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Revista Mexicana de Ingeniería Química

ISSN: 1665-2738

[email protected]

Universidad Autónoma Metropolitana Unidad

Iztapalapa

México

Lara, Alvaro R.

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN Escherichia coli

Revista Mexicana de Ingeniería Química, vol. 10, núm. 2, agosto, 2011, pp. 209-223

Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa

Distrito Federal, México

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Revista Mexicana de Ingeniería Química

CONTENIDO

Volumen 8, número 3, 2009 / Volume 8, number 3, 2009

213 Derivation and application of the Stefan-Maxwell equations

(Desarrollo y aplicación de las ecuaciones de Stefan-Maxwell)

Stephen Whitaker

Biotecnología / Biotechnology

245 Modelado de la biodegradación en biorreactores de lodos de hidrocarburos totales del petróleo

intemperizados en suelos y sedimentos

(Biodegradation modeling of sludge bioreactors of total petroleum hydrocarbons weathering in soil

and sediments)

S.A. Medina-Moreno, S. Huerta-Ochoa, C.A. Lucho-Constantino, L. Aguilera-Vázquez, A. Jiménez-

González y M. Gutiérrez-Rojas

259 Crecimiento, sobrevivencia y adaptación de Bifidobacterium infantis a condiciones ácidas

(Growth, survival and adaptation of Bifidobacterium infantis to acidic conditions)

L. Mayorga-Reyes, P. Bustamante-Camilo, A. Gutiérrez-Nava, E. Barranco-Florido y A. Azaola-

Espinosa

265 Statistical approach to optimization of ethanol fermentation by Saccharomyces cerevisiae in the

presence of Valfor® zeolite NaA

(Optimización estadística de la fermentación etanólica de Saccharomyces cerevisiae en presencia de

zeolita Valfor® zeolite NaA)

G. Inei-Shizukawa, H. A. Velasco-Bedrán, G. F. Gutiérrez-López and H. Hernández-Sánchez

Ingeniería de procesos / Process engineering

271 Localización de una planta industrial: Revisión crítica y adecuación de los criterios empleados en

esta decisión

(Plant site selection: Critical review and adequation criteria used in this decision)

J.R. Medina, R.L. Romero y G.A. Pérez

Revista Mexicanade Ingenierıa Quımica

1

Academia Mexicana de Investigacion y Docencia en Ingenierıa Quımica, A.C.

Volumen 10, Numero 2, Agosto 2011

ISSN 1665-2738

1Vol. 10, No. 2 (2011) 209-223

PRODUCCION DE PROTEINAS RECOMBINANTES EN Escherichia coli

RECOMBINANT PROTEIN PRODUCTION IN Escherichia coli

Alvaro R. Lara∗

Departamento de Procesos y Tecnologıa Universidad Autonoma Metropolitana-Cuajimalpa Artificios 40, Col.Hidalgo, Delegacion Alvaro Obregon, Mexico, D. F., C.P. 01120

Recibido 11 de Febrero 2011; Aceptado 11 de Abril 2011

ResumenLa produccion de proteınas recombinantes (PR) es una de las aportaciones mas importantes de la biotecnologıamoderna. El hospedero bacteriano mas importante para la produccion de PR es Escherichia coli, aunque otros comoBacillus subtilis y Bacillus megaterium estan cobrando cada vez mas importancia. Debido a su impacto economicoy en el sector de la salud humana, el presente trabajo se enfocara principalmente a la produccion de PR terapeuticasen E. coli. Se abordaran en general los aspectos de diseno del vector, la cepa, el cultivo y la purificacion de laPR, con enfasis en las oportunidades que la ingenierıa metabolica ofrece para mejorar la produccion de PR y lasestrategias de cultivo.

Palabras clave: proteına recombinante, Escherichia coli, ingenierıa metabolica, biorreactores.

AbstractRecombinant proteins production (RP) is one of the most important contributions of modern biotechnology.The most important bacterial host for RP production is Escherichia coli, although Bacillus subtilis and Bacillusmegaterium are also gaining importance. Due to its economical relevance and impact on human health, the presentreview is focused on the production of RP in E. coli. General aspects of vector design, strain selection as well ascultivation and downstream processing are covered. Particularly, the opportunities to improve cultivation schemesand downstream through metabolic engineering are discussed.

Keywords: recombinant proteins, Escherichia coli, metabolic engineering, bioreactors.

1 Introduccion

La produccion de PR en bacterias es unatecnologıa que surgio hace cerca de 30 anos yrespondio a una necesidad de proveer proteına deuso terapeutico con un abasto asegurado (que nodependiera de fuentes animales) y calidad constante.La primera PR aprobada para su uso en humanos fuela insulina humana producida en Escherichia coli porla empresa Genentech. Desde entonces, la tecnologıade produccion de PR ha tenido un avance muyimportante. Hasta el ano 2010, el numero de productosbiofarmaceuticos aprobados por la Administracion deAlimentos y drogas de los EUA (FDA) sumaba mas

de 200, de los cuales la gran mayorıa son PR (Walsh,2010). La importancia economica de las PR de usoterapeutico es innegable: las 10 PR de mayor ventadurante 2009 sumaron un total de 50,000 millones dedolares en ventas (Walsh, 2010), lo que representa casila mitad de las reservas internacionales de Mexico al15 de septiembre de 2010.

Muchas de las PR terapeuticas requierenmodificaciones post-traduccionales que no puedenser llevadas a cabo por cepas bacterianas silvestres,por lo que son preferentemente producidas por celulaseucariontes superiores. A pesar de ello, la bacteria E.

∗Autor para la correspondencia. E-mail: [email protected]

Publicado por la Academia Mexicana de Investigacion y Docencia en Ingenierıa Quımica A.C. 209

Alvaro R. Lara./ Revista Mexicana de Ingenierıa Quımica Vol. 10, No. 2 (2011) 209-223

coli sigue siendo una plataforma ampliamente usadapara la produccion de PR, ya que presenta una seriede ventajas importantes (Demain y Vaishnav, 2009):i) su genoma es conocido desde hace varios anos, loque amplıa considerablemente las posibilidades de sumanipulacion genetica, ii) existe una gran cantidadde conocimiento acumulado sobre su fisiologıa ymetabolismo, iii) se tienen varios vectores bienestablecidos para la produccion de PR, iv) puedecrecer rapido en medios muy simples, con altosniveles de produccion de PR. Actualmente, cerca del30 % de las PR de uso terapeutico son producidasempleando E. coli (Ferrer-Miralles y col., 2009), lasmas importantes pueden consultarse en la tabla 1. Deun total de 58 productos aprobados por la FDA en elperiodo 2006-2010, 17 son producidos usando E. coliy 32 empleando celulas de mamıfero (Walsh, 2010).Una vision global de los aspectos involucrados en la

produccion de proteına recombinante por bacterias semuestra en la Fig. 1. Dichos aspectos se abordaran alo largo del presente trabajo.

2 Vectores de expresionLa informacion genetica de la proteına a producirusualmente se inserta en un vector (plasmido) deexpresion. Los elementos esenciales de un vector deexpresion para bacterias se muestran en la Fig. 2. Eltamano del plasmido es muy variable. En general,se prefieren plasmidos de alto numero de copias (porarriba de 500 copias por celula). El numero de copiases, en principio, funcion del origen de replicaciondel plasmido (aunque las condiciones ambientales delcultivo y el estado fisiologico de la bacteria tienen unafuerte influencia sobre el numero de copias -Sayadi ycol., 1989-).

Tabla 1. Principales proteınas recombinantes de uso terapeutico producidas por E. coli(adaptada de Graumann y Premstaller, 2006).

Molecula Observaciones Companıas productoras

Activador del tejido del plasminogeno Forma cuerpos de inclusion RocheInsulina humana y analogos Forma cuerpos de inclusion Eli Lilly, Aventis, Probiomed

Hormona de crecimiento humano Forma cuerpos de inclusion o esacumulada en periplasma

Genentech, Eli Lilly, Pfizer, NovoNordisk, Probiomed y otros

Analogo pegilado de hormona decrecimiento humana

Pegilacion aleatoria Pfizer

Hormona paratiroidea humana Forma cuerpos de inclusion Eli LillyCalcitonina de salmon Secretada Unigene

Factor estimulante de la coloniade granulocitos, pegilado

Forma cuerpos de inclusion,pegilacion N-terminal

Amgen

Interferon α-2a pegilado,interferon α-2b

Pegilacion aleatoria Hoffmann-La Roche, Schering

Interferon alfacon-1 Forma cuerpos de inclusion ValeantInterferon β-1b Forma cuerpos de inclusion Schering AG, ChironInterferon γ-1b Forma cuerpos de inclusion Genentech, Intermune

Antagonista del receptor deinterleucina-1

Amgen

Interleucina-2 ChironToxina de fusion de la difteria Seragen / Ligand

Interleucina-11 Genetics InstituteLipoproteına r OspA Lipoproteına SmithKline Beecham

Peptido natriuretico tipo B Forma cuerpos de inclusion Scios/ Johnson & JohnsonFactor de necrosis TNFα Boehringer Ingelheim

Toxina pertussis Componente de vacunacombinada

Chiron

Subunidad B de la toxina delcolera

SBL Vaccine

Asparginasa Componente de vacunacombinada

Merck

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DISEÑO DEL VECTOR:

-Número de copias

- Promotor

-Presión de selección

SELECCIÓN DE LA CEPA PRODUCTORASELECCIÓN DE LA CEPA PRODUCTORA:

-Altos niveles de producción

-Buen desempeño en el proceso

M difi d f ilit l ifi ió-Modificada para facilitar la purificación

CULTIVO BACTERIANO:

-Diseño óptimo del medio

-Alta densidad celular

-Estrategias de operación

PURIFICACIÓN:

R l l-Ruptura celular

-Separación de proteínas bacterianas

-Eliminación de endotoxinas

Fig. 1. Principales pasos involucrados en laproduccion de proteına recombinante.

Generalmente se asume que un alto numero de copiasdel plasmido resulta en un alto numero de copias delgen de interes, y por lo tanto, la cantidad de PRproducida sera mayor cuanto mayor sea el numero decopias. Modificaciones al origen de replicacion depMB1 (por ejemplo, la familia de plasmidos pUC)son muy empleadas en la produccion de PR. Sinembargo, el empleo de plasmidos con alto numerode copia tambien induce una alta carga metabolica

para la celula (observada como una reduccion enla velocidad de crecimiento y en el rendimiento debiomasa en sustrato). Tambien se ha observadoque una alta concentracion de ARN mensajero pudeconducir a destruccion de los ribosomas y muertecelular (Baneyx, 1999). Un numero de copias menoral de los plasmidos pUC puede favorecer una mayorproduccion de PR (Jones y col., 2000). En este punto,tambien influyen factores como la estabilidad del ARNmensajero (Carrier y col., 1998).

En todo caso, debera encontrarse el nivel deexpresion optimo para la PR producida en una cepade E. coli en particular, lo cual tambien dependeradel promotor empleado. El promotor a emplear debeser cuidadosamente seleccionado con el fin de poderregular la intensidad de induccion. Una expresion muyalta del gene heterologo puede conducir a la formacionde cuerpos de inclusion (agregados intercelularesde proteına), que pueden ser una ventaja para lapurificacion de PR, pero que tambien requieren pasosadicionales en la purificacion, ademas de requerirrecuperar el plegamiento adecuado de la PR antes dela formulacion del producto final.

Existen varios promotores que han sido usadosen experimentos de laboratorio, muchos de los cualesson poco practicos para la produccion industrial dePR. La Tabla 2 muestra algunos ejemplos de lospromotores mas comunes. Un problema encontradocon varios de estos promotores es la expresion basal(expresion del gene heterologo en condiciones noinducidas). Idealmente el promotor a usar deberıaser completamente regulable, muy fuerte, con unaexpresion basal mınima, a la vez que permitieradiferentes grados de induccion, preferentemente

P

SUR

R P SD Gene Heterólogo TT AmpR Ori‐35 ‐10

P

Codón de inicio Codón de paro

Fig. 2. Estructura general de un vector de expresion bacteriano. Como ejemplo se muestra el promotor hıbridotac. El regulador (R) ejerce su efecto sobre el promotor (P), cuyas secuencias -10 y -35 estan separadas por unespaciador de 17 bases. La flecha indica la direccion de la transcripcion. El sitio de union a ribosoma (SUR)consiste de la secuencia Shine-Dalgarno (SD) seguida de un espaciador rico en A+T cuya longitud optima es de 8bases, que preceden al gen heterologo. La secuencia de termino de la transcripcion (TT) es necesaria para estabilizarel ARN mensajero. La resistencia a antibiotico (ampicilina, AMP) facilita la seleccion de celulas transformadas.Ori representa el origen de replicacion del vector. (Adaptado de Palomares y col., 2004).

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Tabla 2. Promotores mas comunes empleados para la produccion de PR. (Adaptado de Jana y Deb, 2005).

Promotor Regulacion Induccion* Desventajas

lac (lacUV5) lacI, lacIq IPTG, termica Bajo nivel de expresion relativo a otros sistemas.Expresion de fuga

trp Agotamiento detriptofano, IAA

Expresion de fuga

tac lacI, lacIq IPTG, termica Expresion de fuga.λpL λcIts 857 Termica La induccion necesita de temperaturas altas (> 40 ◦C).

Es difıcil lograr una induccion parcial.T7 lacI, lacIq IPTG, termica Expresion de fuga. Es difıcil lograr altas densidades

celulares.PhoA phoB, phoR Agotamiento de

fosfatosNo es titulable, limita las opciones de formulacion demedio de cultivo.

Ara araC L-arabinosa Existen pocos vectores disponibles. La glucosa reprimecatabolicamente la induccion.

*IPTG: Isopropil β-D-1 tiogalactopiranosido, IAA: acido indolacrılico

mediante un cambio en las condiciones de cultivo, paraminimizar efectos toxicos y maximizar la formacionde PR. Mientras que los promotores lac y trp sehan usado para experimentos de laboratorio durantemucho tiempo, son poco habituales a escala industrial.El promotor lac requiere la adicion de un inductorque no es metabolizado (IPTG) y que es altamentetoxico. Esto representa una gran desventaja paraprocesos industriales, ya que se debe garantizarque dicho inductor sea completamente eliminado delproducto, y ademas no debe ser enviado a aguasresiduales municipales. En el caso del promotortrp (al igual que el promotor PhoA), la induccionocurre cuando se agota un nutriente (triptofano enel caso del primero, fosfatos en el segundo caso).Esto dificulta el control de la fisiologıa bacterianay determinar el momento preciso de la induccion.Tambien impone una restriccion en la formulacionde los medios de cultivo. En el caso de que seaplique un inductor metabolizable, como la arabinosa,el cultivo esta sujeto a adaptar su metabolismo a dichafuente de carbono, que puede no ser la optima para laproduccion de una PR (Sorensen y Mortensen 2005).

Un promotor mas atractivo para aplicacionesindustriales es el promotor pL/pR del fago lambda.Este promotor esta regulado por la proteına cI857,que impide efectivamente la transcripcion de los genesbajo control de pL/pR a temperaturas por debajo delos 37 ◦C. Dada la naturaleza termolabil de cI857,cuando la temperatura se incrementa (normalmente a42 ◦C), la expresion es muy potente (Valdez-Cruz ycol., 2009).

El empleo del promotor pL/pR permite obteneraltas densidades celulares (concentraciones de

biomasa mayores a 40 g/L, medidas como pesoseco), manteniendo el nivel de expresion del geneheterologo a un nivel despreciable (normalmentecuando las temperaturas del cultivo estan entre 28y 32 ◦C). El incremento de temperatura es unaoperacion sencilla a varias escalas de produccion ypermite manipular con exactitud el momento de lainduccion (por ejemplo, una vez alcanzada una ciertadensidad celular) sin agregar elementos secundariosal medio de cultivo, con la consecuente reduccion decostos. Aunque el incremento de temperatura es maslento a medida que aumenta la escala del biorreactor,un calentamiento mas lento puede de hecho favorecerla produccion de PR (Caspeta y col., 2009). Unade las desventajas de la induccion por temperaturaes que las celulas necesariamente experimentan unestres fisiologico conocido como choque termico, queconduce a respuestas generalizadas en el fluxoma,metaboloma y transcriptoma de E. coli (Wittmann ycol., 2007) y que limitan el crecimiento y las funcionescelulares una vez que se ha iniciado la induccion.

Existen ademas promotores inducibles atemperaturas bajas (maxima actividad a 20 ◦C)derivados de pL (Lim y col., 2000). Estos promotores,aunque mucho menos estudiados, pueden resultaratractivos para su aplicacion industrial, debido a que seacoplarıan los siguientes beneficios: el cultivo puedeoperarse a una temperatura optima para el crecimientode E. coli (37◦C), y una vez alcanzada la densidadcelular deseada, la temperatura puede reducirseconduciendo a la expresion del gen heterologo. Lasolubilidad del oxıgeno es 33 % mayor a 20 ◦C quea 37 ◦C, lo que resulta ampliamente benefico paraaumentar la transferencia de oxıgeno al biorreactor,

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siendo esta una de las principales limitaciones en loscultivos de alta densidad celular, como se explicaramas adelante. Por otra parte, ha sido propuesto queaunque la velocidad de transcripcion y traducciones menor a bajas temperaturas, la velocidad deplegamiento de la proteına es practicamente la mismaa 20 ◦C que a 37 ◦C, lo que serıa benefico para producirproteınas correctamente plegadas y evitar la formacionde cuerpos de inclusion.

El gene heterologo debe ser optimizado para suexpresion en la bacteria, principalmente en el uso decodones y sobre-expresando ARN’s de transferenciapoco comunes. El ARN mensajero es una molecula devida media muy corta, especialmente en E. coli, dondepuede degradarse en menos de 20 s (Wang y col.,2004). Es posible incrementar la estabilidad del ARNmensajero alterando su conformacion y eliminando laexpresion de nucleasas como la RNAsa III (Sorenseny Mortensen, 2005).

Normalmente el plasmido de expresion contieneun gene que proporciona resistencia a antibiotico (enel ejemplo de la Fig. 2, resistencia a ampicilina).Esto permite emplear una presion de seleccion paraasegurar que se cultivan unicamente las celulas quecontienen plasmidos, ya que debido a efectos desegregacion, el plasmido podrıa perderse y las celulaslibres de plasmido crecerıan mas rapido (al carecerde la carga metabolica impuesta por el plasmido),desplazando a las celulas portadoras del mismo, con laconsecuente perdida de productividad. Sin embargo,la expresion del gene de resistencia al antibiotico esprobablemente el origen principal de carga metabolica(Rozkov y col., 2004). Con la finalidad de reducirla carga metabolica, se han desarrollado sistemas quepermiten seleccionar durante el cultivo a las celulasportadoras de informacion genetica, contenida en elplasmido, que complemente alguna auxotrofıa, porejemplo, a algun aminoacido (Cranenburgh y col.,2001; Vidal y col., 2008). Dichas estrategias hanmostrado ser muy eficientes, y tambien resultan en unareduccion de costos en los cultivos industriales.

3 Seleccion de la cepa deproduccion

Un paso importante para alcanzar altasproductividades consiste en la seleccion de la cepade produccion adecuada. Para ello deben considerarseaspectos cineticos, el genotipo y el fenotipo de lascepas. En general se buscan cepas con baja tasa demutacion o de insercion de secuencias provenientes

del plasmido. Las cepas derivadas de E. coli K-12y E. coli B son las mas empleadas. Los avances enel conocimiento de la fisiologıa de E. coli y en eldesarrollo de herramientas moleculares han permitidola obtencion de cepas disenadas especıficamente parala produccion de proteına recombinante. En particular,la cepa BL21 es preferida en el ambito industrial.Ademas de carecer de las proteasas Lon y Omp-t (locual reduce considerablemente la degradacion de laPR dentro de la bacteria), produce bajas cantidadesde acetato (un subproducto metabolico altamenteindeseable del que se hablara mas adelante), lo queresulta ampliamente atractivo (Phue y col., 2005).Otras cepas derivadas de BL21 incluyen versionescarentes de la RNAsa E (BL21 Star-pLysS), versionesdisenadas para incrementar la produccion de PR querequieren el uso de codones raros en E. coli (cepadenominada Rosetta) y versiones que contienen copiasextra de los genes argU, ileY y leuW que codificanpara ARN’s de transferencia y que reconocen codonespoco usuales en E. coli (cepa denominada BL21-CodonPlus). La cepa AD494 es una mutante de K-12 en la tioredoxina reductasa (trxB) que permite laformacion de enlaces disulfuro en citoplasma, queusualmente son reducidos en E. coli, lo que es uncuello de botella para el plegamiento de las PR. Lacepa Origami (tambien derivada de K-12) contieneademas una mutacion en la glutationa reductasa(gor), para facilitar mas la formacion de enlacesdisulfuro (Sorensen y Mortensen 2005; Graumanny Premstaller, 2006).

Todas las cepas modificadas que se hanmencionado estan disponibles comercialmente. Laeleccion de una cepa en particular dependera devarios factores, incluyendo el tamano de la PR aproducir, la presencia de enlaces (o puentes) disulfuro,la posibilidad de optimizar el uso de codones, entreotros. Es importante senalar que en los ultimos anosha existido una intensa investigacion para mejorarlas capacidades de produccion de PR en cepas de E.coli mediante ingenierıa metabolica. Ese punto seratratado mas adelante.

Las bacterias Gram-positivas como Bacillussubtilis y Bacillus megaterium tambien se han usadopara la produccion de PR. De hecho, B. subtilis es muyimportante en la produccion industrial de proteasasy de algunas vitaminas. Al carecer de membranaexterna, estas bacterias pueden secretar una grancantidad de proteınas plegadas al medio extracelular ycontienen una baja cantidad de pirogenos (Fu y col.,2007). Sin embargo, los plasmidos recombinantesson poco estables en B. subtilis, y los rendimientos

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de PR son menores que en bacterias Gram-negativas,principalmente debido a la alta actividad de proteasas,cuya produccion aumenta cuando B. subtilis encuentracondiciones de estres (Huang y col., 2003), quetambien pueden conducir su esporulacion. A pesar delas ventajas que dichas bacterias pueden tener en laproduccion de PR, es poco probable que en el cortoplazo sean relevantes para el mercado farmaceutico.Por el contrario, su importancia en la industria deenzimas y quımica fina probablemente crezca.

4 Cultivo bacterianoPara maximizar la productividad de PR, se prefierealcanzar altas densidades celulares en el biorreactor.En un biorreactor de escala de laboratorio, se puedenalcanzar rutinariamente densidades mayores a los100 g/L de biomasa empleando las condiciones decultivo adecuadas. Existen, sin embargo, limitacionesen la escala industrial que hacen que valores tan altosde biomasa no sean alcanzables. Se ha acumuladouna considerable experiencia en el cultivo de E.coli, lo que ha permitido mejorar notoriamente lasproductividades de los cultivos. La Tabla 3 resumealgunos de los valores mas altos de PR producidaen cultivos de E. coli. A pesar de los considerablesavances, hay todavıa muchas dificultades tecnicas quesuperar. Enseguida se detallan algunos de los aspectosmas importantes para el diseno y operacion de cultivosde alta densidad celular de E. coli.

4.1 Medio de cultivo

El medio de cultivo debe estar balanceado parala produccion de biomasa y PR. Para ello, debe

tomarse en cuenta la composicion de la biomasa.Los principales componentes incluyen la fuentede carbono, nitrogeno, fosforo, azufre, potasio, ymagnesio. Es necesario tambien incluir cofactoresenzimaticos como Mb, Co, Ni, Fe, Ca, Cu, Mn, entreotros. Los factores de crecimiento como la tiaminason necesarios para un adecuado crecimiento. Aunqueen cultivos en matraz agitado se agregan mono y difosfato de potasio para formar un amortiguador depH, esto no es necesario en cultivos en biorreactor,en los que el pH es controlado mediante la adicionde acido o base. Tambien debe observarse que variosde los componentes del medio pueden resultar toxicosa ciertas concentraciones; por ejemplo, el amonio estoxico a partir de 3 g/L (Shiloach y Fass, 2005). Estacantidad de amonio puede ser limitante para cultivosde alta densidad celular si se agrega en su totalidadal inicio del cultivo. Sin embargo, el pH puedecontrolarse con hidroxido de amonio, que ademas deservir como base es una fuente de amonio facilmenteasimilable, reduciendo con ello la acumulacion deiones amonio. El medio de cultivo puede contenerfuentes complejas de nitrogeno, como extracto delevadura o casaminoacidos. No obstante, existe unaclara tendencia a eliminar el uso de componentescomplejos, ya que no permiten un control adecuado dela fisiologıa, y reducen la reproducibilidad del cultivo.

Tomando en cuenta un rendimiento de biomasatıpico de 0.5 g biomasa/g glucosa, se requerirıanal menos 200 g/L de glucosa para llegar a unaconcentracion celular de 100 g/L. La glucosa es toxicaa concentraciones superiores a los 50 g/L, por lo queno puede emplearse una concentracion de glucosainicial tan alta (Shiloach y Fass, 2005; Lara y col.,2008). Por otro lado, la produccion de acetato debida

Tabla 3. Algunas de las mayores concentraciones de PR alcanzadas en cultivos de alta densidad celular de E. coli(adaptada de Choi y col., 2006).

Proteına Cepa Condicion de cultivo y Concentracion Referenciafuente de carbono alcanzada

Proteına verdefluorescente

W3110PTS− GalP+

Alimentacion exponencial,glucosa, extracto de levadura

25 g/L Lara y col. (2008)

Factor decrecimiento ILGF-2

BL21 (DE3) pH-stat, medio R, glucosa,extracto de levadura

9.7 g/L Hu y col. (2004)

Proteınamorfogeneticade hueso

TG1 Alimentacion exponencial,medio definido, glucosa,cuerpos de inclusion

8.6 g/L Vallejo y col. (2002)

Proteına verdefluorescente

W3110PTS− GalP+

Lote, glucosa (100 g/L),extracto de levadura

8.3 g/L Lara y col. (2008)

Aminolevulinatosintetasa

MG1655 Lote, medio LB consuplemento optimizado

5.2 g/L Xie y col. (2003)

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a altas velocidades de consumo de glucosa impedirıallegar a altas densidades celulares. Para evitar esto, sehan desarrollado modos de operacion del cultivo masapropiados.

4.2 Transferencia de oxıgeno al biorreactor

Los cultivos de E. coli para la produccion de PR sonllevados a cabo bajo condiciones aerobias. De estamanera se obtienen mayores rendimientos de biomasay producto, debido a que la generacion de energıaes mayor que bajo condiciones anaerobias. Ademas,bajo condiciones anaerobias la glucosa o fuente decarbono es oxidada solo parcialmente por E. coli,lo que conlleva a la acumulacion de subproductosde fermentacion acido-mixta, que resultan toxicos.La demanda de oxıgeno para la oxidacion completade glucosa a CO2 es una funcion directa de lavelocidad de crecimiento de la bacteria conocida comovelocidad especıfica de consumo de oxıgeno (qO2 ). Lavelocidad de consumo de oxıgeno (VCO) en un cultivose obtiene multiplicando la velocidad especıfica deconsumo por la concentracion de biomasa:

VCO = qO2 · X (1)

Para evitar que la bacteria este limitada por oxıgeno,se requiere suministrar oxıgeno al biorreactor a unavelocidad que sea al menos igual que la velocidadde consumo. La velocidad de transferencia deoxıgeno (VTO) al biorreactor es una funcion demuchas variables de operacion del biorreactor, comola velocidad de agitacion, potencia volumetricasuministrada, constante de transferencia de masa(kLa), temperatura, presion, composicion del gas deentrada al biorreactor, entre otros.

Los parametros operacionales como la velocidadde agitacion no se pueden incrementar mas alla deun lımite economicamente permisible, por lo que laVTO en biorreactores normalmente no excede los 0.15mmolO2/g h (Knoll y col., 2007). Esta VTO permitirıamantener condiciones aerobias a un cultivo de E. colide no mas de 40 g/L, creciendo a una velocidad de0.4 h−1. Evidentemente, la VTO de los biorreactoresconvencionales no permitirıa el desarrollo de altasdensidades celulares en cultivos de E. coli. Paramantener condiciones aerobias en un biorreactor sepuede recurrir a otras estrategias. Por ejemplo,emplear aire enriquecido con oxıgeno u oxıgeno puropara aumentar la solubilidad del oxıgeno y con ellola VTO. Tambien se puede manipular parametrosoperacionales del biorreactor para incrementar lasolubilidad del oxıgeno. Por ejemplo, se ha reportado

una VTO de casi 1 mol O2/L h en un biorreactoroperado a una presion de 10 bar (Knoll y col., 2007).Se ha demostrado que el uso de presiones elevadasen los biorreactores no afectan la fisiologıa ni laproductividad de cultivos de E. coli recombinante(Lara y col., en prensa). La VTO maxima delbiorreactor puede llegar a ser el parametro quedetermine la biomasa alcanzable. Tambien puedemanipularse la fisiologıa del cultivo para reducir laVCO, como se explica mas adelante.

4.3 Modo de operacion y sobreflujometabolico

Como se menciono anteriormente, la produccion deacetato bajo condiciones aerobias es un problemaconstante en los cultivos de E. coli. La produccionde acetato es indeseable ya que representa un derrochede esqueletos carbonados, afecta el pH y el gradientede protones transmembranal, entre otros efectos. Porejemplo, en la Fig. 3, se muestra la drasticadisminucion en el contenido de plasmido de celulasde E. coli como resultado de acumulacion de acetato(Lara y Ramırez, en prensa).

La produccion de acetato bajo condicionesaerobias se atribuye a un desbalance entre losflujos de carbono proveniente de glucosa (la cual estransportada a traves del sistema de fosfotransferasa,PTS) en la glicolisis y el ciclo de los acidostricarboxılicos, lo que conduce a una acumulacionde acetil coenzima A, la cual se transforma aacetato que se transporta hacia afuera de la celula(De Anda y col., 2006). En la Fig. 4 puedenverse detalles de estos procesos metabolicos. Estefenomeno de produccion de acetato es conocido comosobreflujo metabolico. Una manera de evitar elsobreflujo metabolico es restringir la velocidad deconsumo de glucosa mediante la adicion controladade una solucion concentrada al biorreactor. Estopuede hacerse mediante esquemas de alimentacionconstante, alimentacion con incremento lineal, conincremento exponencial, o empleando algoritmos decontrol mas sofisticados para controlar el consumomediante efectos indirectos del metabolismo, como lavariacion de la tension de oxıgeno disuelto (TOD) o elpH.

Un enfoque diferente ha permitido eliminar elacetato producido por E. coli mediante el uso demembranas semi-permeables (enfoque denominadocomo biorreactor con dialisis). Con esta tecnica se halogrado la produccion de mas de 190 g/L de biomasa(Fuchs y col., 2002). Este enfoque, sin embargo, no

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Fig. 3. Contenido especıfico de plasmido en funciondel acetato acumulado en un cultivo de E. coli porlote alimentado bajo condiciones aerobias y a pHconstante.

Glucosa Acetato

PTS

G6PPEP PirG6P

2 PEPAcetato

2 PEP

AcCoA

CATCAT

Fig. 4. Esquema simplificado del metabolismoaerobio de E. coli mostrando la produccion deacetato. La glucosa es transportada y simultaneamentefosforilada a glucosa-6-fosfato (G6P) traves delsistema de fosfotransferasa (PTS), el cual transfiereun grupo fosfato del fosfoenol piruvato (PEP), el cualse convierte en piruvato (Pir). El flujo glucolıtico esmayor que el del ciclo de los acidos tricarboxılicos(CAT), lo que conduce a la acumulacion de acetilcoenzima A (AcCoA). La AcCoA es convertida aacetato, el cual es exportado de la celula y acumuladoen el medio de cultivo.

impide el desperdicio de carbono ni contempla elcontrol de la fisiologıa en el biorreactor.

El metodo de cultivo mas empleado para alcanzardensidades celulares altas y evitar la produccion de

acetato es el cultivo alimentado exponencialmente.En este cultivo se utiliza una fase lote corta, paraacumular biomasa a una velocidad de crecimientomaxima. Una vez agotada la fuente de carbono del lote(usualmente menos de 15 g/L de glucosa o glicerol),se inicia la alimentacion de una solucion concentradade glucosa (de hasta 700 g/L). La velocidad deadicion de glucosa se incrementa exponencialmentepara mantener una velocidad de crecimiento constante(y con ello condiciones fisiologicas bien definidas).Para evitar el sobreflujo metabolico, debe mantenerseuna tasa de consumo de glucosa menor al valorumbral que dispara el sobreflujo metabolico (Eitemany Altman, 2006). Este valor dependera de la cepa, elmedio de cultivo y la temperatura del mismo, peroes comun que corresponda a valores de velocidadespecıfica de crecimiento menores a 0.15 h−1.

Al reducir la tasa de consumo de sustrato sereducira por consecuencia la demanda de oxıgenopara oxidarlo, lo que permite alcanzar densidadescelulares mayores a las que se alcanzarıan en uncultivo por lote, pero sin limitacion por oxıgeno. Yaque la variable objetivo en este tipo de sistemas es lavelocidad de crecimiento (una variable macroscopicaque se puede medir con mayor facilidad que lavelocidad especıfica de consumo glucosa), los cultivospor lote alimentado se operan utilizando una bombaprogramable de acuerdo al algoritmo de controldescrito por la siguiente ecuacion (Lara y col., 2008):

F =

(µset

YX/S+ mS

)· ρF

cXF · VLF

cS F· eµset ·(t−tF ) (2)

Donde F es el flujo de alimentacion, µset esla velocidad de crecimiento deseada, YX/S es elrendimiento de biomasa por sustrato, ms es elcoeficiente de mantenimiento (fraccion del sustratoempleada para funciones de mantenimiento celular),ρF es la densidad de la solucion de alimentacion,cXF y VLF son la concentracion de biomasa y elvolumen de lıquido en el biorreactor al inicio de laalimentacion, cS F es la concentracion de glucosa enla solucion de alimentacion, t y tF son el tiempode proceso y el tiempo al inicio de la alimentacion,respectivamente. Con este metodo, ha sido posiblellegar a concentraciones de biomasa de mas de 100g/L.

La Tabla 3 muestra que las mayoresconcentraciones de proteına recombinante alcanzadasse han logrado con cultivos alimentadosexponencialmente, o en modo pH-stat. Este ultimomodo de operacion consiste en agregar glucosa unavez que el pH se incrementa por encima de un valor

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determinado (debido a re-consumo de acetato). Unavez dosificada la glucosa, el pH vuelve a caer debidoal consumo de sustratos y produccion de acetato.Con este metodo se pueden mantener velocidadesde crecimiento relativamente altas evitando unaacumulacion excesiva de acetato.

Los cultivos por lote normalmente no permitenla acumulacion de altas densidades celulares, debidoa la acumulacion de acetato. Sin embargo, Laray col (2008) reportaron la produccion de mas de 8g/L de proteına recombinante en un cultivo por loteempleando una cepa modificada. Las modificacionesal metabolismo central de esta cepa se explicaran masadelante.

4.4 Heterogeneidades ambientales

Otro problema comun en los cultivos industriales esla existencia de gradientes espaciales en parametrosrelevantes como pH, TOD, concentracion de sustrato,CO2 disuelto, entre otros. Esto se debe principalmentea que el escalamiento ascendente de los biorreactoresgeneralmente conduce a un incremento en el tiempode circulacion (tc), definido como el tiempo que unapartıcula en el biorreactor tarda en dar un recorridoal mismo y regresar al punto de partida (Lara y col.,2006a). La Tabla 4 muestra que empleando loscriterios mas comunes de escalamiento, se obtienenincrementos sustanciales en el tiempo de circulacionen el biorreactor. Los criterios mostrados consistenen incrementar la escala de operacion del biorreactormanteniendo constante el parametro mencionado. Conexcepcion de una velocidad de agitacion constante(N), que mantendrıa el tc sin variaciones, los demascriterios conducen a incrementos de hasta 100 veces enel tc. Sin embargo, mantener N constante requiere demotores cada vez mas potentes, incluso inexistentes,que restringen este criterio para su aplicacion.

Como resultado, el incremento en el tc espracticamente inevitable. Esto conlleva a que existanregiones con diferentes concentraciones. Por ejemplo,la adicion del agente de control de pH (una solucionconcentrada de base) se adiciona normalmente lasuperficie del caldo de cultivo y tardarıa hasta 100 sen mezclarse completamente en el biorreactor. Lomismo ocurre con la solucion de glucosa en un cultivoalimentado. Una manera de estudiar los efectosque las condiciones de gran escala pueden teneren los cultivos es la simulacion de las condicionesesperadas, empleando biorreactores de laboratorio,enfoque denominado escalamiento descendente (Laray col., 2006a).

En biorreactores industriales, las bacteriasviajan cıclicamente entre regiones con alta y bajaconcentracion de sustrato. Como resultado, sumetabolismo sufre desviaciones con exposiciones agradientes de sustrato de duracion tan corta como 2 s(Lara y col., 2009). Otro parametro importante quepresenta gradientes es la TOD, cuya importancia yaha sido explicada. La exposicion cıclica de E. coli agradientes de TOD desata procesos transcripcionalesen tiempos tan cortos como 17 s (Lara y col., 2006b).Sandoval-Basurto y col. (2005) reportaron quegradientes de TOD con tc de 180 s tienen un fuerteimpacto en la produccion de proinsulina humana,provocando una disminucion de hasta 94 % en suproduccion. Esto demuestra la importancia de lasheterogeneidades en la produccion de PR por E. coli,que debe ser tomada en cuenta durante el escalamientode los procesos productivos, para un diseno masinformado de las cepas y procesos.

Tabla 4. Incremento en el tiempo decirculacion (tc) como resultado de los

criterios de escalamiento mas comunespara un escalamiento lineal con un factor

de 10. P/V: potencia volumetrica aplicada,N: velocidad de agitacion, UT : velocidaden la punta del impulsor, Re: numero de

Reynolds, kLa: coeficiente de transferenciade masa, vvm: volumen de aire porvolumen de medio por minuto, vs:

velocidad superficial del aire.(Tomado de Palomares y col., 2010).

Criterio Cambio en tc

P/V 4.55N 1.00

UT 10.00RE 100.00

kLa y vvm 9.40kLa y vs 4.55

5 Purificacion de PRLa purificacion de las PR producidas por E. colipuede seguir varias vertientes (Cisneros-Ruız y Rito-Palomares, 2005), dependiendo de la localizacion dela PR, la cual tambien proporciona ciertas ventajassegun cada caso, como puede verse en la Tabla 5.Si la PR fue acumulada en el citoplasma, el primerpaso es la ruptura celular, la cual se puede llevar acabo empleado medios mecanicos o quımicos. Lahomogeneizacion a alta presion es una operacion

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escalable para este fin. La acumulacion de PR en elcitoplasma con frecuencia lleva a la acumulacion decuerpos de inclusion, lo cual depende de factores comola secuencia de la proteına, la fuerza del promotor,la temperatura, velocidad de crecimiento, entre otrosfactores, pero hasta el momento no es facil predecirsu formacion. En ocasiones es deseable la formacionde cuerpos de inclusion (incluso se agregan proteınasde fusion para conducir a su formacion), ya queprotegen a la PR de la proteolisis, y pueden serseparados por centrifugacion continua. Sin embargo,los cuerpos de inclusion pueden tener agregadasgrandes cantidades de contaminantes como ADN,ARN y chaperonas, haciendo que la proporcion dePR en el cuerpo de inclusion llegue a ser tan bajacomo el 60 % (Singh y col., 2006; Ferrer Mirallesy col., 2009). En la industria se han establecidoprotocolos de separacion de estos contaminantes porcentrifugacion (Wong y col., 1996; Heeboll-Nielseny col., 2003). En el caso de productos solubles enel citoplasma, deben tomarse medidas para evitar laproteolisis del producto, como reducir la temperaturao agregar agentes acomplejantes. Si las proteınas sonacumuladas en el espacio periplasmico, la aplicacionde un choque osmotico permite la extraccion de laproteına a la vez que causa muy poco dano a lascelulas.

La recuperacion de la proteına puede llevarsea cabo empleando filtros de diversos tamanos y/ocon superficie cargada. La filtracion tambien esescalable y esta bien establecida en la escala industrial.Los acidos nucleicos pueden ser removidos medianteextracciones o bien agregando agentes policationicoscomo la polietinilamina. La proteına puede sercapturada o precipitada selectivamente empleando unavariedad de materiales que han sido desarrollados paraeste proposito, como algunas resinas de interaccionhidrofobica (Kato y col., 2004).

En el caso de obtener cuerpos de inclusion, laproteına debe replegarse. La eficiencia de este pasoes la influencia mas fuerte para la productividaddel proceso. La proteına obtenida de los pasosanteriores tiene diferentes estados conformacionales.Para obtener la proteına correctamente plegada y en sucaso, los puentes disulfuro, el metodo mas empleadoes disolver el agregado con agentes caotropicos,detergentes, o alcalinizar. Manipulando correctamenteel estado de oxidacion-reduccion de la solucion, esposible promover tanto el plegamiento correcto comola formacion de los puentes disulfuro (Singh y Panda,2005).

La purificacion final de la proteına puede hacersemediante metodos cromatograficos como intercambio

anionico y cationico, interaccion hidrofobica ycromatografıa de fase reversa. Una revision completade estos metodos esta fuera del alcance de este trabajo.La PR purificada debe ademas tener un contenidomınimo de proteına bacteriana, particularmente deendotoxinas. Es comun tambien la eliminacion de unoo dos aminoacidos terminales (p. ej. Metionina) queno pertenecen a la secuencia original de la proteına. Laadicion de polietilenglicol (PEGilacion) a la proteınapermite reducir reacciones inmunogenicas adversas(Kumagai y col., 2010).

6 Ingenierıa metabolica aplicadaa la produccion de PR

La ingenierıa metabolica tiene como objetivo lamodificacion del metabolismo para incrementar lascapacidades celulares hacia la produccion o el fenotipodeseado. Las aplicaciones de la ingenierıa metabolicaa la produccion de PR por E. coli son muy variadas,pero se resumiran solo algunas de ellas. Por ejemplo,una de las principales desventajas de la produccion dePR en E. coli es que la bacteria no es capaz de hacermodificaciones post-traduccionales. Se han hechoesfuerzos conducentes a introducir vıas metabolicas deglicosilacion en E. coli que, aunque no son como lasde humanos, han dado buenos resultados para mejorarla funcion de la PR (Waker y col., 2002; Skretasy col., 2009). Otros desarrollos intentan modificarel estado de oxidacion-reduccion intracelular o enel periplasma para lograr la formacion de enlacesdisulfuro en E. coli (Masip y col., 2004, Nguyen y col.,2011). Para facilitar la purificacion y el procesamientopost-traduccional, tambien se ha buscado establecerestrategias eficientes para que la PR se transporte alespacio periplasmatico (DeLisa y col., 2003), lo quetambien ha sido un area de investigacion muy activa.

Las herramientas modernas de analisis fisiologicoglobal han permitido estudiar las respuestas de E. colia condiciones de produccion y elucidar estrategiasde mejora del metabolismo celular. Por ejemplo,Choi y col. (2003) estudiaron el transcriptoma decultivos de alta densidad celular de E. coli produciendoPR. Basados en sus resultados, seleccionaron yco-expresaron dos genes (glpF, codifica para untransportador de glicerol y prsA, codifica para unafosforibosil pirofosfato fosfotransferasa), lograndoaumentar la produccion de PR a mas del doble.Estudios proteomicos y del fluxoma tambien hanarrojado informacion valiosa sobre la fisiologıabacteriana en cultivos de alta densidad celular (Lemuthy col., 2008).

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Tabla 5. Ventajas y desventajas de la localizacion de la PR producida en E. coli en losprocesos de purificacion (Adaptado de Choi y col., 2006).

Lugar de acumulacion Ventajas Limitaciones

Citoplasma Frecuentemente forma cuerpos deinclusion, se puede remover lamayorıa de los contaminantes

Requiere replegamiento posterior

Periplasma Se pueden formar puentesdisulfuro, se pueden emplearsenales de secrecion naturales

La traslocacion es empırica ymuchas veces ineficiente

Secrecion extracelular Facilidad de cosecha del productocon buena pureza en el

sobrenadante. Razonablementeeficiente para peptidos.

La maquinaria de secrecion noesta completamente estudiada y esineficiente para proteınas grandes.

El estudio de respuestas transcripcionales agradientes ambientales empleando sistemas deescalamiento descendente ha permitido generar cepasmodificadas con una mejor produccion de PR. Laray col. (2006b) estudiaron la expresion de 21 genesen respuesta a oscilaciones de TOD. Basados ensus resultados, bloquearon parcialmente la ruta defermentacion acido-mixta, lo que resulto en una mayorvelocidad de crecimiento incluso bajo gradientes deTOD y aumentando al doble la produccion de PR bajocondiciones constantes u oscilantes de TOD (Lara ycol., 2006c).

Con el objetivo de reducir el sobreflujo metabolicoy mejorar el desempeno en cultivos de alta densidadcelular, Lara y col. (2008) emplearon una cepa deE. coli modificada en el sistema de transporte deglucosa. En esta cepa, el sistema nativo PTS fuebloqueado, y la glucosa es transportada a traves dela permeasa de galactosa, que esta sobre-expresada anivel cromosomal en la cepa modificada (De Anda ycol, 2006). Como se observa en la Fig. 5, el transportea traves de la permeasa de galactosa no depende dePEP como en el PTS (ver Fig. 4). Esto permitetener mas PEP disponible para funciones biosinteticas.Las cepas mutantes en el PTS tambien tienen unmayor flujo de carbono hacia la vıa de las pentosasfosfato, que incrementarıa la cantidad de precursoresde acidos nucleicos para mantener una mayor cantidadde plasmido.

Dado que la velocidad de consumo de glucosa eneste sistema es 33 % menor que en una cepa nativa, elsobreflujo metabolico es fuertemente reducido. Estoha permitido el cultivo de la cepa modificada en modolote empleando hasta 100 g/L de glucosa inicial, loque condujo a una produccion de 52 g/L de biomasay mas de 8 g/L de PR y solo 2 g/L de acetato (que

despues fue consumido por la bacteria), en contrastecon la cepa nativa, que produjo 34 g/L de biomasa,menos de 4 g/L de PR y cerca de 14 g/L de acetato.La concentracion de PR alcanzada en este estudio es lamas alta reportada para un cultivo por lote. Cabe hacernotar que ni el medio ni la cepa fueron optimizadaspara la produccion de la PR modelo (proteına verdefluorescente), por lo que la produccion podrıa mejoraraun mas.

El cultivo por lote de esta cepa modificadaempleando altas concentraciones de glucosa es unaopcion atractiva ante los cultivos alimentados que,como se ha explicado, presentan desventajas comotiempos de cultivo prolongados y presencia degradientes de sustrato. Sin embargo, uno delos principales retos es el suministro de oxıgeno,ya que se tiene una densa poblacion celularrespirando activamente. Se ha demostrado que lacepa es cultivada satisfactoriamente en biorreactorespresurizados empleando hasta 130 g/L de glucosainicial, con una mınima produccion de acetato,mientras que la sobre-presion del biorreactor llego acasi 5 bar y la VTO a 0.45 mol O2/L h (Knabben ycol., 2010). Esta VTO es la mas alta reportada para uncultivo por lote.

Los ejemplos anteriores muestran el potencial dela ingenierıa metabolica no solo para incrementar laproduccion de PR y su modificacion, sino tambienpara mejorar el desempeno de E. coli ante condicionesde proceso y facilitar las etapas de purificacion.

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Glucosa AcetatoH+

GalP

Glucosa H+

ATP

G6PAcetato

ADP

2 PEP

AcCoA

CATCAT

Fig. 5. Esquema simplificado del transportede glucosa a traves de la permeasa de galactosa.La glucosa es fosforilada por la glucocinasa,consumiendo ATP en vez de PEP. La nomenclatura esla misma que en la Fig. 4.

PerspectivasEl mercado de PR producidas por bacterias es muyimportante a nivel mundial. Las ventajas de laproduccion de PR sobre otros organismos alientala investigacion para superar las desventajas desistemas microbianos, como lograr modificacionespost-traduccionales y producir proteınas de elevadopeso molecular. Los avances recientes en este campo,mantienen vigente el interes en lograr sistemas deexpresion y de cultivo bacteriano cada vez maseficientes. La ingenierıa metabolica y un mejorentendimiento de la fisiologıa de la bacteria durante laexpresion y bajo condiciones de produccion industrialpermitiran sin duda incrementar los rendimientos yabriran nuevas opciones de procesamiento de PR.

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