UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

INSTITUTO BIOMÉDICO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOMÉDICAS

(FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA)

Nataly Melo dos Santos

ANÁLISE DO PERFIL DE EXPRESSÃO E PAPEL FISIOPATOLÓGICO DE ISOFORMAS DA P53 E DA OSTEOPONTINA EM LINHAGENS CELULARES DE

CARCINOMA DE ENDOMÉTRIO

Niterói/RJ, 2016

ii

Nataly Melo dos Santos ANÁLISE DO PERFIL DE EXPRESSÃO E PAPEL FISIOPATOLÓGICO

DE ISOFORMAS DA P53 E DA OSTEOPONTINA EM LINHAGENS CELULARES DE CARCINOMA DE ENDOMÉTRIO

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biomédicas (Fisiologia e Farmacologia) da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Biomédicas. Área de concentração: Fisiologia.

Orientador: Etel Rodrigues Pereira Gimba

iii

Niterói/RJ, 2016

FICHA CATALOGRÁFICA

iv

Nataly Melo dos Santos ANÁLISE DO PERFIL DE EXPRESSÃO E PAPEL FISIOPATOLÓGICO

DE ISOFORMAS DA P53 E DA OSTEOPONTINA EM LINHAGENS CELULARES DE CARCINOMA DE ENDOMÉTRIO

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biomédicas (Fisiologia e Farmacologia) da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Biomédicas. Área de concentração: Fisiologia.

Aprovada em: 13 de dezembro de 2016.

BANCA EXAMINADORA

___________________________________________ Doutora Etel Rodrigues Pereira Gimba

Universidade Federal Fluminense

___________________________________________ Doutor Pablo Pandolfo

Universidade Federal Fluminense

___________________________________________ Doutora Claudia Victoria de Moura Gallo

Universidade do Estado do Rio de Jeneiro

___________________________________________ Doutora Thereza Fonseca Quírico-Santos

Universidade Federal Fluminense

v

Dedico este trabalho a todos que me ajudaram na realização do mesmo e, em especial, aos meus pais, que estiveram sempre presentes e não mediram esforços para que eu pudesse realizar meus sonhos.

vi

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por iluminar meu caminho, guiar meus passos e me proteger nos momentos mais difíceis.

Aos meus pais, Anatário e Nilza, e a minha amada irmã, Stefany, que sempre me apoiaram e me deram suporte para continuar, aturando meu mau humor e minha falta de paciência.

Ao meu amigo, companheiro, namorado e noivo, Pablo, por estar sempre ao meu lado, apoiando minhas decisões, compreendendo a minha ausência e o meu cansaço, principalmente, nesses últimos meses.

A minha querida orientadora, Dra. Etel Gimba por ter acreditado em mim, até mesmo quando eu não acreditei. Sempre com muita paciência e carinho, sabendo puxar a orelha quando preciso e acalentar quando necessário.

As amigas de laboratório, Paula, Abigail, Vanessa Franco e Ana Clara, por serem tão companheiras, nos bons e maus momentos, dividindo as aflições e as tortas no final do expediente. E por me ajudarem na realização desse trabalho, pois sem vocês eu não conseguiria.

Sem deixar de agradecer a Vanessa Mignone e Ana Emília por me ensinarem e me acompanharem no inicio de tudo, sempre torcendo por mim. E claro que não podia faltar, a Isabela, em especial, por sempre me tratar com tanto carinho, compreensão e paciência de um monge budista todas as vezes que fui perturbá-la com alguma coisa.

Ao Dr. Jose Morgado e seus alunos, por nos receberem tão bem em seu laboratório e sempre estarem presentes e prontos para ajudar. Agradeço também ao técnico Giovanne, por ser sempre tão prestativo em preparar as maravilhosas soluções. Agradeço também à todos os funcionários da segurança e limpeza do INCA, que alegram meus dias com sorrisos tão sinceros no rosto.

Aos professores e alunos da pós-graduação, que me receberam de braços abertos. Principalmente a coordenadora Dra. Letícia Oliveira, pelo carinho e cuidado que tem com todos os alunos. Especial agradecimento ao Durval, que além de compartilharmos a mesma orientadora e sermos companheiros de pós, se tornou um grande amigo.

Aos amigos do colégio e da faculdade, por compreenderem minha ausência durante todo esse período, mas sempre pensando em mim.

Aos meus tios (as) e primos (as) que tanto amo e sempre me apoiaram dando forças para seguir em frente.

Ao meu gato amado, Gão, por me fazer companhia nos dias e noites de estudo. Às minhas cadelas, Laisa e Gaia, por alegrarem os dias mais difíceis com tanto amor.

vii

“Não acredite em algo simplesmente porque ouviu. Não acredite em algo simplesmente porque falaram a respeito. Não acredite em algo simplesmente porque está escrito em seus livros religiosos. Não acredite em algo só porque seus professores e mestres dizem que é verdade. Não acreditem em tradições só porque foram passadas de geração em geração. Mas depois de muita análise e observação, se você vê que algo concorda com a razão, e que conduz ao bem e beneficio de todos, aceite-o e viva-o”

Siddhartha Gautam Buddha

viii

RESUMO

Santos, Nataly Melo dos. Análise do perfil de expressão e papel fisiopatológico de isoformas da p53 e da osteopontina em linhagens celulares de carcinoma de endométrio. Dissertação (Mestrado em Ciências Biomédicas - Fisiologia) da Universidade Federal Fluminense, Niterói, 2016.

Uma série de genes vem sendo estudados por terem sua expressão aberrante em tumores de endométrio. Dentre eles, a osteopontina (OPN) e a p53, os quais são expressos de forma aberrante no carcinoma de endométrio (CE). Tem sido demonstrado que a expressão da OPN é capaz de regular a expressão de p53 e vice-versa. No entanto, ainda não há dados sobre as isoformas destes produtos gênicos e suas possíveis relações no CE. Este trabalho teve por objetivo avaliar o perfil de expressão e o potencial papel fisiopatológico das isoformas da OPN e da p53 em distintas linhagens celulares de endométrio. A expressão destes alvos foi avaliada por PCR em tempo real, imunoblot e imunofluorescência. Observamos que a OPNa é a isoforma predominante dentre as três isoformas, tanto em linhagens tumorais quanto não tumorais de endométrio. No entanto, apenas a isoforma OPNc apresenta expressão diferencial entre linhagens tumorais e uma não tumoral. De forma similar, todas as isoformas de p53 também são expressas nestas linhagens investigadas, sendo a p53 completa a isoforma predominante em linhagens tumorais e a Δ40p53 a segunda mais expressa, em especial em linhagens representativas de tumores do Tipo I. A variante Δ40p53 apresenta expressão predominante em linhagens celulares não tumorais de endométrio. Em conjunto, estes dados evidenciam correlação entre a expressão predominante da isoforma OPNa e a variante completa da p53, com padrões específicos de expressão da OPNc e da Δ40p53, de acordo as linhagens analisadas. Estes achados abrem perspectivas da potencial aplicação de isoformas variantes da OPN e de p53 enquanto biomarcadores no diagnóstico diferencial e também para avaliação prognóstica em tumores de endométrio.

Palavras-chave: Osteopontina, p53 e câncer de endométrio.

ix

ABSTRACT

Santos, Nataly Melo dos. Analysis of expression profile and pathophysiological role of p53 and osteopontin isoforms in endometrial carcinoma cell lines. Dissertation (Master in Biomedical Sciences - Physiology) da Universidade Federal Fluminense, Niterói, 2016.

Several genes have been studied by being overexpressed in endometrial tumors. Among them, osteopontin (OPN) and p53, which are overexpressed in endometrial carcinoma (EC). It has been demonstrated that the expression of OPN can regulate the expression of p53 and vice-versa. However, data is lacking regarding these gene products and their putative associations in EC. This work aims to evaluate the expression profile and the potential physiopathological roles of OPN and p53 isoforms in distinct endometrial cell lines.The expression of these gene targets has been evaluated here by real time PCR, immunoblot and immunofluorescense. We observed that OPNa is the predominant isoform among those three tested, both in tumor and non-tumoral cell lines. However, only OPNc isoform is differentially expressed between tumor and non-tumoral cell lines. Similarly, all p53 isoforms are expressed in these tested cell lines, being the full lenght p53 the predominant isoform in tumor cell lines, while Δ40p53 is the second variant in expression levels, especially in cell lines that are representative of Type I tumors. The Δ40p53 variant has predominat expression in non-tumoral cell lines. As a whole, these data evidence correlation between the predominant expression of OPNa and the full lenght p53 variant, with specific expression patterns observed for OPNc and Δ40p53, according to analyzed cell lines. These data open perspectives of the potential use of OPN and p53 isoform variants as biomarkers for differential diagnosis and prognostic evaluation in endometrial tumors.

Keywords: Ostopontin, p53 and endometrial cancer

x

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Estimativa da incidência de câncer na população brasileira........................1

Figura 2. Representação do estadiamento cirúrgico no CE, da FIGO........................4

Figura 3. Aparência histológica dos dois principais tipos de carcinoma......................4

Figura 4. A OPN influencia as diversas características e etapas da progressão

tumoral. Adaptado de Shevde e Samant, 2014 .......................................................11

Figura 5. Papel da OPN em diferentes etapas da cascata metastática.....................12

Figura 6. Splicing alternativo das isoformas da osteopontina....................................15

Figura 7. Estímulos que levam a indução de p53.....................................................17

Figura 8. Estrutura modular da p53............................................................................18

Figura 9. Regiões das isoformas da proteína p53 em humanos................................20

Figura 10. Análise da expressão protéica da isoforma completa de p53 por imunoblot

em linhagens tumorais e não tumorais de endométrio...............................................36

Figura 11. Análise de imunofluorescência representativa da expressão da p53

(canônica) em célula tumoral e não tumoral..............................................................37

xi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Estadiamento cirúrgico, da FIGO, de câncer de endométrio.......................3

Tabela 2. Classificação dualista do câncer de endométrio, classificada por

subtipos........................................................................................................................5

Tabela 3. Validação e utilidade clínica de biomarcadores de câncer de

endométrio....................................................................................................................7

Tabela 4. Prevalência das alterações moleculares nos subtipos do câncer de

endométrio ...................................................................................................................9

Tabela 5. Características das linhagens celulares utilizadas.....................................22

Tabela 6. Sequência de oligonucleotídeos utilizados para amplificação de cada

isoforma da osteopontina...........................................................................................24

Tabela 7. Sequência de oligonucleotídeos utilizados para amplificação das isoforma

da p53.........................................................................................................................25

xii

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1. Nível de expressão das isoformas de OPN nas linhagens celulares de CE

e na não tumoral E6/E7/TERT...................................................................................27

Gráfico 2. Comparação entre o nível de expressão das isoformas de OPN nas

linhagens celulares de CE com a linhagem não tumoral E6/E7/TERT......................28

Gráfico 3. Comparação entre o nível de expressão das isoformas de OPN entre as

linhagens celulares do CE..........................................................................................29

Gráfico 4. Comparação entre o nível de expressão das isoformas da p53 entre as

linhagens celulares do CE e não tumorais de endométrio.........................................31

Gráfico 5. Comparação entre o nível de expressão das isoformas da p53 nas

linhagens celulares de CE com a linhagem não tumoral E6/E7/TERT......................33

Gráfico 6. Comparação entre o nível de expressão das isoformas da p53 nas

linhagens celulares de CE com a linhagem não tumoral EM42.................................34

Gráfico 7. Nível de expressão das isoformas p53 e Δ40p53 nas linhagens celulares

do CE comparadas entre si........................................................................................35

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AKT Serina-treonina quinase ATCC American type culture collection ΑVΒ3 Integrina CD44 Homing cell adhesion molecule cDNA DNA complementar CE Câncer de endométrio CPCNP Câncer de pulmão de não pequenas células DBD Domínio de ligação ao dna DMEM Dulbecco’s modified eagle medium DMEM/F-12 Dulbecco’s modified eagle médium/ nutrient f12 ham DNA Ácido desoxirribonucleico EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid ECL Entry-level peroxidase substrate for enhanced chemiluminescence EGTA Aminopolycarboxylic acid ERK Extracellular signal–regulated kinases FGFR2 Fibroblast growth factor receptor 2 FIGO Internetional federation of gynecology and obstetrics GADD45 The growth arrest and dna damage-inducible 45 HER 2 Human epidermal growth factor receptor 2 INCA Instituto nacional de câncer KRAS Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog MgCl2 Cloreto de magnésio MMPS Metaloproteínas de matriz NACL Cloreto de sódio NA3VO4 Sodium orthovanadate NEG Domínio de regulação negativa NLS Sequência de localização nuclear NP-40 Nonyl phenoxypolyethoxylethanol OPN Osteopontina P21 Cyclin-dependent kinase inhibitor 1 P53 Proteína citoplasmática, de massa molecular 53 kda PBS Tampão fosfato-salino PCR Polymerase chain reaction PI3K Fosfadilinositol-3-quinase PTEN Phosphatase and tensin homolog P/S Penicilina/ estreptomicina PXXP Domínio rico em prolina qRT-PCR Real time detection PCR RE Receptor de estrogênio REG Região reguladora RNAm RNA mensageiro ROS Espécies reativas de oxigênio RP Receptor de progesterona RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction SDS Dodecil sulfato de sódio

xiv

SFB Soro fetal bovino siRNA Small interfering RNA TAD Dominio de transativação TAE Tris-acetato-edta TET Domínio de tretamerização TP53 Gene da proteína p53 UPA Plasminogênio uroquinase

xv

SUMÁRIO

RESUMO ................................................................................................................................................ viii

ABSTRACT ................................................................................................................................................ ix

LISTA DE ILUSTRAÇÕES ............................................................................................................................. x

LISTA DE TABELAS .................................................................................................................................... xi

LISTA DE GRÁFICOS ................................................................................................................................ xii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ........................................................................................................ xiii

SUMÁRIO ................................................................................................................................................ xv

1. Introdução ....................................................................................................................................... 1

1.1. Câncer de Endométrio................................................................................................................. 1

1.1.1. Biologia e epidemiologia ......................................................................................................... 1

1.1.2. Biomarcadores no câncer de endométrio............................................................................... 6

1.1.3. Alterações moleculares no CE ................................................................................................. 9

1.1.4. OPN e P53 .............................................................................................................................. 10

1.2. Osteopontina ............................................................................................................................. 11

1.2.1. Funções gerais da osteopontina ........................................................................................... 11

1.2.2. Osteopontina no CE............................................................................................................... 13

1.2.3. Isoformas de splicing da OPN ................................................................................................ 14

1.3. P53 ............................................................................................................................................. 16

1.3.1. Função e estrutura ................................................................................................................ 16

1.3.2. P53 no câncer ........................................................................................................................ 18

1.3.3. Isoformas de p53 ................................................................................................................... 19

2. Objetivo ......................................................................................................................................... 21

3. Metodologia .................................................................................................................................. 22

3.1. Cultura de células ...................................................................................................................... 22

xvi

3.2. Extração de RNA total ............................................................................................................... 22

3.3. Síntese de DNA complementar (cDNA) ..................................................................................... 23

3.4. RT-PCR ....................................................................................................................................... 23

3.5. Eletroforese em gel de agarose ................................................................................................ 23

3.6. Ensaios de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) ............................................................ 23

3.7. Imunoblot .................................................................................................................................. 25

3.8. Imunofluorescência ................................................................................................................... 26

4. Resultados ..................................................................................................................................... 26

4.1. Avaliação da expressão das isoformas da OPN em linhagens celulares tumorais e não tumorais

de endométrio: ..................................................................................................................................... 26

4.2. Avaliação da expressão das isoformas de p53 em linhagens celulares tumorais e não tumorais

de endométrio: ..................................................................................................................................... 30

4.3. Expressão protéica da isoforma completa da p53 .................................................................... 36

5. Discussão ....................................................................................................................................... 38

6. Conclusão ...................................................................................................................................... 38

7. Bibliografia .................................................................................................................................... 45

1

1. Introdução

1.1. Câncer de Endométrio

1.1.1. Biologia e epidemiologia

O câncer de endométrio (CE) continua a ser a malignidade ginecológica

mais comum em países desenvolvidos, estando sua prevalência ainda em elevação.

Espera-se que se torne ainda mais comum devido à prevalência da obesidade, um

dos principais fatores de risco do CE em todo o mundo. Estimam-se, para o Brasil,

no ano de 2016, 6.950 casos novos de CE, com um risco estimado de 6,95 casos a

cada 100 mil mulheres, ocupando a sexta posição na estimativa geral de tipos de

cânceres em mulher (Figura 1). Dados do INCA apontam que o CE é o quinto mais

incidente na Região Sudeste (9,58/100 mil). Na Região Centro-Oeste (5,99/ 100 mil),

ocupa a sétima posição. Na Região Nordeste (4,58/100 mil), é o oitavo mais

frequente. Na Região Norte (2,71/100 mil), ocupa a nona posição. Enquanto na

Região Sul (5,21/100 mil), é o 12º mais frequente (1).

Figura 1: Estimativa da incidência de câncer na população brasileira para o ano de 2016 (1)

2

Uma vez que a doença é frequentemente sintomática em um estágio

precoce, o CE é muitas vezes diagnosticado em fase inicial. Historicamente, o

tratamento padrão consiste de histerectomia, salpingo-ooforectomia bilateral

(remoção de ambos os ovários e das duas trompas de Falópio) e dissecção de

linfonodos pélvicos, seguida por terapia adjuvante adaptada com base em dados

histológicos (2,3).

O tratamento do câncer de endométrio se tornou mais complexo durante os

últimos 5-10 anos por várias razões: mudanças na classificação histológica que

afeta o tratamento cirúrgico, terapias adjuvantes e prognóstico; mudanças nas

indicações e modalidades de linfadenectomia; e as discrepâncias entre as várias

classificações utilizadas para caracterizar os fatores de risco de recorrência (4).

Os fatores de risco bem estabelecidos para CE tem sido identificados, sendo

em alguns casos de relevância para o desenvolvimento futuro de intervenções

terapêuticas (4). O principal fator de risco é a exposição a estrogênio endógeno e

exógeno associados à obesidade, diabetes, idade precoce da menarca,

nuliparidade, menopausa tardia, idade avançada (≥ 55 anos) e o uso de tamoxifeno

(3). Em contraste, os dados epidemiológicos mostram que o uso de contraceptivos

orais confere proteção em longo prazo contra o CE (4).

As variáveis diagnósticas mais importantes para o CE são o grau histológico

e o estadiamento cirúrgico do tumor, proposto pela primeira vez em 1988 pela

International Federation of Gynecology and Obstetrics (FIGO), incluindo a avaliação

da profundidade da invasão miometrial e metástases em linfonodos (Tabela 1 e

Figura 2) (5).

3

Tabela 1: Estadiamento cirúrgico, da FIGO, de câncer de endométrio (5)

Estágio Definição

I Tumor confinado ao corpo uterino

IA Tumor limitado ao endométrio

IB Invasão maior do que 50% do miométrio

IC Invasão menor do que 50% do miométrio

II Tumor invade o cérvix, mas não se estende além do útero

IIA Invasão do endocérvix

IIB Invasão cervical estromal

III O tumor se estende além do útero, mas não para fora da pelve

IIIA Invasão da serosa, anexos ou citologia peritoneal positiva

IIIB Invasão da vagina

IIIC Linfadenopatia pélvica e/ou paraórtica

IV O tumor estende-se para fora da pelve e/ou invade a bexiga ou a mucosa retal

IVA Invasão da bexiga ou mucosa retal

IVB Metástases à distância (inclusive linfadenopatia intra-abdominal ou inguinal)

4

Figura 2: Representação do estadiamento cirúrgico no CE, da FIGO (6)

Desde 1983, o CE tem sido classificado em dois subgrupos histológicos, tipo

I e tipo II, com base em características clínico-patológicas, as quais apresentam

alterações moleculares únicas e comportamentos clínicos distintos (Figura 3) (2).

Figura 3: Aparência histológica dos dois principais tipos de carcinoma endometrial. (A) Tipo I,

adenocarcinoma endometrióide mostrando glândulas tubulares alinhadas com bordas luminal lisas e

um ninho arredondado de metaplasia escamosa. (B) Tipo II, carcinoma seroso uterino com glândulas

alinhadas por células tumorais de alto grau com fronteira luminal irregular devido ao crescimento do

tumor. Adaptada de Joanne KL Rutgers, 2015 (7).

5

O CE do Tipo I ou endometrióide é dependente de estrogênio e representa

70 - 80% dos casos. Esta via relacionada com estrogênio é associada à hiperplasia

endometrial secundária em resposta à estimulação estrogênica, e mais comumente

de baixo grau, com diferenciação endometrióide e receptores hormonais positivos.

Nos tumores de CE do Tipo I a via fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) / serina-treonina

quinase AKT é a mais frequentemente alterada (3,4).

Já os tumores CE do Tipo II consistem de carcinomas não-endometrióides,

independentes de estrogênio, incluindo os carcinomas serosos, de células claras, os

carcinossarcomas, os adenocarcinomas mucinosos, os carcinomas de células

escamosas e os adenocarcinomas mistos. O CE não relacionado a estrogênio surge

de um endométrio atrófico. Eles normalmente são carcinomas de alto grau, de

diferenciação não-endometrióide, apresentam aneuploidias, e expressão negativa

e/ou fraca de receptores hormonais. As alterações moleculares mais comuns

observadas são mutações de p53 e p16, superexpressão ou amplificação de HER2

e diminuição da expressão de E-caderina (Tabela 2) (3,4).

De acordo com a Organização Mundial da Saúde, os CE são também

classificados com base na sua arquitetura, como: Grau 1: menos de 5% de células

com padrão de crescimento sólido não-escamosas; Grau 2: 6% a 50% de células

com padrão de crescimento sólido não-escamosas; e Grau 3: mais de 50% de

células com padrão de crescimento sólido não-escamosas (8).

Tabela 2: Características dualistas do câncer de endométrio, classificada por subtipos (3,8)

Tipo I Tipo II

Características clínicas

associadas

Síndrome metabólica: obesidade,

hiperlipidemia, hiperglicemia e

aumento das concentrações de

estrogênio

Nenhuma

Grau Baixo (G1, G2 ou G3) Alto (G3)

Expressão de receptores Positivo Negativo

6

hormonais

Histologia Endometrióide Não-endometrióide

Estabilidade genômica Diplóide, instabilidade de

microssatélites frequentes (40%)

Aneuplóide

Mutação em TP53 Não Sim

Alterações genéticas

associadas

Perda da função de PTEN;

Mutações em PIK3CA e KRAs;

Alterações em β-caterina

Perda de função de

p16;

Superexpressão de

HER2;

Alterações em E-

caderina

Prognóstico Bom (sobrevivência global de 85%

em 5 anos)

Ruim (sobrevida global

de 55% em 5 anos)

1.1.2. Biomarcadores no câncer de endométrio

Os biomarcadores são definidos como parâmetros que são medidos de

forma objetiva e avaliados como indicadores de processos biológicos normais,

patogênicos ou mesmo respostas farmacológicas a uma intervenção terapêutica. O

uso de biomarcadores pode auxiliar a desvendar a complexidade de casos

patológicos individuais e apoiar a capacidade de tomada de decisão para

abordagens terapêuticas (9).

O câncer de endométrio é uma doença desafiadora, a qual ainda não pode

ser detectada precocemente por meio de ensaios não invasivos e confiáveis.

Embora avanços na genômica tenham possibilitado a identificação de vários

marcadores biológicos envolvidos na patogênese do endométrio, ainda não há

biomarcadores específicos (10).

7

Um biomarcador (ou um painel de biomarcadores) que poderia predizer com

confiabilidade boa ou má resposta à terapia em pacientes com câncer de endométrio

teria forte utilidade clínica (8). No entanto, a robustez científica de várias etapas

essenciais no desenvolvimento de múltiplos marcadores de prognóstico tem sido

relatada para o CE, tais como a expressão de receptores de estrogênio e

progesterona (RE e RP) que já foram validados em outros tipos tumorais, mas ainda

estão em estudo para o CE e alterações na expressão de genes supressores

tumorais p53 e PTEN que já possuem validação analítica e clínica para a sua

utilização rotineira na clínica (Tabela 3) (11).

Vários parâmetros clinico-patológicos são atualmente utilizados para prever

a evolução dessa doença e para decidir a necessidade para o tratamento adjuvante.

Estes incluem estadiamento cirúrgico, o tipo histológico, o grau, a profundidade de

invasão do miométrio, a invasão do estroma cervical, a invasão do espaço linfático-

vascular e citologia peritoneal. Outros fatores prognósticos de risco incluem a

superexpressão da p53, a diminuição da expressão da p16 nuclear, a expressão do

receptor de progesterona, e diminuição da expressão do supressor de tumor PTEN.

No entanto, a maioria destes parâmetros tem sido criticada por sua subjetividade e

reprodutibilidade limitada. A identificação de novos marcadores prognósticos é

importante para uma melhor identificação de pacientes com risco elevado de recaída

ou morte (10,12).

Tabela 3: Validação e utilidade clínica de biomarcadores de câncer de endométrio (9).

Biomarcadores Validação analítica Validação clínica Utilidade Clínica

Aneuploidia Testes validados Pior prognóstico Não implementado

rotineiramente

Superexpressão de

HER2

Validado em outros

tipos de tumor

Tumores agressivos

(marcador de

prognóstico /

subtipagem)

8

Resposta ao

tratamento com HER

2 (preditivo)

Nenhuma evidência de

melhoria da atividade

Baixa expressão de

RE/PR

Validado em outros

tipos de tumor

Pior prognóstico /

metástase linfonodal

Em estudo

Resposta ao

tratamento endócrino

Não testado

prospectivamente

Superexpressão de

p53 (mutante) e

PTEN

Testes validados Tumores agressivos

(marcador de

prognóstico /

subtipagem)

Subtipo relacionado,

clinicamente aplicado

Entretanto, até o presente momento, poucos biomarcadores aplicados para

o CE são baseados em abordagens moleculares. Desta forma, são utilizados na

clínica o estadiamento cirúrgico (segundo a Federação Internacional de Ginecologia

e Obstetrícia - FIGO), a avaliação do subtipo do tumoral e o grau histológico, de

forma a aconselhar em relação ao prognóstico e a necessidade de tratamento

adjuvante. No entanto, estas abordagens apresentam benefícios de sobrevida

incertos. Tem sido relatado que até 20% dos tumores CE de baixo risco, com base

nestes biomarcadores, acabarão tendo recidivas, e que apenas 50% dos pacientes

com tumores de alto risco serão totalmente curados (9,13,14).

Desta forma, são necessários biomarcadores adicionais que possam melhor

identificar os pacientes que devem ser tratados de forma mais branda, como

também informações que possam evitar excesso de tratamento em pacientes que

não apresentarão recidivas, especialmente em função das pacientes CE serem

idosas que apresentam comorbidades (9).

9

1.1.3. Alterações moleculares no CE

Há várias evidências que sugerem que o CE do Tipo I e o Tipo II são

molecularmente distintos, uma vez que estes tumores apresentam distintas

aberrações genéticas e vias de sinalizações não funcionais (Tabela 4) (13). Tem

sido demonstrado que a via de PI3K/PTEN/AKT é a mais frequentemente alterada

nos tumores do Tipo I. Estes tumores apresentam desregulação por mutações

oncogênicas, perda da função da PTEN, promovendo a proliferação celular

descontrolada e sobrevivência tumoral. Por outro lado, as alterações das principais

vias dos tumores do Tipo II, envolvem os supressores tumorais p53 e/ou p16, os

quais promovem a desregulação do ciclo celular e instabilidade genética (3,4,13).

Tabela 4: Prevalência das alterações moleculares nos subtipos do câncer de endométrio (13)

Alterações Prevalência no tipo I (%) Prevalência no tipo II (%)

PIK3CA mutado 30

20

PIK3CA amplificação 2 - 14 46

KRAS mutado 11 - 26 2

AKT mutado 3 0

PTEN perda de função 83 5

Instabilidade de

microsatélites

20 - 45 0 - 5

Acumulação nuclear de

β-catenina

18 - 47 0

Perda de E-caderina 5 - 50 62 - 87

Mutações em TP53 20 90

Perda da função do p16 8 45

Superexpressão de HER2 3 - 10 32

10

Amplificação de HER2 1 17

Mutações de FGFR2 12 - 16 1

Dentre os genes que vem sendo estudados no CE, a osteopontina (OPN) e

a p53 são alguns destes produtos gênicos expressos de forma aberrante no CE,

sendo o foco do presente projeto (15,16).

1.1.4. OPN e P53

Diversos estudos sugerem que a expressão da OPN é controlada por p53,

ou seja, o gene da OPN é um alvo direto de ativação da transcrição por TP53 (15–

18). Li et al. (2012) demonstraram por imunohistoquímica, que a expressão da p53

foi significativamente correlacionada com a OPN, o que é uma prova indireta da

expressão da OPN regulada por p53.

O gene da OPN apresenta um elemento responsivo à p53 funcional na sua

região promotora, confirmando assim que existe uma interação entre o promotor da

OPN e da proteína p53 in vivo (16,18). Este dado fornece um novo modelo de

participação do TP53 na vigilância imunológica, envolvendo a interação com o

sistema imune do hospedeiro para evitar que células danificadas sofram uma

transformação maligna variando consideravelmente entre os diferentes tipos de

células (15,18).

Conforme citado no inicio do item, a regulação direta da OPN por TP53

lançam luz sobre um dos mecanismos pelo qual o gene TP53 protege as células de

transformação maligna e sugere a possibilidade de desenvolvimento de uma nova

forma de terapia do câncer (15).

11

1.2. Osteopontina

1.2.1. Funções gerais da osteopontina

A osteopontina (OPN) é uma molécula multifuncional que está envolvida em

processos fisiopatológicos. Consiste em uma fosfoproteína da matriz extracelular,

expressa numa variedade de tipos celulares, incluindo ossos, medula óssea;

cartilagens; dentina; rins; cérebro; tecidos vasculares; glândulas mamárias,

salivares, sudoríparas, bilares e pancreáticas; nos túbulos renais distais, intestino,

bem como em macrófagos e linfócitos ativados (19). OPN também é encontrada em

fluidos biológicos, tais como o leite, urina, sangue, fluido seminal e em tumores.

Portanto, a OPN apresenta diversas funções, incluindo o controle da mineralização,

o acoplamento da formação óssea, a ligação de células osteogênicas na matriz

óssea e a reabsorção de nutrientes. É também expressa por fibroblastos no estroma

embrionário e em locais de cicatrização de feridas. Também tem sido descrita como

responsável pela fixação e pela migração celular, sendo assim associada com a

tumorigênese e formação de metástases (Figura 4) (19–21).

Figura 4: A OPN influencia as diversas características e etapas da progressão tumoral.

Adaptado de Shevde e Samant, 2014 (22).

12

Estes aspectos da OPN foram clinica e funcionalmente associados com

diversos tipos de câncer (Figura 5). Diversos estudos mostram a expressão de OPN

em células tumorais e em células encontradas no microambiente tumoral. A

expressão da OPN em células tumorais tem sido demonstrada numa variedade de

tumores, incluindo os de mama, próstata, ovário, estômago, colo do útero, pulmão,

entre outros (12,20,21,23).

Figura 5: Papel da OPN em diferentes etapas da cascata metastática. No sitio primário, as

células tumorais secretam níveis elevados de OPN, que favorecem a sua sobrevivência e proliferação

celular. As células tumorais com capacidade de adesão e migração aumentadas podem se destacar

do tumor primário e degradar a membrana basal para invadir o estroma. A proteólise associada da

matriz extracelular é mediada por metaloproteinases de matriz (MMPs) e ativador de plasminogênio

uroquinase (uPA). A OPN ligada à integrina αVβ3 e/ou CD44 pode ativamente promover a proteólise

local através da ligação de MMP3. A expressão da OPN por células tumorais promove a migração e

adesão de células endoteliais, que são cruciais durante a angiogênese. O transporte de células

tumorais na circulação é um dos passos limitantes para a metástase em órgãos distantes, dada a

interação com o sistema imune do hospedeiro. A inserção nos vasos mostra que a expressão e a

apresentação da OPN sobre a superfície das células tumorais lhes permitem sequestrar e ativar o

fator H do complemento e proteger-se da lise. Em sítios distantes, o extravasamento dessas células é

seguido pela formação de um tumor secundário. Os sinais proliferativos, de sobrevivência e

angiogênese por colônias metastáticas recentemente formadas ocorrem principalmente através de

13

mecanismos semelhantes aos que são utilizados durante os passos iniciais da progressão tumoral

com a OPN secretada pelo tumor continuando a atuar como promotor de progressão (24).

Diversos estudos têm determinado como os níveis de expressão da OPN

total no tecido tumoral ou no plasma ou soro de pacientes se correlacionam com a

sobrevida livre de doença em diversos tipos de câncer. Os níveis da OPN no tecido

tumoral ou no plasma de pacientes podem também fornecer informações de

prognóstico, bem como pode ser usada como um bom marcador biológico para

monitorar a progressão da doença (20).

1.2.2. Osteopontina no CE

Foi descrito que a OPN é expressa em linhagens celulares de CE (23,25).

Aproximadamente 71% dos tumores de CE apresentam alta expressão de OPN

citoplasmática (26,27). Influenciando a progressão desse tumor através da via de

sinalização AKT e ERK1/2. Promovendo a migração, invasão e proliferação de

células tumorais (28). Ramachandran et al. (2012) pontuam que a OPN parece

modular a proliferação celular e, potencialmente, a sobrevivência de células de CE.

De acordo com a distribuição do ciclo celular e ensaio de fragmentação de DNA, a

proporção de células apoptóticas aumenta à medida que o nível da OPN diminui. A

OPN também é capaz de mediar a adesão celular, a interação célula-célula, a

invasão e a formação de colônias em células de tumor em sistemas experimentais, a

OPN é uma candidata fundamental para um marcador de prognóstico do tumor de

CE e um alvo potencial para a intervenção terapêutica no controle de metástases

(21).

Segundo Briese et al. (2006) há uma alta expressão da OPN observada em

67,4% das amostras de tumores analisadas. A superexpressão da OPN foi

observada em tumores endometrióides bem diferenciados de grau 1, indicando que

um nível basal de expressão da OPN ainda pode ser protetora para esse tipo

tumoral. Entretanto, ao observar o aumento do grau de malignidade do CE, verifica-

14

se um aumento das áreas com baixo nível de expressão da OPN ou perda completa

de sua expressão. Em contraste, os carcinomas serosos (tipo II), de alto grau de

malignidade, apresentaram uma alta expressão da OPN. Estes dados nos indicam

que os diferentes padrões de expressão da OPN em tumores do endométrio podem

adicionalmente apoiar a diversidade biológica dos subtipos tumorais, em conjunto

com outros marcadores (29).

Dados de Cho et al. (2009) mostraram que em todas as amostras de câncer

de endométrio estudadas e em 3 linhagens celulares de CE observou-se níveis de

OPN significativamente maiores do que no endométrio normal. Hahne et al. (2013)

pontua ainda que a osteopontina parece desempenhar um papel nos processos

apoptóticos das células tumorais de endométrio. E sua inibição através de siRNAs

leva a uma maior susceptibilidade à terapia de radiação e pode inibir o

desenvolvimento da invasão e metástase nessas células.

Apesar destes diversos estudos e o conhecido papel das isoformas da OPN

em distintos tumores, nenhum destes aborda as isoformas variantes da OPN

principalmente no CE.

1.2.3. Isoformas de splicing da OPN

O splicing é catalisado por spliceossomas, uma maquinaria macromolecular

constituída por cinco pequenas partículas de ribonucleoproteínas nucleares e muitas

proteínas auxiliares. É a interação entre os fatores reguladores do splicing com

sequências presentes em éxons e íntrons que vão determinar se um éxon alvo será

incluído ou excluído no transcrito maduro final. Esta flexibilidade na regulação do

splicing permite uma variedade alternativa de éxons nos transcritos codificados por

praticamente todos os genes, expandindo consideravelmente o potencial de

codificação e plasticidade do genoma (30). O splicing alternativo do pré-RNAm é o

mecanismo pelo qual os íntrons podem ser removidos ou retidos no pré-RNAm, de

forma que os éxons podem ser incluídos ou não no RNAm maduro, levando à

geração de potencialmente centenas de proteínas a partir de um RNAm primário

(31).

15

A transcrição da OPN humana está sujeita a splicing alternativo, gerando

três isoformas de processamento. OPNa é a isoforma completa, a OPNb não contém

o éxon 5, enquanto na OPNc o éxon 4 está deletado (Figura 6). A isoforma completa

tem sido amplamente caracterizada em diferentes processos celulares, e seu papel

na biologia do câncer tem sido amplamente investigada. Estudos sobre o papel da

expressão funcional e o perfil de isoformas humanas de splicing da OPN são mais

recentes e concentrou-se principalmente nas células tumorais (32).

Figura 6: Splicing alternativo das isoformas da osteopontina (Adaptado de Many et al. (2016). A

isoforma OPNa é a variante completa, a OPNb não contém o éxon 5 e a OPNc tem o éxon 4 deletado

(33).

As três isoformas da OPN desempenham papéis específicos em diferentes

tipos de tumores. Por exemplo, no câncer de mama a isoforma OPNc ativa a invasão

e as propriedades de adesão (34). As isoformas OPNa e OPNb são expressas em

amostras tumorais e não tumorais de ovário, ao passo que a OPNc é

especificamente expressa em amostras de tumor de ovário. Nestes tumores, a

OPNc ativa a proliferação, migração, invasão, crescimento independente de

ancoragem e a formação de tumores (35).

Em células de câncer de próstata, a OPNb e OPNc estimulam a proliferação,

a migração e a invasão (36), e em células de carcinoma hepatocelular, a OPNa e

OPNb promovem a migração (34). Já a isoforma OPNa é expressa no plasma de

pacientes saudáveis e em pacientes com câncer de pulmão de não pequenas

células (CPCNP), estando substancialmente elevada em pacientes com CPCNP

(22).

16

1.3. P53

1.3.1. Função e estrutura

A proteína p53 é o produto do gene supressor de tumor, TP53, que tem

recebido significativa atenção por mais de 30 anos (37,38). É comumente apelidado

de "guardião do genoma", dado o seu papel crucial na manutenção da estabilidade

genética e na prevenção da formação do câncer (38,39).

Em condições homeostáticas normais, a p53 é uma proteína de curta

duração, que atua na regulação metabólica, na divisão e diferenciação celular, na

parada do ciclo celular, apoptose, senescência, fertilidade e resposta imunológica.

No entanto, em resposta a uma variedade de estímulos de estresse (40), incluindo

danos no DNA, ativação aberrante de oncogenes, choque térmico, infecção por

vírus, alteração de pH, hipóxia, perda do contato normal célula-célula, privação de

nutrientes, e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), a proteína p53 é

ativada. Dependendo do tipo de tecido e da extensão do dano celular, é

desencadeada uma resposta celular adequada, incluindo a parada do ciclo celular

e/ou morte celular programada (apoptose), impedindo assim a multiplicação das

células com danos que podem levar à formação do câncer (Figura 7) (37–39). A p53

também tem sido demonstrada por regular a geração de novos vasos sanguíneos

(angiogênese), uma atividade que é decisiva para a supressão de tumores (40)

17

Figura 7: Estímulos que levam a indução de p53. Uma grande variedade de estímulos de estresse

celular induz a expressão de p53, levando a mudanças coordenadas na expressão do gene e vários

resultados biológicos, dependendo do tipo de célula e tecido, intensidade e duração da tensão de

ativação. Adaptado de Meek (2015) (40).

Uma vez ativada, a p53 pode induzir a parada do ciclo celular na fase G1 ou

G2. Após danos ao DNA, a p53 induz p21, um inibidor de cinase dependente de

ciclina que medeia à parada do ciclo celular em fase G1 / S, permitindo a reparação

do DNA. Por outro lado, a p53 pode ativar GADD45, que regula a parada do ciclo

celular nas fases G2 / M. Assim, a presença de p53 funcional é importante para os

diferentes pontos de verificação do ciclo celular, permitindo que as células tenham

tempo para reparar os danos ao DNA (39).

Do ponto de vista estrutural, a p53 contém vários domínios que são

essenciais para mediar as suas várias funções (Figura 8) (40). Dois domínios de

transativação, denominados TAD1 e TAD2 respectivamente, estão localizados na

região N-terminal. O TAD2 sobrepõe-se com um domínio rico em prolina, o qual

apresenta importantes contribuições para a apoptose e a resposta à radiação γ. A

região central da proteína engloba a função de ligação de p53 ao DNA específica,

sendo essencial para a transativação, a repressão de alguns genes e supressão

tumoral. A região C-terminal contém sequências necessárias para a localização

nuclear e a ligação não específica ao DNA (37,39,40).

18

Figura 8: Estrutura modular da p53. A proteína p53 é mostrada esquematicamente, salientando

domínios funcionais importantes. TAD1 e TAD2 são os domínios de ativação da transcrição, NLS a

sequência de localização nuclear, TET o domínio de tetramerização e REG a região reguladora C-

terminal. Adaptado de Meek (2015) (40).

1.3.2. P53 no câncer

Está bem estabelecido que a proteína p53 apresenta um papel importante

no que diz respeito ao desenvolvimento e progressão do câncer, assim como a

resposta à quimioterapia (39). A interação entre p53 e as múltiplas vias envolvidas

na regulação do metabolismo e da homeostase celular é complexa e não totalmente

compreendida. A inativação da p53 é uma característica marcante de mudanças

tumorigênicas. Metade de todos os tumores possuem mutações na p53, tornando o

gene p53 (TP53) o gene mais mutado em tumores humanos (38).

Entretanto, a p53 pode também ser inibida por mecanismos independentes

de mutação (38). A inativação desta proteína pode ocorrer não apenas através de

mutações diretas ou deleções no próprio gene de p53, mas também por perturbar

qualquer uma das vias que regulam esta proteína (37,39). Em alguns tipos tumorais,

como o câncer de mama e a leucemia mielóide aguda (LMA), a mutação do gene

TP53 não é uma ocorrência frequente. Nos últimos anos, as isoformas de p53

emergiram como um mecanismo adicional de inativação, dados seus perfis de

expressão diferencial em tumores, em comparação com o tecido normal (39,40).

A expressão da proteína p53 tem sido relatada no endométrio normal e nos

pólipos endometriais durante a fase proliferativa tardia do ciclo menstrual.

Entretanto, a p53 foi mais frequentemente detectada em tumores não

endometrióides, como carcinosarcomas, do que nos tumores endometrióides (41).

Kontantinos et al. (2014) observou que a expressão elevada de p53 estava

relacionada às características morfológicas de agressividade (alto grau, estádio

avançado, subtipo tipo II, envolvimento miometrial) e isso faz acreditar que a p53

19

tem potencial papel no diagnóstico diferencial entre adenocarcinomas

endometrióides ambíguos de alto grau.

1.3.3. Isoformas de p53

A proteína p53 é codificada pelo gene TP53, composto por onze éxons, das

quais a primeiro é não-codificante, sendo altamente conservado ao longo da

evolução e está localizado no cromossomo humano 17p13.1 (39).

A proteína p53 canônica (também chamado p53, FLp53, p53α ou TAp53α)

foi a primeira isoforma da p53 a ser identificada. Pensou-se por 25 anos que esta

era a única isoforma codificada pelo gene TP53 humano. Posteriormente foram

descritas, pelo menos doze isoformas codificadas por este gene (p53, p53β, p53γ,

Δ40p53α, Δ40p53β, Δ40p53γ, Δ133p53α, Δ133p53β, Δ133p53γ, Δ160p53α,

Δ160p53β, e Δ160p53γ (39).

As isoformas de p53 são o resultado de mecanismos moleculares

conservados diferentes, os quais incluem o splicing alternativo, a utilização

alternativa do promotor e iniciação da tradução alternativa. Efetivamente, o TP53

contém um promotor interno (P2), em adição ao seu promotor proximal (P1). O

promotor proximal controla a expressão de p53 (TAp53α, -β, e -γ) e da variante

Δ40p53 (α, β, γ), enquanto que o promotor interno regula a expressão de Δ133p53

(α, β, γ) e de Δ160p53 (α, β, γ) (Figura 9). A partir destes promotores, os doze

isoformas de p53 são produzidas pela utilização de processamento alternativo, bem

como de iniciação alternativa da tradução (37,39).

20

Figura 9: Regiões das isoformas da proteína p53 em humanos. TAD: domínio de transativação;

PXXP: domínio rico em prolina; DBD: domínio de ligação ao DNA; NLS: sinal de localização nuclear;

OD: domínio de oligomerização; Neg: domínio de regulação negativa. Adaptado de Surget (2013)

(39,42).

Considerando-se o racional acima apresentado, e o ainda desconhecido

perfil de expressão das isoformas da OPN e de p53 em tumores de CE e suas

possíveis inter-relações na fisiopatologia e progressão deste tumor, torna-se

importante à avaliação do perfil de expressão de algumas destas variantes em

células de CE.

21

2. Objetivo

Avaliar o perfil de expressão das isoformas da OPN e de p53 em distintas

linhagens celulares tumorais e não tumorais de endométrio.

Objetivos específicos

1°- Caracterizar o perfil de expressão das isoformas da OPN e de p53 em

linhagens tumorais e não tumorais de endométrio.

2°- Verificar a correlação entre a expressão das isoformas de P53 e da OPN

e com as características das distintas linhagens celulares testadas.

22

3. Metodologia

3.1. Cultura de células

Utilizamos linhagens celulares tumorais de endométrio representativas de

subtipos de CE, grau histopatológico e status mutacional do TP53 diferentes,

(Ishikawa, RL-95-2, AN3CA e KLE) (Tabela 5) e linhagens celulares não tumorais de

endométrio (E6/E7/TERT e EM42). Estas linhagens foram cultivadas mediante as

condições recomendadas pela American Type Culture Collection, em meio DMEM

(Dulbecco's Modified Eagle Medium) ou DMEM/F12 (mistura de 1:1 -

Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient F-12 Ham), contendo 10% de

soro fetal bovino (SFB), e 1% de Penicilina/Estreptomicina (P/S).

Tabela 5: Características das linhagens celulares utilizadas (43–45)

Linhagens celulares Subtipo/Grau Gene TP53 mutado

E6/E7/TERT Não tumoral -

EM42 Não tumoral -

Ishikawa Tipo I / G1 ID *-

RL95-2 Tipo I / G2 Sim

AN3CA Tipo I / G3** Sim

KLE Tipo II / G3 Sim

*ID – informação desconhecida; ** Informações contraditórias, podendo ser do Tipo I/

G3 ou Tipo II/ G3

3.2. Extração de RNA total

O RNA total das linhagens foi extraído segundo o protocolo do mini kit de

extração “RNeasy” (Qiagen). Em seguida, as amostras foram quantificadas em

espectrofotômetro NanoDrop Lite da Thermo Scientific.

23

3.3. Síntese de DNA complementar (cDNA)

A síntese de cDNA foi realizada a partir de 1 µg de cada amostra de RNA

total, segundo o protocolo do kit “Superscript II First-Strand Synthesis System for RT-

PCR” (Invitrogen).

3.4. PCR com o cDNA das linhagens de endométrio

Foi preparada uma mistura de reação contendo 2μL de tampão Taq 10x

(Amersham, 0,2 μL de Taq polimerase 500 U, 0,4 μL de dNTPs 10 μM, 1 μL do

oligonucleotídeo forward a 10 μM e 1 μL do oligonucleotídeo reverse a 10 μM, 0,6 μL

de MqCl2 50 mM, 1 μL de cDNA (1000 ng/μL) e 13,8 μL de água destilada estéril

para um volume final de 20 μL.

O protocolo consiste em uma incubação inicial de 94ºC, seguido por 40

ciclos de 94°C por 5 minutos, 10 ciclos a 94°C por 30 segundos, 55ºC por 30

segundos e 72ºC por 1minuto e 30 segundos.

3.5. Eletroforese em gel de agarose

Os produtos de amplificação por PCR forma analisados por eletroforese

horizontal por meio de géis de agarose. Os géis utilizados continham 2% de agarose

(Invitrogen) dissolvida em o tampão TAE (Tris-Acetato-EDTA) e o corante

intercalante de DNA Gel Red (Biotium), de acordo com as recomendações do

fabricante. A corrida eletroforética foi realizada a 100 volts. Após a corrida, os géis

foram analisados no sistema de imagens Gel DocXR e as bandas obtidas foram

comparadas com o padrão de peso molecular de 1 Kb ou 100 bp (Invitrogen).

3.6. Ensaios de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR)

O nível de expressão das isoformas da OPN e p53 nas linhagens de CE e

nas não tumorais foram medidos por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR),

utilizando o sistema de detecção de SYBR Green (SYBR™ Green PCR Master Mix,

24

Applied Biosystems) e oligonucleotídeos específicos para cada isoforma (46–48),

utilizando o GAPDH como gene de expressão constitutiva das isoformas de OPN

(Tabela 6) e β-actina como gene de expressão constitutiva das isoformas de p53

(Tabela 7).

Todas as amostras foram analisadas em triplicata. O nível de expressão

relativa destes transcritos será calculado pelo método de quantificação relativa,

utilizando a fórmula 2-∆∆CT. A mistura da reação da PCR (20 μL) contém 10 μL de

SYBR Green, 5 μL de cDNA (sintetizado a partir de 1 μg de RNA total).

O programa utilizado, para ciclagem das isoformas de OPN, consiste de uma

incubação inicial a 50°C por 2 minutos, seguidos de uma incubação a 94°C por 5

minutos, 10 ciclos a 94°C por 30 segundos, 55ºC por 30 segundos e 72ºC por

1minuto e 30 segundos, 30 ciclos 94°C por 30 segundos, 50°C por 30 segundos e

72°C por 1 minuto e 30 segundos, seguidos por uma extensão final de 65ºC por 5

segundos e 95º por 5 segundos e curva de melt 95°C por 5 segundos, 50°C por 5

segundos e 95°C por 5 segundos.

E o programa utilizado, para as isoformas de p53, consiste de incubação

inicial a 50°C por 2 minutos, seguidos de uma incubação a 94°C por 3 minutos, 34

ciclos a 94°C por 1 minuto, 58°C por 1 minuto e 72°C por 1 minuto, seguidos por

uma incubação final a 72°C por 10 minutos e curva de melt a 95°C por 5 segundos,

50°C por 5 segundos e 95°C por 5 segundos.

Tabela 6: Sequência de oligonucleotídeos utilizados para amplificação de cada isoforma da

osteopontina

Gene Oligonucleotídeos Sequência 5’- 3’

OPNa OPNA F ATC TCC TAG CCC CAC AGA AT

OPNa OPNA R CAT CAG ACT GGT GAG AAT CAT C

OPNb OPNB F ATC TCC TAG CCC CAG AGA C

OPNb OPNB R AAA ATC AGT GAC CAG TTC ATC ATG AG

OPNc OPNC F CTG AGG AAA AGC AGA ATG CTG

OPNc OPNC R GTC AAT GGA GTC CTG GCT GT

GAPDH GAPDH F TGA CCC CTT CAT TGA CCT CA

GAPDH GAPDH R AGT CCT TCC ACG ATA CCA AA

25

Tabela 7: Sequência de oligonucleotídeos utilizados para amplificação das isoforma da p53

Gene Oligonucleotídeos Sequência 5’- 3’

P53 P53 β F GCA CAC CTA TTG CAA GCA AGG GTT C

P53 β P53 β R GCG AGC ACT GCC CAA CA

P53 β P53 γ F GAA AGC TGG TCT GGT CCT GAA

P53 γ P53 γ R ACT AAG CGA GCA CTG CCC AA

P53 γ Δ40 p53 F GTA AGT CAA GTA GCA TCT GAA GGG TG

Δ40 p53 Δ40 p53 R TCC CTG GAT TGG CAG CC

Δ40 p53 Δ133 p53 F TCC CTG GAT TGG CAG CC

Δ133 p53 Δ133 p53 R TGA CTT TCA ACT CTG TCT CCT TCC T

Δ133 p53 β-actina F GGC CAG ACC ATC GCT ATC TG

β-actina β-actina R GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA

β-actina CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC

3.7. Imunoblot

As células foram lavadas em PBS antes da incubação com tampão de lise (1%

de Triton X-100, 150 mM de NaCl, 10 mM de Tris, pH 7,4, 1 mM de EDTA, 1 mM de

EGTA, pH 8,0, 0,2 mM de Na3VO4, 0,2 mM de NP-40) em gelo durante 30 min. Os

lisados celulares foram separados por centrifugação a 13000rpm à 4°C durante 15

minutos e os sobrenadantes foram recolhidos. A concentração de proteína foi

determinada com o reagente BCA utilizando albumina de soro bovino (BSA) como

padrão. Os lisados de proteína de cada linhagem de CE e não tumorais, foram

separados por eletroforese em dodecil sulfato de sódio 10% (SDS) / gel de

acrilamida para p53, e transferidos por 1 hora à 250mA para membranas

nitrocelulose (GE). Após bloqueamento para ligação não específica com leite a 5% e

0,05% de Tween-20 em solução salina tamponada com fosfato, as membranas

foram incubadas overnight com o anticorpo anti-TP53 (diluição 0,8µg/mL - DO-1

Novus Biologicals). O reagente de detecção ECL (Amersham ECL Prime Western

Blotting Detection Reagent - GE) foi utilizado depois da incubação por 1 hora com o

anticorpo secundário anti- mouse (Peroxidase Labelled anti-mouse, diluição 1:20000

do kit ECL GE) e as membranas expostas no ChemiDoc MP system (BioRad).

26

3.8. Imunofluorescência

Para imunofluorescência, a linhagem tumoral AN3CA e a não tumoral

E6/E7/TERT foram plaqueadas em placa de 12 poços, sobre lamínulas em uma

densidade celular de 3x104 células por poço em 24h. Em seguida as células foram

fixadas em paraformaldeído 4% e incubadas overnight a 4°C com o anticorpo

primário anti-p53 (DO-1 - 1:400). Seguiu-se incubação com o anticorpo secundário

marcado fluorescentemente (Alexa Fluor 546) foi incubado por 1h em temperatura

ambiente. As imagens foram capturadas com o microscópio confocal de varredura a

laser FV10i-O, usando o software FV10-ASW (Olympus, Tóquio, Japão).

4. Resultados

4.1. Avaliação da expressão das isoformas da OPN em linhagens

celulares tumorais e não tumorais de endométrio:

Para avaliar o perfil de expressão das variantes de splicing alternativo da

OPN no CE, analisamos os níveis transcricionais da OPNa, OPNb e OPNc em

linhagens celulares tumorais e não tumorais de endométrio por qRT-PCR. As três

variantes da OPN se mostraram expressas nas linhagens tumorais e na linhagem

não tumoral E6/E7/TERT. A linhagem não tumoral EM42, não apresentou níveis

detectáveis de expressão de transcritos codificantes das isoformas da OPN. A

variante OPNa corresponde a isoforma de maior nível de expressão em relação as

demais isoformas (Gráfico 1) em todas as linhagens analisadas.

27

Isoformas da OPN

E6/

E7/TE

RT

Ishik

awa

RL95

-2

AN3C

AKLE

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0OPNa

OPNb

OPNc

*** *** *** *** ***

Linhagens celulares

Nív

el d

e e

xp

ressão

rela

tiva

Gráfico 1: Nível de expressão das isoformas de OPN nas linhagens celulares de CE e na não

tumoral E6/E7/TERT. Os níveis transcricionais das isoformas da OPN foram analisados por qRT-

PCR, utilizando oligonucleotídeos específicos para estas isoformas e o GAPDH foi utilizado como

gene de expressão constitutiva. Os resultados apresentados foram realizados em duplicata e em 3

ensaios independentes, utilizando a isoforma OPNa como amostra de referência para cada linhagem

(valor de refer6encia =1). Os valores de P referem-se à comparação entre o nível de expressão

transcricional da OPNa com as isoformas OPNb ou OPNc. ***P<0,001.

Comparamos também o nível de expressão das 3 isoformas da OPN entre

as distintas linhagens analisadas. A linhagem KLE (representativa do subtipo

tumoral II/G3) e a linhagem Ishikawa (representativa do tipo I/G1), apresentam

maiores níveis de expressão das três isoformas da OPN em comparação com a

linhagem não tumoral. Ressalta-se que a variante OPNc corresponde à isoforma de

maior nível de expressão nas linhagens tumorais (exceto a linhagem AN3CA) em

relação a não tumoral E6/E7/TERT (Grafico 2). Embora a isoforma OPNa seja a

variante de splicing mais expressa em relação às duas demais isoformas, tanto em

linhagens tumorais quanto não tumoral, a variante OPNc apresenta-se mais

28

diferencialmente expressa entre a maioria das linhagens tumorais e a não tumoral

de endométrio.

OPNa

OPNb

OPNc

0.0

0.5

1.0

1.5

1020304050

200400600800

E6/E7/TERT

Ishikawa

RL95-2

AN3CA

KLE

******

****

Isoformas da OPN

Nív

el d

e e

xp

ressão

rela

tiva

Gráfico 2: Comparação entre o nível de expressão das isoformas de OPN nas linhagens

celulares de CE com a linhagem não tumoral E6/E7/TERT. Os níveis transcricionais das isoformas

da OPN foram analisados por qRT-PCR, utilizando oligonucleotídeos específicos para estas

isoformas e o GAPDH foi utilizado como gene de expressão constitutiva. Os resultados apresentados

foram realizados em duplicata e em 3 ensaios independentes, utilizando a isoforma E6/E7/TERT

como amostra de referência para cada linhagem (valor de referência = 1). Os valores de P referem-se

à comparação entre o nível de expressão transcricional da OPNc em cada linhagem. *P<0,05 e

***P<0,001.

Comparando o nível de expressão das 3 isoformas da OPN apenas entre as

linhagens tumorais de graduação histológica distintas, observamos que a linhagem

celular KLE apresenta níveis de expressão mais elevados das 3 isoformas da OPN,

mesmo ao comparar com uma outra linhagem de grau G3, AN3CA (Gráfico 3C).

29

Isoforma OPNa

Ishikawa (I/G1) KLE (I/G3)

0

10

20

30

40

A

Linhagens celulares

Nív

el d

e e

xp

ressão

rela

tiva

Isoforma OPNb

Ishikawa (I/G1) KLE (I/G3)

0

10

20

30

40

Linhagens celulares

Nív

el d

e e

xp

ressão

rela

tiva

Isoforma OPNc

Ishikawa (I/G1) KLE (I/G3)

0

10

20

30

40

Linhagens celulares

Nív

el d

e e

xp

ressão

rela

tiva

Isoforma OPNa

RL95-2 (I/G2) KLE (I/G3)

0

5

10100

200

300

400

500

600

B

Linhagens celulares

Nív

el d

e e

xp

ressão

rela

tiva

Isoforma OPNb

RL95-2 (I/G2) KLE (I/G3)

0

5

10300

400

500

600

Linhagens celulares

Nív

el d

e e

xp

ressão

rela

tiva

Isoforma OPNc

RL95-2 (I/G2) KLE (I/G3)

0

5

10100

200

300

400

500

600

Linhagens celulares

Nív

el d

e e

xp

ressão

rela

tiva

Isoforma OPNa

AN3CA (I/G3) KLE (I/G3)

0

5

10

400

600

800

1000

1200

C

Linhagens celulares

Nív

el d

e e

xp

ressão

rela

tiva

Isoforma OPNb

AN3CA (I/G3) KLE (I/G3)

0

5

10800

1000

1200

Linhagens celulares

Nív

el d

e e

xp

ressão

rela

tiva

Isoforma OPNc

AN3CA (I/G3) KLE (I/G3)

0

5

10600

800

1000

1200

Linhagens celulares

Nív

el d

e e

xp

ressão

rela

tiva

Gráfico 3: Comparação entre o nível de expressão das isoformas de OPN entre as linhagens

celulares do CE. Os níveis transcricionais das isoformas da OPN foram analisados por qRT-PCR,

utilizando oligonucleotídeos específicos para estas isoformas e o GAPDH foi utilizado como gene de

expressão constitutiva. Os resultados apresentados foram realizados em duplicata e em 3 ensaios

independentes. (A) Comparação entre o nível de expressão transcricional das isoformas da Opn entre

a linhagem KLE e a Ishikawa, a qual foi utilizada como amostra de referência (valor de referência = 1)

para cada isoforma da OPN; (B) Comparação da linhagem KLE entre a RL95-2, como amostra de

referência (valor de referência = 1) para cada isoforma da OPN; (C) Comparação da linhagem KLE

entre a AN3CA, como amostra de referência (valor de referência = 1) para cada isoforma da OPN. O

valor de P não possui significância estatística.

30

4.2. Avaliação da expressão das isoformas de p53 em linhagens

celulares tumorais e não tumorais de endométrio:

Para avaliar o perfil de expressão das variantes da p53 no CE, analisamos

os níveis transcricionais das isoformas p53, p53β, p53γ, Δ40p53 e Δ133p53 em

linhagens celulares tumorais e não tumorais de endométrio. As cinco variantes foram

expressas em níveis variáveis em todas as linhagens analisadas. Nas 4 linhagens

celulares de CE testadas (Ishikawa, RL95-2, AN3CA e KLE), a isoforma completa de

p53 (p53 canônica) é a isoforma de maior nível de expressão. Entretanto, nas três

linhagens representativas do subtipo tumoral I (Ishikawa, RL-95-2 e AN3CA), a

isoforma Δ40p53 também apresenta níveis elevados de expressão (Gáfico 4B, C e

D). Por outro lado, esta mesma isoforma Δ40p53 é aquela que apresenta os níveis

de expressão mais elevados nas linhagens não tumorais de endométrio testadas

(Gráfico 4E e F).

31

Ishikawa

p53

p53

p53

40

p53

133

p53

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

A

Isoformas da p53

Nív

el

de

ex

pre

ss

ão

re

lati

va

da

s i

so

form

as

RL95-2

p53

p53

p53

40

p53

133

p53

0.0

0.5

1.0

1.5

B

Isoformas da p53

Nív

el

de

ex

pre

ss

ão

re

lati

va

da

s i

so

form

as

AN3CA

p53

p53

p53

40

p53

133

p53

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

C

Isoformas da p53

Nív

el

de

ex

pre

ss

ão

re

lati

va

da

s i

so

form

as

KLE

p53

p53

p53

40

p53

133

p53

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

D

Isoformas da p53

Nív

el

de

ex

pre

ss

ão

re

lati

va

da

s i

so

form

as

E6/E7/TERT

p53

p53

p53

40

p53

133

p53

0

5

10

15

20

25

E

Isoformas da p53

Nív

el

de

ex

pre

ss

ão

re

lati

va

da

s i

so

form

as

EM42

p53

p53

p53

40

p53

133

p53

0

5

10

15

20

F

Isoformas da p53

Nív

el

de

ex

pre

ss

ão

re

lati

va

da

s i

so

form

as

Gráfico 4: Comparação entre o nível de expressão das isoformas da p53 entre as linhagens

celulares do CE e não tumorais de endométrio. Os níveis transcricionais das isoformas da p53

foram analisados por qRT-PCR, utilizando oligonucleotídeos específicos para estas isoformas e a β-

actina foi utilizado como gene de expressão constitutiva. Os resultados apresentados foram

realizados em duplicata e em 3 ensaios independentes. Comparação entre os níveis transcricionais

de expressão das isoformas da p53, respectivamente, na linhagem Ishikawa (A), RL95-2 (B), AN3CA

(C), KLE (D), E6/E7/TERT (E) e EM42 (F), utilizando como amostra de referência a p53. O valor de P

não possui significância estatística.

32

Ao comparar o perfil de expressão de todas as isoformas da p53 nas

linhagens de endométrio em relação às linhagens não tumorais, observamos que o

nível de expressão da isoforma completa p53 é maior em todas as linhagens de CE

em relação às linhagens não tumorais E6/E7/TERT e EM42 (Gráfico 5A e Gráfico

6A). Já com relação às demais isoformas, o perfil de expressão diferencial, quando

ocorre, entre as linhagens tumorais e não tumorais é especifico para cada variante.

Com relação às variantes Δ40p53 e Δ133p53, observamos que as linhagens

RL95-2 ou a AN3CA, apresentam níveis mais elevados destas isoformas que as

demais linhagens analisadas (Gráfico 5D e E) em comparação com a linhagem

E6/E7/TERT. Ao comparar com a linhagem não tumoral EM42, apenas na linhagem

AN3CA observa-se expressão mais elevada da isoforma Δ133p53 em relação a esta

linhagem não tumoral. Já a isoforma p53β apresenta maior nível de expressão nas

linhagens de representativas do subtipo tumoral I em relação à linhagem

E6/E7/TERT (Gráfico 5B). Esta mesma variante já apresenta nível de expressão

semelhante ao comparar as distintas linhagens tumorais com a linhagem não

tumoral EM42. Por outro lado, a isoforma p53γ apresenta níveis semelhantes de

expressão entre as distintas linhagens de endométrio, tanto tumorais quanto as duas

não tumorais. Desta forma, a isoforma completa de p53 e a Δ40p53 parecem ser as

que apresentam maior perfil diferencial de expressão entre células tumorais e não

tumorais e entre distintas linhagens tumorais de CE. Especialmente nas linhagens

não tumorais, e nas linhagens celulares do subtipo I observa-se sigificativa

superexpressão da isoforma Δ40p53.

33

Isoforma p53

E6/E7/T

ERT

Ishik

awa

RL95-2

AN3C

AKLE

05

101520253035404550556065

A

Linhagens celulares

Nív

el d

e e

xp

ressão

rela

tiva

Isoforma p53

E6/E7/T

ERT

Ishik

awa

RL95-2

AN3C

AKLE

0

1

2

3

4

5

B

Linhagens celulares

Nív

el d

e e

xp

ressão

rela

tiva

Isoforma p53

E6/E7/T

ERT

Ishik

awa

RL95-2

AN3C

AKLE

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

C

Linhagens celulares

Nív

el d

e e

xp

ressão

rela

tiva

Isoforma 40p53

E6/E7/T

ERT

Ishik

awa

RL95-2

AN3CAKLE

0

1

2

3

4

5

6

D

Linhagens celulares

Nív

el d

e ex

pre

ssão

rel

ativ

a

Isoforma 133p53

E6/E7/T

ERT

Ishik

awa

RL95-2

AN3CAKLE

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

E

Linhagens celulares

Nív

el d

e ex

pre

ssão

rel

ativ

a

Gráfico 5: Comparação entre o nível de expressão das isoformas da p53 nas linhagens

celulares de CE com a linhagem não tumoral E6/E7/TERT. Os níveis transcricionais das isoformas

da p53 foram analisados por qRT-PCR, utilizando oligonucleotídeos específicos para estas isoformas

e a β-actina foi utilizado como gene de expressão constitutiva. Os resultados apresentados foram

realizados em duplicata e em 3 ensaios independentes, utilizando a linhagem E6/E7/TERT como

amostra de referência para cada isoforma da p53 (A) Isoforma p53, (B) Isoforma p53β, (C) Isoforma

p53γ (D) Isoforma Δ40p53 e (E) Isoforma Δ133p53. O valor de P não possui significância estatística.

34

Isoforma p53

EM42

Ishik

awa

RL95-2

AN3C

AKLE

0

5

10

15

20

25

30

35

A

Linhagens celulares

Nív

el d

e e

xp

ressão

rela

tiva

Isoforma p53

EM42

Ishik

awa

RL95-2

AN3C

AKLE

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

B

Linhagens celulares

Nív

el d

e e

xp

ressão

rela

tiva

Isoforma p53

EM42

Ishik

awa

RL95-2

AN3C

AKLE

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

C

Linhagens celulares

Nív

el d

e ex

pre

ssão

rel

ativ

a

Isoforma 40p53

EM42

Ishik

awa

RL95-2

AN3CAKLE

0

1

2

3

4

5

6

D

Linhagens celulares

Nív

el d

e ex

pres

são

rela

tiva

Isoforma 133p53

EM42

Ishik

awa

RL95-2

AN3CAKLE

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

E

Linhagens celulares

Nív

el d

e ex

pre

ssão

rel

ativ

a

Gráfico 6: Comparação entre o nível de expressão das isoformas da p53 nas linhagens

celulares de CE com a linhagem não tumoral EM42. Os níveis transcricionais das isoformas da

p53 foram analisados por qRT-PCR, utilizando oligonucleotídeos específicos para estas isoformas e a

β-actina foi utilizado como gene de expressão constitutiva. Os resultados apresentados foram

realizados em duplicata e em 3 ensaios independentes, utilizando a linhagem EM42 como amostra de

referência para cada isoforma da p53 (A) Isoforma p53, (B) Isoforma p53β, (C) Isoforma p53γ (D)

Isoforma Δ40p53 e (E) Isoforma Δ133p53. O valor de P não possui significância estatística.

Com bases nestes dados, também comparamos o nível de expressão das

isoforma p53 (canônica) e da variante Δ40p53 entre as linhagens tumorais de

graduação histológica diferente (Gráfico 7). Observamos que a linhagem KLE possui

maior nível de expressão transcricional da p53 completa que as linhagens Ishikawa

e RL95-2, embora em relação esta última linhagem a diferença não seja

estatisticamente significativa (Gráfico 7A e B). Entretanto, um menor nível de

expressão transcricional, quando comparada com a linhagem AN3CA (Gráfico 7C).

Já a isoforma Δ40p53 apresenta menor nível de expressão transcricional na

linhagem KLE em relação às linhagens Ishikawa, RL95-2 e AN3CA. Estes dados

reforçam os achados de que a isoforma completa de p53 tem expressão

predominante em linhagens mais agressivas de CE, enquanto a isoforma Δ40p53

parace ter sua expressão diminuida nestas linhagens, porém expressão mais

35

elevada em linhagens representativas do subtipo tumoral I ou mesmo em linhagens

não tumorais (Gráfico 5D e 6D).

p53 40p53

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Ishikawa

KLE*

**

A

Isoformas da p53

Nív

el d

e e

xp

ressão

rela

tiva

p53 40p53

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

RL95-2

KLE

***

B

Isoformas da p53

Nív

el d

e e

xp

ressão

rela

tiva

p53 40p53

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0 AN3CA

KLE

******

C

Isoformas da p53

Nív

el d

e e

xp

ressão

rela

tiva

Gráfico 7: Nível de expressão das isoformas p53 e Δ40p53 nas linhagens celulares do CE

comparadas entre si. Os níveis transcricionais das isoformas p53 e Δ40p53 foram analisados por

qRT-PCR, utilizando oligonucleotídeos específicos para estas isoformas e a β-actina foi utilizado

como gene de expressão constitutiva. Os resultados apresentados foram realizados em duplicata e

em 3 ensaios independentes, utilizando diferentes linhagens celulares (A) Ishikawa, (B) RL95-2 e (C)

AN3CA como amostra de referência para cada isoforma da p53 em comparação com a linhagem

KLE. Os valores de P são dados entre a comparação da isoforma p53 ou Δ40p53 em cada linhagem.

*P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001.

36

4.3. Expressão proteica da isoforma completa da p53

Com o objetivo de também avaliar o perfil de expressão proteico da p53,

realizamos ensaios de imunoblot com o que o anticorpo DO-1, que reconhece a

isoforma completa de p53, tal como observado em nível transcricional, a isoforma

completa de p53 (Gráfico 4) apresenta maior nível de expressão proteica em todas

as linhagens tumorais testadas em relação às linhagens não tumorais EM42 e

E6/E7/TERT. Observamos também que as linhagens Ishikawa, AN3CA e a KLE

apresentam maiores níveis de expressão protéica da isoforma completa de p53 que

a linhagem RL95-2 (Figura 10).

Figura 10: Análise da expressão protéica da isoforma completa de p53 por imunoblot em

linhagens tumorais e não tumorais de endométrio. A expressão protéica endógena da p53

(canônica) foi analisada utilizando um anticorpo específico para esta variante (DO-1). Este anticorpo

reconhece um epítopo localizado entre os aminoácidos 20-25 da p53 canônica. Desta forma, este

anticorpo não reconhece as isoformas truncadas Δ133p53 ou Δ40p53 na porção N-terminal da

proteína p53. A expressão do GAPDH foi utilizada como um controle endógeno constitutivo.

De forma a corroborar com a análise de expressão proteíca de p53 realizada

por imunoblot e também observar sua sublocalização celular em uma linhagem

tumoral e também em uma não tumoral de endométrio, realizamos ensaio de

imunofluorescência, utilizando o mesmo anticorpo DO-1 especifico para a para p53

completa. Observa-se maior intensidade de marcação da p53 (canônica) na

linhagem tumoral AN3CA, em comparação com linhagem a não tumoral E6/E7/TERT

(Figura 11). Esta marcação de expressão da p53 completa é marcantemente

nuclear, embora haja marcação citoplasmática desta variante, tanto na linhagem

tumoral quanto na não tumoral. Observa-se também maior expressão nuclear da

37

isoforma p53 completa na linhagem tumoral AN3CA, em comparação com a

linhagem E6/E7/TERT.

Figura 11: Análise de imunofluorescência representativa da expressão da p53 (canônica) em

célula tumoral (linhagem AN3CA) e não tumoral (linhagem E6/E7/TERT). 1- Imagem morfológica

das células, campo claro; 2- Expressão da p53 pela marcação com o anticorpo DO-1, campo escuro.

38

5. Discussão

Nosso estudo consiste na primeira caracterização da expressão das

isoformas da p53 e das isoformas da OPN nas linhagens celulares de câncer de

endométrio, tentando estabelecer possíveis relações entre a expressão destas

variantes. Mostramos que quase todas as linhagens analisadas expressaram as 3

isoformas da OPN e todas as 5 isoformas da p53, em diferentes níveis de expressão

transcricional.

A avaliação do nível de expressão das isoformas da OPN mostrou que a

isoforma completa OPNa é a variante de maior nível de expressão, tanto nas

linhagens tumorais de endométrio, quanto nas não tumorais. Assim como o nosso

modelo tumoral, dados da literatura mostram que a variante OPNa é super-expressa

em amostras tumorais de pulmão e estimula várias características tumorigênicas

(49). Em células de mesotelioma, por exemplo, OPNa é marcantemente super-

expressa e ativa significativamente a proliferação celular, migração e invasão (49).

No câncer de pulmão de não pequenas células e no plasma indivíduos saudáveis, a

OPNa é também a principal isoforma expressa (2). Quando comparamos os níveis

de expressão das isoformas de OPN entre as linhagens tumorais em relação a não

tumoral E6/E7/TERT, observamos que as linhagens KLE (tipo II/G3) e a Ishikawa

(tipo I/G1) foram aquelas que apresentaram maior nível de expressão das 3

isoformas da OPN, mesmo sendo de subtipos diferentes. A expressão das três

isoformas é comum em outros tipos tumorais, associadas com diferentes eventos

tumorais. No câncer gástrico e no glioma as 3 isoformas se mostram expressas, mas

apenas as isoformas OPNb e OPNc foram associadas com a gravidade da doença.

No câncer de próstata também se observa a expressão das variantes OPNa, OPNb

e OPNc. No entanto, apenas a OPNb e OPNc promovem o aumento da proliferação,

migração e invasão (3). Estes dados indicam que em linhagens de endométrio as

isoformas de OPN podem ser expressas concomitantemente como em outros tipos

tumorais, podendo atuar de formas tumor-específica distintas na progressão tumoral.

Ensaios futuros deverão validar o papel funcional específico de cada uma destas

variantes em linhagens de endométrio.

39

Observamos também que a isoforma OPNc corresponde a variante mais

expressa nas linhagens tumorais (exceto na AN3CA) em relação à não tumoral

E6/E7/TERT. Embora a OPNa seja a isoforma mais expressa em relação as demais,

apenas a OPNc apresenta-se diferencialmente expressa entre a maioria das

linhagens tumorais testadas e a não tumoral E6/E7/TERT. Ressalta-se que a

linhagem EM42 não apresentou níveis detectáveis de expressão dos transcritos

variantes da OPN. Um estudo feito por Shi et al. (2014) demonstrou que a OPNa,

está presente tanto nos tecidos de câncer de mama como em tecidos não tumorais

correspondentes. No entanto, neste modelo tumoral apenas a variante OPNc é

expressa de forma exclusiva nesses tumores, mas não e em tecidos não tumorais,

sendo a sua super-expressão capaz de promover a invasão de células tumorais in

vitro (50). Outro estudo mostra que no câncer de mama a OPNa e a OPNc podem

atuar sinergicamente para suportar a sobrevivência de células tumorais circulantes

(51). Também foi descrito previamente por nosso grupo que a isoforma OPNc é

expressa especificamente em amostras de tumor de ovário, não sendo detectada

nos tecidos ovarianos benignos e não tumorais (35). Estes achados evidenciam que

a OPNc apresenta potencial aplicação enquanto biomarcador no diagnóstico

diferencial entre amostras tumorais e não tumorais de endométrio, de forma similar

aos tumores de ovário (34) e de mama (48).

Outro dado observado no presente estudo foi que o nível de expressão

transcricional da OPNc é significativamente maior na linhagem KLE (tipo II/G3) em

relação as outras linhagens tumorais de menor grau e à não tumoral E6/E7/TERT. A

linhagem KLE também apresentou maior nível de expressão das 3 variantes da

OPN, até mesmo em comparação com a linhagem AN3CA, a qual também possui

elevado grau de diferenciação histológica (52,53). No entanto, a classificação

histológica da linhagem AN3CA é controversa, de forma que alguns autores à

classificam como representativa de tumores do Tipo I/G3, enquanto outros como do

Tipo II/G3 (52,53). Assim, esta diferença no nível de expressão da OPNc entre a

linhagem KLE e a AN3CA poderia se justificar por seus distintos graus de

agressividade. Embora em nosso modelo de estudo OPNa seja a isoforma de

expressão predominante em cada uma das linhagens de endométrio analisadas,

tanto tumorais quanto não tumorais, a maior expressão da OPNc em linhagens

40

tumorais representa importante achado. Estes dados podem indicar a OPNc como

um marcador de diagnóstico diferencial de tecidos tumorais de endométrio em

relação aos não tumorais. Além disto, poderia ter potencial aplicação enquanto um

marcador prognóstico em tumores de endométrio, já que apresenta maior nível de

expressão em linhagens representativas de tumores de endométrio mais agressivos,

de maior grau histológico. Estudos futuros deverão validar estes achados em

ensaios funcionais relacionados a aspectos da agressividade tumoral e em amostras

teciduais de tumores de endométrio.

Nossos dados em relação à avaliação do nível de expressão das isoformas

de p53 mostram que a variante completa p53 é a que apresenta maior nível de

expressão nas linhagens tumorais, em relação às outras isoformas. Nas linhagens

representativas do tipo I (Ishikawa, RL95-2 e AN3CA), a variante Δ40p53 também

apresenta níveis mais elevados de expressão, segundo a segunda mais expressa

dentre as variantes testadas. Por outro lado, essa mesma isoforma apresenta

expressão predominante nas linhagens não tumorais, em comparação com as

outras isoformas. Ressalta-se que observamos que a p53 completa e a Δ40p53 são

as variantes de maior nível de expressão diferencial nas tumorais de CE

representativas de tumores do tipo I e as linhagens não tumorais. Estes dados

sugerem que em tumores do Tipo I a variante Δ40p53, em associação com a

variante p53 completa podem favorecer a um fenótipo menos agressivo, já que na

linhagem do Tipo II, KLE, menores níveis relativos de expressão da Δ40p53 em

relação à variante completa p53 que nas linhagens do Tipo II (Gráfico 4). Em

consonância com esta hipótese, Takahashi et al. (2014) observaram que em células

de melanoma que expressam a p53 completa, a isoforma Δ40p53 parece afetar o

crescimento de culturas de células tumorais e não tumorais , diminuindo sua

viabilidade e induzindo a apoptose (54). Outro estudo forneceu também evidências

de um papel protetor da variante Δ40p53 em pacientes com câncer de ovário

mucinoso. Estes autores também observaram a expressão mais elevada da Δ40p53

em tecidos normais de ovário (55). Nas análises realizadas por Hafsi et al. (2013),

mostrou-se que Δ40p53 exerce um efeito inibitório sobre a p53 completa, quando

super-expressa em relação à variante completa. No entanto, quando expressa em

níveis inferiores ou iguais a p53, a Δ40p53 parece exercer efeitos mais complexos,

41

variando desde a inibição até à ativação da transcrição da p53, dependendo do

contexto celular (56). Assim, nossos dados referentes ao perfil de expressão em

linhagens representativas de tumores dos Tipos I e II de endométrio podem sugerir

que a variante Δ40p53 possam exercer efeito inibitório sobre a p53 completa,

favorecendo a um fenótipo menos agressivo nestes tumores. Estudos funcionais de

avaliação do efeito da Δ40p53 sobre a função da p53 completa em células de

tumores de endométrio deverão avaliar de forma específica as ações desta variante.

Também comparamos o nível de expressão transcricional da p53 completa e

da variante Δ40p53 entre as linhagens tumorais representativas de distintos subtipos

tumorais de endométrio. A linhagem KLE possui maior expressão de p53 completa

em relação às linhagens Ishikawa (tipo I/ G1) e RL95-2 (tipo II/ G2). Por outro lado,

apresenta menor nível de expressão desta variante quando comparado com a

linhagem AN3CA. Na linhagem KLE, o nível de expressão da isoforma Δ40p53 é

significantemente menor em relação às outras linhagens testadas. Estes achados

reforçam os dados de que a p53 completa apresenta expressão mais elevada nas

linhagens tumorais, enquanto a Δ40p53 tem sua expressão diminuída na KLE e

aumentada nas linhagens do tipo I e nas não tumorais. Estes dados mais uma vez

suportam a proposta de que a isoforma Δ40p53 seja um regulador da função da p53

completa. Além disto, a avaliação da expressão da variante Δ40p53 também

apresenta potencialidade de aplicação enquanto biomarcador de prognóstico em

tumores de endométrio, dada sua maior expressão em linhagens menos agressivas.

Assim, como em relação às variantes de p53 estes achados precisam ser validados

em amostras teciduais visando à caracterização das mesmas enquanto

biomarcadores.

Observamos que na comparação entre todas as isoformas de p53 nas

linhagens tumorais de CE em relação as não tumorais, a p53 completa foi a variante

de maior nível de expressão nas linhagens tumorais. As demais isoformas

apresentam perfil de expressão específico para cada linhagem celular analisada

neste estudo. Assim como observado por Hofstetter et al. (2012), a expressão das

isoformas da p53 ocorre em diferentes níveis de expressão em distintos subtipos

tumorais de ovário. Estes achados, em conjunto com os dados apresentados em

42

nosso estudo, apoiam a hipótese de que os subtipos histológicos representam

entidades patológicas distintas, refletidas em perfis de expressão gênicas que são

típicos destes fenótipos. Outro dado observado sobre a avaliação do nível de

expressão das isoformas de p53 foi que as variantes Δ40p53 e a Δ133p53 são

expressas em maiores níveis transcricionais nas linhagens RL95-2 e AN3CA, em

comparação com a linhagem não tumoral E6/E7/TERT. A Δ133p53 apresenta

também expressão mais elevada apenas na linhagem AN3CA em relação à

linhagem não tumoral EM42. No câncer de ovário seroso, as isoformas Δ133p53 e

Δ40p53 foram avaliadas como potenciais biomarcadores. A expressão de Δ133p53

constituiu um marcador prognóstico independente em pacientes com câncer de

ovário seroso avançado com a p53 mutada. E a Δ40p53 influenciou a sobrevida livre

de recorrência, mas não a sobrevivência global no câncer de ovário do tipo

selvagem da p53 (57). Mostramos também que a isoforma p53β apresenta-se com

nível de expressão mais elevado nas linhagens do tipo I (Ishikawa, RL95-2 e

AN3CA) em relação à linhagem não tumoral E6/E7/TERT. Por outro lado, esta

variante apresenta níveis semelhantes de expressão ao comparar linhagens

tumorais em relação à linhagem não tumoral EM42. Dados da literatura indicam que

no carcinoma de células renais, a isoforma p53β foi avaliada como um potencial

marcador de progressão, tanto nos níveis de RNAm, como proteicos. Estes autores

mostraram que a super-expressão de p53β pareceu estar associada com a

progressão tumoral (47). Nas análises do presente estudo a variante p53γ possui

níveis semelhantes entre as linhagens tumorais e não tumorais, não apresentando

diferença na sua expressão ou uma possibilidade de aplicação quanto um possível

biomarcador. Na literatura observamos que as isoformas p53β, p53y e Δ133p53 são

expressas diferentemente em uma variedade de neoplasias, incluindo melanoma,

câncer do ovário, carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço, carcinoma

de células renais, leucemia mieloide aguda, câncer do cólon e câncer da mama (48).

Nestes distintos modelos, estas variantes apresentam diferentes funções,

dependendo do tipo tumoral. Estes achados corroboram com os nossos dados, em

que os níveis de expressão são distintos para cada linhagem celular.

A avaliação da expressão proteica da isoforma p53 completa validou nossas

observações transcricionais dessa variante, onde foi observado que o nível de

43

expressão proteico é maior nas linhagens tumorais em comparação as não tumorais

de endométrio. Da mesma forma, que observamos uma maior sublocalização

nuclear da p53 completa na linhagem tumoral AN3CA em relação a não tumoral

E6/E7/TERT. Têm sido observados em achados recentes da literatura os níveis

transcricionais de variantes de splicing nem sempre refletem os proteômicos, devido

a evidências que sugerem que na maioria das variantes expressas não tenha um

papel celular funcional como proteínas (58). Desta forma, estudos complementares

deverão elucidar se as isoformas de p53 e da OPN analisadas em nível

transcricional neste estudo se refletem ou não em níveis proteicos.

Nas mesmas linhagens tumorais que apresentam um elevado nível de

expressão da OPNc, também observamos elevados níveis de expressão da p53

completa, em especial nas linhagens do Tipo I. Estes dados evidenciam que não

somente a OPN e p53 totais, mas também suas variantes podem regular a

expressão umas das outras ou terem uma correspondência de expressão entre seus

padrões transcricionais. A literatura já evidência que a OPN é um alvo transcricional

direto da p53 e que o gene da OPN tem um elemento responsivo na região

promotora da p53 (18). Assim, nossos resultados sugerem uma provável inter-

relação entre essas isoformas, visto que nas linhagens tumorais de alto grau

histológico há um predomínio da OPNc e da p53 completa. Já as linhagens do tipo I

há um predomínio também da isoforma Δ40p53 e uma diminuição da OPNc de

acordo com o grau histológico das linhagens. Estudos adicionais serão essenciais

para elucidar essas possíveis inter-relações entre estas variantes e suas atividades

funcionais em relação à progressão tumoral de endométrio.

44

6. Conclusões

Em conclusão, o presente estudo demonstra que as isoformas OPNa, OPNb

e OPNc da OPN são expressas tanto em linhagens tumorais quanto na não tumoral

EM42. Dentre elas a OPNa é a isoforma predominante entre as três isoformas, mas

apenas a OPNc apresenta expressão diferencial entre linhagens tumorais e não

tumoral, abrindo perspectivas da potencial aplicação desta variante enquanto

biomarcador de diagnóstico diferencial e também de prognóstico. De forma similar,

todas as isoformas de p53 também são expressas nestas linhagens investigadas,

sendo a p53 completa a isoforma predominante em linhagens tumorais e a Δ40p53 a

segunda mais expressa, em especial nas linhagens representativas de tumores de

menor grau histológico. Esta última isoforma é aquele de expressão predominante

em linhagens celulares não tumorais de endométrio. Assim, apresentamos

evidências de que a isoforma p53 completa e mutante é a mais oncogênica nestes

tumores, enquanto a isoforma Δ40p53 pode exercer papel antagônico a esta

isoforma, podendo ser uma variante que pode representar um marcador de células

menos agressivas ou de células não tumorais de endométrio quando superexpressa

em relação às demais variantes.

45

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