TESE DE DOUTORADO

Murchas permanentes em plantas da família Arecaceae .

Histopatologia e ultraestrutura da interação patóg eno - planta.

Jorge André Sacramento de Magalhães

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIB EIRO

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RIO DE JANEIRO

Junho – 2005

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II

Murchas permanentes em plantas da família Arecaceae .

Histopatologia e ultraestrutura da interação patóge no - planta.

Jorge André Sacramento de Magalhães

“Tese apresentada ao Centro de

Biociências e Biotecnologia, da

Universidade Estadual do Norte

Fluminense Darcy Ribeiro, como

parte das exigências para a

obtenção do título de Doutor em

Biociências e Biotecnologia.“

Orientador: Dr. Flávio Costa Miguens

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RIO DE JANEIRO

Junho – 2005

III

Murchas permanentes em plantas da família Arecaceae .

Histopatologia e ultraestrutura da interação patóg eno - planta.

JORGE ANDRÉ SACRAMENTO DE MAGALHÃES

“Tese apresentada ao Centro de

Biociências e Biotecnologia, da

Universidade Estadual do Norte

Fluminense Darcy Ribeiro, como

parte das exigências para a

obtenção do título de Doutor em

Biociências e Biotecnologia.“

Aprovada em 23 de junho de 2005. Comissão Examinadora: Profa. Maura da Cunha (DSc, Ciências Biológicas - Biofísica) - UENF Prof. Pedro Henrique Monnerat (PhD, Nutrição de Plantas) - UENF Prof. José Luiz Bezerra (PhD, Plant Pathology) – CEPEC/CEPLAC Prof. Flávio Costa Miguens (DSc, Ciências Biológicas - Biofísica) – UENF

(Orientador)

IV

A minha Família pelo apoio irrestrito

Dedico

V

Agradecimentos

A Deus pela força, fé e determinação.

Ao Dr Flávio Costa Miguens, meu orientador, pela orientação, experiência

profissional e em particular pela amizade.

A minha família, minha mãe Alvanira e meu pai Amaury e minhas irmãs

pelo amor e dedicação.

A minha ex-namorada Ana Brígida Soares pelo carinho e alento.

Ao agradecer aos proprietários rurais Clóvis de Paula Machado, João

Carlos Enne e Marcus Vinicius Crespo, agradeço a todos os proprietários rurais

pela recepção carinhosa, que nos receberam em suas propriedades e em

particular a APRUSAM.

A Prefeitura Municipal de Conceição de Macabu e Prefeitura Municipal de

Quissamã, em especial as Secretarias de Agricultura.

Ao Sr Manoel Couto, que nos acompanhou em diversas saídas de campo e

no contato com os produtores rurais de Conceição de Macabu.

Ao Dr. José Inácio Lacerda Moura, personificando a CEPLAC – Comissão

Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira, pela calorosa acolhida e facilidades na

coleta de material.

VI

A amiga e ex-aluna Lívia Mello de Amorim pela grande contribuição nesse

estudo.

A todo corpo técnico do LBCT pela total disponibilidade nesse estudo.

A todo corpo docente do LBCT pelos conhecimentos técnicos

disponibilizados nesse estudo.

A todos os ex-alunos de Iniciação Científica que tiveram minha co-

orientação, meus sinceros agradecimentos.

Aos amigos: Noil, Carlos Eduardo, Gilmar um agradecimento especial pela

amizade. E a todos os colegas e companheiros de pós-graduação que sempre

estavam disponíveis para bate-papos amenos e descontraídos para aliviar a

tensão.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico –

CNPq, à Fundação de Amparo à Pesquisa Carlos Chagas Filho do Estado do Rio

de Janeiro – FAPERJ, à Fundação Estadual do Norte Fluminense – FENORTE, e

à Universidade Estadual do Norte Fluminense Darci Ribeiro – UENF, pelo apoio

financeiro para realização deste projeto.

VII

SUMÁRIO

RESUMO..................................................................................................... VIII

ABSTRACT................................................................................................. X

INTRODUÇÃO............................................................................................ 1

REVISÃO DE LITERATURA....................................................................... 5

OBJETIVOS................................................................................................ 43

MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................... 45

RESULTADOS (AGRONÔMICOS)…………………………………………… 59

ARTIGOS.................................................................................................... 71

Classical Biological Control and mass trapping of Rhynchophorus

palmarum L. 1794 (Coleoptera:Curculionidae). A hypothesis based in

morphological evidences. ……………………………………………………...

71

Scanning Electron Microscopy of Wilt Disease in Peach Palms [Pupunha]

– (Bactris gasipaes Kunth). ……………………………………………..........

91

A Light and Electron Microscope Study of Coconut Tree, Cocos nucifera

L. (Arecaceae), affected by Phytoplasma. …………...................................

108

Structural study of Phytomonas staheli and Cocos nucifera interactions. 127

Scanning Electron Microscopy of Bursaphelencus cocophilus (Cobb,

1919) Baujard 1989 (Nematoda: Tylenchida). ……………………………...

150

DISCUSSÃO............................................................................................... 170

CONCLUSÃO............................................................................................. 181

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................ 183

VIII

RESUMO

Magalhães, Jorge André Sacramento de. D.Sc. Universidade Estadual do Norte

Fluminense Darcy Ribeiro, junho de 2005. Murchas permanentes em plantas da

família Arecaceae. Histopatologia e ultraestrutura da interação patógeno - planta.

Orientador: Dr. Flávio Costa Miguens.

A cocoicultura comercial é relativamente recente na região Norte do Estado

do Rio de Janeiro. No entanto, têm sido detectados problemas agronômicos e

fitossanitários que merecem atenção. Por outro lado, a literatura especializada

ressalta que transpor metodologias e soluções de uma região geográfica para

outra é desaconselhável. Neste estudo caracterizou-se histopatológica e

ultraestruturalmente a interação patógeno/planta, em murchas permanentes de

plantas da família Arecaceae. E ainda, foi realizado levantamento cultural e

agronômico da cocoicultura no norte fluminense; determinada a etiologia de

murchas permanentes da família Arecaceae na região norte fluminense. Os dados

obtidos permitiram comparar a interação patógeno/planta no Estado do Rio de

Janeiro com obtidos no Estado da Bahia.

A descrição anatômica e ultraestrutural da interação Phytomonas staheli /

Cocos nucifera e da interação Bursaphelenchus cocophilus / Attalea funifera,

Cocos nucifera, Elaeis guineensis e Elaeis sp. foi realizada comparando dados da

região norte fluminense com os da região sudeste do Estado da Bahia; bem

como, descrevendo os respectivos agentes etiológicos.

IX

A etiologia de murchas permanentes em Bactris gasipaes no sul do Estado

da Bahia foi investigada tendo sido sugerida sua origem fúngica. Resultados

preliminares confirmam a presença de Amarelecimento Letal na região norte

fluminense e descrevem anatômica e ultraestruturalmente a interação Candidatus

Phytoplasma palmae / Cocos nucifera.

X

ABSTRACT

Magalhães, Jorge André Sacramento de. D.Sc. Universidade Estadual do Norte

Fluminense Darcy Ribeiro, junho de 2005. Permanent wilt in plants of the

Arecaceae family. Histopathology and ultrastructure of the interaction pathogen -

plant. Advisor: Dr. Flávio Costa Miguens.

The commercial coconut crop is relatively recent in the region in the North

of the Rio de Janeiro State. However, they have been detected agronomic and

phytosanitary problems that deserve attention. On the other hand, specialized

literature establish that to transpose methodologies and solutions of a geographic

region for another one it is not recommended. In this study the interaction

pathogen/plant was characterized in histopathologic and ultrastructurally

approach in permanent wilt in the plants of the Arecaceae family. In addition,

agronomic features of the coconut crop were carried through determined the

etiology of Arecaceae diseases in the Rio de Janeiro state. north family in the

region of the state of Rio de Janeiro north. These data had allowed to compare

the interaction with then obtained from Bahia state.

The anatomical and ultrastructural description of the Phytomonas staheli /

Cocos nucifera interaction and of the Bursaphelenchus cocophilus / Attalea

funifera, Cocos nucifera, Elaeis guineensis and Elaeis sp. interaction were carried

through comparing results of the region of the Rio de Janeiro state of with the

Bahia state as well as describing the respective etiological agents.

XI

Preliminary results confirm the presence of Lethal Yellowing in the region

of the Rio de Janeiro state and describe anatomically and ultrastructurally the

interaction Candidatus Phytoplasma palmae / Cocos nucifera.

1

INTRODUÇÃO

As plantas necessitam de um aporte de água e adequadas quantidades de

nutrientes inorgânicos e orgânicos. Com relação a nutrição mineral as plantas

necessitam de macronutrientes e micronutrientes na forma de sais inorgânicos

diluídos na água disponível no solo, constituindo, desta forma a solução do solo,

sendo portanto absorvidos pelo sistema radicular. Água, compostos inorgânicos e

orgânicos são transportados em longa distância, no interior da planta, pelo

sistema condutor. O sistema solo-planta-atmosfera é relacionado com o fluxo

ascendente de água e seus solutos, culminando com evapotranspiração; sendo

dependente do potencial de matriz, do potencial osmótico e capilaridade dos

elementos de vaso e traqueídeos do xilema e das condições ambientais. O

transporte de longa distância de água e fotossintetatos das folhas para raiz ocorre

preponderantemente através dos elementos de tubo crivado do floema; sendo

dependente do carregamento ativo desses elementos e do potencial osmótico

(Salisbury e Ross, 1985; Taiz e Zeiger, 1998).

Plantas podem apresentar um quadro de murcha desencadeado por

fatores abióticos ou bióticos. Um quadro de murcha irreversível causado por

fatores abióticos ocorre quando a demanda hídrica, que varia, principalmente, de

acordo com a espécie, não é suprida pela reserva de água no solo e não atende a

demanda atmosférica. Neste caso, a evapotranspiração torna-se maior,

incapacitando a manutenção da coluna d’água no interior da planta e, por si só,

inviabilizando a condução xilemática e, portanto, o sistema solo-planta-atmosfera

(Reichardt, 1990). Murchas irreversíveis provocadas por fatores bióticos têm, de

um modo geral, o comprometimento morfológico, fisiológico ou ambos do sistema

2

condutor. Os principais agentes etiológicos de murchas irreversíveis são vírus,

fitoplasmas, espiroplasmas, bactérias, fungos, protozoários e nematóides (Agrios,

1997; Bedendo, 1996; Lamb, 1996; Lucas, 1998).

Agronomicamente, murchas irreversíveis, de origem abiótica ou biótica,

constituem um sério problema. Para o controle de murchas irreversíveis de

origem abiótica medidas culturais podem ser empregadas. O controle de murchas

irreversíveis de origem biótica depende do agente etiológico envolvido e seu

modo de transmissão. Geralmente, preconiza-se a eliminação das plantas fontes

de infecção e o controle de vetores (Agrios, 1997; Bedendo, 1996; Lamb, 1996;

Lucas, 1998).

A família Arecaceae originou-se provavelmente no período Cretáceo,

possui em torno de 236 gêneros e 3.400 espécies com exemplares distribuídos

nos mais variados ecossistemas. Há representantes arbustivos e arbóreos, e

raros casos de plantas trepadeiras. A característica marcante dessa família é a

presença de meristema apical único, normalmente chamado de palmito, de onde

emergem as folhas compostas (Joly, 2002). A família Arecaceae, em 1832, foi

descrita por Schultz em substituição à família Palmae. Contudo, muitos autores

utilizam, ainda que erroneamente, a denominação família Palmae.

As plantas da família Arecaceae são separadas de acordo com sua

importância econômica (Quadro 1) como de interesse urbanístico, ornamentais de

folhagem e flores, e, principalmente como fonte de alimento (Seth, 2004).

Atualmente, existem mais de 100 diferentes espécies de palmeiras sendo

utilizadas e produzidas comercialmente no mundo, chegando a um total de mais

de 2.500 variedades espalhadas, principalmente, nas regiões tropicais (Virtual

Palm Enciclopédia, 2004).

As perdas provocadas por doenças limitam a produtividade agrícola, e as

epidemias podem ter conseqüências devastadoras. Muitas das doenças que

ocorrem em plantas envolvem interações especializadas entre o patógeno e a

planta hospedeira (Lamb, 1996; Agrios, 1997). É comum encontrar na literatura

doenças associadas a agentes infecciosos ou doenças relacionadas à deficiência

mineral, poluentes químicos ou fatores climáticos adversos (Lucas, 1998).

Doenças infecciosas são aquelas oriundas da infecção da planta por um

patógeno. Estas doenças são caracterizadas pela capacidade do patógeno

crescer e se multiplicar rapidamente nas plantas suscetíveis e também por sua

3

habilidade de ser transmitido a plantas sadias, a partir de plantas doentes,

provocando a mesma doença. Contudo, quando um organismo vive em um

hospedeiro e obtém deste o seu nutriente, ele é denominado parasita. Parasitismo

refere-se às relações entre o parasita e seu hospedeiro. Por sua vez,

patogenicidade pode ser definida como a capacidade do parasita interferir em

uma ou mais funções essenciais da planta hospedeira causando-lhe danos

adicionais, portanto, uma doença (Agrios, 1997).

Quadro 01 - Espécies da família Arecaceae e seus principais uso s.

Espécie Nome Vulgar Usos

Acrocomia aculeata Seiva: Açúcar e vinho (Galeano & Bernal, 2002).

Arenga pinnata Palmeira negra Seiva: Açúcar (Galeano & Bernal, 2002).

Attalea cohune Cohune palm Frutos: óleo. Folhas: fibras (Campos et al., 2000).

Attalea funifera Piaçava Frutos: óleo. Folhas: fibras (Woodroof, 1970; Child,

1974; Grimwood, 1975).

Bactris gasipaes Pupunha Frutos: alimentação animal e humana.

Folhas: fibras e construção civil.

Meristema: palmito (Macía, 2004).

Borassus flbellifer Palmyra palm Frutos: óleo. Folhas: fibras (Campos et al., 2000).

Cocos nucifera Coco Seiva: bebida alcoólica “Toddy”

Frutos: óleo, albúmem sólido e líquido, fibras de

enchimento.

Folhas: fibras cobertura, fibras de enchimento.

Meristema: salada maravilha (Woodroof, 1970; Child,

1974; Grimwood, 1975).

Copernicia prunifera Babaçu Fruto: Óleos e carvão. Folhas: cera (Campos et al.,

2000).

Chamaedorea angustisecta Palmeirinha Inflorescências: desodorização de ambientes e

ornamentação (Galeano & Bernal, 2002).

Ellaeis guineensis Dendê Frutos: óleo (Woodroof, 1970; Child, 1974; Grimwood,

1975).

Euterpe edulis Jussara Meristema: palmito (Macía, 2004).

Euterpe oleracea Açaí Meristema: palmito.

Frutos: alimentação animal e humana (Macía, 2004).

Euterpe precatória Açaí do mato Raízes: infusões no combate a hepatite e anemia

(Campos et al., 2000).

Iriartea deltoidea Paxiubão Folhas: construção civil. Estipe: canoas (Campos et al.,

2000).

Mauritia flexuosa Buriti Folhas: fibras e pecíolos na construção de gaiolas e

armadilhas (Campos et al., 2000).

4

Phoenix dactylifera Tâmara Frutos: alimentação animal e humana.

Folhas: fibras (Woodroof, 1970; Child, 1974;

Grimwood, 1975).

Phytelephas macrocarpa Jarina Frutos: fabricação de anéis e botões a partir das

sementes.

Folhas: infusões de folhas jovens no combate a

infecções renais e alergias (Galeano & Bernal, 2002).

Roystonea regia Palmeira real Árvore: ornamental. Meristema: palmito (Woodroof,

1970; Child, 1974; Grimwood, 1975)

Murchas irreversíveis ou permanentes bióticas têm sido descritas na família

Arecaceae desde o século XIX e lhes têm sido imputadas as mais diferentes

origens (Franco,1964). No entanto, os principais agentes etiológicos de murchas

irreversíveis ou permanentes nesta família são vírus, fitoplasmas, fungos,

protozoários, nematóides e de origem desconhecida (Van Bel et al., 2002;

Mpunami et al., 2000; Peng et al., 1999; Morand e Sorci, 1998; Giblin-Davis et al.,

1989).

A elucidação da etiologia de murchas permanentes na família Arecaceae

esteve freqüentemente relacionada com a microscopia óptica e eletrônica. Os

estudos das doenças: Marchitez sorpressiva do dendê (Parthasarathy et al.,

1976), Hartrot do coqueiro (Dollet et al., 1977; Da Cunha, 1998), Anel Vermelho

dos coqueiros e dendezeiros (Cobb, 1919), e Amarelecimento Letal das palmeiras

(Dollet et al., 2001; Nejad e Johnson, 2000 Gerber e Giblin-Davis, 1990; Van

Slobbe et al., 1978) são exemplos da importância destas ferramentas em

fitopatologia. Não podendo deixar de ser considerado, o quadro de reciprocidade

de doenças e patógenos em espécies, desta família (Dollet et al., 2001; Nejad e

Johnson, 2000 Gerber e Giblin-Davis, 1990; Van Slobbe et al., 1978).

Neste trabalho, abordaremos o estudo de murchas permanentes em

plantas da família Arecaceae, visando compreender a histopatologia e

ultraestrutura da interação patógeno/planta. Para tanto, recorreremos a espécies

de interesse para o agronegócio, que serviram como modelo para esse estudo,

onde destacamos: Attalea funifera, Mart. (piaçava), Bactris gasipaes, Khunt

(pupunha), Cocos nucifera, L. (coco) e Elaeis guineensis, Jacq (dendê).

5

REVISÃO DE LITERATURA

Família ARECACEAE

A família ARECACEAE foi redescrita em 1832, por Schultz a partir da

família PALMAE, descrita inicialmente por Juss 1789, com objetivo de abranger

todas as espécies com caracteres comuns a família (Virtual Palm Encyclopedia,

2004). Nos trópicos é difícil encontrar uma família de plantas que apresente maior

diversidade de utilizações que as espécies desta família, também conhecidas

como palmeiras. De fato, esta família tem sido considerada uma das mais

versáteis devido aos seus múltiplos usos. A família melhor estudada dentre as

monocotiledôneas é a das gramíneas como fornecedora de alimentos,

principalmente grãos. No entanto, esta família apresenta poucos usos quando

comparada com a família ARECACEAE (Martin, 1999).

A família Arecaceae originou-se no período Cretáceo ou Pré-cretáceo,

entre 144 e 66 milhões de anos atrás, possui em torno de 236 gêneros e 3.400

espécies com exemplares distribuídos nos mais variados ecossistemas. Há

representantes arbustivos e arbóreos, raros casos de plantas trepadeiras. A

característica marcante dessa família é a presença de meristema apical único,

normalmente chamado de palmito de onde emergem as folhas compostas. As

gemas laterais existentes nas axilas das folhas são destinadas à emissão de

inflorescências e posteriormente a frutificação. Tipicamente, o caule é do tipo

estipe não ramificado, com folhas terminais atingindo de um a vinte metros de

altura, podendo este ser totalmente desnudo ou encoberto pelas bainhas das

folhas que compõe a copa da planta, existindo também representantes sem

6

caules com folhas que nascem ao nível do chão e com caule subterrâneo. Folhas

adultas basicamente palmadas ou penadas, apresentando-se em botão e

pregueadas. Os pecíolos são longos, freqüentemente, com uma bainha

invaginante e larga. Folhas juvenis, bem como, adultas de certas espécies, são

inteiras e graminiformes largas. As Inflorescências são paniculadas, axilares e

protegidas por uma ou mais brácteas grandes. Quando só há uma bráctea e esta

é lenhosa, com a característica forma de canoa, então é designada de cimba ou

espata. Possuem flores pequenas, com perianto não vistoso, em 2 séries, trímero,

unissexuais e raramente hermafroditas. Quando unissexuais, geralmente na

mesma inflorescência, e raramente em plantas distintas. As flores masculinas

possuem 6 estames em geral, e as femininas apresentam ovário súpero,

tricarpelar, trilocular, com 1 óvulo em cada lóculo. As vezes, um só lóculo é fértil

(Cocos ssp). Fruto é seco ou carnoso, indeiscente. Sementes com abundante

endosperma, em geral oleaginoso. O sistema radicular é fasciculado (Joly, 2002).

Há poucos dados sobre a histopatologia e ultraestrutura da família

ARECACEAE. A maioria reporta-se aos folíolos. De um modo geral, plantas desta

família apresentam folíolos com estrutura dorsiventral. A epiderme adaxial

apresenta células de forma cúbica, glabras e revestidas por cera epicuticular,

freqüentemente do tipo camada lisa. Segue-se uma a duas camadas de células

sub-epidérmicas. O mesófilo é composto por duas a três camadas de parênquima

paliçádico e quatro a cinco camadas de parênquima lacunoso. Entre o

parênquima lacunoso e a epiderme abaxial freqüentemente encontra-se uma a

duas camadas de células sub-epidérmicas. A epiderme abaxial tem a mesma

origem da epiderme adaxial na forma de suas células, sendo menores.

Estômatos tetracíticos são os mais freqüentes, estando presentes somente na

epiderme abaxial. Tricomas estrelados são comuns na epiderme abaxial. A

superfície abaxial é revestida por cera epicuticular, apresentando grande

diversidade de formas. Os feixes vasculares são do tipo colaterais e circundados

por fibras de esclerênquima. Idioblastos taníferos ocorrem entremeados às

células do mesófilo e no parênquima dos feixes vasculares; idioblastos

cristalíferos, predominantemente apresentando cristais do tipo ráfide, são

encontrados entre as células do mesófilo (Barthloth et al., 1998; Costa, 2004;

Esaú, 1960, Tomlinson, 1961). As ceras epicuticulares apresentam uma

7

morfologia diversificada com relação a epiderme e as células estomáticas, sendo

comum a existência de cristais de silício nessas ceras (Lins et al., 2002).

A histologia da região meristemática é a usual das monocotiledôneas,

apresentando células indiferenciadas que formam folhas e gemas florais.

Sobrejacentemente a região meristemática evidencia-se a formação de primórdios

foliares e florais. Nestas regiões os feixes vasculares apresentam distribuição

casualisada, usualmente circundados por fibras de esclerênquima (Da Cunha,

1998).

Attalea funifera Mart. (piaçava) – Esta palmeira, conhecida por piaçava

ou piaçaba “Bahia coquilla”, é espécie nativa, cujas fibras são longas, resistentes,

rígidas, lisas, de textura impermeável e de alta flexibilidade. Essa palmeira se

desenvolve bem em solos de baixa fertilidade e com características físicas

inadequadas para a exploração econômica de muitos cultivos. A necessidade de

pouco investimento financeiro para plantio, manutenção e exploração, torna a

piaçaveira uma opção agrícola atraente, pelos reduzidos riscos e altos

rendimentos que proporciona ao investidor (Casali, 2001). O interesse comercial

nessa cultura vem principalmente do uso de suas fibras marginais dos pecíolos na

confecção de vassouras e enchimentos na indústria automotiva (Medina, 1959).

Em 1999, o Brasil exportou 9.300 toneladas de piaçava, sendo os principais

compradores os Estados Unidos, Portugal, Alemanha e Holanda. Não há

estatísticas confiáveis sobre a cultura, já que é praticamente impossível controlar

a produção, tampouco a ocupação e o modo de utilização da mão-de-obra, pois

se trata de uma cultura extrativista. Sabe-se que a Bahia responde por 90% da

produção nacional, com 30 mil hectares, principalmente na região Sudeste

(Bezerra, 2000).

O gênero Attalea inclui espécies nativas da região tropical das Américas.

São plantas endêmicas das florestas costeiras do leste brasileiro,

economicamente importante devido à qualidade de suas fibras da bainha foliar.

São árvores de porte alto, até 20 metros de altura, apresentando 12 a 15 folhas,

com disposição helicoidal em ângulos agudos com o estipe, cujas bainhas foliares

envolvem parcialmente o caule. Seus frutos são biconvexos, medindo cerca de 10

cm quando plenamente desenvolvidos (Aquino et al., 2001).

8

Grande parte dos dados de literatura referente a A. funifera se refere às

características e empregos de suas fibras (Aquino et al., 2001; Aquino et al.,

2003) e a extração e caracterização da lignina destas fibras (Gonçalves et al.,

2000, Schuchardt et al., 1995). A biologia da reprodução e a ecologia destas

plantas também têm sido analisadas. Usualmente, A. funifera produz

inflorescências funcionais femininas, masculinas e bisexuais. Os grãos de pólen

são relativamente secos, e a polinização pelo vento não é significante, sendo

promovida principalmente por pequenos percevejos – Mystrops sp. – e besouros

– Phyllotrox tatianae – atraídos olfativa e visualmente. A produção de folhas e

flores, a maturação dos frutos e abscisão das folhas ocorre continuamente, sendo

que a maior floração ocorre de dezembro a abril (Voeks, 1985; Voeks, 1988,

Voeks, 2002). Sua classificação botânica é:

Reino: Plantae

Sub-reino: Tracheobionta

Super-divisão: Spermatothyta

Divisão: Magnoliophyta

Classe: Liliopsida

Ordem: Arecales

Família: Arecaceae

Gênero: Attalea

Espécie: Attalea funifera Mart (ex Streng)

Bactris gasipaes Kunth (pupunha) – Trata-se de uma palmeira precoce e

rústica, com ocorrência natural na zona equatorial das Américas, apresentando

várias subvariedades ou tipos de acordo com tamanho e coloração de seus frutos

(Bovi & Cardoso, 1978, apud por Sawazaki et al., 1998). A pupunha encontra-se

em franca expansão em nosso país com cultivos crescentes no sul da Bahia e

interior de São Paulo. No Estado do Rio de Janeiro, ainda é uma cultura

incipiente. Na Região Norte Fluminense vêm sendo desenvolvidas culturas

comerciais em Santa Maria Madalena e Conceição de Macabu, tendo como

principal objetivo à obtenção de palmito de origem cultivada. É uma planta de

ciclo curto, aproximadamente 18 meses, e que perfilha, potencializando uma

extração escalonada e perene de palmito ideal para a indústria de conservas

9

(Monteiro et al., 2002). Por outro lado, um potencial uso e pouco difundido em

nosso país e com bastante expressão na Costa Rica é o uso dos frutos e

subprodutos da extração de palmito na alimentação animal enriquecendo,

consideravelmente, o teor protéico da ração, a digestibilidade e o ganho de peso;

constituindo como uma excelente alternativa ao uso de gramíneas na alimentação

de ruminantes. O consumo de frutos de pupunha após o cozimento revela-se um

alimento rico em carboidratos, lipídios e proteínas (Clement & Mora-Urpi, 1987). A

importância dessa palmeira cresceu consideravelmente no Brasil, por ser uma

excelente alternativa para cultivo sustentável do palmito. O palmito é considerado

uma iguaria tipicamente brasileira, sendo o Brasil o maior produtor e maior

consumidor. O Brasil já foi o maior exportador, mas exportava menos de 10% de

sua produção. A produção legal brasileira nos últimos anos tem sido relativamente

estável, variando entre 35.637 toneladas em 1998 a 41.714 toneladas em 2001.

Entretanto, sabe-se que existe uma quantia considerável de palmito extraído

ilegalmente de matas nativas que não entram nas estatísticas oficiais (Reis et al.,

2000). À produção legal brasileira representa mais de 50% de todo o palmito

comercializado no mundo, que é estimado em torno de 80.000 toneladas por ano.

O palmito de pupunheira é cultivado e produzido na Costa Rica e no Equador.

Além de considerado ecológico e de melhor qualidade, tem sua comercialização

controlada por grupos multinacionais que investem em qualidade e marketing e

divulgam os problemas do palmito brasileiro, quanto a sua extração ilegal de

palmiteiros nativos da Mata Atlântica. Um maior rigor no controle da extração

ilegal, deverá levar a uma expansão do mercado de palmito de pupunha cultivada

no Brasil. Apenas para atender a demanda interna de palmito estima-se seriam

necessários 130.000 ha de pupunheiras cultivadas (Corpei, 2001). Além disto,

palmitos ecologicamente corretos e de boa qualidade são competitivos no

mercado internacional. O mercado nacional e internacional representam,

potencialmente, um agronegócio que promoveria geração de empregos e

riquezas tanto no campo como na indústria e comércio (EMBRAPA, 2004).

A pupunheira pode ocorrer em um único estipe delgado e ereto ou, mais

freqüentemente, apresentar vários estipes formando touceira. Os estipes podem

atingir diâmetros de 20 centímetros e apresentar espinhos pretos e duros em

arranjo circular da base até o topo, porém há variedades com número reduzido de

espinhos ou sem espinhos. Plantas adultas podem atingir 30 metros de altura,

10

com uma abundante produção de perfilhos na altura do solo. As folhas pinadas,

com até 3,5 metros de comprimento, são compostas com pecíolos ou bainhas

curtas podendo apresentar espinhos. Os folíolos medem aproximadamente 60

centímetros de comprimento e 3,2 centímetros de largura; sua nervura média

apresenta um tom verde escuro na superfície adaxial e um tom palha na

superfície abaxial. A inflorescência protegida por espata única é composta de

pequenos rácemos com 20 a 30 centímetros de comprimento com flores

masculinas e femininas intercaladas exceto, na porção terminal onde existem

somente flores masculinas. Os frutos são dispostos em cachos com 50 a 100

frutos, podendo chegar a 300, totalizando, em média, 11 kg por cacho. A cor dos

frutos é variável de amarelo, alaranjado, marrom ou vermelho, e se tornam

purpura quando maduros. O formato é ovóide oblato, cilíndrico ou cônico com 2,5

a 5 centímetros de comprimento, com base verde, o aspecto é coreáceo, tendo

três cálice pontiagudos. Podem apresentar 5 a 6 cachos de frutos

concomitantemente. A casca dos frutos é fina, envolvendo polpa com coloração

variando desde amarelo escuro a laranja claro. A polpa tem sabor adocicado com

traço amargo ou caústico e seco. As sementes têm formato cônico, com 2

centímetros de comprimento, cuja casca é dura e fina. A noz ou endosperma é

branco e oleaginoso, apresentando flavorizante de coco. Raramente são

encontradas duas sementes fundidas (Morton, 1987). Sua classificação botânica

é:

Reino: Plantae

Sub-reino: Tracheobionta

Super-divisão: Spermatothyta

Divisão: Magnoliophyta

Classe: Liliopsida

Ordem: Arecales

Família: Arecaceae

Gênero: Bactris

Espécie: Bactris gasipaes Kunth (syn: Guiliema gasipaes)

Cocos nucifera L. (Coco) - O coqueiro constitui parte importante na vida

dos habitantes de mais de 90 países tropicais. Na Ásia e na Oceania, seu cultivo

11

se confunde com a própria cultura desses povos (Harries, 1978; Phillips, 1994).

Planta típica de pequenos agricultores, o coqueiro foi introduzido no Brasil, pelos

portugueses, em 1553. Posteriormente, distribuindo-se na região litorânea do

Norte e Nordeste, onde está concentrada 92 % da produção nacional. A área

plantada e a produção nacional são relativamente pequenas quando comparadas

às dos principais países produtores (Pires et al., 1999 apud Marcilio et al., 2001).

O continente Asiático é o maior produtor mundial de coco contribuindo, em

1997, com uma produção de 39 milhões de toneladas, que representa 86 % da

produção mundial. Atualmente, estima-se que na América do Sul a produção e de

1 milhão de toneladas, da qual o Brasil participa com 640 mil toneladas. No

entanto, em termos de mercado exportador de coco verde o Brasil apresenta uma

participação pífia, menos de 1 % de sua produção. Todavia, o Brasil vem

aumentado a área plantada nos últimos anos chegando, em 1997, a

aproximadamente 260 mil hectares. No entanto, a produção brasileira representa

menos de 2 % da mundial. Um parâmetro de comparação e o Sri Lanka, último

colocado em produção no continente Asiático, tem em torno de 416 mil hectares

plantados de coco com uma colheita, em 1997, de 2 milhões de toneladas

(Arachichi, 1998; Pires et al., 1999). O mercado de coco para consumo in natura

ainda e incipiente, porém promissor. Um exemplo é a Republica Dominicana que

contribui com 48 % do coco in natura consumido nos Estados Unidos e 30 % na

União Européia. (Corral, 2001; Pires et al., 1999 apud Marcilio et al., 2001).

Nos últimos 10 anos, no Brasil, tem havido um incremento no consumo in

natura de albúmem liquido, em conseqüência tem ocorrido uma expansão da área

plantada com variedades Anãs Verde. No biênio 2000-2002, observou um

crescimento de aproximadamente 90 % da área plantada, variando de 50.000

hectares em 2000 para 90.000 hectares em 2002. Estima-se uma produção de 1

bilhão de frutos em 2005, enquanto que, em 1999 foi da ordem de 280 milhões de

frutos (Warwick, 2000; Porto, 2002). O consumo de água de coco teve um

incremento de aproximadamente 500 % entre 1997 e 2002, partindo de 125

milhões de litros por ano e atingindo a marca de 600 milhões de litros por ano

(Mello, 1997).

Em termos produtivos, o Estado do Rio de Janeiro figura com a maior

produtividade do país por hectare, com uma média de 14 toneladas por hectare.

Sendo esta uma cultura em expansão no estado (ASBRACOCO, 1996; Pires et

12

al., 1999; EMATER, 2000). De acordo com Censo Agropecuário (IBGE, 1996), o

Estado do Rio de Janeiro responde por 0,84 % e o Município de Campos dos

Goytacazes com 0,02 % da produção nacional, respectivamente. Contudo, desde

a iniciativa pioneira do Município de Quissamã, implementada no início da década

de 90, de substituição da monocultura de cana-de-açúcar pela cocoicultura, a

área plantada desta cultura tem sido expandida na região. Atualmente,

cocoicultura comercial no Município de Carapebus apresenta 80.000 plantas, em

Conceição de Macabu, 30.000 plantas. Estando em franca expansão nos

Municípios de São Francisco de Itabapoana, São João da Barra e Campos dos

Goytacazes (Miguens et al., 2003). Em 2003, a cocoicultura foi introduzida no

Projeto Frutificar, projeto de fruticultura irrigada implementado pela Federação de

Industrias do Estado do Rio de Janeiro (FIRJAN) e o Governo do Estado do Rio

de Janeiro.

O gênero Cocos é constituído de uma única espécie, Cocos nucifera L.

podendo ser dividido em três grupos: Gigantes, Anões e Híbridos (Quadro 02),

contendo um grande número de variedades, ecotipos, morfotipos e populações.

As variedades são nomeadas normalmente com sua localidade de origem. As

variedades apresentam, fecundação cruzada ou auto-fecundação; seu

crescimento é rápido e a fase vegetativa é variável podendo ser de: sete anos

para as gigantes, 4 anos para os híbridos e três anos para as anãs (Ferreira et al.,

1994; Silva, 2002). As principais variedades existentes no Brasil apresentam as

seguintes características:

Quadro 2 – Principais características botânicas e agronômicas de C. nucifera L.

Característica Gigante Anão Híbrido

Floração Tardia Precoce Intermediária

Idade de floração 5 a 7 anos 2 a 3 anos 3 a 4 anos

Vida útil (anos) 60 a 80 30 a 40 50 a 60

Tamanho do fruto Grande Pequeno Intermediário /Grande

Crescimento Rápido Lento Intermediário

Porte (Altura) 35 metros 8 a 10 metros 20 metros

Número de folhas 18 a 22 folhas 14 a 16 folhas Intermediário

Produção (frutos/ano) 60 a 80 130 a 150 120 a 150

Peso do fruto 1400 g 900 g 1200 g

13

Peso de noz 700 g 550 g 800 g

Peso do albúmem 350 g 250g 400 g

Exigência edafoclimática Rústico Muito Exigente Exigente

Destino da Produção Agroindústria

Culinária

Água Agroindústria

Culinária

Água

Fonte: Aragão et al., 2002

Coqueiro gigante – Plantas de porte alto, atingindo cerca de 35 m de altura; pouco

produtivas (60 a 80 frutos/planta/ano); inicio de produção aos sete anos após o

plantio; os frutos são utilizados pela indústria de processamento na forma de coco

ralado, leite de coco, óleo de coco, etc. O espaçamento adotado nos cultivos é de

9 x 9 m (Woodroof, 1970; Fontes et al., 1998).

Coqueiro Anão – Planta de porte baixo, atingindo até 12 m de altura, muito

produtiva (200 a 250 frutos/planta/ano); início de produção aos três anos após o

plantio, os frutos são consumidos verdes com aproximadamente sete meses de

idade (Child, 1974; Ferreira et al., 1994) em função de a água ser de excelente

qualidade. O espaçamento adotado é de 7,5 x 7,5 m com as plantas distribuídas

em triângulo, onde ocorre um melhor aproveitamento do espaço e otimização no

uso da luz (Ferreira et al., 1994; Passos, 1998; Silva, 2002).

Híbridos – Destacam-se os híbridos obtidos do cruzamento entre o coqueiro anão

(planta mãe) e o coqueiro gigante (planta polinizadora). São plantas de porte

intermediário, atingindo cerca de 20 m de altura; produzem de 120 a 150

frutos/planta/ano. Iniciam a produção aos quatro anos após o plantio, sendo os

frutos com dupla aptidão no mercado, voltada para o consumo verde (água), e na

indústria de processamento alimentar como coco seco. O espaçamento adotado

nos cultivos está situado numa posição intermediária em relação às variedades

apresentadas, com plantas dispostas triangularmente com espaçamento de 8,5 X

8,5m (Fontes et al., 1998; Silva, 2002).

Como os novos plantios com coqueiros anões e híbridos são realizados,

em sua maioria, com irrigação localizada, com a utilização do sistema de plantio

em triângulo eqüilátero, tem-se observado, em algumas situações, que os

espaçamentos indicados têm apresentado problemas de sombreamento,

possivelmente decorrentes do maior desenvolvimento das plantas. Como

conseqüência, aumentam as dificuldades relativas à consorciação com outras

14

culturas e a mecanização nas entrelinhas, comprometendo em alguns casos, a

qualidade dos frutos. A utilização de plantios em quadrado e ou retângulo,

adotando-se maiores espaçamentos, é uma alternativa que pode ser seguida por

pequenos produtores de coco, que dependem da utilização das entrelinhas para

plantio de culturas de subsistência. Nas áreas tradicionais de cultivo, como a

baixada litorânea do Nordeste do Brasil, o plantio do coqueiro-gigante é

tradicionalmente realizado em quadrado, obedecendo a um espaçamento médio

em torno de 10m de lado, o que corresponde a aproximadamente 100 plantas por

hectare. Essa baixa densidade de plantio possibilita não somente melhor

utilização das entrelinhas com a consorciação de culturas, como também permite

melhor tolerância do coqueiro a déficits hídricos (Ferreira et al., 1998; Child,1974).

O aumento da densidade de plantio do coqueiro reduz a produção por

planta, embora aumente a produção por área. A utilização de baixa densidade de

plantio, por outro lado, permite a exploração de maior volume de solo, justificando

assim a maior produção por planta. Nesse caso, o aumento da produtividade

pode ser obtido com menor quantidade de fertilizantes, por causa da menor

produção total de biomassa, reduzindo, conseqüentemente, a quantidade de

nutrientes absorvidos, os quais são direcionados para a produção de frutos

(Ohler, 1999). No caso de plantios de coqueiro-anão irrigados, destinados à

produção de água, o aumento da densidade de plantio pode refletir na redução do

tamanho do fruto, conseqüentemente, depreciando o seu valor no mercado

(Ferreira et al., 1994).

A definição do melhor espaçamento a ser adotado, deve levar em

consideração o manejo a ser utilizado, a variedade a ser cultivada, as

características da propriedade, e os objetivos do produtor. Deve-se observar, no

entanto, a tendência crescente de utilização de sistemas integrados de produção,

onde são enfatizadas a necessidade de adoção de modelos sustentáveis de

exploração, com ênfase no melhor aproveitamento dos recursos naturais, e

redução do uso de insumos químicos, visando a obtenção de frutos de melhor

qualidade e de menor custo. Neste contexto, os novos espaçamentos devem

permitir a exploração de plantas melhoradoras de solo e ou produtoras de

alimentos, onde o coqueiro deve ser considerado como parte de um sistema

sustentável de produção (Fontes et al., 1998; Fremond et al., 1975).

15

A faixa de plantio corresponde a uma área com aproximadamente 4 metros

de largura, localizada ao longo da linha de plantio do coqueiro, e que tem sido

utilizada para consorciação com fruteiras, como forma de melhorar o

aproveitamento da água fornecida aos coqueiros irrigados por micro-aspersão. A

cultura do mamoeiro tem sido uma das principais alternativas de consórcio,

quando são plantadas duas a seis plantas em fileiras duplas entre os coqueiros,

os quais são distanciados com 7,5 m. Neste consorcio alternado, aproveita-se à

existência de dois micro-aspersores originalmente dimensionados para a irrigação

do coqueiro, para irrigar os mamoeiros, fazendo-se o ajuste necessário da lâmina

de água fornecida pelo micro-aspersor, para atender os coqueiros e as culturas

consorciadas. Ao final do ciclo produtivo do mamoeiro, que é de

aproximadamente 3 anos, inicia-se a fase produtiva do coqueiro, permitindo,

assim que o produtor tenha receita desde a implantação do cultivo. O consórcio

em faixas seria no início desaconselhável em áreas que apresentam déficit hídrico

elevado e ou que não utilize irrigação, pois, nesse caso, deverá haver uma

elevação substancial da competição por água e nutrientes entre coqueiros e

plantas consorciadas. Mesmo em plantios irrigados, há necessidade de se fazer

um monitoramento dos teores de umidade do solo e do estado hídrico das plantas

para que possam ser supridas adequadamente as suas necessidades hídricas e

nutricionais (Fontes et al., 2003).

As entrelinhas são áreas situadas entre as linhas de plantio de coqueiro,

que o pequeno produtor utiliza para consorciação com outras culturas, nos anos

que antecedem o início da fase produtiva do coqueiro. Nos espaçamentos

tradicionais, o consórcio apresenta maior viabilidade, até o 3o ano da cultura,

época em que não há limitação de luminosidade. Entre 4 e 15 anos

aproximadamente e, principalmente, quando se adota o sistema de plantio em

triângulo eqüilátero, a deficiência de luz prejudica sensivelmente o

desenvolvimento das plantas consorciadas, quando se utiliza coqueiros híbridos,

os quais apresentam, além de maior vigor, uma maior disposição das folhas que

dificulta a penetração de luz. Após 20 anos, aproximadamente, o consórcio volta a

ser utilizado, embora não apresente a mesma condição favorável observada

durante a fase juvenil, uma vez que as raízes apresentam um maior

desenvolvimento, o que, por certo, aumenta a competição entre plantas. O

16

sistema de plantio em triângulo eqüilátero dificulta a utilização das entrelinhas por

causa do maior sombreamento (Fontes et al., 2003).

Na região litorânea do Nordeste do Brasil, onde é cultivado o coqueiro

gigante, a mandioca predomina entre as culturas consorciadas, em decorrência

de sua adaptação aos solos arenosos de baixa fertilidade, onde é

tradicionalmente cultivado o coqueiro. A seleção da cultura a ser consorciada

deverá ser feita considerando-se as condições de clima e solo e de mercados

locais, possibilitando assim a obtenção de maior receita por área cultivada.

Recomenda-se, no entanto, a manutenção de um coroamento de

aproximadamente 2 metros de raio, contados a partir do estipe do coqueiro, com

objetivo de reduzir a competição entre plantas. O consórcio de entrelinhas, além

de reduzir os custos de produção, diminui a competição por água e nutrientes

entre coqueiros e a vegetação nativa de cobertura. A argumentação de que este

sistema dificulta o manejo da área poderá ser contornada utilizando-se o plantio

em linhas alternadas, permitindo assim a execução dos tratos culturais sem

prejuízo das plantas consorte (Fontes et al., 2003).

Diversas culturas têm sido preconizadas para consórcio com coqueiro. O

cacau, Teobroma cacao, L., tem apresentado respostas positivas devido

principalmente a necessidade de sombreamento desta cultura, sendo os melhores

resultados obtidos em plantios em triângulo com espaçamento de 9,5 x 9,5 metros

(Osei-Bonsu et al., 2002).

Como as demais palmeiras, o coqueiro (Cocos nucifera L.) é uma planta

essencialmente tropical que encontra condições climáticas favoráveis entre as

latitudes 20oN e 20oS. Por ser uma cultura de produção contínua, a oscilação nos

fatores climáticos tem influência direta na sua produção. A temperatura média

anual deve estar em torno dos 27 oC, com variações diárias de 5 a 7 oC. As

necessidades hídricas podem ser supridas com uma pluviosidade de 1500 mm

anuais, com uma média mensal nunca inferior a 130 mm. Umidades atmosféricas

excessivamente altas ou baixas são prejudiciais à cultura, pois umidades altas

diminuem a transpiração e, conseqüentemente, a absorção de nutrientes, além de

favorecer a propagação de doenças fúngicas. Por outro lado, uma umidade de 60

% é prejudicial à planta. Portanto, a umidade ideal de cultivo será em função da

disponibilidade de água no solo e do controle de doenças fúngicas pertinentes à

região de plantio (Passos,1998; Fremond et al., 1975; Child,1974).

17

Os ventos fracos e moderados favorecem o desenvolvimento do coqueiro,

por aumentarem sua transpiração e, por sua vez, a absorção de nutrientes e água

pelas raízes. Todavia, nos locais com carência hídrica os ventos tornam-se um

agravante da seca (Passos, 1998). Deve-se ainda considerar que ventos fracos e

moderados participam, ainda que de forma incipiente, na polinização (Meléndez-

Ramírez et al., 2004).

Em relação à luminosidade, há dados na literatura reportando que, de um

modo geral, o coqueiro é uma planta exigente (Ferreira et al., 1998). No entanto, a

maioria dos autores cita as condições mínimas de germinação e desenvolvimento,

que são: insolação de 2000 horas anuais distribuídas em, no mínimo, 4horas

diárias (Passos, 1998; Fremond et al., 1975).

O coqueiro pode ser cultivado em vários tipos de solos, desde que estes

tenham boa drenagem; e, ausência de impedimentos físicos e químicos que

dificultem o crescimento do sistema radicular, até pelo menos um metro de

profundidade (Fontes et al., 1998).

Há diversos relatos sobre a origem e distribuição de C. nucifera. É

praticamente consenso que é uma planta oriunda do sudeste asiático (Harries,

1978); apesar de ter sido sugerida sua origem na América Latina (Purseglove,

1972). Existem também relatos sobre sua distribuição através de correntes

marítimas para os diferentes continentes. No entanto, a distribuição antrópica tem

sido considerada a mais provável, tanto do ponto de vista histórico como botânico

(Harries, 1978). No Brasil, foi introduzido em 1553 por Martin Affonso de Souza

na Capitânia de São Vicente, atualmente Estado de São Paulo. Desde sua

introdução até o século XX, não há dados sobre novas introduções, apesar de

sua ampla distribuição, principalmente, no litoral tropical do Brasil. No último

século, diversas introduções (Quadro 3) de variedades comerciais foram

realizadas (Ferreira et al., 1998).

18

Quadro 3

Principais introduções de variedades comerciais de C. nucifera. L no Brasil

Variedade Ano de Introdução

Indeterminada 1553

Gigante do Oeste Africano 1978/1983/1984

Gigante de Rennel 1983/1984/1986

Gigante da Polinésia 1983/1986

Gigante da Malásia 1983/1984/1986

Gigante de Rotuma 1983

Gigante de Tonga 1983/1984

Gigante de Vanuatu 1984/1986

Typica [Gigante] Não determinado

Anão Verde 1925 e 1939

Anão Amarelo 1938

Anão Vermelho 1939

Anão Amarelo da Malásia 1978/1982

Anão Vermelho dos Camarões 1978/1982

Nana [Anão] Não determinado

Fonte: Ferreira et al., 1994; EMBRAPA, 2004.

Híbridos de diversas variedades têm sido selecionados no país visando

atender o mercado de albúmem sólido, líquido ou ambos (Quadro 4). Usualmente,

o coqueiro híbrido é produzido por polinização cruzada artificial utilizando-se

pólen das variedades gigante em variedades anãs. Os fenótipos, dentre os

híbridos, são freqüentemente de fácil distinção em relação à geração parental. As

inflorescências apresentam um número de flores inferior ao das variedades anãs

e superior ao das variedades gigantes; e, é comum não haver coincidência

temporal entre a abertura das flores masculinas e a receptividade das flores

femininas. Coqueiros híbridos não devem ser fontes de sementes porque a

segunda geração não permite previsibilidade devido à segregação. (Mendonça,

2002).

19

Quadro 4 – Exemplos de coqueiros híbridos obtidos n o Brasil

Cruzamentos artificiais Híbridos

Variedade Gigante Variedade Anã

Typica Nana Anão verde [EMBRAPA]

Do Oeste Africano Amarelo da Malásia Super coco [SOCOCO]

Do Brasil da Praia do Forte Verde do Brasil do Jequi Bebedouro [GBrPFx AveBrJ]

Do Oeste Africano Vermelho de Camarões PB 111 [SOCOCO]

De Rennel Vermelho de Camarões PB 113 [SOCOCO]

Fonte: Ferreira et al., 1994; Neto et al., 2003; Aragão, 2004; SOCÔCO, 2004; EMBRAPA, 2004.

O coqueiro é uma planta arbórea, caule tipo estipe, não ramificado, com

gema terminal única (Ferri, 1973); folha tipo penada, constituída pelo pecíolo que

se continua pela ráquis onde se prendem os folíolos (Menon e Pandalai, 1958;

Ferreira et al.,1994); inflorescências paniculadas apresentando pedúnculo,

espigas e flores, monóicas e axilares protegidas por bráctea denominada espata;

fruto do tipo drupa; sistema radicular fasciculado.

As folhas de C. nucifera são do tipo palmada, constituída por pecíolo ou

ráquis foliar, com bainha circundando aproximadamente 90% do perímetro do

caule tipo estipe e folíolos com venação do tipo paralelinérvea. O número de

folhas varia de acordo com as variedades. Plantas gigantes apresentam na

maturidade de 18 a 22 folhas enquanto que as variedades anãs apresentam de

14 a 16 folhas (Tomlinson, 1961; Waters, 1978). Sua classificação botânica é:

Reino: Plantae

Sub-reino: Tracheobionta

Super-divisão: Spermatothyta

Divisão: Magnoliophyta

Classe: Liliopsida

Ordem: Arecales

Família: Arecaceae

Subfamília: Arecoideae

Gênero: Cocos

Espécie: Cocos nucifera, L.

Elaeis guineensis, Jacq. (dendê) - O interesse pela cultura do dendê

deve-se ao aproveitamento do óleo extraído de seus frutos, chegando-se ao

20

rendimento de 20 % de óleo extraído do mesocarpo e 5 % extraído da noz. Na

Europa, o uso do óleo de dendê data de 1590, na produção de sabão; enquanto

que, no Brasil o uso do óleo de dendê destina-se, fundamentalmente, a culinária e

a indústria cosmética (Henderson & Osborne, 2000). A produção de óleo de

dendê acena com uma potencialidade pouco explorada e com perspectivas

animadoras de expansão da cultura não só no Brasil, mas em toda região tropical.

O cultivo da espécie pode ser implementado, e consiste na utilização desse óleo

para obtenção de biodiesel, um combustível menos poluente (Wooley, 2001). O

interesse de óleos vegetais como o de dendê, parte do princípio que os ésteres

de óleos vegetais a partir de processos catalíticos específicos, possibilita a

obtenção de óleo combustível, que pode ser adicionado ao diesel ou ainda

substitui-lo na alimentação de veículos automotores propelidos por tal

combustível. Pesquisas em todo o mundo vêm despontando devido à

necessidade de se desenvolver sistemas produtivos auto-sustentáveis e com

balanço reduzido de emissões para a atmosfera.

A avaliação do comportamento dos preços dos óleos vegetais nos últimos

30 anos demonstra que, na média, os preços têm tido um declínio anual de 3 %,

em dólares deflacionados, enquanto que o preço do petróleo tem crescimento

constante ao longo do período. Recentemente, o governo federal criou o

Programa Brasileiro de Biocombustíveis – Rede Nacional de Biodiesel, sob a

coordenação do Ministério da Ciência e Tecnologia, onde se insere o Programa

Probioamazon – dendê. Este programa objetiva, através de grupos técnicos,

multi-institucionais e multidisciplinares, definir especificação técnica, garantir a

qualidade do biocombustível e seus aspectos legais, assegurar viabilidade e

competitividade técnica e social, ambiental e econômica. Para a Amazônia, foi

priorizada a cultura do dendezeiro como fonte geradora de matéria-prima para o

desenvolvimento do Programa Biodiesel (ANP, 2004).

O Brasil tem uma área plantada com dendê em torno de 82.000 hectares

distribuídos entre o Norte e o Nordeste do país com uma produção de 167

milhões de toneladas de frutos (IBGE, 2000). Os estados da região Sudeste, Sul e

Centro-Oeste não aparecem nas estatísticas. Porém de uma maneira bastante

comum são observadas plantas de dendê espalhadas em zonas de pecuária da

região sudeste, possivelmente uma herança da presença de escravos nessas

regiões. Na Região Norte Fluminense tal panorama não é diferente, pois

21

dendezeiros espaçados são rotineiramente encontrados em seus pastos

(Magalhães et al., 2001).

Em relação à diversidade genética, existem várias espécies que permitem

o cruzamento interespecífico. Elaeis guineensis vêm tendo seus índices produção

reduzidos ao longo das últimas décadas em função de pragas e doenças. A

possibilidade de obtenção de híbridos produtivos e resistentes é viável. Híbridos

de Elaeis guineensis Jacq. e Elaeis olerifera Kunth têm sido obtidos com sucesso

quanto a resistência a determinadas pragas e doenças. Sabe-se que a espécie E.

olerifera possui ecotipos no Brasil, Guiana Francesa, Suriname, Peru e Norte da

Colômbia, onde estudos genéticos revelaram uma forte diversidade genética entre

os grupos e a possibilidade de aumento da diversidade entre eles (Barcelos et al.,

2002).

O dendezeiro também é conhecido como “palma-de-guiné”, “dendem”

(Angola), “palmeira dendem”, e “coqueiro-de-dendê” e seu fruto é conhecido como

dendê. Apresenta-se como uma palmeira com até 15 metros de altura, com raízes

fasciculadas, estipe ereto, escuro, sem ramificações e anelado, devido a

cicatrizes deixadas por folhas antigas. As folhas compostas podem alcançar até

10 metros de comprimento com folíolos atingindo 60 centímetros, as ráquis tem

as bases recobertas por espinhos. As inflorescências têm flores femininas e

masculinas intercaladas, de cor creme-amareladas, formando cachos. Frutos do

tipo noz pequenas e duras, com formato ovóide - angulosos e alongados,

possuem mesocarpo ou polpa fibrosa que envolve o endocarpo pétreo; nascem

negros e quando estão maduros alcançam cor que varia do amarelo forte ao

vermelho rosado passando por matizes de cor alaranjada e ferrugem. Os frutos

por estarem dispostos em cachos podem, por abundância, acabar comprimindo-

se e deformando-se. A polpa produz o óleo de dendê - óleo de palma, palm oil ou

Palmenol, a cor amarela ou avermelhada é devido à presença de carotenóides

apresentam sabor adocicado e cheiro peculiar. A semente ocupa totalmente a

cavidade do fruto e contém o óleo de palmiste (palm kernel oil) que é

esbranquiçado e quase sem cheiro e sabor (Henderson, 1988; McCurrach, 1976).

No gênero Elaeis existem mais três espécies de interesse comercial: Elaeis

melanococca Gaertner e Elaeis olerifera Kunth, ambas nativas da América Latina

encontradas no Brasil e conhecidas como caiaué. Estas vêm sendo usadas na

22

obtenção de híbridos com a Elaeis guineensis visando maior resistência

fitossanitária.

Os frutos de Elaeis guineensis, de acordo com a espessura do endocarpo,

são classificados nos seguintes tipos: Macrocaria - possui frutos com endocarpo

com espessura acima de 6 milímetros, sem importância econômica; Dura - fruto

com endocarpo de espessura entre 2 a 6 milímetros, com fibras dispersas na

polpa. Usado como planta feminina na produção de híbridos comerciais; Psífera -

frutos sem endocarpo separando polpa da amêndoa. Usada como fornecedora de

pólen na produção de híbridos comerciais. A obtenção de híbridos é realizada

pelo cruzamento de ecotipos dentro da espécie Elaeis guineensis, e o mais

comum é o Tenera: híbrido do cruzamento Psífera com Dura; tem endocarpo com

espessura entre 0,5 a 2,5 milímetros com anel de fibras ao redor. Suas sementes

são recomendadas para plantios comerciais. Têm vida econômica de até 30 anos,

produzindo anualmente 10 a 12 cachos por planta portando 1.000 a 3.000 frutos.

O peso individual dos cachos varia de 20 a 30 kg. Este híbrido é bom produtor de

inflorescências femininas (SEAGRI, 1999; EMBRAPA/SPI, 1995).

Sua classificação botânica é:

Reino: Plantae

Sub-reino: Tracheobionta

Super-divisão: Spermatothyta

Divisão: Magnoliophyta

Classe: Liliopsida

Ordem: Arecales

Família: Arecaceae

Subfamília: Arecoideae

Gênero: Elaeis

Espécie: Elais guineensis Jacq

Amostragem agronômica

Estima-se que em florestas tropicais cerca de 27.000 espécimes, da

totalidade de organismos, são perdidos por ano (Wilson, 1993). Essa situação é

mil vezes superior a condições naturais e bem próximas de extinções de eras

23

geológicas, como as do Período Cretáceo. Todavia, modificações e extinção de

biomas em extinção foram avaliadas por Constanzza e colaboradores (1997),

onde os mesmos calcularam o valor de 17 ecossistemas, incluindo a produção de

alimentos para 16 biomas. O valor estimado, somente quanto a produção de

alimentos, foi da ordem de 1386 x 10 9 dólares por ano. No contexto da

fitopatologia, o conhecimento de novas espécies de patógenos submete-se, muita

das vezes, ação de fitopatologistas amadores, que suportam e encorajam a

descrição de novos patógenos, tornando-se uma poderosa fonte de pesquisas

(Blackwell et al., 1997 ; Ingram, 1999). Fitopatógenos desempenham um papel

inequívoco na dinâmica das populações de hospedeiros e no ecossistema que

eles habitam (Burdon & Tompson, 1995; Clarke, 1996; Rodriguez & Redman,

1997; Ingram, 1999). Doenças de plantas têm sua importância acentuada em

situações quando se compara patógenos em ambientes silvestres em relação aos

que já estão inseridos em agro-ecossistemas. A situação é clara, pois existiu uma

coevolução patógeno hospedeiro desde os centros de origem (Dinoor & Eshed,

1990).

Nesse contexto, a teoria da epidemiologia se confunde ou se supre com

modelos experimentais, no qual o conceito de empirismo e metodologia cientifica

participam como atributos pertinentes (Jeger, 2000). Por outro lado, Waggoner e

Aylor (2000) comparam o avanço da epidemiologia com o aumento no

entendimento de modelos de doenças de plantas. E, a necessidade de

embasamento matemático não é considerado elemento fundamental para

suportá-la. Um ponto relacionado à amostragem epidemiológica concerne à

relação C/N. Plantas que não são susceptíveis a certos patógenos ou herbívoros

não envolveriam mecanismos de defesa, como metabólitos secundários, a

expensas da relação C/N, o que inviabilizaria correlações desta relação com a

suscetibilidade de espécies de plantas a doenças. O custo energético com

metabólitos secundários ocorre em detrimento ao investimento da planta no

desenvolvimento e produção (Jeger, 2000).

Os estudos epidemiológicos em doenças de plantas e sua dinâmica

tiveram um grande avanço com van der Plank (1965), elaborado por analogias a

estudos epidemiológicos entre humanos e animais. A partir desses parâmetros,

um modelo matemático baseado numa equação diferencial, que reconhecia

especificamente a doença, é categorizada em três componentes que

24

enumeramos a seguir - a latência da infecção - a infecção ainda não ocorreu; a

infecção e a pós-infecção, em que ocorreu a remoção do patógeno. A equação

possui três chaves de parâmetros epidemiológicos: uma razão de infecção

baseado no tecido infectado, e na duração do período latente e infeccioso.

Baseado nessa equação é possível atribuir valores numéricos e predizer onde a

epidemia irá ocorrer, a sua razão de crescimento e o tamanho da epidemia. Um

sistema de quatro equações foi montado, que recebeu o nome de SEIR, onde S =

suscetível, E = exposição (equivale a período de latência), I = infecção e R =

remoção ou pós-infecção (Jeger, 1986; Jeger, 1987; Jeger e Van den Bosch,

1994). Em termos históricos, modelagens em epidemiologia são normalmente

aplicadas a patógenos foliares; modelagens com patógenos de solo e viroses

tornam-se mais difíceis pela dificuldade de identificação dos parâmetros e

conseqüentemente amostragem dos mesmos (Jeger, 2000).

A teoria da amostragem consiste no estudo das relações existentes entre

uma população e as amostras dela extraída. Uma boa amostragem tem como

objetivo principal deduzir informações relativas a uma população e o grau de

segurança das informações obtidas que será maior quando a amostra se

aproximar da população (Spiegel, 1993). Um dos maiores problemas é a

determinação prévia do tamanho da amostra ou o número de repetições.

Numerosas soluções já foram propostas, mas nenhuma é inteiramente

satisfatória. Na experimentação agrícola ou zootécnica a experiência indica que

dificilmente se conseguem resultados razoáveis com ensaios que tenham menos

de 20 parcelas, sendo este número deve ser tomado como mínimo (Pimentel,

1990). Quanto maior o número de amostras de uma população melhor. Por outro

lado, esta situação nem sempre é aplicável por isso amostras ao acaso

representam a melhor alternativa, onde todos os indivíduos desta população terão

a mesma chance de serem selecionados para compor a amostra. Todavia, a idéia

de amostras ao acaso será tendenciosa, quando a ocorrência de um grupo for

regida por um mesmo fator. Este grupo não irá representar a população que é

influenciada por vários outros fatores e composta de vários outros grupos. Por

isso a necessidade de se estratificar a população para que as amostras partam

dos vários grupos que a compõem tornando o quesito ao acaso menos

importante. Uma questão interessante parte do princípio que uma população seja

influenciada por um único fator como o universo de doenças a que uma lavoura é

25

susceptível no campo, seja ao acaso ou não, pois sabe-se que todos os

indivíduos que pertencem a essa população terão condições iguais de sucumbir à

doença (Pimentel, 1990). Tem sido apontado que o erro experimental irá diminuir

quando o tamanho da amostra se aproximar ao da população, porém como

observações pontuais da população irão demonstrar uma situação momentânea,

fatores esporádicos e repentinos poderão ou não ser representados naquela

amostra (Cochran & Cox, 1978). Uma situação de campo poderá estar sendo

influenciada por uma série de fatores como regime hídrico ou uma condição de

desequilíbrio momentâneo.

Um panorama das propriedades rurais do Norte Fluminense (Quadro 5),

relatando o número de estabelecimentos e suas dimensões, apresentado pelo

Centro de Informação e Dados do Estado do Rio de Janeiro, refere-se a dados do

último Censo Agropecuário realizado pelo Instituto Brasileiro de Geografia e

Estatística de 1996, estando, portanto, relativamente defasados.

Quadro 5

Distribuição de propriedades rurais na região norte do Estado do Rio de Janeiro.

< de 10 ha 10 ha a < de 100 ha 100 ha a < de 1 000 ha 1 000 ha e > Regiões de Governo

e municípios

Total

N° Área (ha) N° Área (ha) N° Área (ha) N° Área (ha)

Norte Fluminense 15 028 8 316 29 952 5 393 183 830 1 248 335 521 68 113 894

Campos dos Goytacazes 7 114 4 290 14 218 2 276 78 344 512 142 264 33 54 215

Cardoso Moreira 564 213 1 019 290 9 038 60 15 684 1 1 316

Conceição de Macabu 223 43 271 120 5 166 59 14 216 1 2 420

Macaé 973 204 1 576 541 20 334 213 61 584 15 27 265

Quissamã 317 107 511 123 5 148 79 23 285 8 11 737

São Fidélis 2 323 1 108 4 809 1 077 33 089 135 32 492 3 4 189

São João da Barra 3 514 2 351 7 548 966 32 711 190 45 996 7 12 752

Fonte: IBGE: 1996/CIDE 2002

Dados relativos a cocoicultura (Quadro 6) nos municípios do norte

fluminense, fornecidos pela Empresa de Assistência Técnica e Extensão Rural –

EMATER/RIO, são relativamente recentes, datando de 2002.

26

Quadro 6

Dados agronômicos da cocoicultura na Região Norte F luminense

Município Área Colhida (ha) Produção (ton) Produtividade (ton/ha)

Campos dos Goytacazes 143,5 3513 24,4

Cardoso Moreira ND ND ND

Conceição de Macabu 21,0 171 8,1

Carapebus 355,0 8875 25,0

Macaé 2,7 75 27,7

Quissamã 520,0 16900 32,5

São Fidélis ND ND ND

São Francisco de Itabapoana 300,0 9600 32,0

São João da Barra 32,0 1130 35,3

ND= não detectado (Fonte: EMATER-Rio, 2002)

Murchas Permanentes ou Irreversíveis

Uma planta é dita murcha permanentemente, quando o potencial hídrico da

raiz e parte aérea é tão negativo, que a manutenção da coluna d’água no interior

dos elementos de vaso do xilema não acontece e a planta entra em estado de

murcha permanente. Tal quadro é desencadeado pela ação de patógenos ou

estresse hídrico acentuado. No primeiro caso a presença do patógeno provoca

uma alteração do potencial hídrico, da raiz e da parte aérea, enquanto que o

potencial hídrico do solo é preservado. Por outro lado uma murcha permanente

gerada por estresse hídrico ou seca acarreta uma alteração do potencial hídrico

do solo, comprometendo por sua vez os potenciais hídricos da planta. Nas duas

situações planta entra em estado de murcha permanente, onde o

restabelecimento da água do solo ou dos potenciais hídricos da planta, não

possibilita a reestruturação da coluna de água no interior dos elementos de vaso

do xilema, bem como o trafego de fotossintetatos no interior dos elementos de

tubo crivado do floema (Agrios, 1997; Lucas, 1998; Reichardt, 1995; Mepsted et

al., 1995). As perdas provocadas por doenças limitam a produtividade agrícola, e

as epidemias podem ter conseqüências devastadoras. Muitas das doenças que

ocorrem em vegetais envolvem interações especializadas entre o patógeno e a

planta hospedeira (Lamb, 1996). O conceito de doença em vegetais é

relativamente controverso. No entanto, tem sido aceito que uma planta é saudável

27

ou normal quando desempenha suas funções fisiológicas em concordância com o

melhor de seu potencial genético: suas células meristemáticas ou cambiais

dividem-se e diferenciam-se como necessário e geneticamente programado; e,

seus diferentes tipos de células especializadas absorvem água e nutrientes do

solo; translocam estas substâncias através da planta; realizam fotossíntese;

translocam, metabolizam ou estocam os produtos fotossintetizados; produzem

sementes ou outros órgãos reprodutivos para sobrevivência e multiplicação. Por

outro lado, quando há qualquer interferência por microorganismos ou fatores

ambientais na capacidade das células ou tecidos da planta ou parte da planta em

realizar uma ou mais destas ações, a planta é dita doente (Agrios, 1997).

Freqüentemente, encontra-se na literatura a distinção entre doença, causada por

um agente infeccioso (biótico), e desordens devidas a agentes não infecciosos

(abióticos) tais como deficiência mineral, poluentes químicos ou fatores climáticos

adversos (Lucas, 1998).

Doenças infecciosas são aquelas que resultam da infecção da planta por

um patógeno. Estas doenças são caracterizadas pela capacidade do patógeno

crescer e se multiplicar rapidamente nas plantas doentes e também pela sua

habilidade de ser transmitido a plantas saudáveis, causando-lhes a mesma

doença. Contudo, quando um organismo vive em um hospedeiro e obtém deste

seu nutriente é denominado parasita. Parasitismo refere-se às relações entre o

parasita e seu hospedeiro. Por outro lado, patogenicidade pode ser definida como

a habilidade do patógeno interferir em uma ou mais funções essenciais da planta

hospedeira (Agrios, 1997).

Muitos animais que exploram plantas são denominados pragas ou pestes.

Estes causam danos a raízes, folhas, brotos, flores e frutos. Usualmente estas

pragas, que incluem insetos, sugadores e mastigadores, e outros animais,

permanecem tempos relativamente curtos em uma planta e posteriormente

migram para explorar uma nova fonte de alimento. Contribuindo assim

decisivamente para a dispersão de parasitas e patógenos (Lucas, 1998).

Murcha de Fitoplasma

Doenças relacionadas ao amarelecimento de plantas são conhecidas

desde 1902 (Kunkel, 1926). Posteriormente, tais enfermidades passariam a ter

28

suas etiologias associadas a vírus. Em 1967, Doi e colaboradores observaram em

seções ultrafinas do floema de plantas afetadas por amarelecimento a presença

de partículas pleomórficas, circundadas por uma única membrana semelhante a

micoplasmas humanos. Tais organismos tinham a peculiaridade de serem

sensíveis à tetraciclina. A partir desta descoberta foi empregada a denominação

“organismos semelhantes a micoplasma” (OSMs) (McCoy et al., 1989; Lee &

Davis, 1992). Em 1994, a denominação fitoplasma – Phytoplasma - foi proposta,

no 10o Congresso Internacional da Organização de Micoplasmologia. Essa

denominação passaria então a ser adotada para organismos, relacionados ao

amarelecimento em plantas (Int. Comm. Syst. Bacteriol. Subcomm.Taxon.

Mollicutes, 1993, 1997). A contaminação de plantas sadias ocorre através da

saliva de insetos picadores sugadores contaminados com fitoplasmas. Diferente

de micoplasmas humano e animal, o cultivo axênico de fitoplasmas não tem

alcançado êxito. A classificação e identificação de tais patógenos está relacionada

à sintomatologia, ao hospedeiro, e a presença de insetos vetores (Chiykowski &

Sinhá, 1989; Chiykowski, 1991; Errampalli et al., 1991).

Recentemente, a imunocitoquímica tem fornecido ferramentas para

identificação e classificação precisa desses organismos, onde destacamos o uso

de anticorpos mono e policlonais (Chen, et al., 1992; Lee e Davis, 1992, Loi et al.,

2002). Em relação à biologia molecular, a seqüência altamente conservada do

gene 16sRNA e a presença de proteínas ribossomais forneceram subsídio para o

estudo da filogenia destes patógenos, posicionando tais organismos na classe

dos Molicutes (Lim & Sears, 1989; Kuske & Kirkpatrick, 1992; Namba, et al.,1993

Gundersen et al., 1994; Kirkpatrick, et al., 1990; Kirkpatrick, et al., 1994). A

morfometria revela patógenos com diâmetros variando de 200 a 800nm (Lee &

Davis, 1992). Todavia, apresentam acentuado pleomorfismo variando desde

estruturas esféricas a filamentosas, identificadas por microscopia óptica e

microscopia eletrônica (Haggis & Sinhá, 1978; Waters & Osborne, 1978; Lee &

Davis, 1983; Kitagima, 1994).

A sintomatologia de plantas susceptíveis a fitoplasma exibe desordens

relacionadas ao balanço hormonal sendo desencadeada uma série de sinais, tais

como: perda de pigmentação floral, desenvolvimento de flores em limbo foliar,

hiperbrotamento e auteração nas dimensões de entre-nós (McCoy et al., 1989;

Chang & Lee, 1995; Chang, 1998, Martinez et al., 2000). Perdas de produtividade,

29

amarelecimentos, ausência de sazonalidade e “die back” podem ocorrer

culminando, em sua quase totalidade, com a morte da planta. A extensão de

sinais, sintomas e severidade da infecção variam de acordo com a interação

fitoplasma/planta (Lee et al., 2000).

Anatomicamente, a infecção por fitoplasma pode acarretar necrose do

floema, relacionada inicialmente com a multiplicação excessiva do patógeno nos

feixes condutores (Lee et al., 2000). A disseminação destes patógenos, ocorre

fundamentalmente através de insetos picadores sugadores, destacando os

membros da família CICADELIDAE e FULGORIDAE (Banttari & Zeyen, 1979;

Brc´ak, 1979; Grylls, 1979; Tsai, 1979; Nielson, 1979). Todavia, pode se propagar

vegetativamente, por meio de estacas de plantas infectadas. Estruturas

vegetativas como bulbos e rizomas também se constituem como elementos

disseminadores de phytoplasma. Todavia, a transmissão mecânica não tem sido

descrita (Lee & Davis, 1992; Lee et al., 2000).

As perdas provocadas por fitoplasmas podem afetar as mais variadas

culturas da agricultura moderna, abrangendo policulturas como cultivo de

ornamentais, fruticultura e monoculturas extensivas. Há relatos de infecções por

estes patógenos nas regiões tropicais e temperadas, ocorrendo no continente

americano, europeu, asiático e na Oceania (Lee et al., 2000).

Desde a descoberta deste patógeno, o cultivo axênico tem falhado,

dificultando a taxonomia pelos métodos tradicionais de cultura de procariotos (Lee

et al., 2000). Woese e colaboradores (1980, 1987) classificaram esses

organismos como descendentes de linhagens de bactérias gram-positivas. Além

disto, Weisburg e colaboradores (1989) analisando seqüências 16S rRNA

corroboraram situando esses patógenos como bactérias gram-positivas,

descendentes de bactérias semelhantes a Clostridium, ancestrais de uma

linhagem de lactobacillus, onde seu genoma apresentava uma baixa quantidade

de guanina e mais citosina. Filogeneticamente os micoplasmas são divididos em

quatro grupos Mycoplasma hominis, M. pneumoniae, Spiroplasma, and

Anaeroplasma. O grupo dos Anaeroplasma divide-se em duas ordens:

Anaeroplasmatales e Acholeplasmatales, onde estão situados os “organismos

semelhantes a micoplasma” (OSMs) do gênero Acholeplasma, posicionado no

grupo dos Anaeroplasmas. O gênero Phytoplasma também pode ser substituído

pelo Acholeplasma.

30

Phytoplasma palmae (=Acholeplasma palmae) infesta o coqueiro e outras

plantas da família Arecaceae. O amarelecimento letal foi primeiro detectado na

Jamaica em 1872, em mais de trinta tipos de palmeiras. O primeiro relato de

infecções de cultivos comerciais por P. palmae foi inicialmente descrito em dendê,

na região noroeste da Amazônia, em San Martin, Peru. É uma doença recorrente

na América Latina e Caribe, tendo sido detectada, em 1974 no Equador; na

Colômbia, em 1988; além da Flórida, USA e sul da França (Kitajima, 1994; Lee et

al., 2000; Morales et al., 2002). Genericamente, a doença é denominada

Amarelecimento Letal e tem sido reportada no Brasil em Rondônia (Rudgard,

1987). As denominações, “Ringspot disease”, “Bud mottle” (Harrison e Jones,

2003), “Lethal disease” (Mpunami et al., 2000) e “Cape St Paul wilt disease” (Okai

et al., 2004) referem-se a murchas irreversíveis de plantas da família Arecaceae

que têm como agente etiológico P. palmae.

Os principais sintomas são queda prematura dos frutos que apresentam

aspecto necrosado na região de inserção do fruto no cacho, inflorescências com

extremidade necrosada e folhas amareladas no sentido ápice-base. Usualmente,

há morte do meristema apical do caule em estágios terminais da doença. A morte

da planta ocorre aproximadamente com 3 a 5 meses ao aparecimento dos

primeiros sintomas. Esta sintomatologia tem sido relacionada a mudanças

fisiológicas observadas em plantas doentes (Jones, 1997).

Há uma redução da condutividade estomática, atividade fotossintética e

respiração radicular, sendo observada também uma redução no acúmulo de

açúcares na região radicular. Desta forma, ocorre um aumento da concentração

de açúcares nas folhas. Tal aspecto sugere uma inibição do transporte de

açúcares no floema, conduzindo ao estresse de tecidos saudáveis e,

conseqüentemente, o desenvolvimento dos sintomas visuais (Maust et al., 2003).

Em mamoeiros, Carica papaya, que apresentam Amarelecimento Letal há

alterações no mecanismo de fechamento dos estômatos que têm sido

relacionadas com níveis de ácido abscíssico (Guthrie et al., 2001). Indícios

apontam para a produção de compostos tóxicos por parte do fitoplasma e ou pela

planta em resposta a presença do mesmo. Esses compostos estariam associados

aos sintomas de necrose do floema, amarelecimento foliar e queda prematura dos

frutos.

31

A microscopia tem sido uma das ferramentas no estudo da interação

fitoplasma/planta (Lee et al., 2000). A presença de fitoplasma no interior dos

elementos de tubo crivado tem sido associada a alterações de parede celular em

berinjela, Solanum melongena L., e em Catharanthus roseus (Siddique et al.,

2001). Em três diferentes cultivares de rosas, alterações morfológicas das flores

têm sido relacionadas à infecção por fitoplasma e conseqüente alterações das

paredes celulares de pétalas e sépalas (Kaminska et al., 2001a). Em Magnolia

spp., a presença de fitoplasma tem sido relacionada a alterações de parede

celular e a presença de vesículas no interior dos elementos do floema (Kaminska

et al., 2001b). A microscopia eletrônica de varredura tem sido utilizada como

ferramenta de diagnóstico e científica no estudo da interação Phytoplasma/Carica

papaya, L., revelando estruturas esféricas, com diâmetro variando entre 400-1600

nanômetros, no interior de elementos de tubo crivado (Poghosyan et al., 2004).

Em Acacia, Robinia pseudoacacia L., têm sido detectadas estruturas

paracristalinas nas células companheiras do floema de plantas infectadas que

apresentam uma proliferação anormal de ramos e folhas (Chapman et al., 2001).

Tem sido sugerida a secreção de toxinas pelos fitoplasmas. Estas

substâncias seriam produzidas na região dos elementos de tubo crivado de menor

calibre e altamente infectados; e, translocadas para os elementos do floema de

maior calibre originando o quadro sintomatológico (Guthrie et al., 2001).

Na cocoicultura, as variedades gigantes apresentam sintomatologia

agravada quando comparada às variedades anãs. Nas primeiras ocorre um

bronzeamento exacerbado das folhas, associado a um atrofiamento das

inflorescências, que não chegam emergir da espata (Mariano,1997). Experiências

no México tem demonstrado que a variedade Anão Amarelo da Malásia é a

variedade que apresentou as menores perdas por amarelecimento letal, inferior a

6 %, indicando o seu uso em programas de melhoramento genético (Zizumbo-

Villarreal & Colunga-GarciaMarin, 2001).

Amarelecimento letal em plantas da família Arecaceae tem sua

transmissão associada a um inseto com aparelho bucal picador sugador, espécies

de cigarrinhas aceitas como potencias vetores. Epidemias de amarelecimento

letal no México, Flórida e Caribe estão associadas ao inseto Myndus crudus

(Cixidae) (Eden-Green, 1978; Eden-Green & Schuiling, 1978; Howard et al., 1983;

Mariano,1997). Esses insetos ovopositam e se desenvolvem em cobertura morta

32

e resíduos, oriundos da limpeza das plantas. Portanto, a remoção do material

decomposto, próximo aos plantios, reduzem a possibilidade de desenvolvimento

de ninfas e potenciais insetos adultos (Howard & Oropeza, 1998). Miguens e

colaboradoes (2004) coletaram coqueiros em São João da Barra, norte do Estado

do Rio de Janeiro, apresentando sintomatologia de murcha permanente sendo

conduzidos para diagnóstico. Murcha-de-Phytomonas e anel-vermelho foram

plausibilidades eliminadas em analises, por microscopia óptica de fase, de

extratos frescos das plantas. A microscopia eletrônica de transmissão e de

varredura revelou, em extratos e em amostras de bainhas foliares, inflorescências

e meristema apical do estipe, organismos esféricos e pleomórficos no interior dos

elementos de tubo crivado. Tais estruturas se apresentavam compatíveis com P.

palmae e as plantas, exibiam sintomatologia de Amarelecimento Letal.

Murcha de Phytomonas

Murcha de Phytomonas, “murcha-fatal” ou “hartrot” - palavra de origem

holandesa equivalente a “heart rot” em inglês – é uma murcha permanente ou

irreversível que tem como agente etiológico Phytomonas staheli infectando os

elementos de tubo crivado do floema (Dollet et al., 1977, Camargo, 1999). Doença

similar em dendezeiros é denominada “Marchitez sorpressiva” (Parthasarathy et

al., 1976).

O nome Phytomonas foi proposto por Donovan em 1909, para os

tripanosomatídeos encontrados por Lafont, naquele mesmo ano, no látex de

Euphorbia pilulifera, (Euphorbiacea) sendo que, a especificidade do hospedeiro foi

a base para o estabelecimento deste novo gênero. Recentemente, os

tripanosomatídeos integrantes do gênero Phytomonas têm sido definidos como

parasitas promastigotas que não possuem a enzima arginase, não apresentam

forma opistomastigota, não apresentam forma cística, e com ciclo evolutivo

envolvendo plantas e insetos (Camargo et al., 1987; Wallace et al., 1992).

Algumas espécies destes tripanosomatídeos são, atualmente, aceitos como

patógenos vegetais (Agrios, 1997, Lucas, 1998).

Diversas espécies de Phytomonas (Quadro – 7) são descritas na literatura

apesar da controversa classificação dos tripanosomatídeos em geral e do gênero

Phytomonas em particular (Wallace et al., 1992). Recentemente, surge uma

subdivisão do gênero Phytomonas considerando o órgão ou tecido vegetal

33

infectado. Parasitos laticicolas, ocorrem nos sistemas laticiferos; floemicolas,

parasitam os elementos de tubo crivado do floema; floricolas, isolados da flores

de Cucurbitaceae; e, fruticolas, quando presentes em frutos (Camargo, 1999).

Quadro – 7

Principais espécies do gênero Phytomonas

Espécie Hospedeiro Família [do hospedeiro]

Phytomonas davidi Euphorbia pilulifera Euphorbiaceae (Wallace et

al., 1992)

Phytomonas davidi Chamesyce thymipholia Euphorbiaceae (Wallace et

al., 1992)

Phytomonas francai Manihot esculenta Euphorbiaceae (Wallace et

al., 1992)

Phytomonas tirucalli Euphorbia tirucalli Euphorbiaceae (Camargo,

1999)

Phytomonas elmassiani Araujia angustifolia Asclepiadaceae (Wallace et

al., 1992)

Phytomonas bordasi Morrenia odorata Asclepiadaceae (Camargo,

1999)

Phytomonas ficuum Ficus edulis Urticaceae (Camargo, 1999)

Phytomonas ganorae Ficus hochstetteri Urticaceae (Wallace et al.,

1992)

Phytomonas bancrofti Ficus opposita Urticaceae (Wallace et al.,

1992)

Phytomonas tortuosa Ficus costarricana Urticaceae (Wallace et al.,

1992)

Phytomonas leptovasorum Coffea liberica Rubiaceae (Wallace et al.,

1992)

Phytomonas staheli Cocos nucifera,

Elaeis guineensis,

Attalea funifera

Arecaceae (Palmae)

(Wallace et al., 1992 ; Camargo,

1999)

Phytomonas serpens Lycopersicum esculentum Solanaceae (Camargo, 1999)

Uma questão ainda em aberto refere-se a patogenicidade de protozoários

do gênero Phytomonas às plantas. No caso da necrose do floema do café,

causada por P. leptovasorum (Stahel, 1931), do chochamento das raízes do aipim

ou mandioca, causada por P. françai (Kitajima et al., 1986), da “Marchitez

sorpresiva” do dendê, causada por P. staheli (Dollet et al., 1977) e da murcha fatal

ou Hartrot do coqueiro, causada também por P. staheli (Parthasarathy et al.,

34

1976) está praticamente estabelecida a patogenicidade destes tripanosomatídeos

(Vickerman & Dollet, 1992). No entanto, restam dúvidas quanto a este aspecto em

relação às plantas da família Euphorbiacea e Asclepiadacea (Dollet et al., l993).

Em Chamaesyce thymifolia (Euphorbiacea), apesar da freqüência que se

encontra Phytomonas em seu sistema laticífero, aparentemente não há doença

estabelecida (Da Cunha, 1993). Por outro lado, Phytomonas sp. isolados de

Euphorbia characias possuem enzimas capazes de digerir celulose e pectinas

(Vickerman & Dollet, 1992). Uma descrição sucinta das doenças citadas acima

permitirá uma melhor compreensão do problema.

A murcha do café foi mencionada pela primeira vez em 1906, no Suriname,

como uma doença que se propaga rapidamente, e foi associada inicialmente a

fatores climáticos e às condições do solo. Os sintomas morfológicos desta doença

são o aparecimento de folhas amarelo brilhante entre a folhagem normal,

seguidos de gradual aumento do número de folhas sintomáticas e, finalmente da

murcha das raízes. A partir deste ponto, os sintomas são exacerbados e a planta

morre rapidamente. Há duas formas da murcha do café ou da necrose do floema

do café ocorrer: a aguda e a crônica. Na primeira, as plantas morrem em 3 a seis

semanas; na segunda, perecem em 6 a 12 meses (Vermeulen, 1953). Descrições

mostraram que as plantas doentes apresentavam anormalidades na divisão

celular das células cambiais, e necrose dos elementos de tubo crivado. Foi

demonstrada uma clara relação entre a presença de tripanosomatídeos, P.

leptovasorum, nos elementos de tubo crivado e o estabelecimento da doença

(Stahel, 1931). Esta foi a primeira descrição de uma infecção por

tripanosomatídeos em uma planta não laticífera. Quanto aos vetores, tem sido

sugerido como possíveis vetores da necrose do floema do café, hemípteros do

gênero Lincus. A enxertia, em plantas saudáveis, de ramos e raízes infectadas

com Phytomonas leva ao desenvolvimento da doença (Vermeulen, 1953).

Na mandioca ou aipim, uma doença caracterizada pelo desenvolvimento

anormal do sistema radicular, resultando em uma planta com raízes pequenas e

delgadas, com baixas concentrações de amido, e com uma clorose generalizada

das partes aéreas, tem sido denominada “chochamento das raízes”. Esta

enfermidade tem sido associada com a presença de Phytomonas sp. ou P. francai

no interior do sistema laticífero destas plantas. Apesar de não ter sido identificado

seu vetor ou vetores, uma vez estabelecida no mandiocal, esta doença pode se

35

espalhar rapidamente pela plantação e atingir taxas de infecção superiores a 50

%. Além disto, foi obtido sucesso na transmissão da infecção por enxertia

(Kitajima et al., 1986). Protozoários flagelados, P. francai, foram também

identificados, no início do século, em tubos laticíferos de Manihot palmata

(Aragão, 1927).

Desde que foi descrita pela primeira vez na Colômbia em 1963, a

“marchitez sorpresiva”, também denominada “secamento ascendente” ou

“tostada”, vem causando graves perdas em plantações de dendê, na América

Latina (Dollet & Lopes, 1978). Inicialmente, o “secamento ascendente” ou

“tostada” ou “amarelecimento letal” foi relacionado com a presença de

microrganismos semelhantes a micoplasma – MLO - em extratos destas plantas

(Parthasarathy, 1974). No entanto, a análise ultraestrutural de inflorescências de

plantas doentes, oriundas do Peru, demonstrou a presença de tripanosomatídeos

no interior dos elementos de tubo crivado destas inflorescências (Dollet et al.,

l977). Posteriormente, a mesma abordagem foi utilizada para examinar plantas

afetadas pela “marchitez sorpresiva” coletadas no Peru, Equador, Colômbia e

Suriname. O resultado foi uma evidente associação entre a presença de

protozoários flagelados no interior dos elementos de tubo crivado das

inflorescências, principalmente das jovens, e o estabelecimento da enfermidade.

Os protozoários, que pela sua morfologia, tamanho e ultraestrutura se

assemelhavam aos observados no látex das plantas laticíferas, foram então

descritos como pertencentes à super-classe Mastigophora, Ordem Kinetoplastida,

Família Trypanosomatidae e Gênero Phytomonas. No entanto, foi sugerido que

estes protozoários difeririam essencialmente dos encontrados nas

Euphorbiaceae, pela sua localização no interior da planta (Dollet & Lopes, 1978).

Posteriormente, foi estabelecido que Phytomonas staheli, tripanosomatídeo

encontrado, em Arecaceae, deveria ser considerado como uma espécie em

separado (Mcghee & Mcghee, 1979).

Quanto ao impacto “marchitez sorpresiva”, o exemplo do Suriname é

bastante elucidativo. De 1915 a 1974 foram realizadas oito introduções de

diversas cultivares de dendê, neste país. Sendo que, em abril de 1956, cerca de

1.000 híbridos de alta produtividade foram plantados na Estação Experimental de

Agricultura de La Poule. Após três anos consecutivos de recordes de produção,

uma murcha de origem desconhecida, dizimou a plantação. Neste caso, a doença

36

apresentou taxas de mortalidade de 5 % no início de 1961 atingindo 23 % no final

deste mesmo ano; evoluindo para 80 % no final de 1963; 98 % durante o ano de

1966; e 99,5 % no final de 1975 (Schut, 1976). No Brasil, a “marchitez sorpresiva”

foi inicialmente descrita em cultivares experimentais do sul da Bahia (Oliveira &

Bezerra, 1982); e, vem se constituindo em uma das mais sérias enfermidades da

cultura do dendê na Bahia, principalmente, porque a morte da planta se dá 4 a 5

meses após os primeiros sintomas (Oliveira et al., 1987).

“Hartrot”, “murcha-fatal” ou “murcha-de-Phytomonas” são alguns dos

nomes da infecção causada por Phytomonas staheli em Cocos nucifera. Esta

doença tem sido um fator limitante à cocoicultura em diversas regiões da América

Latina, principalmente, porque taxas de mortalidade superiores a 90 % podem ser

atingidas em espaços de tempo relativamente curtos (Alexander et al., 1981;

Alexander, 1981; Louise et al., 1986).

Um coqueiro saudável produz uma nova folha e o decaimento de uma folha

antiga a cada mês. Assim, em uma planta saudável somente a folha mais velha

apresenta avançados sinais de senescência, com coloração amarronzada e

ressecada. Os primeiros sintomas da “murcha fatal” são a coloração amarronzada

das duas ou três últimas folhas simultaneamente e a queda de frutos de tamanho

médio. Durante a progressão da doença os sintomas incluem: perda parcial ou

total dos frutos; coloração amarelada e posteriormente amarronzada das folhas

jovens; necrose das inflorescências, abertas ou fechadas; e necrose das folhas

imaturas. Em seu estágio final, evidencia-se necrose e podridão do meristema do

ápice caulinar e, algumas vezes, das raízes. Diversos fatores influenciam o

intervalo de tempo entre o aparecimento dos primeiros sintomas e a morte da

planta. No entanto, o intervalo mais freqüente é de 8 a 12 meses (Waters, 1978).

Durante o biênio 1976/1977, a “murcha-de-Phytomonas” foi responsável

pela perda de aproximadamente 15.000 exemplares de Cocos nucifera, dentre as

diversas variedades comercialmente plantadas em Trinidad. Nestas plantas,

formas promastigotas de tripanosomatídeos foram encontradas exclusivamente

no interior dos elementos de tubo crivado (Waters, 1978). No entanto, não tem

sido possível estabelecer qualquer correlação entre o estágio de desenvolvimento

dos órgãos da planta, a concentração de Phytomonas encontrada no interior dos

elementos de tubo crivado do protofloema e do metafloema e o estágio de

desenvolvimento desta enfermidade. Freqüentemente, estes protozoários se

37

distribuem irregularmente (Thomas et al., 1979). Por outro lado, tem sido sugerido

que em elementos de tubo crivado altamente infectados, as placas crivadas

podem ser obstruídas por estes protozoários (Attias, 1989). Recentemente, dados

histoquímicos têm demonstrado o acúmulo de calose nas placas crivadas dos

elementos de tubo crivados de plantas doentes quando comparadas à plantas

sadias. Análise ultraestrutural dos elementos de tubo crivado de plantas doentes

tem revelado que P. staheli pode obliterar, fisicamente e pela deposição de calose

os poros das placas crivadas dos elementos de tubo crivado (Da Cunha, 1998).

No Brasil, a “murcha-de-Phytomonas” foi primeiramente descrita na cultura

de coqueiro da região sudeste da Bahia (Bezerra & Figueiredo, 1982), podendo

ser considerada uma área endêmica. Nesta região, tem sido realizada

transmissão experimental utilizando Lincus lobuliger (Hemiptera, Pentatomidae),

sendo que pela primeira vez se demonstrou a transmissão de P. staheli de

coqueiros, para dendezeiros (Rezende et al., 1986). No Estado do Rio de Janeiro,

no Município de Quissamã, foi identificada a murcha-de-Phytomonas em Cocos

nucifera (Da Cunha et al., 1995). No entanto, não foi obtido sucesso na

identificação de vetores e, tampouco, no isolamento e cultivo destes protozoários.

Por outro lado, nos exemplares infectados foram detectadas formas

promastigotas de tripanosomatídeos nos elementos de tubo crivado do ápice

caulinar, no meristema apical, nas folhas e inflorescências (Da Cunha et al., 1996;

Da Cunha, 1998).

Há uma grande variedade no grau de susceptibilidade à murcha de

Phytomonas entre as variedades comerciais de coqueiros. No entanto, ainda não

foi possível selecionar uma variedade ou híbrido de Cocos nucifera resistente ao

protozoário (Alexander, 1981; Alexander et al., 1981; Louise et al., 1986).

Observações de campo realizadas na Colômbia sugerem que Cocos nucifera cv

Gigante do Panamá não é afetado pela doença (Mccoy & Martinez-lopes, 1982).

No Brasil, inspeções fitossanitárias realizadas nos Municípios de Ilhéus, Belmonte

e Una, região sudeste da Bahia, sugerem que Cocos nucifera cv Anão Vermelho

da Malásia seria bastante tolerante a esta enfermidade (Bezerra & Figueiredo,

1982).

Uma grande diversidade de animais alimenta-se de vegetais. Durante sua

alimentação movem-se de planta para planta, algumas vezes cobrindo longas

distâncias. Estes organismos agem como agente de dispersão de patógenos,

38

sendo, então, denominados vetores. Basicamente, dois tipos principais de vetores

podem ser identificados: os que carreiam externamente o patógeno e os que o

transportam internamente, principalmente no tubo digestivo (Lucas, 1998). Tem

sido demonstrada a presença de P. serpens no tubo digestivo, hemocele e

glândulas salivares de insetos vetores, indicando um ciclo envolvendo

hospedeiros intermediários (Jankevicius, 1992). As evidências indicam que a

transmissão de protozoários do gênero Phytomonas (Quadro 8) enquadra-se no

último tipo (Wallace et al., 1992).

Os dados apresentados induzem ao raciocínio que há uma determinada

especificidade vetor/planta. No entanto, ainda é precoce e contraditória esta

conclusão. Por outro lado, resultados obtidos, em diferentes estudos, têm

permitido excluir as hipóteses agronômicas como causa da murcha de coqueiros.

Por outro lado, nematóides e fungos têm sido rechaçados como agentes

etiológicos desta enfermidade, uma vez que plantas protegidas quimicamente

com nematicidas e fungicidas desenvolvem a doença (Alexander et al., 1981).

Atualmente, parte-se da premissa que um microorganismo, do gênero

Phytomonas, é o agente etiológico e que este é transmitido de plantas infectadas

para plantas não infectadas por um inseto sugador/picador (Dollet, 1982). A

melhor perspectiva para a compreensão da transmissão da “marchitez sorpresiva”

e da “murcha-de-Phytomonas” está relacionada com a determinação de seus

vetores, possivelmente um Hemiptera, Pentatomidae. Uma autêntica evidência

seria a detecção destes tripanosomatídeos nas glândulas salivares destes

insetos. A dificuldade da identificação dos insetos vetores pode estar relacionada

com a incursão sazonal de hemípteros nas áreas de cultivo (Mcghee & Mcghee,

1979). No Brasil, Ochlerus sp. (Pentotomidae) tem sido apontado como vetor de

Phytomonas em plantações de coqueiros (Dollet et al., 1993).

39

Quadro – 8. Principais vetores de Phytomonas sp

Inseto Família Hospedeiro Família [hospedeiro]

Nysius euphorbiae Lygaeidae E. pilulifera Euphorbiaceae

Charisesterus cuspidatus Coreidae Euphorbia ssp. Euphorbiaceae

Dieuches humilis Lygaeidae E. pilulifera Euphorbiaceae

Stenocephalus agilis Coreidae E peplus Euphorbiaceae

Pachybrachius bilobata Lygaeidae E. cyanthophora Euphorbiaceae

Stenocephalus agilis Coreidae E. pinea Euphorbiaceae

Edessa loxdali Pentatomidae C. palmata Moraceae

Oncopeltus fasciatus Lygaeidae A curassavica Asclepiadaceae

Oncopeltus cingulifer Lygaeidae A curassavica Asclepiadaceae

Oncopeltus unifasciatellus Lygaeidae A fruticosa Asclepiadaceae

Oncopeltus cingulifer Lygaeidae A fruticosa Asclepiadaceae

Oncopeltus unifasciatellus Lygaeidae A curassavica Asclepiadaceae

Oncopeltus famelicus Lygaeidae P. extensa Asclepiadaceae

Oncopeltus fasciatus Lygaeidae A syriaca Asclepiadaceae

Oclerus ssp. Pentatomidae C. nucifera Arecaceae

Lincus ssp. Pentatomidae E. guineensis Arecaceae

Lincus crupius Pentatomidae E. guineensis Arecaceae

Lincus lamelliger Pentatomidae E. guineensis Arecaceae

Lincus vandoesburgi Pentatomidae E. guineensis Arecaceae

Lincus lobulliger Pentatomidae C. nucifera Arecaceae

Lincus lobulliger Pentatomidae E. guineensis Arecaceae

Lincus ssp. Pentatomidae C. iberica Rubiaceae

Phthia picta Pentatomidae L. esculentum Solanaceae

Nezara viridula Pentatomidae L. esculentum Solanaceae

Fonte: Wallace et al., 1992. Trypanosomatids in plants. In: Parasitic Protozoa

O ciclo de vida de Phytomonas tem sido descrito em poucos estudos que,

no entanto, são convergentes. Em linhas gerais, promastigotas em divisão

ocorrem no látex e no sistema condutor, onde raras formas amastigotas são

observadas. Uma vez ingeridas pelos insetos e, aproximadamente 4 dias após a

ingestão, formas promastigotas são encontradas no intestino dos insetos na

região do piloro. Nesta fase, não foram observadas formas em divisão. Em torno

do sexto dia tem início um crescimento antero-posterior das formas promastigotas

tornando-se formas gigantes em torno do décimo dia após a ingestão e

localizadas ainda na região do piloro do tubo digestivo dos insetos. Neste período,

formas promastigotas gigantes começam a aparecer na hemocele. Finalmente,

40

aproximadamente 26 dias após a ingestão pequenas formas promastigotas

ocorrem na glândula salivar dos insetos. Têm sido proposto que estes pequenos

protozoários são formas metacíclicas que são injetadas no interior da planta

hospedeira (Wallace et al., 1992).

Anel Vermelho

A ação dos nematóides sobre as plantas hospedeiras se manifesta de três

maneiras: ação traumática, ação espoliadora e ação tóxica. A ação traumática

advém de injúrias mecânicas resultantes da movimentação que certos

nematóides realizam no interior do vegetal injuriando de seus tecidos. Na ação

espoliadora resulta das substâncias nutritivas que são desviadas para o sustento

do organismo do nematóide parasito. Na ação tóxica, os nematóides secretam

substâncias da glândula salivar que provocam uma série de alterações no tecido

vegetal infectado essas alterações podem ser: paralisação da divisão celular,

morte dos tecidos infectados e hipertrofia e proliferações celulares acarretando na

formação de galhas (Lordello, 1992). Os nematóides são causadores de doenças

em plantas nos mais variados cultivos e são conhecidos como desencadeadores

de murchas em vegetais. O nematóide no contexto da murcha pode ser tido como

patógeno principal ou secundário, onde nesse último o abrir portas a patógenos,

principalmente fungos, que, algumas vezes, também provocam murchas (Marley

& Hillocks, 1996).

Grande parte dos nematóides é de vida livre e se alimenta de

microorganismos. No entanto, diversas espécies de nematóides causam doenças

em plantas. Estima-se que aproximadamente 11 % das perdas de culturas

economicamente importantes, tais como: legumes, aipim, banana, coco, batata,

beterraba, cana de açúcar e batata-doce estejam relacionadas aos nematóides

(Agrios, 1997). Estas perdas estão relacionadas aos nematóides como agentes

etiológicos de doenças, bem como veículos de outros patógenos (Lucas, 1998).

Nematóides parasitas de plantas são pequenos, com cerca de 300 a 1000

µm de comprimento e 15 a 35 µm de diâmetro. O ciclo de vida da maioria dos

nematóides parasitas de plantas é muito similar. Dos ovos saem formas juvenis

que, usualmente, são similares aos adultos. As formas juvenis crescem e o final

de cada estágio é terminado por uma muda. Todos os nematóides têm quatro

41

estágios juvenis, com a primeira muda ocorrendo no ovo. Ao término da última

muda, os nematóides se diferenciam em machos e fêmeas, se forem anfimíticos

podem produzir ovos férteis na presença de machos ou na ausência destes, e as

fêmeas partenogeneticamente. O ciclo de vida completa-se em 2 a 4 semanas

(Lordelo, 1992; Agrios, 1997).

Os nematóides parasitas de plantas podem ser classificados em:

migradores, quando se movimentam nos tecidos das plantas e sedentários,

quando vivem alojados em tecidos ou algum órgão da planta. Os nematóides

parasitas de plantas também podem ser ectoparasitos, quando não penetram nos

tecidos vegetais, mas se alimentam nas primeiras camadas de células ou

endoparasitos, quando penetram no hospedeiro (Agrios, 1997). Nematóides

endoparasitos, que provocam a síndrome denominada murcha, afetam o sistema

vascular do hospedeiro, preponderantemente o xilema aumentando

consideravelmente a resistência ao fluxo de água quando comparado com feixes

vasculares não infectados (Lucas, 1998).

Nematóides do gênero Bursaphelencus causam severas murchas em

diversas espécies arbóreas. Freqüentemente, estes nematóides apresentam uma

relação simbiótica com os vetores, os quais eles o invadem e por estes são

transportados para plantas sadias (Franco, 1964; Agrios, 1997). Nas plantas da

família Arecaceae economicamente importantes, o Bursaphelencus cocophylus

(Cobb, 1919) Baujard, 1989, agente etiológico do Anel Vermelho, ocorre em

piaçava, coco e dendê (Ferreira et al., 1998). Estes parasitos, usualmente,

infectam plantas jovens, de 3 a 10 anos de idade e a morte da árvore ocorre em

aproximadamente 3 meses (Agrios, 1997). Nos estágios avançados da doença,

os sintomas são muito semelhantes aos das plantas infectadas por P. staheli. No

entanto, a murcha das folhas não é tão pronunciada. Nos estágios iniciais

percebe-se o amarelecimento das folhas mais jovens e posteriormente o das

folhas adultas.

O Bursaphelencus cocophilus mede de 700 µm a 1000 µm de comprimento

e cerca de 15 µm de largura. Seu ciclo de vida completa-se em até 10 dias e tem

como vetor Rynchophorus palmarum (COLEOPTERA:CURCULIONIDAE). O

crescimento populacional dos nematóides é extremamente rápido e ocorre no

parênquima fundamental da planta, principalmente caule, pecíolos e raízes. Em

42

três a seis meses, a planta morre e os nematóides permanecem ativos por um

período de até 12 meses (Agrios, 1997).

Aparentemente, o coleóptero Rynchophorus palmarum pode conduzir o

nematóide internamente ou externamente via tubo digestivo ou exoesqueleto

respectivamente. O controle da doença pode ser feito com o emprego de

nematicidas ou preferencialmente pelo controle populacional do vetor. Neste

aspecto, desde os experimentos pioneiros de Bondar (1940) diversos tipos de

armadilhas ou sistemas de captura têm sido desenvolvidos para o controle destes

insetos (Moura et al., 1990). O controle populacional dos vetores tem sido

diretamente relacionado com o controle da doença (Fenwick, 1987; Moura et al.,

2002).

Murchas de origem desconhecida

Na América Central e América do Sul, 10 mil hectares de dendê – E.

guineensis - foram afetados, na década de 1970, por podridões do meristema

apical – “bud-rot disease”, acarretando destruição de plantações inteiras no

Panamá, Colômbia, Suriname, Equador e Brasil gerando retrocesso no

desenvolvimento desta cultura na América Latina. A causa desta doença

permanece desconhecida. No decorrer dos últimos 30 anos após a primeira

descrição da doença permanece a dúvida se esta apresenta uma ou mais origens

infecciosas ou é puramente uma desordem fisiológica ou ambas. Patógenos e

insetos vetores não têm sido imputados para esta murcha. No momento, têm-se

recorrido a espécies nativas resistentes – E. oleifera - para gerar híbridos

interespecíficos E. oleifera x E. guineensis (Franqueville, 2003).

43

OBJETIVOS

OBJETIVO GERAL

Caracterizar anatômica e ultraestruturalmente a interação patógeno/planta,

em murchas permanentes de plantas da família Arecaceae.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Realizar levantamento cultural e epidemiológico da cocoicultura no norte

fluminense;

Determinar a etiologia de murchas permanentes da família Arecaceae na

região norte fluminense;

Determinar a etiologia de murchas permanentes em Bactris gasipaes no sul

do Estado da Bahia;

Descrever anatômica e ultraestruturalmente a interação Candidatus

Phytoplasma palmae/Cocos nucifera;

Descrever anatômica e ultraestruturalmente a interação Phytomonas

staheli/Cocos nucifera;

Descrever anatômica e ultraestruturalmente a interação Bursaphelenchus

cocophilus/Attalea funifera, Cocos nucifera e Elaeis guineensis;

Descrever morfológica, anatômica e ultraestruturalmente os agentes

etiológicos de murchas permanentes da família Arecaceae na região norte

fluminense;

44

Comparar os dados da interação patógeno/planta no Estado do Rio de

Janeiro com obtidos no Estado da Bahia.

45

MATERIAIS E MÉTODOS

O trabalho foi conduzido no Laboratório de Biologia Celular e Tecidual

(LBCT), Centro de Biociências e Biotecnologia (CBB), Universidade Estadual do

Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), Campos dos Goytacazes, Estado do Rio

de Janeiro. A Estação Experimental Lemos Maia (EELM), Centro de Pesquisas do

Cacau (CEPEC), Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC),

Una, Estado da Bahia, foi a unidade de campo de referência.

Material vegetal

Coqueiros Anão Verde, conforme denominação dos produtores, Cocos

nucifera, L. híbridos de origem desconhecida, com 1 a 4 anos de plantio; e,

dendezeiros de pasto, denominação regional, Elaeis spp., com idade superior a

20 anos, foram coletados nos municípios da região norte do Estado do Rio de

Janeiro principalmente no município de Conceição de Macabu (CM) e também no

município de São João da Barra (SJB) (Mapa 1). Piacaveiras (Attalea funifera

Mart.), adultas com idade desconhecida; pupunheiras (Bactris gasipaes Kunth),

com 10 anos de plantio; coqueiros (Cocos nucifera L.) Anão Verde da Malásia,

com 12 anos de plantio; e, dendezeiros (Elaeis guineensis Jacq.), com 15 anos de

plantio, foram coletados na Estação Experimental Lemos Maia (EELM-CEPEC-

CEPLAC) e na região sul do Estado da Bahia (Mapa 1).

46

A localização geográfica individualizada do material vegetal (Quadro 9),

obtida por sistema de posicionamento global via satélite em aparelho GARMIM

GPS12®, Garmim Global Positioning System GPS12, utilizando o software 4.03,

Garmim Coorporation, UK, e os dados culturais foram obtidos com o produtor ou

com o Dr. Jose Inácio Lacerda Moura, chefe da EELM, CEPEC, CEPLAC.

Quadro 9 – Dados relativos à localização dos exemplares utilizados neste

trabalho.

Espécie/variedade Idade Diagnóstico Latitude Longitude EU UF

Attalea funifera Mart.

adulta B. cocophilus 15o21’27.8” 39o01’45.3” EELM BA

adulta B. cocophilus 15o19’54.0” 39o03’13.6” UNA BA

adulta sadia 15o16’23.4” 39o04’39.4” UNA BA

Bactris gasipaes Kunth.

Fenótipo sem espinho 10 anos indeterminado 15o15’13.2” 39o02’31.7” EELM BA

Fenótipo sem espinho 10 anos indeterminado 15o15’09.1” 39o02’24.8” EELM BA

Fenótipo sem espinho 10 anos indeterminado 15o15’13.9” 39o02’32.0” EELM BA

Fenótipo sem espinho 10 anos indeterminado 15o15’09.8” 39o02’25.8” EELM BA

Fenótipo sem espinho 10 anos sadia 15o15’09.3” 39o02’24.5” EELM BA

Cocos nucifera L.

Anão Verde > 15 anos P. staheli 22o12’02.0” 41o50’46.5” CM RJ

Anão Verde 6 anos P. staheli 22o11’36.8” 41o51’01.3” CM RJ

MAPA – 1 Mapa parcial Brasil.

Estado da Bahia.

Região Sudeste (seta preta).

Estado do Rio de Janeiro.

Região Norte (seta branca).

Fonte: IBGE

47

Anão Verde 1 - 2

anos

indeterminado 22o09’43.7” 41o45’19.8” CM RJ

Anão Verde 1 - 2

anos

indeterminado 22o09’43.8” 41o45’20.1” CM RJ

Anão Verde 4 - 5 anos B. cocophilus 22°05'07" 41°52'06" CM RJ

Anão Verde 4 - 5 anos P. palmae 21o39’10.9” 41o03’09.4” SJB RJ

Anão Verde 4 - 5 anos P. palmae 21o38’47.0” 41o03’30.9” SJB RJ

Anão Verde 4 - 5 anos P. palmae 21o38’46.3” 41o03’34.6” SJB RJ

Anão Verde > 15 anos sadia 22o12’02” 41o50’46” CM RJ

Gigante do Oeste

Africano

>15 anos P. staheli 15o15’12.0” 39o02’31.2” EELM BA

Anão Verde da Malásia 10 anos P. staheli 15o16’23.2” 39o04’39.8” EELM BA

Anão Verde da Malásia 10 anos B. cocophilus 16o15’22.8” 39o04’40.1” UNA BA

Anão Amarelo da

Malásia

8 anos indeterminado 15o16’20” 33o07’30” EELM BA

Híbrido (F2) 10 anos P. staheli 15o16’21.3” 39o07’12.4” UNA BA

Elaeis guineensis Jacq.

15 anos B. cocophilus 15o16’13.2” 39o02’32.8” EELM BA

15 anos B. cocophilus 15o16’11.2” 39o02’30.8” EELM BA

Elaeis ssp.

>20 anos indeterminado 22o11’31.7” 41o50’42.4” CM RJ

>20 anos Anel

Vermelho

22o11’25.3” 41o49’30.6” CM RJ

>20 anos indeterminado 22o12’17.2” 41o50’17.2” CM RJ

>20 anos Anel Vermelho 22o11’25.2” 41o49’30.4” CM RJ

4/5 anos indeterminado 22o10’58” 41o51’22” CM RJ

4/5 anos indeterminado 22o10’58” 41o51’22” CM RJ

Campanhas de campo

As campanhas de campo visaram analisar procedimentos agronômicos,

tratos culturais e amostragem epidemiológica. A identificação sintomatológica de

murchas permanentes foi enfocada. A documentação fotográfica das campanhas

de campo foi realizada analogicamente em filme 35 mm Kodak Kodacrome 400

ASA em máquina fotográfica Pentax ESPIO 738®, Negativos e positivos

fotográficos foram digitalizadas em Genius Scanner Color Vivid Pro II e

48

processadas com software Ulead PhotoImpact 3 - Ulead Systems; a

documentação fotográfica digital foi realizada em equipamento Digital Sony

Câmera (DSC-P93®) 5.1 megapixels por polegada quadrada de resolução

máxima.

Campanhas quinzenais foram realizadas em propriedades rurais nos

municípios da região norte do Estado do Rio de Janeiro (Mapa 1), constituída por

Campos dos Goytacazes, Cardoso Moreira, Carapebus, Conceição de Macabu,

Macaé, Quissamã, São Francisco do Itabapoana, São Fidélis e São João da

Barra. As propriedades Fazenda Fênix, Fazenda Santa Maria e Fazenda Santo

Antonio da Associação de Produtores Rurais de Santa Maria (APRUSAM) no

Município de Conceição de Macabu foram utilizadas como unidades

experimentais.

Campanhas semestrais foram realizadas na Estação Experimental Lemos

Maia (EELM), Centro de Pesquisas do Cacau (CEPEC), Comissão Executiva do

Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC), Una, Estado da Bahia. Nestas foram

determinados os espaçamentos de plantas da família Arecaceae ao longo da

rodovia BR 101, BA 040 e BA 001, no intervalo Campos dos Goytacazes-Ilheus.

A determinação de latitude e longitude das armadilhas foi realizado em

aparelho de posicionamento global via satélite GARMIM GPS12®, Garmim Global

Positioning System GPS12, utilizando o software 4.03, Garmim Coorporation, UK.

Coleta de insetos

Armadilhas tipo balde com isca de banana ou banana e cana-de-açúcar,

com volume total de 5 litros foram utilizadas. Vinte unidades foram utilizadas,

sendo 10 unidades na axila da 10ª. folha de C. nucifera e 10 unidades enterradas,

com abertura ao nível do solo, a 20 centímetros da base do estipe. Verificações

quinzenais foram realizadas, durante 12 meses. Estas armadilhas foram

instaladas na Fazenda Fênix, Fazenda Santa Maria e Fazenda Santo Antonio

(Quadro 10), Município de Conceição de Macabu, Estado do Rio de Janeiro.

49

Quadro 10 - Distribuição de armadilhas tipo balde com isca de banana ou

banana e cana-de-açúcar na região norte do Estado do Rio de Janeiro.

Armadilha no. Latitude Longitude

MP01A MP01B 22o10’54.8” 41o51’23.6”

MP02A MP02B 22o10’52.5” 41o51’23.0”

MP03A MP03B 22o10’52.9” 41o51’23.2”

MP04A MP04B 22o10’58.5” 41o51’21.7”

MP05A MP05B 22o10’58.2” 41o51’22.4”

MP06A MP06B 22o11’36.0” 41o50’39.9”

MP07A MP07B 22o11’35.5” 41o50’39.9”

MP08A MP08B 22o11’30.5” 41o50’46.2”

MP09A MP09B 22o11’38.4” 41o50’42.6”

MP10A MP10B 22o11’41.6” 41o50’55.5”

MP = Murcha de Phytomonas; algarismos arábicos = numero da armadilha;

A = armadilha axilar, B = armadilha solo.

Armadilhas tipo balde, com volume total de 100 litros, e tipo pet com isca

de cana-de-açúcar, com volume de aproximadamente 6 litros, foram utilizadas.

Vinte unidades foram utilizadas, sendo 10 unidades com abertura a 50

centímetros do nível do solo e 10 centímetros do estipe de C. nucifera e 10

unidades a 150 cm do nível do solo e aderidas ao estipe. Verificações quinzenais

foram realizadas, durante 24 meses. Alternativamente, machos adultos foram

utilizados juntamente com cana-de-açúcar como isca. Estas armadilhas foram

instaladas na Fazenda Fênix, Fazenda Santa Maria e Fazenda Santo Antonio

(Quadro 11), Município de Conceição de Macabu, Estado do Rio de Janeiro.

50

Quadro 11 - Distribuição de armadilhas tipo balde, 100 litros, e tipo pet com

isca de cana-de-açúcar na região norte do Estado do Rio de Janeiro.

Armadilha no. Latitude Longitude

AV01A AV01B 22010’48.1’’ 41051’22.6’’

AV02A AV02B 22010’58.9’’ 41051’25.8’’

AV03A AV03B 22011’42.7’’ 41050’57.7’’

AV04A AV04B 22010’57.4’’ 41051’25.6’’

AV05A AV05B 22010’58.0’’ 41051’26.0’’

AV06A AV06B 22011’36.0’’ 41050’48.0’’

AV07A AV07B 22011’37.8’’ 41050’46.2’’

AV08A AV08B 22011’21.5’’ 41049’47.3’’

AV09A AV09B 22011’22.0’’ 41049’36.5’’

AV10A AV10B 22012’19.6’’ 41050’39.0’’

AV11A AV11B 22012’24.0’’ 41050’28.7’’

Testemunho 22012’19.6’’ 41050’35.0’’

AV = Anel Vermelho; algarismos arábicos = numero da armadilha; A = armadilha tipo

balde, B = armadilha tipo pet.

Amostragem de campo

A amostragem de campo foi realizada na região norte do Estado do Rio de

Janeiro (Quadro 12), visando traçar perfil cultural e fitossanitário da cocoicultura.

O critério ao acaso foi utilizado para visitas as propriedades rurais. No entanto,

visando abranger um percentual significativo de plantios comerciais, as

propriedades que margeiam as rodovias principais e estradas vicinais de 1ª. e 2ª.

ordem foram visitadas. As visitas foram realizadas no período de novembro de

1999 a dezembro de 2004.

51

Quadro 12 - Municípios da região norte do Estado do Rio de

Janeiro inseridos na amostragem de campo e o número de

propriedades rurais visitadas.

Município No. de propriedades rurais

Campos dos Goytacazes 11

Carapebus 2

Cambuci 2

Conceição de Macabu * 31

Macaé 1

Quissamã 57

São Fidélis 2

São Francisco de Itabapoana 25

São João da Barra* 26

* Dados Completos

Os principais dados levantados através de inquisição aos cocoicultores e

visitas as propriedades foram: numero de plantas, idade da cultura, origem das

mudas, espaçamento empregado, produtividade, adubação e periodicidade,

irrigação e uso de defensivos (Formulário 1). Pragas e doenças pré-existentes

foram levantadas através de questionário e inspeção nas propriedades. Havendo,

ainda, diagnóstico de campo.

Formulário – 1 Questionário para os produtores rurais durante as visitas de

campo.

52

Nome da propriedade

Proprietário

Localização UE:

Total (ha) Cocoicultura (ha)

No. plantas Espaçamento Obs:

Origem das mudas

Tipo das mudas

Adubação Periodicidade

Tipo de adubo

Coroamento Periodicidade

Irrigação Sim: Não: Tipo

Herbicida Periodicidade

Inseticida Periodicidade

Acaricida Periodicidade

Nematicida Periodicidade

Pragas pré-existentes

Tratamento empregado

Doenças pré-existentes

Tratamento empregado

Pragas diagnosticadas

Tratamento sugerido

Doenças diagnosticadas

Tratamento sugerido

Murcha biótica sintomatologia Sim: Não: Diagnóstico [campo]:

Diagnóstico laboratorial

Retorno em / / . Reservatório eliminado? Sim: Não:

Informações relevantes:

Equipe executora:

Data:

Veiculo: Placa:

Centro de Biociências e Biotecnologia Laboratório de Biologia Celular e Tecidual

53

Os parâmetros relativos à sintomatologia de murcha biótica foram plantas

isoladas apresentando murcha ascendente ou descendente de parte das folhas;

folhas amareladas, amarronzadas, ou ambas; folha no. 1 murcha ou não

identificável; inflorescências amarronzadas; frutos amarronzados; queda

prematura de frutos; número excessivo de folhas em abscisão. A deposição

circular e periférica de antocinanina em cortes transversais do estipe foi

considerada indicativo de Anel Vermelho.

Microscopia óptica

Extratos frescos, obtidos mecanicamente em morsa Metal Leve, de

bainhas foliares, de inflorescências, de meristema apical de caule e de diversas

alturas do estipe foram observados por microscopia óptica de fase ou de

contraste interferencial diferencial (DIC) em microscópio Axioplan Zeiss.

Extratos positivos e negativos para patógenos e fragmentos de bainhas

foliares, de inflorescências, de meristema apical de caule e de diversas regiões do

estipe foram processados para microscopia óptica, seguindo-se as etapas

descritas abaixo:

Fixação: Imersão das amostras em solução contendo 2,5 % de glutaraldeído, 4,0

% formaldeído diluídos em tampão cacodilato de Sódio 0,1 M, pH ~ 7,0, durante

duas horas, a temperatura ambiente;

Lavagem: Imersão das amostras em tampão cacodilato de Sódio 0,1 M, pH ~ 7,0,

durante duas horas, a temperatura ambiente, três repetições;

Pós-fixação: Imersão das amostras em solução contendo 1,0 % de tetróxido de

Ósmio diluído em tampão cacodilato de Sódio 0,1 M, pH ~ 7,0, durante uma hora,

a temperatura ambiente e protegido do espectro visível da radiação

eletromagnética;

Lavagem: conforme descrito anteriormente;

54

Desidratação: Imersão das amostras em série crescente de propanona ou álcool

etílico – 30 %, 50 %, 70 %, 90 %, 100 % e 100 % com cartucho de sulfato de

Cobre, duas repetições, durante uma duas cada etapa, a temperatura ambiente;

Infiltração[1]: Infiltração das amostras em série crescente resina epoxi – Epon 812

ou resina epóxi de baixa viscosidade (Spurr, 1969) – 25 %, 50 %, 75 % e 100 % –

diluída em propanona ou álcool etílico 100 % com cartucho de Sulfato de Cobre

durante doze horas cada etapa, a temperatura ambiente;

Polimerização[1]: As amostras foram orientados em formas de polimerização,

preenchidas com resina epóxi, e polimerizados em estufa a 60°C durante 48

horas, no caso de Epon 812 e em estufa a 60°C duran te 12 horas, quando

infiltrados em resina epóxi de baixa viscosidade (Spurr, 1969).

Infiltração[2]: Em materiais que foram processados conforme descrito

anteriormente e nos quais foi omitida a etapa de pós-fixação, a infiltração foi

realizada em série crescente de resina metacrilato UNICRYL – 25 %, 50 %, 75 %

e 100 % – diluída em propanona ou álcool etílico 100 % com cartucho de Sulfato

de Cobre durante doze horas cada etapa, a temperatura ambiente;

Polimerização[2]: As amostras foram orientados em tubos de 1,5 mililitros

preenchidos com resina metacrilato - UNICRYL - e polimerizados em estufa a

60°C durante 24 horas.

Microtomia: Blocos polimerizados foram desbastados gerando uma superfície de

corte em formato de trapézio regular em aparelho Reichet Ultracut S. Cortes

semifinos, com espessura variando entre 1 e 2 µm, foram obtidos com navalha de

vidro ou de safira - Saphatome. Os cortes foram aderidos em laminas para

microscopia óptica e corados com solução aquosa de Azul de Toluidina a 1,0 %,

acrescida de 0,1 % de sulfato de Boro.

Documentação: Os dados relativos à microscopia óptica foram documentados

digitalmente em microscopia de campo claro ou contraste diferencial interferencial

55

em microscópio óptico Axioplan Zeiss, equipado com câmera ZVS – Zeiss,

acoplado ao sistema AnaIySIS/ Soft Imaging System de processamento digital

de imagens.

Microscopia eletrônica de varredura

Extratos positivos e negativos para patógenos e fragmentos de bainhas

foliares, de inflorescências, de meristema apical de caule e de diversas alturas do

estipe foram processados para microscopia óptica, seguindo-se as etapas

descritas abaixo:

Fixação: Imersão das amostras em solução contendo 2,5 % de glutaraldeído, 4,0

% formaldeído diluídos em tampão cacodilato de Sódio 0,1 M, pH ~ 7,0, durante

duas horas, a temperatura ambiente;

Adesão: O material contido nos extratos foi aderido por contato, durante 30

minutos, a lamínulas redondas revestidas com poli-L-lisina;

Lavagem: Imersão das amostras em tampão cacodilato de Sódio 0,1 M, pH ~ 7,0,

durante duas horas, a temperatura ambiente, três repetições;

Pós-fixação: Imersão das amostras em solução contendo 1,0 % de tetróxido de

Ósmio diluído em tampão cacodilato de Sódio 0,1 M, pH ~ 7,0, durante uma hora,

a temperatura ambiente e protegido do espectro visível da radiação

eletromagnética;

Lavagem: conforme descrito anteriormente;

Desidratação: Imersão das amostras em série crescente de propanona ou álcool

etílico – 30 %, 50 %, 70 %, 90 %, 100 % e 100 % com cartucho de sulfato de

Cobre, duas repetições, durante uma duas cada etapa, a temperatura ambiente;

Secagem: As amostras foram secas pelo método do ponto crítico do dióxido de

Carbono em aparelho BALTEC – CPD 030;

56

Metalização: Amostras secas foram aderidas com fita adesiva dupla-face de

carbono ou cola de prata a suportes metálicos cobertas - por sputtering - com

uma camada de aproximadamente 20 nanômetros de ouro em aparelho BALTEC

– SCD 050;

Documentação: As amostras foram observadas e documentadas digitalmente em

microscópio eletrônico de varredura Zeiss DSM 962.

Microscopia eletrônica de transmissão

Extratos positivos e negativos para patógenos e fragmentos de bainhas

foliares, de inflorescências, de meristema apical de caule e de diversas alturas do

estipe foram processados para microscopia óptica, seguindo-se as etapas

descritas abaixo:

Fixação: Imersão das amostras em solução contendo 2,5 % de glutaraldeído, 4,0

% formaldeído diluídos em tampão cacodilato de Sódio 0,1 M, pH ~ 7,0, durante

duas horas, a temperatura ambiente;

Lavagem: Imersão das amostras em tampão cacodilato de Sódio 0,1 M, pH ~ 7,0,

durante duas horas, a temperatura ambiente, três repetições;

Pós-fixação: Imersão das amostras em solução contendo 1,0 % de tetróxido de

Ósmio diluído em tampão cacodilato de Sódio 0,1 M, pH ~ 7,0, durante uma hora,

a temperatura ambiente e protegido do espectro visível da radiação

eletromagnética;

Lavagem: conforme descrito anteriormente;

Desidratação: Imersão das amostras em série crescente de propanona ou álcool

etílico – 30 %, 50 %, 70 %, 90 %, 100 % e 100 % com cartucho de sulfato de

Cobre, duas repetições, durante uma duas cada etapa, a temperatura ambiente;

57

Infiltração: Infiltração das amostras em série crescente resina epoxi – Epon 812

ou resina epóxi de baixa viscosidade (Spurr, 1969) – 25 %, 50 %, 75 % e 100 % –

diluída em propanona ou álcool etílico 100 % com cartucho de Sulfato de Cobre

durante doze horas cada etapa, a temperatura ambiente;

Polimerização: As amostras foram orientadas em formas de polimerização,

preenchidas com resina epóxi, e polimerizados em estufa a 60°C durante 48

horas, no caso de Epon 812 e em estufa a 60°C duran te 12 horas, quando

infiltrados em resina epóxi de baixa viscosidade (Spurr, 1969).

Microtomia: Blocos polimerizados foram desbastados gerando uma superfície de

corte em formato de trapézio regular em aparelho Reichet Ultracut S. Cortes

ultrafinos – com espessura variando entre 90 e 120 nanômetros foram obtidos

com navalha de diamante – Diatome. Os cortes foram contrastados com citrato

de chumbo e acetato de uranila;

Documentação: Os dados relativos à microscopia eletrônica de transmissão foram

documentados analogicamente em chapas fotográficas, medindo 8,3 por 10,2

centímetros, de alta sensibilidade – Kodak Electron Microscope Film 4489 - em

microscópio eletrônico de transmissão Zeiss EM 900.

Contrastação negativa

Extratos positivos e negativos para patógenos de fragmentos de bainhas

foliares, de inflorescências, de meristema apical de caule e de diversas alturas do

estipe foram processados para observação pelo método de contrastação negativa

em microscopia eletrônica de transmissão. Esta metodologia foi empregada em

plantas com suspeita de infecção por fitoplasma. As etapas dessa metodologia

são descritas abaixo:

Fixação: Imersão em solução contendo 2,5 % de glutaraldeído, 4,0 % formaldeído

diluídos em tampão cacodilato de Sódio 0,1 M, pH ~ 7,0, durante duas horas, a

temperatura ambiente;

58

Centrifugação: O material fixado foi centrifugado a 1.000 g, durante 5 minutos;

Filtração: O deposito foi ressuspenso na mesma solução tampão e filtrado em

filtros de 20 µm de porosidade;

Centrifugação: conforme descrito anteriormente;

Lavagem: Imersão em tampão cacodilato de Sódio 0,1 M, pH ~ 7,0, durante duas

horas, a temperatura ambiente, três repetições;

Pós-fixação: Imersão em solução contendo 1,0 % de tetróxido de Ósmio diluído

em tampão cacodilato de Sódio 0,1 M, pH ~ 7,0, durante uma hora, a temperatura

ambiente e protegido do espectro visível da radiação eletromagnética;

Lavagem: conforme descrito anteriormente;

Contrastação negativa: Os materiais foram ressuspensos em 0,5 mL de solução

tampão e depositados, durante 30 minutos, sobre grade de cobre de 200 mesh

revestida com Formvar™. Após retirar-se o excesso de solução, foram

contrastados negativamente com solução aquosa saturada de acetato de uranila

ou solução alcoólica de acido fosfotungstico. Alternativamente, após a etapa de

fixação, foram realizadas as etapas de contrastação negativa.

Documentação: Os dados relativos à contrastação negativa foram documentados

analogicamente em chapas fotográficas, medindo 8,3 por 10,2 centímetros, de

alta sensibilidade – Kodak Electron Microscope Film 4489 - em microscópio

eletrônico de transmissão Zeiss EM 900.

Descrição detalhada de matérias e metodologias empregadas, quando

couber, está descrita nos respectivos manuscritos.

59

RESULTADOS AGRONÔMICOS

A amostragem agronômica realizada na região norte do Estado do Rio de

Janeiro em propriedades dedicadas total ou parcialmente à cocoicultura, revelou

características flutuantes, dependo primordialmente do município em questão

(Quadro 13).

Quadro 13. Distribuição de propriedades rurais na região norte do Estado do Rio

de Janeiro dedicadas total ou parcialmente a cocoicultura. Regiões de

Governo Municipios

< 10 ha >10 ha < de 100 ha

> 100 ha < de 1.000 ha

> 1.000 ha

TotalIBGE Ψ TotalIBGE Ψ TotalIBGE Ψ TotalIBGE Ψ Norte Fluminense 15.028 5.393 1.248 68 0

Campos dos

Goytacazes 7.114

8

2.276

2

512

1

33

0

Conceição de

Macabu 223

20

120

7

59

4

1

0

Macaé 973 0 541 1 213 0 15 0

Quissamã 317 40 123 11 79 6 8 0

São Fidélis 2.323 2 1.077 0 135 0 3 0

São Francisco de

Itabapoana SD

18

SD

7

SD

0

SD

0

São João da Barra 3.514 12 966 8 190 6 7 0

SD = Sem dados, IBGE (1996) X Estudo Ψ.

Em propriedades com dimensões acima de 1.000 hectares foi identificada

a monocultura canavieira ou pecuária de corte e/ou leite. Nas propriedades

variando entre 100 e 1.000 hectares, predomina o mesmo quadro, tendendo a

diversificação, na qual cocoicultura está inserida. Nestas propriedades identificou-

se o melhor trato cultural. Propriedades entre 10 e 100 hectares apresentam perfil

similar ao anterior, porém os tratos culturais são precários. Nas propriedades

60

menores do que 10 hectares, quando dedicadas a cocoicultura, os tratos culturais

são praticamente inexistentes. O Município de Conceição de Macabu é um

exemplo do descrito. Dentre os 15 pequenos produtores, propriedades menores

que 10 hectares, predominam assentados pelo Poder Público e subsidiados

econômica e estruturalmente na implantação, os tratos culturais são praticamente

inexistentes. A área de cocoicultura varia entre 5 a 10 hectares com no máximo

1.000 plantas por produtor. A produtividade foi sempre aquém da esperada. Em

outros dois grupos, propriedades variando entre 10 e 100 hectares e entre 100 e

1.000 hectares, os tratos culturais tornam-se mais específicos quanto maior for a

propriedade e a produtividade gira em torno de 100 frutos por planta por ano. No

entanto, parte dos médios produtores organizaram-se em associação visando

agregar valor às culturas, Associação dos Produtores Rurais de Santa Maria –

APRUSAM. E, a única propriedade acima de 1.000 hectares dedica-se a pecuária

bovina de leite e corte. Este quadro se repete na maioria dos municípios da

região.

Não foram identificadas aquisições de mudas certificadas na região norte

fluminense, exceto as primeiras introduções no Município de Quissamã, no inicio

da década de 1990. Um pequeno percentual de viveiristas adquiriu mudas

oriundas de produtores do nordeste brasileiro, principalmente do Município de

Souza, Paraíba. Sendo estas, em sua grande maioria, híbridos vendidos como

Anão Verde. Posteriormente, o maior percentual dos produtores iniciou os plantios

com mudas de viveiristas locais, normalmente resultantes de fecundação natural

do dossel existente. Embora várias plantas com fenótipo de híbridos tenham sido

costumeiramente encontrados nos plantios, plantas com aspecto fenotípico de

anãs foram observados na sua grande maioria. Todavia, a filogenia dessas

plantas não foi passível de identificação, pois o material genético que as deram

origem não apresentava certificação, seja esta de produtores de muda local, bem

como, aqueles que promoviam a formação de seu próprio viveiro, para

manutenção de seus plantios.

Os espaçamentos observados foram os mais variados possíveis, desde 5 X

5 metros (Figura 1) a 12 X 12 metros entre plantas, dispostos em triângulo

eqüilátero. A manutenção de mulch foi freqüentemente identificada (Figura 2).

Sendo usual o espaçamento de 8,5 X 8,5 metros em triângulo eqüilátero (Figuras

3 e 4), totalizando 140 plantas por hectare.

61

Figuras 1e 2 - Município de São João da Barra [21°4 1’30”S – 41°03’26”W].

Plantas - aproximadamente 400 C. nucifera híbridos - com espaçamento em

torno de 5 X 5 metros, parte em triângulo eqüilátero e parte em quadrado. Figura

2 – Detalhe de mulch. Figura 3 - Município de Conceição de Macabu [22°11’21”S

– 41°49’47”W]. Fazenda Santa Maria, 350 hectares d e área total, pecuária de

leite e corte, cafeicultura e cocoicultura. Vista panorâmica de cocoicultura -

aproximadamente 15.000 C. nucifera Anão Verde distribuídos em 4 glebas - com

espaçamento em torno de 8,5 X 8,5 metros, parte em triângulo eqüilátero. Figura

4 - Município de Campos dos Goytacazes [22°01’49”S – 41°13’27”W]. Sítio do

Riquinho, 60 hectares de área total, laser e cocoicultura. Vista panorâmica de

cocoicultura - aproximadamente 500 C. nucifera Anão Verde distribuídos em 2

glebas - com espaçamento em torno de 8,5 X 8,5 metros, parte em triângulo

eqüilátero, irrigado.

3

1 2

4

62

Consórcios foram empregados por produtores independentemente do

tamanho da propriedade. O consórcio cocoicultura e cafeicultura foi o único

realizado de maneira adequada quanto a espaçamento e luminosidade. Nestes,

os coqueiros encontram-se espaçados 9,5 X 9,5 metros intercalados com duas

fileiras de café (Figuras 5 e 6). A produtividade da cocoicultura foi em torno de

120 frutos por planta por ano. Este foi observado no Município de Conceição de

Macabu dentre os associados da APRUSAM. O consórcio coqueiro adulto, com

aproximadamente 8 anos de plantio, e pecuária bovina de leite foi identificado

com sucesso na Fazenda Santo Antônio (Figura 7). Na Estação Experimental

Lemos Maia, CEPEC/CEPLAC, foi verificado, em colaboração com Dr. José

Inácio Lacerda Moura, o consórcio C. nucifera Anão Verde Malásia, com

espaçamento 8,5 X 8,5 metros, com pimenta do reino, Piper nigrum, L. Não foi

identificadas competição por luminosidade e os sistemas radiculares mantinham-

se individualizados, sendo ambas culturas perenes (Figura 8). Em contraste,

consórcios coqueiro jovem e mandioca, foi realizado de forma inadequada por

diversos produtores. Consórcios incomuns também foram observados,

principalmente coqueiro e cana-de-açúcar (Figura 9); freqüentemente, nestes

consórcios, o espaçamento era inadequado. O consorciamento de coqueiro e

goiaba foi comumente encontrado na região (Figura 10), em sua totalidade com

espaçamento inadequado da cocoicultura. Curiosamente, foram identificadas

introduções de cocoicultura em consórcio com caprinocultura (Figura 11) ou com

ovinocultutra. Nos municípios de São Francisco de Itabapoana e São João da

Barra, a motivação dos consórcios consistiu basicamente de fruticultura, sendo

frequentes os consórcios coqueiro e abacaxi, coqueiro e melancia.

Lixa grande – Sphaerodothis acrocomiae - e lixa pequena – Phyllachora

torrendiella - estavam presentes na quase totalidade dos cultivos analisados. A

helmintosporiose - Bipolaris incurvata – foi frequentemente identificada em plantas

jovens e adultas. Queima das folhas – Botryosphaeria cocogena – era também

frequente. No entanto, as doenças fungicas, apesar de apresentarem alta

incidência, usualmente apresentavam baixa severidade.

63

Figuras 5 e 6 - Município de Conceição de Macabu [22°11’36”S – 41°51’01”W],

Fazenda Fenix. Figura 5 - Coqueiros - aproximadamente 800 C. nucifera Anão

Verde - com espaçamento em torno de 8,5 X 8,5 metros, parte em triângulo

eqüilátero e 1 fileira de café. Figura 6 - Coqueiros - aproximadamente 800 C.

nucifera Anão Verde - com espaçamento em torno de 9,5 X 9,5 metros, parte em

triângulo eqüilátero e 2 fileiras de café. Figura 7 – Fazenda Santo Antônio

[22°11’37”S – 41°50’46”W]. Coqueiros Anão Verde, co m aproximadamente 8

anos, em consórcio com pecuária bovina de leite, gleba com 3 hectares.

6 7

5

64

Figura 8 - Estação Experimental Lemos Maia, CEPEC/CEPLAC consórcio C.

nucifera Anão Verde Malásia, com espaçamento 8,5 X 8,5 metros, com pimenta

do reino, Piper nigrum, L.. Figura 9 – Município de Campos dos Goytacazes

[21°57’46”S – 41°11’27”W]. Detalhe de consórcio coq ueiro e cana-de-açúcar e

reduzido espaçamento. Figura 10 - Município de São João da Barra, Sítio Rei Sol

[21°41’30”S – 41°03’26”W]. Consórcio coqueiro e go iaba. Apesar do

espaçamento de 8,5 X 8,5 metros em triângulo eqüilátero há sombreamento das

goiabeiras. Figura 11 - Município de São João da Barra, Estrada do Açu

[21°45’36”S – 41°05’21”W]. Consórcio coqueiro – re cém plantados - e

caprinocultura.

Dentre as pragas (Quadro 14), destacavam-se a broca da raquis foliar–

Amerrhinus ynca, a brocado do pedúnculo floral – Homalinotus coriaceus, e a

broca do olho do coqueiro – Rhinchophorus palmarum. Lepidópteras, inseto

11

9

10

8

65

rodilha do coqueiro, falsa barata do coqueiro, cochonilhas, pulgões e ácaros

foram encontrados esporadicamente nos diversos municípios.

Quadro 14 – Pragas do coqueiro identificadas na Região Norte Fluminense

Identificação Praga (Nome científico)

In loco Armadilha Frequência

Amerrhinus ynca Sahlber 1823 ++

Coraliomela brunnea Thumberg 1821 ++

Homalinotus coriaceus Gyllenhal 1836 +++

Parisoschoenus obesulus Casey 1922 ++

Rhinostomus barbirostris Fabricius 1775 +

Rhynchophorus palmarum Linnaeus 1764 ++++

Hemisphaerota tristes Boheman 1850 +

Strategus aloeus Linnaeus 1764 ++

Brasssolis sophorae Linnaeus 1758 ++

Hyalospila ptychis Dyar 1919 ++

Aspidiotus destructor Signoret 1869 +

Cerataphis lataniae Boisduval 1867 +

Aceria guerreronis Keifer 1965 +++

Cochonilha branca do coqueiro ++

+ = até 25%; ++ = 26 –50%; +++ = 51 – 75%; ++++ = 76 - 100%.

Baseado em: Ferreira et al., 1998. A cultura do coqueiro no Brasil.

Quadros de deficiência mineral das plantas avaliadas foram rotineiramente

observados. A situação agravava-se nas propriedades onde o manejo era

realizado de maneira inadequada. A deficiência de boro era freqüentemente

encontrada nos municípios estudados, bem como, deficiência de cobre.

O uso de irrigação não era freqüentemente empregado pelos produtores.

Quando presente, a grande maioria utiliza o sistema de microaspersão ou

variantes deste sistema, porém não foi verificado cuidado com a qualidade da

água ou com a perenidade da mesma. A fonte da água de irrigação adotada na

região consistia da escavação até a altura do lençol freático formando-se

pequenos açudes, em que o nível de água oscilava de acordo com nível do lençol

66

freático. Cultivos irrigados na região litorânea, utilizavam água ferruginosa em

sua quase totalidade, sendo a única exceção o Município de Quissamã.

No intuito de avaliar a cocoicultura e a presença de plantas da família

Arecaceae, as margens da BR 101, BA 040 e BA 001, no trajeto Campos dos

Goytacazes – Ilhéus, e de traçar um perfil desta cultura ao longo desse percurso

foram coletados dados dos cultivos encontrados, sendo que o quadro é muito

semelhante ao observado no Norte Fluminense, onde existem plantios em que os

tratos culturais são plausíveis do ponto de vista agronômico. Em contra partida,

situações de total abandono com plantas exibindo sintomas de murcha

permanente se intercalam com cultivos de médio a grande porte bem conduzidos.

A maior distância linear entre plantas desta família foi de 250 metros, não sendo

observada uma solução de continuidade ao longo do trecho estudado.

Verificações quinzenais, durante 12 meses, em armadilhas tipo balde com

isca de banana ou banana e cana-de-açúcar dispostas na axila da 10ª. folha de C.

nucifera (Figura 12) ou enterradas, com abertura ao nível do solo, a 20

centímetros da base do estipe, foram infrutíferas. Não tendo sido coletados

insetos das famílias Lygeidae e Pentatomidae, apesar destas armadilhas estarem

instaladas na Fazenda Fênix, Fazenda Santa Maria e Fazenda Santo Antonio,

Município de Conceição de Macabu, Estado do Rio de Janeiro, locais em que

exemplares de C. nucifera encontravam-se infectados por Phytomonas staheli.

Armadilhas tipo balde (Figuras 12 e 14) e tipo pet (Figuras 13, 15,16) com

isca de cana-de-açúcar encontravam-se dispostas na Fazenda Fênix, Fazenda

Santa Maria e Fazenda Santo Antonio, Município de Conceição de Macabu,

Estado do Rio de Janeiro (Croqui 1).

67

Figura 12 – Armadilha tipo balde suspensa. Fazenda Fenix [22°11’36”S –

41°51’01”W], Figura 13 – Armadilha tipo pet. Figura 14 - Armadilha tipo balde,

100l. Figura 15 – Armadilha tipo pet suspensa. Fazenda Fenix [22°11’36”S –

41°51’01”W]. Figura 16 – Armadilha tipo pet suspensa. Fazenda Fenix

[22°11’36”S – 41°51’01”W] R. palmarum capturado (seta).

13

12 14

15 16

68

A Fazenda Fênix tem 755 hectares dos quais aproximadamente 80

hectares dedicados a cocoicultura, com espaçamento mínimo de 8,5 x 8,5 metros

em triângulo eqüilátero. Localiza-se na parte norte do croqui. A Fazenda Santa

Maria tem 350 hectares dos quais aproximadamente 82 hectares dedicados a

cocoicultura, com espaçamento de 8,5 x 8,5 metros em triângulo eqüilátero.

Localiza-se na porção sul do croqui. E, a Fazenda Santo Antonio tem 300

hectares dos quais aproximadamente 45 hectares dedicados a cocoicultura, com

espaçamento de 8,5 x 8,5 metros em triângulo eqüilátero, localizando-se na

porção centro-leste do croqui. A distribuição das armadilhas atendeu aos

parâmetros representatividade topográfica, idade dos plantios, consórcios e

ocorrência de doenças, descritas a seguir: (1) Relevo em declive, próximo a

córrego, 150 coqueiros adultos, 6 anos de plantio, e mancha de Mata Atlântica;

(2) Relevo em declive, 300 coqueiros adultos, sendo 150 com mais de 20 anos e

150 com 6 anos de plantio, e mancha de Mata Atlântica, duas ocorrências de

Murcha de Fitomonas; (3) Baixada, , próximo a córrego, 1.500 coqueiros adultos,

6 anos de plantio; (4) Baixada, 1.500 coqueiros adultos, 6 anos de plantio com

espaçamento de 9 x 9 metros, consórcio coqueiro x café, duas entrelinhas; (5)

Baixada interface pasto coqueiral, 1.500 coqueiros adultos, 6 anos de plantio com

espaçamento de 8,5 x 8,5 metros, consórcio coqueiro x café, uma entrelinha; (6)

Meia-encosta, 1.000 coqueiros adultos, 10 anos de plantio com espaçamento de

8,5 x 8,5 metros, consórcio coqueiro x pecuária bovina de leite; (7) Meia-encosta,

Nicolas Le Coustour

N 1111

2222

3333 4444

5555 6666

7777

8888

9999 10101010 11111111

TTTT

Croqui 1 – Distribuição de armadilhas.

1 AV01A AV01B 2 AV02A AV02B 3 AV03A AV03B 4 AV04A AV04B 5 AV05A AV05B 6 AV06A AV06B 7 AV07A AV07B 8 AV08A AV08B 9 AV09A AV09B

10 AV10A AV10B 11 AV11A AV11B T Testemunhos

RJ - 182

69

600 coqueiros adultos, 5 anos de plantio com espaçamento de 8,5 x 8,5 metros,

entre o 2° e 3° ano consórcio coqueiro x mandioca; (8) Baixada limitada por

córrego, 8.000 coqueiros adultos, 8 anos de plantio com espaçamento de 8,5 x

8,5 metros, interface pasto coqueiral; (9) Baixada limitada por córrego, 1.000

coqueiros adultos, 8 anos de plantio com espaçamento de 8,5 x 8,5 metros,

ocorrência de Anel Vermelho em Elaeis ssp.; (10) Baixada limitada por córrego,

800 coqueiros, 3,5 anos de plantio com espaçamento de 8,5 x 8,5 metros,

extremidade oeste de ocorrência de Anel Vermelho em Elaeis ssp.; (11) Baixada

limitada por córrego, 800 coqueiros, 3,5 anos de plantio com espaçamento de 8,5

x 8,5 metros, interface leste pasto coqueiral e norte mancha de Mata Atlântica; (T)

Interface mancha de Mata Atlântica coqueiral.

Verificações quinzenais das armadilhas, supra citadas, foram realizadas

durante 24 meses, os primeiros 12 meses na ausência de insetos atrativos

(Gráfico 1) e 12 meses na presença de machos adultos foram utilizados

juntamente com cana-de-açúcar (Gráfico 2).

70

Gráfico 1 Número de insetos [Y] versos armadilhas tipo balde (A) e pet (B) [X]. No

período de 2003, sem insetos atrativos. R. palmarum, C. sorditus, outros

insetos.

Gráfico 2 Número de insetos [Y] versos armadilhas tipo balde (A) e pet (B) [X]. No

período de 2004, com insetos atrativos. R. palmarum, C. sorditus, outros

insetos.

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

20,0

TA TB 1A 1B 2A 2B 3A 3B 4A 4B 5A 5B 6A 6B 7A 7B 8A 8B 9A 9B 10A 10B 11A 11B

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

TA TB 1A 1B 2A 2B 3A 3B 4A 4B 5A 5B 6A 6B 7A 7B 8A 8B 9A 9B 10A 10B 11A 11B

71

O manuscrito abaixo foi elaborado de acordo com as normas editoriais do

periódico The Journal of Insect Sciences, uma revista de circulação internacional

editada pela Universidade do Arizona, USA.

Mass Trapping and Classical Biological Control of

Rhynchophorus palmarum L. 1794 (Coleoptera:Curculionidae).

A hypothesis based in morphological evidences.

Flávio Costa Miguens1,¥, Jorge André Sacramento de Magalhães1, Lívia Mello de

Amorim1, Geórgia Peixoto Bechara Mothé1, Viviane Rossi Goebel1, Nicola Le

Coustour2, Marie Lummerzheim2 and José Inácio Lacerda Moura3

72

Mass Trapping and Classical Biological Control of

Rhynchophorus palmarum L. 1794 (Coleoptera:Curculionidae).

A hypothesis based in morphological evidences.

Flávio Costa Miguens1,¥, Jorge André Sacramento de Magalhães1, Lívia Mello de

Amorim1, Geórgia Peixoto Bechara Mothé1, Viviane Rossi Goebel1, Nicola Le

Coustour2, Marie Lummerzheim2 and José Inácio Lacerda Moura3

1 – Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, Centro de Biociências e

Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darci Ribeiro. Campos

dos Goytacazes, Rio de Janeiro, Brazil.

2 – École Superiéure d’ Agriculture de Purpan, 75 voie du Toec. 31076, Toulouse,

CEDEX 3, France.

3 – Estação Experimental Lemos Maia, Centro de Pesquisas do Cacau, Comissão

Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira. Estrada Una-Colonia, Km 0. Una –

Bahia – Brasil.

¥ - Corresponding author present adress: Laboratório de Biologia Celular e

Tecidual, Centro de Biociências e Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte

Fluminense Darci Ribeiro. Avenida Alberto Lamego, 2000 – Parque Califórnia.

28.013-600 – Campos dos Goytacazes – Rio de Janeiro – Brasil. 55.22.27261514

- flavio@uenf.br

Abstract

Palm weevils have been reported as a pest and red ring nematode vectors

for several palms of the Arecaceae family. Rhynchophorus palmarum (Coleoptera:

Curculionidae) is a pest for coconut crop and other palms and vector of

Bursaphelencus cocophilus (Nematoda) etiological agent of Red Ring disease.

Current methods recommended use of enemies and parasites in integrated pest

management of Rhynchophorinae. In addition, mass trap reduce environmental

damage. The objectives of our study on coconut plantations were: (1) to determine

the efficiency of low expensive kariomones traps and (2) low expensive

73

kariomones and pheromones traps using adult males; and (3) to examine R.

palmarum using light and scanning electron microscopy searching for

ectoparasites which can be proposed in integrated pest management. Handmade

kariomones mass traps were efficient to R. palmarum and other Curculionidae

capture but kariomones plus adult male R. palmarum was maintained inside trap

enhanced its attractiveness for this palm weevil and Cosmopolites sordidus

(Coleoptera: Curculionidae). R. palmarum presented eventually fungal infection. In

contrast, mites infested more than 50% of palm weevils. Infestation level was

always high. Surface morphology of the mites and its interactions with R.

palmarum is briefly described. All stages of ectoparasites life cycle were observed

on weevil elytra compartments. In this way, morphological evidences suggest the

hypothesis of mites as a biological control agent in R. palmarum integrated pest

management.

Key words: Coconut palm, Curculionidae, Mites, Light and Electron Microscopy,

Integrated Pest Management.

Introduction

The basic life cycles of Rhynchophorus species were similar. Adult female

weevils are attracted to damaged, stressed, or healthy palms and oviposit 30 to

400 eggs on plants. Larvae bore into the palms and after several instars develop

into adults in about 2 months (Watananpongsiri, 1966; Giblin-Davis et al., 1989).

Rhynchophorus species seek harborage in leaf axils of healthy palms (Weissling

and Giblin-Davis, 1993) R. palmarum and other palm weevil have crepuscular

flight patterns (Rochat, 1987).

Fermented sap exuding from dead or wounded palms is highly attractive to

R. cruentatus (Chittenden, 1902). Moist fermenting tissues from various palm

species, fruits, sugarcane, pineapple are similarly attractive to palm weevils

(Diegado and Moreno, 1986; Giblin-Davis et al., 1994). Early research provided

evidence that general fermentation volatiles, such as ethanol, appeared attractive

to Rhynchophorus weevils (Hagley, 1965). Kairomones include ethyl acetate, ethyl

propionate, ethyl butyrate, and ethyl isobutyrate for different weevil species (Gries

et al., 1994). Studies with Rhynchophorus obscurus provided the first evidence

that males of palm weevils produce male and female-attracting aggregation

pheromones (Chang and Curtis 1972). Subsequently, male-produced aggregation

74

pheromones have been demonstrated for many species in the subfamily

Rhynchophorinae, such as R. palmarum (Moura et al., 1989; Rochat et al.,

1991a,b), R. cruentatus (Weissling et al., 1993), R. phoenicis (Gries et al., 1993),

R. ferrugineus and R. vulneratus (Hallett et al., 1993), M. hemipterus (Giblin-Davis

et al., 1994; Rochat et al., 1993), Cosmopolites sordidus (Budenberg et al., 1993),

Sitophilus spp. (Walgenbach et al., 1983). Ethyl acetate perceived by male R.

palmarum also stimulates pheromone production (Jaffé et al., 1993). Lethal traps

baited only with aggregation pheromones or host kairomones are not very

attractive to palm weevils, but in combination synergize attractiveness 8-20 fold

for R. palmarum (Oehlschlager et al., 1992) and other Rhyncophorinae (Giblin-

Davis et al., 1994; Gries et al., 1993; Hallett et al., 1993; Oehlschlager et al., 1995;

Perez et al., 1994; Perez et al., 1995; Rochat et al., 1995; Weissling et al., 1993,

1994).

It has been demonstrated that many species of the subfamily

Rhynchophorinae are pests of crop and ornamental palms. Rhynchophorus

ferrugineus (Olivier) has been infested in Mediterranean area (Murphy and

Briscoe, 1999; Barranco et al., 2000). Integrated pest management (IPM) based

on pheromone traps, chemical controls and enthomopathogenic nematodes have

been used to save infested date palms. Despite good results of these techniques

in the laboratory, they were not efficient in the field to succeed in eliminating red

palm weevil (Ferry and Gomes, 2002). Since 1921, palm weevils have been

reported as red ring nematode vectors (Ashby, 1921). The coconut palm weevil,

Rhinchophorus palmarum is a pest for Cocos nucifera (Bondar, 1940; Franco,

1964) and several plants of the Arecaceae family and sugarcane. In Brazil, larvae

and adult R. palmarum have been found in nineteen species from Arecaceae

family (Silva et al., 1968). In addition, R. palmarum has been reported as vector of

Bursaphelenchus cocophilus (Nematoda), causal agent of Red Ring disease

(Hagley, 1963; Griffith, 1987).

The term biological control has been applied in a broad sense to cover the

use of any organism to control a pest or pathogen and classical biological control

when any organism has been used to control a pest. Pests almost invariably have

natural enemies or parasites somewhere in their geographic area and introduction

of such enemies or parasites can reduce the size of the pest population (Lucas,

1998). Parasitoid is an organism that is parasite early in its development but that

75

finally kills the host during or at the completion of development; often used in

reference to many insect parasites of other parasites (Schmidt and Roberts, 1989;

Eggleton and Gaston, 1992). Current methods recommended for the management

of Rhynchophorus species have focused on integrated pest management (IPM)

involving surveillance, pheromone lures, cultural control and chemical treatments

(Murphy and Briscoe, 1999).

Few studies have been conducted on the natural enemies of R. ferrugineus

or other Rhynchophorus species within their native ranges has been identified

virus, bacteria, nematodes, insects and mites (Murphy and Briscoe, 1999). Two

mite species, Hypoaspis sp. and Tetrapolypus rhynchophori Ewing (Pymotidae)

have been recorded infesting the adult weevil, but the status of these species as

parasites is uncertain (Peter, 1989). Researchs on the natural enemies of R.

palmarum in the Neotropical Region have only revealed that this weevil is attacked

by members of the parasitic dipteran family, Tachinidae; Paratheresia menezesi

palm (Moura et al. 1993, 1995) and Paratheresia rhynchophorae (Guimaraes et

al., 1977) have been also identified in Brazil as ectoparasites. Three species of

endoparasitic nematodes have been reported but their pathogenicity is unclear

(Gerber and Giblin-Davis, 1990). In addition, it has been suggested that various

potential fungal and bacterial plant and weevil pathogens may contaminate and

affect behavior and population dynamics of palm weevils (Griffith, 1987).

The objectives of our study on coconut plantations were: (1) to determine

the efficiency of low expensive kariomones traps and (2) low expensive

kariomones and pheromones traps using adult males; and (3) to examine R.

palmarum using light and scanning electron microscopy searching for

ectoparasites which can be proposed in integrated pest management.

Materials and Methods

Study site and field experiments

The study was done near Conceiçao de Macabu municipality (22o05’07”S -

41o52’06”W) on the northern of Rio de Janeiro state, Brazil. Experiments were

carried out on three commercial farms, during 2003 (year1) and 2004 (year2).

Phoenix farm total area was 775 ha, 80 ha to coconut plantations, approximately

11,800 plants divided in 3 areas. Saint Anthony farm had 6,500 coconut trees

occupying 45 ha divided in 3 areas and its total area were 300 ha. In Saint Mary

76

farm, 16,000 plants were distributed in 4 areas occupying 107 ha of 350 ha total

area. Cocos nucifera phenotype Green Draft were planted at low density, 8.5 x 8.5

m spacing, approximately 140 plants/ha. Plants age varied between 1 to 15 years

old. The vegetation around coconut plantations was predominantly grasses but

fragments of Atlantic Rain Forest occurred. The soil was clayey. The climate in this

region is warm tropical subhumid with relatively low rainfall and high atmospheric

temperatures. The total annual precipitation was 796.6 mm (2003) and 672.9 mm

(2004) and the mean annual air temperature was about 26oC in 2004.

Insect traps were located in the periphery of coconut plantation areas

(Table 1). They were divided in two groups. Trap type A, white plastic 100 l bucket

presenting 2.5 cm in aperture and containing 4 kg of sugarcane 25 cm long

tablets in 2003 (year1) and 4 kg of sugarcane 25 cm long tablets plus adult male of

R. palmarum in 2004 (year2). Trap type B, transparent plastic 6 l pet bottle for soft

drink presenting 2.2 cm in aperture and containing 250 g of sugarcane 10 cm long

tablets in 2003 (year1) and 250g of sugarcane 10 cm long tablets plus adult male

of R. palmarum in 2004 (year2). Pheromone and insecticides were not used.

Intervals of collect were 15 days. Controls were empty traps.

Photographic data was carried out using a SONY DSC-P93®Cyber-shot

(Sony Corporation, Tokyo, Japan) and images were done at 3.2 megapixels/inch2.

Light microscopy and scanning electron microscopy

For light microscopy, insects were anesthetized at 4 C, during 20 minutes,

and fixed by immersion for 2h at room temperature in 2.5% glutaraldehyde, 4%

formaldehyde in 0.1 M cacodylate buffer, pH 7.2, washed in the same buffer

during 2 hours. Then, insects were dissected and observed in an Axioplan Zeiss

microscope. Images were digitized with a CCD camera ZVS Zeiss (Germany)

controlled by an image analysis system AnalySIS® (Soft Imaging System, Zeiss,

Germany). Similar samples were used for light and electron microscopy.

For scanning electron microscopy, insects were anesthetized as described

above and fixed by perfusion for 2h at room temperature in 2.5% glutaraldehyde,

4% formaldehyde in 0.1 M cacodylate buffer, pH 7.2, washed in the same

buffer, post-fixed in a buffered 1% OsO4 solution for 1h, washed, dehydrated in

acetone series. Then, samples were critical point dried in a Balzer’s apparatus

(CPD 030) and covered with gold - 20 nm - in a Balzer’s apparatus (SCD 050).

Data were carried out at 25 kV in a Zeiss DSM 962 scanning electron microscope.

77

Acarology terms were used in according to Glossary of Terms in Acarology

of University of Illinois at Urbana-Chanpaingn (www.cvm.uiuc.edu, 2005).

Results

Curculionidae were predominant in mass trapping capture. They were

represented by Rynchophorus palmarum and Cosmopolites sordidus. Kariomones

traps presented low effectiveness in R. palmarum capture (Graphic 1), when

compared to traps in which kariomones plus adult male R. palmarum was

maintained inside trap (Graphic 2). Seasonal differences in weevil capture were

not identified. Traps disposed close to Atlantic Forest fragments were the most

effectives. Color trap did not affect capture level. Male and female R. palmarum

distribution in captures was haphazard. C. sordidus were copiously captured and

their number was also most expressive in traps close to Atlantic Forest fragment

border. Non Curculionidae insects were extremely diversified and were not

identified (Graphics 1 and 2).

Male and female R. palmarum presented eventually fungal infection mainly

on its thorax and abdomen articulations (Figure 1). Mites infested more than 50%

of R. palmarum. Ectoparasites occurred occasionally on weevil body but

preponderantly in elytra compartment. Adult mites presented yellow-brown color

(Figure 2) while eggs and nymph instars were translucent (Figures 6 to 9).

Egg, nymph instars and adult mites were observed under elytra (Figures 3

and 5), in both sides of hind wings (Figures 6 to 9) and on dorsal surface of the

coleopterans abdomen. In elytra external surfaces mites were absent (Figure 4).

Adult mites and nymph instars were approximately 3 mm long and were found

mainly in elytra internal surface (Figures 2 and 3). Elliptical eggs measurements

were 30 µm in length and 15 µm in width and were found adhered to both sides of

hind wings (Figures 6 and 7). Some images suggest nymph feeding (Figure 8).

Ecdysis could be detected due exoskeletal ghost presence on hind wings (Figure

9).

External morphology was similar in nymph and adults mites. They

presented bilateral symmetry and body shape was oblong slightly reduced in

anterior region (Figures 10 to 12). Capitulum consisted of pedipalps and

hypostome (Figure 10 to 13). Pedipalps present 6 segments that emerged of basis

capituli (Figure 10) and long setae were present in segment 6. They were

78

visualized extended, partially (Figures 10, 12 and 13) or completely retracted

(Figure 11). In dorsal view, a pair of setae was observed close to anterior

extremity, four setae laterally disposed and a row of three setae in anterior middle

body (Figure 12). Hyposteme was frequently hidden and disposed medially (Figure

13). Legs had 6 segments ending in a claw (Figures 12 and 14). Nymph instars

were not identified. Pedipalps were not fully developed in nymph (Figure 14). This

was the main difference between adults and nymph. They were adhered to insect

surface by stalks that were disconnected during development (Figure 14).

Discussion

Rhynchophorinae weevils are suitable for mass trapping because of their

long life cycle and adult longevity, low fecundity, and reliance on aggregation

pheromones and host kariomones (Oehlschlager et al., 2002). In coconut

plantations, Rynchophorus palmarum and Cosmopolites sordidus were copiously

captured mainly in traps using kariomones plus adult male R. palmarum inside

trap, probably due pheromone liberation. These results confirm previous reports

that sugarcane fermentation volatiles are attractive to palm weevils (Diegado and

Moreno 1986, Giblin-Davis et al., 1994; 1994) and according to Jaffe et al. (1993)

kariomones perceived by this weevil stimulate pheromone production. In addition,

traps baited only with aggregation pheromones or kairomones are not very

attractive to palm weevils, but in combination synergize attractiveness 8-20 fold to

R. palmarumand other Rhynchophorinae (Moura et al., 1989; Rochat et al,.

1991a; Oehlschlager et al,. 2002). C. sordidus capture probably is relates to R.

palmarum male-produced aggregation pheromones is effective for many species

in the subfamily Rhynchophorinae as well as Cosmopolites sordidus (Budenberg

et al., 1993).

The abundance of adult palm weevils is affected by seasonal changes. R.

palmarum populations appear to peak at the end of the rainy season and

throughout most of the dry season in coconut plantations in Trinidad (Hagley,

1963), and in the dry season in oil palm plantations in Brazil (Schuiling and

Dinther, 1981). In Florida, R. cruentatus (Weissling et al., 1994; 1994) is more

abundant in spring, before the onset of the rainy season. Seasonal differences

were not identified of trap capture level of R. palmarum in coconut plantations in

79

Rio de Janeiro state, Brazil. In contrast, the effectiveness of capture was

increased when traps disposed close to Atlantic Forest fragments.

Trap silhouette and color as potential visual cues for foraging palm weevils.

Different trap designs have been tested to optimize capture of palm weevils

(Giblin-Davis et al., 1994; Oehlschlager et al., 1992; 1993; Weissling et al., 1992;

1993). Insect traps baited with 100 l white plastic bucket or baited with 6 l

transparent plastic pet bottle for soft drink presented similar results suggesting that

design and color could not interfere in capture features. These results are

coherent with palm weevil habits previously reported which all color in the human

perceived spectrum is not a critical parameter for R. palmarum (Oehlschlager et

al., 1993). R. palmarum has been captured equally well in ground traps and

suspended traps (Giblin-Davis et al., 1996). Similar results were obtained in this

work.

Continuous mass trapping reduced R. palmarum trap counts over time and

lowered Red Ring disease (RRD) incidence (Chinchilla et al., 1993; Oehlschlager

et al., 1995). There was only one confirmed case of RRD during these

experiments suggesting that low expensive traps using recycled pet bottles and

kariomones plus adult R. palmarum are effective in weevil capture reducing RRD

in coconut plantations and must be considered to facilitate pest management

decisions.

Various potential fungal and bacterial plant and weevil pathogens may

contaminate and affect behavior and population dynamics of palm weevils (Griffith,

1987). It has been demonstrated that Beauveria bassiana cause 100% of mortality

in R. palmarum (Santana and Lima, 1994). In this way, fungal colonization of palm

weevil surface from Rio de Janeiro might represent a potential agent for natural

biocontrol. However, research efforts must be made in this way.

Integrated pest management has been proposed to control pests and

pathogens in coconut crop (Moura et al., 2002). Biological control and classical

biological control have been proposed to control plant pathogens and pests,

respectively. Natural enemies or parasites can reduce the size of the pest

population (Lucas, 1998). Parasitoid and cleptoparasitoid habit might be evolved in

host disease or dead (Eggleton and Gaston, 1990; Eggleton and Belshaw, 1992;

Eggleton and Belshaw, 1993). Studies have been conducted on the natural

enemies of Rhynchophorinae species within their native ranges has been

80

identified virus, bacteria, nematodes, insects and mites (Murphy and Briscoe,

1999). It has been suggested that association of R. palmarum with red ring

nematode and three species of endoparasitic nematodes may affect the

population dynamics of the weevils but their pathogenicity is unclear (Gerber and

Giblin-Davis, 1990; Giblin-Davis, 1993). Two mite species, Hypoaspis sp. and

Tetrapolypus rhynchophori Ewing (Pymotidae) have been recorded infesting the

adult weevil, but the status of these species as parasites is uncertain (Peter,

1989), although Acari have been proposed as a biocontrol agent against insects

(Welbourn and Young, 1988). The studies on the natural enemies of R. palmarum

in the Neotropic have only revealed that this weevil is attacked by members of the

parasitic dipteran family, Tachinidae; Paratheresia menezesi palm (Moura et al.,

1993; 1995) and Paratheresia rhynchophorae (Guimaraes et al., 1977) have been

also identified in Brazil as ectoparasites. Association of R. palmarum with mites

may affect the population dynamics of the weevils and/or its behavior. In addition,

mite life cycle is apparently completed in elytra compartment of R. palmarum. In

this way, morphological evidences presented here suggest mites as weevil

ectoparasites and its use a possible biological control agent for R. palmarum in

integrated pest management.

Acknowledgements

We wish to thank the staff of the Estação Experimental Lemos Maia, Centro

de Pesquisas do Cacau, Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira

(CEPEC/CEPLAC) and Associação dos Produtores Rurais de Santa Maria

(APRUSAM) for their cooperation in this project. This research was supported by

Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico, CNPq.

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de

Janeiro, FAPERJ and Parque de Alta Tecnologia do Norte Fluminense,

TECnorte/FENORTE.

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Legends of the figures

Figure 1 – Rhynchophorus palmarum highly infected by fungus (arrow) mainly in

its articulations. Digital photograph.

Figure 2 – R. palmarum internal surface of elytron. Note adult mites (arrow)

grouped on elytron. Digital photograph.

Figure 3 - R. palmarum internal surface of elytron showing mites nymphae

(black/white arrows), several stalks (white arrow) and mucus (black arrow). SEM.

Figure 4 - R. palmarum external surface of elytron showing parallel striae. Note

surface free of mites. SEM.

Figure 5 - R. palmarum internal surface of elytron showing mites nymphae

(black/white arrows), several stalks (white arrow) on surface. SEM.

Figure 6 – Mite egg measuring approximately 30 µm in length and 15 µm in width

on hind wings. DIC microscopy.

Figure 7 – Hind wing of R. palmarum showing mites nymphae (black/white

arrows), and eggs on its internal surface (white arrows). DIC microscopy.

Figure 8 – Hind wing surface of R. palmarum showing mite nymph (black/white

arrow) with pedipalps adhered in wing surface (black arrows). DIC microscopy.

Figure 9 – Hind wing of R. palmarum showing mites nymphae exoskeletal ghost

(black/white arrow) and nymph on its internal surface (white arrows). DIC

microscopy.

Figure 10 – Frontal view of mite anterior region on R. palmarum elytron. Capitulum

and leg pair 1 can be observed. Note pedipalp completely extended (star) and

partially articulated (open star). Setae can be observed in last pedipalp segment.

SEM.

87

Figure 11 – Lateral view of mite anterior region on R. palmarum elytron. Capitulum

showing pedipalp completely retracted (star). SEM.

Figure 12 – Lateral view of mite nymph on R. palmarum hind wing. Mite body

present elliptical feature. A pair of setae can be observed in anterior dorsum, two

rolls with four setae disposed laterally and one central roll. SE/BSE, SEM.

Figure 13 – Frontal view of mite on R. palmarum hind wing. Capitulum is clearly

observed showing extended pedipalps (arrow) and hyposteme (open arrow).

SE/BSE, SEM.

Figure 14 – Ventral view of mite nymph on R. palmarum elytron. Capitulum (white

arrow) showing differences compared to adult – Figure 13. Note adhesion stalk

(black/white arrow) in posterior region of the nymph. SEM.

88

Graphic 1 – Insect colleted in mass traps type A and B. Year: 2003

I N S E C T N U M B E R - ∑

Column black: Insect Column white: R. palmarum Column gray: C. sordidus

Graphic 2 – Insect colleted in mass traps type A and B. Year: 2004 I N S E C T N U M B E R - ∑

Column black: Insect Column white: R. palmarum Column gray: C. sordidus

0

20

40

60

80

100

120

140

160446

CB CA 10B 10A 9B 9A 8B 8A 7B 7A 6B 6A 5B 5A 4B 4A 3B 3A 2B 2A 1B 1A

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1A 1B 2A 2B 3A 3B 4A 4B 5A 5B 6A 6B 7A

344

174

7B 8A 8B 9A 9B 10A 10B CA CB

89

1 2 25 mm 5 mm

9 1000 µm 8 250 µm

3 2 mm

2 mm 4

6 100 µm

7 100 µm

1 mm 5

90

100 µm 10

200 µm 12 100 µm 13

50 µm 11

100 µm 14

91

O manuscrito abaixo foi elaborado de acordo com as normas editoriais do

periódico Fitopatologia Brasileira, uma revista de circulação internacional editada

pela Sociedade Brasileira de Fitopatologia.

Scanning Electron Microscopy of Wilt Disease in Pea ch Palm [Pupunha] -

(Bactris gasipaes, Kunth).

Flávio Costa Miguens 1,¥, Jorge André Sacramento de Magalhães 1,* and

José Inácio Lacerda Moura 2

92

Scanning Electron Microscopy of Wilt Disease in Pea ch Palm [Pupunha] -

(Bactris gasipaes, Kunth).

Flávio Costa Miguens 1,¥, Jorge André Sacramento de Magalhães 1,* and

José Inácio Lacerda Moura 2

1 – Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, Centro de Biociências e

Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darci Ribeiro.

2 – Estação Experimental Lemos Maia, Centro de Pesquisas do Cacau, Comissão

Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira. Una – Bahia – Brasil.

¥ - Corresponding author present adress: Laboratório de Biologia Celular e

Tecidual, Centro de Biociências e Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte

Fluminense Darci Ribeiro. Avenida Alberto Lamego, 2000 – Parque Califórnia.

28.013-600 – Campos dos Goytacazes – Rio de Janeiro – Brasil. Telephone and

fax number: 55.22.27261514 - flavio@uenf.br

* Bolsista FENORTE/TECNORTE - Parte da Tese de Doutorado, UENF Darcy

Ribeiro (2005).

Abstract

Pupunha or Peach palm - B. gasipaes subsp. utilis - has been cultivated in

anthropomorphic and agroforestry systems. It has been proposed that cultivated

pupunha had multiple origins, resulting from the synthesis of independently

93

domesticated ancestral in Central and Latin America. Heart-of-palm and fruits has

been the most important uses of B. gasipaes which is perennial for both heart-of-

palm and fruits. Palms have been planted at 3,000 to 20,000 plants/ha for heart-of-

palm extraction and 400 to 500 plants/ha fruit production. Generally begins

flowering after 3 to 5 years and may produce fruit crops for 50-70 years. The most

common pathogens of B. gasipaes have been fungi. Diseased and health

spineless phenotype palms origin were collected that displayed wilt symptoms

resembling those of Phytomonas wilt or Red Ring diseases were collected from

Lemos Maia experimental station, CEPEC/CEPLAC, Una, Bahia, Brazil. The

present investigations were undertaken to investigate the etiological agent of this

disease using scanning electron microscopy. External symptoms were leaves

crow wilt from main stem in diseased palms and absent in healthy palm. Offshoots

were always healthy.

Additional keywords: Peach Palm, Bactris gasipaes Kunth, Lethal wilt, Scanning

Electron Microscopy

Resumo

Microscopia Eletrônica de Varredura de Murchas em P upunha [Peach Palm]

- (Bactris gasipaes, Kunth).

Pupunha ou em inglês, peach palm - B. gasipaes subsp. utilis – tem sido

cultivada em ambientes impactados antropomorficamente ou em sistemas

agroflorestais. Tem sido proposto que a pupunha teria múltiplas origens,

resultando da síntese da domesticação independente de ancestrais da América

Central e Latina. Palmito e frutos têm sido os mais importantes usos de B.

gasipaes que e perene para ambos propósitos. A densidade de cultivo tem sido

94

3.000 a 20.000 plantas/ha para extracao de palmito e 400 to 500 plantas/ha para

produção de frutos. A floração geralmente ocorre entre o 3º. e 5º. ano e as

palmeiras produzem frutos por 50-70 anos. Os patógenos mais comuns de B.

gasipaes tem sido fungos. No entanto, pupunhas que apresentavam sintomas de

murchas bióticas, semelhantes aos de murcha de Phytomonas ou Anel Vermelho

foram identificadas na Estação Experimental Lemos Maia,

EELM/CEPEC/CEPLAC, Una, Bahia, Brasil. O presente trabalho foi desenvolvido

visando caracterizar os sintomas e o agente etiológico da doença. B. gasipaes -

fenótipo sem espinho - doentes e saudáveis foram coletadas na EELM e

analisadas por microscopia eletrônica de varredura. A sintomatologia externa foi

murcha, amarelecimento e, posterior, bronzeamento da coroa de folhas. Sintoma

presente nas plantas doentes e ausente nas sadias. Perfilhos sempre

apresentavam-se com aspecto saudável.

Palavras-chave adicionais: Pupunha, Bactris gasipaes Kunth, Murcha Fatal,

Microscopia Eletrônica de Varredura

Introduction

Agricultural research has been traditionally focused on the commodity

crops, while relatively little attention to minor crops, including Pupunha - Brazilian

common name, or Peach Palm, the most usual English name (Mora-Urpi et al.,

1997). In pre-Colombian times, B. gasipaes, including sub-species, geographical

distribution was wide, extending from central Bolivia to northeastern Honduras and

from the month of the Amazon River and Guyanas to the Pacific coast of Ecuador

and Colombia (Arroyo & Mora-Urpi, 1996). Wild type, B. gasipaes subsp.

speciosa, occurs mainly in disturbed natural ecosystems while cultivated type, B.

95

gasipaes subsp. utilis, occurs often in anthropomorphic systems (Huber, 1904;

Clement & Mora-Urpi, 1987) as often as agroforestry systems (Clement, 1989). It

has been proposed that cultivated B. gasipaes had multiple origins, resulting from

the synthesis of independently domesticated ancestral in Central and Latin

America (Mora-Urpi, 1984, 1993; Arroyo & Mora-Urpi 1996). The cultivated

pupunha has been correctly referred to as Bactris gasipaes Kunth (Uhl &

Dransfield, 1987) and was a complex of diverse landraces (Mora-Urpi et al., 1997).

Heart-of-palm and fruits has been the most important uses of B. gasipaes (Blanco-

Metzler et al., 1992) and was easy to cultivate in agroforestry system (Mora-Urpi et

al., 1997). B. gasipaes is perennial for both heart-of-palm and fruits and in

agriculture has been planted at 3,000 to 20,000 plants/ha for heart-of-palm

extraction and 400 to 500 plants/ha fruit production. Generally begins flowering

after 3 to 5 years and may produce fruit crops for 50-70 years (Clement, 1989;

Mora-Urpi et al., 1997).

There are now germoplasm bank at experimental stations in Brazil

Colombia, Costa Rica, Ecuador, Nicaragua, Panama, Peru and Venezuela. Most

of these are located within the natural range of cultivated B. gasipaes, except

those in Sao Paulo and Bahia, Brazil. In 1993, germoplasm bank was established

at Lemos Maia experimental station, CEPEC/CEPLAC, Una, Bahia. Spineless

phenotype palms origin was Bolivia, Brazil, Colombia and Costa Rica and its

current conditions have been considered good (Mora-Urpi et al., 1997). Heart-of-

palm production in Brazil has been produced mainly in the states of Acre, Para,

Bahia, Espirito Santo and Sao Paulo with, at least, 6,000 ha planted as of 1996

(Bovi, 1997).

96

The most common pathogens of B. gasipaes have been fungi. Yellow spot

– Pestaliopsis spp., Brown spots – Mycosphearella spp, Ring spot Deschlera

(Bipolaris) incurvata - and Cork vein – Fusarium moniliformae, have been

described affecting its leaves. Spear rot fungus – Phytophthora palmivora, Spear

rot bacteria, Erwinia chrysantemi, has been shown infecting stems (Mora-Urpi et

al., 1997). Although, Red Ring disease has been reported after artificial

inoculations of nematodes, Bursaphelenchus cocophilus (Victoria, 1979). Stem rot

of peach palm caused Phytophthora palmivora has been recently reported in

Paraná (Santos et al., 2004), Para (Benchimol el al., 1998), Pernambuco (Tavares

et al., 1998) and São Paulo (Pizzinatto et al., 2002) states, Brazil. On the other

hand, this pathogen affects others Arecaceae plants. Black pod disease is an

important illness of cacao (Theobroma cacao L.), caused by P. palmivora

occurring in Brazil (Faleiro et al., 2004) and worldwide (Tahi et al., 2005).

Recently plant samples of pupunha (B. gasipaes) that displayed wilt

symptoms resembling those of Phytomonas wilt or Red Ring diseases were

collected from Lemos Maia experimental station, CEPEC/CEPLAC, Una, Bahia,

Brazil. These infections have not been identified and never examined. The present

investigations were undertaken to investigate the etiological agent of this disease

using scanning electron microscopy.

Materials and methods

Study site and plant material

The study was done in germoplasm bank established at Estação

Experimental Lemos Maia EELM/CEPEC/CEPLAC, that was established in 1993.

This institution was near Una municipality (15o18’00”S - 33o05’00”W) on the

97

southeastern of Bahia state, Brazil. The vegetation around the EELM was typical

Atlantic Rain Forest. The soil was clayey. The climate in this region is warm

tropical humid to subhumid with relatively high rainfall and high atmospheric

temperatures. The total annual precipitation was 2045.8 mm and the mean annual

air temperature was about 28oC in 2004.

B. gasipes spineless phenotype were planted at low density, 5 x 5 m

spacing, approximately 400 plants/ha. Plants were 10 years old and stem 8-10 m

long. Four palms presenting wilt symptoms and one healthy plant were collected.

Leaflets, rachis, stems and roots from diseased and healthy plants were examined

under differential interferential microscopy (DIC) for laboratorial diagnostic in an

Axioplan Zeiss microscope. Similar samples were used for scanning electron

microscopy. Photographic data were carried out analogically using Kodacolor®400

ASA and digitally in a Sony DSC-P93®, 3.2 megapixels.

Palms and offshoots were transversely sectioned upward and downward,

10 to 10 cm, from stem/crow interface to laboratorial diagnostic and scanning

electron microscopy.

Scanning electron microscopy

For scanning electron microscopy, samples were fixed for 2h at room

temperature in 2.5% glutaraldehyde, 4% formaldehyde in 0.1 M cacodylate buffer,

pH 7.2, washed in the same buffer, post-fixed in a buffered 1% OsO4 solution for

1h, washed, dehydrated in acetone series. Then, samples were critical point dried

in a Balzer’s apparatus (CPD 030) and covered with gold - 20 nm - in a Balzer’s

apparatus (SCD 050). Data were carried out at 25 kV in a Zeiss DSM 962

scanning electron microscope.

98

Results

The majority of ten years old B. gasipes spineless phenotype was

asymptomatic presenting one main stem and maintained with 6 to 7 offshoots.

Symptomatic peach palms were clearly affected in adult stem and offshoots were

apparently not infected (Figure 1). Morphological symptoms reflected disease

degree. Firstly, palms showed yellowing of oldest leaves. Subsequently, these

leaves became desiccated and turning brown and their rachis break frequently

near or at same distance for the base (Figure 2). Disease proceeded gradually

with older leaves turning browning and younger leaves became successively

symptomatic. At last stage of disease development, crows were completely

affected and the first leaf remained erect but yellowing (Figure 3). Then, the first

leaf turning browning and, finally, palms were dead. Dead palms always present

asymptomatic offshoots (Figure 1). In transverse sections of apical stem, necrotic

regions were found. These lesions were absent in firstly stages of disease

development. External and internal symptoms did not show a clear relationship.

Laboratorial diagnostics were negative to Phytomonas staheli

(Trypanosomatidae) and Bursaphelenchus cocophilus (Nematoda). Yeast and

bacteria were found in palms extracts from peach palms presenting high infection

degree (data not shown).

Vascular bundles were randomly distributed in roots, stems and rachis.

They had 2-8 metaxylem vessels and a variable number of protoxylem vessels.

Phloem elements were surrounded by vascular parenchyma. Vascular bundles

were limited by sclerenchyma tissue (Figure 4). Parenchyma lesions were only

observed in diseased peach palms.

99

Hyphae networks were mainly observed in xylem vessels (Figures 5 to 7),

parenchyma tissues (Figures 8 to 11) and rarely in sieve elements (Figure 14) of

peach palms basal crows and apical stem. There was a decrease of fungal

colonization upward and downward from stem/crow interface. Leaflets, apical

rachis, stems 30 cm below stem/crow interface, and roots did not show fungal

hyphae.

Mycelia were composed by strongly ramified hyphae with 2.5 µm in wide

(Figure 9). They were found in rachis, meristem and apical stem but absent in

leaflets and inflorescences. Fundamental parenchyma of diseased plants revealed

lesions and fungal network presence (Figures 10 and 11). Secondary infections

were not identified in necrotic lesions. Hyphae networks were not detected in roots

and offshoots of diseased palms or healthy palms.

Mycelia networks could be observed in protoxylem (Figure 5), metaxylem

(Figures 6 and 7) and vascular parenchyma (Figure 11) of diseased peach palms.

Parenchymatic lesions of diverse aspects and diameters were observed in

diseased plants. Apparently, infection level varied in according of diseased

degree, in both vascular parenchyma or vessels elements.

Fibrils measuring 70 nm in mean diameter were observed in sieve elements

of peach palms in last stage of illness (Figure 13). Fungal hyphae were identified

inside sieve elements of rachis, stem meristem and stem vascular bundles of

these plants (Figure 14).

Discussion

Wilting diseases are usually irreversible and can play a variety of symptoms

but, as the name suggest, wilting due water stress is their most characteristic

100

feature. Vascular wilt pathogens are characterized by their ability to invade

vascular system and became systematically distributed via symplast or apoplast to

all parts of the plant. In Arecaceae (Palmae) plants, wilt diseases are caused

symplast pathogens as well as phytoplasmas (for review: Lee et al., 2000) and

Phytomonas staheli (for review: Camargo, 1999) and apoplast pathogens such as

Fusarium oxysporum (Mepsted et al., 1995) and plant parasite nematode,

Bursaphelenchus cocophilus (Giblin-Davis et al., 1989; Griffith, 1987). Although,

southeast of Bahia state has been considered endemic area for Hatrot, caused by

P. staheli, and Red Ring disease, B. cocophilus (Moura et al., 2002). However,

Fusarium, Trypanosomatidae and Nematoda parasites were never detected in

laboratorial diagnostic or scanning electron microscopy of peach palm diseased

plants. In contrast, mycelia were always found in diseased plants and its affected

organs. In this way, our results suggest a circumstantial evidence to a fungal

disease, although a fungus has not yet been identified.

Phytophthora contains some of the world’s most important and destructive

plant pathogen. Phytophtora palmivora has been reported affecting B. gasipaes in

Brazil (Benchimol el al., 1998; Pizzinatto et al., 2002; Santos et al., 2004; Tavares

et al., 1998). Black pod disease is an illness of cacao (Theobroma cacao L.),

caused by P. palmivora occurring in Brazil (Faleiro et al., 2004) and worldwide

(Tahi et al., 2005). Bahia state is a traditional center of cacao crop production,

including Una municipality. In addition, there are at the Estacao Experimental

Lemos Maia intercropping of cacao, Theobroma cacao L., cupuacu, Theobroma

grandiflorum L., and coconut or oil palms. These plants could be reservoir or

source of pathogens.

101

The current classification system in Phytophthora relies mainly on

morphology of the sporangium and gametangia, with species being separated into

six morphologically defined groups (Waterhouse et al., 1983). Unfortunately,

sporangium and zoospore were not yet detected by light and electron microscopy

this study of wilt peach palm.

The fungi that cause vascular wilts usually invade the xylem vessels of

plants. However, spread into all tissue of the plant organs and infect either by

growing directly through the cells as an intracellular mycelium or by growing

between the cells as an intercellular mycelium (Agrios, 1997). Scanning electron

microscopy of diseased peach palms revealed intercellular and intracellular

mycelium, including sieve elements of the phloem.

In conclusion, we believe that wilt disease of B. gasipaes is a fungus

disease that infects mature palm stem/crows interface, then colonizes upward and

downward the parenchyma, vascular bundles vessels and parenchyma and

eventually sieve elements. Researches should be carried out in order to accurate

fungus identification and to elucidate why offshoots of diseased palm are not

affected.

Acknowledgements

We wish to thank the staff of the Estação Experimental Lemos Maia, Centro

de Pesquisas do Cacau, Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira

(CEPEC/CEPLAC) for its cooperation in this project. This research was supported

by Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico, CNPq.

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de

102

Janeiro, FAPERJ. Parque de Alta Tecnologia do Norte Fluminense,

TECnorte/FENORTE.

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104

Legends to the figures

Figure 1 – Partial view of peach palm spineless phenotype from germoplasm bank

at Estação Experimental Lemos Maia EELM/CEPEC/CEPLAC. Diseased palm

(open arrow) surrounded by healthy plants. Note healthy offshoots (arrow) of

diseased palm.

Figure 2 – Peach palm at intermediary stage of wilt disease. Note browning of

oldest leave (arrow), rachis break (open arrow) and initial yellowing of young

leaves.

Figure 3 – Peach palm at last stage of wilt disease. Note browning of leaves and

yellowing of first leaf (open arrow).

Figure 4 – Transverse section of stem meristem from healthy peach palm.

Vascular bundles surrounded by fundamental parenchyma. Xylem and phloem

vessels enclosed in vascular parenchyma and limited by sclerenchyma arcs. Note

absence of lesions or mycelia network. SEM.

Figure 5 – Transverse section of stem meristem from peach palm at intermediary

stage of wilt disease. Vascular bundles surrounded by fundamental parenchyma.

Metaxylem without fungal hyphae while protoxylem vessels (arrow) were infected.

SEM.

Figure 6 – Transverse section of rachis from peach palm at last stage of wilt

disease. Vascular bundles surrounded by fundamental parenchyma. Metaxylem

and protoxylem vessels (arrow) presenting mycelia network. SEM.

Figure 7 – High magnification of transverse section of rachis from peach palm at

last stage of wilt disease. Metaxylem vessels presenting fungal hyphae (arrow).

SEM.

105

Figure 8 – Longitudinal section of stem meristem from peach palm at intermediary

stage of wilt disease. Mycelia (arrow) network on vascular parenchyma cells (pc).

SEM.

Figure 9 – Longitudinal section of stem meristem from peach palm at intermediary

stage of wilt disease. Ramified fungal hyphae with 2.5 µm in wide. SEM.

Figure 10 – Transverse section of rachis from peach palm at intermediary stage of

wilt disease. Vascular bundles surrounded by fundamental parenchyma. Note

lesion in fundamental parenchyma presenting mycelia network (open arrow). SEM.

Figure 11 – Transverse section of rachis from peach palm at last stage of wilt

disease. Large lesion of fundamental parenchyma presenting mycelia network

(open star). SEM.

Figure 12 – Transverse section of stem meristem from peach palm at initial stage

of wilt disease. Vascular bundles (open star) surrounded by fundamental

parenchyma (P). Note mycelia network surrounded by parenchyma cell walls

(open arrow). SEM.

Figure 13 – Transverse section of rachis from peach palm at last stage of wilt

disease. Fibrils inside sieve element. SEM.

Figure 14 – Transverse section of rachis from peach palm at last stage of wilt

disease. Sieve element showing mycelia network (arrow). SEM.

106

4

5

6

200 µm

200 µm

200 µm

50 µm 7

2 1 3

107

50 µm 8

10

12

9

14 13

11 50 µm

200 µm

200 µm

10 µm

10 µm

1 µm

PC PC

108

O manuscrito abaixo foi elaborado de acordo com as normas editoriais do

periódico Journal of Phytopatology, uma revista de circulação internacional

editada por Blackwell Publising Ltd., UK.

A Light and Electron Microscope Study of Coconut Tr ee, Cocos nucifera L.

(Arecaceae), affected by Phytoplasmas.

Flávio Costa Miguens¥, Viviane Rossi Goebel, Maura da Cunha

and Jorge André Sacramento de Magalhães

109

Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, Centro de Biociências e Biotecnologia,

Universidade Estadual do Norte Fluminense Darci Ribeiro.

A Light and Electron Microscope Study of Coconut Tr ee, Cocos nucifera L.

(Arecaceae), affected by Phytoplasmas.

Flavio Costa Miguens ¥, Viviane Rossi Goebel, Maura da Cunha

and Jorge Andre Sacramento de Magalhaes

¥ - Corresponding author present adress: Laboratório de Biologia Celular e

Tecidual, Centro de Biociências e Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte

Fluminense Darci Ribeiro. Avenida Alberto Lamego, 2000 – Parque Califórnia.

28.013-600 – Campos dos Goytacazes – Rio de Janeiro – Brasil. 55.22.27261514

- flavio@uenf.br

Additional author e-mail address: maura@uenf.br

This research was supported by Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico

e Tecnológico, CNPq. Fundacao Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do

Estado do Rio de Janeiro, FAPERJ. Parque de Alta Tecnologia do Norte

Fluminense, TECnorte/FENORTE.

Abstract

Phytoplasmas are pleiomorphic structures, morphologically resembled

animal mycoplasmas and have been associated with plant yellows diseases.

Lethal Yellowing disease affects coconut trees and other palms. The present

investigations were undertaken to morphological characterization of Lethal Yellow

disease in C. nucifera. External symptoms were upwards yellowing and wilting

leaves diseased plants and lower leaves eventually turning brown. First leaf was

always wilting. Nutfall was partial and necroses were not observed. Light

microscopy shown no difference between inflorescence leaflets, petiole and

meristem anatomy of healthy and diseased plants. In electron microscopy, there

110

were no clear morphological differences in the xylem and phloem of infected and

uninfected plants. Phytoplasmas were never observed in vessel elements. They

occurred in variable density only in the sieve tube elements. Phytoplasmas were

rounded structures limited by single membrane without cell wall. Cytoplasm was

electron-lucent and did not show membrane limited organelles. Their diameters

vary between 180 and 820 nm. Occasionally, elliptical structures were also

observed. Callose apposition was eventually observed but cell wall alterations

were not identified. In conclusion, this study presents structural evidences for the

association of Phytoplasma - Lethal Yellowing disease – with coconut palm wilt in

Brazil.

Key words: Lethal Yellowing disease, Cocos nucifera L., Phytoplasmas, Light

microscopy, Transmission and Scanning Electron Microscopy.

Introduction

Phytoplasmas were discovered by electron microscopy, in 1967, inside the

sieve tubes of plants affected by various yellows diseases (Doy et al., 1967). They

are Eubacteria of the class Mollicutes, phylogenetically related to the Gram-

positive bacteria with small genomes and low G+C content and the absence of a

cell wall (Weisburg et al., 1989; Lee et al., 2000). Phytoplasmas have been found

to be associated with more than 300 plant diseases, usually known as yellows,

phyllody or witches’ broom diseases (McCoy et al., 1989). Phytoplasmas

taxonomic system has been resulted from the development and use of molecular

methods. These and other recent advances are laying the foundation for future

progress in understanding the mechanisms of phytoplasma pathogenicity (Lee et

al., 2000). They are pleiomorphic structures, morphologically and ultrastructurally

resembled animal mycoplasmas (Garnier et al., 2001) that appear as rounded

membrane limited structures with an average diameter ranging from 200 to 800

nm (Lee et al., 2000). A filamentous morphology for phytoplasma has been

reported using electron microscopy, including in coconut palm (Waters and

Osborne, 1978; Haggis and Sinha, 1978; Lee and Davis, 1992).

In plants, Phytoplasmas induce diverse and severe symptoms including leaf

yellowing, stunting, short internodes, proliferations, flower malformations and

sterility, fruit size reduction and deformations. Histological studies showed that

some phytoplasmas induced anatomical and ultrastructural aberrations such as

111

callose deposit on the sieve plates, followed by the collapse of sieve elements,

while others affected phloem differentiation by increasing or decreasing numbers

of sieve elements (Garnier et al., 2001).

To infect a plant, mycoplasmas need an insect vector sucking phloem sap

from sieve tubes and, probably, each phytoplasma or spiroplasma is transmitted

by specific insect species (Lee and Davis, 1992). Mycoplasmas are acquired by

insects when feeding on infected plants and, to be transmitted, the mycoplasmas

need to multiply in the vector. For this, they cross the intestine mid-gut, then

multiply in the hemolymph and subsequently infect other organs including the

salivary glands. Only when they have reached the salivary glands can they be

inoculated into a plant, as part of the saliva needed to lubricate the mouth parts

during food uptake. Such a cycle takes 15–20 days. No pathological effects are

associated with mycoplasmas multiplication within the insects. Infected insects

remain infectious for their whole life (Garnier et al., 2001).

Coconut palm - Cocos nucifera L. (C. nucifera) Arecaceae - is one of the

most important crops throughout the tropics (Ohler, 1999). It was introduced into

Brazil during Portuguese colonial times in the 16th century. Several varieties were

reintroduced during 20th century and coconut plantations in Brazil occupy

approximately 260,000 hectares (Ferreira et al., 1998). Lethal Yellowing (LY)

disease symptoms on coconut palms show many similarities independent of

ecotype. The first symptoms are premature nutfall followed by the blackening of

emerging inflorescences. This is followed by discoloration (yellowing) and necrosis

of fronds that usually starts with the oldest (lowermost) leaves and progresses to

the younger ones until finally the palm dies within 3–6 months after the onset of

symptoms (Beakbane et al., 1972; Waters and Osborne, 1978; Jones, 1997). The

area of origin of the pathogen is not known. There are two hypotheses, that lethal

yellowing comes from the area of origin of coconuts in Southeast Asia or that

lethal yellowing is Caribbean in origin (Howard, 1983). LY disease and its vector

present the same geographical distribution. They have been reported Africa, Asia,

North America – Mexico, Florida and Texas – Central America and Caribbean but

absent in European and Mediterranean Plant Protection Organization region. In

South America, there is an unconfirmed LY case in Guyana (CABI/EPPO, 1990).

Coconut plantations in Mexico have been devastated by LY disease

vectored by Myndus crudus Van Duzze (M. crudus) (Homoptera:Cixiidae)

112

(Howard, 1983, 1995). In Cuba, LY has been recognized for more than 100 years.

An epidemic outbreak of LY in the 1960’s killed the majority of plants and between

1985 and 1990 the disease destroyed the criollo coconut type cultivation, in

Niquero and Pilon respectively (Llauger et al., 2002). In Jamaica, 1979,

experimental data suggests that almost total destruction of a population of

susceptible palms can occur. An estimated 4 million coconut palms had been

killed by palm lethal yellowing disease on the island. In Florida, out of an estimated

1-1.5 million C. nucifera on the mainland, 300 000 had died by 1983 (CABI/EPPO,

1990).

Light and electron microscope methods have been used to detect

phytoplasmas diseases and describe plant structural alterations (Zaim and

Samad, 1995; Lherminier et al., 1999; Siddique et al., 2001; Chapman et al., 2001;

Kaminska et al., 2001; Castro and Romero, 2002; Loi et al., 2002, Cordova et al.,

2003; Musetti and Favali, 2003; Chang et al., 2004; Favali et al., 2004; Poghosyan

et al., 2004). The present investigations were undertaken to characterization of

Lethal Yellow disease in C. nucifera using light and electron microscopy methods.

This is the first study of naturally infected phytoplasma diseases of coconut trees

in Brazil.

Material and methods

Study site and plant material

The study was done in commercial plantations that were established in

2000/2001. This plantation was near Sao Joao da Barra municipality, 21o38’25”S -

41o03’04”W (Garmin®GPS 12, software 4.03 – Garmin Europe Ltd, Unit 5, The

Quadrangle, Abbey Park Ind. Estate, Romsey, U.K. S051 9AQ) on the north coast

of Rio de Janeiro. The vegetation around the plantations was typical of the coastal

dunes, is dominated by species of grass (Poacaea). The soil was sandy. The

climate in this region is warm tropical subhumid with relatively low rainfall and high

atmospheric temperatures. The total annual precipitation was 827.8 mm (2001),

571.0 mm (2002), 796.6 mm (2003) and 672.9 mm (2004) and the mean annual

air temperature was about 26oC (EMBRAPA, 2005).

Plants were 1,500 C. nucifera ecotype Green Dwarf, which 19 present LY

external symptoms. Photographic data was carried out using a SONY DSC-

P93®Cyber-shot (Sony Corporation, Tokyo, Japan) and images were done at 3.2

113

megapixels/inch2. Fresh extracts from leaflets, basal petioles, inflorescences and

stem meristem from 3 diseased plants and 3 healthy plants were examined under

differential interferential microscopy (DIC) for laboratorial diagnostic in an Axioplan

Zeiss microscope (Zeiss Oberkohen, Germany). Extracts and fragments of these

palms were used for light and electron microscopy.

Light and electron microscopy

For light and electron microscopy, samples were fixed for 2h at room

temperature in 2.5% glutaraldehyde type II (Merck, Germany), 4% fresh

formaldehyde (Sigma/Aldrich, Inc., Steinheim, Germany) in 0.1 M sodium

cacodylate buffer (EMS, Washington, PA, USA), pH 7.2, washed in the same

buffer, post-fixed in 1% OsO4 (Sigma/Aldrich, Inc. Steinheim, Germany) diluted in

the same buffer for 1h, washed, dehydrated in acetone (Merck, Germany) series

and embedded in low viscosity resin (Spuur, 1969) (Sigma Chemical Co, St

Louis, Mo, USA). For light microscopy, semi-thin sections (~1µm) were made with

glass knives in ultramicrotome Reicherts Ultracut (Wien, Austria) were obtained

from the same material used for transmission electron microscopy. Sections were

stained in 1% toluidine blue (Merck Co Inc., Whitehouse Station, NJ, USA) and

observed in a Zeiss Axioplan microscope. Images were digitized with a CCD

camera ZVS Zeiss (Germany) controlled by an image analysis system AnalySIS®

(Soft Imaging System, Zeiss, Germany). For transmission electron microscopy,

ultra-thin sections (90-120 nm) were carried out in ultramicrotome Reicherts

Ultracut (Wien, Austria) and stained in 0.5% uranyl acetate (Sigma/Aldrich, Inc.

Steinheim, Germany) in aqueous solution for 30 min and in lead citrate

(Sigma/Aldrich, Inc. Steinheim, Germany) for 5 min and observed under a Zeiss

EM 900 transmission electron microscope.

Negative contrast was performed in extracts of basal petiole and stem

apical meristem of same plants with phosphotungstic acid (Ted Pella Inc, Redding,

Ca, USA) or uranil acetate (Sigma/Aldrich, Inc. Steinheim, Germany) aqueous

solution. Samples were observed in a Zeiss EM 900 transmission electron

microscope (Zeiss Oberkohen, Germany).

For scanning electron microscopy, samples fixed and dehydrated as

described above were critical point dried in a Balzer’s (Baltec Limited,

Liechtenstein) apparatus (CPD 030) and covered with gold - 20 nm - in a Balzer’s

(Baltec Limited, Liechtenstein) apparatus (SCD 050). Extracts of basal petiole and

114

stem apical meristem of same plants were adhered in glass slides with poly-L-

lysine (Sigma/Aldrich, Inc. Steinheim, Germany) and treated as described above.

Data were carried out at 25 kV in a Zeiss DSM 962 scanning electron microscope

(Zeiss Oberkohen, Germany).

Results

Yellowing symptoms in nineteen affected coconut trees were expressed an

upward leaves wilt. Subsequently, the 4-6 oldest leaves turned yellow. The lower

leaves eventually turned brown. First leaf was always wilting. Nutfall was partial

(Figure 1). Necroses were not observed in any organ or stem meristem. Cross-

sections of the roots and stems did not shown altered coloration (Figure 2). Plants

usually die in 6 months of initial symptom expression. Unopened and young

inflorescences of diseased palms showed unaltered morphology (Figure 3) but

mature inflorescences were always brown (Figure 1).

Laboratorial diagnostics were negative for yeast, protozoa and nematodes.

However, one diseased plant presented bacteria secondary infection (data not

shown). Raphides and starch granules were present always in fresh extracts.

Light microscopy shown no difference between healthy and diseased

(Figure 4, 5, 7 and 9) plants. In both, leaflets presented dorsiventral feature

(Figure 4). Adaxial epidermis cells were cubic and had vacuole stained by toluidine

blue, probably tannin. Cells of the hypodermic layers showed parenchymatic

aspect without chloroplasts. Mesophyll was composed of 2-3 layers of columnar

palisade parenchyma cells. It also had 3-4 layers of irregular spongy parenchyma

cells. Palisade and spongy parenchyma cells presented several chloroplasts and

conspicuous vacuoles that could be easily recognized and occupied up to 80% of

the cell volume (Figure 4). In all coconut leaflets analyzed, the vascular system

was collateral and vascular bundles were surrounded by strengthening tissue,

forming a bundle sheath of lignified fibers. The xylem consisted of 1-2 elements of

metaxylem and 4-8 of protoxylem. The phloem was formed by sieve tube

elements, usually associated with two companion cells and a variable number of

parenchyma cells (Figure 5 and 6). The sieve tube elements had their sieve area

at the lateral and terminal cell wall. The sieve plates had pore diameters of

approximately 0.5 µm - 1.0µm. Vascular bundles were randomly distributed in

rachis and stem presenting 1-4 elements of metaxylem and 4-12 of protoxylem

115

and sieve tube elements, usually associated with two companion cells and a

variable number of parenchyma cells (Figure 9). Epicuticular wax is present in

adaxial and abaxial leaves surface surfaces of health and diseased plants (Figures

4 and 7). Raphids were observed inside vacuole of crystalliferous idioblasts

(Figure 5). Stomata apparatus were tetracytic presenting two stomatic cells and

two subsidiary cells. Fungal hyphae were never detected in healthy and diseased

plants (Figure 7) in stomata pores or substomatic cavities. Peltate trichomes

occurred in abaxial surface. Leaflets surfaces and trichomes did not show any

pathogen signal (Figure 8).

There were no morphological differences in the xylem and phloem of

infected and uninfected plants. Phytoplasmas were never observed in vessel

elements (data not shown). Phytoplasma occurred in variable density in the sieve

tube elements, and seems to be confined to them (Figures 10-12). In infected

plants, phytoplasmas and electrondense structures were frequently observed in

sieve elements (Figures 11 and 12). Callose appositions were rarely identified. P-

protein like fibrils were dispersed throughout the sieve element in uninfected and

infected plants (Figure 13). Undeveloped sieve tube elements showed

phytoplasma infection and paracrystalline electrondense structures (Figures 14

and 15).

Phytoplasma were mainly rounded structures limited by single membrane

without cell wall (Figure 15). Cytoplasm was electron-lucent and did not show

membrane limited organelles (Figures 10 to 12). Diameters of rounded structures

vary between 180 nm to 820 nm. Occasionally, elliptical structures were also

observed presenting variable measurements. The longest was 1400 nm in length

and the smallest width was 300 nm (Figure 20).

Extracts from apical meristem, inflorescences and leaflets of symptomatic

coconut palms examined in TEM (Figure 15) and SEM (Figures 16 and 17)

consistently revealed the presence of rounded pleiomorphic. These structures

were not observed in tissue extracts or tissue sections of several asymptomatic

coconut palms used as controls. Starch granules and raphids were frequently

identified.

Phytoplasmas were vascular pathogens occurring only inside sieve tube

elements and infection degrees vary strongly. Yellow older leaves presented high

infection level (Figure 18) presenting sieve elements fully of phytoplasmas

116

(Figure 19) while green leaves of the same palm usually presented low infection

level with few numbers of pathogens in sieve elements (Figure 20). Browning

leaves were always dead and pathogens were not identified. Similar infection

degree was found in other organs of all diseased palms.

Discussion

Several research approaches has been proposed for understanding the

mechanisms of phytoplasma pathogenicity (Lee et al., 2000). Light and electron

microscopy has been elegant and precise tools to study plant microbe interactions

and micoplasmalike organism were related to plant yellows diseases using

electron microscopy (Doy et al., 1967). Scanning electron microscopy has been

used for phytoplasma diagnostic in Carica papaya, L. They were rounded

structures 400-1600 nm in diameter and occurred only in phloem sieve elements

of diseased papaya plants (Poghosyan et al., 2004). In C. nucifera, phytoplasmas

were described as pleiomorphic filamentous bodies (Walters and Osborne, 1978).

In this study, phytoplasmas were predominantly detected as rounded structures

with diameter varying between 180 nm to 820 nm but elliptical bodies were also

identified in sieve elements of diseased palms.

In situ hybridization (ISH-TEM) using oligodeoxynucleotides as probes for

labelling of phytoplasmas in plant tissue showed pathogen in the lumen of sieve

tubes and moving through phloem sieve plate in experimental phytoplasma

infections of Catharantus roseus L. (Lherminier et al., 1999). Although,

phytoplasmas have identified close to sieve plate in coconut tree phloem traffic on

sieve plate was not detected.

In Little Leaf Disease of Brinjal (Solanum melongena L.) and Periwinkle (C.

roseus), has been described that phytoplasma distribution within the same

vascular bundle is irregular, some sieve cells were fully packed whereas others

were almost empty. The cell content of putative phytoplasmas was also variable

from one to another within the same infected sieve element (Siddique et al., 2001).

Coconut palm phloem showed similar phytoplasma distribution. However, our

results suggest that content of phytoplasmas could maintain a relationship with its

plant colonization.

Difficulties in demonstrating the presence of phytoplasmas in diseased

roses and experimentally infected plants by direct PCR and by electron

117

microscopic techniques may indicate that phytoplasma number in these hosts is

very low (Kaminska et al., 2001). However, mature sieve elements of diseased

coconut from Sao Joao da Barra were always infected by phytoplasmas. In

addition, TEM images suggest that infection can occur during phloem developing.

Callose deposition occluding sieve pores has been described in C. roseus

infected by phytoplasmas (Favali et al., 2004). Sieve plates of infected coconut

phloem were similar to those of healthy plants, although TEM images suggested

callose apposition. However, we believe that immunolabeling methods are the

indicate approach to elucidate callose apposition.

Phloem sieve tube elements, companion cells and parenchyma cells of

leaflets of Robinia pseudoacacia L., affected by witches’ broom disease revealed

crystal-like inclusions (Chapman et al., 2001) that are morphologically similar to

those observed in diseased coconut palms. We agree with Chapman and his

colleagues suggestion that “crystal-like inclusions may merely be by-products of

the plant's metabolic activity. Extensive additional work would be required to

establish the precise relationship (if any) of the arrays and inclusions to

phytoplasmas.”

There are five permanent wilt diseases or yellowing diseases that affect

plants of the Arecaceae family, coconut palm in particular. The ‘ringspot’ disease

of African oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) affected 1–3-year-old plants, inducing

a systemic chlorosis initially observed in the younger leaves. Ringspots and

elongated rings are observed on leaflets and rachis of the young leaves. Tertiary

and quaternary roots show necrosis, which later progressed into the central

portion of the primary and secondary roots. The yellowing eventually reached the

lower leaves and the spear leaf developed a systemic necrosis that affected the

meristem. Necrosis affects also stem and fruits. Stem cross-section, close to the

insertion of the roots, showed a characteristic purple coloration in the vascular root

system. Plants usually died within 3–4 months of initial symptom expression. Five-

year-old and older oil palms were not affected (Dzido et al., 1978). Naturally

infected oil palms reveal in tissue extracts and cytoplasm of the mesophyll cells

the presence of filamentous virus-like particles - 800 nm long and 15 nn in

diameter - using negative contrast method in transmission electron microscopy. In

addition, partial molecular characterization showed the virus to be related to fovea

virus (Morales et al., 2002). Tissue extracts of diseased coconut palms did not

118

reveal virus-like particles using same methodology. Symptoms of Ringspots

disease were strongly different those observed in coconut palm. In West Africa the

most serious disease of oil palm (Elaeis guineensis) is a vascular wilt caused by

Fusarium oxysporum Schl. f. sp. elaeidis. External symptoms are decrease in the

size of the both petiole and leaflets lamina and internal symptoms are

morphological and physiological alterations. This disease affects other palms,

mainly Rhapis excelsa (Mepsted et al., 1995 a,b). Yeast and fungi was never

found in wilt coconut trees from Sao Joao da Barra and leaves size reduction did

not occurred. Phytomonas staheli (Trypanosomatidae) is the etiological of Hartrot

in coconut palm (Parthasarathy et al., 1976; Parthasarathy and Van Slobbe, 1978)

and Marchitez sorpressiva in oil palm. Red Ring disease is caused by

Bursaphelenchus cocophilus (Nematoda) (Agrios, 1997; Giblin-Davis et al., 1989;

Griffith 1987). Both plant pathogens affect innumerous other palms. However, they

are easily detected in DIC microscopy as well as electron microscopy. The present

studies have revealed that lethal wilt of C. nucifera form Sao Joao da Barra, Brazil,

are due to phytoplasma infection, although external symptoms are slightly different

those previously described. The consistent presence of phytoplasmas in sieve

elements coconut and their absence from healthy or asymtomatic plants strongly

supports the phytoplasma etiology, although it is not direct proof of the disease.

The pleiomorphic bodies seen in the phloem sieve cells by microscopic methods

are similar to those reported for other phytoplasma diseases.

M. crudus has been imputed as vector of phytoplasma in coconut palm

(Howard, 1983, 1995) but it is not reported in Brazil. In South America, there is an

unconfirmed report of LY case in Guyana (CABI/EPPO, 1990). In this way,

remains one open question. What is the LY vector in Rio de Janeiro State? We

believe that other auchenorrynchan insects will be imputed.

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Legends to figures

Figure 1 – Partial view of commercial plantations in Sao Joao da Barra

municipality on the north coast of Rio de Janeiro. Diseased coconut palm

(21o38’46.3 S - 41o03’34.6 W) that present yellowing symptoms. Note upward

leaves wilting and browning. First leaf (arrow) is not clearly visible due its wilting.

Nutfall is partial. Bar = 100 cm.

Figure 2 – Stem cross-section of the same plant. Internal symptoms for Rinspots

disease and Red Ring disease are negative. Necroses are not observed. Bar = 10

cm.

Figure 3 – Recently open inflorescence of diseased showing healthy feature. Note

ovary browning (arrow). Bar = 10 cm.

Figure 4 – Transverse section of diseased coconut leaflet from 13th leaf. Adaxial

epidermis cells are cubic and present stained vacuole. Hypodermic cell layers

showed parenchymatic aspect without chloroplasts. Schlerenchyma fibers are

present between hypodermis and palisade parenchyma. Mesophyll has 2-3 layers

of columnar palisade parenchyma cells and 3-4 layers of irregular spongy

parenchyma cells. Idioblasts are dispersing in mesophyll. Abaxial epidermis cells

are also cubic and stomata occur in this surface. Epicuticular wax is present in

123

adaxial and abaxial surface. Parallel vascular bundles can be observed. Note

dorsiventral arrangement of laminar blade. Bar = 100 µm. LM.

Figure 5 – Transverse section of diseased coconut leaflet from 13th leaf. Vascular

bundle showing vessel elements, parenchyma cells, sieve tube elements (arrow)

and companion cells. Vascular system is collateral and surrounded by a bundle

sheath of schlerenchima fibers (open arrow). Raphids in vacuoles of spongy cells

(black arrow) Bar = 25 µm. LM.

Figure 6 – Transverse section of diseased coconut leaflet from 13th leaf. Vascular

bundle showing sieve tube elements (star) surrounded by companion cells. Note

phloem without infection in sieve tubes lumen. Bar = 2 µm. TEM.

Figure 7 – Transverse section of diseased coconut leaflet from 9th leaf. Stomatum

apparatus and substomatic chamber (sc) without pathogen signal. Bar = 25 µm.

LM.

Figure 8 – Frontal view of abaxial epidermis of diseased coconut leaflet from 9th

leaf. Peltate trichomes (open arrow), stomata (arrows) and ordinary epidermal

cells without pathogen signal. Bar = 50 µm. SEM.

Figure 9 – Transverse section of vascular bundles of diseased coconut meristem.

Metaxylem (X) and sieve tubes (Ph) can be observed. Phytoplasmas were not

observed. Bar = 20 µm. LM.

Figure 10 – Transverse section of diseased coconut leaflet from 9th leaf. Highly

infected sieve tube elements (open star). Note phytoplasmas without membrane

limited organelles. Bar = 1 µm. TEM.

Figure 11 – Transverse section of diseased coconut leaflet from 6th leaf. Low

infection level in sieve tube elements (open star) and contiguous sieve elements

without phytoplasmas (star). Bar = 1 µm. TEM.

Figure 12 – Transverse section of diseased coconut leaflet from 6th leaf. Low

infection level in sieve tube elements. Phytoplasmas are mainly rounded

structures (arrow). Bar = 500 nm. TEM.

Figure 13 – Transverse section of diseased coconut leaflet from 6th leaf. Low

infection level in sieve tube elements. Phytoplasmas (arrow), mitochondria (open

arrow) and fibrils network can be observed . Bar = 500 nm. TEM.

Figure 14 – Transverse section of diseased coconut leaflet from 3th leaf. Sieve

tube element in development showing phytoplasmas (open arrow) in its lumen and

paracrystalline structures. Bar = 2 µm. TEM.

124

Figure 15 – Transverse section of diseased coconut leaflet from 3th leaf. High

magnification of figure 14 showing phytoplasmas (open arrow) in its lumen and

paracrystalline structures (arrow). Bar = 100 nm. TEM.

Figure 16 – Negative stain of meristem extract of diseased coconut palm. The

rounded structure is a phytoplasma. Bar = 100 nm. TEM.

Figure 17 – Low magnification of meristem extract of diseased coconut palm

showing pleiomorphic, mainly rounded and elliptical structures that are

phytoplasmas. Bar = 1 µm. SEM.

Figure 18 – Transverse section of diseased coconut leaflet from 6th leaf. Highly

infected sieve tube elements (open arrows). Phytoplasmas present inside vessel

elements, probably due to technical artifact. Bar = 20 µm. SEM.

Figure 19 – Transverse section of diseased coconut leaflet from 6th leaf. High

magnification of figure 18 showing phytoplasmas in sieve tube element lumen

(open star). Bar = 2 µm. SEM.

Figure 20 – Transverse section of diseased coconut leaflet from 6th leaf.

Phytoplasmas are in the lumen of contiguous sieve tube element. Note rounded

(arrow) and elliptical (black/white arrow) structures. Bar = 1 µm. SEM.

125

1 3 2

4 5

6 7

8 9

SC

X

X

Ph

126

6

10 11

12

14 15 16

18

17

19

20

13

127

O manuscrito abaixo foi elaborado de acordo com as normas editoriais do

periódico European Journal of Plant Pathology, uma revista de circulação

internacional editada por Kluwer Academic Publisher, The Netherlands.

Structural study of Phytomonas stahely and Cocos nucifera interactions.

Maura da Cunha1, Darli Grativol Keller1, Ivãn Bustamante Filho1, Jorge André

Sacramento de Magalhães1, Valdirene Moreira Gomes2, Wanderley de Souza3,

José Luiz Bezerra4 and Flávio Costa Miguens1*

128

Structural study of Phytomonas stahely and Cocos nucifera interactions.

Maura da Cunha1, Darli Grativol Keller1, Ivãn Bustamante Filho1, Jorge André

Sacramento de Magalhães1, Valdirene Moreira Gomes2, Wanderley de Souza3,

José Luiz Bezerra4 and Flávio Costa Miguens1*

1 - Laboratório de Biologia Celular e Tecidual - Universidade Estadual do Norte

Fluminense Darcy Ribeiro. UENF. Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro,

Brazil.

2 - Laboratório de Bioquímica e Fisiologia de Microorganismos - Universidade

Estadual do Norte Fluminense (UENF) – Campos dos Goytacazes – Rio de

Janeiro.

3 – Laboratório de Ultraestrutura Celular Hertha Meyer, Instituto de Biofisica

Carlos Chagas Filho - Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) - Rio de

Janeiro.

4 - Centro de Pesquisas do Cacau, Comissão Executiva do Plano da Lavoura

Cacaueira. CEPEC/CEPLAC. Itabuna, Bahia, Brasil.

*Author for correspondence :

Dr. Flávio Costa Miguens

Laboratório de Biologia Celular e Tecidual. Centro de Biociências e Biotecnologia.

Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF).

Rua Alberto Lamego no 2000, Parque Califórnia

CEP 28013-600 - Campos dos Goytacazes - Rio de Janeiro - Brasil

Telefax: 00552227261514 - E-mail: flavio@uenf.br

Summary

Phytomonas wilt or Hartrot is a fatal disease that affects Arecaceae

(Palmae) plants including coconut palm that is an important susceptible crop. The

purpose of this study was described Phytomonas stahely/Cocos nucifera

interactions. Adult palms, two varieties and one ecotype were analysed from

northeast and southeast Brazil. Coconut palm losses due Phytomonas wilt vary in

according to variety or ecotype and geographic area and it was insignificant in Rio

de Janeiro state (southeast) but substantial, circa 30% and exceptionally 100%,

129

Bahia state (northeast). Symptomatic and healthy palm were analysed by light and

electron microscopy. Laboratorial diagnostics reveal twisted promastigote form of

P. staheli in shoot apex, leaves, stem and inflorescence extracts of illness plants

but never in healthy plants. Parasites were not found in any root analysed.

Parasites infected sieve tube elements of the phloem and eventually in xylem

vessels of severely diseased palms. General anatomy of healthy and diseased

palms was similar. However, callose deposition in sieve plates was revealed by

histochemistry method and confirmed using immunocytochemistry. Plugging

action of P-protein and plastids alterations were also observed. Images strongly

suggest parasites traffic between sieve elements although their cellular body were

largest than the sieve pores. Parasite growth in sieve elements and its number

might obliterate the sieve tube elements interrupting the transport of phloem

or/and consuming plant nutrients. It was determined a relationship between the

percentage of infected vascular bundles in the different organs of diseased

coconut palms and disease severity.

Key words Fatal wilt or Hartrot, Trypanosomatidae, Plant Anatomy, Phloem,

Microscopy, Immunocytochemistry.

Introduction

In the most recent classification, Phytomonas are Trypanosomatidae

included in Protozoa kingdom (Cavalier-Smith, 1999; Cox, 2002). These parasites

are heteroxenous promastigote that not present arginase and their life cycles that

involve insect, intermediary host, and plants, definitive host (Camargo et al., 1987;

Wallace et al., 1992; Camargo, 1999). In 1909, the genus Phytomomas was

created on bases of definitive host, a plant (Donovan, 1909). Phytomonas have

been classified in floricola (flower flagellates), fruticola (fruit flagellates),

phloemicola (phloem flagellates) and laticicola (latex flagellates) in according to

plant compartment that occurred (Camargo, 1999). Phytomonas pathogenicity in

plants is still an open question. There are symptomless laticiferous plants (Dollet,

1984; da Cunha et al., 2000), except cassava, Manihot esculenta (Kitajima et al.,

1986). Fruticola and floricola flagellates were never associated to diseases. In

contrast, phloemicola parasites have been always associated to diseases in

Arecaceae and Rubiaceae plants (Camargo, 1999).

130

Phytomonas stahely McGhee & McGhee was described as new specie

(McGhee & McGhee, 1979) from parasites found in sieve elements of diseased

coconut and oil palms. Hartrot or fatal wilt of palms (Parthasarthy et al., 1976;

Parthasarthy and Slobbe, 1978) and Marchitez sorpressiva (Dollet et al., 1977;

Dollet and Lopes, 1978) were wilt diseases that affected coconut and oil palm

associated to trypanosomatids presence in sieve tubes. Attalea funifera (Bezerra

et al., 1983); Cocos nucifera (Bezerra and Figueiredo, 1982), Elaeis guineensis

(Oliveira e Bezerra, 1982; Oliveira et al., 1987; Attias et al., 1987) and Roystonea

regia (Attias et al., 1989) has been reported infected by P. stahely in Brazil.

Recently, it has been proposed that phloem restrict trypanosomatids isolated from

Arecaceae (Palmae) plants form a monophyletic group occurring only in Latin

America (Dollet, 2001). Fatal wilt disease has been transmitted experimentally by

Lincus lobuliger (Hemiptera:Pentatomidae) from diseased coconut to healthy oil

palm (Rezende et al., 1986). Southeast of Bahia state has been considered an

endemic area (Moura et al., 2002).

The most pronounced effects of the wilt syndromes are water stress and

deficiencies in plant transport systems (Beckman, 1987; Lucas, 1998). Callose

synthesis and deposition, lignification, phenolic compounds, P-protein

accumulation in sieve plate and pores has been reported in response plants

submitted to stress (Eschrich, 1975; Beckman, 1987; Lucas, 1998). Phloem

plastids were also reported to be involved with defence mechanisms in plants

(Walsh and Melaragno, 1981; Zucker, 1983). The mechanisms by which P.

stahely cause disease in plants were not clear. However, it has been suggested

that there are phloem blockage or alterations in phloem transport by parasites

presence (Agrios, 1997, Dollet, 2001).

The first introduction of coconut trees in Western Hemisphere was in Cabo

Verde and São Tome Islands by Vasco da Gama when he was returning from

India and East Africa in 1499 (Harries, 1977; 1978). It was first grown as a

plantation crop in Ceylon in the 1840’s (Child, 1974). In Brazil, it was introduced in

São Vicente during Portuguese colonial times in the 16th century and several

ecotypes were reintroduced during 20th century, mainly in northeast of the country

(Ferreira et al. 1998). In 1996, there was 260,000 ha coconut palms in Brazil and

Phytomonas wilt, imputed vectors and susceptible palms present same

131

geographical distribution. The purpose of this study was described P. stahely / C.

nucifera interactions.

Materials and methods

Plant material and study sites

Five symptomatic and one healthy coconut palms, Cocos nucifera variety

Malayan Green Dwarf, 10 years old, and one symptomatic C. nucifera variety

West African Tall were collected from germoplasm bank established at Estação

Experimental Lemos Maia EELM/CEPEC/CEPLAC. Experimental Station is near

Una municipality (15o18’00”S - 33o05’00”W) on the south-eastern of Bahia state,

Brazil. The vegetation around the EELM was typical Atlantic Rain Forest. The soil

was clayey. The climate in this region is warm tropical humid with relatively high

rainfall and high atmospheric temperatures. The total annual precipitation was

2045.8 mm and the mean annual air temperature was about 28oC in 2004. Twenty

one diseased and one healthy C. nucifera ecotype Green Dwarf plants were

collected in commercial plantations from Quissamã (22o06’24”S - 41o28’20”W)

and Conceição de Macabu (22o05’07”S - 41o52’06”W) municipalities on the north

of Rio de Janeiro state, Brazil. The vegetation around the plantations was

dominated by species of grass. The soil was sandy in Quissamã and clay in

Conceição de Macabu. The climate in this region is warm tropical subhumid with

relatively low rainfall and high atmospheric temperatures. The total annual

precipitation varied between 550mm to 850 mm and the mean annual air

temperature was about 26oC.

Coconut trees were divided in according to morphological symptoms.

Palms at least stage of the infection were designed type 1 and presented

browning of the oldest leaves, usually starting from tips, yellowing of younger

leaves, turning black of unopened and opened inflorescence, falling of all nuts and

putrefaction of shoot apex with foul odour. In intermediary infection stage, plant

type 2 presented yellowing of oldest leaves, browning of unopened and opened

inflorescence, nutfalls and putrefaction of shoot apex was absent. Plant type 3,

probably less of 3 months after initial infection presented a gradual yellowing and

initial browning of the leaves, initial browning of unopened and opened

inflorescence. Phytomonas wilt losses percentages were determined on bases of

132

field and laboratorial diagnostics considering variety or ecotype and experimental

area.

Light and electron microscopy

Extracts from roots, shoot apex, stem undifferentiated, stem in the first

stage of differentiation, young leaves, mature leaves; unopened inflorescence,

young and mature opened inflorescence were analysed by phase contrast

microscopy and scanning electron microscopy to determine for laboratorial

diagnostic. Fragments of these organs were also analysed by light and electron

microscopy. In order to determine infection level, the number of infected and

uninfected vascular bundles per unit area (mm2) was counted in the scanning

electron microscope, 20 areas per region per plant.

For light microscopy, samples were fixed in formalin-acetic-alcohol,

dehydrated in ethanol and embedded in paraffin (58- 60o C). Sections (10-12 µm)

were stained with basic fucsin-astrablau (Roeser, 1962). Callose was localised by

0.05% aniline blue that stained sky blue (Johansen, 1940). Tannins were localised

by 10% aqueous ferric chloride that stained blue-green (Johansen, 1940). The

samples were observed in a ZEISS Axioplan photomicroscope.

For electron microscopy, samples were fixed in 2.5% glutaraldehyde, 2.0%

formaldehyde in 0.05M cacodylate buffer, pH 7.4, for two hours at room

temperature. They were post-fixed with 1.0% OsO4 in the same buffer. Then,

samples were rinsed in distilled water, in bloc stained in 0.5% aqueous uranyl

acetate at room temperature for two hours, dehydrated in acetone and embedded

in Epoxi resin (Polybed). Sections were stained with uranyl acetate followed by

lead citrate and observed in a ZEISS 900 transmission electron microscope. For

scanning electron microscopy, after post-fixation, samples were dehydrated in

acetone, critical point dried in CO2, covered by sputtering with 20 nm gold and

observed in a ZEISS 962 scanning electron microscope.

Callose immunocytochemistry. Antisera against calose were prepared by

immunisation of white New Zealand rabbits with laminarin (polymer of B-1,3-

glucan) from Laminaria digitata (Sigma). Pre-immune serum was collected before

immunisation. For immunocytochemical analysis, samples were first submitted to

fixation for 2 hours at room temperature in a solution containing 0.1 %

glutaraldehyde, 2.0 % formaldehyde in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.3, rinsed

133

three times with 0.1 M phosphate buffer, pH 7.3, dehydrated in solutions of

increasing concentrations of methanol (30 % - 90 %) and processed for LR Gold

embedding. Ultrathin sections were treated following protocol previously described

(Pain et al., 1996) with some modifications. PBS + BSA (10 mM phosphate and

0.15 M NaCl pH 7.5, containing 1 % bovine serum albumin) was used for all

rinsing steps and for dilution of the reagents. Sections were immunolabelled by

immersing grids in drops (40 µl) of solutions in the following sequence: (1) PBS +

BSA, 30 min; (2) pre-immune serum in PBS + BSA, 20 min; (3) anti-vicilin serum

(1:100) in PBS + BSA, 2 hours at room temperature; (4) five changes of buffer, 10

min each; (5) goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with 5 nm or 10 nm

colloidal gold (Sigma) (1:50) in PBS + BSA, 2 h at room temperature; (6) five

changes of PBS + BSA, 10 min each; (7) five changes of deionized water, 10 min

each. Sections were then air-dried onto a Formvar film, stained with uranyl acetate

and lead citrate and observed in a ZEISS 900 transmission electron microscope.

Control sections were prepared by replacing the primary anti serum with pre-

immune serum.

Results

Adult coconut palm losses due Phytomonas wilt vary in according variety or

ecotype and geographic area. In Rio de Janeiro state, Phytomonas wilt was rare

and losses of Green Dwarf ecotype were less than 0,5% while was approximately

5% to Malayan Green Dwarf variety from EELM in Bahia state. There was a

substantial loss of West African Tall variety, above 30%, during 2002/2003 in the

same experimental station and 100% of Green Dwarf ecotype in a commercial

farm near Una municipality.

Diseased specimens of Cocos nucifera showed a gradient of

morphological symptoms. In contrast, the healthy plant presented no

morphological alteration. Shoot apex putrefaction occurred in 100% coconut

palms type 1 and it was related to secondary infection. This aspect was not

common plants type 2 and absent in type 3. Laboratorial diagnostics using light

and electron microscopy confirmed field morphological symptoms. Phytomonas

staheli were observed in extracts of shoot apex, stems, leaves, and inflorescence

from diseased palms in all different degrees of infection and absent in roots

extracts. Yeast and bacteria were observed in palms type 1 and type 2. Twisted

134

promastigote trypanosomatids measurements vary between 10 to 18 µm in length

and 1.5 to 2.5 µm in diameter (Figures 1). Parasites were not observed in healthy

palms. There was a positive relation between disease degree determined by

morphological symptoms and percentage of infected sieve elements in palm

organs (Table 1). In contrast, highly infected sieve elements were found besides

low infected sieve tubes (Figure 2, 4 and 21).

There was no anatomical difference between the vascular bundle of healthy

and diseased plants. In all organs analysed, the differentiated vascular system

showed random isolated bundles dispersed in ground parenchyma. Strengthening

tissue, forming a bundle sheath of lignified fibers, surrounds the vascular bundles.

The xylem consisted of 1-2 elements of metaxylem and 4-12 of protoxylem

(Figures 2 and 3). The phloem was formed by sieve tube elements, usually

associated with two companion cells and a variable number of parenchyma cells

(Figures 2, 4, 14 and 15). Tanniferous idioblasts, revealed by ferric chloride, were

found in infected and uninfected parenchyma tissues (Figure 5).

Xylem and phloem presented similar ultrastructure in healthy and infected

plants. However, peculiarities were identified mainly in sieve elements of diseased

plants. Plastids located at the periphery of the sieve elements were frequent in

uninfected (Figures 6 and 7) and rare in illness palms. They presented external

and internal membranes but thylakoid membranes were not identified and starch

grains were infrequent. Usually, electron dense structures with crystalline like

aspect were found in plastid stroma (Figure 7). Longitudinal sections of vascular

bundles of highly infected palms, plants type 1, parasites occurred also in vessel

elements of the xylem in the shoot apex and sieve elements presented infection

level related to disease severity (Figures 8 to 11). A high infection level was

always observed in stem meristem - heart of palm - and undifferentiated organs in

the three phases of infection (Figure 11). The differentiated organs of the three

plants analysed showed lower levels of infection (Table 1).

In coconut sieve elements, P. staheli were twisted promastigotes and

presented cytoskeleton typical of trypanosomatids, specially sub-pellicular

microtubules; flagellum attached to cell body through specialised junctions and

flagellar pocket, sometimes a paraflagellar rod could be observed; flagellum had a

135

basic strucuture showing a 9+2 pattern of axonemal microtubules; mitochondria

was usual but kinetoplast had different levels of condensation (Figure 11).

In sieve lumen of healthy and diseased plants, filaments of P-protein were

dispersed throughout the sieve element, trapped at sieve pores. In transmission

electron microscopy, P-protein filaments were often distributed close to parasites.

Sometimes, parallel fibrils of P-protein could be observed in the sieve pore (Figure

12) and perpendicularly to cell membrane (Figure 13).

The sieve tube elements had their sieve area at lateral and terminal wall.

The sieve plates had pore diameters varying between 0.5 µm to 1.0 µm and

infected sieve elements frequently presented fibrils in its lumen (Figure 14).

Callose deposition was observed in sieve tube elements of healthy and diseased

plants. In healthy palms, callose deposition was weakly revealed by aniline blue in

light microscopy (Figure 14) while strongly in diseased plants (Figure 15). In

transmission electron microscopy, it appeared as an electron-lucent structure

(Figure 12). The increase in deposition of callose in infected sieve tube elements

was verified (Figure 12, 15, 18 to 22). These deposits in uninfected sieve tube

elements were thin when compared to diseased plants. Plant showed a gradient

of callose deposition in relationship with infection level (Table 1). Immunolabelling

method strongly suggested that electron lucent areas of sieve plate were resulting

of callose deposition (Figures 16 and 17).

Despite the fact that parasites cell bodies were largest than sieve pores,

several images strongly suggest parasite transit between sieve elements (Figure

18 to 22). P. staheli flagella were found in sieve pores (Figures 18 and 20). Cell

bodies moving through sieve pore were also identified (Figures 19 to 22).

Apparently, there were rearrangements of sub-pellicular microtubules (Figure 19)

and cytoplasm (Figure 22) of parasites during its transit. In addition, in lateral

sieve plates (Figure 23) and ending sieve plates (Figure 24) parasites flagellum

were difficult to be visualised and cell bodies were preferentially disposed

perpendicularly to sieve plate.

Discussion

Plant disease may limit the kind of plant grow in a large geographic area

(Agrios, 1997). It has been reported losses due Phytomonasstaheli mainly in

coconut and oil palm in Latin America (Waters, 1978; McCoy and Martinez-Lopes,

136

1982, Ohler, 1999). Southeast Bahia state (northeast Brazil) has been cited as

endemic area for Phytomonas wilt in palms where there is overlap of etiological

agent, vectors and host distribution and constant low tax of this disease is

expected (Moura et al., 2002). It has been suggested that Yellow Dwarf varieties

are more resistant than Green Dwarf (Bezerra and Figueiredo, 1982). Devastation

verified in commercial farm from Una can be related to ecotype susceptibility or

deficient integrate disease management and West African Tall epidemic tax was

due crop management. In Rio de Janeiro state, fatal wilt level has been

insignificant and vector was not yet identified. However, vector imputation is

fundamental for disease control. Lincus lobuliger (Hemiptera:Pentatomidae) has

been implicated in protozoan transmission (Resende et al., 1986). P. staheli

vectors have been identified in genus Lincus and Oclerus (Camargo, 1999; Dollet,

2001).

Since parasites of Trypanosomatidae family were found in sieve elements

of diseased coconut (Parthasarthy et al., 1976; Parthasarthy and Slobbe, 1978)

and oil palms (Dollet et al., 1977; Dollet and Lopes, 1978) and other plants from

Arecaceae family (Camargo, 1999) and described as new specie (McGhee &

McGhee, 1979) a large majority of fatal wilt information is related to

protozoological studies (for review: Camargo, 1999; Dollet, 2001). Results

presented here establish a clear relationship of disease developments with host

morphological alterations and compare anatomy and ultrastrucuture of healthy

and diseased palms.

The anatomy of healthy and diseased palms was very similar. Callose

deposition was the main difference. Callose is a linear β-1,3 glucan with some 1,6-

branches and it is a glucose noncellulosic polysaccharide, differing from cellulose

in the type of linkage between the glucose residues (Hopkins, 1995). Usually,

callose has been detected on basis of its specific staining with aniline blue (Hong

et al., 2001) and using immunocytochemistry (Northcote et al., 1989). Similar

approach and results were obtained for coconut diseased palms. Callose has

been localized at cell plate, plasmodesmata, root hair, cotton seed hair, and spiral

thickenings in tracheids (Stone and Clarke, 1992). However, mature sieve-plate

pores in monocotyledons have little or no callose (Behnke, 1971; Walsh & Evert,

1975). The synthesis of callose also can be induced by wounding, pathogen

137

infection, and physiological stress (Stone and Clarke, 1992; Kauss, 1996). It has

been reported that the callose is deposited in apposition layer in diseased tomato

(Beckman et al., 1982). In this study, callose apposition was observed in different

degree of P. staheli infection. Callose function in diseased palms might be sealing

the sieve plates. Nevertheless, both obliteration by trypanosomatids and callose

accumulation could provoke functional disturbs of phloem transport in P. staheli

infected coconut.

The long-distance movement of macromolecules in vascular tissues can

impact profoundly normal plant growth and development. The phloem of most

angiosperms contains proteinaceous structures, collectively called P proteins

(phloem proteins), that accumulate in differentiating sieve elements and persist in

translocating sieve elements. The functional role of P proteins and the

interrelationship between mobile P protein subunits and polymerized structures

remain unresolved. However, P protein deposition appears to be much more

dynamic than originally thought, and the existence of translocable P protein

subunits suggests that P protein interactions can occur at a distance from the site

of synthesis. It appears likely that polymerized and unpolymerized P proteins exist

in dynamic equilibrium within sieve elements, where the concentration of each is

responsive to physiological changes within the vascular system (Golecki et al.,

1999). The P protein is deposited initially into ultrastructurally distinct

polymorphous or crystalline bodies during sieve element differentiation (reviewed

in Cronshaw, 1975; Cronshaw and Sabnis, 1990; Sabnis and Sabnis, 1995). P

protein bodies either persist or more often disperse, forming a filamentous

network in the parietal cytoplasm that is thought to be immobilized through

interactions with the appressed endomembrane system (Smith et al., 1987).

Disruption of sieve elements that occurs during wounding results in the

accumulation of P protein filaments at the sieve plate, ostensibly blocking

translocation by forming P protein plugs (Hopkins, 1995). In C. nucifera were

identified two kinds of P-like protein in the sieve tube elements and its

accumulation was probably due to the infection of Phytomonas and/or related

vector feeding that wound sieve elements. P protein plugs affect long-distance

movement of macromolecules in vascular tissues and probably impact normal

plant physiology.

138

In addition, it has been reported that phloem plastids explode in immediate

response to pressure release in the sieve elements and set substances free that

react with the P protein body material (Knoblauch and van Bel, 1998). Starch and

protein granules from broken plastids could contribute to the plug of the sieve tube

elements (Walsh & Melaragno, 1981). The function of plastids inclusions in

monocotyledons is not clear. However, there is evidence that they are involved in

plugging action mechanisms (Eleftheriou, 1990). Phloem plastids were easily seen

in uninfected vascular bundle of C. nucifera but not in infected ones. Our

observations suggest that fragments of plastids from the sieve tube elements of

the Phytomonas infected vascular bundle would also contribute with the presence

of the protozoa, callose and P-like protein, for plugging of the phloem during

infection caused by P. staheli. Vector injury of sieve tube elements could result in

the same in local response.

In conclusion, symptomatic coconut palms presented at least 30% of sieve

elements of phloem infected by Phytomonas staheli and in terminal stage of

disease when circa of 98% vascular bundles were infected. In contrast, vessel

elements of xylem present few parasites only in terminal stage of fatal wilt. These

data strongly suggest that long-distance translocation in the phloem is affected by

Phytomonas staheli presence and plant response to pathogen.

Ackowledgements

Research supported by CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico

e Tecnológico), FINEP (Instituição para Financiamento de Estudos e Projetos),

FENORTE (Fundação Estadual do Norte Fluminense) and PRONEX (Programa

de Núcleos de Excelência).

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perspective. American Nature 121: 335-365.

Legend to the figures

Figure 1 – Extract of stem apical meristem of Cocos nucifera variety Malayan

Green Dwarf from Bahia state. Phytomonas staheli presenting twisted cellular

bodies. Starch grains and debris cellular can be observed in background.

Scanning Electron Microscopy.

Figure 2 – Longitudinal section of leaf primordial from Cocos nucifera variety West

African Tall from Bahia state. Five sieve elements (square) showing different

infection level. Vascular parenchyma (asterisk) and sclerenchyma (star) in

formation presenting typical anatomy. Light microscopy.

Figure 3 – Transversal section of stem meristem from Cocos nucifera variety

Malayan Green Dwarf. Infected vascular bundle (ellipse) of basal petiole from

palm type 2 young leaf. Vascular bundle surrounded by parenchyma showing

bundle parenchyma (small cells), xylem (open arrow) and phloem (white arrow).

Scanning Electron Microscopy.

Figure 4 – Longitudinal section of primordial leaf from Cocos nucifera ecotype

Green Dwarf, type 2, from Rio de Janeiro state. Vascular bundle presenting five

infected sieve tube elements (asterisk). Note callose deposition in sieve plate

(arrow) and companion cells (cc). Light Microscopy.

Figure 5 – Longitudinal section of stem meristem from Cocos nucifera ecotype

Green Dwarf, type 2, from Rio de Janeiro state. Tanniferous idioblast showing

electron dense tannin accumulation in vacuole. Transmission Electron

Microscopy.

Figure 6 – Transversal section of stem meristem from healthy Cocos nucifera

ecotype Green Dwarf from Rio de Janeiro state. Vascular bundle showing

companion cells (cc) and sieve elements. Phloem plastid (arrow) in sieve

element. Transmission Electron Microscopy.

Figure 7 – Transversal section of stem meristem from healthy Cocos nucifera

ecotype Green Dwarf from Rio de Janeiro state. High magnification of sieve

144

element from Figure 6. Phloem plastid close to cell wall presenting external and

internal membranes but thylakoid membrane is not clear. Note crystal-like

structures in stroma. Transmission Electron Microscopy.

Figure 8 – Longitudinal section of basal petiole from Cocos nucifera ecotype

Green Dwarf, plant type 1, from Rio de Janeiro state. Highly infected in sieve

element showing P. staheli. Scanning Electron Microscopy.

Figure 9 – Longitudinal section of basal petiole from Cocos nucifera ecotype

Green Dwarf, plant type 2, from Rio de Janeiro state. Contiguous sieve element

showing intermediary level of P. staheli infection. Scanning Electron Microscopy.

Figure 10 – Longitudinal section of basal petiole from Cocos nucifera ecotype

Green Dwarf, plant type 3, from Rio de Janeiro state. Lowly infected in sieve

element showing P. staheli. Scanning Electron Microscopy.

Figure 11 – Transversal section of stem meristem from Cocos nucifera variety

Malayan Green Dwarf, plant type 3, from Bahia state. Highly infected sieve

element showing lateral sieve area (black arrow). P. staheli present typical

trypanosomatid morphology. Condensed kinetoplast (black/white arrow) is the

most evident structure. Transmission Electron Microscopy.

Figure 12 – Longitudinal section of primordial leaf from Cocos nucifera ecotype

Green Dwarf, plant type 2, from Rio de Janeiro state. Infected (arrow) sieve

contiguous elements showing terminal sieve area. In cell plate can be identified

cell wall (cw), callose apposition (c) and fibrilar P-like protein in pore lumen (pl).

Transmission Electron Microscopy.

Figure 13 – Transversal section of stem meristem from Cocos nucifera variety

Malayan Green Dwarf, plant type 3, from Bahia state. Sieve element showing

crystal-like P protein adhered to cell membrane (arrow). Transmission Electron

Microscopy.

Figure 14 – Longitudinal section of stem meristem from healthy Cocos nucifera

ecotype Green Dwarf from Rio de Janeiro state. Note sieve plate (arrow) slender

callose deposition. Aniline blue treatment. Light Microscopy.

Figure 15 – Longitudinal section of stem meristem from Cocos nucifera variety

Malayan Green Dwarf, plant type 3, from Bahia state. High callose apposition in

sieve plate (arrow). Aniline blue treatment. Light Microscopy.

145

Figure 16 – Transversal section of stem meristem from Cocos nucifera ecotype

Green Dwarf, plant type 2, from Rio de Janeiro state. Immunolabeling control

replacing primary anti-serum by pre-immune serum. Note sieve element cell wall

(cw), callose apposition (c) and sieve pore lumen (pl) without gold particles.

Transmission Electron Microscopy.

Figure 17 – Transversal section of stem meristem from Cocos nucifera ecotype

Green Dwarf, plant type 2, from Rio de Janeiro state. Callose

immunocytochemistry using antisera against laminarin (B-1,3-glucan polymer).

Anti-rabbit IgG antibody conjugated with 10 nm colloidal gold labeling mainly

callose apposition (c) in sieve element cell wall. Note sieve element cell wall (cw)

and sieve pore lumen (pl) without gold particles. Transmission Electron

Microscopy.

Figure 18 – Transversal section of sieve plate from Cocos nucifera ecotype Green

Dwarf, plant type 2, from Rio de Janeiro state. Parasite flagella can be observed in

two sieve pores lumen. Note callose (c) apposition surrounding sieve pore (pl).

CW = cell wall. Transmission Electron Microscopy.

Figure 19 – Longitudinal section of sieve pore in sieve plate from Cocos nucifera

ecotype Green Dwarf, plant type 2, from Rio de Janeiro state. Two parasite cell

bodies moving through sieve pore lumen. Note juxtaposition of protozoa cell

membranes (black/white arrow) and sub-pellicular microtubules. Callose (c)

apposition surrounding sieve pore. Transmission Electron Microscopy.

Figure 20 – Longitudinal section of sieve plate (black arrow) from Cocos nucifera

ecotype Green Dwarf, plant type 1, from Rio de Janeiro state. Parasites cell

bodies moving through sieve pore lumen. Note callose apposition surrounding

sieve pores. Transmission Electron Microscopy.

Figure 21 – Longitudinal section of stem meristem from Cocos nucifera variety

Malayan Green Dwarf, plant type 3, from Bahia state. Sieve element highly

infected. Parasite cell body (rectangle) moving through sieve pore lumen. Note

callose apposition surrounding sieve pores. Transmission Electron Microscopy.

Figure 22 – Longitudinal section of stem meristem from Cocos nucifera variety

Malayan Green Dwarf, plant type 3, from Bahia state. High magnification of

rectangle from figure 21. Parasite cell body in sieve pore lumen showing a large

146

number of cytoplasm vesicles and mitochondria. Note callose (c) apposition

surrounding sieve pores and cell wall (cw). Transmission Electron Microscopy.

Figure 23 – Transversal section of sieve element close to sieve plate from Cocos

nucifera ecotype Green Dwarf, plant type 1, from Rio de Janeiro state. Twisted

parasites cell bodies are evident but flagella are not clear suggesting adhesion to

cell membrane. Scanning Electron Microscopy.

Figure 24 – Longitudinal section of sieve elements from Cocos nucifera ecotype

Green Dwarf, plant type 2, from Rio de Janeiro state. Lateral view of terminal

sieve plate. Twisted parasites cell bodies are evident both sides of sieve plate but

flagella are not clear. Scanning Electron Microscopy.

147

Table 1. Morphology of Phytomonas wilt diseased and healthy coconut palms. External symptoms, structural characters and infection level showing relationship between field and laboratorial data.

Cocos nucifera L. - for all varieties and ecotypes. External symptoms Type 1 type 2 Type 3 Healthy

Nuts fall +++++ +++ ++ - Unopened inflorescence browning +++++ ++ + - Young inflorescence browning +++++ +++ ++ - Mature inflorescence browning +++++ +++ ++ - Wilt of first leaf +++++ +++++ +++++ - Oldest leaf browning +++++ +++++ +++++ +++ Oldest leaves browning +++++ +++ ++ - Younger leaves yellowing ++++ ++ + - Shoot apex putrefaction ++++ ++ - -

Internal symptoms Tanniferous idioblasts frequent frequent frequent frequent P-protein high high high low Plastids in sieve elements rare rare rare frequent Callose deposition high median median low

Infection level* Stem meristem 98.4 +2.7 85.0 +6.0 72.4 + 11.8 - Stem 76.1 + 4.9 67.0 + 9.6 66.6 + 8.2 - Basal petioles of adult leaves 92.0 + 6.4 90.8 + 6.5 63.3 + 9.6 - Basal petioles of young leaves 51.3 +4.2 55.4 +9.0 30.3 +9.1 - Unopened inflorescence 98.3 + 2.6 89.8 + 4.3 80.6 +9.4 - Young inflorescence 97,0 + 3.8 88.9 + 5.3 76.0 +9.2 - Mature inflorescence 52.5 + 5.4 53.2 + 7.9 43.1 + 7.1 - Primary and secondary roots - - - -

+++++ = 100% ; ++++ = 100% to 75%; +++ = 74% to 50%; ++ = 49% to 25%; + > 25%; - = 0%. * Percentages of vascular bundles infected by P. staheli (median and SD).

148

10

9

8

1 10 µm

3 250 µm

4 10 µm

2

VP

VP 10 µm

5 6 7

*

* *

* *

cc cc

cc

cc

10 µm 10 µm

cc

5 µm

11 10 µm 10 µm

10 µm

5 µm

149

24

14

15

18

20

22

21

19

23

cw

c

pl

cw

c

pl

12

13

10 µm

16

cw

c

pl

cw

c

pl 17

c

c

c

cw

1 µm

2 µm

1 µm

10 µm

0,5 µm

10 µm

10 µm

1 µm

0,5 µm

5 µm

1 µm

5 µm

150

O manuscrito abaixo foi elaborado de acordo com as normas editoriais do periódico

Pesquisa Agropecuária Brasileira, uma revista de circulação internacional editada

pela Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Brasília, Brasil.

Scanning Electron Microscopy of Bursaphelencus cocophilus (Cobb, 1919)

Baujard 1989 (Nematoda: Tylenchida)

Jorge André Sacramento de Magalhães1, Lívia Mello de Amorim1,

Antonio Henrique Almeida de Moraes Neto1-2, José Inácio Lacerda Moura3

and Flávio Costa Miguens1,¥

151

Scanning Electron Microscopy of Bursaphelencus cocophilus (Cobb, 1919)

Baujard 1989 (Nematoda: Tylenchida)

Jorge Andre Sacramento de Magalhaes1, Livia Mello de Amorim1,

Antonio Henrique Almeida de Moraes Neto1-2, Jose Inacio Lacerda Moura3 and

Flavio Costa Miguens1,¥

1 – Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, Centro de Biociências e

Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darci Ribeiro.

2 – Núcleo de Biologia e Controle de Endo e Ectoparasitos de Interesse Médico e

Veterinário, Departamento de Biologia, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação

Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil.

3 – Estação Experimental Lemos Maia, Centro de Pesquisas do Cacau, Comissão

Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira. Una – Bahia – Brasil.

¥ - Corresponding author: Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, Centro de

Biociências e Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darci

Ribeiro. Avenida Alberto Lamego, 2000 – Parque Califórnia. 28.013-600 –

Campos dos Goytacazes – Rio de Janeiro – Brasil. 55.22.27261514 -

flavio@uenf.br

Abstract

The morphology of males and females nematode, Bursaphelenchus

cocophilus (Cobb, 1919) Baujard, 1989, etiological agent of Red Ring disease,

were examined using scanning electron microscopy. Nematodes were isolated

from inflorescences, leaves and stem tissues of diseased palms. Coconut and oil

palms were collected in Rio de Janeiro state, Brazil while Cocos nucifera L. variety

Malayan Green Dwarf, Elaeis guineensis Jacq., and Attalea funifera Mart., from

152

southeast of Bahia state, Brazil. DIC microscopy confirmed nematodes infection

for all plants. Morphological differences were not observed between adult B.

cocophilus from palm host neither related to geographic occurrence, except those

isolated of Elaeis sp. from Rio de Janeiro state. Nematodes were found in stem

parenchyma of plant organs. Nematodes bodies of both sexes were long, slender,

cylindrical and tapered at both ends. No morphological differences were identified

among juveniles and adults, except on measurements. Elliptical eggs had smooth

external surface and rough internal surface. Style, cephalic end, body surface

were described. B. cocophilus showed bursa flap in the posterior end of the males.

Nematodes isolated of oil palm collected from Rio de Janeiro present

morphological differences when compared with B. cocophilus. Morphological data

suggest that Red Ring disease might have more of one etiological agent.

Index terms

Red Ring disease nematode - Plant parasite nematode – Nematode morphology –

Arecaceae (Palmae) family

Microscopia eletrônica de varredura de Bursaphelencus cocophilus (Cobb,

1919)

Baujard 1989 (Nematoda: Tylenchida)

Resumo

A morfologia de nematóides, machos e fêmeas, Bursaphelenchus

cocophilus (Cobb, 1919) Baujard, 1989, agente etiológico da doença Anel

Vermelho, foi examinada por microscopia eletrônica de varredura. Nematóides

foram isolados de tecidos de inflorescências, folhas e estipe de palmeiras

doentes. Coqueiros e dendezeiros foram coletados no Estado do Rio de Janeiro,

Brasil; enquanto que, Cocos nucifera L. variedade Anão Verde da Malásia, Elaeis

guineensis Jacq., e Attalea funifera Mart., do sudeste do Estado da Bahia, Brasil.

A microscopia óptica (DIC) confirmou a infecção por nematóides em todas as

plantas. Não foram observadas diferenças morfológicas entre B. cocophilus em

relação à planta hospedeira ou região geográfica, exceto para isolados de Elaeis

sp. coletados no Estado do Rio de Janeiro. Nematóides foram encontrados no

153

parênquima dos órgãos infectados. O corpo dos nematóides de ambos os sexos

era longo, delgado, cilíndrico e achatado na extremidade anterior e cônico na

posterior. Não foram identificadas diferenças morfológicas entre adultos e formas

juvenis, exceto em relação às medidas. Ovos elípticos apresentavam a superfície

externa lisa e a interna rugosa. A descrição do estilete, região cefálica e superfície

corporal e fornecida. Machos de B. cocophilus apresentaram uma bursa na região

posterior. Nematóides isolados de dendezeiros do Estado do Rio de Janeiro

apresentaram diferenças morfológicas quando comparados com B. cocophilus.

Os dados morfológicos sugerem que a doença Anel Vermelho poderia ter mais de

um agente etiológico.

Termos para indexação

Anel Vermelho, Nematóides parasitas de plantas, Morfologia de nematóides,

família Arecaceae (Palmae)

Introduction

Plant parasitic nematodes (PPN) are a threat to important crops worldwide.

Intensive trade has made many PPN, which were once localized to specific areas

of the world, cosmopolitan. A global survey in 1987 indicated that the annual yield

losses due to parasitic nematodes approximated 12% in agricultural productivity

(Sasser & Freckman, 1987). More recent estimates on global crop losses are not

available (Jasmer et al., 2003). Besides causing direct damage to plants, some of

the PPN are vectors of troublesome plant viruses (Zuckerman & Rohde, 1981).

All nematode-plant interactions involve cellular modifications of feeding

cells and surrounding tissue (Hussey, 1989). Plants respond to the presence of

PPN by employing various generic defense strategies (Veech, 1981) that include

the release of naturally occurring nematicides, phytoalexins and other compounds

(Gommers & Bakker, 1988), systemic induction of pathogenesis-related proteins

(Hammond-Kosack et al., 1989), production of protease inhibitors (Brenner,

1998) and reactive oxigen (Waetzig et al., 1999). In addition to these chemical

barriers, plants reinforce the cell wall by lignification, suberization, and callose

deposits at the site of stylet penetration (Hussey et al., 1992). Plants have evolved

154

a defense system against PPN that is mediated by a set of disease resistance

genes (Dangl & Jones, 2001).

Nematode cuticular morphology can facilitate attachment to host surfaces

and may also function in evasion of host defense (Jones et al., 1993). All PPN

have an oral stylet (Bird, 1971) that serves to perforate plant cell walls, inject

esophageal gland secretions into plant cytoplasm, and ingest host cytoplasm from

the feeding site. (Dropkin, 1989). PPN may induce modification of plant cells into

giant cells and a syncytium is also associated with changes in host gene

expression and cell cycle regulation (Gheysen & Fenoll, 2002; Gheysen et al.,

1997; Goverse et al., 2000).

Bursaphelenchus species are obligate sedentary parasites and use insects

as an intermediate host for their dispersal in which they refrain from feeding and

reproduction (Bergdahl et al., 1999). Bursaphelenchus cocophilus (Cobb, 1919)

Baujard 1989 (Nematoda:Tylenchida) (Baujard, 1989) is the causal agent of a

permanent wilt disease in coconut trees and other plants of the Arecaceae

(Palmae) family (Agrios, 1997; Griffith, 1987; Lucas, 1998). This disease was

named Red Ring on basis of the characteristic red band always present in the

stem of affected palm (Nowel, 1919). The palm weevil Rhinchophorus palmarum,

L. (Coleoptera: Curculionidae) has been implicated as the vector of this nematode

(Cobb, 1919). R palmarum has been also reported as a pest of palms and

sugarcane plants (Griffith, 1987). The red ring nematode has been also reported

as Rhadinaphelencus cocophilus (Cobb, 1919) Goodey, 1960 (Giblin-Davis et al.,

1989).

Red Ring external symptoms are confined to the leaves, which turn yellow

from the tip of the leaflefts to the basis of the raquis and, then, turn brown. Leaf

symptoms start on the lowest leaves and progress upward. Internal symptom is a

circular antocianin deposition cortex tissue of affected organs. This ring is usually

red in tall cultivars but may be browner in dwarf cultivars and hybrids. Internal

symptom is fully developed before external symptoms became visible (Franco,

1964; Griffith, 1987).

Coconut palm, Cocos nucifera L. (Arecaceae), is one of the most important

perennial crops throughout the tropics (Ohler, 1999). It was introduced in Brazil

155

during Portuguese colonial times in the 16th century. Several ecotypes were

reintroduced during 20th century, mainly in northeast of the country (Ferreira et al.,

1998). During the years 1940-1960, coconut plantations in have been devastated

by Red Ring disease (Franco, 1964; Ferreira et al., 1998). Recently, it has been

reported Red Ring disease in coconut plantations in Rio de Janeiro state (Miguens

et al., 2003).

Since the 1970s, scanning electron microscopy (SEM) has been used

extensively as a valuable investigative tool in taxonomic and structural studies,

including evaluation of drug effects, of both parasitic flatworms and nematodes,

and has also provided better understanding of host parasite relationships (Halton,

2004).

Besides that, SEM has revealed marked interspecific and intraspecific

variations and regional differences in surface topography, particularly in exposing

previously unimagined microtopographical features and their spatial relationships

(Halton, 2004). The taxonomic value of this technique is patently evident from the

images of helminths portrayed in guides and accounts aimed at their identification

(Gibbons, 1986; 2002).

Previous descriptions of red ring nematodes indicate possible

contradictions (Cobb, 1919; Lordello & Zamith, 1954; Goodey, 1960; Thorne,

1961; Nickle, 1970; Brathwaite & Siddiqi, 1975, Baujard, 1989, Giblin-Davis et al.,

1989). In addition, there is only one SEM description of this nematode collected

from Trinidad coconut trees and Venezuela oil palms in the literature (Giblin-Davis

et al., 1989). The aim of this study was to describe Bursapheluncus cocophilus

morphology of three Arecaceae (Palmae) family species from different

geographical regions in Brazil using scanning electron microscopy.

Materials and methods

Plant material

Threes Red Ring symptomatic Cocos nucifera L. ecotype Green Dwarf

were collected in commercial plantations from Conceicao de Macabu (22o05’07”S -

41o52’06”W) municipality on the north of Rio de Janeiro state, Brazil. Four

symptomatic Elaeis sp. from bovine farms were collected in the same area. Two

156

diseased coconut palms (C. nucifera variety Malayan Green Dwarf), three oil

palms (Elaeis guineensis Jack.) and two piassavas (Attalea funifera Mart.) were

collected in Estacao Experimental Lemos Maia (EELM/CEPEC/CEPLAC). This

experimental station is near Una municipality (15o18’00”S - 33o05’00”W) on the

southeast of Bahia state, Brazil. Fresh juices were observed under differential

interferential contrast (DIC) microscopy to confirm field diagnostic.

Scanning electron microscopy (SEM)

For SEM, extracts and fragments of inflorescences, leaves, stem meristem

and stem were fixed in 4.0% formaldehyde plus 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M

Sodium cacodilate buffer, pH ~ 7.0, during 2 hours. Samples were washed in the

same buffer. Post-fixation was carried out with 1.0% Osmium tetroxide in the same

buffer, during 2 hours. Then, they were dehydrated in ethanol series, dried by CO2

critical point in a Balzer’s apparatus (CPD 030), covered by spputering with 20 nm

of gold in a Balzer’s apparatus (SCD 050) and observed under SEM at 25 kV in a

Zeiss DSM 962. Measurements were carried out in Zeiss DSM 962 software.

Results

Light microscopy (DIC) confirmed nematodes infection for all plants

(Figures 1 to 3). Although, only four years old coconut tree from Conceição de

Macabu municipality, north of the Rio de Janeiro state presented palm weevil,

Rhinchophorus palmarum L., six females and five males on leaves axils. Weevil

larvae were found into apical stem.

Bursaphelencus cocophilus

Bursaphelencus cocophilus (Cobb, 1919) Baujard, 1989 (Nematoda:

Tylenchida) body of both sexes was long, slender and cylindrical, and slightly

tapered at anterior ends (Figure 1, 2 and 7). Juveniles and adults were found

mainly in cortical parenchyma (Figure 4 and 5). No morphological differences

were identified among juveniles and adults, except on measurements (Figure 5).

Eggs were elliptical and its external surface was smooth and had a rough

internal surface (Figure 6). Their measurements were approximately 60 µm long

and 40 µm in wide and were found mainly in parenchyma tissue, exceptionally in

metaxylem.

157

In frontal view, the cephalic end is slightly flat and has a simple oral opening

surrounded by a labial disc and most externally by six lips (Figures 7 and 9). A

protrude above circular region could be observed surround lips. Cephalic sectors

were not clearly identified. Two amphids apertures were found in a slightly lateral

position (Figures 7, 9 and 10). Annular striations (0.18 – 0.27 µm wide) had been

revealed in lateral view of anterior end of both males and females of B. cocophilus

and its number varied between 8 (Figure 7) to 5 or were absent (Figures 8 to 10).

Styles present conical form and measurement varied in according nematodes

developments (Figure 8).

The cuticle covering the body presented transverse striations. Longitudinal

cordons or alea that run backward from the cephalic region interrupt the

transverse cuticular striations in two lateral fields, ending near the posterior end

(Figures 11). This structure could be observed just after molt. The longitudinal alea

were composed of two to four longitudinal striations (Figure 11). Two external

longitudinal striations were always present while internal longitudinal striations

could be absent.

The morphology of the posterior end of males B. cocophilus showed semi-

conical spicule laterally protrude ending in two slender striations. Its length was

circa 1.5 µm (Figure 12). The bursa flap or caudal alae were fused together

forming a spade-shaped flap with a tapering terminus and its dorsal surface was

annulated (Figure 13).

Females of B. cocophilus had a vulval flap in crescent-shaped and its

diameter varied in according to development (Figure 14). The tail was elongate

with a slightly rounded terminus.

Plant parasite nematodes (PPN)

Plant parasite nematodes (Figures 15 to 21) isolated of Elaeis sp. from

north Rio de Janeiro state showed morphological differences when compared with

B. cocophilus (Figures 1-14). They were also found mainly in cortical parenchyma.

In frontal view of PPN, three cephalic sectors were observed covering oral

aperture (Figure 15) or six cephalic sectors surrounding oral aperture (Figure 16).

Style was not observed. In lateral of the cephalic end, PPN showed cylindrical

morphology without a clear neck (Figure 17) and its bodies tapered abruptly at the

158

anterior end (Figure 15 to 17). Laterally, amphids were present (Figure 15 and 17).

Lateral alea had five longitudinal striations (Figures 18 to 20) and its mean wide

was 0.6 µ. Nematodes body showed transverse striations measurement

approximately 0,8 µm in wide (Figures 17 to 21). Transverse striations were

strongly marked in adult nematodes and slender immediately after cuticular

change (Figure 18). Three morphological types of transverse striations could be

observed. Smooth transverse striations protrude above in its anterior edge

(Figures 15 and 17). Convex transverse striations presenting thin striate relief

(Figure 19). Finely rough striation presenting thin protrude above edge (Figures

18, 19 and 20). Anal aperture (Figures 20 and 21) were slightly crescent-shaped.

Males did not have a characteristic bursa in the tail. Juveniles were not clearly

identified. Eggs were not observed.

Discussion

Red Ring disease nematode has controversy taxonomy (Baujard, 1989;

Giblin-Davis et al., 1989). However, a large majority of the plant pathology

literature use Bursaphelenchus cocophilus on basis nematode morphology

(Agrios, 1997; Baujard, 1989; Ferreira et al., 1998; Franco, 1964; Griffith, 1987;

Ohler, 1999). However, taxonomy was not intent of this article. In according

Baujard (1989), B. cocophilus terminology was used mainly due the caudal alae

or bursa flap present in Red Ring disease nematode to be are similar to those

described for most members of the genus Bursaphelenchus, such as B. xylophilus

(Yik & Birchfield, 1981), B. seani (Giblin & Kaya, 1983), and B. kevini (Giblin et al.,

1984).

Scanning electron microscopy (SEM) has been used extensively as a

valuable investigative tool in taxonomic and structural studies of nematodes. Its

resolution has enabled details of surface architecture to be revealed (Halton,

2004). SEM has been choice tool to distinguish two groups of nematodes causing

similar symptoms. B. cocophilus were observed in juice and tissues of all disease

palms. However, Elaeis sp. from Rio de Janeiro state that had external and

internal symptoms of Red Ring disease was infected with morphologically diverse

nematode.

159

SEM observations of the vulval flap of B. cocophilus females shown

similarity in appearance to the vulval flap in B. xylophilus (Yik & Birchfield, 1981).

The striations of the cuticle and lateral fields of both sexes of B. cocophilus are

similar to other members of the genus Bursaphelenchus, eg., B. xylophilus (Yik &

Birchfield, 1981), B. seani (Giblin & Kaya, 1983), and B. kevini (Giblin et al., 1984).

B. cocophilus isolates of palms from Bahia and coconut palm from Rio de

Janeiro states possess fine transverse annulations on the head that is similar to

SEM observations of aphelenchoids reported previously (Hooper & Clark, 1980;

Yik & Birchfield, 1981; Giblin & Kaya, 1983; Giblin et al., 1984). In fact, only

Aphelenchoides helicosoma Maslen, 1979 has been confirmed with SEM to be

without fine annular striations on the head (Hooper & Clark, 1980). These

transverse striations were not observed in PPN isolates Elaeis sp. from Rio de

Janeiro state.

Cobb (1919) emphasized the thickening of the distal end of the spicule in R.

cocophilus. Subsequently, reports have not mentioned this feature (Lordello &

Zamith, 1954; Nickle, 1970; Brathwaite & Siddiqi, 1975). Spicule of Red Ring

disease nematode, B. cocophilus, from palms of both Bahia and Rio de Janeiro

states, revealed two thickening in its end. These structures could represent those

drafts by Cobb (1919) and resemble those of Bursaphelenchus hunti (Giblin &

Kaya, 1983).

The taxonomy of PPN is related to the en face pattern emphasizes in labial

disc and lip sectors (Hooper and Clark, 1980; Baldwin et al., 1983). Nematodes

isolated from Elaeis sp. presented two morphologically distinct en face pattern.

One of then had three lip sectors while other presented six structures.

Unfortunately, amphid openings were rarely observed in these PPN regardless its

taxonomic value (Hooper and Clark, 1980). When observed, they were disposed

laterally suggesting aphelenchs pattern.

Red Ring is a permanent wilt (Agrios, 1997; Lucas, 1998). In 1919,

diseased was named Red Ring on the bases of the characteristic red band of

tissue always present in the stem transverse sections of an affected palm (Nowell,

1919). This internal symptom has been used at present (Griffith, 1987). Although,

this illness occur without internal symptom (Franco, 1964). Wilt coconut tree from

160

Conceicao de Macabu was infected by B. cocophilus and was infested by weevil

vector, R. palmarum but did not shown internal symptoms.

Red Ring external symptoms were confined to the leaves, which turn yellow

from the tip of the leaflefts to the basis of the raquis and, then, turn brown. Leaf

symptoms start on the lowest leaves and progress upward. Internal symptom is a

circular alteration in cortex tissue of affected organs and it is usually red in tall

cultivars but may be browner in dwarf cultivars and hybrids. Internal symptom is

fully developed before external symptoms became visible (Franco, 1964; Griffith,

1987). Oil palms from north of Rio de Janeiro state presenting all external and

internal symptoms of Red Ring were infected by PPN morphologically distinct of B.

cocophilus. These results suggest that Red Ring disease might have more of one

etiological agent. We believe that is yet an open question.

Conclusion

1. Plant parasite nematodes isolate of Cocos nucifera L. variety Malayan

Green Dwarf, Elaeis guineensis Jacq. and Attalea funifera Mart. collected in

Estacao Experimental Lemos Maia, at southeast of Bahia state, Brazil, can be

classified as Bursaphelencus (Rhadinaphelencus) cocophilus on bases in its

anatomical and morphological aspects previously described (Baujard, 1989;

Giblin-Davis et al., 1989).

2. Plant parasite nematodes isolate of C. nucifera L. ecotype Green Dwarf

collected in commercial farms at north of Rio de Janeiro state, Brazil, can be also

classified as Bursaphelencus (Rhadinaphelencus) cocophilus on bases in its

anatomical and morphological aspects previously described (Baujard, 1989;

Giblin-Davis et al., 1989).

3. Plant parasite nematodes isolate of Elaeis sp. collected in commercial

bovine farms at north of Rio de Janeiro state, Brazil, do not show morphological

characters of the genus Bursaphelencus (Baujard, 1989; Giblin-Davis et al., 1989).

Although, oil palms present external and internal symptoms of Red Ring disease.

4. Symptomatic C. nucifera L. ecotype Green Dwarf collected in commercial

farms at north of Rio de Janeiro state, Brazil, was highly infected by B. cocophilus

161

but did not show red ring internal symptom, confirming previous data (Franco,

1964).

5. Symptomatic oil palms collected in commercial bovine farms at north of

Rio de Janeiro state, Brazil, was highly infected by plant parasites nematodes and

palms showed all red ring internal and external symptoms of Red Ring disease

suggesting that this disease can have diverse plant parasite nematodes as

etiological agent.

Acknowledgements

We wish to thank the staff of the Estação Experimental Lemos Maia, Centro

de Pesquisas do Cacau, Comissao Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira

(CEPEC/CEPLAC) and Associacao dos Produtores Rurais de Santa Maria

(APRUSAM) for their cooperation in this project. This research was supported by

Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico, CNPq.

Fundacao Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de

Janeiro, FAPERJ and Parque de Alta Tecnologia do Norte Fluminense,

TECnorte/FENORTE.

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Legends to the figures

Figure 1 – Extract of apical meristem of Cocos nucifera ecotype Green Dwarf from

Sabor de Macabu farm, Rio de Janeiro state. Bursaphelenchus cocophilus female

presenting filiform posterior end. LM (DIC).

Figure 2 – Extract of apical meristem of C. nucifera ecotype Green Dwarf from

Sabor de Macabu farm, Rio de Janeiro state. B. cocophilus female anterior end.

Note stylet (arrow) and neck (open arrow). LM (DIC).

Figure 3 – Extract of apical meristem of C. nucifera ecotype Green Dwarf from

Sabor de Macabu farm, Rio de Janeiro state. B. cocophilus female posterior

showing filiform tail. LM (DIC).

Figure 4 – Transverse section of apical meristem of C. nucifera variety Malayan

Green Dwarf from EELM, Bahia, state. Juvenile B. cocophilus female with body

and posterior end exposed while anterior end is immersed in plant parenchyma.

Note filiform posterior end. SEM.

Figure 5 – Nine juveniles of B. cocophilus showing morphology similar to adults

and immersed in plant parenchyma of Attalea funifera from Southeast Bahia .

SEM.

Figure 6 – Egg of B. cocophilus in lesion of Attalea funifera parenchyma, palm

from southeast Bahia state. Smooth external and roughly internal surface can be

observed. SEM.

Figure 7 – B. cocophilus in en face pattern. Oral aperture (open arrow)

surrounded by labial disc and six lip sectors are identifiable. A protrude above

edge is visualized circling lip sectors. Amphid apertures (black/white arrows).

Cephalic transverse striation (bracket). Nematode isolate of Attalea funifera from

southeast Bahia state. SEM.

166

Figure 8 – Ejected stylet (black/white arrow) of B. cocophilus presenting conical

form. Transverse striations are absent in the neck. Parasite isolated of Attalea

funifera from southeast Bahia state. SEM.

Figure 9 – Anterior end of B. cocophilus with non ejected stylet presenting smooth

neck. Note identical en face (black/white arrow) pattern of figure 8. Amphid

aperture can be observed (arrow). Parasite isolated of Attalea funifera from

southeast Bahia state. SEM.

Figure 10 – Transverse striations are absent in the cephalic end of on ejected

stylet of B. cocophilus. Amphid aperture can be observed (arrow). Parasite

isolated of Elaeis guineensis from southeast Bahia state. SEM.

Figure 11 – B. cocophilus isolate of Attalea funifera from southeast Bahia state.

Transverse striations in middle body of nematode. Two longitudinal striations

(black/white arrow) limiting smooth area occur laterally. SEM.

Figure 12 – B. cocophilus male lateral view. Posterior end showing semi-conical

spicule laterally protrude ending in two slender striations (black/white arrow).

Parasite isolate of Attalea funifera from southeast Bahia state. SEM.

Figure 13 – Posterior end of B. cocophilus showing typical bursa or caudal alea.

Nematode during cuticular molt. Note small aperture close to tail end (open arrow).

Parasite isolate of Attalea funifera from southeast Bahia state. SEM.

Figure 14 – Vulval aperture (black/white arrow) in posterior body of B. cocophilus

just before cuticular molt. Note crescent moon aspect of the structure. Parasite

isolate of Attalea funifera from southeast Bahia state. SEM.

Figure 15 – En face pattern of plant parasite nematode (PPN) presenting three

structures (black/white arrow) covering oral opening. Amphid aperture can be

observed . PPN isolate of Elaeis sp from Rio de Janeiro state. SEM.

Figure 16 – Frontal view of plant parasite nematode showing six cephalic sectors

(black/white arrow) surrounding oral aperture. PPN isolate of Elaeis sp from Rio de

Janeiro state. SEM.

Figure 17 – Lateral view of plant parasite nematode (PPN). Cephalic region is not

identifiable. Amphid aperture can be observed (black/white arrow). Smooth

transverse striations presenting protrude anterior edge are visualized (open

arrow). PPN isolate of Elaeis sp from Rio de Janeiro state. SEM.

167

Figure 18 – Lateral view of plant parasite nematode (PPN) just after molt. Parasite

presenting smooth transverse striations and five longitudinal striations (black/white

arrow) and its old cuticle (arrow) close to body. PPN isolate of Elaeis sp from Rio

de Janeiro state. SEM.

Figure 19 – Lateral view of adult plant parasite nematode (PPN) presenting

convex transverse striations and four deep longitudinal striations (black/white

arrow). PPN isolate of Elaeis sp from Rio de Janeiro state. SEM.

Figure 20 – Lateral view of juvenile plant parasite nematode, laterally showing five

deep longitudinal striations (black/white arrow). Transverse striations are

apparently and limited by thin protrusions. Anal aperture (open arrow). PPN isolate

of Elaeis sp from Rio de Janeiro state. SEM.

Figure 21 – High magnification of same nematode of figure 20. Male plant

parasite nematode showing anal aperture (open arrow). Transverse striations

present a delicately rough relief and are limited by thin protrusions. PPN isolate of

Elaeis sp from Rio de Janeiro state. SEM.

168

1 25 µm

2

3 5 µm

20 µm

20 µm

4 50 µm

5

6 7 8

9 10

20 µm 5 µm 1 µm

5 µm 1 µm 2 µm 11

169

2 µm 15 5 µm

16

5 µm

5 µm 19

17 20 µm

20

5 µm 18 21

2 µm

12 13 14 10 µm

1 µm

10 µm

170

DISCUSSÃO

A cocoicultura no norte fluminense

Em geral, produtores rurais com propriedades de dimensões superiores a

1000 hectares revelaram-se extremamente conservadores, mesmo sendo

detentores de um nível de instrução mais elevado. Estes normalmente confiam

suas propriedade a encarregados sendo comum identificar nesses grupos,

empresários vinculados a mais de um ramo, não só os relacionados à

agropecuária. Provavelmente, por possuírem atividade diversificada, se

apresentaram mais restritivos a empreendimentos diferentes aos tradicionais da

região.

Nas propriedades com dimensões variando entre 1000 e 100 hectares, se

identificou proprietários que apresentavam nível de educação formal oscilando

entre o ensino médio e o superior, usualmente, graduação em áreas dispares da

agropecuária. O perfil sócio-econômico se completava com atividades

empresariais voltadas para outros ramos da economia. No entanto, estavam

freqüentemente presentes em suas propriedades e disponíveis a implementar

novas tecnologias. Tal grupo revelou-se extremamente consciente em relação à

diversificação nas propriedades, sendo freqüente a fruticultura associada à

pecuária bovina de corte e leite. Dentre as fruteiras, a cocoicultura encontra-se

em expansão neste grupo.

Há uma relação direta, com raras exceções, entre o tamanho da

propriedade e o nível de instrução formal. Produtores rurais de áreas menores

que 100 hectares podem ser subdivididos em grupos: herdeiros, assentados,

171

posseiros e outros. A fruticultura, com destaque para cocoicultura, e criação de

animais de pequeno porte, principalmente suínos e caprinos, são as principais

atividades deste grupo. Freqüentemente, a condução da lavoura era feita de uma

maneira extremamente leiga e o trato cultural praticamente inexistente.

De acordo com o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, o

agronegócio brasileiro é uma atividade próspera, segura e rentável por ser

moderno, eficiente e competitivo. E, o agronegócio é responsável por 33 % do

Produto Interno Bruto (PIB), 42 % das exportações totais e 37 % dos empregos

brasileiros. O Brasil tem 388 milhões de hectares de terras agricultáveis férteis e

de alta produtividade, dos quais 27 % ainda não explorados (MAPA, 2005). A

agricultura na região norte fluminense confronta-se com estes dados por não

revelar modernidade, eficiência e competitividade. Por outro lado, praticamente

não há terras produtivas a serem exploradas na região.

O Programa de desenvolvimento da fruticultura – PROFRUTA – visa

consolidar padrões de qualidade e competitividade da fruticultura brasileira, em

conformidade com requisitos de mercado interno e externo e expressa uma das

prioridades estratégicas do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

(MAPA, 2005). O programa FRUTIFICAR tem como missão e objetivo

“implementar políticas públicas voltadas à agricultura familiar e a todo o

agronegócio, cumprindo uma agenda social com ênfase na geração de

oportunidades de trabalho e renda para o desenvolvimento sustentável e o

fortalecimento do interior do Estado do Rio de Janeiro” (SEAAPI, 2005). No

entanto, a falta de acesso aos órgãos extencionistas, públicos e competentes, era

comum na quase totalidade das propriedades do norte fluminense.

Paralelamente, verificou-se a ausência de profissionais, responsáveis pela

assessoria técnica nestas propriedades, comprometendo o manejo e a

segurança. Este quadro talvez seja o responsável pelos baixos índices de

produtividade. Muitos plantios apresentavam a produtividade inferior a 100 frutos

por ano, dados que se mostram conflitantes aos disponibilizados por instituições

governamentais. Por outro lado, o manejo integrado de pragas e patógenos é

preconizado na agricultura moderna (Agrios, 1997). Fato contrastante com o

verificado em grande parte das pequenas e médias propriedades no norte

fluminense que se revelarem como potenciais reservatórios de pragas e doenças.

172

A Instrução Normativa n° 6, de 13 de março de 2000, do Ministério da

Agricultura, Pecuária e Abastecimento, considerando a exigência da Certificação

Fitossanitária pela Convenção Internacional de Proteção dos Vegetais, altera o

Certificado Fitossanitário de Origem e institui o Certificado Fitossanitário de

Origem Consolidado, visando atestar a qualidade fitossanitária de origem das

cargas de produtos vegetais, bem como, coibir o trânsito de produtos potenciais

veículos de pragas quarentenárias. Por outro lado, a produtividade da cocoicultura

está relacionada ao objetivo e a variedade, a cultivar ou ao ecotipo que cumpra

este objetivo (Ferreira et al., 1998; Olher, 1999). No norte fluminense, o uso de

mudas certificadas é raro, refletindo a deficiência de incentivos governamentais

na certificação e fitossanidade das mudas empregadas nos plantios. Porém,

algumas exceções devem ser salientadas como as do Município de Quissamã,

que vem se apresentando com uma cocoicultura sólida, potencialmente aliada ao

pioneirismo. Destacamos também a Associação dos Produtores Rurais de Santa

Maria – APRUSAM – no Município de Conceição de Macabu, por ter vinculada a

seus quadros produtores motivados a transformar a cocoicultura como principal

fonte de renda em detrimento da pecuária leiteira.

Em relação aos espaçamentos e tratos culturais mais uma vez o grupo de

produtores com 100 a 1000 hectares é o que apresenta melhor panorama, porém

distante do ideal do ponto de vista agronômico. Child (1974), Ferreira e

colaboradores (1994, 1998), Fontes (2003) sugerem espaçamentos de 7,5 x 7,5

metros variedades anãs; 8,5 X 8,5 metros híbridos; 9 X 9 metros a 11 X 11 metros

variedades gigantes. Foi observado na maioria das vezes espaçamentos

superiores a 8,5 X 8,5 metros com emprego de variedades anãs e a distribuição

das plantas em triângulo equilátero é infreqüente.

A Lei nº 7802, de 11 de julho de 1989, dispõe sobre a pesquisa, a

experimentação, a produção, a embalagem e rotulagem, o transporte,

armazenamento, a comercialização, a propaganda comercial, a utilização, a

importação, a exportação, o destino final dos resíduos das embalagens, o

registro, a classificação, o controle, a inspeção e a fiscalização de agrotóxicos,

seus componentes e afins. Na maioria das propriedades do norte fluminense a

legislação e seus regulamentos são praticamente ignorados. Além disso, a

utilização de defensivos e insumos agrícolas não recebe o acuro necessário no

que tange especificidade do produto a cultura, a dosagem correta, e a

173

periodicidade das aplicações. Esta conduta pode provocar o desenvolvimento de

pragas resistentes e potencialmente perigosas na região, como as coleobrocas

que podem ser vetores de murchas permanentes, e comprometer a produção de

uma maneira acentuada. Leal e colaboradores (1998) estabeleceram que a

cocoicultura tem uma perda de até 50 % da produção pela ação de pragas.

Contudo, a falta de periodicidade revela-se positiva com relação à saúde humana,

pois os prazos de carência dos defensivos utilizados são sempre respeitados.

Todavia essa situação é relativamente difícil de avaliar, pois estudos de

monitoramento da qualidade da água de coco verde, quanto a resíduos de

pesticidas são escassos (Brito et al., 2002). Um exemplo ilustrativo, Moura &

Vilela (1996) recomendam quatro pulverizações anuais dirigidas às

inflorescências para controle de H. coriaceus uma praga bastante freqüente nessa

região. No decurso das visitas de campo não foi verificada nenhuma pulverização

com esse intervalo.

O emprego de consórcios simples e múltiplos é uma forma do produtor

agregar valor à cocoicultura (Olher, 1999). O uso de consórcios na região norte

fluminense tem se revelado diversificado, porém verifica-se um desconhecimento,

em relação às técnicas, espaçamentos e os consortes adaptados às condições da

região. A competição por luz e nutrientes é freqüentemente observada. Havendo,

o favorecimento de doenças fúngicas. O pastoreio de bovinos, caprinos e ovinos

sob o coqueiral é uma alternativa viável desde que seja respeitado o

desenvolvimento das plantas. De acordo com Fontes (2003), a consorciação

entre linhas e na faixa de plantio do coqueiro é viável e diminui os custos de

produção e implantação da cultura, bem como o consórcio coqueiro X pecuária

reduz as roçagens e otimizam o uso do espaço.

A adubação das plantas, quando existente, optava-se pelo uso de

formulações. Correções de fertilidade baseadas na análise do solo foram

incomuns. Nesse contexto, o cuidado com reposição de micronutrientes era

esquecido, cuja deficiência sempre foi verificada. Woodroof (1970) relata que os

cultivos devem sempre seguir as recomendações de adubações, pois o fruto do

coqueiro é bastante completo no que se refere ao suprimento de lipídios,

carboidratos e proteínas; e que por ter uma produção distribuída ao longo dos

doze meses do ano exigem muito das plantas, essas recomendações também

estão de acordo com as propostas por Child (1974) e Grinwood (1975). Muitas

174

das doenças diagnosticadas nesse estudo, principalmente as fúngicas estão

relacionadas a estados nutricionais deficitários e estresses relacionados a déficit

hídricos, que reduzem a eficácia e a eficiência do sistema de defesa das plantas,

estado esse descritos por Agrios (1997) e Bergamin Filho (1995). Onde os

déficits hídricos, possivelmente existiram em função da irregularidade das chuvas

na região de acordo com dados da EMBRAPA Agrobiologia (2005) principalmente

nas propriedades, onde não apresentavam sistemas de irrigação. Não obstante

as propriedades que empregavam sistema de irrigação não demonstravam o

acuro devido com sistema, como qualidade da água e nesse contexto o sistema

de filtragem, fundamental na microaspersão, que era sempre esquecido. Esta

prática comprometia a aplicação de uma lâmina d’água correta. Bernardo (1995)

recomenda que o sistema de filtros na microaspersão seja verificado a cada

semana e o sistema de retro-lavagem executado a cada dois dias, todavia muitos

sistemas observados nesse estudo estavam inoperantes, ou funcionando de uma

maneira deficiente.

Murchas permanentes da família Arecaceae na região norte fluminense

Na região norte fluminense foram identificadas murchas permanentes

causadas por Phytoplasmas, Phytomonas staheli (Trypanosomatidae) e

Bursaphelenchus cocophilus (Nematoda) causando amarelecimento letal, murcha

fatal e anel vermelho, respectivamente. No entanto, os vetores destes patógenos

não foram imputados na região, exceto para anel vermelho. O controle destas

doenças está vinculado ao controle de vetores, sendo que estes podem também

se comportar como praga para a cultura (Mariano,1997; Ferreira et al., 1998; Lee

et al., 2000). Sendo assim, o combate aos vetores se apresenta como a principal

alternativa ao controle das supracitadas murchas. Defensivos químicos aparecem

como a principal alternativa na região.

Em 1967, foram observadas, por microscopia eletrônica de transmissão, no

floema de plantas afetadas por amarelecimento a presença de estruturas

pleiomórficas, circundadas por uma única membrana semelhante a micoplasmas

humanos (Doi et al., 1967). A morfometria revela patógenos com diâmetros

variando de 200 a 800nm (Lee & Davis, 1992). Todavia, apresentam acentuado

pleiomorfismo variando desde estruturas esféricas a filamentosas, identificadas

175

por microscopia óptica e microscopia eletrônica (Haggis & Sinhá, 1978; Waters &

Osborne, 1978; Lee & Davis, 1983). A sintomatologia de plantas susceptíveis a

fitoplasma exibe desordens morfofisiológicas. No entanto, A extensão de sinais,

sintomas e severidade da infecção variam de acordo com a interação

fitoplasma/planta (Lee et al., 2000). Na cocoicultura, as variedades gigantes

apresentam sintomatologia agravada quando comparada às variedades anãs.

Nas primeiras ocorre um bronzeamento exacerbado das folhas, associado a um

atrofiamento das inflorescências, que não chegam emergir da espata

(Mariano,1997). Experiências no México tem demonstrado que a variedade Anão

Amarelo da Malásia é a variedade que apresentou as menores perdas por

amarelecimento letal, inferior a 6%, indicando o seu uso em programas de

melhoramento genético (Zizumbo-Villarreal & Colunga-GarciaMarin, 2001).

A disseminação destes patógenos, ocorre fundamentalmente através de

insetos picadores sugadores, destacando os membros da família CICADELIDAE

e FULGORIDAE (Banttari & Zeyen, 1979; Brc´ak, 1979; Grylls, 1979; Tsai, 1979;

Nielson, 1979). Todavia, a transmissão mecânica não tem sido descrita (Lee &

Davis, 1992; Lee et al., 2000). Epidemias de Amarelecimento Letal no México,

Flórida e Caribe relacionam a mesma com a presença do inseto Myndus crudus

(Cixidae) (Eden-Green, 1978; Eden-Green & Schuiling, 1978; Howard et al., 1983;

Howard et al., 2001; Mariano,1997). No entanto, o vetor ou vetores de

Amarelecimento Letal na região norte fluminense ainda não foi identificado.

Murcha de Phytomonas, “murcha fatal” ou “hartrot” – uma palavra

holandesa, que se assemelha a corruptela em inglês de “heart rot” – é uma

murcha permanente ou irreversível que tem como agente etiológico Phytomonas

staheli (McGhee & McGhee, 1979) infectando os elementos de tubo crivado do

floema (Dollet et al., 1977, Camargo, 1999). Doença similar em dendezeiros é

denominada “Marchitez sorpressiva” (Parthasarathy et al., 1976). No Brasil, a

“Marchitez sorpresiva” foi inicialmente descrita em cultivares experimentais do sul

da Bahia (Oliveira & Bezerra, 1982); e, vem se constituindo em uma das mais

sérias enfermidades da cultura do dendê na Bahia, principalmente porque a morte

da planta se dá 4 a 5 meses após os primeiros sintomas (Oliveira et al., 1987); e,

a “murcha de Phytomonas” foi primeiramente descrita na cultura de coqueiro da

região sudeste da Bahia (Bezerra & Figueiredo, 1982), podendo ser considerada

uma área endêmica (Moura et al., 2002). Nesta região, tem sido realizada

176

transmissão experimental utilizando Lincus lobuliger (Hemiptera, Pentatomidae),

sendo que pela primeira vez se demonstrou a transmissão de P. staheli de

coqueiros, para dendezeiros (Rezende et al., 1986). Na família Arecaceae,

Oclerus ssp., Lincus ssp, L. crupius, L. vandoesburgi e L. lobulliger

(Pentatomidae) têm sido imputados como vetores de P. staheli (Wallace et al.,

1992). No Estado do Rio de Janeiro, no Município de Quissamã, foi identificada a

murcha de Phytomonas em Cocos nucifera (da Cunha et al., 1995). No entanto,

até o momento, não foi obtido sucesso na identificação de vetores apesar do

intensivo emprego de armadilhas experimentais no decurso de 2000 – 2004.

O insucesso deste estudo na captura de insetos com hábito picador –

sugador os principais vetores de “Murcha de Fitomonas” e “Murcha por

Fitoplasma” como o “balde suspenso” na axila da décima folha e as “enterradas”

na base da estipe pode estar relacionado a comportamento destes insetos.

Haword e colaboradores (2001) argumentam que insetos de hábito picador

sugador se alimentam ou são atraídos por cores, podendo também compostos

voláteis liberados pelas plantas, serem responsáveis pela atração desses insetos.

Nesse contexto, de acordo com esses autores, tais insetos tem um hábito

explorador, podendo picar uma planta aleatoriamente no decurso de sua busca

por alimentos. Sendo assim a ausência dos vetores relatados pela literatura no

Norte Fluminense, potencializam a existência de uma ou outras espécies

diferentes, portando-se como vetores esporádicos dessas enfermidades da

cultura do coqueiro na região.

Em plantas da família Arecaceae economicamente importantes, o

Bursaphelencus cocophylus (Cobb, 1919) Baujard, 1989, agente etiológico do

anel vermelho, ocorre em piaçava, coco e dendê (Franco, 1964; Ferreira et al.,

1998). Seu ciclo de vida completa-se em até 10 dias e tem como vetor

Rynchophorus palmarum (COLEOPTERA:CURCULIONIDAE). Desde os

experimentos pioneiros de Bondar (1940), diversos tipos de armadilhas ou

sistemas de captura têm sido desenvolvidos para o controle destes insetos

(Moura et al., 1990). O uso de inimigos naturais e captura massal de insetos, por

intermédio de armadilhas tem um papel, importante na agricultura moderna, pela

redução no uso de defensivos e conseqüente melhora ambiental. Experiências

bem sucedidas como as de Moura e colaboladores (1990) na captura de vetores

do “anel vermelho” com uso de armadilhas despontam como uma alternativa

177

viável e amplamente difundida na cocoicultura. Todavia o uso de captura massal

de insetos no norte fluminense evidencia-se como uma prática pouco difundida.

Desta forma a idealização das armadilhas objetivou propor alternativas de

controle a insetos vetores e não vetores e identificá-los também, bem como

avaliar o quadro de infestação na região. Os resultados foram produtivos na

captura de Rhynchophorus palmarum L. e teve um papel secundário no combate

a uma praga que não esta relacionada com a cocoicultura, mas de outra cultura

bastante difundida na região que é a bananeira (Musa paradisiaca L), onde a

praga é conhecida como “moleque-da-bananeira – Cosmopolites sordidus

(Germar, 1824) vinculada a perdas da ordem de até 80 %. As armadilhas tipo

balde mostraram-se bastante eficientes mesmo sem o uso de ferômonio. Valendo

salientar que as armadilhas tipo “pet” mostraram-se como uma alternativa de fácil

acesso aos produtores e uma opção viável a um dos principais problemas de lixo

urbano, que é o destino de garrafas plásticas. Por outro lado, Faleiro e

colaboradores (2002) usando cana-de-açúcar e ferômonio mostraram-se

próximos dos relatados nesse estudo nos períodos de menor infestação relatados

por aqueles autores. Romano & D’Agostino (2003), também usando ferômonio

atrativo na captura de C. sordidus, atingiram níveis de captura semelhantes aos

descrito nesse estudo, ressaltando-se também que as iscas usadas por aqueles

autores envolvia no uso de pseudo-caule da banana.

Controle biológico e coleta massal de vetores

Mass Trapping and Classical Biological Control of Rhynchophorus palmarum L.

1794 (Coleoptera:Curculionidae). A hypothesis based in morphological evidences.

Murchas permanentes em Bactris gasipaes

Scanning Electron Microscopy of Wilt Disease in Peach Palm [Pupunha] - (Bactris

gasipaes, Kunth). (vide manuscrito)

A interação Phytoplasma palmae/Cocos nucifera

178

A Light and Electron Microscope Study of Coconut Tree, Cocos nucifera L.

(Arecaceae), affected by Phytoplasmas, (vide manuscrito).

A interação Phytomonas s taheli/Cocos nucifera

Structural study of Phytomonas stahely and Cocos nucifera interactions, (vide

manuscrito).

A interação Bursaphelenchus cocophilus - Attalea funifera - Cocos nucifera -

Elaeis guineensis

Scanning Electron Microscopy of Bursaphelencus cocophilus (Cobb, 1919)

Baujard 1989 (Nematoda: Tylenchida), (vide manuscrito).

A interação patógeno/planta no Estado do Rio de Jan eiro e no Estado da

Bahia

O sucesso para o estabelecimento de uma doença está relacionado com a

disponibilidade de três fatores: o patógeno, o hospedeiro e o meio ambiente.

Considerando-se o binômio patógeno/hospedeiro, pode-se acrescentar um quarto

fator, isto é, a pré-disponibilidade a interações físicas, bioquímicas e moleculares

mutuas. Desta forma o meio ambiente se associa no gerenciamento dessa união

criando condições, físicas, químicas e climáticas para o estabelecimento de uma

doença (Lucas, 1998; Agrios, 1997). A agricultura moderna voltada para o

agronegócio tem envolvido o aumento das áreas de plantio e pela

homogeneidade da produção e dos produtos. Do ponto de vista epidemiológico,

tal uniformidade pode desencadear conseqüências devastadoras, diante do

surgimento de pragas e doenças incontroláveis (Lucas, 1998). Murcha fatal e anel

vermelho têm sido consideradas doenças endêmicas no sudeste da Bahia devido

à incidência baixa, porém constante (Moura et al., 2002). Neste trabalho

constatou-se a ocorrência de casos esporádicos destas doenças na região norte

fluminense. No entanto, deve-se considerar que desde os primórdios da

cocoicultura extensiva na região norte fluminense este perfil tem se mantido

179

constante (da Cunha, 1998). Assim, não pode ser descartada a hipótese de um

surto epidêmico na região.

No binômio patógeno/hospedeiro tem sido considerada a vertente

patógeno/hospedeiros, ou seja, uma espécie afetando diversos hospedeiros

(Lucas, 1998). Plantas reservatório é um conceito que associa, usualmente, uma

outra espécie da mesma família como reservatório natural, susceptível ou não, a

determinado patógeno. Tal conceito tem sido demonstrado em relação a P. staheli

(Camargo, 1999; Dollet, 2001) e B. cocophilus (Franco, 1964, Griffith, 1987).

Apesar da cocoicultura extensiva ter sido implantada na região norte fluminense

no início da década de 1990, desde o início da fase produtiva tem sido relatados

casos de infecções por P. staheli no Município de Quissamã (da Cunha, 1998) e

de Conceição de Macabu (Magalhães et al., 2001) e por B. cocophilus, e

provavelmente outros nematóides patógenos de plantas com sintomatologia de

Anel Vermelho, no Município de Conceição de Macabu (Miguens et al., 2003). Em

relação a Anel Vermelho, constatou-se que Elaeis sp. pode ser considerada

planta reservatório da doença. No entanto, tratando-se da Murcha Fatal tal

questão permanece em aberto. O diagnóstico de Amarelecimento Letal no

Município de São João da Barra é preocupante, considerando-se a ignorância da

fenologia dos plantios na região norte fluminense e o trafego indiscriminados de

mudas e produtos da cocoicultura. Deve-se considerar ser este o primeiro relato

da doença no sudeste do Brasil. O Amarelecimento Letal apresenta um

considerável nível de perdas em epidemias em outras áreas de cultivo extensivo

(CABI/EPPO, 1990; Howard, 1983, 1995; Llauger et al., 2002). Na região sudeste

da Bahia, diagnósticos de infecções por fitoplasmas ainda não foram relatados.

Um dos fatores do trinômio das doenças, o meio ambiente, pode

apresentar-se como limitante da dispersão de patógenos através de barreiras

geográficas e edafoclimáticas (do Vale & Zambolim, 1996; Agrios, 1997, Lucas,

1998). A região norte fluminense e a sudeste da Bahia apresentam condições

edafoclimáticas distintas. No entanto, diversas fitopatologias da cocoicultura estão

presentes em ambas regiões. Um aspecto paralelo, porém relevante, prende-se a

continuidade de plantas reservatório, apesar da descontinuidade edafoclimáticas.

Tal fato é exemplificado em campanhas de campo no trecho rodoviário Campos

dos Goytacazes (RJ) – Ilhéus (BA).

180

O fracasso de uma epidemia pode estar associado à existência de

patotipos, ou seja, a diversidade genotípica dos patógenos de uma região e

extrapolando para os vetores que também podem distinguir duas regiões (Lucas,

1998). Tem sido sugerido, com base na análise de DNA do cinetoplasto, que P.

staheli pode apresentar patotipos regionais (Dollet, 2001). Recentemente,

morfotipos de P. staheli foram descritos em cocultivo in vitro isolados de C.

nucifera do Município de Conceição de Macabu (RJ) e de Una (BA) (Keller, 2005).

Assim, dentre as fitopatologias descritas para ambas regiões, a única que

possivelmente encontra suporte na literatura é a Murcha Fatal.

Juliatti & Santos (1999) consideram a avaliação de doenças de plantas

como uma tarefa importante em fitopatologia, porém os métodos usados pelos

fitopatologistas na avaliação das doenças empregam uma metodologia subjetiva.

E a fitopatometria passa a ser o ramo da fitopatologia envolvido nesta avaliação

onde a doença é avaliada baseando-se na intensidade dos sintomas e ou sinais

(Azevedo, 1998). A histopatologia as interações patógeno/Arecaceae no norte

fluminense e sudeste da Bahia, não apresentaram nenhuma peculiaridade. No

entanto, o refinamento e a diversidade metodológica poderá alterar a realidade

atual.

181

C0NCLUSÕES GERAIS

O panaroma agronômico da cocoicultura no Norte Fluminense revelou,

uma demanda dos produtores rurais pelos órgãos públicos no que tange o

monitoramento fitossanitário, a extensão e assistência técnica rural. Papel esse

desempenhado pelos setores da administração pública vinculada a agricultura.

Foi observado, uma forte expansão dos cultivos de coco na região Norte

Fluminense, com grande parte dos cultivos em idade inferior a cinco anos de

plantio.

Uma forte solução de continuidade com respeito à presença de plantas

com sintomas de murchas permanentes foi identificada ao longo do trecho

rodoviário que liga Campos dos Goytacazes – RJ a Una – BA, porém as

diferenças edafoclimáticas entre as duas regiões de estudo não eram

concernentes, demonstrando condições de vetores e epidemiologia distintas.

O uso de armadilhas tipo “balde” e “pet” revelaram-se eficazes na coleta de

insetos vetores, principalmente com relação ao Rhynchophorus palmarum – vetor

do anel vermelho, e outros insetos que não estão relacionados com a cocoicultura

como o Cosmopolites sordidus. Essas armadilhas tiveram sua eficiência

amplificada quando era utilizado em conjunto cariomôneos e um macho atrativo

de R. palmarum.

182

A grande presença de ácaros associados às partes móveis de R.

palmarum, onde estes aparentemente completavam seu ciclo associado ao

inseto, os caracterizavam como possíveis agentes de controle biológico.

O forte desenvolvimento micelial no parênquima fundamental e

esporadicamente no feixe condutor de Bactris gasipaes - pupunheira, sugerem

que a sintomatologia de murcha permanente identificada em exemplares dessas

plantas adultas, coletadas na região Sudeste da Bahia, tem origem fúngica.

A sintomatologia de murcha permanente e a presença de organismos

pleomórficos encontrados no floema de Cocos nucifera L. coletados em São João

da Barra – Norte Fluminense, conferem o diagnóstico de murcha por fitoplasma

nas plantas coletadas.

É possível correlacionar os sintomas externos e internos de murcha-por-

Phytomonas em Cocos nucifera L..

A forte presença de calose nos elementos de tubo crivado do floema e a

ausência de plastídeos no interior dos mesmos infectados por Phytomonas staheli

sugerem que em casos de infecção de C. nucifera por Phytomonas staheli este

aspecto ultraestrutural é uma resposta da planta a presença desses patógenos,

obliterando os mesmos.

Os sintomas de anel vermelho identificados no Norte Fluminense

comparados com os identificados no Sudeste da Bahia revelaram-se

semelhantes, porém a micromorfologia externa de nematóides encontrados em

Elaeis spp – dendê com sintomas típicos de anel vermelho encontrados no Norte

Fluminense, revelaram-se distintas das micromorfologias típicas de

Bursaphelenchus cocophilus descritas na literatura e identificadas em Elaeis

guineensis, Attalea funifera e Cocos nucifera, coletados no Sudeste da Bahia,

bem como em um único exemplar de Cocos nucifera coletado no Norte

Fluminense, com sintomatologia atípica de anel vermelho.

183

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