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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
RAYSSA FÁTIMA HUBNER-CAMPOS
EFEITO DE FUNGOS ENTOMOPATOGÊNICOS EM
Periplaneta americana
Orientador: Prof. Dr. Wolf Christian Luz
Dissertação de Mestrado
Goiânia - Goiás, 2011
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
RAYSSA FÁTIMA HUBNER-CAMPOS
EFEITO DE FUNGOS ENTOMOPATOGÊNICOS EM
Periplaneta americana
Orientador:
Prof. Dr. Wolf Christian Luz
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Medicina
Tropical e Saúde Pública do Instituto de
Patologia Tropical e Saúde Pública da
Universidade Federal de Goiás para
obtenção do Título de Mestre em Medicina
Tropical e Saúde Pública.
Goiânia – Goiás, 2011
Dedico este trabalho a meus pais Ari Bil e Fátima
Hubner e meu ao irmão Ranier pelo carinho, fé e
companheirismo em todos os momentos da minha vida.
Ao meu amado marido Franklin, minha alma gêmea,
pelo amor e apoio incondicionais. E, em especial, ao
meu filho Benjamin por iluminar a minha alma.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Christian Luz, Professor do Departamento de Microbiologia, Imunologia,
Parasitologia e Patologia (DMIPP), Setor de Parasitologia do Instituto de Patologia
Tropical e Saúde Pública (IPTSP) da Universidade Federal de Goiás (UFG), pela
orientação, amizade, sinceridade, incentivo e confiança.
Ao IPTSP e ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da UFG, pela
oportunidade.
Aos colegas do Laboratório de Patologia de Invertebrados, em especial ao Prof. Dr.
Everton K. K. Fernandes, Priscilla R.. Borges, Luciana S. Lobo, Nathalia A. de Souza,
Walmirton B. D’Alessandro, Juscelino R. Filho e Renan N. Leles pela amizade,
carinho, auxílio e sabedoria.
Aos amigos que fiz no IPTSP, em especial a Profª. Drª. Adelair H. dos Santos e José
Clementino O. Neto, pelas experiências e conselhos compartilhados.
Ao meu irmão Ranier, meu exemplo de vida, por me fazer rir e renovar minhas
esperanças.
A meus pais, Bil e Fátima, exemplos de resignação e amor incondicionais, por
acreditarem em mim e estarem ao meu lado em todos os momentos da minha vida.
Ao meu marido Franklin, minha vida, meu norte, que com seu amor e sabedoria me
ajuda a superar todas as barreiras e transformar o impossível em real.
A todos os amigos presentes na minha vida, perto ou longe, e cujas linhas seriam
insuficientes para nominá-los, obrigada pela torcida.
A Deus, por permitir que eu trilhasse esse caminho com tantas bênçãos.
SUMÁRIO
Lista de figuras ......................................................................................................vii
Lista de tabelas.........................................................................................................x
Lista de siglas e abreviaturas...................................................................................xi
1 Introdução/Revisão de literatura .............................................................................. 1
1.1 Periplaneta americana ............................................................................................. 1
1.1.1 Sistemática e morfologia .......................................................................................... 1
1.1.2 Ciclo biológico de P. americana .............................................................................. 8
1.1.3 Aspectos comportamentais ...................................................................................... 9
1.1.4 Contaminação de insumos alimentares e habitações ............................................. 10
1.1.5 A produção de alérgenos e a indução de asma e alergias ...................................... 10
1.1.6 P. americana no contexto hospitalar ...................................................................... 10
1.2 Métodos de controle de baratas .............................................................................. 11
1.2.1 Inseticidas químicos ............................................................................................... 11
1.2.2 Inseticidas botânicos .............................................................................................. 12
1.3 Controle biológico de pragas ................................................................................. 12
1.3.1 Fungos entomopatogênicos para o controle microbiano ........................................ 13
1.3.2 Ciclo biológico de fungos entomopatogênicos ...................................................... 13
1.3.3 Combate de insetos pragas com fungos .................................................................. 15
1.3.4 Fungos e baratas ..................................................................................................... 15
2 Justificativa ............................................................................................................ 17
3 Objetivos ................................................................................................................ 18
3.1 Objetivo geral ......................................................................................................... 18
3.2 Objetivos específicos ............................................................................................. 18
4 Metodologia ........................................................................................................... 19
4.1 Origem e criação de P. americana ......................................................................... 19
4.2 Origem e cultivo dos fungos .................................................................................. 21
4.3 Preparo de formulado óleo-água ............................................................................ 22
4.4 Preparo de ninfas para aplicação de formulado e incubação pós tratamento ........22
4.5 Preparo de ootecas para aplicação de formulado e incubação pós tratamento.......23
4.6 Preparo de adultos para aplicação de formulado e incubação pós tratamento ..... 24
4.7 Análise de resultados.............................................................................................. 24
5 Resultados .............................................................................................................. 25
5.1 Ensaio com ninfas .................................................................................................. 25
5.1.1 Comportamento pós-tratamento e mortalidade de ninfas ...................................... 25
5.1.2 Desenvolvimento de fungo sobre ninfas mortas .................................................... 26
5.2 Ensaio com ootecas ................................................................................................ 27
5.2.1 Desenvolvimento de fungo sobre ootecas .............................................................. 27
5.2.2 Eclosão de ninfas.................................................................................................... 27
5.3 Ensaio com adultos. ............................................................................................... 29
5.3.1 Comportamento pós-tratamento e mortalidade de adultos.....................................29
5.3.2 Desenvolvimento de fungo sobre adultos mortos .................................................. 32
6 Discussão ............................................................................................................... 33
6.1 Comportamento pós-tratamento e mortalidade de ninfas e adultos ....................... 33
6.2 Desenvolvimento de fungo sobre ninfas e adultos mortos..................................... 34
6.3 Desenvolvimento de fungo sobre ooteca e eclosão de ninfas ................................ 35
7 Conclusões e considerações finais ......................................................................... 36
8 Referências bibliográficas ...................................................................................... 37
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Vista lateral de adulto de Periplaneta americana, com cabeça (A), tórax (B)
e abdome (C).....................................................................................................................1
Figura 2 - Vista superior da cabeça e tórax de Periplaneta americana. (A) Início das
antenas segmentadas e (B) Pronoto com faixa amarela claro...........................................2
Figura 3 - Olhos compostos (A) e parte de antena de Periplaneta americana. Em
destaque, parte da antena multisegmentada com pêlos sensoriais (B). Imagem obtida
através de microscópio de luz, magnitude 400 vezes........................................................2
Figura 4 - Pata de Periplaneta americana. (A) - Coxa (a), fêmur (b), tíbias (c) e tarsos
(d). (B) - Em destaque tarso com espinhos e fossulae espongiosas (e). Imagem obtida
através de microscópio de luz, aumento de 400 vezes......................................................3
Figura 5 - Porção final do abdome de Periplaneta americana. (A) - Macho: com dois
cercis (a) e dois estilos (b). (B) - Fêmeas com dois cercis (c)...........................................4
Figura 6 - Ooteca de Periplaneta americana em oviposição (A). Ooteca posta (B) com
coloração escura devido ao endurecimento da membrana externa....................................5
Figura 7 - Vista interna de ooteca de Periplaneta americana. (A) - Ooteca recém-posta,
contendo ovos em seu interior. (B) - Ooteca com ± 25 dias de incubação a 30 ± 1ºC,
contendo ninfas em seu interior. (C) - Em destaque ninfa envolvida pela membrana do
ovo ...................................................................................................................................5
Figura 8 - Ooteca de Periplaneta americana após eclosão das ninfas. (A) Vista superior
da membrana interna que separa os ovos em duas fileiras................................................6
Figura 9 - Ninfas de primeiro ínstar de Periplaneta americana......................................7
Figura 10 - Ninfa de Periplaneta americana durante a ecdise. Ninfa com fissura
mediana dorsal, indicando o início da ecdise (A), e numa fase mais avançada com parte
da exúvia já retirada (B). Adulto de P. americana após última muda (C), de colocação
esbranquiçada com a antiga exúvia ao lado.......................................................................7
Figura 11 - Ciclo de Metarhizium sp em inseto. (Adaptado de Alves 1998).................14
Figura 12 - Caixa de criação com adultos e ninfas de Periplaneta americana vedada
com filó (A), contendo no seu interior caixas de papelão sobrepostas (aquelas utilizadas
no transporte de ovos de galinhas) para esconderijo e sítio de postura de ootecas (B)...20
Figura 13 – (A) - Vista interna de uma caixa de criação de Periplaneta americana com
adultos e ninfas se alimentando. (B) - Placa de Petri com ração seca triturada
(Whiskas®) para gatos (a) e copo plástico com algodão umedecido em água
(b).....................................................................................................................................20
Figura 14 - Ninfas previamente imobilizadas por exposição a 4°C por 20 min, sendo
tratadas topicamente, com 0,5 µl de formulado fúngico (5x104
conídios/ninfa) na região
do tórax e abdome, com auxílio de micropipeta semiautomática....................................23
Figura 15 – Ninfa morta de Periplaneta americana com Metarhizium anisopliae IP 46
após ± 10 dias de incubação > 98% UR e 25ºC..............................................................27
Figura 16 - Ooteca de Periplaneta americana com micélio e conídios de Metarhizium
anisopliae IP 46 30 dias após incubação a > 98% umidade relativa a 25ºC..................28
Figura 17 – Eclosão (%) de ninfas de ootecas de Periplaneta americana tratadas com
Metarhizium anisopliae IP 46 e Metarhizium robertsii IP 34 (2,5 x 105 conídios/ooteca
formulados em óleo-água) e incubadas a > 98% umidades relativas e 25ºC, até 45 dias
após tratamento................................................................................................................28
Figura 18 – Mortalidade acumulada (%) de fêmeas adultas de Periplaneta americana
tratados com conídios de Metarhizium anisopliae IP 46, formulados em óleo-água, e
incubadas a umidade relativa > 98% UR e 25ºC, por 15 dias após
tratamento........................................................................................................................31
Figura 19 – Mortalidade acumulada (%) de machos adultos de Periplaneta americana
tratados com conídios de Metarhizium anisopliae IP 46, formulados em óleo-água, e
incubadas a umidade relativa > 98% UR e 25ºC, por 15 dias após tratamento...............32
Observação: 1 cm da figura equivale a medida indicada sob a barra.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - País, origem e ano dos isolados de fungos entomopatogênicos testados......21
Tabela 2 - Mortalidade acumulada (%) de ninfas de Periplaneta americana tratadas
com fungos entomopatogênicos, e desenvolvimento de fungos inoculados sobre ninfas
mortas..............................................................................................................................26
Tabela 3 - Mortalidade acumulada (%) de adultos de Periplaneta americana tratados
com conídios de Metarhizium anisopliae IP 46 e tempo letal.........................................30
Tabela 4 - Dose letal, seus respectivos intervalos de confiança, e slope, necessária para
matar 50 e 90% de adultos de Periplaneta americana tratadas com conídios de
Metarhizium anisopliae IP 46 formulado em óleo/água.................................................31
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ANOVA - Análise de Variância
BDA - Batata Dextrose Agar
IP – Sigla de isolado fúngico armazenado no IPTSP
IPTSP - Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
N1 - Ninfas de primeiro ínstar
SDAL- Sabouraud Dextrose Agar e Extrato de Levedura
SNK – Teste de comparação múltipla de Student - Newman- Keuls
UR - Umidade Relativa
USDA - United States Department of Agriculture
UVC – Radiação Ultra-Violeta - C
ARS – Agricultural Research Service
ARSEF - Agricultural Research Service of Entomopathogenic Fungi
RESUMO
Periplaneta americana é uma barata sinantrópica que veicula patógenos, contamina
ambientes e alimentos e provoca graves problemas de saúde, como episódios recorrentes de
asma e outras alergias especialmente em crianças. Atualmente, o controle desta praga é difícil
devido à resistência adquirida a vários inseticidas químicos e a ineficácia destes produtos sobre
a fase de ooteca. Fungos entomopatogênicos são usados para o controle biológico de insetos de
importância médica e veterinária. Entretanto, há poucas informações sobre a eficiência e o
potencial de fungos entomopatogênicos para combater P. americana. O presente estudo avaliou
a patogenicidade de 11 fungos pertencentes a sete diferentes gêneros, sobre P. americana. Os
fungos que causaram mortalidade > 90% em ninfas, em um primeiro experimento, foram
testados também em ootecas desta espécie. Em adultos, selecionou-se o fungo que causou maior
mortalidade em ninfas e ootecas. Conídios foram formulados em óleo-água (Graxol® a 10%) a
108 conídios/ml. Ninfas, ootecas e adultos foram tratados topicamente com 0,5 µl, 2,5 µl e 5,0
µl do formulado, numa dose final de 5x104 conídios/ninfa, 2,5x10
5 conídios/ooteca e 5x10
3, 10
4,
5x104, 10
5 ou 5x10
5 conídios/adulto, respectivamente, e incubados em câmara úmida a 25 + 1º e
12 h de fotofase. A mortalidade de ninfas e adultos foi verificada diariamente por 25 dias e o
crescimento do fungo sobre a superfície dos cadáveres acompanhado por até 15 dias. Durante
45 dias foram avaliados diariamente o desenvolvimento do fungo inoculado sobre a ooteca e a
eclosão de ninfas, e a sobrevivência destas após a eclosão, foi acompanhada por mais 15 dias.
As ninfas, ootecas e adultos do grupo controle foram tratados com a emulsão sem conídios. Os
adultos e as ninfas tratadas ou eclodidas de ootecas tratadas foram alimentadas com ração para
gatos (0,5 g) (Whiskas®) e água através de algodão umedecido (0,1 ml) oferecidos em pequenos
containers. Primeiras ninfas mortas foram observadas dois dias após o tratamento com
Beauveria bassiana IP 361, Metarhizium robertsii IP 34, M. anisopliae sensu lato IP 46, B.
bassiana IP 3, M. frigidum ARSEF 4561 e Purpureocillium lilacinum IP 320. B. bassiana IP
361, M. robertsii e M. anisopliae causaram mortalidade em mais de 80% das ninfas. Os demais
fungos testados causaram mortalidade em ninfas inferior a 20%. Em adultos a mortalidade
dependeu da dose e não diferiu entre os sexos. O fungo inoculado iniciou crescimento distinto
sobre os cadáveres após o terceiro dia de incubação das ninfas e adultos mortos em câmara
úmida. Micélio cresceu sobre a superfície das ootecas tratadas com fungos IP 34 e IP 46 após 11
dias de incubação e os novos conídios foram visualizados com ≥ 20 dias. 31% das ootecas
tratadas com IP 46 e 23% com IP 34 tornaram-se ressecadas e abauladas e nenhuma ninfa
eclodiu dessas ootecas. Em ootecas do grupo controle e em ootecas tratadas com conídios, a
eclosão de ninfas iniciou após 33 dias de incubação. Todas as ninfas eclodidas dessas ootecas
sobreviveram durante 25 dias. M. anisopliae, M. robertsii e B. bassiana IP 361 foram
patogênicos para ninfas e apresentam potencial para o controle biológico de P. americana.
ABSTRACT
Periplaneta americana is a synanthropic cockroach that carries pathogens, contaminates food
and the environment, and causes severe health problems, such as recurrent episodes of asthma
and other allergies, especially in children. Actually, the control of this pest is difficult due to
acquired multiple resistance to chemical insecticides and the ineffectiveness of these products in
oothecae. Entomopathogenic fungi are used for biological control against insects of medical and
veterinary importance. However, there is little information about the effectiveness and the
potential of entomopathogenic fungi to combat P. americana. In present study the pathogenicity
of 11 fungal strains belonging to seven different genera was evaluated in nymphs of P.
americana. Fungi that caused mortality > 90% in nymphs in the first test, were assayed in
oothecae of P. americana. For the test with adults the fungus that caused higher mortality in
nymphs and oothecae was selected. Conidia were formulated in oil-in-water (Graxol® 10%) at
108 conidia/ml. Nymphs, oothecae and adults were then treated topically with 0.5 µl, 2.5 µl
and 50 µl of the formulate, at a final dose of 5 x 104 conidia/nymph, 2,5 x 105 conidia/oothecae
and 5x103, 104, 5x104, 105 or 5x105 conidia/adult, respectively, and incubated in a humid
chamber at 25 ± 1ºC and 12 h photophase. The mortality of nymphs and adults was checked
daily for 25 days and the growth of fungi on the surface of the cadavers evaluated for up to 15
days. The development of the inoculated fungus on the ootheca was assessed daily during 45
days and subsequent hatching of nymphs monitored for another 15 days. Control nymphs, adults
and oothecae were treated with the emulsion without conidia. Adults and nymphs whether
treated as adults and nymphs or nymphs hatched from treated oothecae, were fed with dry cat
food (0.5 g) (Whiskas®) and water through moistened cotton (0.1 ml) arranged in small
containers. First dead nymphs were observed two days after treatment with Beauveria bassiana
IP 361, Metarhizium robertsii IP 34, M. anisopliae sensu lato IP 46, B. bassiana IP 3, M.
frigidum ARSEF 4561 and Purpureocillium lilacinum IP 320. Beauveria bassiana IP 361, M.
robertsii and M. anisopliae caused mortality in more than 80% of the tested nymphs. The other
fungi tested caused less than 20% mortality in nymphs. In adults mortality depended on the dose
and did not differ between the sexes. The inoculated fungus began to grow distinctly on the
cadavers three days after incubation of dead nymphs and adults in a humid chamber. Testing
activity of IP 34 and IP 46 in oothecae, mycelium grew on the surface of the treated ootheca 11
days after incubation and new conidia were formed at ≥ 20 days. In 31% of oothecae treated
with IP 46 and 23% treated with IP 34, oothecae had shrunk and no nymphs had hatched. In
all controls and oothecae treated with conidia, nymphs began to hatch 33 days after
incubation. All hatched nymphs survived for the following 25 days. M. anisopliae, M.
robertsii and B. bassiana IP 361 were pathogenic to nymphs and have potential for
biological control of P. americana.
C B A
1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DE LITERATURA
1.1 Periplaneta americana
1.1.1 Sistemática e morfologia
Periplaneta americana é um artrópode pertencente° à classe Insecta, ordem
Blattaria ou Blattodea. Os adultos apresentam forma ovalada com corpo achatado
dorsoventralmente, dividido em cabeça, tórax e abdome. Eles medem entre 35 a 40 mm
de comprimento e possuem coloração brilhante vermelha-amarronzada e uma faixa
amarela ou marrom clara margeando o pronoto (Goddard 2002, Bell et al. 2007) (Figs. 1
e 2).
A cabeça protegida pelo pronoto possui um par de longas antenas filiformes
multi-segmentadas de função tátil e olfativa, olhos compostos grandes e dois ocelos. As
peças bucais são desenvolvidas para mastigar alimentos (Bell et al. 2007) (Fig. 3).
Fig. 1 - Vista lateral de adulto de Periplaneta americana, com cabeça (A),
tórax (B) e abdome (C).
0.5 cm
B
A
B
A
Fig. 3 - Olhos compostos (A) e parte da antena de Periplaneta americana.
Em destaque, parte da antena multisegmentada com pêlos sensoriais (B).
Imagem obtida através de microscópio de luz, magnitude de 400 vezes.
Fig. 2 - Vista superior da cabeça e tórax de Periplaneta americana.(A) Início
das antenas segmentadas e (B) Pronoto com faixa amarela clara.
0,17 cm
0,05 cm
400 x 0,05
cm
Do tórax projetam-se dois pares de asas, sendo o primeiro par coriáceo e o
segundo membranoso. Um par de patas origina-se de cada um dos três segmentos
torácicos. As patas apresentam coxas robustas, fêmures, tíbias com espinhos e tarsos
pentâmeros e estruturas de adesão (fossulae espongiosas) que lhes conferem
excepcional capacidade de locomoção e rapidez em praticamente qualquer tipo de
superfície (Bell et al. 2007) (Fig. 4).
O abdome alargado e achatado alberga órgãos internos. Ao final do último
segmento encontram-se órgãos sensoriais denominados cercis e estilos. Os estilos são
presentes apenas no macho e desempenham função tátil durante a cópula. Os cercis,
cobertos por pêlos sensoriais, são responsáveis por captar movimentos do ar e vibrações
em superfícies (Bell et al. 2007) (Fig. 5).
Fig. 4 - Pata de Periplaneta americana. (A) - Coxa (a), fêmur (b), tíbias (c) e tarsos (d).
(B) - Em destaque tarsos com espinhos e fossulae espongiosas (e). Imagem obtida através de
microscópio de luz, com magnitude de 400 vezes.
0,09 cm
A
B
d
c
b e
a
0,2 cm
A B
a b c
A ooteca de P. americana é uma estrutura em forma de bolsa alongada com uma
quilha denteada, ao longo da sua borda superior, com uma membrana interna que separa
os ovos e outra externa que os protege contra perda de água (Maya et al. 2002). A
ooteca de P. americana não necessita de água adicional para o desenvolvimento das
ninfas. Contudo, danos ocasionados à casca da ooteca, durante ou após a oviposição,
levam a rápida perda de água e inviabilizam o desenvolvimento das ninfas em seu
interior (Roth & Willis 1955).
As ootecas são compostas principalmente por minerais, lipídios e proteínas. As
proteínas são estabilizadas através de ligações cruzadas, desidratação e impregnação
com metabólitos fenólicos. É através deste processo que a casca da ooteca se transforma
gradualmente, de uma membrana fina e delicada em uma casca espessa e resistente
(Pryor et al. 1946, Kramer et al. 1991).
O oxalato de cálcio é um dos principais minerais da casca da ooteca, e pode ser
responsável junto com o ácido protocatecuico, pelo endurecimento e rigidez da ooteca
de P. americana (Pryor et al. 1946, Kramer et al. 1991). O oxalato de cálcio está
presente também na cutícula da barata, mas o ácido protocatecuico é reportado apenas
em ootecas. Acredita-se que a associação entre esses componentes seja a responsável
pela resistência da ooteca a condições adversas do meio ambiente.
Fig. 5 - Porção final do abdome de Periplaneta americana. (A) – Macho: com dois
cercis (a) e dois estilos (b). (B) – Fêmeas com dois cercis (c).
0,2 cm 0,2 cm
Inicialmente de coloração castanha clara e textura mole, a ooteca torna-se
gradativamente dura e marrom. Cada ooteca possui entre 12 e 18 ovos, e mede cerca de
8 mm de comprimento e 5 mm de altura (Ponce et al. 2005, Bell et al. 2007) (Figs. 6 a
8).
A B
C
Fig. 6 - Periplaneta americana em oviposição de ooteca (A). Ooteca após três dias de
oviposição com coloração escura devido ao endurecimento da membrana externa (B).
Fig. 7 – Vista interna de ooteca de Periplaneta americana. (A) - Ooteca recém-posta
com ovos. (B) - Ooteca com ± 25 dias de incubação a 30 ± 1ºC, contendo ninfas em seu
interior. (C) - Em destaque ninfa envolvida pela membrana do ovo.
A B
B
a
b
0,14 cm 0,12 cm
0,2 cm
0,11 cm
0,02 cm
A
As ninfas eclodidas são semelhantes a adultos, exceto por serem menores,
ápteras e com órgãos sexuais subdesenvolvidos (Bell et al. 2007) (Fig. 9). Em um
primeiro momento após a eclosão, as ninfas alimentam-se de pellets fecais produzidos
pelos adultos para aquisição de simbiontes intestinais (Bell et al. 2007).
As ninfas sofrem várias mudas até atingir a fase adulta. A quantidade de mudas
necessárias para completar o desenvolvimento depende tanto de fatores bióticos quanto
de abióticos (Vianna et al. 2000). As mandíbulas desgastadas, seja pela roedura de
alimentos mais duros ou traumas, levam as baratas imaturas a terem mudas mais
frequentes. Em condições desfavoráveis, como na falta de alimentos, temperaturas
extremas e/ou presença abundante de predadores, as baratas podem apresentar número
de ecdises menor como estratégia de sobrevivência. Após a última ecdise surgem
adultos idênticos aos progenitores (Fig. 10) (Vianna et al. 2000).
Fig. 8 – Ooteca de Periplaneta americana após
eclosão das ninfas. (A) - Vista superior da
membrana interna que separa os ovos em duas
fileiras.
0,13 cm
B
A C
1.1.2 Ciclo biológico de P. americana
Fig. 9 – Ninfas de primeiro ínstar de Periplaneta americana.
Fig. 10 – Ninfa de Periplaneta americana durante ecdise. Ninfa com fissura mediana dorsal,
indicando o início da ecdise (A), e numa fase mais avançada com parte da exúvia já retirada
(B). Adulto de P. americana após última muda (C), de colocação esbranquiçada com a exúvia
ao lado.
0,33 cm
0,20 cm
0,88 cm 1,7 cm
P. americana tem desenvolvimento hemimetabólico com fases de ooteca, ninfa e
adulto. Durante o período reprodutivo machos e fêmeas liberam, através das glândulas
atriais, feromônios de atração, e durante a cópula com os corpos em oposição, ocorre a
transferência de espermatóforo pelo macho para a fêmea (Bell et al. 2007).
Fêmeas de P. americana formam, em média, uma nova ooteca a cada 4 a 10
dias, no entanto, no auge de seu período reprodutivo, essa espécie pode produzir até
duas ootecas por semana. Um a dois dias após a formação da ooteca a fêmea deposita-a
em local seguro, perto de fontes de alimento, escondendo e cobrindo-a com uma massa
feita através da mastigação de madeira, papelão ou outro material com auxílio da
secreção bucal (Yeh 1995).
As ninfas eclodem após um período de incubação da ooteca, que a 30 ± 1ºC
varia entre 30 e 45 dias. O período de embriogênese é fortemente influenciado pela
temperatura. Temperaturas mais altas aceleram o desenvolvimento dos embriões,
enquanto temperaturas mais baixas aumentam o tempo de incubação dos ovos ou
podem ainda impedir seu desenvolvimento (Vianna et al. 2001). Para que ocorra o
desprendimento da membrana externa da ooteca e a eclosão, as ninfas no interior da
ooteca necessitam realizar movimento e pressão física sincronizados. Este processo
inicia-se com cerca de 16 dias de embriogênese, aumentando de intensidade ao final
desta. Caso não ocorra o sincronismo, por morte de algumas ninfas, a eclosão ficará
comprometida para todas as outras (Provine 1976).
As ninfas de P. americana necessitam de 5 a 15 meses para chegar à fase adulta.
O número de ínstares ninfais é variável entre os sexos, com média de 11 a 13 ínstares
para o macho e 9 a 13 para a fêmea. A duração de cada ínstar ninfal está relacionada à
condições ambientais, podendo estender-se de 14 a 33 dias. Machos podem viver, em
média, dois anos e meio e fêmeas aproximadamente três anos e quatro meses (Vianna et
al. 2001, Bell et al. 2007).
1.1.3 Aspectos comportamentais
P. americana é denominada sinantrópica por haver desenvolvido estreita relação
com o homem (Bell et al. 2007). Pode ser encontrada dentro e fora de edificações, em
lugares escuros e úmidos. Em áreas peridomiciliares como jardins abriga-se ao redor de
madeiras apodrecidas, entulhos, perto de árvores e outras vegetações. Na presença de
predadores, escassez de alimento ou falta de abrigo, invadem habitações humanas. Nas
casas refugiam-se em banheiros, cozinhas, dentro de armários, atrás de cortinas, no
interior de caixas de esgotos, caixas d' água e de gordura, em ralos e qualquer outro
local que ofereça proteção contra predadores como lagartixas e escorpiões (Rust 2008).
Além da invasão domiciliar, P. americana pode ser encontrada em galpões de
armazenamento, lojas de animais, supermercados, escolas, restaurantes e hospitais,
dentre outros. P. americana apresenta comportamento subsocial e gregário. Em todos os
estágios de desenvolvimento, os indivíduos imaturos encontram-se associados a adultos.
A agregação é estimulada pela produção de feromônios por estes insetos (Amé et al.
2004, Ponce et al. 2005, Bell et al. 2007).
Essas baratas são atraídas pelo cheiro de restos de alimentos acumulados,
principalmente os contendo açúcar e gordura, além de resíduos orgânicos e fluídos
corporais humanos, como escarro e fezes. Alimentam-se de tudo que serve ao consumo
humano, além de produtos contendo celulose, cola, urina, escarro, unha, cabelos, suas
próprias mudas, restos de animais mortos e sangue seco. Podem sobreviver por 15 dias
sem água e por até 42 dias sem comida (Bell et al. 2007).
As peças bucais iniciam o processo de digestão extracorpórea através da
secreção de líquido das glândulas bucais sobre o alimento, para amolecê-lo e depois
ingeri-lo (Vargas 1995). A regurgitação de parte do conteúdo intestinal pode estar
relacionada à necessidade de transferir às proles simbiontes intestinais. Outra função da
regurgitação seria, junto com a defecação, a demarcação de território com a
impregnação de odor característico (Bell et al. 2007).
1.1.4 Contaminação de insumos alimentares e habitações
Ao se alimentarem, indivíduos de P. americana regurgitam porções de alimentos
semi-digeridos, defecam e contaminam assim comidas e bebidas, tornando-as
impróprias para o consumo humano ou animal (Ponce et al. 2005). Além disso,
excretam líquidos oleosos pelas glândulas corporais para demarcação de território ou
como conduta de fuga. Esses líquidos corporais conferem odor e gosto nauseantes
característicos a alimentos, superfícies e objetos com os quais entram em contato,
permanecendo impregnados por longa duração causando mal estar aos habitantes
(Ponce et al. 2005, Bell et al. 2007).
1.1.5 A produção de alérgenos e a indução de asma e alergias
Nos últimos anos têm crescido as evidências da associação entre asma e a
presença de baratas. P. americana por meio de restos de suas exúvias, fezes, saliva e
excreções corporais, produz alérgenos que causam erupções cutâneas, prurido intenso,
coriza, inchaço das pálpebras e lacrimejamento em pessoas sensíveis (Arlian 2002,
Pomés & Villalba 2007, Rust 2008). Estes alérgenos, mesmo após a eliminação das
baratas, permanecem nos locais por até seis meses ainda com potencial irritante
(Eggleston 2003). A permanência prolongada de P. americana em habitações pode
ocasionar também complicações mais graves do trato respiratório em seus moradores.
Crianças que habitam casas com infestação leve a moderada por P. americana,
apresentam sensibilização respiratória aguda como resposta imune exacerbada a
alérgenos produzidos por estes insetos, e desenvolvem episódios mais frequentes e
graves de asma quando comparadas a crianças que não tem contato com baratas
(Moraes et al. 2001, Sarinho et al. 2004, Lopes et al. 2006).
1.1.6 P. americana no contexto hospitalar
P. americana é responsável por graves problemas como a disseminação de
patógenos causadores de doenças infecto-contagiosas, principalmente em hospitais,
ocasionando surtos de infecção hospitalar (Fathpour et al. 2003, Graczyk et al. 2005,
Tachbele et al. 2006, Vahabi et al. 2007).
A alternância de habitats, com a permanência durante o dia em locais altamente
contaminados como canais de esgoto, fossas e lixões, e a saída à noite em busca de
alimento, caracteriza P. americana como veiculadora de patógenos e parasitas ao
homem (Ponce et al. 2005). Ao transitar em áreas habitáveis pelo homem, a barata
americana propaga, por ação mecânica, microrganismos patogênicos de origem humana
e animal. Esta propagação ocorre pela superfície corporal e patas, em casas, hospitais,
restaurantes e criadouros de animais (Prado et al. 2002, Lemos et al. 2006, Miranda &
Silva 2008). Cerca de 29 espécies de vírus, fungos, protozoários, helmintos e bactérias
com significativa resistência a antibióticos, já foram identificados em P. americana
(Fathpour et al. 2003, Pai et al. 2003, Thyssen et al. 2004, Graczyk et al. 2005, Lemos et
al. 2006, Prado et al. 2006, Tachbele et al. 2006).
Ocasionalmente, P. americana aproxima-se do rosto de pessoas adormecidas ou
inconscientes acamadas, em busca de restos de alimentos semidigeridos, como leite
regurgitado em recém-nascidos. Ao se alimentar desses restos, provoca “roeduras”
sobre a pele e mucosa, em especial nos lábios e região angular da boca, ocasionando no
local uma erupção vesiculosa denominada herpes blattae (Miranda & Silva 2008).
Ainda como oportunista, P. americana pode alimentar-se de secreções das fossas nasais
e em alguns casos pode invadir cavidades naturais, como nariz e ouvidos, causando
problemas respiratórios e auditivos graves (Figueiredo et al. 2002).
1.2 Métodos de controle de baratas
1.2.1 Inseticidas químicos
Inseticidas químicos, devido ao baixo custo e rápida resposta, são produtos de
primeira escolha e os mais difundidos no combate às baratas (Miller et al. 2003).
Contudo, o uso permanente destes produtos tem sido continuamente questionado devido
a resultados insatisfatórios, contaminação do ambiente e intoxicação de pessoas e
animais domésticos (Alarcon et al. 2005).
A falha no controle de baratas com inseticidas químicos pode ser atribuída à
resistência adquirida, por parte das baratas, a produtos químicos como
organofosforados, carbamatos e piretróides (Rust 2008). Vários fatores podem
determinar o desenvolvimento de resistência química e genética de baratas à inseticidas
químicos. Dentre estes, destacam-se a dificuldade de identificação da espécie e seleção
do tratamento adequado. Os erros mais comuns são os tratamentos repetidos com
superdosagens ou aplicação de quantidades inferiores de inseticidas às recomendadas
pelos fabricantes (Crow 1957, Rust & Reierson 1991, Salmeron & Omoto 2003).
No Brasil, o Ministério da Saúde não possui programas específicos para controle
de P. americana ou de outras baratas, comparáveis com os programas para controle de
dengue ou malária. O governo brasileiro publica periodicamente uma lista com os
produtos químicos autorizados no país para uso contra insetos pragas. Desta forma, a
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) é responsável por fiscalizar a
comercialização destes produtos, mas são os Estados e Municípios que definem quais
diretrizes as empresas privadas de combate a insetos pragas devem seguir (SES 2011,
Machado 2011). A escolha do inseticida químico a ser usado é decidida entre a empresa
e o cliente, e está diretamente relacionada à quantidade de baratas existentes, bem como
o tipo e o local a ser tratado (Marcondes 2001, Quirino 2003).
1.2.2 Inseticidas botânicos
São compostos à base de plantas ou metabólitos secundários destas que têm sido
utilizados no controle integrado de algumas pragas agrícolas (Menezes 2005). No
entanto, em relação a baratas, são usados apenas como repelentes, a exemplo dos óleos
de limão, lima, laranja, toranja, dentre outros (Chopa et al. 2006, Thavara et al. 2007,
Ling et al. 2009, Yoon et al. 2009).
1.3 Controle biológico de pragas
O controle biológico de pragas é a aplicação de inimigos naturais, como
patógenos, predadores ou parasitóides para combater e/ou controlar pragas, tanto na
agricultura quanto no meio médico e veterinário (Alves 1998). Crescentes preocupações
com o meio ambiente e com os riscos à saúde humana e animal, provenientes do uso
inadequado de inseticidas químicos, têm estimulado esforços para o desenvolvimento de
alternativas mais eficientes e seguras no combate a insetos pragas. Dentre as opções
pesquisadas, fungos entomopatogênicos apresentam-se como uma opção segura e
eficiente para o controle de muitas pragas (Faria & Wraight 2007, Zimmermann 2007).
1.3.1 Fungos entomopatogênicos para o controle microbiano
Acredita-se que 80% das doenças causadas à artrópodes tenham os fungos como
agentes patogênicos. Cerca de 90 gêneros e 700 espécies de fungos entomopatogênicos
foram descritas no mundo, e muitos desses fungos ocorrem no Brasil (Alves 1998).
Porém, o potencial da maioria desses fungos para o controle de pragas ainda é
desconhecido. Alguns gêneros, entre eles Metarhizium e Beauveria, têm recebido maior
atenção, mas sem terem ainda todo seu potencial investigado (Faria & Wraight 2007). O
grande número de espécies aliado à alta variabilidade genética e capacidade de infectar
insetos em diversos ambientes fazem dos fungos agentes promissores no controle
biológico (Khachatourians 1998).
1.3.2 Ciclo biológico de fungos entomopatogênicos
O ciclo biológico de fungos, como Metarhizium anisopliae e Beauveria
bassiana, inicia-se com a adesão de conídios à superfície do inseto hospedeiro. A
cutícula atua como uma barreira mecânica e fisiológica a ser atravessada, contudo,
fungos também podem invadir o hospedeiro através de orifícios naturais e pontos de
injúrias (Goettel & Lacey 1995). Uma vez aderido, o conídio inicia a germinação que se
completa com a formação de um tubo germinativo e hifas. Em determinadas espécies,
como M. anisopliae, há formação de apressório e grampo de penetração que auxiliam
no processo de penetração da cutícula (Khachatourians 1998) (Fig. 11). O processo de
invasão fúngica envolve forças mecânicas e excreção de enzimas extracelulares
degradadoras da cutícula (Goettel & Lacey 1995). Após a penetração, as hifas atingem a
hemocele, e neste momento o inseto ativa mecanismos de defesa interna contra o
crescimento fúngico, como fagocitose, destruição de plasmócitos infectados,
encapsulamento de propágulos fúngicos e formação de nódulos. O fungo patogênico
escapa dos mecanismos de defesa do inseto, e forma corpos hifais. A ação de toxinas,
associada a alterações na hemocele, cessação da alimentação e depleção de reservas
nutricionais, devido ao crescimento de corpos hifais e micélio, causam a morte do inseto
(Khachatourians 1998). Muitos fungos colonizam órgãos como o corpo gorduroso,
sistema digestivo, tubos de Malpighi, hipoderme, sistema nervoso, músculos e
traquéias. Após a morte do inseto, hifas emergem através dos espiráculos e da cutícula
e, associado ao crescimento de micélio, ocorre a conidiogênese do fungo no cadáver. A
disseminação de novos conídios no ambiente ocorre através de chuva, vento e animais,
podendo contaminar e infectar novos hospedeiros (Goettel & Lacey 1995,
Khachatourians 1998).
Fig. 11 – Ciclo de Metarhizium sp. em inseto hospedeiro. (Adaptado
de Alves 1998)
1.3.3 Combate de insetos pragas com fungos
Fungos entomopatogênicos têm sido utilizados na agricultura para o controle de
cascudinhos (Chernaki et al. 2007), cigarrinhas (Pria Júnior et al. 2008), broca gigante
da cana-de açúcar (Figueirêdo et al. 2002), lagartas e percevejos do algodão (Filho et
al. 2002, Samuels & Coracini 2004), cupins (Fernandes & Alves 1991), moscas (Wright
et al. 2004, Angel et al. 2005) dentre outros. O potencial de fungos entomopatogênicos
para o combate de insetos de importância médica e veterinária tem sido demonstrado
em laboratório para Triatoma infestans (Luz et al. 1998), Anopheles gambiae (Scholte
et al. 2005), carrapatos (Pirali et al. 2007, Leemon & Jonsson 2008) dentre outros, e
també recentemente em campo para A. gambiae (Bukhari 2011) e Aedes aegypti (Lobo
et al. dados não publicados). Desta forma, devido ao potencial inseticida dos fungos,
vários países investem em pesquisas para o desenvolvimento, produção e
comercialização de micoinseticidas, formulados principalmente com M. anisopliae ou
B. bassiana (Faria & Wraight 2007).
1.3.4 Fungos e baratas
Ainda não existem no Brasil produtos comerciais à base de fungos
entomopatogênicos para o controle de baratas sinantrópicas ou outros insetos pragas
urbano. Um inseticida formulado com conídios de M. anisopliae em pó espalhativo,
chamado “Zero QK-S 0,4 DP” é comercializado na Guatemala para o combate
específico de baratas. O fabricante recomenda que esse produto seja espalhado em uma
fina camada nas superfícies a serem tratadas. Apesar da citação de não toxicidade a
mascotes, o produto é classificado como ligeiramente tóxico (Grau IV - OMS) e não há
informações específicas sobre segurança para humanos (Agricola 2011). O produto é
comercializado exclusivamente na Guatemala e pedidos de importação são negados,
bem como informações adicionais do inseticida.
Até hoje existem poucas informações publicadas sobre efeito de fungos em
baratas, seja em condições de campo ou laboratório. Os trabalhos relatam, em grande
parte, o sinergismo entre produtos químicos e M. anisopliae em adultos de B.
germanica (Kaakeh et al. 1996, 1997, Zurek et al. 2002, Quesada-Moranga et al. 2004,
Adebi & Dayer 2005). Apesar do sinergismo ser um fator importante para controle
integrado, o conhecimento do real potencial dos fungos entomopatogênicos, sobretudo
para P. americana, ainda faz-se necessário.
Até o presente momento, tem-se conhecimento de apenas um único estudo
publicado sobre a associação entre fungos entomopatogênicos e P. americana, e este
relata o efeito de B. bassiana nessa espécie. Nesse estudo, conídios causaram
mortalidade em adultos e diminuíram a eclosão de ninfas em ootecas tratadas (Mohan et
al. 1999). Ainda não existem informações sobre o potencial de outras espécies ou
linhagens de fungos para controle biológico de P. americana.
2 JUSTIFICATIVA
A presença de baratas em hospitais propicia o risco de contaminação de
ambientes, artigos médico-hospitalares, pacientes e trabalhadores com a disseminação
mecânica de vírus, fungos e bactérias. Apesar da veiculação de patógenos por baratas
em ambiente hospitalar já ter sido comprovada, a atribuição da causa das doenças às
baratas ainda é dificultada, tanto pela falta de um protocolo de
identificação/rastreamento quanto pelo hábito noctívago das mesmas.
As opções disponíveis para combater este inseto são paliativas, isto porque o
tratamento escolhido, na maioria das vezes, é um gel comestível com ação inseticida,
que afeta apenas ninfas e adultos. A ooteca neste tipo de tratamento não é combatida,
permitindo uma nova infestação em pouco tempo. Mesmo no tratamento químico por
pulverização, a ooteca ainda mantém-se inacessível, uma vez que a mesma é oviposta
em local escondido, e aparentemente, o inseticida químico não possui capacidade de
transpor a casca da ooteca e afetar as ninfas em desenvolvimento.
A falta de informação quanto à conduta correta em casos de infestações, advinda
da ausência de programas que norteiem o combate a baratas, favoreceu o uso abusivo de
produtos químicos, e por consequência, a seleção de populações resistentes à produtos
atualmente utilizados. Além da resistência adquirida, outro efeito colateral do abuso
destes produtos é a toxicidade para o meio ambiente e o homem.
As injúrias causadas por esta praga, bem como a falta de alternativas para o seu
controle, suscitam esforços para o desenvolvimento de estratégias que sejam viáveis,
seguras e eficazes. Fungos entomopatogênicos obtiveram resultados satisfatórios, em
condições de laboratório e/ou campo, contra alguns insetos de interesse médico. Nesse
sentido, o uso de fungos, que poderão afetar todas as fases de desenvolvimento da
barata, inclusive a ooteca, apresenta–se como uma alternativa promissora no combate a
esta praga.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Contribuir para o desenvolvimento do controle biológico de P. americana com
fungos entomopatogênicos.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar o efeito de fungos entomopatogênicos em ninfas de P. americana;
Avaliar o efeito em ootecas, dos isolados fúngicos mais virulentos para ninfas de
P. americana;
Avaliar o efeito em adultos, dos isolados fúngicos mais virulentos para ootecas
de P. americana;
4 METODOLOGIA
4.1 Origem e criação de P. americana
A criação de P. americana foi originada a partir de espécimes adultos capturados
na cidade de Goiânia, Goiás, Brasil em 2009. Os insetos foram criados sob condições de
laboratório, em caixas plásticas (30 x 30 x 30 cm) com até 50 casais cada. Em cada
caixa foram colocadas quatro bandejas de papelão, aquelas utilizadas para o transporte
de ovos de galinhas (10 x 10 x 10 cm). As bandejas sobrepostas foram destinadas ao
esconderijo das baratas e sítio de postura de ootecas. As caixas foram vedadas com filó
para impedir fuga e propiciar aeração. Os insetos foram mantidos a 25 + 1ºC, 70 + 10 %
de umidade relativa (UR) e fotofase natural (Fig. 12).
As baratas foram alimentadas com ração seca comercial para gatos (Whiskas®,
Mars Brasil Incorporated, Indústria e Comércio Ltda. Guararema, SP, Brasil)
previamente triturada, e com água fornecida através de algodão umedecido
acondicionado em copos plásticos de 200 ml (Fig. 13). Três vezes por semana foram
retirados indivíduos mortos, exuvias, excesso de fezes, restos de alimentos, ootecas
postas e feita a reposição de água e ração.
As ootecas retiradas do substrato foram acondicionadas individualmente em
placa de Petri (40 x 11 mm), expostas, em ambos os lados, a radiação ultravioleta
(UVC) durante 15 minutos para diminuição da microbiota existente na superfície e
depois mantidas, em incubadora própria, a 30 ± 2ºC, > 98% UR até eclosão das ninfas.
As ninfas foram transferidas para caixa plástica (30 x 30 x 30 cm) e mantidas sob as
mesmas condições dos adultos.
a b
4.2 Origem e cultivo dos fungos
Fig. 13 – (A) - Vista interna de uma caixa de criação de Periplaneta americana com adultos e
ninfas se alimentando. (B) - Placa de Petri com ração seca triturada (Whiskas®
) para gatos (a) e
copo plástico com algodão umedecido em água (b).
Fig. 12 - Caixa de criação com adultos e ninfas de Periplaneta
americana vedada com filó (A), contendo no seu interior
caixas de papelão sobrepostas (aquelas utilizadas no transporte
de ovos de galinhas) para esconderijo e sítio de postura de
ootecas (B).
A B
B
A
Tabela 1 – Origem, ano e país dos fungos entomopatogênicos testados.
4.2 Origem e cultivo dos fungos
As informações sobre os fungos utilizados nos testes, como o país, o ano de
isolamento e o hospedeiro ou substrato de origem são apresentadas na Tabela 1.
Para o preparo do meio de cultura BDA (batata, dextrose, ágar) 170 g de batatas
foram descascadas, cortadas em pequenos pedaços, colocadas em um béquer de plástico
com 1.000 ml de água destilada e autoclavadas. Após 20 min a 120ºC, o béquer foi
retirado do autoclave e deixado em temperatura ambiente até esfriar. O líquido foi então
filtrado, completado o volume para 1.000 ml com água destilada, acrescentado 20 g
dextrose e 18 g ágar, ajustado o pH para 7 e autoclavado novamente durante 20 min. O
meio foi distribuído em placas de Petri de vidro (100 x 20 mm) e essas armazenadas a
4ºC até a utilização. Após o repique do fungo, as placas foram incubadas a 25 ± 1ºC, 75
± 10% de umidade relativa e fotofase de 12 h durante 15 dias.
Fungo Isolado País Ano Substrato/
Hospedeiro
Beauveria bassiana IP 3 a Brasil 2001 Solo
B. bassiana IP 361 a Brasil 2010 Amblyomma
c
Isaria farinosa ARSEF 1065 b Brasil 1983 Chlosyne
d
I. cateniobliqua ARSEF 6244 b China 1999 besouro
e
Metarhizium anisopliae s.l. IP 46 a Brasil 2001 Solo
M. robertsii IP 34 a Brasil 2001 Solo
M. frigidum ARSEF 4561 b Austrália 1989 Solo
Purpureocillium lilacinum IP 320 a Brasil 2006 Solo
Simplicillium lanosoniveum ARSEF 8822 b Tanzânia 2008 culicídeo
f
Sporothrix insectorum IP 268 a Brasil 1997 Leptopharsa
g
Tolypocladium cylindrosporum ARSEF 962 b Canadá 1971 solo
a Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP), UFG, Goiânia, Goiás, Brasil.
b USDA-ARS Robert W Holley. Institute Center for Agriculture and Health, NY, Ithaca,
USA c Ixodida,
d Lepidoptera,
e Coleoptera,
f Diptera,
g Hemiptera
4.3 Preparo de formulado fúngico em óleo-água
Conídios de cada fungo foram raspados com auxílio de uma espátula da
superfície do meio de cultura, transferidos para tubos de vidro contendo 10 ml de
Tween 80®
(0,1%) e pérolas de vidro, agitados em vortex por 3 min, filtrados através de
algodão hidrófilo e a concentração determinada pela contagem dos conídios em câmara
de Neubauer. Os conídios foram formulados em 10% de óleo vegetal emulsionável
(Graxol®, Agrária Indústria e Comércio Ltda., Jardinópolis, SP, Brasil) na concentração
final de 108 conídios/ml. No início de cada experimento, a viabilidade dos conídios (>
95 %) foi confirmada pela inoculação de 100 µl da suspensão de conídios, em placa de
Petri contendo meio SDAL (Sabouraud dextrose ágar acrescido de extrato de levedura),
incubados a 25 + 1ºC por até 24 h. A contagem de conídios germinados (100 conídios
em quatro quadrantes), foi feita utilizando um microscópio óptico. Conídios foram
considerados germinados quando o tubo germinativo foi mais longo que o diâmetro do
conídio.
4.4 Preparo de ninfas para aplicação de formulado e incubação pós
tratamento
Dez ninfas (N1) com 24 a 72 h após a eclosão foram colocadas em placas de
Petri (100 x 20 mm) com papel filtro estéril e expostas a 4ºC por 20 minutos, para
diminuir a movimentação durante o tratamento. Com auxílio de um pincel de cerdas
finas, as ninfas foram dispostas com a face ventral para baixo. Com ajuda de uma
micropipeta semiautomática, 0,5 µl de formulado fúngico foi aplicado sobre a região
dorsal do tórax e abdome de cada ninfa, resultando numa dose final de 5x104
conídios/ninfa (Fig. 14). As ninfas do grupo controle foram tratadas apenas com
formulado óleo-água, sem adição de conídios. As placas com as ninfas foram
acondicionadas a 25 + 1ºC e > 98% UR. As ninfas foram alimentadas apenas com ração
seca comercial para gatos (Whiskas®) (0,5 g por placa) previamente triturada e água
através de algodão umedecido (0,1 ml), ambos fornecidos em copos artesanais de
alumínio (1 ml). A cada três dias, os recipientes com água e comida foram substituídos
por novos. A mortalidade foi verificada diariamente por 25 dias. Ninfas mortas foram
transferidas para câmara úmida a 25 + 1ºC, e o crescimento de fungo na superfície dos
cadáveres foi avaliado por até 15 dias.
Fig. 14 - Ninfas previamente imobilizadas por
exposição a 4°C por 20 min, sendo tratadas
topicamente com 0,5 µl de formulado fúngico
(5x104
conídios/ninfa) na região do tórax e abdome,
com auxílio de micropipeta semiautomática.
4.5 Preparo de ootecas para aplicação do formulado e incubação pós
tratamento
Ootecas com três a cinco dias após oviposição pelas fêmeas foram retiradas do
substrato, acondicionadas individualmente em placas de Petri com papel filtro estéril,
totalizando cinco ootecas tratadas para cada fungo por repetição. Foram testados M.
anisopliae IP 46 e M. robertsii IP 34, que em teste anterior, causaram mortalidade ≥
90% em ninfas. Com pipeta semiautomática, foram aplicados topicamente 2,5 µl de
formulado óleo-água, resultando numa dose final de 2,5 x 105
conídios/ooteca. As
ootecas do grupo controle foram tratadas apenas com a emulsão óleo-água, sem
conídios. As placas com as ootecas foram acondicionadas a 25 + 1ºC e > 98% UR, e
acompanhados por 50 dias o desenvolvimento de fungo sobre a ooteca e a eclosão de
ninfas. A sobrevivência de ninfas eclodidas foi avaliada diariamente por mais 25 dias.
As ninfas foram alimentadas conforme descrito no item 4.4.
4.6 Preparo de adultos para aplicação do formulado e incubação pós
tratamento
Adultos, machos e fêmeas, foram separados das caixas de criação dois dias
antes de cada tratamento para diminuir o stress ao manuseio. Foi testado M. anisopliae
IP 46, que em teste anterior, causou maior mortalidade em ninfas e ootecas. Os
espécimes foram tratados topicamente, na região ventral do tórax e abdome, com 50 µl
de formulado fúngico, através de uma micropipeta semiautomática. Foram testadas
cinco doses 5x103, 10
4, 5x10
4, 10
5 e 5x10
5 conídios/adulto. Adultos do grupo controle
foram tratados apenas com formulado óleo-água. Copos plásticos (350 ml) contendo no
seu interior papel filtro e um esconderijo feito de caixa para ovos de galinhas, foram
perfurados nas laterais e utilizados para acondicionar os adultos. Cada copo plástico
recebeu apenas um indivíduo tratado, perfazendo cinco adultos tratados para cada dose.
Os copos com os adultos foram acondicionados a 25 + 1ºC e > 98% UR por até 25 dias.
Água foi ofertada permanentemente através de algodão umedecido (0,5 ml) (3 cm).
Ração seca comercial para gatos previamente triturada (Whiskas®) (0,5 g por placa), foi
ofertada a cada cico dias, por 24 h, e então removida, para prevenir crescimento de
contaminantes. A mortalidade foi verificada diariamente por 25 dias. Adultos mortos
foram transferidos para câmara úmida a 25 + 1ºC, após prévia decontaminação da
superfície corporal, e o crescimento de fungo sobre os cadáveres avaliado por até 15
dias.
4.7 Análise dos resultados
Foram realizadas seis repetições independentes para ninfas, ootecas e adultos,
cada uma usando nova cultura de fungo. Os valores de mortalidade relativa acumulada
de ninfas foram transformados em arcsin e examinados com Análise de Variância
(ANOVA) e teste de comparação múltipla Student-Newman-Keuls (SNK). As médias
foram consideradas significativamente diferentes com P < 0,05.
5 RESULTADOS
5.1 Ensaio com ninfas
5.1.1 Comportamento pós-tratamento e mortalidade de ninfas
Geralmente as ninfas iniciaram movimentos repetitivos com as antenas e patas
imediatamente após aplicação tópica do formulado óleo-água com ou sem conídios.
Durante cinco a 10 minutos elas passaram suas antenas primeiramente sobre a superfície
corporal e depois pelo seu aparelho bucal. As patas também foram levadas à boca. A
partir do quinto dia após inoculação até o 25° dia, ninfas tratadas com Sporothrix
insectorum (IP 268) apresentaram hiperatividade, movimentando-se rapidamente na
placa de Petri. O comportamento de ninfas tratadas com os outros fungos, não foi
diferente ao observado em ninfas do grupo controle.
Dois dias após tratamento, pelo menos 80% das ninfas tratadas com B. bassiana
IP 361, M. robertsii IP 34 e M. anisopliae IP 46 demostraram uma distinta desordem de
movimento com incremento de sinais de paralisia. Esses insetos morreram no mesmo
ou nos próximos dias (Tab. 2). Primeiras ninfas mortas foram encontradas com dois dias
pós tratamento com B. bassiana IP 3 e IP 361, M. robertsii IP 34, M. anisopliae IP 46,
M. frigidum ARSEF 4561 e Purpureocillium lilacinum IP 320. Enquanto a mortalidade
de ninfas tratadas com IP 361, IP 34 e IP 46 aumentou nos dias seguintes e atingiu
valores ≥ 58,3% e ≥ 81,7% depois de 10 e 25 dias pós tratamento, respectivamente. A
maioria das ninfas (≥ 80%) tratadas com os outros fungos sobreviveu (Tab. 2).
Nenhuma ninfa morreu quando tratada com Isaria cateniobliqua ARSEF 6244, I.
farinosa ARSEF 1065, Simplicillium lanosoniveum ARSEF 8822, Sporothrix
insectorum IP 268 e Tolypocladium cylindrosporum ARSEF 962, ou no grupo controle,
e incubada em seguida durante 25 dias. O efeito dos fungos testados sobre a
mortalidade acumulada foi altamente significativo para ambos, 10 e 25 dias de
incubação (F10,55 ≥ 18,3; P ≤ 0,0001, Tab. 2).
Tabela 2 – Mortalidade acumulada (%) de ninfas de Periplaneta americana tratadas
com fungos entomopatogênicos e número relativo de ninfas mortas com
desenvolvimento do fungo inoculado.
5.1.2 Desenvolvimento de fungo sobre ninfas mortas
O crescimento distinto de micélio sobre ninfas mortas foi observado inicialmente
nas regiões intersegmentais das patas e antenas após o terceiro dia de incubação dos
cadáveres em câmara úmida. A maioria das ninfas (≥ 91,5%) que morreu após o
tratamento com B. bassiana, Metarhizium spp. ou P. lilacinum apresentou micélio e
conídios sobre os indivíduos mortos nos dias seguintes (Tab. 2, Fig. 15).
Fungo Mortalidade acumulada (%) Desenvolvimento
de fungo (%)
10º dia 25º dia 15º dia
Beauveria bassiana IP 3 1,7 ± 1,5 a 5 ± 4,6 a 100
B. bassiana IP 361 58,3 ± 11,4 b 81,7 ± 8,6 c 100
Isaria cateniobliqua 0 a 0 a -
I. farinosa 0 a 0 a -
Metarhizium anisopliae 66,7 ± 13,8 b 95 ± 3,1 c 91,5 ± 4
M. frigidum 13,3 ± 3 a 20 ± 2,4 b 100
M. robertsii 71,7 ± 8,6 b 93,3 ± 1,9 c 91,7 ± 5
Purpureocillium
Lilacinum 8,3 ± 4,3 a 18,3 ± 6,4 b 100
Simplicillium
lanosoniveum 0 a 0 a -
Sporothrix insectorum 0 a 0 a -
Tolypocladium
cylindrosporum 0 a 0 a -
F10,55 18,3 77,1 -
P < 0,0001 < 0,0001 -
Dez ninfas de primeiro ínstar foram tratadas topicamente com suspensão de
conídios (5 x 104
conídios/ninfa) formulados em óleo/água (Graxol® 10%) e
incubadas a 25 ± 1°C, umidade relativa > 98% e 12 h de fotofase por até 25 dias.
Os valores médio de mortalidade (calculados com seis repetições independentes)
na mesma coluna, baseados em análise de variância e teste de comparação múltipla
Student-Newman-Keuls, seguidos por letras diferentes (a - c) foram
significativamente diferentes entre si. Não houve mortalidade de ninfas dos grupos
controles.
Fig. 15 - Ninfa morta de
Periplaneta americana com
Metarhizium anisopliae IP 46
após 10 dias de incubação a >
98% UR e 25ºC.
5.2 Ensaio com ootecas
5.2.1 Desenvolvimento de fungo sobre as ootecas
Micélio e novos conídios distintos dos isolados IP 46 e IP 34 foram visualizados
inicialmente sobre a quilha, e depois, por toda extensão da ooteca tratada, após um
mínimo de 11 dias (micélio) e 20 dias (conídios) de incubação após tratamento (Fig.
16). No 30° dia, 31% das ootecas tratadas com IP 46 e 23% das ootecas tratadas com IP
34 foram cobertas por micélio e conídios.
5.2.2 Eclosão de ninfas
Em ootecas nas quais houve desenvolvimento de micélio e conídios do fungo
inoculado, nenhuma ninfa eclodiu durante os 45 dias de exposição. A eclosão de ninfas
a partir de ootecas, sem micélio ou conídios na superfície externa, tratadas ou não com
IP 34 ou IP 46, iniciou em média 33 dias após tratamento e terminou até o 44° dia.
Nenhuma ninfa eclodiu entre 45 e 50 dias de incubação. Nos grupos controle, 100% das
ninfas eclodiram até 45 dias de incubação. Todas as ninfas eclodidas a partir de ootecas
0,33 cm
Tempo (pós-tratamento)0 30 35 40 45
Ecl
osã
o (
%)
0
20
40
60
80
100Controle
IP 46
IP 34
tratadas com conídios (69% e 77% de eclosão para IP 46 e IP 34, respectivamente; Fig.
17) ou de ootecas do grupo controle sobreviveram durante os 25 dias seguintes.
5.3 Ensaio com adultos
Fig. 16 – Ooteca de Periplaneta americana com micélio e
conídios de Metarhizium anisopliae IP 46, 30 dias após
incubação a umidade relativa > 98% e 25ºC.
Fig. 17 - Eclosão (%) de ninfas de Periplaneta americana a partir de
ootecas tratadas com Metarhizium anisopliae IP 46 e Metarhizium
robertsii IP 34, formulados em óleo-água, (2,5 x 105 conídios/ooteca) e
incubadas a umidade relativa > 98% e 25ºC, até 45 dias após tratamento.
0,12 cm
5.3.1 Comportamento pós-tratamento e mortalidade de adultos
Assim como as ninfas, adultos, tanto machos quanto fêmeas, após aplicação
tópica do formulado óleo-água, com ou sem conídios, iniciaram movimentos repetitivos
com antenas e patas. Durante mais ou menos 15 minutos, adultos, de maneira
semelhante às ninfas, passaram suas antenas primeiramente sobre a superfície corporal
e depois pelo seu aparelho bucal. Além das antenas, as patas também foram levadas ao
aparelho bucal. Em seguida os adultos deslocaram-se para dentro do suporte de papelão
contido no interior do copo plástico.
Primeiros adultos mortos foram visualizados com três dias pós tratamento tanto
para machos quanto para fêmeas. A maior mortalidade em machos foi obtida com três
das cinco doses testadas (5x104, 10
5, 5x10
5 conídios/adulto) já em fêmeas, a maior
mortalidade foi alcançado apenas em indivíduos tratados com a maior dose (5x105
conídios/adulto) (Tabela 3).
A susceptibilidade dos adultos dependeu da dose, quanto maior a dose maior a
mortalidade e não diferiu entre os sexos (Fig. 18 e 19) . O efeito do dose testada sobre a
mortalidade acumulada foi altamente significativo para ambos, 5 e 10 dias de
incubação, tanto para machos (F5,30 ≥ 54,8 e P ≤ 0,0001) quanto para fêmeas (F5,30 ≥
76,4 e P ≤ 0,0001) .
Tabela 3 – Mortalidade acumulada (%) de adultos de Periplaneta americana tratados com
conídios de Metarhizium anisopliae IP 46 e tempo letal.
Mortalidade acumulada Tempo letal (TL)
Dose 5 dias 10 dias TL50 TL90 Slope
Fêmea
Controle 0 a 0 a * * *
5x103 3,3 ± 3,3 a 50 ± 4,5 b 10,1 (8,4 - 2,5) 15,1 (12,6 - 21,1) 0,25 ± 0,06
104 20,0 ± 4,2 a 70 ± 4,5 c 8 (6,4 - 10) 13,4 (11,2 - 17,8) 0,24 ± 0,05
5x104 63,3 ± 6,1 b 86,7 ± 4,2 d 4,6 (3,7 - 5,5) 7,4 (6,4 - 9,3) 0,45 ± 0,08
105 83,3 ± 6,1 c 93,3 ± 4,2 d/e 3,8 (2,9 - 4,6) 6,3 (5,4 - 7,8) 0,51 ± 0,09
5x105 100 d 100 e 2,7 (2,3 - 3,1) 3,9 (3,4 - 4,6) 1,05 ± 0,18
F 5,30 76,4 82,1
P 0,0001 0,0001
Macho
Controle 0 a 0 a * * *
5x103 20,0 ± 10,2 b 70 ± 4,5 b 8,0 (6,4 - 9,8) 13,1 (11,0 - 17,5) 0,25 ± 0,05
104 46,7 ± 11,1 c 90 ± 4,5 c 7,3 (6,0 - 9) 12,5 (10,5 - 16,2) 0,24 ± 0,04
5x104 73,3 ± 6,7 d 100 d 5,3 (4,4 - 6.3) 8,8 (7,6 - 11) 0,36 ±0,05
105 100 e 100 d 3,7 (3,0 - 4,3) 6,0 (5,2 - 07,4) 0,55 ± 0,09
5x105 100 e 100 d 3,0 (2,5 - 3,5) 4,8 (4,2 - 06) 0,71 ± 0,13
F 5,30 54,8 173,7
P 0,0001 0,0001
Cinco adultos foram tratados topicamente com suspensão de conídios (105, 2x10
5, 10
6, 2x10
6 ou 10
7
conídios/ml) formulados em óleo/água (Graxol® 10%) e incubados a 25 ± 1°C, umidade relativa >
98% e 12 h de fotofase por até 25 dias. Os valores médio de mortalidade (calculados com seis
repetições independentes) na mesma coluna, baseados em análise de variância e teste de
comparação múltipla Student-Newman-Keuls, seguidos por letras diferentes (a - e) foram
significativamente diferentes entre si. Não houve mortalidade de adultos dos grupos controles.
Tabela 4 – Dose letal, seus respectivos intervalos de confiança, e slope, necessária para
matar 50 e 90% de adultos de Periplaneta americana tratadas com conídios de
Metarhizium anisopliae IP 46 formulado em óleo/água.
0
20
40
60
80
100
24
68
1012
14Mort
alid
ade
Dia
s
Dose
Fêmea
5x103104
5x104
105
5x105
Dose Letal (LD)
Sexo Dias LD 50 LD 90 Slope
Fêmea 5 3,8 x 10
4 (2,7 x 10
4 - 5,1 x 10
4) c 1,5 x 10
5 (1,5 x 10
5 - 2,5 x 10
5) 2,2 ± 0,3
10 4,5 x 103 (1,3 x 10
3 - 8,4 x 10
3) a 7 x 10
4 (3,7 x 10
4 - 2,6 x 10
6) 1,1 ± 0,2
Macho
5 1,3 x 104 (9,2 x 10
3 - 1.9 x 10
4) b 6,9 x 10
4 (4,5 x 10
4 - 1.3 x 10
5) 1,8 ± 0,3
10 8,3 x 103 (4,5 - 2,9 x 10
3) a 1,9 x 10
4 (8,6 X 10
3 - 7,1 x 10
4) 0,9 ± 0,3
Fig. 18 – Mortalidade acumulada (%) de fêmeas adultas de
Periplaneta americana tratados com conídios de Metarhizium
anisopliae IP 46, formulados em óleo-água, e incubadas a umidade
relativa > 98% UR e 25ºC, por 15 dias após tratamento.
0
20
40
60
80
100
24
68
1012
14Mort
alid
ade
Dia
s
Dose
Macho
5x103104
5x104
105
5x105
5.3.2. Desenvolvimento de fungo sobre adultos mortos
O crescimento de micélio sobre adultos mortos foi observado primeiramente nos
órgãos sensoriais (cercis e estilos), nas regiões intersegmentais das patas e antenas e no
aparelho bucal, três dias após a incubação dos cadáveres em câmara úmida. Em alguns
indivíduos tratados com as 2 menores doses (5x103 ou 10
4 conídios/adulto) houve
crescimento de fungo contaminante. Conídios de M. anisopliae cresceram em ≥ 86%
dos adultos mortos incubados nos dias seguintes.
Fig. 19 – Mortalidade acumulada (%) de machos adultos de
Periplaneta americana tratados com conídios de Metarhizium
anisopliae IP 46, formulados em óleo-água, e incubadas a umidade
relativa > 98% UR e 25ºC, por 15 dias após tratamento.
tratamento.
6 DISCUSSÃO
6.1 Comportamento pós-tratamento e mortalidade de ninfas e adultos
As ninfas, bem como os adultos, tentaram limpar seu próprio corpo após contato
do formulado, independentemente da presença de conídios, visto que no grupo controle,
também foram observados os mesmos movimentos de limpeza. Ficou claro que as
ninfas e adultos, não conseguiram sempre retirar, suficientemente, os conídios para
escapar da infecção com fungos patogênicos. Não foi possível, contudo, afirmar que
esse comportamento estava relacionado apenas à higiene corporal ou também à
estratégias de defesa, como existe em alguns himenópteros e isópteros sociais, os quais
detectam patógenos e impedem sua propagação (Hughes et al. 2002, Traniello et al.
2002, Lacerda 2009). A diminuição dos movimentos, seguidos de paralisia e morte das
ninfas em poucos dias após o tratamento, observadas para alguns dos fungos, deve-se
provavelmente a toxinas fúngicas ou enzimas produzidas por B. bassiana e Metarhizium
spp. O número e o tipo de toxinas ou enzimas ligadas à virulência podem variar entre
espécies do mesmo gênero e entre linhagens da mesma espécie de fungo. Sua expressão
depende do hospedeiro (Gómez & Alves 1983, Magalhães et al. 1997, Milner et al.
1998, 2003, Amiri-Besheli et al. 2000, Roberts & Leger 2004, Silva et al. 2004). No
presente estudo, toxinas ou enzimas podem ter contribuído eventualmente para
aumentar a eficácia de B. bassiana, M. anisopliae e M. robertsii em P. americana.
A hiperatividade observada em ninfas tratadas com S. insectorum,
aparentemente não foi ligada à patogenicidade dessa espécie, visto que não houve
mortalidade neste grupo. Mesmo assim, a hiperatividade eventualmente favorece a
sobrevivência de ninfas infectadas com fungos patogênicos, uma vez que o aumento da
temperatura corporal, ligada a maior atividade, pode interferir no desenvolvimento do
fungo e contribuir para combater a infecção, conforme descrito em abelhas e gafanhotos
por Téllez-Jurado et al. ( 2009).
B. bassiana, M. anisopliae e M. robertsii foram patogênicos para P. americana,
o que também foi visto em Mohan et al. (1999) com B. bassiana em P. americana e
com M. anisopliae em Blatella germanica (Kaakeh et al. 1996, 1997, Zurek et al. 2002,
Quesada-Moranga et al. 2004, Abedi & Dayer 2005, Lopes & Alves 2011). O presente
estudo relata, pela primeira vez, a patogenicidade de M. anisopliae IP 46 e M. robertsii
IP 34 em P. americana.
Os demais fungos testados (Isaria cateniobliqua, I. farinosa, M. frigidum,
Purpureocillium lilacinum, Simplicillium lanosoniveum, S. insectorum e Tolypocladium
cylindrosporum) não foram considerados patogênicos, visto que causaram mortalidade
inferior a 20% em 25 dias. Apesar desses fungos não terem sido patogênicos para ninfas
de P. americana, é importante notar que podem existir outras linhagens fúngicas
patogênicas para essa ou outras espécies de baratas. Também podem existir outras
linhagens de B. bassiana, M. anisopliae ou M. robertsii com maior virulência contra
esta barata do que foi encontrada com os isolados testados no presente estudo. A
variabilidade intraespecífica (entre linhagens de B. bassiana) e intragênica (M.
anisopliae, M. robertsii e M. frigidum) da virulência das linhagens fúngicas para P.
americana no presente estudo, foi também encontrada para Metarhizium e Beauveria
em outros insetos como Triatoma infestans (Luz et al. 1998, Lazzarini et al. 2006),
Phlebotomus duboscqi (Ngumbi et al. 2011) e Musca domestica (Sharififard et al.
2011). A recente reclassificação dos gêneros de Metarhizium e Beauveria permite hoje
uma melhor compreensão da variabilidade intraespecífica e intragênica relacionada à
virulência em insetos específicos (Bischoff et al. 2006, 2009, Rehner et al. 2011)
6.2 Desenvolvimento de fungo sobre ninfas e adultos mortos
O crescimento de B. bassiana, M. anisopliae e M. robertsii e a conidiogênese
desses fungos sobre 90% ou mais das ninfas mortas, e de M. anisopliae em ≥ 86% dos
adultos, consolidaram os dados de patogenicidade, e mostraram que pelo tratamento
tópico o fungo consegue vencer as defesas do inseto e causar infecção, como foi
mostrado também por Quesada-Moranga et al. em B. germanica (2004). Lopes & Alves
(2011) observaram que o tratamento tópico foi mais eficaz do que a a infecção oral,
uma vez que a ingestão de conídios de M. anisopliae com alimentos não causou
mortalidade em adultos/ninfas de B. germânica, possivelmente devido à inativação dos
conídios no intestino da barata.
A produção de novos conídios nos cadáveres é importante, pois favorece a
disseminação de conídios em colônias de baratas subsociais e gregárias. Quesada-
Moranga et al. (2004) demonstraram a transmissão horizontal de conídios de M.
anisopliae entre B. germanica mortas e indivíduos saudáveis da mesma espécie.
6.3 Desenvolvimento de fungo sobre ooteca e eclosão de ninfas
Ootecas de P. americana, como as de Blatta orientalis, são resistentes e
aparentemente impermeáveis a água (Pryon 1946). Os fungos que infectaram as ootecas
provavelmente através da quilha, na qual a casca está menos forte e eventualmente
facilitou a penetração de hifas, inviabilizaram o desenvolvimento das ninfas mais
rapidamente do que aconteceria se a invasão ocorresse através da casca da ooteca. A
quilha é a parte mais vulnerável da ooteca, com microespaços parcialmente selados em
P. americana, que são separados apenas no momento da eclosão das ninfas (Maya et al.
2002, Pryon 1946).
Ninfas em desenvolvimento na ooteca necessitam estar sadias para exercer
coletivamente pressão mecânica na membrana interna e eclodir, e não são capazes de
eclodir quando parte das ninfas sucumbem à infecção fungica (Provine 1976). É
possível que a infecção pelos fungos patogênicos, e eventual morte de apenas uma, ou
várias ninfas dentro da ooteca, possam ter comprometida a viabilidade de todas as
demais vivas. O aparecimento de conídios sobre a ooteca favorece a disseminação dos
fungos e a infecção de colônias, visto que P. americana ovipõe em locais nos quais já
existem ootecas (Bell et al. 2007).
7 CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS
Baseados nos resultados obtidos sobre o comportamento, a mortalidade de P.
americana e a conidiogênese de B. bassiana IP 361, M. anisopliae IP 46, e M. robertsii
IP 34 nas ninfas mortas, e a atividade ootequicida das duas últimas espécies, ficou claro
que esses fungos possuem potencial para controle biológico desta praga e podem
contribuir com o desenvolvimento de estratégias para interromper o ciclo de vida ovo-
adulto.
Futuros esforços devem centrar-se em estudos sobre essas ou outras linhagens
mais virulentas dos gêneros Beauveria e Metarhizium, com pesquisas, em especial,
sobre formulações e tipos de aplicação específica e mecanismos de ação de toxinas em
P. americana.
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