi) in humans, and nagana (Trypanosoma

congolense and Trypanosoma brucei) in cattle. According to the World Health

Organization (WHO), 16–18 million people are infected with T. cruzi, 2–3 million

individuals have the clinical symptoms of the chronic stage of Chagas’ disease and, every

year, are reported 21,000 deaths and 300,000 new cases [4]. Moreover, Chagas’ disease is

transmitted not only by Triatomine insects but also by blood transfusion, this latter

mechanism is responsible for the occurrence of Chagas’ disease in regions where it is not

endemic [5]. Currently, this patology is treated with nitroheterocyclic agentes such as

Nifurtimox and Benzinidazole. These two drugs are effective against the circulating form

of the parasite (trypomastigotes) during the acute phase of the disease, but not during

during the chronic stage.


FARIAS, M. P. A.

Besides, several researchers reported that Nitrofuran compounds, displays a very

important role in medicine as antimicrobial [6] and antiparasitic agents [7]. On the other

hand it has also reported that hydrazide-hydrazones structure posses numerous chemical,

biological and medicinal applications because of their versatile biological activities

appearing as antimicrobial [8], anticonvulsant [9] and antitubercular [10].

Prodrugs are particularly appealing as therapeutic agents because of their selective

toxicity for microorganisms possessing specific activating enzymes [11]. Nitrofurazone, (5-

nitro-2-furaldehyde semicarbazone) is a potent prodrug derivative of nitrofuran that is often

used in combination therapies and as choice second against Gram-positive and Gram-

negatives infections of skin injuries typified by Escherichia coli, Proteus ssp, C.

perfringers, and also S. aureus. [12]. It is also used as a systemic antibacterial agent in

veterinary medicine therapeutically and prophylactically for domestic animals [13]. These

toxic profile of Nitrofurazone have limited its use in medicine.

Over the years, the wide range of 5-nitro-2-furaldehyde derivatives has been

synthesised in view to obtain available information about synthesis, structure-activity

relationship, and toxicity. Previous works [14] related the synthesis and antitrypanosomal

activity of 5-nitro-2-furaldehyde derivatives that presents a N-oxide moiety and a flexible

side chain like a alkylamino semicarbazide group. The butylamino and hexylamino

derivatives were the most active of the series.

Nitrofurazone (NF) presents weak solubility in watery way (clog P = 0.23), as also

in solvent polar, being its total solubility gotten in Dimethylformamide or

Dimethylsulfoxide. The molecular modifications in Nitrofurazone structure so far are

limited alkylation / arylation in the NH of amide or then in reduction of hidrazone group,


FARIAS, M. P. A.

both modifications do not reveal improvement in the pharmacological optimisation of these

compounds, since the hidrazone group is important for the complexing abilities with metals

and that the free amide is a structural requisite for the antimicrobial action of compounds

containing semicarbazones or thiosemicarbazones [15].

In order to investigate the lipophilicity influence in the biological profile and

toxicity of nitrofurazone structure, in the present study, new N-alkyl and N,N-dialkyl

derivatives of nitrofurazone were synthesised. We have planed the introduction of a flexible

alkyl side chain selectively in the N2-hydrazine position and unselectively N2, N4-

semicarbazide group. To obtain unselectively N2,N4-dialkyl compounds a cinetic control

was realiesed. The obtained compounds were characterised by IR, 1H-NMR, 13C-NMR and

elemental analysis. The new compounds were screened for antibacterial and antiprotozoal

activities, and toxic profile for derivative 2 (more potent antimicrobial derivative).

2. Results and discussion

2.1. Chemistry

The general synthetic route that was chosen for the preparation of alkyl derivatives

of nitrofurazone derivatives included a N2-alkyation using alkyl halides in basic conditions

and aprotic solvent such DMF. N2-alkyl-substituted compounds were obtained at room

temperature. N2,N4-disubstituted compounds were obtained when the reaction was carried

out at 60oC. Our attention was next turned to the cinetic control of the reaction in view to

obtain only a N2-alkyl-substituted derivative.

The obvious synthetic route planned to achieve the new nitrofurazone derivative

compounds 2, 3, 4 and 5 is shown in figure 1.


FARIAS, M. P. A.

ONO2N NH NH2

O

ONO2N N NH2

O

R1

ONO2N N NH

O

R1 R2

K2CO3 a, bRX, DMF

2 R1 = CH2(CH3)2CH33 R1 = CH2(CH3)3CH3a) RT: 93% of monosubstituted compounds (2,4) 7% of disubstituted compounds (3,5)

4 R1 = R2= CH2(CH3)2CH35 R1 =R2= CH2(CH3)3CH3a) 60ºC: 50% of monosubstituted compounds (2,4) 50% of disubstituted compounds (3,5)

Figure 1: Synthetic route.

The formation of compounds were supported by IR, 1H-NMR, 13C-NMR and

elemental analysis. To the N2-alkyl and N2,N4-dialkyl nitrofurazone derivatives, the IR

spectra the bands representating azometine and carbonyl groups appeared at 3193-3387 cm-

1and 1627- 1671 cm-1. 1H-NMR of compounds 2-5, showed single signals corresponding to

resonances of azomethine protons at 7.42-7.38. The hydrazide-hydrazone N-H protons

(position N2) were observed single signals for NF at 10.81, for derivatives wasn’t observed,

but for NH2 and NHR (position N4) were observed single signals for NF at 6.64, and for

derivatives monosubstituted 6.63 e 6.62 and triplet signals for derivatives disubstituted

NHR at 6.60 e 6.57 and alkyl protons at 0.97-0.98, 1.44-1.32, 1.59-1.49 and triplet signals

at 3.93-3.91 for NCH2 (N2) and duble triplet signals at 3.29 and 3.31 for NHCH2 (N4),

respectively (Fig 1a). 13C-NMR spectra of compounds exhibited resonances arising from

azomethine (C=N) , hydrazide-hydrazone (C=O) and alkyl side chains carbons ressonances


FARIAS, M. P. A.

at 123.73, 156.08, 40.77, 27.16, 20.03, 13.71 respectively (Figure 2).

Figure 2: 1H-NMR (a) and 13C-NMR (b) spectral data of compound 2

12 3

45 6

7

8

910

OO2NN

N NH2

O156.08151.68

110.76

113.52

123.73151.78

13.71

20.03

27.16

40.77

7.37

12 3

45 6

7

8

910

OO2NN

N NH2

O

6.63

6.80

7.42

0.95

1.45-1.31

1.60-1.47

3.93(a) (b)

3. Biological Investigation

3.1. In vitro evaluation of Antimicrobial activity

All of the strains came from the collection of the Department of Antibiotics (UFPE-

BR). Nitrofurazone prototype was used as reference drug. The inhibition zone in diameter

(mm) around test disc of tested compounds are showed in table 1.

In general the compounds 2, 3, 4, 5 and its prototype Nitrofurazone (NF) exhibited

moderate to good antibacterial activity against almost strain of gram positive bacteria,

mycobacterial, yeast and fungi. Compound 2 (N2-butyl derivative), was found to be the

most active of them all. S. aureus was the most sensitive of the gram positive tested strains,

its inhibition zone was 30 mm. This compound also showed to be active against

mycobacterium strains, with inhibition zone of 40 mm. Concerning gram negative strains,

only E. coli and S. Enteriditis, compound 2 showed inhibition zone of 16 a 3 mm,

respectively.


FARIAS, M. P. A.

Table 1. Antimicrobial activities of synthesized compounds against the tested bacterial strains and fungi using disc diffusion method (300µg/mL-1). Microorganism / code Inhibition zone in diameter (mm) around test disc* 5 4 3 2 NF S. aureus ATCC 6538 16 26 25 30 23 B. subtilis DAUFPE 16 19 25 22 31 26 P. aeruginosa ATCC 27853 - - - - - E. coli ATCC 25992 - - - 16 22 K. pneumoniae ATCC 29665 - - - 16 22 S. enteridites (DAUFPE 414) - - - - 13 M. luteus (100) ATCC 2225 - - - 20 13 M. phlei (DAUFPE 70) 12 - 11 - - M. smegmatus (DAUFPE 71) 10 15 21 25 30 M. tuberculosis-607(DAUFPE 82) 25 23 40 40 27 S. faecalis (ATCC 6057) 14 20 15 22 17 Cândida sp ((DAUFPE 720) - - - - - Cândida sp (DAUFPE 1224) - - - 13 - Cândida sp (DAUFPE 4249) 17 25 25 29 - Cândida sp (DAUFPE 4224) - 19- 11 15 - C. cruzei (DAUFPE 1002) - - - - - C. albicans (DAUFPE 1007) - - - - - A. niger (DAUFPE 2003) 11 19 13 19 - Neurospora sp - - - 13 - a Each compound was measured three times. DAUFPE is collection from Department of Antibiotics of the University Federal of Pernambuco State, Brazil. ATCC is American Typin Culture Colection.

In according to the literature, Nitrofurazone is active against almost Gram negative

tested strains [12], but, without action against fungi strains. In contrast, N2-alkyl derivatives

revealed an novel activity against some strains of Candida spp and Aspergillus niger. This

data clearly demonstrates a new antimicrobial profile to this class of nitrofuryl compounds.

3.2. Bcteriostatic activity

The bacteriostatic activity for NF and compound 2 was determined in vitro, (table

2). These compound showed a highest potency to B. Subtilis. S. aureus and moderate

activity against Mycobacterium tuberculosis. N2,N4-dialkyl-substituition (2c-d), more

lipophylic of them, do not showed a improvement of activity. Although, our results showed


FARIAS, M. P. A.

that, both N2-alkyl derivatives have structurally requirements in order to retain activity

against Gram positive bacteria like S. aureus, B. subtilis and novel activity of this

Nitrofuran against Candidas sp.

Table 2: Minimum inhibitory concentration (MIC) of the Nitrofurazone and derivative 2 against several microorganisms. Microrganism CIM valuesa (µg/mL)

Nitrofurazone Compound 2 S. aureus ATCC 6538 8 1-2 B. subtillis DAUFPE 16 2 0,1 M. luteus ATCC 2225 50 19 M. phlei (DAUFPE 70) ND 10 M. tuberculosis (DAUFPE 82) 50 20 S. faecalis ATCC 6057 ND 10 C. albicans (DAUFPE 1007) ND 10 Candida sp (DAUFPE 1224) ND 10 Candida sp (DAUFPE 4224) > 400 90 Candida sp (DAUFPE 4249) ND 10 A. niger (DAUFPE 203) ND 5-6 a See corresponding footnotes in table I. ND is not determined.

3.3. Antiprotozoal activity

The effort to find mechanism based small molecular inhibitior for T. cruzi

biochemistry target are continuous. Two recents publications related the discovery of

semicarbazones and thiosecarbazones as prominsing led compounds against cruzain

(cystein proteinase or also known GP57/61) [16, 17]. These studies investaged substitutions

at NH-1 and C-5 in (thio) semicarbazones group, however, did not investigated

substitutions at NH-3 position of the hydrazone. Therefore, we investigates the chemical

modification at NH-3 of semicarbazone chain to obtain new Structure Activity

Relantionship (SAR) dates for antichagasic nitrocompounds.

In decade of 60, Nitrofurazone was evaluated as antichagasic drug, by researches of

the Institute Oswaldo Cruz (RJ, BRAZIL). This drug administrated by oral route for 53


FARIAS, M. P. A.

days consecutively in the dose of 100mg/kg/day mice experimentally infected with T. cruzi

cured 95,4% of the animals (62/65) [18]. The clinical studied for acute Chagas disease

showed good results, with few collateral effects, however, the study of chronic cases

obtained good clinical results, but several side effects were observed at the third week of

Nitrofurazone administration (10 to 30mg/kg/day), with suspension of the treatment [19].

Table 3: Culture growth inhibition and bioavailability of developed 5-nitrofurfuryl derivatives.

Y strain Drug IC50 (µM) (±0.5)a

rPGINizb

Bioavailability CLog P c

Nitrofurazone 2,20 PGI = 40% 0,23

2 4,63 0,7 1,57 3 6,64 0,4 2,07 4 4,71 0,7 2,76 5 1,05 1,8 2,85 Benznidazole 1,82 1,2 aThe IC50 values for each drug compound studied in the Y of T. cruzi strain was expressed as mean ± 0.5 for three independent experiments. brPGINiz is ratio of percentage of growth inhibition at 1,5 µM for Nitroturazone (PGI is percentage of growth inhibition at 1,5 µM). c Bioavailability is expressed as log P, calculated using the demo SRC’s LogKow (KowWin) Program software.

Nitrofurazone (NF) and derivatives was characterized for activity against

epimastigote form of T. cruzi ( IC50 in µM ). In this study we used the noninfective

epimastigote form, as has been done in several other studies with other nitrofuran

derivatives as well as other synthetic potential trypanocidal agents, which have also proved

to be efficient against the trypomastigote and amastigote forms [20]. Moreover, the

epimastigote form is a suitable model for studying the mode of action of the compounds

employed in the present study. Since the low molecular weight thiol content in the

trypomastigote and amastigote forms of T. cruzi is lower than in the epimastigote form

[21], should render these compounds more effective in the infective and intracellular

replicative forms.


FARIAS, M. P. A.

The results are summarized in table 3. The compound N2,N4-dipentyl-Nitrofurazone

(5) was the most potent antitrypanosomal agent (with mean IC50 of 1,08 µM). The simple

extension of the n-butyl of 2 to n-pentyl 3 reduce the in this agents, however, the extension

of n-butyl (compound 4) to n-pentyl (compound 5) gives three times improvement of

activity, with potency equivalent to Benzimidazole ( IC50 = 1,82 µM) and more potent than

prototype, Nitrofurazone (IC50 = 2,20 µM). These results could show that the

Nitrofurazone is an potent antitrypanosomal agent, but, presumably, present limitation in

transport for cross cell membranes. It is well known that compound with low or negative

clog P (bioavailability) values cross the cell membranes very poorly [21]. We interpret

these finding to indicate that the improvement of clog P is important parameter for

optimization of antichagasic agents.

3.4. Preliminary Toxicity Test

The toxicity test (Letal dose or LD50) of 2-butyl-1-(5-

nitrofurfurylidene)semicarbazida (2) was performed in intraperitoneal way. The activity in

vivo was carried through for the derivative 2 (more potent antimicrobial derivative),

revealed LD50 = 186 mg/kg, In this assay, these compounds induce significants behavioral

effects at some dosages, and clinical signals to both doses included motor uncoordination,

hiperactivity, tremors, decrease of muscle tone, prostração and labored brating. In the

present study, we verified that the derivative showed an slightly more toxic than the

prototype (Nitrofurazone showed LD50 = 300 mg/kg), however, this prototype is less

liposoluble than compound 2, with poor power of crossing-cell membrane.


FARIAS, M. P. A.

3.5. Evaluation of the Preliminary Toxicity in organ

The study of toxicity of organs it showed in turn that, with the increase of the

lipofilia, a bigger reach of the organs for the drug occurs, being lethal in the dose of 305

mg/Kg managed in male albinic mice with 100% of deaths. The study it proves the hepatic

toxicity of the derivative, also present in the archetype, besides disclosing toxicity in other

organs that the archetype for possessing one bad solubility does not obtain to reach, as for

example the brain that revealed well modified what it proves the increase of the lipofilia of

the new derivative for this way through of the brain barrier; the study still it observed a

reach in organs as lung in degree varied of damage, and the kidneys.

However for evaluation end of the toxicity of organs, the study with the evaluation

of the organs of the animals in the dose of 70 becomes thus necessary complementary

mg/Kg managed in male albinic mice with 0% of deaths, being able itself to make a

comparative degree in the doses biggest and lesser in that it refers to the reach of the drug

in the organs.

4. Experimental

4.1. Chemistry

1H-NMR spectra were recorded on a Varian UNITY plus-300 MHz NMR

spectrophotometer using CDCl3 as solvent as tetramethylsilane as an internal standard. IR

spectra were obtained on using KBr pellets. Microanalyses for C, H, N were performed in a

EA1110 apparatus and were within ±0.4% of the required theoretical values. The melting

points were determined using a Thomas Hoover apparatus and the results are given without

correction. Thin-layer chromatography was carried out on silica gel plates having

fluorescence indicator F254 (0.2 mm, E. Merck); the spots were visualised with UV light.

Column chromatography was performed on silica using Kiesegel 60 (230-400 mesh, E.

Merck). All reagents used in the present work were of analytical grade.


FARIAS, M. P. A.

4.1.1. General Procedure for the synthesis of N2-alkyl-Nitrofurazones derivatives.

To a stirred mixture in dimethylformamide (DMF), as solvent, of Nitrofurazone,

0,02mol, potassium carbonate (K2CO3 0,02mol) and alkyl halide 0,021 mol under room

temerature. After 48h., the mixture was taken up in 100 mL of water and then extracted

with three 20mL portions of ethyl acetate. The organic phase was washed with water,

filtered and dried (Na2SO4). The residue was chromatographed on silica gel with 2% ethyl

acetate in hexane.

4.1.1.1. 2-butyl-1-(5-nitrofurfurylidene)semicarbazida (2): Yield: 65%. m.p. 110-112oC.

Rf: 0.66 (ethyl acetate:hexane 6:4); 1H NMR CDCl3 (δ ppm): 7.42 (s, 1H, CH); 7.37 (d,

1H, Het-H, J= 3.89Hz), 6.80 (d, 1H, Het-H, J= 3.89Hz); 6.63 (s, 2H, NH2), 3.93 (t, 2H,

CH2N, J= 7.19Hz), 1.60-1.47 (m, 2H, CH2), 1.45-1.31 (m, 2H, CH2), 0.95 (t, 3H, CH3, J=

7.19Hz). 13C-NMR CDCl3 (δ ppm): 156.08(C6), 152.68(C1), 151.78 (C4), 123.73(C5),

113.52 (C2), 110.76 (C3), 40.77 (C7), 27.16 (C8), 20.03(C9), 13.71(C10). Anal. Calcd. for

C10H14O4N4: C, 47.24; H, 5.55; N, 22.03. Found: C, 47.25; H, 5.88; N, 22.17.

4.1.1.2. 2-pentyl-1-(5-nitrofurfurylidene)semicarbazida (3): Yield: 70%. m.p. 116-118 oC.

Rf: 0.69 (ethyl acetate:hexane 6:4); 1H NMR CDCl3 (δ ppm): 7.42 (s, 1H, CH); 7.38 (d,

1H, Het-H, J= 3.59Hz), 6.81 (d, 1H, Het-H, J= 3.59Hz); 6.62 (s, 2H, NH2), 3.92 (t, 2H,

CH2N, J=7,49Hz), 1.62-1.42 (m, 2H, CH2), 1.40-1.23 (m, 4H, 2CH2), 0.90 (t, 3H, CH3 J=

6,59Hz). 13C-NMR CDCl3 (δ ppm): 156.12(C6), 152.65(C1), 151.75 (C4), 123.83(C5),

113.51 (C2), 110.80(C3), 41.00 (C7), 28.84 (C8), 24.85(C9), 22.35(C10), 13.93(C11).

Anal. Calcd. for C11H16O4N4: C, 49.24; H, 6.01; N, 20.88. Found: C, 49.08; H, 6.07; N,

20.75.


FARIAS, M. P. A.

4.1.1.3. 2,4-dibutyl-1-(5-nitrofurfurylidene)semicarbazida (4): Yield: 50%. Yellow oil. Rf:

0.82 (ethyl acetate:hexane 6:4); 1H NMR CDCl3 (δ ppm): 7.38 (s, 1H, CH); 7.37 (d, 1H,

Het-H, J = 3.89Hz), 6.76 (d, 1H, Het-H, J = 3.89Hz); 6,57 (s, 1H, NH), 3.92 (t, 2H, CH2N,

J = 7.19Hz), 3.31 (t, 2H, CH2NH, J=7.19Hz), 1.61-1.45 (m, 4H, 2CH2), 1.44-1.25 (m, 4H,

2CH2), 0.94 (t, 6H, 2CH3, J = 7.19Hz). ). 13C-NMR CDCl3 (δ ppm): 154.86(C6),

153.13(C1), 151.59 (C4), 122.32(C5), 113.62 (C2), 110.28(C3), 41.00 (C7), 40.27 (C11),

32.11(C8), 27.14(C12), 20.06(C9), 20.03(C13), 13.75(C10), 13.70(C14). Anal. Calcd. for


4.1.1.4. 2,4-dipentyl-1-(5-nitrofurfurylidene)semicarbazida (5): Yield: 45%. Yellow oil.

Rf: 0.85 (ethyl acetate / hexane 6:4); 1H NMR: CDCl3 (δ ppm): 7.38 (s, 1H, CH); 7.37(d,

1H, Het-H, J = 3.89Hz), 6.78 (d, 1H, Het-H, J = 3.89Hz); 6.60 (t, 1H, NH, J = 5.69Hz),

3.91 (t, 2H, CH2N, J =7.49Hz), 3.29 (td, 2H, CH2NH, J =6.89Hz, J =5.69Hz), 1.62-1.44

(m, 4H, 2CH2), 1.41-1.20 (m, 8H, 4CH2), 0.89 (t, 3H, CH3, J =6.59Hz), 0.88 (t, 3H, CH3, J

=6.59Hz). 13C-NMR CDCl3 (δ ppm): 154.61(C6), 153.09(C1), 151.52(C4), 122.29(C5),

113.64 (C2), 110.33(C3), 41.11 (C7), 40.46 (C12), 30.82(C8), 29.66(C13), 28.94(C9),

28.80(C14), 24.72(C10), 22.27(C15), 13.92(C11), 13.85(C16). Anal. Calcd. for


4.1.1.5. 5-nitro-2-furaldehyde semicarbazone: (1) m.p. 116-118oC. Rf: 0.69 (ethyl acetate /

hexane 6:4); 1H NMR: DMSOd6 (δ ppm): 10.81 (s, 1H, NH); 7.78 (s, 1H, CH); 7.77(d, 1H,


FARIAS, M. P. A.

Het-H, J = 3.89Hz), 7.23 (d, 1H, Het-H, J = 3.89Hz); 6.64 (s, 2H, NH2). 13C-NMR

DMSOd6 (δ ppm): 157.00(C6), 152.00(C1), 154.00(C4), 128.45(C5), 115.95(C2),

112.80(C3). Anal. Calcd. for C6H6O4N4: C, 36.37; H, 3.05; N, 28.27. Found: C, 36.43; H,

3.02; N, 28.32.

4.2. Biology Properties

4.2.1. Antimicrobial activity

The antimicrobial activity was determined in vitro by disc diffusion method [17]

against S. aureus ATCC 6538, B. subtilis DAUFPE 16, P. aeruginosa ATCC 27853, E. coli

ATCC 25992, K. pneumoniae ATCC 29665, S. enteridites (DAUFPE 414), M. luteus (100)

ATCC 2225, M. phlei (DAUFPE 70), M. smegmatus (DAUFPE 71), M. tuberculosis-

607(DAUFPE 82), S. faecalis (ATCC 6057), Cândida sp (DAUFPE 720), Cândida sp

(DAUFPE 1224), Cândida sp (DAUFPE 4249), Cândida sp (DAUFPE 4224), C. cruzei

(DAUFPE 1002), C. albicans (DAUFPE 1007), A. niger (DAUFPE 2003) and Neurospora

sp. It is dispensed into Petri dishes to yield a uniform depth of 6mm. Overnight cultures

were grown in adequate broth and temperature and diluted to obtain an opacity equivalent

to 0.5 on the Mc Farland scale. The drugs are weighed and dissolved in acetone to give

concentrations equal to 300µg/mL. The discs were placed in the surface of culture medium

after the complete evaporation of acetone. The plates are incubated for 18 hours at adequate

temperature.

4.2.2. Bacteriostatic Activity

The bacteriostatic activity were determined in vitro. Overnight cultures were grown

at 37oC in Mueller-Hinton broth and afterwards, diluted to obtain an opacity equivalent to


FARIAS, M. P. A.

0.5 on the McFarland scale. The compound is solubulized in DMSO and a serial 2-fold

dilution of compound is prepared in water to give concentrations 10-fold higher than the the

final one desired. A series of tubes was prepared by mixing one part of each dilution of

compound with nine parts of Mueller-Hinton broth, previously inoculated and incubated for

18 h at 37ºC. The MIC is considered to be the lowest drug concentration for wich there is

no microbial growth.

4.2.3. Antichagasic Activity

Epimastigotes of T. cruzi (Y strain) were cultivated at 26 °C in Liver Infusion Tryptose

medium (LIT) supplemented with 10% fetal calf serum, 1% hemin, 1% R9 medium and 50

µg/mL gentamycin. Parasites (106 cells/mL) were cultivated in a fresh medium in the

absence or in the presence of the compounds being tested or 0.01 mg/mL benznidazol

(Rochagan, Roche). Cell growth was determined after 11 days of culture by counting viable

forms in a hemacytometer. The compounds were prepared from a stock solution in DMSO.

To determine the IC50, cultures of Y strain epimastigotes in the presence of different

concentrations of the compounds were evaluated after 11 days as described above. IC50

calculation was carried out using non-linear regression on Prism 4.0 GraphPad software.

The percentage of inhibition was calculated in relation to untreated cultures.

4.2.4 Toxicity tests

Male Suiss adult white mice (ca. 25-28g.) were divided in groups and private of eat

20 hours before injections. The drugs were diluted in Tween 80 (two crops) and saline

(0,9%). The single intraperitoneal injections are given and the general effects were

observed during 60 min and continued about 72 hs after injection. The control group

receiving solvent only.


FARIAS, M. P. A.

4.2.5 Histopathologyc tests of the diverse organs

All the manipulation involving the animals was carried through in accordance with

the international principles for biomedical research involving animal as norms of the

International Guiding Principles animals (CIOMS) - Geneva 1985 Will be Biomedical

Research Involving and all the procedures had been carried through in accordance with the

"Consensus Recommendations carried through on Effective Animal Institutional Care and

Use Committees - NIH and USDA - published by the laboratory of Animal Science, special

edition, January of 1987. [23]

Of all the animals had been harvested fragments of lung, kidneys, liver, heart and

brain, that had been conditioned in solution of tampon formalina 10% and had destined it

the confection of histological blades. The fragments had been submitted to the cleavage,

being after that processed in accordance with the techniques of routine for the paraffin

inclusion block-type, cut in microtome the 3-4 micrometers and blush for the technique of

Hematoxilina-Eosina (H.E.) according to described methodology for Behmer, Tolosa and

Freitas Neto (1976).[24]

It analyzes it of you plate them was carried through in optic microscope. All processing of

the material and optic microscopy had been carried through in the area of animal Pathology

of the Department of Veterinary Medicine of Universidade Federal Rural de Pernambuco.

Acknowledgements

The authors thank from the “Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico” (CNPq), the “Fundação de Amparo a Ciência do Estado de Pernambuco”

(FACEPE) and Banco do Nordeste for financial support. We gratefully acknowledge the


FARIAS, M. P. A.

Departamento de Química Fundamental, Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) for

recording the 1H-NMR, 13C-NMR and IR spectra and Microanalyses of all compounds.

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FARIAS, M. P. A.

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NIH and USDA. http: //www.hospitalheliopolis.org.br/cep_2.htm. Acessado em 13 de

fevereiro de 2006.

[24] Behmer, O.A.; Tolosa, E.M.C.; Freitas Neto, A.G. Manual de técnicas para histologia

normal e patológica. São Paulo: Edart – São Paulo Livraria Editora Ltda. 1976. cap. 1-9, p.

27-80, 257.


FARIAS, M. P. A.

Submetido ao periódico: Microbiological Research

Capítulo 3

Artigo 2 – Evaluation of Nitrofurazone and N2-alkyl-derivatives against methicillin

resistant Staphylococcus aureus (MRSA) multi-drug resistance


FARIAS, M. P. A.

Evaluation of Nitrofurazone and N2-alkyl-derivatives against methicillin

resistant Staphylococcus aureus (MRSA) multi-drug resistance

Dalci José Brondani1+/ , Maria Nelly Caetano Pisciottano*, Maria Patrícia A. de Farias1, Diogo R. de Magalhães Moreira, Rogério Ribeiro Soares* , Antônio Marcos Saraiva* and

Ana Cristina Lima Leite

1LABSINFA – Laboratório de Planejamento, Avaliação e Síntese de Fármacos, Dept. de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde- Universidade Federal de Pernambuco, CEP.50740-521

Recife, PE, Brasil *GIPDIRA (Grupo Internacional de Pesquisas em Doenças Infecciosas e Resistência Antimicrobiana)-Laboratório de Analise Microbiológica, Dept de Ciências Farmacêuticas, CCS, UFPE

Nitrofurazone (5-nitro-2-furaldehyde semicarbazone) is a potent prodrug derivative of nitrofuran that is often used in combination therapies against skin injuries typically by E. coli, Clostridum perfringens, Proteus ssp and S. aureus. In the present study, Nitrofurazone and novel derivatives N2-alkylated were screened for their antibacterial in vitro activities against methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) multi-drug resistance. The butyl derivative had the highest antimicrobial activities than Nitrofurazone, with minimum inhibitory concentrations in the range of less of 16µg/mL.

Keywords: Nitrofurazone - antibacterial activities - Staphylococcus aureus MRSA

Financial support: CNPq, CAPES and FACEPE + Corresponding author. Fax: +55-81-2126.8510. E-mail: [email protected] * GIPDIRA fellowship lead


FARIAS, M. P. A.

INTRODUCTION

In recent years, the numbers of life-threatening infections caused multi-drug

resistant Gram-positive and Gram-negative pathogen bacteria have reached an alarming

level in many countries around the world (Berber et al. 2003, Mitscher et al. 1999). The

clinic reports in worldwide have independently described the emergence of vancomycin

intermediate Staphylococcus aureus (VISA) and methicillin-resistance Staphylococcus

aureus (MRSA) isolates and other human pathogen Gram-positives isolates (Lee 1999).

Given the evidence for the rapid global spread of resistant clinical isolates and the

appearance of drug resistence strains among community acquired infections, the needs for

discovery or optimisation of new antimicrobial agents active towards these resistant strains

is of paramount importance (Bradford 2001).

Prodrugs are particularly appealing as therapeutic agents because of their selective

toxicity for microorganisms possessing specific activating enzymes (Abreu et al. 2002).

Nitrofurazone (5-nitro-2-furaldehyde semicarbazone), is a potent prodrug derivative of

nitrofuran that is often used in combination therapies and as choice second against Gram-

negatives and Gram-positives infections of skin injuries typically by E. coli, Proteus ssp, C.

perfringens, and also S. aureus. (Chamberlain 1997). However, resistance to Nitrofurazone

is very common and reduces the efficacy of Nitrofurazone containing regimes and also

toxic profile of this drug has limited its use in medicine. Nitrofurazone presents weak

solubility (clog P = 0.23), as much in watery way as also in solvent polar, being its total

solubility gotten in Dimethylformamide or Dimethylsulfoxide. The molecular

modifications in Nitrofurazone structure so far are limited alkylation / arylation in the NH

of amide or then in reduction of hidrazone group, both modifications do not reveal


FARIAS, M. P. A.

improvement in the pharmacological optimisation of these compounds (Toscher, 1997). It

is well known that compounds with low or negative C log P values cross cell membranes

very poorly (Gago et al. 1987). In order to investigate the lipophilicity influence in the

biological profile of Nitrofurazone structure, some compounds were synthesised containing

flexible N2-alkyl group (butyl and pentyl) in side chain. In the present study, these novel

derivatives of Nitrofurazone were evaluated against methicillin resistant Staphylococcus

aureus (MRSA) multi-drug resistance.

MATERIALS AND METHODS Drugs – Nitrofurazone (NF) and derivatives NF01 and NF02 was synthesised from

Labsinfa-UFPE (Msc Thesis 2006) and are showed in figure 1. Dimethylsulfoxide (DMSO)

and all other reagents were purchased from Merck, analytical grade.

OO2NN

N NH2

O

RNF R= HNF01 R= butilNF02 R= pentil

Figure 1: Nitrofurazone (NF) and N2-alkyl derivatives NF01 and NF02

Microorganisms - The following microorganisms were used for detecting antibacterial

activity: S. aureus (ATCC 6538), S. aureus (ATCC 6538P), S. aureus (ATCC 25923), and

also 15 clinical isolates of methicillin resistant S. aureus MRSA multiresistant, with

phenotype characterisation determinated (Caetano et al. 2002).


FARIAS, M. P. A.

Preparation of samples for testing – Nitrofurazone and derivatives was dissolved in 30% of

DMSO. For the minimum inhibitory concentration (MIC) tests, the drugs was first diluted

to the highest concentration (32 µg/mL) and then serial twofold dilutions were performed in

a concentration range from 32µg/mL to 0,125 µg/mL in plates containing Müeller-Hinton

Agar. The final concentration of DMSO into plates was 3%, a value that did not cause

interference in the antimicrobial activity.

Antimicrobial susceptibility testing - MIC of drugs was determined by macrodilution

technique as described by the National Committee for Clinical Laboratory Standards

(1996). The bacteria inoculum was prepared from recent cultures, suspended in saline

solution The cultures were diluted in Müeller-Hinton Agar at a density adjusted to a

McFarland 0.5 BaSO4 standard [1 to 2 x108 colony-forming units (CFU)/mL]. The final

inoculum was of approximately 5 x 105 CFU/mL. To facilitate testing of a large volume of

cultures, the Steers replicator is used, then plates were incubated at 36 ± 1°C for 24 h. The

antimicrobial testing was conducted in duplicate. MIC was the lowest concentration of

antimicrobial agent that completely inhibited growth of the microorganisms in the plates.

RESULTS AND DISCUSSION

We screened antimicrobial activity in vitro for Nitrofurazone (NF) and N2-alkyl

derivatives (NF01 and NF02) against several strains of Staphylococcus aureus (three

reference strains and fifteen clinical isolated MRSA multirestant), using tetracycline

cloridrate as standard drug in assay. The values for minimum inhibitory concentrations of

compound are showed in table.


FARIAS, M. P. A.

TABLE

TABLE: Activity of Nitrofurazone (NF) and compounds NF01 and NF02 against methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) multi-drug resistance

MIC (µg/mL) Strains Origin of the Strains

NF NF01 NF02 TC+ S. aureus ATCC 6538 Reference strain

8.0

8.0

8.0

4.0

S. aureus ATCC 6538P Reference strain

16

4.0

8.0

8.0

S. aureus ATCC 25923 Reference strain 8.0 8.0 8.0 8.0 S. aureus AM-860 Hemoculture 8.0 8.0 8.0 8.0 S. aureus AM-922 Wound of leg 8.0 8.0 16 8.0 S. aureus AM-952 Cavitary liquid 16 8.0 16 16 S. aureus AM-1003 Secretion of wound 8.0 8.0 16 32 S. aureus AM-1004 Catheter tip 16 16 16 32 S. aureus AM-1005 Secretion of leather hair 8.0 8.0 16 16 S. aureus AM-1006 Secretion of surgery wound 8.0 16 16 16 S. aureus AM-1007 Double lumen catheter 8.0 8.0 16 32 S. aureus AM-1008 Tracheal secretion

16

16

16

32

S. aureus AM-1009 Catheter tip 8.0 16 16 32 S. aureus AM-1010 Tracheal secretion 16 16 16 32 S. aureus AM-1011 Tracheal secretion 16 8.0 16 32 S. aureus AM-1012 Catheter exit tip 16 8.0 16 32 S. aureus AM-1013 Catheter tip 16 8.0 16 32 S. aureus AM-1014 Catheter tip

16

8.0

16

32

+TC is Tetracycline, standard drug. AM is Collection of the Laboratory of Analyse Microbiology, UFPE-Brazil. The results had shown that the Nitrofurazone and compounds NF01 and NF02 had been

active for several strains, being distinguished it action against strains AM1004, AM1009,

AM1012, AM1013 and AM1014, this strains with origin from catheter tip. We can also

emphasize that for strains AM922, AM1003 and AM1005, Nitrofurazone and also NF01

shown a moderate activity, strengthening the importance of the nitrocompounds for the


FARIAS, M. P. A.

treatment of cutaneous infections for Gram-positive agents. In summary, we can affirms

that derivative NF01 is more potent than the Nitrofurazone, considering its good values for

the MIC and that also it has a superior molecular weight, what results in a lesser molar

concentration for the cases where the values of the MIC is equal for the Nitrofurazone. The

gotten results had disclosed that the increase of the liposolubility for the Nitrofurazone is an

important molecular modification for optimisation of this farmaco.

REFERENCES

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FARIAS, M. P. A.

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FARIAS, M. P. A.

Capítulo 4

Conclusões e Perspectivas


FARIAS, M. P. A.

CONCLUSÕES e PESPECTIVAS

Neste trabalho de dissertação, preocupou-se em desenvolver uma nova metodologia

via de acesso geral e seletiva para a obtenção dos derivados N2 e N2

,N4 da Nitrofurazona,

à partir de reagentes simples, de acesso fácil e de custo satisfatório. Este interesse de

sintetizar novos derivados da Nitrofurazona deve-se ao seu grande espectro de atividade

biológica, bem como sua alta toxicidade.

No primeiro capítulo desta dissertação, realizou-se a revisão bibliográfica do

protótipo Nitrofurazona e seus derivados, abordou-se desde a primeira síntese, para a

Nitrofurazona, até os dias atuais com suas modificações, além de relatar-se toda sua

atividade biológica já estudada.

No segundo capítulo, apresentou-se o primeiro artigo, onde se obteve os novos

derivados alquílicos da Nitrofurazona de boa estabilidade a partir da própria Nitrofurazona

como produto de partida, e halogenetos de alquila, resultando na obtenção de 4 novos

derivados; estes foram caracterizados através de Espectroscopia de Infravermelho e

Ressonância Magnética Nuclear de prótons e de carbono 13; os novos derivados foram

avaliados in vitro frente às bactérias Gram positivas e Gram negativas, além de fungos

filamentosos e leveduras; os resultados revelaram que os derivados N-alquil são mais

potentes que o protótipo Nitrofurazona, principalmente para as bactérias Gram positivas.

O derivado que apresentou maior potencial de inibição para os microorganismos

testados foi o N2 butil (composto 2). O derivado N2

,N4 -dipentil (composto 5) apresentou

maior potencia quando avaliado frente as cepas y de T. cruzi na forma evolutiva


FARIAS, M. P. A.

epimastigota e na realização de IC50, mostrando melhores resultados para o derivado com

IC50 de 1,05 nm, contra 2,2 nm da nitrofurazona e 1,8 nm do Benznidazol ® ( Rochagan ).

Comprovando-se com este trabalho uma maior potencia deste frente a quimioterapia

antachagasica.

A DL50 do derivado mais ativo o N2 butil foi igual a 186mg/kg, apresentado-se

levemente mais tóxica que o protótipo, a Nitrofurazona. Ainda neste capítulo realizou-se a

avaliação de toxicidade de órgãos, onde se pode observar maior alcance no número de

órgãos pelo derivado, o que é justificável pelo aumento da lipofilia da molécula.

No terceiro capítulo apresentamos o segundo artigo, submetido ao periódico:

Microbiological Research, onde mencionamos a atividade do derivado N2 butil frente às

cepas de Staphylococcus aureus (MRSA), multi-druga resistente, em comparativo com o

protótipo Nitrofurazona, podendo-se constatar a melhor resposta do derivado N2 butil que

apresentou MIC de 4 e 2 vezes melhor que o protótipo para a maioria das cepas avaliadas.

Contudo, apesar da toxicidade do novo derivado ter se revelado levemente mais

elevada, faz-se necessário estudos mais aprofundados com um gráfico de doses respostas,

podendo ainda no futuro todos estes problemas ainda encontrados frente a toxicidade serem

eliminados com o melhoramento da tecnologia farmacêutica com a produção de formas

farmacêuticas inteligentes, sejam fármacos de liberação controladas, sejam com o processo

de nanoencapsulação de derivado, vislumbrando assim sua integração no mercado

farmacêutico como potente fármaco bioativo, haja visto seu potencial observado.


FARIAS, M. P. A.

Capítulo 5

Anexos


FARIAS, M. P. A.


FARIAS, M. P. A.

Farias, Maria Patrícia Albuquerque de

Novos derivados da nitrofurazona : síntese,avaliação da toxicidade aguda e estudo dasatividades antimicrobiana e antichagásica / MariaPatrícia Albuquerque de Farias. – Recife : O Autor,2006.

90 folhas : il., fig., tab.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2006.

Inclui bibliografia e anexos.

1. Ciências farmacêuticas – Síntese de fármacos. 2. Doenças tropicais – Doença de Chagas, Brasil – Aspectos morfológicos, patogenia e transmissão. 3. Derivados nitrofurânicos – testes de toxicidade, atividades antimicrobiana e antichagásica. 4. Novos fármacos – Síntese orgânica – Grupo Nitro – Importância na química medicinal. I. Título.

615.28 CDU (2.ed.) UFPE 615.3 CDD (22.ed.) BC2006-337

novos derivados da nitrofurazona: sÍntese, avaliaÇÃo da ... · fisiopatologia da doença de...

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