Universidade de So Paulo

Instituto de Qumica de So Carlos

Otimizao de mtodo QuEChERS para determinao de

sulfonamidas presentes em lodo floculado com posterior anlise

em LC-ESI-TOF.

Edvaldo Vasconcelos Soares Maciel

Orientador: Professor Doutor lvaro Jos dos Santos Neto

So Carlos, dezembro de 2014.

AUTORIZO A DIVULGAO E REPRODUO DE TODO O CONTEDO

CONTIDO NESTE TRABALHO PARA FINS DIDTICOS OU DE PESQUISA, COM

A DEVIDA CITAO SOBRE A FONTE DO MESMO.

Todo homem tem o direito de decidir sobre o seu prprio destino

Robert Nesta Marley

Dedicatria

Ao senhor Maciel e a dona Cida pelo amor e por acreditarem em mim durante todo

este tempo, sem vocs eu jamais chegaria at aqui.

Agradecimentos

Agradeo ao Professor Doutor lvaro Jos dos Santos Neto, pelo apoio,

pacincia, pelos conselhos, e por ter me dado a oportunidade de desenvolver

este trabalho.

Ao grupo de cromatografia do IQSC, principalmente a Marassa pela ajuda,

pacincia e a amizade.

A Professora Doutora Eny Maria Vieira e ao Professor Doutor Igor Renato

Bertoni Olivares, por serem profissionais que eu me espelho e admiro, e por

terem aceitado fazer parte da minha banca.

A minha namorada Thas, pela pacincia, carinho e acima de tudo por estar

ao meu lado nas horas mais difceis.

A toda a Repblica Irmos Metralha pelos ensinamentos, pelo abrigo e por ter

feito de mim um homem com seus alicerces fincados na amizade e no amor

pelas pessoas e pela famlia.

Aos meus avs de considerao Jos Alceu e Dona Jandira, pelo amor e

carinho por algum que nunca fez parte da famlia.

A minha turma, principalmente ao Rodrigo, Leonardo, Douglas, Augusto,

Fernando pelos dias de estudo, ou pelas prticas de laboratrio sempre feitas

com esforo e alegria.

E por ltimo a Deus, pela energia e pela f que sempre foi o meu jogo de

cintura para as horas difceis.

Resumo

Este presente trabalho tem como enfoque a otimizao de um mtodo baseado em QuEChERS para preparo de amostra proveniente de lodo de esgoto, com posterior identificao de compostos denominados sulfonamidas utilizados na formulao de antibiticos de uso veterinrio e humano. O mtodo denominado QuEChERS surgiu da necessidade de se criar um procedimento de preparo amostral melhorado considerando a necessidade de realizar diversas anlises de rotina em laboratrios. Sendo assim, podemos dizer que o mesmo apresenta certa simplicidade, resumida em poucas etapas onde rapidamente pode-se obter um clean-up da amostra com a utilizao de poucos recursos como: volume de solvente, e pessoal treinado. Para o tratamento da amostra em questo, foi ento empregado o mtodo com algumas modificaes, que foram avaliadas atravs de planejamento experimental obtido pelo software STATISTICA. O desenvolvimento do projeto foi ento efetuado com a realizao de testes considerando variveis como: fase orgnica utilizada na extrao, proporo e volume de fase aquosa/orgnica, quantidade de sal complexante (NaCL e MgSO4) e utilizao de adsorvente como PSA, C18 e grafite, permitindo assim que o procedimento fosse otimizado visando a melhor condio de utilizao do mtodo QuEChERS considerando a matriz lodo e a classe de analitos das sulfonamidas. As variveis independentes (proporo de ACN e H2O como solvente de extrao, volume de solvente, proporo de NaCl e quantidade de MgSO4) da etapa de extrao foram ento avaliadas de acordo com planejamento experimenta e mostraram-se significativas para o aumento da eficincia de extrao a proporo de gua e acetonitrila utilizadas como solventes de extrao e quantidade de MgSO4. A partir dos resultados obtidos pelo planejamento a melhor condio de extrao foi obtida com 4,0 g de amostra, 8,0 mL de solvente na proporo 80% ANC (0,1% cido frmico) e 20% H2O, 30% de NaCl (m/v) e 40 mg de MgSO4.

ABSTRACT

The aim of this work is to approach the optimization of a method based on "QuEChERS" for sample preparation from sewage sludge, with subsequent identification of compounds called sulfonamides used in the formulation of veterinary and human drugs. The method known as "QuEChERS" arose from the need to creating sample preparation methods, considering to realize various routine analysis in laboratories.Thus, we can say that it presents certain simplicity, summarized in a few steps where you can quickly get a "clean-up" of the sample with the use of limited resources such as volume of solvent, and trained personnel. For the treatment of the sample in question, the method was used with some modifications, which were evaluated using the obtained experimental design software "Statistica". The development project was made with procediments considering variables, such as: organic phase used in the extraction, proportion and volume of water / organic phase, amount of complexing salt (NaCl and MgSO4) and use of adsorbent as PSA, C18 and graphite , thus enabling the procedure to be optimized aiming better utilization condition of the method "QuEChERS" considering the sludge matrix and analyte class of sulfonamides. The independent variables (ratio of ACN and H2O as solvent extraction, solvent volume ratio of amount of NaCl and MgSO 4) the extraction step were evaluated according to design experiment and were significant for increasing the extraction efficiency, the proportion of water and acetonitrile used as solvent extraction and the amount of MgSO4. By the results obtained from the planning experimental, the best extraction condition was 4.0 g of sample, 8.0 mL of solvent in the proportion 80% ACN (0.1% formic acid) and 20% H2O, 30% NaCl (w / v) and 40 mg of MgSO4.

SUMRIO

1 INTRODUO.......................................................................1

2 OBJETIVOS..........................................................................14

3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS................................15

3.1 MATERIAIS...............................................................15

3.2 MTODOS.................................................................17

4 RESULTADOS E DISCUSSES..........................................20

5 CONCLUSO........................................................................31

6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS......................................33

1

1 INTRODUO

Com o mundo atual globalizado e a tecnologia se desenvolvendo na direo

da incluso e de estar ao alcance de todas as pessoas, os mais variados setores

industriais vem crescendo e tomando propores antes no imaginveis desde a

sua escala de produo at a demanda por matria prima.

No mbito das indstrias qumicas no tem sido diferente, j que na situao

atual inmeros produtos utilizados pelos seres humanos tm sua origem ligada a

processos qumicos, o que causa um alerta nas autoridades governamentais ligadas

a preservao ambiental, pois com a crescente demanda na fabricao de novos

produtos oriundos de atividades laboratoriais surge tambm uma crescente gerao

de resduos que pode vir a contaminar bens naturais como a gua e o solo, assim

como os animais e a prpria humanidade.

Levando em conta este cenrio descrito acima, plausvel que tambm haja

um maior incentivo das autoridades e esforo da comunidade cientifica no

desenvolver de novas tcnicas aplicadas aos processos realizados que visem uma

reduo dos impactos ambientais gerados pelas atividades industriais considerando

toda a sua linha de produo at o uso do produto final.

Neste trabalho o enfoque foi nas indstrias farmacuticas onde os remdios

criados so constitudos de substncias ativas que atualmente esto sendo

classificadas como uma classe emergente de contaminantes afetando organismos

terrestres e principalmente aquticos1,2.

Pesquisas recentes documentam a ocorrncia destes compostos

farmacuticos em guas naturais e em efluentes de tratamento de esgoto urbano,

em nveis de concentrao na escala de g/L e ng/L.3,4,5,6

Abaixo temos um esquema representativo das diversas formas de entradas

das sulfonamidas no meio ambiente.

2

Figura 1 Esquema representativo das diversas formas de contaminao das sulfonamidas

ao meio ambiente.

Fonte:.BARAN, W., 2011, p 2.

Dentro da ampla classe de compostos farmacuticos, podemos citar os

antibiticos como sendo aqueles de maior periculosidade quando encontrados no

meio ambiente, visto que em contato com organismos vivos podem acabar gerando

resistncia ao uso desses medicamentos, diminuindo assim a efetividade no

combate a diversos tipos de doenas.

Isso resultado do aumento no uso dessas drogas por atividades ligadas a

criao de rebanhos, aves e peixes assim como fruto do hbito das pessoas de se

automedicarem fazendo uso sem orientao de tais substncias que podem resistir

as reaes das vias metablicas sendo excretadas com at 90% da quantidade

inicialmente ingerida, acarretando em uma seleo de carter gentico onde apenas

as bactrias mais perigosas se reproduzem, causando preocupao e necessidade

de que se tenha legislaes e procedimentos para monitorar, medir e controlar este

tipo de resduo gerado7,8.

Inclusa nessa gama de agentes antibacterianos, est a classe das

sulfonamidas, que so utilizadas desde a dcada de 1930 para tratamento de

3

doenas em seres humanos devido ao seu grande espectro de ao que se mostra

eficaz contra bactrias gram positivas e gram negativas, alm de ser considerado

um remdio de baixo custo para a linha de produo e comercializao, fato que

tambm faz com que essa classe de frmacos seja utilizada no uso veterinrio9,10.

Esta classe de antibiticos sintticos deriva-se da substncia conhecida como

sulfonilamida e existem diversos compostos antimicrobianos que contm o grupo

sulfonamida como uma espcie de radical similar formando ento um conjunto de

cerca de 150 SNs diferentes11.

A estrutura molecular com propriedades bacteriostticas a que nos referimos

esta representada na figura 2, sendo composta por um radical (-N4H2) em uma das

extremidades, seguido de um anel benznico unido a um grupo sulfonil ligado a

outro grupo amida que serve como stio para ligao de outros radicais, gerando

ento as diversas sulfonamidas que tem sido reportada ao longo da histria12.

Figura 2 Estrutura geral das sulfonamidas.

Olhando para a parte farmacolgica, observa-se que as sulfonamidas tem

estrutura semelhante a do p-aminobenzico tambm conhecido como PABA,

composto importante para reaes de sntese de cido flico por parte das

bactrias. Sendo assim, as sulfonamidas agem como agentes competidores pelos

stios ativos de uma enzima denominada dipropteroato sintetase, o que impede a

sntese de cido flico por parte das bactrias impedindo assim a sua

proliferao13,14.

Devido a diversidade de sulfonamidas existentes e seus diferentes modos de

ao, elas so largamente utilizadas nos dias atuais tanto para uso humano quanto

veterinrio e como no h tratamento espcifico para tais resduos que so deixados

no meio ambiente, a contaminao inevitvel, causando resistncia por parte das

4

bactrias e mutaes da enzima dipropteroato sintetase, o que dificulta a ao das

sulfonamidas no mecanismo de inibio da sntese do cido flico diminuindo sua

eficcia no combate as enfermidades13,15,16,17.

Sendo assim preciso estudo para a criao de novos mtodos que

identifiquem e quantifiquem esses antibiticos em nosso ambiente. O problema

que tais agentes bacterostticos se encontram em quantidades minmas em

matrizes complexas com diversos tipos de interferentes que podem prejudicar uma

determinao final de sua concentrao, logo se faz necessrio o uso de mtodos

que limpem e preparem tais amostras para posterior uso de tcnicas de separao e

quantificao desses contaminantes.

Quando se trata de amostras de origem ambiental de extrema importncia

que os processos de preparo de amostras sejam efetivos e eliminem quaisquer

impurezas presentes, alm de permitir a concentrao dos analitos de interesse para

uma melhor identificao final.

Atualmente com polticas de preservao do meio ambiente, do contexto da

qumica verde e dos interesses financeiros dos setores industriais, so exigidos cada

vez mais mtodos que executem o processo de clean-up amostral de maneira

rpida, usando o mnimo de reagentes e gerando pouco resduo. Tcnicas como a

SPE (Solid Phase Extractation), MEPS (Micro-Extractation by Packed Sorbent),

SPME (Solid Phase Micro-Extractation) e QuEChERS (quick, easy, cheap,

effective, rugged and safe) tem sido usadas, revelando nveis satisfatrios de

desempenho no processo de preparo da amostra, alm de proporcionar taxas de

recuperao dos analitos e de reduo de efeitos de matriz cada vez melhores

frente a mtodos anteriormente utilizados. Vale ressaltar que cada uma dessas

tcnicas tem suas particularidades porm no geral elas se assemelham por serem

processos limpos, econmicos e simples de serem executados, fatos que as tornam

mais viveis do ponto de vista industrial e ambiental18,19,20,21.

Dentre os locais onde se tem encontrado a maior parte dos contaminantes de

origem farmacutica destaca-se o solo, que possu caractersticas porozas

contendo matria inorgnica e orgnica favorecendo assim interaes adsortivas

dessa matriz com os mais diversos tipos de compostos incluindo os frmacos22.

5

Outra importante matriz atingida por este tipo de contaminao so as guas

subterrneas e de rios, levando em conta que o solo desencadeia papel fundamental

na preservao de ecossistemas adjacentes por realizar a filtragem de certas

substncias23. O lodo de esgoto, tambm conhecido como bioslido, proveniente de

estaes de tratamento est incluso tanto no solo onde usado como adubo

orgnico quanto nos efluentes de guas residurrias onde gerado.

Considerando ento a fora das interaes de adsoro entre o lodo e os

resduos de interesse, o processo de identificao e quantificao de tais analitos

tem certo grau elevado de difilcudade, pois para extra-los de uma matriz complexa

como essa necessrio um mtodo efetivo que garanta confiabilidade na limpeza

da amostra24,25,26.

Levando em conta esses fatores, o mtodo QuEChERS surge como uma

alternativa aos mtodos anteriormente utilizado, desenvolvido no ano de 2003 que

at os dias atuais vem sendo utilizado e aprimorado revelando altos nveis de

recuperao, baixo consumo de reagentes e geraes de resduos, mostrando-se

adequado para o estudo proposto27.

Inicialmente a metodologia QuEChERS foi desenvolvida com o objetivo de

ser aplicada em amostras de origem alimentar com a finalidade de extrair e isolar

algumas classes de pesticidas e inseticidas como: os organoclorados,

organofosforados e os organonitrogenados. Portanto o mtodo deveria ter uma

ampla faixa de atuao sendo classificado como um mtodo MRMs (Multiclass and

Multiresidue Methods). A necessidade de se desenvolver uma nova metodologia de

sucesso na identificao dessas classes de contaminantes provm da conscincia

ambiental que vinha se criando durante a dcada de 90, j que os pesticidas so

uma classe de resduos com mais de 50 anos de estudos e desenvolvimentos de

diversas metodologias, porm nenhuma capaz de cobrir toda a faixa de

contaminantes polares e apolares nos reportando uma faixa de recuperao e

repetibilidade aceitvel27,28. A flexibilidade uma das principais vantagens do

mtodo escolhido para esse estudo, pois desde a sua criao em 2003, inmeras

pesquisas reportam adaptaes do processo de extrao QuEChERS para torn-lo

mais adequado e reprodutivo para determinado tipo de matriz29,30.

6

Fluxograma 1 - Procedimento original criado por (Anastassiades et al, 2003);

Como era de se esperar a metodologia QuEChERS inicial contempla poucos

passos de extrao, sendo considerada simples e de fcil execuo podendo ser

conduzida por pessoas com um treinamento mnimo aceitvel no manuseio

laboratorial.

Porm para este presente trabalho onde procura-se otimizar tal procedimento,

faz-se necessrio entender cada um dos passos, as interaes e efeitos gerados

pelos reagentes usados, sendo assim uma explicao mais terica da metodologia

em geral deve ser feita.

O mtodo original de preparo de amostra QuEChERS pode ser dividido em

algumas etapas como:

7

i) Fragmentao e homogenizao: Como a massa da matriz utilizada no

mtodo menor em relao a outras tcnicas tradicionais de extrao,

existe a necessidade de se fragmentar a amostra inicial (geralmente na

ordem de quilogramas) e homogenizar a mesma para se obter uma

maior superfcie de contato na hora de extrair os componentes.

ii) Extrao e partio: Devido natureza das matrizes utilizadas nesse

mtodo serem alimentares ou ambientais, sempre h uma grande

porcentagem de gua nas mesmas, por isso necessrio a adio de

um solvente orgnico como etapa de extrao, para que haja a

separao entre a fase aquosa e a orgnica com posterior migrao

dos analitos de interesse para a fase orgnica. Logo este o papel

exercido pelo solvente utilizado no mtodo, geralmente acetonitrila,

podendo ser tambm acetona ou acetato de etila.

iii) Adio do sal: nesta etapa da extrao so feitas as adies de NaCl e

MgSO4 a fim de induzir a separao das fases aquosa/orgnica e o

ajuste da polaridade atravs do efeito denominado salting-out, o qual

auxilia promovendo a secagem da fase aquosa aumentando o

coeficiente de distribuio de determinado analito na fase orgnica

diminuindo a presena do mesmo na gua, aumentado assim a

eficincia do mtodo de extrao.

iv) Adio de padro interno: adiciona-se uma soluo de padro interno

visando minimizar possveis erros provenientes das etapas de extrao

do mtodo, esta soluo pode ser usada em uma etapa inicial do

procedimento, porm se a matriz apresenta uma concentrao

significativa de gordura (0,3 g/10,0 mL de acetonitrila) que pode criar

uma camada adicional para onde partes dos analitos podem migrar,

recomendvel a adio deste padro somente no final do procedimento

analtico de extrao.

v) Utilizao de composto adsorvente: etapa em que uma alquota da

amostra movida para um tubo extrator vazio onde uma pequena

quantidade de composto adsorvente, geralmente PSA (primary

secondary amine), C18 ou grafite adicionada e homogeneizada com

a soluo para que o material absortivo se distribua por toda a alquota

8

retendo compostos interferentes provenientes da matriz, realizando

assim um clean up adicional do extrato a ser analisado.

vi) Anlise da amostra: dependendo da origem do extrato, aps a

execuo do quinto passo a amostra j pode ser inserida em um GC

ou HPLC para separao e posterior quantificao dos analitos,

geralmente por espectrometria de massas.

Aps a escolha da metodologia baseada em QuEChERS como o mtodo de

extrao, uma otimizao para adequar as etapas de processamento e as

quantidades de reagentes utilizados necessria, j que a matriz de anlise

distinta daquelas empregadas inicialmente pelos criadores do mtodo28.

Sendo assim, o uso de ferramentas quimiomtricas para se realizar um

planejamento experimental indicado, esses estudos podem ser feitos tanto pelo

software Statistica quanto por linguagem de progamao usando progamas com o

matlab. O operador pode realizar ensaios em diferentes nveis, variando quantidades

de reagentes e composies, para que atravs de manipulaes estatsticas se

obtenha a melhor condio de resposta do mtodo.

Quando h necessidade de otimizao ou validao de um mtodo analtico,

um nmero elevado de anlises se faz necessrio, porm dficil a disponibilidade

de pessoas suficientes para a realizao de tal tarefa em tempo hbil. Por isso o uso

dos recusos estatsticos para um planejamento de experimentos retorna dados

confiveis em um tempo aceitvel, garantindo que os recursos investidos em

determinado estudo tragam resultados satisfatrios, beneficiando assim

pesquisadores e empresas que necessitam realizar diversas anlises em um curto

espao de tempo31,32.

Neste presente trabalho, fez-se uso de alguns tipos de planejamentos

experimentais para se estudar e avaliar condies de aplicabilidade do mtodo

QuEChERS em amostras de lodo, portanto uma explicao um pouco mais

detalhada das caractersticas destes tipos de planejamentos se faz necessria33,34.

i) Planejamento experimental fatorial completo: este tipo de planejamento

representado por n k, onde o nmero de nveis representado por

n, enquanto que k representa os fatores a serem considerados

durante a anlise. Para este tipo de desenho estatstico temos 7

9

graus de liberdade, sendo 3 deles responsveis pelos efeitos

independentes dos fatores, enquanto que os outros 4 esto

relacionados aos efeitos das interaes entre esses fatores, ou seja,

para este tipo de planejamento consegue-se visualizar efeitos

singulares assim como relacionados das variveis presentes no ensaio

em questo.[montgomery]

Figura 3 Esquema representativo para um planejamento experimental nk.

Fonte: MONTGOMERY, D.C., 2004, p 228.

ii) Planejamento experimental fatorial fracionado: Quando se tem um

grande nmero de fatores a serem analisados em determinado

experimento, consequentemente tem-se tambm um aumento na

quantidade de interaes que devero ser consideradas, extendo

assim o tempo necessrio para completar um planejamento. Como

tempo um fator limitante, este tipo de experimento considera apenas

as interaes principais (efeitos exercidos pelos fatores de maneira

independente), deixando de lado os efeitos de interao entre as

variveis, possibilitando assim a realizao de apenas uma frao do

planejamento experimental, esse modelo representado por nk-p, onde

n e k tem mesma definio que para experimentos fatoriais

completos, enquanto que p simboliza o nmero de efeitos interativos

entre as variveis a ser desprezado.[montgomery]

iii) Planejamento experimental composto central: Quando se opta por

realizar planejamentos experimentais, principalmente de segunda

ordem, desvios da lineariedade relacionados aos efeitos exercidos

10

pelos fatores podem aparecer, por isso opta-se por realizar (alm do

planejamento inicial) um estudo de composto central, que seria a

escolha por um ponto central, pontos axiais (estrela) e a utilizao dos

nveis provenientes do planejamento fatorial completo realizado

anteriomente feito (ex: -1, +1), permitindo assim uma estimativa do erro

interno associado ao planejamento, e a gerao de superfcies de

resposta que nos permitem a identificao das melhores condies de

utilizao do mtodo a ser otimizado. [montgomery, artigo favoritos]

Figura 4 Esquema representativo para um planejamento de composto central.

Fonte:

Depois de realizado todo o processo de estudo da matriz, da classe dos

analitos, do preparo da amostra e do tratamento estatstico, possvel realizar a

quantificao e identificao dos compostos atravs de tcnicas cromatogrficas.

No ramo da cromatografia os processos de separaes so regidos por

interaes entre uma fase mvel (onde est contido o analito) e uma fase

estacionria, nesta etapa de separao e identificao dos analitos, diferentes

variveis podem influenciar em uma melhor separao cromatogrfica.

Atualmente existem vrias tcnicas cromatogrficas diferenciadas entre si

pelo mecanismo utilizado na separao dos analitos, assim como na natureza da

fase mvel e estacionria a serem utilizadas35.

11

Figura 5 Principais tcnicas de cromatografia.

As tcnicas cromatogrficas tambm podem ser classificadas entre as que

utilizam uma coluna como residncia da fase estacionria e atuam sob alta

presso e as planares para anlises mais simples e objetivas.

No caso de metodologias para preparo de amostra, geralmente so utilizadas

as tcnicas de cromatografia mais complexas, que utilizam a coluna de separao,

portanto iremos se ater a explicar somente sobre esses tcnicas cromatogrficas.

Tcnicas em coluna

i) Cromatografia Lquida Clssica: Criada no incio do sculo 20, baseada

em uma fase mvel lquida que passava atravs de colunas de vidro de

dimetros internos de 1,0 -> 5,0 cm e comprimentos entre 50,0 ->

500,0 cm, a fases estacionrias utilizadas eram partculas com

dimetros de at 200,0 mm por onde a soluo contendo o analito flua

at a sada da coluna, onde eram coletadas fraes dessa amostra em

tubos de ensaio, e cada frao teoricamente representava um grau de

12

separao entre os compostos presentes. O fato da coluna ser

relativamente grande e no se usar sistemas pressurizados, acabava

resultando anlises demoradas, logo esse tipo de tcnica serviu mais

como base para o desenvolvimento da cromatografia lquida de alta

eficincia (HPLC)35,36.

ii) Cromatografia Lquida de Alta Eficincia: Utilizada na separao de

compostos com alta massa molar e compostos inicos, essa tcnica

utiliza colunas com comprimento de at 250,0 mm e dimetro de 4,6

mm contendo partculas de at 10 m compactadas. A fase mvel

impulsionada por uma bomba peristltica elevando o fluxo e

aumentando a presso do sistema, resultando em altas velocidades de

anlise em tempos menores, permitindo a realizao de diversas

anlises com boa reprodutibilidade e confiabilidade35,36.

iii) Cromatografia com fludo supercrtico: nesta tcnica um composto em

seu estado super crtico (CO2, por exemplo) utilizado como a fase

mvel do sistema de separao. Esse tipo de cromatografia indicada

para aqueles compostos que dificilmente poderiam ser analisados por

GC ou HPLC, devido a sua baixa volatilizao, probabilidade de

degradao em altas temperaturas ou ausncias de grupos funcionais

ativos para interaes com os detectores presentes em HPLC35,36.

iv) Cromatografia Gasosa: indicada para amostras termicamente

estveis e volteis. Nesse tipo de cromatografia a fase mvel

empregada um gs inerte que s atua no carregamento dos analitos

coluna a dentro. As separaes so realizadas por diferena na

temperatura de ebulio dos compostos em questo e as suas

solubilidades com a fase estacionria, geralmente so usadas

partculas slidas compactadas na coluna que adsorvem os analitos,

ou partculas lquidas envolvidas por um filme slido compactado na

coluna. Atualmente o uso de colunas capilares resistentes a

temperaturas na faixa de 450 oC, para aplicabilidade em compostos de

massas moleculares cada vez maiores, tem sido utilizadas juntamente

com novos mtodos de injeo como o cold on-column e PTV

contribuindo assim para o desenvolvimento da cromatografia gasosa

de alta resoluo35,36.

13

Com a criao e desenvolvimento de diversas tcnicas cromatogrficas como

as descritas acima, foi possvel obter um controle maior sobre as variveis que

influenciam na corrida cromatografica, assim como atingir menores tempos e

maiores resolues na separao das mais variadas classes de compostos

qumicos.

No casso desse trabalho a cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) foi

escolhida para realizar o processo de separao e a espectrometria de massas para

a identificao e quantificao das sulfonamidas.[referncia sobre HPLC]

Sendo assim, aliando um mtodo de separao efetivo juntamente com as

informaes obtidas do planejamento experimental (sobre melhores condies de

extrao para o preparo de amostra), espera-se resultados satisfatrios sobre a taxa

de recuperao de frmacos nos mais diversos tipos de matriz, justificando de

maneira positiva o intuito deste trabalho.

14

2 OBJETIVOS

Este trabalho tem como objetivo a otimizao de um mtodo para preparo de

amostra baseado em QuEChERS visando a extrao confivel das sulfonamidas

presentes em lodo floculado, com posterior separao e identificao atravs de

cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) acoplada a um detector de tempo de

vo (TOF)

A escolha deste bioslido como matriz de estudo foi devido ao mesmo

apresentar altas probabilidades de adsoro residual dos mais diversos tipos de

frmacos, incluindo as sulfonamidas11.

15

3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

3.1 MATERIAIS

Durante a fase de desenvolvimento do mtodo, foram usados reagentes

como: acetonitrila (Tedia, grau HPLC) na fase mvel do sistema cromatogrfico,

para preparo de amostras e das soluo estoque das sulfonamidas, cido frmico

98% (Tedia), hidrxido de amnio 30% (Synth), os sais NaCl e MgSO4 e gua

purificada atravs de um sistema milli-Q (Millipore)

Para a obteno da soluo estoque, oito compostos classificados como

sulfonamidas foram utilizados, sendo elas: Sulfacetamida, Sulfadiazina,

Sulfametoxazol, Sulfatiazol, Sulfamerazina, Sulfametizol, Sulfametzaina e

Sulfacloropiridazina.

Sendo os padres para a realizao dos testes fornecidos pela Sigma

Aldrich.

Tabela 1 Estrutura das sulfonamidas, massa molecular e pka.

Nome Massa

Molar

pKa Estrutura

Sulfacetamida 214,24 5,43

Sulfadiazina 250,28 6,81

Sulfametoxazol 253,28 5,81

Sulfatiazol 255,32 7,24

16

Sulfamerazina 264,30 7,35

Sulfametizol 270,33 5,51

Sulfametazina 278,33 7,89

Sulfacloropiridazina 284,72 5,90

A soluo estoque (SE) foi preparada em acetonitrila na concentrao de 400

mg . L-1 e armazenada em refrigerao durante todo o processo de desenvolvimento

do mtodo. Outras solues denominadas de trabalho (ST) eventualmente em

concentraes diferentes da soluo estoque foram preparas a partir de uma

soluo intermediria (SI), que visando a no degradao da soluo estoque era

feita a partir da mesma.

O preparo da amostra a ser testada no processo de extrao (QuEChERS )

utilizou lodo floculado cedido pelo laboratrio de processos biolgicos (LPB), o qual

foi mantido na geladeira do laboratrio de cromatografia da USP (CROMA).

Antes de pesar as alquotas de lodo a serem utilizadas nos testes, o excesso

de gua contido foi retirado atravs de filtrao a vcuo com um funil de Bchner.

Em seguida pores de 4,0 g do lodo seco foram pesadas e transferidas para

tubos falcon de 50,0 mL onde a contaminao com as sulfonamidas foi feita usando

as solues de trabalho (ST) nas concentraes desejadas.

Por ltimo os tubos foram deixados abertos dentro da capela do laboratrio

por 60 minutos afim de que toda a acetonitrila presente nas solues de trabalho

utilizadas fosse volatilizada, aps estes passos as amostras foram mantidas sob

refrigerao por 48h antes do incio do processo de extrao.

17

As condies utilizadas na etapa de separao e deteco dos analitos foi o

uso de um sistema HPLC da srie 20A Prominence, Shimadzu operando em fase

reversa, equipado com uma coluna Agilent C18 ( 2,1 mm x 100mm x 2,7 m),

temperatura do forno a 40o C, volume de injeo de 5,0 L, fase mvel de

acetonitrila e gua, ambas acidificadas a 0,1% com cido frmico.

Para a deteco e quantificao das sulfonamidas em questo fez-se uso de

um espectrmetro de massas hbrido, modelo micrOTOF-Q II (Bruker) operando no

modo full SCAN, com ionizao por eletrospray (ESI) no modo positivo sob voltagem

no capilar de 3,5 kV, a temperatura na fonte estava em 200o C, o fluxo do gs

secante manteve-se em 8,0 L . min-1 e utilizou-se uma presso de 4,0 bar para o

nebulizador.

3.2 MTODO

Primeiramente variveis como massa de lodo utilizada e composio da fase

extratora foram testadas de maneira independente, nos reportando que a quantidade

e composio escolhida inicialmente eram as melhores, porque assemelhavam-se

bastante com aquelas usadas no mtodo de extrao original. Sendo assim fixou-se

em 4,0 g a quantidade de lodo utilizada por amostra, e o uso de acetonitrila/gua na

composio da fase extratora.

Depois de escolhida uma metodologia baseada em QuEChERS para o

processo de extrao, a otimizao das etapas de anlise foi realizada atravs de

planejamento experimental gerado pelo software STATISTICA.

Com a realizao de um planejamento quimiomtrico fatorial, fica possvel

evidenciar e quantificar a importncia das variveis que afetam no decorrer do

processo de extrao, assim como avaliar o efeito independente ou relacionado

delas, dentro do desempenho final do mtodo analtico.

Como o planejamento experimental deve abranger todas as variveis com

potencial para afetar o mtodo de extrao, inicialmente foram escolhidas as

variveis originais presentes no mtodo QuEChERS desenvolvido para anlise

de pesticida em matrizes alimentcias.

18

Sendo assim um planejamento fatorial fracionrio 24-1 foi realizado, visando

obter informaes sobre a maneira como as variveis clssicas influenciavam de

modo independente o mtodo utilizado para a anlise de sulfonamidas em lodo

granular.

Foram realizados no total oito experimentos avaliando dois nveis (-1, +1),

com a quantidade a ser otimizada de cada varivel clssica empregada na

mtodologia a ser otimizada.

Tabela 2 Fatores avaliados e nveis apresentados no planejamento experimental 2(4-1)

Variveis

Nveis Avaliados

-1 +1

Volume da soluo

extratora

2 3

ACN/H2O 2:1 4:1

NaCl (%) 10 30

MgSO4 (mg) 40 80

Os experimentos foram realizados seguindo etapas adaptadas de um modelo

prximo ao original empregado em QuEChERS

19

Fluxograma 2 Etapas do preparo de amostra baseado no mtodo QuEChERS utilizadas no trabalho.

Secagem de Lodo

(filtrao a vcuo);

Pesagem do lodo em

tubo falcon (50 mL);

Adio de soluo

contaminante;

Amosstra em repouso

por 48h;

Adio de NaCl (s) +

vortex;

Centrfuga 3400 rpm;

Tranferncia fase

orgnica para tudo

falcon (15 mL);

Adio de MgSO4

anidro + vortex;

Centrifuga 3400 rpm;

Anlise em LC-ESI-

TOF;

Secagem em fluxo de

N2 + resuspeno em

H2O

tranfere 2 mL para

ephendorf;

20

4 RESULTADOS E DISCUSSES

Aps a realizao dos testes propostos no planejamento experimental 24-1 e

anlise dos cromatogramas obtidos para cada sulfonamida presente na amostra, os

picos foram integrados e as reas referentes a cada composto transcritas para o

software STATISTICA 7.0.

Tabela 3 Planejamento experimental 2(4-1) com os respectivos fatores, nveis e sulfonamidas presentes.

Com isso, foi possvel a obteno de grficos de Pareto que informam a

contribuio independente de cada varivel no mtodo QuEChERS empregado na

extrao.

21

Figura 6 Projees de pareto para as variveis do planejamento 2(4-1)

.

22

Observando os grficos de Pareto fica evidente que a varivel que menos

afeta no desempenho do mtodo em questo a porcentagem de NaCl, portanto

visando um planejamento experimental mais completo, a varivel foi retirada.

23

Depois de observado os resultados iniciais, foi ento proposto um novo

planejamento experimental completo, ou seja, um planejamento 23 que nos permite

analisar as variveis de maneira independente e relacionada.

Para isso utilizou-se da mesma ferramenta estatstica, ressaltando que novos

experimentos no foram realizados, ou seja, apenas foi retirada a varivel % NaCl

e os dados foram avaliados de acordo com um planejamenteo fatorial completo 23.

Tabela 4 Planejamento experimental 2(3) com os respectivos fatores, nveis e sulfonamidas presentes.

Depois de gerado a tabela com o planejamento completo, as mesmas

ferramentas e o mesmo mtodo de anlise critica dos dados foi adotado.

Grficos de Pareto, mostrando a contribuio relacionada e independente das

variveis para cada sulfonamida presente na amostra, foram gerados e avaliados

com a perspectiva de que uma nova otimizao poderia ser realizada frente aos

resultados observados.

Figura 7 Projees de pareto para as variveis do planejamento 2(3)

.

24

25

Ao observar as projees de Pareto para o planejamento experimental

completo 23, feito com o intuito de verificar a contribuio relacionada entre as

variveis presentes na extrao, assim como de forma independente, podemos

constatar um aumento no efeito combinado das variveis no mtodo em geral, o que

nos trs primeiramente a certeza de que retirar a varivel % NaCl foi uma boa

escolha.

Pensando em melhorar ainda mais o mtodo de preparo de amostra, foram

realizados experimentos visando a obteno de superfcies de resposta de segunda

ordem para cada condio usada, o que se tratava de um planejamento

experimental de composto central.

Este tipo de planejamento experimental um dos mais comuns de segunda

ordem, e nos retorna uma estiva sobre o erro interno do experimento e informaes

sobre os termos axiais ao central, que iro determinar os valores quadrticos

responsveis por um ajuste mais preciso no rendimento experimental. Basicamente

este tipo de planejamento realizado escolhendo-se um ponto central, e aplicando

testes experimentais e estatsticos na regio em torno do ponto central.[referncia

da internet, salva nos favoritos]

Nesse caso uma avaliao sobre as variveis que seriam englobadas no novo

planejamento foi necessria, considerando ento toda a etapa de preparo de

amostra e os passos utilizados pelo mtodo. Chegamos concluso que a varivel

Volume de Solvente no poderia ser alterada, pois como seu efeito na projeo de

Pareto teve sinal negativo, apenas uma diminuio do volume utilizado traria efeitos

positivos no resultado final, e isso seria impossvel, pois o volume utilizado j era o

mnimo levando em conta que uma extrao de 2,0 mL de fase orgnica se faz

necessria durante os procedimentos, e ao diminuir mais esse valor de volume de

soluo extratora, esses 2,0 mL no poderiam ser retirados, comprometendo assim

o mtodo como um todo.

Logo no planejamento composto central, apenas as variveis Composio de

Solvente e a massa de MgSO4, foram consideradas.

Portanto, foi escolhido um planejamento 22 onde os nveis avaliados ao redor

do ponto central tiveram um = 2, ou seja, os pontos estrela avaliados neste

planejamento tiveram uma abrangncia maior que a regio delimitada pelo

26

experimento (-1, 0, +1), nos permitindo assim avaliaes mais precisas sobre o

rendimento experimental atravs de projees de superfcie quadrticas. Sendo

assim o experimento foi feito em 4 nveis adjacentes ao centro, sendo eles: (-2, -1,

+1,+2), enquanto que o ponto central foi fixado em (0, 0).

Tabela 5 Planejamento de composto central 2(2) com os respectivos fatores, nveis e sulfonamidas presentes

Vale ressaltar que para este planejamento (diferente do planejamento 23 onde

retiramos a varivel NaCl e fizemos apenas ajustes estatsticos), a realizao de

novos experimentos foi necessria e estes foram conduzidos com a mesma

metodologia de preparo de amostra aplicada para os outros planejamentos, porm

agora apenas as variveis quantidade de MgSO4 e proporco ACN/H2O foram

variadas nos pontos estrela, enquanto que para o ponto central as mesmas

quantidades j otimizadas nos experimentos no planejamento 23 se mantiveram, o

ponto central foi realizado em quadruplicata, visando uma melhor anlise sobre os

erros internos provenientes do mtodo.

Tabela 6 - Fatores avaliados e nveis apresentados no planejamento de

composto central 22

Variveis independentes

Nveis Codificados

-1,41 -1,0 0 1,0 1,41 ACN/gua 2,59:1 3:1 4:1 5:1 5,41:1

MgSO4 (g) 25,9 30 40 50 54,1

27

Como se trata de uma anlise quimiomtrica atravs de um planejamento de

2a ordem, as condies otimizadas de aplicabilidade do mtodo foram avaliadas a

partir de grficos de superfcie para cada sulfonamida presente na amostra,

ajustados a partir dos termos quadrticos obtidos do planejamento, representando o

recuperao e repetibilidade do mtodo para cada ponto, seja ele adjacente (estrela)

ou o central.

Figura 8 - Superfcies de resposta dos pontos testados no planejamento experimental de composto central.

28

Os grficos de superfcie oriundos do experimento composto central, nos

reportaram as condies utilizadas no ponto central como sendo a melhor

encontrada para a utilizao do mtodo, pois para as oito sulfonamidas o ponto

central aquele que tem maior intensidade de resposta na superfcie de segunda

ordem, ou seja, este planejamento experimental foi efetivo e nos provou que a

melhor condio encontrada nos testes provenientes do planejamento 24-1 era

realmente a ideal a ser aplicada para o mtodo.

Estudos recentes mencionam a utilizao de ferramentas estatsticas na hora

de uma otimizao experimental, permitindo assim realizar tais procedimentos em

menor tempo com menos consumo de reagentes, assim como mencionam a

29

efetividade ao se aplicar a metodologia QuEChERS na extrao de analitos de

origem farmacutica em amostras de lodo37,38,39.

Como a matriz escolhida para este trabalho no tem origem alimentcia como

aquelas aplicveis ao mtodo original, uma bateria de experimentos visando avaliar

a contribuio na adio de um composto adsortivo, etapa inicialmente aplicada por

(Anastassiades et al, 2003) foi realizada.

Os testes foram realizados nas condies otimizadas pelo planejamento de

composto central, as quantidades utilizadas foram: 4,0 g de lodo, 8,0 mL de soluo

extratora (1,6 mL H2O e 6,4 mL de ACN), 30 % de NaCl e 40 mg de MgSO4.

Figura 9 Intensidade de rea dos picos das sulfonamidas pelo mtodo de extrao utilizado (testes

utilizando fase adsorvente e a amostra controle).

Ao observar o grfico, conclumos, assim como (Bourdat-Deschamps et al,

2014) o uso de uma fase adsorvente no mtodo de preparo de amostra era

dispensvel, pois somente sulfametizol e sulfametoxazol responderam melhor

quando usados grafite e PSA respectivamente, enquanto que as seis demais

sulfonamidas presentes na amostra tiveram melhor resposta quando no realizada

esta etapa no mtodo, o que claro vantagoso pois com menos etapas e uso de

menos reagentes se tem uma melhor rapizes e rentabilidade do mtodo

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

S/N

Controle

PSA

GRA

C18

30

respectivamente. Sendo assim optou-se por excluir essa etapa do mtodo de

preparo amostral40.

31

5 CONCLUSO

A otimizao de uma metodologia para preparo de amostra baseada em

QuEChERS e realizada atravs de planejamentos experimentais revelou

resultados finais satisftorios.

O intuito desde o incio era adequar os procedimentos e quantidades de

reagentes utilizados a fim de se ter a melhor relao custo/benefcio possvel, ou

seja, um rendimento e uma aplicabilidade boa para o mtodo sem esquecer de todo

o contexto da qumica verde e a gerao de resduos imposta pelo uso de tal

metodologia.

Os experimentos realizados a partir da tabela de nveis gerados pelo

planejamento experimental fatorial fracionrio 2(4-1), permitiu observar a contribuio

independente de cada varivel clssica empregada no mtodo, levando a uma

deciso de retirar a varivel % NaCl j que a mesma revelava ser a varivel de

menos efeito sobre a etapa extratora, com isso um novo planejamento, agora

classificado como fatorial completo foi usado.

No planejamento fatorial completo 23, apenas as variveis: composio da

fase extratora, volume de solvente e quantidade de MgSO4 (mg) foram

consideradas, revelando( atravs das projees de pareto) a contribuio independe

e relacionada de tais fatores. Como a varivel volume de solvente teve sinal

negativo nos grficos, apenas uma diminuio da mesma acarretaria em melhora na

metodologia, porm no era vivel essa diminuio j que o volume utilizado era o

menor possvel para a etapa de extrao.

Visando o melhor ajuste possvel e a melhor otimizao para o mtodo

QuEChERS, aplicvel as oito sulfonamidas presentes no lodo granular, um

planejamento experimental contendo um ponto central foi gerado e somente os

fatores: quantidade de MgSO4 (mg) e composio da fase extratora foram variados

nos nveis adjacentes ao central.

O planejamento em questo nos reportou grficos de superfcie indicando que

as condies utilizadas no ponto central eram aquelas que apresentavam as

melhores taxas de recuperao de analito (observada atravs das reas dos picos),

ou seja, uma otimizao satisfatria do mtodo.

32

Logo este planejamento de composto central serviu para minimizar erros

internos em nosso experimento e confirmar a condio ideal de utilizao do mtodo

QuEChERS (encontrada no planejamento experimental fracionrio 24-1) como

aplicvel a amostras de lodo granular a fim de realizar o clean up da amostra para

posterior separao e deteco dos agentes antimicrobianos da classe das

sulfonamidas.

Por ltimo, importante comentar que o estudo em questo serviu para

mostrar a importncia na utilizao de ferramentas estatsticas na hora de realizar

uma otimizio experimental, assim como para acrescentar conhecimentos

analticos sobre procedimentos de preparo de amostra e cromatografia, tornando

esse trabalho uma importante forma de adquirir experincia laboratorial e fixar

conhecimentos trabalhados durante o curso.

33

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