mobilizaÇÃo de reservas e partiÇÃo de metabÓlitos...
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MOBILIZAÇÃO DE RESERVAS E PARTIÇÃO DE
METABÓLITOS DURANTE A GERMINAÇÃO DA SEMENTE E O
ESTABELECIMENTO DA PLÂNTULA EM MORINGA
ADNA LAÍS DE OLIVEIRA LEOCÁDIO FURTADO
MACAÍBA/RN
Março/2014
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO
UNIDADE ACADÊMICA ESPECIALIZADA EM CIÊNCIAS
AGRÁRIAS – UAECIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FLORESTAIS
ii
ADNA LAÍS DE OLIVEIRA LEOCÁDIO FURTADO
MOBILIZAÇÃO DE RESERVAS E PARTIÇÃO DE METABÓLITOS
DURANTE A GERMINAÇÃO DA SEMENTE E O ESTABELECIMENTO DA
PLÂNTULA EM MORINGA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Florestais da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
Unidade Acadêmica Especializada em Ciências
Agrárias, Macaíba-RN, como parte integrante
dos requisitos para obtenção do grau de mestre
em Ciências Florestais.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Eduardo Luiz Voigt
CO-ORIENTADORA: Prof.a
Dr.a
Elizângela
Emídio Cunha
MACAÍBA/RN
Março/2014
iii
Aprovação da banca
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus por ter me dado forças e ânimo nos momentos mais difíceis, por ser fiel
comigo em todos as horas ao longo desta jornada.
Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Florestais, pela oportunidade de mais
um sonho na área acadêmica.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo
apoio financeiro, possibilitando a realização deste estudo.
Agradeço eternamente ao meu orientador prof. Dr. Eduardo Voigt por todo
conhecimento repassado, por todas as orientações e por todos os conselhos tanto para meu
crescimento científico, profissional e pessoal.
Aos professores Paulo Marinho e Elizângela Cunha por toda colaboração neste
trabalho.
Aos meus pais, Ezequiel Leocádio da Silva e Gezilda Xavier de O. Leocádio, por
toda ajuda e por suas orações, serei eternamente grata.
Ao meu querido esposo Felipe Furtado, pela compreensão devido à minha ausência
no lar, pelas palavras de entusiasmo e força para não desistir devido às inúmeras vezes que
pensei que não conseguiria chegar ao fim.
À minha irmã, Mara Jamiles e ao meu cunhado, Ambrósio, pelo apoio.
Aos meus sogros, Marisa e Ricardo Furtado, pelas orações em meu benefício.
Aos meus avós, tios e primos, por toda ajuda ao longo deste percurso.
A minha amiga Clarice Sales, por sempre me incentivar e apoiar neste mestrado.
Ao Laboratório de Estudos em Biotecnologia Vegetal, pela oportunidade em abrir
espaço para meus experimentos, em especial à prof.a Cristiane Macedo.
Aos colegas do Labveg, Lisiane, Cibelley, Monique, Renata, Bruno, Yuri, Hudson e
Denilson, por toda ajuda. Em especial, aos meus queridos colegas que muito me ajudaram e
colaboraram no decorrer do meu experimento, Ana Paula, Paula, Demetrios, Danilo,
Jussiara, Hanieri e Ciro.
v
Aos colegas de mestrado que juntos compartilhamos momentos de tristeza e alegria.
vi
SUMÁRIO
Página
LISTA DE FIGURAS...................................................................................................... vii
LISTA DE ABREVIATURAS....................................................................................... viii
RESUMO........................................................................................................................... 1
ABSTRACT...................................................................................................................... 2
1.INTRODUÇAO GERAL.............................................................................................. 3
2.REVISÃO DE LITERATURA..................................................................................... 5
2.1. Moringa oleifera Lam. ............................................................................................... 5
2.2. Mobilização de reservas.............................................................................................. 6
3.REFERÊNCIAS..................................................................................................... 8
CAPÍTULO I - Mobilização de reservas e partição de metabólitos durante a
germinação da semente e o estabelecimento da plântula em moringa...............................
11
RESUMO........................................................................................................................... 12
ABSTRACT....................................................................................................................... 13
1.INTRODUÇÃO..............................................................................................................
2.MATERIAIS E MÉTODOS.........................................................................................
14
16
2.1. Material vegetal...........................................................................................................
2.2. Determinações bioquímicas.........................................................................................
16
16
2.3. Atividades enzimáticas................................................................................................ 18
2.4. Delineamento experimental e análise estatística.........................................................
3.RESULTADOS..............................................................................................................
20
21
4.DISCUSSÃO...................................................................................................................
5.CONSIDERAÇÕES FINAIS........................................................................................
24
27
REFERÊNCIAS................................................................................................................ 28
ANEXOS............................................................................................................................. 33
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Conteúdo de MS nos cotilédones, no sistema radicular e na parte aérea de
moringa durante a germinação da semente e o estabelecimento da plântula. (A) MS dos
cotilédones até o 20° DAE; (B) MS do sistema radicular do 10° ao 20° DAE; (C) MS da
parte aérea do 12° ao 20° DAE. Os pontos representam observações individuais
realizadas na análise de regressão, ajustando-se ao modelo mais adequado.
33
Figura 2: Conteúdo de LN nos cotilédones de moringa durante a germinação e o
estabelecimento da plântula. Os pontos representam observações individuais realizadas
na análise de regressão, ajustando-se ao modelo mais adequado.
34
Figura 3: Conteúdo de PS nos cotilédones, no sistema radicular e na parte aérea de
moringa durante a germinação da semente e o estabelecimento da plântula. (A) PS de
cotilédones até o 20° DAE; (B) PS do sistema radicular do 10° ao 20° DAE; (C) PS da
parte aérea do 12° ao 20° DAE. Os pontos representam observações individuais
realizadas na análise de regressão, ajustando-se ao modelo mais adequado.
35
Figura 4: Conteúdo de amido nos cotilédones, no sistema radicular e na parte aérea de
moringa durante a germinação da semente e o estabelecimento da plântula. (A) Amido de
cotilédones até 0 20° DAE; (B) Amido do sistema radicular do 10° ao 20° DAE; (C)
Amido da parte aérea do 12° ao 20° DAE. Os pontos representam observações
individuais realizadas na análise de regressão, ajustando-se ao modelo mais adequado.
36
Figura 5: Conteúdo de AST nos cotilédones, no sistema radicular e na parte aérea de
moringa durante a germinação da semente e o estabelecimento da plântula. (A) AST de
cotilédones até o 20° DAE; (B) AST do sistema radicular do 10° ao 20° DAE; (C) AST
da parte aérea do 12° ao 20° DAE. Os pontos representam observações individuais
realizadas na análise de regressão, ajustando-se ao modelo mais adequado.
37
Figura 6: Conteúdo de ANR nos cotilédones, no sistema radicular e na parte aérea de
moringa durante a germinação da semente e o estabelecimento da plântula. (A) ANR de
cotilédones até o 20° DAE; (B) ANR do sistema radicular do 10° ao 20° DAE; (C) ANR
da parte aérea do 12° ao 20° DAE. Os pontos representam observações individuais
realizadas na análise de regressão, ajustando-se ao modelo mais adequado.
38
Figura 7: Conteúdo de AALT nos cotilédones, no sistema radicular e na parte aérea de
moringa durante a germinação da semente e o estabelecimento da plântula. (A) AALT de
cotilédones até o 20° DAE; (B) AALT do sistema radicular do 10° ao 20° DAE; (C)
AALT da parte aérea do 12° ao 20° DAE. Os pontos representam observações
individuais realizadas na análise de regressão, ajustando-se ao modelo mais adequado.
39
Figura 8: Atividades enzimáticas nos cotilédones de moringa durante a germinação da
semente e o estabelecimento da plântula. (A) atividade de ICL; (B) atividade de proteases
ácidas; (C) atividade de amilases. Os pontos representam observações individuais
realizadas na análise de regressão, ajustando-se ao modelo mais adequado.
40
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
ANR, açúcares não redutores;
AST, açúcares solúveis totais;
ATP, trifosfato de adenosina;
BSA, albumina sérica bovina;
AALT, aminoácidos livres totais;
DAE, dias após a embebição;
ICL, isocitrato liase;
LN, lipídeos neutros;
MS, massa seca;
PRS, proteínas de reserva de sementes;
PS, proteínas solúveis.
1
RESUMO
A germinação da semente e o estabelecimento da plântula são processos críticos para o
cultivo comercial. Assim, este trabalho tem como objetivo caracterizar a mobilização
das reservas e a partição dos produtos durante estes processos em moringa, uma espécie
promissora para a produção de biodiesel no Nordeste Brasileiro. Para tanto, as sementes
foram germinadas em sistema de rolo sob condições controladas (80 µmol/m2/s,
fotoperíodo de 12h e 27±2 °C) e as plântulas foram transferidas para água destilada em
vasos plásticos de 1 L de capacidade e mantidas em condições de casa de vegetação por
mais 10 dias. As coletas foram realizadas aos 0, 4, 8, 10, 12, 16 e 20 dias após a
embebição (DAE), dividindo as plântulas em cotilédones, parte aérea e sistema
radicular. Foram determinados os conteúdos de massa seca (MS), lipídeos neutros (LN),
proteínas solúveis (PS), amido, açúcares solúveis totais (AST), açúcares não redutores
(ANR) e aminoácidos livres totais (AALT) e as atividades de isocitrato liase (ICL),
proteases ácidas e amilases. A partição dos produtos, em termos de MS, ocorreu de
forma diferencial, resultando em baixa razão parte aérea/sistema radicular, indicativa de
um possível mecanismo de resistência ao déficit hídrico. A mobilização das PS foi
iniciada na germinação, enquanto que a mobilização dos LN e do amido foi
desencadeada no estabelecimento da plântula, embora todas as reservas tenham sido
exauridas até o 20° DAE, culminando com a expansão das primeiras folhas. No sistema
radicular, houve acumulação de AST, ANR e AALT do 12° ao 16° DAE e consumo
destes metabólitos até o 20° DAE, enquanto que na parte aérea, ocorreu diminuição de
AST e AALT em paralelo com o aumento de ANR do 12° ao 20° DAE. As atividades
de ICL, proteases ácidas e amilases ocorreram de forma coordenada com a mobilização
de LN, PS e amido, respectivamente. Estes padrões de mobilização das reservas e
partição dos metabólitos em moringa se mostraram distintos daqueles verificados para
outras espécies arbóreas estudadas. É possível que estes padrões estejam relacionados
com estratégias metabólicas utilizadas por esta espécie para alcançar sucesso durante o
estabelecimento da plântula.
PALAVRAS-CHAVES: Moringa oleifera Lam., relação sistema radicular/parte aérea,
transição heterotrofia-autotrofia.
2
ABSTRACT
Seed germination and seedling establishment are critical processes for commercial
plantation and depend directly on reserve mobilization as a source of cellular fuels and
biosynthetic precursors. In this way, we investigated the coordination among reserve
mobilization, metabolite partitioning, and mobilizing enzyme activities in Moringa oleifera
Lam (moringa) an oil-seeded species employed in biofuel production. Seeds were
germinated under controlled conditions and seedlings were grown hydroponically at a
greenhouse. Samples were harvested at 0, 4, 8, 10, 12, 16, and 20 days after imbibition
(DAI). The contents of dry mass (DM), neutral lipids (NL), soluble proteins (SP), starch,
total soluble sugars (TSS), non-reducing sugars (NRS), and total free amino acids (TFAA)
as the activity of isocitrate lyase (ICL), acid proteases, and amylases were determined. The
mobilization of storage proteins was initiated during seed germination whereas the
mobilization of storage lipids and starch was triggered throughout seedling establishment
although all reserves have been depleted until 20 DAI. The partitioning of DM and
metabolites to the roots and the shoots was uneven during seedling establishment. Low
shoot/root ratio on the basis of DM could be related to the natural occurrence of moringa in
drought climates. In the roots, TSS, NRS, and TFAA were accumulated from 12 to 16 DAI
and then were consumed until the end of the experiment. In the shoots, TSS and TFAA
were consumed in parallel with NRS accumulation from 12 to 20 DAI. The activity of ICL,
acid proteases, and amylases was coordinated with the mobilization of lipids, proteins and
starch respectively. Thus, we propose that the patterns of reserve mobilization and
metabolite partitioning verified in moringa seem distinct from those found to other tree
species and may be involved in metabolic strategies to enable environment colonization.
Key-words: Moringa oleifera Lam., relative root/shoot, heterotrophy-autotrophy transition.
3
1. INTRODUÇÃO GERAL
As sementes cumprem importantes papéis na natureza e para a humanidade. Nos
diferentes ecossistemas, as sementes são os principais propágulos das espécies nativas,
permitindo a reprodução da maioria das gimnospermas e angiospermas (Raven et al.,
2007). De maneira similar, as sementes consistem nos principais insumos para o
estabelecimento dos cultivos nos agrossistemas (Bewley e Black, 1994). Além disso, as
sementes são fontes de alimentos para os seres humanos e os animais domesticados
(Bewley e Black, 1994) e são fontes de matérias-primas para a indústria de alimentos
(Buckeridge et al., 2004a) e, mais recentemente, de biodiesel (Dabdoub e Bronzel,
2009).
O biodiesel consiste principalmente em ésteres alquílicos de ácidos graxos ou
hidrocarbonetos obtidos como produtos das reações de transesterificação ou
craqueamento de triacilgliceróis, respectivamente. Os óleos vegetais têm sido indicados
como matérias-primas promissoras para a produção de biodiesel, tanto pela sua
composição química (Dabdoub e Bronzel, 2009), quanto pelas repercussões econômicas
e sociais decorrentes da produção de sementes oleaginosas em larga escala (Lovatelli,
2005).
O aprimoramento das técnicas para a obtenção de matérias-primas em larga
escala é o passo inicial para viabilizar a produção do biodiesel, portanto são
fundamentais para o desenvolvimento da cadeia produtiva as pesquisas científicas
voltadas à expansão das fronteiras agrícolas, ao aumento da produtividade das lavouras
e à conservação dos produtos agrícolas. Para alcançar estes objetivos, é necessário
identificar regiões com potencial para produção de sementes oleaginosas (Silva et al.,
2007), adequar as técnicas de cultivo (Roscoe et al., 2007), aumentar a produtividade
(Lovatelli, 2005) e aprimorar os processos de colheita, beneficiamento, conservação e
transporte dos produtos agrícolas.
A Região Nordeste é promissora para a expansão das fronteiras agrícolas
voltadas à cadeia produtiva do biodiesel por alguns motivos. Esta região é pioneira nas
pesquisas científicas sobre o cultivo de sementes oleaginosas e extração de óleo a partir
de espécies rústicas e é caracterizada pela diversidade climática, propiciando
alternativas para a produção de matérias-primas. Dentre as espécies cotadas para a
4
produção de biodiesel na Região Nordeste, a moringa (Moringa oleifera Lam.) pode ser
destacada.
5
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Moringa oleifera Lam.
Esta espécie é pertencente à família Moringaceae, considerada rústica sendo
originária do noroeste Indiano, totalmente adaptável a condições de sequeiro como
irrigadas, também produz sementes oleaginosas e ocorre espontaneamente no semiárido
Nordestino do Brasil, apresenta um grande potencial devido a sua diversidade em uso
medicinal, alimentar, agrícola e industrial (Ramachandran et al., 1980; Correa, 1984).
As sementes da moringa contém óleo de uma qualidade excelente sendo usadas
para cozinhar, confecção de sabão, para indústria de cosméticos, farmacêuticas. As
folhas são utilizadas na alimentação humana apresentando betacaroteno, vitamina C,
proteína, cálcio, ferro e fósforo (Alves et al., 2005). Na zona rural do Nordeste
Brasileiro as sementes de moringa são utilizadas em grande quantidade devido a sua
importância no tratamento de águas impuras servindo para o consumo humano e animal,
devido a grande escassez de água potável para essas regiões, é considerada uma
alternativa para o semiárido devido ser uma planta perene e resistente à seca, pouco
exigente a qualidade do solo e adubação, bastante tolerante a presença de pragas e
doenças, além de servir como cerca-viva e quebra-vento (Gerdes, 1997; Silva; Kerr,
1999).
A despeito do potencial econômico da moringa para a Região Nordeste, poucos
trabalhos de mobilização de reservas propiciaram a produção de conhecimentos
aplicados ao cultivo desta espécie. Tendo em vista que o crescimento pós-germinativo é
o momento crucial para o estabelecimento das plântulas nos campos de cultivo, o
presente trabalho visa analisar, de forma integrada, os processos de mobilização das
reservas nutritivas nos tecidos de armazenamento e de partição dos produtos derivados
para os tecidos vegetativos após a germinação das sementes de moringa.
6
2.2. Mobilização de reservas
As principais biomoléculas de reserva em sementes são grupos específicos de
carboidratos, lipídios e proteínas. Os carboidratos de reserva são diversificados,
incluindo a sacarose, os oligossacarídeos da série rafinósica, o amido e os
polissacarídeos de reserva de parede celular (Buckeridge et al., 2004a). A sacarose e os
oligossacarídeos da série rafinósica são açúcares solúveis acumulados no vacúolo das
células do eixo embrionário e dos tecidos de armazenamento. De forma contrastante, o
amido é formado pelos polissacarídeos amilose e amilopectina, os quais são depositados
em camadas concêntricas semicristalinas, formando grânulos dentro dos amiloplastos
(Bewley e Black, 1994). Por último, os polissacarídeos de reserva de parede celular
(PRPC) são um grupo heterogêneo de biomoléculas depositadas em paredes secundárias
espessadas (Buckeridge et al., 2004a).
Em sementes oleaginosas, os lipídios de reserva correspondem a óleos ou
triacilgliceróis (TAGs), os quais são armazenados em organelas denominadas
oleossomos ou corpos lipídicos (CLs) (Bewley e Black, 1994).
Dentre as proteínas de reserva armazenadas em sementes, as albuminas são
comuns em eudicotiledôneas, as globulinas são as principais proteínas de reserva em
leguminosas, as prolaminas são predominantes em cereais e as glutelinas são
características do trigo (Bewley e Black, 1994). As prolaminas e glutelinas são
armazenadas em organelas chamadas corpos protéicos (CPs), enquanto as albuminas e
globulinas são mantidas em vacúolos de estocagem de proteínas (VEPs) (Herman e
Larkings, 1999).
A mobilização das reservas é desencadeada durante a germinação das sementes e
se estende pelo estabelecimento das plântulas, viabilizando a colonização do ambiente
(Raven et al., 2007). O processo de mobilização envolve diferentes enzimas hidrolíticas,
que são ativadas ou sintetizadas de novo e catalisam a degradação das biomoléculas de
reserva. Os produtos de hidrólise ou seus derivados são transportados dos tecidos de
armazenamento para o eixo embrionário via floema, fornecendo energia e precursores
biossintéticos (Buckeridge et al., 2004b).
A mobilização das reservas nos tecidos de armazenamento deve ser sincronizada
com o crescimento do eixo embrionário. Neste sentido, a regulação da mobilização das
7
reservas é fundamental para garantir o sucesso do estabelecimento das plântulas
(Buckeridge et al., 2004b). Originalmente, duas hipóteses são consideradas para
explicar a regulação da mobilização das reservas: a hipótese hormonal e a hipótese da
relação fonte-dreno. De acordo com a hipótese hormonal, o eixo embrionário regula a
expressão e a atividade das enzimas hidrolíticas por intermédio de hormônios
sintetizados no eixo embrionário e transportados para os cotilédones ou o endosperma.
Em comparação, conforme a hipótese da relação fonte-dreno, o eixo embrionário
funciona como um dreno, consumindo os produtos de mobilização transportados a partir
das fontes, os cotilédones ou o endosperma. Assim sendo, o eixo embrionário pode
limitar a atividade das enzimas hidrolíticas nos cotilédones ou no endosperma por
mecanismos de retroalimentação negativa (Bewley e Black, 1994).
Alguns trabalhos têm sugerido que produtos de mobilização podem apresentar
algum papel como sinais para a regulação da mobilização das reservas. A acumulação
de açúcares em cotilédones destacados reduz a atividade das alfa-amilases, indicando a
ação dos açúcares como sinais na regulação da mobilização do amido (Karunagaran e
Ramakrishna, 1991). De forma análoga, o aumento da concentração de aminoácidos
livres em cotilédones destacados diminui a atividade das proteinases, sugerindo que os
aminoácidos podem mediar a regulação da mobilização das proteínas (Ramakrishna e
Rao, 2005). Corroborando estas evidências, a aplicação externa de açúcares reduz a
expressão e a atividade de enzimas envolvidas na degradação dos triacilgliceróis,
indicando que os açúcares podem também atuar como sinais para a regulação da
mobilização dos lipídios (Rylott et al., 2001; Borek et al., 2006).
Poucas iniciativas têm sido realizadas no sentido de compreender a regulação da
mobilização das reservas em espécies do semiárido brasileiro. Assim sendo, o presente
trabalho contribui para o esclarecimento deste processo em moringa (Moringa oleifera
Lam.), uma espécie promissora para a obtenção de matéria-prima voltada à produção do
biodiesel na Região Nordeste.
8
3. REFERÊNCIAS
ALVES et al. “Germinação de sementes e desenvolvimento de plântulas de Moringa
oleifera L. em diferentes locais de germinação e submetidas à pré-embebição”. Ciência
e Agrotecnologia, Lavras, v.29, n.5, p.1083-1087, set./out., 2005.
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ed. New York: Plenum Press, 445 p, 1994.
BOREK, S.; RATAJCZAK, W.; RATAJCZAK, L. Ultrastructural and enzymatic
research on the role of sucrose in mobilization of storage lipids in germinating yellow
lupine seeds. Plant Science, v.170, p.441-452, 2006.
BUCKERIDGE, M. S.; SANTOS, H. P.; TINÉ; M. A. S.; AIDAR, M. P. M.
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básico ao aplicado, Porto Alegre: Artmed, p.163-185, 2004.
CORREA, M.P. Dicionário das plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas. Rio de
Janeiro, MA/IBDF, v.5. 1984.
DABDOUB, M. J.; BRONZEL, J. L.; RAMPIN, M. A. Biodiesel: visão crítica do status
atual e perspectivas na academia e na indústria. Química Nova, v.32, p.776-792, 2009.
GERDES, G. Como limpar e tratar água suja com sementes da moringa. ESPLAR –
Centro de Pesquisa e Assessoria, Fortaleza, 18p. 1997.
9
HERMAN, E.M.; LARKINS, B.A. Protein storage bodies and vacuoles. The Plant Cell,
v.11, p.601-613, 1999.
KARUNAGARAN, D.; RAMAKRISHNA P.R. Mode and control of starch
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1991.
LOVATELLI, C.; Agroenergia Uma opção estratégica para o Brasil: Motivações para o
uso de bicombustíveis; Revista Política Agrícola; Ano XIV – Nº 4 – Out./Nov./Dez.
2005.
RAMACHANDRAN, C. et al. Drumstick (Moringa oleifera) a multipurpose Indian
vegetyable. Economy Botany, [S.I.], v.34, p.276-283, 1980.
RAMAKRISHNA, V.; RAO, P.R. Axial control of protein reserve mobilization during
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49, p.23-27, 2005.
RAVEN, P.H.; EVERT, R.F.; EICHHORN, S.E. Biologia Vegetal. 7. ed. Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.
ROSCOE, R.; RICHETTI, A.; MARINHO, E. Análise de viabilidade técnica de
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Agrícola, v.16, p.48‑59, 2007.
RYLOTT, E.L.; HOOKS, M.A.; GRAHAM, I.A. Co-ordinate regulation of genes
involved in storage lipid mobilization in Arabidopsis thaliana. Biochemical Society
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10
SILVA, A.R.; KERR, W.E. Moringa: uma nova hortaliça para o Brasil. Uberlândia:
UFU/DIRIU, 95p. 1999.
SILVA, C. C DANTAS, J. P; SANTOS, J. C. O.; SANTOS, T. T. S. Obtenção do
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forrageira. 2007. Disponível em: <http://
http://www.annq.org/congresso2007/trabalhos_apresentados/T76.pdf> Acesso em: 15
ago 2012.
11
CAPÍTULO I
Mobilização de reservas e partição de metabólitos durante
a germinação da semente e o estabelecimento da plântula
em moringa
12
MOBILIZAÇÃO DE RESERVAS E PARTIÇÃO DE METABÓLITOS DURANTE A
GERMINAÇÃO DA SEMENTE E O ESTABELECIMENTO DA PLÂNTULA EM
MORINGA
LEOCÁDIO, A.L.O.; OLIVEIRA, D.F.A.; CUNHA, E.E.; MARINHO, P.S.; MACÊDO,
C.E.C.; VOIGT, E.L.
Departamento de Biologia Celular e Genética, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, Campus Universitário, Lagoa Nova, CEP 59072-910, Natal, Rio Grande do Norte,
Brasil.
RESUMO
A germinação da semente e o estabelecimento da plântula são processos críticos para o
cultivo comercial. Assim, este trabalho tem como objetivo caracterizar a mobilização
das reservas e a partição dos produtos durante estes processos em moringa, uma espécie
promissora para a produção de biodiesel no Nordeste. Para tanto, as sementes foram
germinadas em sistema de rolo sob condições controladas (80 µmol/m2/s, fotoperíodo
de 12h e 27±2 °C) e as plântulas foram transferidas para água destilada em vasos
plásticos de 1 L de capacidade e mantidas em condições de casa de vegetação por mais
10 dias. As coletas foram realizadas aos 0, 4, 8, 10, 12, 16 e 20 dias após a embebição
(DAE), dividindo as plântulas em cotilédones, parte aérea e sistema radicular. Foram
determinados os conteúdos de massa seca (MS), lipídeos neutros (LN), proteínas
solúveis (PS), amido, açúcares solúveis totais (AST), açúcares não redutores (ANR) e
aminoácidos livres totais (AALT) e as atividades de isocitrato liase (ICL), proteases
ácidas e amilases. A partição dos produtos, em termos de MS, ocorreu de forma
diferencial, resultando em baixa razão parte aérea/sistema radicular, indicativa de um
possível mecanismo de resistência ao déficit hídrico. A mobilização das PS foi iniciada
na germinação, enquanto que a mobilização dos LN e do amido foi desencadeada no
estabelecimento da plântula, embora todas as reservas tenham sido exauridas até o 20°
DAE, culminando com a expansão das primeiras folhas. No sistema radicular, houve
acumulação de AST, ANR e AALT do 12° ao 16° DAE e consumo destes metabólitos
até o 20° DAE, enquanto que na parte aérea, ocorreu diminuição de AST e AALT em
paralelo com o aumento de ANR do 12° ao 20° DAE. As atividades de ICL, proteases
ácidas e amilases ocorreram de forma coordenada com a mobilização de LN, PS e
amido, respectivamente. Estes padrões de mobilização das reservas e partição dos
metabólitos em moringa se mostraram distintos daqueles verificados para outras
espécies arbóreas estudadas. É possível que estes padrões estejam relacionados com
estratégias metabólicas utilizadas por esta espécie para alcançar sucesso durante o
estabelecimento da plântula.
PALAVRAS-CHAVES: Moringa oleifera Lam., relação sistema radicular/parte aérea,
transição heterotrofia-autotrofia.
13
ABSTRACT
Seed germination and seedling establishment are critical processes for commercial
plantation and depend directly on reserve mobilization as a source of cellular fuels and
biosynthetic precursors. In this way, we investigated the coordination among reserve
mobilization, metabolite partitioning, and mobilizing enzyme activities in Moringa oleifera
Lam (moringa) an oil-seeded species employed in biofuel production. Seeds were
germinated under controlled conditions and seedlings were grown hydroponically at a
greenhouse. Samples were harvested at 0, 4, 8, 10, 12, 16, and 20 days after imbibition
(DAI). The contents of dry mass (DM), neutral lipids (NL), soluble proteins (SP), starch,
total soluble sugars (TSS), non-reducing sugars (NRS), and total free amino acids (TFAA)
as the activity of isocitrate lyase (ICL), acid proteases, and amylases were determined. The
mobilization of storage proteins was initiated during seed germination whereas the
mobilization of storage lipids and starch was triggered throughout seedling establishment
although all reserves have been depleted until 20 DAI. The partitioning of DM and
metabolites to the roots and the shoots was uneven during seedling establishment. Low
shoot/root ratio on the basis of DM could be related to the natural occurrence of moringa in
drought climates. In the roots, TSS, NRS, and TFAA were accumulated from 12 to 16 DAI
and then were consumed until the end of the experiment. In the shoots, TSS and TFAA
were consumed in parallel with NRS accumulation from 12 to 20 DAI. The activity of ICL,
acid proteases, and amylases was coordinated with the mobilization of lipids, proteins and
starch respectively. Thus, we propose that the patterns of reserve mobilization and
metabolite partitioning verified in moringa seem distinct from those found to other tree
species and may be involved in metabolic strategies to enable environment colonization.
Key-words: Moringa oleifera Lam., relative root/shoot, heterotrophy-autotrophy transition.
14
1. INTRODUÇÃO
A mobilização das reservas nutritivas viabiliza o estabelecimento da plântula,
uma vez que os produtos de mobilização liberados pelos tecidos de armazenamento são
transportados para o eixo em crescimento, onde são utilizados principalmente no
desenvolvimento das primeiras folhas (aparato fotossintético) e das raízes (sistema de
absorção). Durante este processo, os produtos de mobilização atuam como combustíveis
celulares, sustentando a produção de ATP via oxidação mitocondrial, e como
precursores biossintéticos, permitindo a produção de biomoléculas para a manutenção e
o crescimento celular (Bewley et al., 2012).
A despeito dos amplos conhecimentos sobre mobilização de reservas em plantas
cultivadas, pouco ainda se sabe sobre este processo em espécies arbóreas nativas ou
exóticas não domesticadas. No entanto, já está claro que a diversidade das reservas
utilizadas durante o estabelecimento da plântula reflete a diversidade biológica. Em
Aniba rosaeodora (Lauraceae) (Lima et al., 2008), Andira parviflora e Hymenaea
parviflora (Fabacaea) (Gonçalves et al., 2002), nativas da Floresta Amazônica, e em
Schinopsis brasiliensis (Anacardiaceae) (Dantas et al., 2008), nativa da Caatinga, o
amido consiste na principal reserva. Em contraponto, as galactomananas são os
carboidratos de reserva majoritários nas leguminosas endospérmicas tropicais Mimosa
scabrella, Schizolobium parayba, Stryphnodendron barbatiman (Ganter et al., 1993),
Sesbania marginata (Buckeridge et al., 1996) e Apuleia leiocarpa (Pontes et al., 2002).
Sementes oleaginosas são produzidas por espécies de diferentes biomas,
incluindo as nativas da Caatinga Cnidosculus phyllacanthus (Euphorbiaceae)
(Cavalcanti et al., 2009) e Anacardium occidentale (Anacardiaceae) (Voigt et al., 2009),
a nativa da Floresta Atlântica Caesalpinia peltophoroides (Fabaceae) (Corte et al.,
2006) e as nativas da Floresta Amazônica Bertholletia excelsa (Lecythidaceae) e Parkia
pendula (Fabaceae) (Gonçalves et al., 2002). Em C. phyllacanthus (Cavalcanti et al.,
2009), A. parviflora (Fabaceae) e H. parviflora (Fabacaea) (Gonçalves et al., 2002), as
proteínas de reserva de sementes (PRS) são amplamente acumuladas.
Vários esforços tem sido feitos no sentido de caracterizar o processo de
mobilização de reservas em diferentes espécies arbóreas (Corte et al., 2006; Lima et al.,
15
2008; Reis et al., 2011). No entanto, poucos trabalhos abordam a partição dos produtos
de mobilização para as diferentes partes da plântula (Pontes et al., 2002; Reis et al.,
2012). Desta forma, a literatura ainda carece de trabalhos que estabeleçam relações
entre a mobilização e a partição, gerando modelos integrados que esclareçam as
estratégias metabólicas utilizadas como mecanismos adaptativos (Corte et al., 2006;
Reis et al., 2012). Além disso, estes modelos podem fundamentar aplicações práticas
voltadas à recuperação de áreas degradadas (Borges et al., 2002) e à utilização
econômica (Lima et al., 2008).
Moringa oleifera (Moringaceae), conhecida popularmente como moringa, é uma
espécie arbórea originária do Noroeste Indiano e introduzida no Nordeste Brasileiro
como planta ornamental (Lorenzi e Matos, 2002) que apresenta elevado potencial
econômico. Diversas partes da planta podem ser utilizadas na alimentação humana e
animal e nas indústrias de cosméticos e farmacêuticas (Bezerra et al., 2004). As
sementes de moringa tem sido utilizadas no tratamento de água para o consumo humano
(Bezerra et al., 2004) e são matérias-primas promissoras para a produção de biodiesel
(Rashid et al., 2008; Silva et al., 2010).
Tendo em vista que a germinação da semente e o estabelecimento da plântula
são processos críticos para o cultivo comercial, o presente trabalho tem como objetivo
investigar a coordenação entre a mobilização das reservas, a partição dos produtos e a
atividade de enzimas degradativas em moringa. Os resultados obtidos são discutidos de
forma integrada, no sentido de encontrar relações entre os padrões de mobilização das
diversas reservas e de acumulação e utilização dos diferentes metabólitos.
16
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1.Material vegetal
As sementes de moringa (Moringa oleifera Lam.) utilizadas neste trabalho foram
coletadas de dez matrizes em diferentes municípios do Estado do Rio Grande do Norte.
Após a remoção manual das alas, as sementes foram lavadas com detergente comercial
diluído na proporção de 1:500, desinfetadas com etanol 70% (v/v) por 3 min, seguido de
NaClO 0,25% (m/v) por 3 min sob agitação eventual. Logo após, as sementes foram
lavadas três vezes e embebidas por 6 h em água destilada estéril.
O semeio foi realizado entre folhas de papel toalha tipo Germitest® (280 x 380 mm)
umedecidas com água destilada estéril, na proporção de duas vezes e meia a massa do
papel, em sistema de rolo (Vieira e Carvalho, 1994). As sementes foram incubadas em
câmara de crescimento sob condições controladas (radiação fotossinteticamente ativa de
80 μmol/m2/s, fotoperíodo de 12 h e temperatura de 28±2 °C) por 10 d. As sementes
germinadas foram transferidas para água destilada em vasos plásticos de 1 L de
capacidade e mantidas em condições de casa de vegetação por mais 10 d. As coletas
foram realizadas aos 0, 4, 8, 10, 12, 16 e 20 dias após a embebição (DAE). Durante as
coletas, as plântulas foram divididas em cotilédones, parte aérea e sistema radicular. As
amostras foram congeladas e mantidas a -20 °C até a realização das determinações
bioquímicas.
2.2.Determinações bioquímicas
Lipídios neutros (LN)
A quantificação dos LN foi realizada pelo método gravimétrico. Para tanto,
amostras de cotilédones com aproximadamente 200 mg de massa seca foram extraídas
com 8 mL de n-hexano a 60 °C por 5 h sob agitação eventual. Em seguida, o
sobrenadante foi transferido para tubos de plástico de massa conhecida. Após a
evaporação do n-hexano a 80 °C, o conteúdo de LN foi calculado a partir da diferença
entre a massa inicial e final dos tubos e expresso em mg de LN/2 cotilédones.
17
Proteínas solúveis (PS)
Para a extração das PS a partir dos cotilédones, amostras com cerca de 200 mg
de massa fresca foram extraídas com 1,5 mL de tampão Tris-HCl 100 mM pH 7,0
adicionado de NaCl 500 mM e 2-mercaptoetanol 2 mM por maceração durante 5 min.
Após centrifugação a 10.000 xg por 10 min, os sobrenadantes foram coletados e os
precipitados foram re-extraídos com 1 mL do tampão de extração por mais duas vezes.
Ao final, os sobrenadantes foram reunidos perfazendo 3,5 mL de extrato total por
amostra. As PS da parte aérea e do sistema radicular, por sua vez, foram extraídas com
tampão Tris-HCl 100 mM pH 7,0 seguindo os procedimentos supracitados. A
determinação das PS foi realizada de acordo com o método de Bradford (1976),
utilizando albumina sérica bovina (BSA) como padrão e o conteúdo de PRS foi
expresso em mg de PS/2 cotilédones ou em mg de PS/parte.
Açúcares solúveis totais (AST), açúcares não redutores (ANR) e aminoácidos livres
totais (AALT)
A extração de AST, ANR e AALT foi realizada a partir de amostras com
aproximadamente 200 mg de massa fresca. Estas amostras foram extraídas com 5 mL de
etanol 80% (v/v) a 60 °C durante 30 min em tubos hermeticamente fechados. Após a
coleta dos sobrenadantes, os resíduos foram re-extraídos com 5 mL de etanol 80% (v/v)
sob as mesmas condições. Em seguida, os sobrenadantes foram reunidos perfazendo 10
mL de extrato total por amostra, enquanto os resíduos foram reservados e utilizados
para a extração e a determinação de amido.
Para a dosagem de AST, foi utilizado o método de Dubois (1956). Em cada
determinação, foram adicionados 100 μL da amostra; 400 μL de água destilada; 500 μL
de fenol 5% (m/v); e 2,5 mL de H2SO4 90% (v/v). A leitura foi realizada a 490 nm e o
cálculo do conteúdo de AST foi baseado em uma curva padrão de D-glicose, sendo
expresso em mmol de AST/g de MS.
A dosagem de ANR foi realizada pelo método de Morris (1948), com algumas
modificações, utilizando o reagente de antrona (Morris 1948; Yemm e Willis 1954). Em
18
cada determinação, 100 μL da amostra; 800 μL de água destilada; e 100 μL de KOH
30% (m/v) foram pré-incubados a 100 °C por 10 min. Após resfriamento, 2,5 mL do
reagente de antrona foram adicionados em cada amostra e foi realizada incubação a 40
°C por 15 min. A leitura foi realizada a 620 nm e o conteúdo de ANR das amostras foi
calculado a partir de uma curva padrão de sacarose, sendo expresso em mg de ANR/g
de MS.
A dosagem de AALT foi realizada pelo método de Peoples (1989), com a
utilização do reagente de ninidrina. Para cada determinação, foram adicionados 100 μL
da amostra; 400 μL de água destilada; 250 μL de tampão citrato 200 mM pH 5,0; e 250
μL do reagente de ninidrina. Os tubos foram vedados e incubados a 100 °C por 15 min.
Após resfriamento, foram adicionados 4 mL de etanol 50% (v/v) em cada amostra. As
leituras foram realizadas a 570 nm e o conteúdo de AALT foi calculado de acordo com
uma curva padrão de L-glutamina, sendo expresso em µmol de AALT/g de MS.
Amido
A extração de amido foi realizada utilizando os resíduos da extração dos
compostos solúveis de baixa massa molecular (AST, ANR e AALT). Para tanto, as
amostras foram extraídas com 3 mL de HClO4 30% (v/v) por maceração durante 5 min.
Após centrifugação a 10.000 xg por 10 min, os sobrenadantes foram coletados e os
precipitados foram re-extraídos com 3 mL de HClO4 30% (v/v). Ao final, os
sobrenadantes foram reunidos perfazendo 6 mL de extrato total por amostra.
A dosagem de amido foi realizada com a utilização do reagente de antrona
(Morris 1948; Yemm e Willis 1954). Para cada determinação, foram utilizados 100 μL
da amostra; 900 μL de água destilada; e 2,5 mL do reagente de antrona. A leitura foi
realizada a 620 nm, utilizando uma curva padrão de D-glicose. Os valores obtidos foram
multiplicados pelo fator 0,9 para conversão em amido segundo McCready et al. (1950),
sendo expressos em mg de amido/2 cotilédones ou em mg de amido/parte.
2.3.Atividades enzimáticas
19
A atividade de isocitrato liase (ICL) foi estimada pelo método de Chell et al.
(1978). Para obter os extratos enzimáticos, amostras de cotilédones com cerca de 200
mg de massa fresca congelada foram maceradas por 5 min. com 1,5 mL de tampão
fosfato de potássio 100 mM pH 7,6 suplementado com MgCl2 1 mM e 2-
mercaptoetanol 10 mM. Após centrifugação a 10.000 xg por 20 min, os sobrenadantes
foram coletados e utilizados como extratos enzimáticos. Estes procedimentos foram
conduzidos a 4 °C. Para cada determinação, foram adicionados 1 mL de tampão
imidazol 50 mM pH 6,8; 200 µL de MgCl2 50 mM; 200 µL de EDTA 10 mM; 200 µL
de fenilhidrazina-HCl 40 mM; 200 µL de DL-isocitrato 10 mM; e 200 µL do extrato
enzimático. A atividade enzimática foi calculada a partir da absorbância do complexo
glioxilato-fenilhidrazina a 324 nm, a cada minuto, durante 10 min, e expressa em µmol
de glioxilato-fenilhidrazina/g de MS/min.
A atividade de proteases foi determinada pelo método de Beevers (1968 –
modificado) usando caseína como substrato. Para a extração, amostras de cerca de 200
mg de massa fresca congelada foram maceradas durante 5 min com 1,5 mL de tampão
tris-HCl 50 mM pH 7,2 contendo 2-mercaptoetanol 2 mM. As amostras foram
centrifugadas a 10.000 xg por 20 min e os sobrenadantes foram utilizados como extratos
enzimáticos. Todos os procedimentos foram realizados a 4 °C. Em cada determinação,
foram adicionados 250 µL de extrato, 250 µL de tampão acetato de potássio 100 mM
pH 5,5 e 250 µL de caseína 1% (m/v). As amostras foram incubadas a 40 °C por 60 min
e as reações foram paradas pela adição de 250 µL de ácido tricloroacético 20% (m/v).
As amostras foram mantidas no gelo por 20 min e centrifugadas a 10.000 xg por 20 min
a 4 °C. A atividade enzimática foi calculada de acordo com a determinação de
aminoácidos nos sobrenadantes pelo método de Peoples (1989), com a utilização do
reagente de ninidrina.
A atividade de amilases foi estimada pelo método de Elarbi et al. (2009). A
extração foi realizada com amostras de aproximadamente 200 mg de massa fresca
congelada, as quais foram maceradas por 5 min com 1,5 mL de tampão acetato de
potássio 100 mM pH 6,0 contendo CaCl2 5 mM. Após extração, as amostras foram
centrifugadas a 10.000 xg por 20 min e os sobrenadantes foram empregados como
extratos enzimáticos. Estes procedimentos foram conduzidos a 4 °C. Para cada
determinação foram adicionados 100 µL de extrato e 400 µL de amido solúvel 0,5 %
(m/v) em tampão acetato 100 mM pH 6,0 contendo CaCl2 5 mM. As amostras foram
incubadas a 55 °C por 10 min e a atividade enzimática foi calculada a partir da
20
quantidade de açúcares redutores produzidos, determinada pelo método do 3,5-dinitro-
salicilato (Miller, 1959).
2.4.Delineamento experimental e análise estatística
Durante o experimento, as coletas foram realizadas ao acaso, obtendo-se cinco
repetições por tempo de coleta considerando cada procedimento de extração e
determinação. Os resultados foram submetidos a análises de regressão linear por meio
do ajuste de modelos simples e polinomiais (de segunda a sexta ordens),
sequencialmente. Como critérios de escolha do melhor modelo foram considerados: a
soma de quadrados Tipo I e o valor de probabilidade para o teste F associado a ela; o
coeficiente de determinação múltipla (R2
e R2 ajustado para graus de liberdade); o
coeficiente de variação (CV%). Além disso, para auxiliar no desempate entre modelos,
foram feitos testes para verificar o atendimento a pelo menos uma das três suposições:
variância residual constante; normalidade dos resíduos (teste de Shapiro-Wilk); e
inexistência de autocorrelação residual (teste de Durbin-Watson). Todas as análises
estatísticas foram realizadas por meio do programa R versão 2.13.0 (R Development
Core Team, 2011).
21
3. RESULTADOS
Durante a germinação da semente e o estabelecimento da plântula de moringa, a
diminuição do conteúdo de MS nos cotilédones se ajustou ao modelo de equação
quadrática, demonstrando diminuição no decorrer do tempo (Fig. 1A). De fato, houve
diminuição de 52% no conteúdo de MS dos cotilédones no 20° DAE em relação ao
início do experimento, evidenciando a mobilização de reservas. No entanto, a partição
dos produtos de mobilização ocorreu de forma diferencial entre o sistema radicular
(Fig.1B) e a parte aérea (Fig.1C). O aumento do conteúdo de MS em ambas as partes se
ajustou ao modelo de equação linear, sendo que o conteúdo de MS no sistema radicular
aumentou 13 vezes do 10° ao 20° DAE e o conteúdo de MS na parte aérea aumentou 8
vezes do 12° ao 20° DAE.
O conteúdo de LN nos cotilédones de moringa ao longo do experimento se
ajustou ao modelo de equação quártica (Fig. 2). Houve diminuição de aproximadamente
10 vezes no conteúdo de LN a partir da protrusão da radícula (10° DAE) até o final do
experimento (20° DAE), mas a mobilização dos lipídeos de reserva ocorreu de forma
mais acelerada entre o 12° e o 16° DAE, coincidindo com a partição de MS para a parte
aérea (Fig. 1A) e o sistema radicular (Fig. 1B).
Em comparação com os lipídeos, a mobilização das proteínas de reserva nos
cotilédones de moringa iniciou ainda durante a germinação (4° DAE) (Fig. 3A). Assim
sendo, a variação do conteúdo de PS, descrita pelo modelo de equação de quarta ordem,
indica que ocorreu diminuição de cerca de 30 vezes no conteúdo destas reservas do 4°
até o 20° DAE. Em contraponto, a acumulação de PS no sistema radicular (Fig. 3B) e na
parte aérea (Fig. 3C) seguiu diferentes tendências ao longo do estabelecimento da
plântula. Enquanto que o conteúdo de PRS no sistema radicular se ajustou ao modelo de
equação quadrática, apresentando maiores valores entre o 12° e 16° DAE, o conteúdo de
PS na parte aérea foi descrito pelo modelo de equação linear, aumentando 3,2 vezes do
12° ao 20° DAE.
A variação do conteúdo de amido nos cotilédones durante a germinação da
semente e o estabelecimento da plântula de moringa pode ser descrita pelo modelo de
equação de terceira ordem (Fig. 4A). Segundo este modelo, houve aumento de cerca de
22
57% no conteúdo de amido no 12° DAE em relação ao início do experimento e ocorreu
diminuição de aproximadamente 90% no conteúdo desta reserva no 20° DAE em
comparação com o 12° DAE. Estes resultados indicam que houve biossíntese de amido
em paralelo com o início da mobilização dos lipídeos de reserva (Fig. 2). Além disso, a
acumulação de amido no sistema radicular (Fig. 4B), ajustada ao modelo de equação
cúbica, e na parte aérea (Fig. 4C), descrita pelo modelo de equação quadrática, indica
que houve aumento de cerca de 9,5 e 7,6 vezes no conteúdo de amido do sistema
radicular e da parte aérea, respectivamente, no 20° DAE em relação ao momento de
emissão destas partes.
A variação do conteúdo de AST no decorrer do experimento, descrita pelo
modelo de equação quártica, indica que ocorreu aumento de aproximadamente 2,6 vezes
destes metabólitos desde a protrusão da radícula até o 20° DAE (Fig. 5A), coincidindo
com a mobilização dos lipídeos de reserva (Fig. 2) e do amido (Fig. 4A) durante este
período. Além disso, a partição de AST para o sistema radicular (Fig. 5B) e para a parte
aérea (Fig. 5C) seguiram diferentes tendências durante o crescimento da plântula.
Enquanto que o conteúdo de AST no sistema radicular se ajustou ao modelo de equação
quadrática, apresentando maiores valores entre o 12° e 16° DAE, o conteúdo destes
metabólitos na parte aérea foi descrito pelo modelo de equação quadrática, porém
diminuindo cerca de 2,6 vezes do 12° até o final do experimento.
Durante a germinação da semente e o estabelecimento da plântula de moringa, o
aumento do conteúdo de ANR nos cotilédones se ajustou ao modelo de equação
quártica, demonstrando aumento de cerca de 2,5 vezes do 12° ao 20° DAE (Fig. 6A).
De forma semelhante ao que ocorreu com o conteúdo de AST (Fig. 5A), o aumento do
conteúdo de ANR coincidiu com a mobilização dos lipídeos de reserva (Fig. 2) e do
amido (Fig. 4A) nos cotilédones durante o mesmo período. O conteúdo de ANR no
sistema radicular, segundo o modelo de equação quadrática, aumentou
aproximadamente 2 vezes do 10° ao 16° DAE e diminuiu cerca de 28% do 16° ao 20°
DAE (Fig. 6B). Em comparação, o conteúdo de ANR na parte aérea, ajustado ao
modelo de equação linear, aumentou aproximadamente 1,2 vez do 12° ao 20° DAE
(Fig. 6C). É notável que a diminuição do conteúdo de AST da parte aérea (Fig. 5C) foi
acompanhada pelo aumento do conteúdo de ANR.
23
A variação do conteúdo de AALT nos cotilédones durante o experimento pode
ser descrita pelo modelo de equação quártica, havendo aumento de cerca de 2,6 vezes
no conteúdo destes metabólitos desde a protrusão da radícula até o 20° DAE (Fig. 7A),
em paralelo com a mobilização das proteínas de reserva (Fig. 3A). A partição dos
AALT ocorreu de forma diferencial entre o sistema radicular (Fig.7B) e a parte aérea
(Fig.7C). De fato, o conteúdo de AALT no sistema radicular, ajustado ao modelo de
equação cúbica, apresentou aumento de cerca de 1,5 vez do 10° ao 12° DAE e
demonstrou diminuição de aproximadamente 1,5 vez do 12° ao final do experimento.
De modo distinto, o conteúdo de AALT na parte aérea, descrito pelo modelo de equação
quadrática, diminuiu cerca de 1,5 vez do 12° ao 20° DAE. Pode-se perceber que a
diminuição do conteúdo de AALT tanto no sistema radicular quanto na parte aérea foi
acompanhada do aumento do conteúdo de PS nestas partes do 12° até o 20° DAE (Fig.
3B e 3C).
Durante a germinação da semente e o estabelecimento da plântula de moringa, a
atividade de ICL nos cotilédones foi ajustada ao modelo de equação quadrática,
ocorrendo aumento de cerca de 6 vezes a partir do 10° até o 20° DAE (Fig. 8A). A
atividade de proteases ácidas nos cotilédones de moringa se ajustou ao modelo de
equação quártica ao longo do experimento (Fig. 8B). De acordo com este modelo,
houve aumento de aproximadamente 4 vezes na atividade destas enzimas a partir do 10°
até o 16° DAE, a partir do qual se manteve inalterada. De forma semelhante, a atividade
de amilases nos cotilédones de moringa também pôde ser descrita pelo modelo de
equação quártica durante o experimento (Fig. 8C). Assim, a atividade destas enzimas
aumentou cerca de 2,2 vezes do 12° até o 20° DAE.
24
4. DISCUSSÃO
O presente trabalho apresenta uma análise integrada para os processos de
mobilização de reservas nos cotilédones e partição dos produtos para o eixo em
crescimento durante a germinação da semente e o estabelecimento da plântula em
moringa, uma espécie com potencial para a produção de biodiesel. Neste sentido, é
notável que a MS mobilizada a partir dos cotilédones (Fig. 1A) é transferida de forma
diferencial para as partes do eixo em crescimento, ocorrendo maior acumulação de MS
no sistema radicular (Fig. 1B) em comparação com a parte aérea (Fig. 1C). Tendo em
vista que a moringa é uma espécie originária de regiões tropicais expostas à seca (Rivas
et al., 2013), a baixa razão parte aérea/sistema radicular pode consistir em um
mecanismo de resistência ao déficit hídrico durante o estabelecimento da plântula, uma
vez que um sistema radicular mais extenso e profundo pode garantir maior eficiência na
absorção de água (Larcher, 2000). Em contraponto, nas espécies tropicais de clima
úmido Caesalpinia peltophoroides (Corte et al., 2006) e Schizolobium parahyba
(Weidlich et al., 2010), ocorre maior acumulação de MS na parte aérea em relação ao
sistema radicular, indicando que maior investimento no aparato fotossintético pode ser
uma estratégia para o estabelecimento da plântula sob condições limitantes de
luminosidade (Larcher, 2000).
A mobilização das diversas reservas é iniciada em diferentes momentos do
desenvolvimento inicial em moringa. De fato, a mobilização das proteínas de reserva se
inicia ainda durante a germinação da semente (Fig. 3A), enquanto que a degradação dos
lipídeos de reserva é desencadeada a partir da protrusão da radícula (Fig. 2) e a do
amido se inicia apenas durante a emissão da parte aérea (Fig. 4A). Este padrão de
mobilização das reservas é aparentemente incomum em comparação com aquele
descrito para outras espécies arbóreas estudadas. A partir da germinação da semente, os
açúcares solúveis e o amido são consumidos conjuntamente em S. parahyba (Weidlich
et al., 2010) e é iniciada a mobilização dos açúcares solúveis e dos lipídeos e proteínas
de reserva em C. peltophoroides (Corte et al., 2006). Na nativa do Cerrado
Platymiscium pubescens (Borges et al., 2002), os oligossacarídeos da família da
rafinose (OFRs) e as proteínas de reserva são degradadas concomitantemente desde a
germinação e, na nativa da Floresta Amazônica Aniba rosaeodora (Lima et al., 2008), a
25
mobilização do amido e dos lipídeos e proteínas de reserva é iniciada de forma paralela
a partir da protrusão da radícula.
A fração de ANR relativa aos AST varia no decorrer da germinação da semente
e do estabelecimento da plântula nos cotilédones de moringa. Aproximadamente 95%
dos AST correspondem a ANR nas sementes quiescentes e, durante a germinação, este
percentual diminui para cerca de 66% até o 10° DAE. No decorrer deste processo, os
ANR provavelmente são utilizados como combustíveis celulares na oxidação
mitocondrial, enquanto que se inicia a degradação das PRS para fornecer aminoácidos
utilizados na síntese de novo de proteínas, viabilizando a reativação do metabolismo
(Müntz et al., 2001). Durante a emissão da parte aérea, ocorre aumento da fração de
ANR nos cotilédones, perfazendo cerca de 87% dos AST no 12° DAE. Considerando
que, este aumento na fração de ANR ocorre em paralelo com a acumulação de amido
nos cotilédones (Fig. 4A), é possível que estes carboidratos sejam sintetizados via
gliconeogênese (Eastmond e Graham, 2001) a partir da mobilização dos lipídeos de
reserva (Fig. 2). Resultados semelhantes também são encontrados em outras espécies
arbóreas oleaginosas, incluindo A. rosaeodora (Lima et al., 2008) e Anacardium
occidentale (Voigt et al., 2009). Do 16° ao 20° DAE, a fração de ANR se mantém em
torno de 70% dos AST. Uma vez que, durante este período, finaliza a mobilização dos
lipídeos de reserva (Fig. 2) e ocorre a degradação do amido (Fig. 4A), os ANR
provavelmente produzidos a partir destas reservas devem atuar como açúcares de
transporte dos cotilédones para o eixo em crescimento (Bewley et al., 2012).
Embora a mobilização das PRS (Fig. 3A), dos lipídeos de reserva (Fig. 2) e do
amido (Fig. 4A) nos cotilédones tenha sido iniciada em diferentes momentos do
desenvolvimento inicial em moringa, os padrões de partição dos produtos de
mobilização são bastante similares nos cotilédones e no sistema radicular. De fato, há
acumulação de AST (Fig. 5A), ANR (Fig. 6A) e AALT (Fig. 7A) nos cotilédones do
12° ao 20° DAE, período no qual a mobilização das diferentes reservas se mostra mais
intensa e atinge a exaustão. Outras espécies arbóreas estudadas apresentam padrão
diverso para a partição dos produtos de mobilização, pois ocorre diminuição do
conteúdo de AST nos cotilédones de C. peltophoroides (Corte et al., 2006) e S.
parahyba (Weidlich et al., 2010) e diminuição do conteúdo AST e AALT nos
cotilédones de Erythrina velutina Willd (Reis et al., 2012) durante a mobilização das
reservas. Além disso, há acumulação de AST (Fig. 5B), ANR (Fig. 6B) e AALT (Fig.
26
7B) no sistema radicular das plântulas de moringa do 12° ao 16° DAE e consumo destes
metabólitos até o final do experimento. Estes metabólitos devem ser consumidos, pelo
menos em parte, como precursores biossintéticos, tendo em vista a acumulação de MS
(Fig. 1B) e amido (Fig.4B) durante o mesmo período nesta parte das plântulas.
Na parte aérea das plântulas de moringa, no entanto, ocorre consumo de AST
(Fig. 5C) e AALT (Fig. 7C) em paralelo com a acumulação de ANR (Fig. 6C) e amido
(Fig. 4C) do 12° ao 20° DAE. Considerando que, durante este período, as reservas são
exauridas nos cotilédones (Fig. 2, 3A e 4A) e as primeiras folhas estão em expansão, é
provável que os ANR e o amido sejam acumulados na parte aérea como produtos de
fotossíntese. Estes eventos indicam fortemente que o estabelecimento da plântula em
moringa é alcançado no 20° DAE, marcado pela transição do metabolismo heterotrófico
baseado na mobilização das reservas para o metabolismo autotrófico fotossintético.
A mobilização das diferentes reservas nos cotilédones de moringa ao longo do
desenvolvimento inicial está coordenada com a atividade de enzimas envolvidas na
degradação destas reservas. De fato, as proteínas de reserva (Fig. 3A) são mobilizadas
mais precocemente que as reservas de carbono (Fig. 2 e 4A) e a atividade de proteases
ácidas (Fig. 8B) é máxima no 16° DAE, enquanto que a atividade de ICL (Fig. 8A) e de
amilases (Fig. 8C) é máxima mais tarde, no 20° DAE. Está bem estabelecido que as
proteases ácidas armazenadas e sintetizadas de novo iniciam a degradação das proteínas
de reserva nos vacúolos de estocagem de proteínas (VEPs) em eudicotiledôneas (Müntz,
et al., 2001; He, et al., 2007). Além disso, a enzima glioxissomal ICL está envolvida na
conversão de lipídios de reserva em sacarose em espécies oleaginosas (Eastmond e
Graham, 2001) e as amilases são reconhecidas como enzimas que iniciam a degradação
do amido em plastídios (Smith et al., 2005). Desta forma, os padrões de atividade
verificados para estas enzimas podem ser considerados bons marcadores dos processos
de mobilização que ocorrem nos cotilédones de moringa.
27
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Tomando em conjunto os resultados obtidos no presente trabalho pode-se
concluir que a mobilização das reservas, a partição dos metabólitos e a atividade de
enzimas degradativas em moringa apresentam padrões distintos daqueles verificados
para outras espécies arbóreas estudadas. Neste sentido, é possível que estes padrões
estejam relacionados com estratégias metabólicas utilizadas por esta espécie para
alcançar sucesso durante o estabelecimento da plântula.
28
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33
ANEXOS
Figura 1: Conteúdo de MS nos cotilédones, no sistema radicular e na parte aérea de moringa durante a
germinação da semente e o estabelecimento da plântula. (A) MS dos cotilédones até o 20° DAE; (B) MS do
sistema radicular do 10° ao 20° DAE; (C) MS da parte aérea do 12° ao 20° DAE. Os pontos representam
observações individuais realizadas na análise de regressão, ajustando-se ao modelo mais adequado.
A
B
C
34
Figura 2: Conteúdo de LN nos cotilédones de moringa durante a germinação e o estabelecimento da plântula. Os pontos representam observações individuais realizadas na análise de regressão, ajustando-se ao modelo
mais adequado.
35
Figura 3: Conteúdo de PS nos cotilédones, no sistema radicular e na parte aérea de moringa durante a
germinação da semente e o estabelecimento da plântula. (A) PS de cotilédones até o 20° DAE; (B) PS do
sistema radicular do 10° ao 20° DAE; (C) PS da parte aérea do 12° ao 20° DAE. Os pontos representam
observações individuais realizadas na análise de regressão, ajustando-se ao modelo mais adequado.
C
B
A
36
Figura 4: Conteúdo de amido nos cotilédones, no sistema radicular e na parte aérea de moringa durante a
germinação da semente e o estabelecimento da plântula. (A) Amido de cotilédones até 0 20° DAE; (B) Amido
do sistema radicular do 10° ao 20° DAE; (C) Amido da parte aérea do 12° ao 20° DAE. Os pontos representam
observações individuais realizadas na análise de regressão, ajustando-se ao modelo mais adequado.
A
C
B
37
Figura 5: Conteúdo de AST nos cotilédones, no sistema radicular e na parte aérea de moringa durante a
germinação da semente e o estabelecimento da plântula. (A) AST de cotilédones até o 20° DAE; (B) AST do
sistema radicular do 10° ao 20° DAE; (C) AST da parte aérea do 12° ao 20° DAE. Os pontos representam
observações individuais realizadas na análise de regressão, ajustando-se ao modelo mais adequado.
C
B
A
38
Figura 6: Conteúdo de ANR nos cotilédones, no sistema radicular e na parte aérea de moringa durante a
germinação da semente e o estabelecimento da plântula. (A) ANR de cotilédones até o 20° DAE; (B) ANR do
sistema radicular do 10° ao 20° DAE; (C) ANR da parte aérea do 12° ao 20° DAE. Os pontos representam
observações individuais realizadas na análise de regressão, ajustando-se ao modelo mais adequado.
C
B
A
39
Figura 7: Conteúdo de AALT nos cotilédones, no sistema radicular e na parte aérea de moringa durante a
germinação da semente e o estabelecimento da plântula. (A) AALT de cotilédones até o 20° DAE; (B) AALT
do sistema radicular do 10° ao 20° DAE; (C) AALT da parte aérea do 12° ao 20° DAE. Os pontos representam
observações individuais realizadas na análise de regressão, ajustando-se ao modelo mais adequado.
C
B
A
40
Figura 8: Atividades enzimáticas nos cotilédones de moringa durante a germinação da semente e o
estabelecimento da plântula. (A) atividade de ICL; (B) atividade de proteases ácidas; (C) atividade de amilases.
Os pontos representam observações individuais realizadas na análise de regressão, ajustando-se ao modelo
mais adequado.
C
B
A