micrornas como biomarcadores do ritmo circadiano

Mestrado em Medicina Legal

microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano.

Joana Rodrigues Pinto

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M

2019

JOANA RODRIGUES PINTO

microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano.

Dissertação de Candidatura ao Grau de Mestre em Medicina Legal submetida ao Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto Orientadora - Doutora Ana Luísa Teixeira, Investigadora Júnior, Grupo de Oncologia Molecular e Patologia Viral do Centro de Investigação do Instituto Português de Oncologia do Porto; Colaboradora externa, Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar da Universidade do Porto Co-orientadora – Mestre Francisca Dias, Doutoranda em Ciências Biomédicas, Grupo de Oncologia Molecular e Patologia Viral do Centro de Investigação Português de Oncologia do Porto

INFORMAÇÃO TÉCNICA TÍTULO: microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano.

Dissertação de Candidatura ao Grau de Mestre em Medicina Legal, apresentada ao

Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto

AUTOR: Joana Rodrigues Pinto DATA: setembro de 2019 EDITOR: Joana Rodrigues Pinto CORREIO ELETRÓNICO: [email protected]

1º EDIÇÃO: setembro de 2019

“Time is what we want most, but what we use worst.”

By William Penn

7

microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano

ÍNDICE

AGRADECIMENTOS ............................................................................................................ 9

RESUMO ............................................................................................................................. 13

ABSTRACT .......................................................................................................................... 17

ÍNDICE DE FIGURAS ......................................................................................................... 19

ÍNDICE DE TABELAS ......................................................................................................... 20

ABREVIATURAS ................................................................................................................. 21

1. Introdução..................................................................................................................... 27

1.1. Contextualização histórica .................................................................................... 27

1.2. Relógio biológico e mecanismos moleculares do ritmo circadiano ..................... 30

1.3. Regulação do ritmo circadiano pela luz ............................................................... 33

1.4. Importância do cortisol no ritmo circadiano .......................................................... 34

1.5. microRNAs ............................................................................................................ 38

1.6. microRNAs envolvidos na via do cortisol e sua importância para as ciências

forenses ........................................................................................................................... 40

2. Objetivos ....................................................................................................................... 45

2.1. Objetivo principal .................................................................................................. 45

2.2. Objetivos específicos ............................................................................................ 45

3. Materiais e métodos ..................................................................................................... 49

3.1. Seleção do perfil de microRNAs........................................................................... 49

3.2. População em estudo ........................................................................................... 49

3.3. Processamento de amostras ................................................................................ 50

3.4. Extração de microRNAs ....................................................................................... 51

3.5. Síntese de cDNA .................................................................................................. 51

3.6. Quantificação por PCR tempo real ....................................................................... 52

3.7. Quantificação dos níveis de cortisol sérico e salivar ……………………………….52

3.8. Análise estatística ................................................................................................. 53

4. Resultados.................................................................................................................... 57

8


4.1. Frequências de deteção dos microRNAs estudados em amostras de sangue e saliva

.......................................................................................................................................... 57

4.2. Níveis de cortisol e quantificação relativa dos microRNAs nas amostras de sangue

e saliva ............................................................................................................................. 59

5. Discussão ..................................................................................................................... 65

6. Conclusão e perspetivas futuras ................................................................................. 71

7. Referências bibliográficas ............................................................................................ 75

AGRADECIMENTOS

9


AGRADECIMENTOS

Ao concluir esta etapa do meu percurso académico, não poderia deixar de agradecer

a todas as pessoas que contribuíram, de forma direta e indireta, para a execução deste

projeto.

Agradeço à Professora Doutora Maria José Pinto da Costa, Diretora do Mestrado em

Medicina Legal, a oportunidade de ingressar neste mestrado, assim como todos os

conhecimentos transmitidos e disponibilidade.

À Doutora Ana Luísa Teixeira, minha orientadora um muito obrigada por ter aceite a

orientação científica deste trabalho e por me ter proposto este projeto tão desafiante.

Obrigada por todas as sugestões, saber partilhado, críticas construtivas e principalmente

por me ter ajudado a crescer a nível científico, laboratorial mas também pessoal.

À minha coorientadora, Mestre Francisca Dias, um muito obrigada pela paciência que

teve comigo, pelo conhecimento partilhado e por todas as vezes que me “salvou” e arranjou

soluções para os obstáculos que foram surgindo ao longo deste caminho. A tua boa

disposição contagia qualquer um e faz toda a diferença.

A todo o Grupo de Oncologia Molecular e Patologia Viral do Instituto Português de

Oncologia do Porto, em especial à Mariana Morais e Inês Nogueira pela ajuda

esclarecimento de dúvidas.

Agradeço a colaboração do Serviço de Química Clínica do Departamento de

Diagnóstico Laboratorial do IPO-Porto pela quantificação dos níveis de cortisol e a todos

os voluntários, sem os quais, a realização deste projeto não teria sido possível.

Um muito obrigada, às minhas amigas e colegas de Mestrado Bruna Cavalcante e

Bela Barros. Foi muito importante para mim todo o vosso apoio e amizade. Crescemos

juntas nesta etapa e espero continuar a compartilhar muito bons momentos ao vosso lado.

À minha melhor amiga Rafaela Maia, por sempre acreditar em mim, estar sempre do

meu lado a ouvir as minhas lamentações. O teu apoio foi e será sempre fundamental.

Aos meus amigos(as), em especial João Miranda e André Almeida, por me fazerem rir

mesmo quando as coisas não correram bem e estarem sempre do meu lado. Obrigado por

todos os momentos de descontração.

AGRADECIMENTOS

10


À minha irmã Sara Pinto, não há pessoa que me conhece melhor do que tu. Muito

obrigada pelo teu esforço e disponibilidade em ajudar, mesmo não sendo a tua área de

formação. És sempre a primeira a estender a mão quando mais preciso.

A toda a minha família, mas em especial aos meus pais, os melhores do mundo. O

vosso apoio é incondicional e sem vocês nada disto seria possível. Obrigada por todos os

valores que me transmitiram ao longo deste caminho, que é a minha vida. Por todos os

momentos que me fizeram ver o lado positivo da situação, por todos os obstáculos que me

ajudaram a ultrapassar e por toda a compreensão.

A todos, muito obrigado.

RESUMO

RESUMO

13


RESUMO

A vida na Terra adaptou-se ao ciclo de dia e de noite, através da evolução dos

relógios biológicos. Os relógios biológicos são ritmos biológicos endógenos que ajustam o

equilíbrio entre o comportamento e as necessidades do organismo, face às mudanças

constantes do ambiente, sendo um processo transversal aos organismos unicelulares e

multicelulares. O estudo do funcionamento e regulação dos relógios biológicos é designado

de Cronobiologia, nesta área os ritmos biológicos são classificados em ritmos ultradianos,

infradianos e circadianos. O ritmo circadiano, é o período de aproximadamente 24 horas,

de acordo com o tempo de rotação da Terra em torno do seu eixo. O controlo deste permite

a regulação de uma ampla variedade de processos fisiológicos, nomeadamente a

regulação da via do cortisol sérico.

O cortisol é uma hormona corticosteróide produzida pela glândula suprarrenal,

estando diretamente envolvida na regulação dos níveis de stress e do ritmo circadiano. Na

regulação da via do cortisol, estão envolvidos mecanismos de regulação epigenéticos

como é o caso dos microRNAs (miRNAs). Os miRNAs pertencem a uma família de

pequenas moléculas de RNA não codificante, com uma grande importância em estudos

forenses, uma vez que apresentam uma elevada estabilidade, podendo permanecer

estáveis ao longo do intervalo post-mortem (IPM). O IPM fornece uma estimativa do

intervalo que ocorre entre a morte e a descoberta do respetivo cadáver. Deste modo, a

elevada estabilidade dos miRNAs neste intervalo, poderá permitir a análise da dinâmica

dos miRNAs associada à via de produção do cortisol possibilitando que seja fornecida uma

estimativa do momento da morte de um indivíduo, e assim auxiliar na inclusão ou exclusão

de possíveis suspeitos a um local de crime ou fornecer informações temporais de amostras

biológicas depositadas num suporte físico.

O objetivo deste estudo foi analisar o potencial dos miRNAs envolvidos nas vias de

produção do cortisol como biomarcadores de ritmo circadiano em amostras de sangue e

saliva. Inicialmente, foi realizada a revisão da literatura com o objetivo de selecionar o perfil

de miRNAs com maior potencial para ser analisado, tendo sido selecionados os seguintes

miRNAs: hsa-miR-10a, hsa-miR-10b, hsa-miR-16, hsa-miR-20, hsa-miR-21, hsa-miR-24 e

hsa-miR-144-5p. Realizaram-se colheitas de sangue a 20 indivíduos voluntários saudáveis,

nos períodos da manhã e da tarde e colheitas de saliva no período da noite. As amostras

foram processadas e os miRNAs extraídos. Posteriormente foi realizada a síntese de DNA

complementar e, de seguida os miRNAs foram analisados por qPCR em tempo real.

RESUMO

14


Observamos que os miRNAs foram detetados em ambos os fluídos biológicos,

contudo apresentaram frequências de deteção muito variáveis, com exceção do hsa-miR-

144-5p que não foi detetado na saliva. De acordo com os resultados, observamos que os

hsa-miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-24 apresentam um aumento de expressão ao longo

do dia, contrariamente aos níveis de cortisol, que foram diminuindo ao longo deste. Por

outro lado, o hsa-miR-144-5p também demonstrou um aumento de expressão entre os

períodos da manhã e da tarde mas não foi detetado à noite. O presente estudo concluiu

que os hsa-miR-10a, hsa-miR-16, hsa-miR-24 e hsa-miR-144-5p poderão ser

biomarcadores úteis no que respeita à determinação do espaço temporal em que uma

amostra de sangue foi colhida, podendo ser fortes candidatos a serem incluídos num perfil

de miRNAs a estudar a quando de uma determinação do IPM.

Futuramente, o presente estudo deveria ser replicado num maior número de

indivíduos, de modo a validar as associações encontradas. Adicionalmente também seria

interessante o estudo da expressão destes miRNAs em amostras de sangue periférico

durante o período da noite e em amostras de saliva durante o período da manhã e tarde,

de modo a complementar os resultados obtidos.

ABSTRACT

ABSTRACT

17


ABSTRACT

Life on Earth has adapted to the day and night cycle through the evolution of

biological clocks. Biological clocks are endogenous biological rhythms that adjust the

balance between the behavior and the needs of the organism, in response to the constant

changes of the environment. This process is transversal to the unicellular and multicellular

organisms and the study area of the regulation of biological clocks is called chronobiology.

Biological rhythms are classified into ultradian, infradian and circadian. The circadian

rhythm is the period of approximately 24 hours, according to the time of rotation of the earth

around its axis. Its control allows regulation of a wide variety of physiological processes,

including regulation of the serum cortisol pathway.

Cortisol is a corticosteroid hormone produced by the adrenal gland and is directly

involved in the regulation of the stress levels and the circadian rhythm. The regulation of

the cortisol pathway is made by several mechanisms, including epigenetic mechanisms like

microRNAs (miRNAs). MiRNAs are small non-coding RNAs that present a high stability in

several body fluids, including over the postmortem interval (PMI). The PMI provides an

estimate of the interval that occurs between the death and discovery of the respective body.

The high stability of miRNAs during this period may be usefull in the analysis of the miRNA

dynamics associated with the cortisol pathway, therefore allowing the estimation of an

individual's time of death. Consequently, miRNAs are potential biomarkers capable of

determine the timeline of biological samples found on a crime scene and also assist in the

inclusion or exclusion of possible suspects.

The aim of this study was to analyse the miRNAs involved in the cortisol pathway

as potential circadian rhythm biomarkers in blood and saliva samples. Initially, a literature

review was performed in order to select the miRNAs profile with the highest potential to be

analyzed, and the following miRNAs were selected: hsa-miR-10a, hsa-miR-10b, hsa-miR-

16, hsa-miR-20, hsa-miR-21, hsa-miR-24 and hsa-miR-144-5p. Blood samples were taken

from 20 healthy volunteers in the morning and afternoon and saliva samples were collected

in the evening. The samples were processed and the miRNAs were extracted.

Subsequently, complementary DNA synthesis was performed and then miRNAs were

analyzed by real time quantitative PCR. We observed that, with the exception of has-miR-

144-5p that was not detected in the saliva, all the miRNAs were detected in both biological

fluids, but had very variable detection frequencies. According to the results, we observed

that hsa-miR-10a, hsa-miR-16 and hsa-miR-24 showed an increased expression

throughout the day, as opposed to cortisol levels, which decreased over the course of the

ABSTRACT

18


day. Hsa-miR-144-5p also showed increased expression between morning and afternoon

but was not detected at night. The present study concluded that hsa-miR-10a, hsa-miR-16,

hsa-miR-24, and hsa-miR-144-5p may be useful biomarkers for determine the time frame

in which sample was taken. Additionally, these miRNAs may be strong candidates to be

included in a miRNA profile to be studied at the time of an PMI determination.

In order to validate the associations found, future studies should replicate this study

in a larger number of volunteers. Moreover, it would be interesting to study these miRNAs

expression in peripheral blood samples at night and in saliva samples in the morning and

afternoon to complement the results obtained.

.

ÍNDICE DE FIGURAS

19


ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Localização do núcleo supraquiasmático (Adaptado de Netter FH (21)). ......... 30

Figura 2. Transcription-translation feedback loop – Formação do dímero CLOCK:BMAL1 e

consequente ativação da transcrição dos genes que codificam reguladores CRY e PER no

núcleo. Ligação do dímero PER:CRY no citoplasma que é transportado para o núcleo para

inibir ativadores de transcrição dos genes CLOCK e BMAL1. ........................................... 32

Figura 3. Auxiliar transcription-translation feedback loop responsável pela regulação do

gene BMAL1. Ativação de Reverb α e Ror α que consequentemente inibem ou ativam

(respetivamente) da produção de BMAL1. ......................................................................... 32

Figura 4. Regulação da transcrição dos clock controlled genes (ccgs), responsáveis por

codificar substâncias que regulam os neurónios do NSQ. ................................................. 33

Figura 5. Regulação dos relógios circadianos. A informação da entrada do estímulo

luminoso na retina transportado para o SNC, é coordenado pelo NSQ onde está localizado

o relógio central responsável por regular ciclos sono-vigília, performances cognitivas e

transmitir as informações para os relógios dos órgãos periféricos, permitindo assim a

homeostasia corporal. ......................................................................................................... 34

Figura 6. Mecanismo de ação eixo hipotálamo-hipófise-adrenal. ...................................... 35

Figura 7. Síntese de glicocorticóides e posterior formação de proteína quinase. ............. 36

Figura 8. Via da síntese do cortisol. Transporte do colesterol da membrana mitocondrial

externa para a membrana mitocondrial interna pela proteína StAR. Na mitocôndria e

reticulo endoplasmático, o colesterol passa por ações sequenciais até ser transformado em

cortisol. ................................................................................................................................. 36

Figura 9. Variações dos níveis de cortisol ao longo de um dia (Adaptado de Fleming B.

(51)). .................................................................................................................................... 37

Figura 10. Representação esquemática da biogénese de microRNAs ............................. 39

Figura 11. Mecanismo de ação dos miRNAs (Adaptado de Teixeira AL e colaboradores

(52)). .................................................................................................................................... 39

Figura 12. Frequência de deteção (%), dos miRNAs em estudo ao longo do dia. ............ 58

Figura 13.Níveis do cortisol e miRNAs ao longo do dia. .................................................... 60

Figura 14. Relação dos hsa-miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-24 com a regulação da via da

síntese do cortisol. ............................................................................................................... 68

ÍNDICE DE TABELAS

20


ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1. Colheita das amostras biológicas ....................................................................... 50

Tabela 2. Valores de fold-change e pvalue para os hsa-miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-

24. ........................................................................................................................................ 61

ABREVIATURAS

21


ABREVIATURAS

A

AC Adenilciclase

ACTH Hormona adrenocorticotrófica

ACTHr Recetor da hormona adrenocorticotrófica

AGO Argonauta

AVP Arginina vasopressina ou Hormona antidiurética

AKE Cloreto de amónio fosfato de hidrogénio e EDTA

B

BMAL1 Brain and muscle arnt-like-protein-1

C

cAMP Adenosina 3’ 5’ monofosfato cíclico

CCGs Clock controlled genes

cDNA DNA complementar

CLOCK Circadian locomotor output cycles kaput

CRE cAMP response element

CREB cAMP response element binding

CREm Modulador de CRE

CRH Hormona libertadora de corticotrofina

CRY Crypthochrome gene

Ct Cycle threshold

D

DGCR8 DiGeorge Syndrome Critical Region 8

dL Decilitro

ABREVIATURAS

22


dsRNA Double-stranded ribonucleic RNA

E

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

G

CG Glucocorticóides

H

HSF1 Heat shock factor 1

I

IFN γ Interferão gama

L

LSS Lanosterol sintase

M

MCR2 Recetor melanocortina-2

MiRNA MicroRNA

mRNA RNA mensageiro

N

NFR2 Nuclear factor erythroid 2-related factor 2

NSQ Núcleo supraquiasmático

ABREVIATURAS

23


P

PCR Polymerase Chain Reaction

PER Period gene

PKA Proteína quiinase A

IPM Intervalo post-mortem

pre-miRNA microRNA precursor

pri-miRNA microRNA primário

PVN Núcleo paraventricular

R

RER Reticulo endoplasmático rugoso

RISC RNA-induced silencing complex

RNA Ácido ribonucleico

RNase Ribonuclease

RNA Pol II RNA Polimerase II

RT Reverse Transcriptase

S

SNC Sistema nervoso central

StAR Proteína reguladora aguda esteroideogénica

STAT3 Signal transducer and activator of transcription 3

T

TNF α Fator de necrose tumoral

TRBP Transactivation-responsive RNA-binding protein

ABREVIATURAS

24


X

XPO5 Proteina Exportina 5

INTRODUÇÃO

INTRODUÇÃO

27


1. Introdução

1.1. Contextualização histórica

O relógio tornou-se imprescindível para controlar a passagem do tempo na vida

agitada da nossa sociedade, visto que horários e prazos são critérios continuamente

presentes no dia-a-dia do Homem. Porém, os relógios biológicos já são parte integrante e

indispensável na Terra desde a evolução dos organismos unicelulares mais primitivos até

ao ser humano. À medida que a trajetória do Sol e da Lua se concretiza, juntamente com

a inclinação natural do eixo da Terra, resultam a ocorrência de ciclos associados ao dia e

à noite, estações do ano, fases da Lua e oscilação de marés (1). Deste modo, as espécies

desenvolveram determinados comportamentos de forma a se adaptarem e viverem com

estas mudanças ciclícas. Exemplos destas oscilações, são o facto de algumas espécies

de plantas germinarem numa determinada época, de outras perderem as folhas, de alguns

animais migrarem para regiões mais propícias à sua sobrevivência e outros hibernarem

durante épocas adversas para a sua sobrevivência. Tal como outras espécies, o organismo

do ser humano apresenta ritmos biológicos endógenos denominados de relógios

biológicos, que lhe permite adaptar antecipadamente as suas respostas, face a estímulos

externos como a luz e a temperatura (1).

O estudo do funcionamento e regulação dos relógios biológicos é designado de

Cronobiologia. A Cronobiologia é a ciência que se dedica a estudar a relação entre o tempo

cronológico (resultante da rotação do planeta Terra no seu próprio eixo) e o ritmo biológico

dos organismos, bem como os efeitos que resultam da desregulação entre ambos, como

por exemplo, desregulações no sono, no desenvolvimento, metabolismo e funções

comportamentais (2). O primeiro cientista a suspeitar da existência de relógios biológicos

foi o astrónomo Jean Jaques de Mairan, que em 1729 observou que uma planta no seu

escritório, de espécie Mimosa pudica, abria conforme a luminosidade. Para comprovar

essa observação, decidiu colocar a planta dentro de um baú e verificou que mesmo nas

condições de escuridão, a planta continuou a movimentar-se como se acompanhasse os

ciclos de dia e noite durante alguns dias (3). Um século após, em 1835, Augustin Pyrame

de Candolle, observou que a planta de espécie Mimosa pudica, mantida no escuro num

período mais prolongado, apresentava um movimento variável entre as 22 horas e 23

horas, mas em condições normais de iluminação, o movimento da planta era ajustado para

as 24 horas. Isto, permitiu-lhe concluir que o ciclo era uma expressão do ritmo endógeno

da planta e que dependia da variável claro/escuro do ambiente (4). Apesar das

INTRODUÇÃO

28


descobertas, a Cronobiologia não foi considerada um campo legítimo de estudos

científicos e, apenas no século XX é que começou a ganhar relevo quando novas técnicas

começaram a comprovar a importância do funcionamento dos relógios biológicos ao nível

neurológico e molecular (5).

O termo relógio biológico foi introduzido só no final da década de 40 do século

passado, pelo alemão Gustav Kramer. Este investigador estudou a migração das aves,

argumentando que as aves migravam para Norte na primavera tendo como ponto de

referência o sol (6). Para Gustav Kramer, as aves necessitavam de uma entidade fisiológica

que fosse precisa para a contagem do tempo, ou seja, um relógio (7). A luz, tal como a

temperatura por exemplo, são definidos como “inputs” ambientais, também designados por

zeitgebergs, capazes de sincronizar o tempo cronológico com o tempo biológico e assim,

conferir vantagem seletiva na espécie (6). Mais tarde, Franz Halberg não só definiu os

ritmos biológicos como atividades endógenas do organismo sincronizadas com o ambiente

e que se repetiam ciclicamente, como também os classificou em ritmos ultradianos,

infradianos ou circadianos (8). Halberg definiu os ritmos ultradianos como ritmos

caracterizados por pequenas variações em curtos espaços de tempo, ou seja, ritmos que

ocorrem várias vezes num período de 24 horas. Exemplo destes ritmos são os batimentos

cardíacos e respiratórios (9). Relativamente aos ritmos infradianos, caracterizou-os como

variações ocorridas num período superior a 28 horas. Exemplos destes ritmos são os ciclos

estrais em roedores (que ocorrem a cada 3 ou 4 dias em ratos) e o ciclo menstrual (que

ocorre aproximadamente a cada 28 dias nas mulheres) (9). Por último, Halberg definiu os

ritmos circadianos (do latim Circa diem que significa “sobre o dia”) como ritmos

caracterizados pela ocorrência num período de 24 horas, de acordo com o tempo de

rotação da terra em torno do seu próprio eixo. Exemplos destes ritmos são o ciclo

claro/escuro, a produção hormonal (cortisol, melatonina), regulação da temperatura

corporal e pressão arterial (10).

Tal como Gustav Kramer, também Curt Richter afirmou que os relógios biológicos

seriam “instrumentos do corpo para manter a contagem do tempo”. Sugeriu também, que

os relógios biológicos poderiam estar presentes em diferentes órgãos (7). O

reconhecimento da presença de estruturas envolvidas na medição do tempo, através de

experiências que consistiram na observação de lesões progressivas no sistema nervoso

central (SNC) em ratinhos, com a permanência ou supressão de ritmos diários, levou-o à

conclusão que o centro responsável pela regulação da ritmicidade era o hipotálamo (7).

Com esta descoberta, em 1972, Martin Moore Ede, juntamente com a sua equipa, partiu

do princípio que o zeitgeberg com maior influência sobre o relógio biológico seria o ciclo

INTRODUÇÃO

29


claro/escuro e por isso decidiu estudar o papel da visão neste ciclo, conseguindo descrever

a via retino-hipotalâmica que terminava em dois núcleos na base do cérebro, os núcleos

supraquiasmáticos (NSQ) (11). No mesmo ano, um estudo em ratinhos demonstrou que os

ritmos circadianos envolvidos na ingestão de água ficavam suprimidos na existência de

lesões nos NSQ (12). Passados 7 anos, Kawamura e Inouye cortaram todas as ligações

das restantes estruturas do cérebro dos ratinhos com os NSQ. Antes do “knockout” das

restantes estruturas, observaram que a atividade elétrica do hipotálamo apresentava

ritmicidade circadiana, porém após o procedimento, a ritmicidade circadiana apenas

persistiu na região dos núcleos, confirmando que eram as estruturas responsáveis pela

oscilação endógena do sistema nervoso central (SNC) (13). Estabeleceram então dois

critérios para que uma estrutura fosse considerada um oscilador endógeno: 1) atividade

autónoma mesmo quando isolado de outras estruturas e mantido in vivo e, 2) a capacidade

do tecido restaurar a sua atividade se implantado em hospedeiros sem atividade (13). Na

década de 90, o segundo critério foi confirmado através de uma experiência com ratinhos

com um período de atividade de 21 horas versus ratinhos com um período de atividade de

24 horas. Ao ser provocada uma lesão nos NSQ dos modelos animais com período de

atividade de 24 horas, estes ficaram sem atividade, porém, após serem transplantados os

NSQ com um período de atividade de 21 horas, os ratinhos que anteriormente tinham um

período de atividade de 24 horas passaram a ter ritmos de atividade e repouso com

períodos iguais aos dos dadores (14).

INTRODUÇÃO

30


1.2. Relógio biológico e mecanismos moleculares do ritmo circadiano

Os relógios biológicos são um mecanismo intrínseco às células, organizados, e que

preparam o organismo para os estímulos externos com o objetivo de manter a homeostasia

corporal (15). O nosso organismo possui um relógio principal no cérebro que funciona

como um temporizador, coordenando todos os relógios biológicos do organismo e

mantendo-os sincronizados. Nos seres vertebrados, o relógio principal constitui cerca de

20 000 neurónios com capacidade rítmica autossustentável que formam uma estrutura

denominada NSQ (16). O NSQ localiza-se mais precisamente no hipotálamo anterior, na

região ventral do cérebro, na junção do cérebro médio com os tálamos óticos (2). Este

núcleo, está estrategicamente posicionado para receber informações visuais e para

percecionar a presença e ausência de luz, tanto direta como indiretamente através da via

da retina (Figura 1) (17). Outro temporizador presente no cérebro é a glândula pineal,

responsável pela secreção de melatonina (18). Embora o SNC regule a maioria dos ritmos

circadianos nos mamíferos, muitos órgãos e tecidos do corpo podem gerar ritmos

circadianos independentemente, sendo denominados osciladores circadianos periféricos

(19). Os osciladores periféricos estão presentes no sangue, coração, fígado, tecido adiposo

e outras regiões (20).

Figura 1. Localização do núcleo supraquiasmático (Adaptado de Netter FH (21)).

Os relógios biológicos têm a capacidade de estabelecer os horários das refeições,

do sono, os níveis das hormonas como é o caso do cortisol sérico, regular a resposta do

INTRODUÇÃO

31


corpo ao açúcar, entre outros processos biológicos. Permitem também que as mudanças

nos processos celulares ocorram em tempos ideais (22). A realização destes processos

biológicos é realizada uma vez que, o relógio do SNC é composto por múltiplos osciladores

unicelulares que quando sincronizados, geram respostas circadianas coordenadas (23).

Embora os componentes moleculares individuais do relógio circadiano não sejam

totalmente homólogos entre o ser humano e a mosca Drosophila melanogaster, o

conhecimento atual sobre o ritmo circadiano e a sua interação com fatores externos foi

aprofundado pelos estudos realizados neste modelo animal (24). Foi a partir deste modelo

que o primeiro gene do relógio foi identificado, nomeadamente o gene period (PER) (7). Os

restantes genes foram identificados nos anos 90: cryptochrome (CRY), brain and muscle

arnt-like protein-1 (BMAL1) e circadian locomotor output cycles kaput (CLOCK) (25).

Ao nível celular, os ritmos circadianos são consequência dos genes relógio que

conjuntamente se autorregulam para gerar ritmos que regulam e preparam o organismo

para estímulos externos, mantendo a homeostasia corporal (26-28). Por sua vez, ao nível

molecular os ritmos circadianos são sustentados por interações de loops de feedback

negativo que produzem ritmos cíclicos ao nível das proteínas e do ácido ribonucleico (RNA)

dos principais componentes do relógio (2).

Tal como já foi referido, os principais genes envolvidos nos mecanismos do relógio

são: os genes CLOCK, BMAL1, PER e CRY (2). Estes genes podem ser divididos em duas

categorias antagónicas: os reguladores positivos e os reguladores negativos. Nos

reguladores positivos estão incluídos os principais fatores responsáveis pela transcrição

no primeiro feedback loop, nomeadamente os genes CLOCK e BMAL1. Estas proteínas

ligam-se, formando um dímero e têm como principal função a ativação da transcrição. No

núcleo ligam-se a promotores E-box que, por sua vez, vão aumentar e controlar a

transcrição dos genes que codificam os reguladores negativos: CRY e PER. As proteínas

CRY e PER quando são produzidas no citoplasma ligam-se, formam um dímero, e são

transportadas novamente para o núcleo onde vão ter a função de inibir ativadores de

transcrição dos genes CLOCK e BMAL1 (29). Antes do próximo ciclo iniciar, o dímero

CLOCK:BMAL1 deve ser reativado e por isso, os níveis de produção das proteínas CRY

e PER vão diminuir até se tornarem insuficientes para reprimir a atividade de

CLOCK:BMAL1, o qual volta a ativar a transcrição dos genes que codificam os reguladores

negativos, reiniciando um novo ciclo (Figura 2).

INTRODUÇÃO

32


Figura 2. Transcription-translation feedback loop – Formação do dímero CLOCK:BMAL1 e consequente ativação da transcrição dos genes que codificam reguladores CRY e PER no núcleo. Ligação do dímero PER:CRY no citoplasma que é transportado para o núcleo para inibir ativadores de transcrição dos genes CLOCK e BMAL1.

Ao mesmo tempo, um segundo feedback loop (Figura 3) é responsável pela

regulação do gene BMAL1. No núcleo, os dímeros CLOCK:BMAL1 ativam a transcrição do

gene Reverb α e β (conhecido como NR1D1 e NR1D2 ou subfamília do recetor nuclear 1)

cuja respetiva proteína compete com a proteína Ror α, β e γ, para se ligarem a CORE que

está localizado em E-box de promotores do BMAL1. No entanto, quando se ligam ao

promotor, as proteínas possuem ações contrárias. A Ror α vai ativar a expressão de

BMAL1, enquanto que Reverb α vai inibir a expressão (30). Como consequência ocorrem

oscilações das concentrações de Reverb α, Ror α e produção de BMAL1. Contudo, se

ocorrer uma maior expressão de Ror α, ou seja, mais ativação, a proteína BMAL1 vai ser

produzida para formar novamente dímeros com a proteína CLOCK.

Figura 3. Auxiliar transcription-translation feedback loop responsável pela regulação do gene BMAL1. Ativação de Reverb α e Ror α que consequentemente inibem ou ativam (respetivamente) da produção de BMAL1.

INTRODUÇÃO

33


É importante referir que as proteínas envolvidas na regulação da transcrição dos

próprios genes do relógio também regulam a transcrição de genes alvo, denominados clock

controlled genes (CCGs) (Figura 4). Os CCGs são responsáveis por codificar substâncias

como vasopressina, recetores de hormonas (glucocorticoides, estrogénios)

neurotransmissores, fatores de transcrição (HSF1, STAT3), neuropéptidos, que regulam

os neurónios do NSQ e posteriormente, todo o organismo através de enervações diretas

sobre o tecido alvo (31).

Figura 4. Regulação da transcrição dos clock controlled genes (ccgs), responsáveis por codificar substâncias que regulam os neurónios do NSQ.

1.3. Regulação do ritmo circadiano pela luz

O estímulo externo, que vai permitir regular o ritmo circadiano, é a luz. A entrada da

luz é permitida através da retina, apresentando o seguinte trajeto: retina, NSQ, órgãos

periféricos.

A retina é uma estrutura localizada na parte mais interna do globo ocular. Esta

estrutura, constituída por células especializadas, nomeadamente fotorrecetores, tem como

principal função converter o estímulo luminoso em impulsos nervosos, através da

transdução e transmissão de sinal pelo nervo ótico para o cérebro (32). Alguns estudos

demonstram que muitos aspetos da função e da fisiologia da retina são controlados por um

relógio circadiano, tais como a libertação da melatonina pela glândula pineal, o aumento

do cortisol nas primeiras horas do dia e posterior diminuição, a síntese de dopamina, entre

outros (33-35). A informação da entrada de luz é transportada para o SNC diretamente

pela via trato retina-hipotálamo para o NSQ (28). Após receber a informação, o NSQ

coordena-a para todos os órgãos periféricos como o fígado, o coração, os pulmões e outros

sistemas, de forma a regular e organizar os processos fisiológicos (36) (Figura 5).

INTRODUÇÃO

34


Figura 5. Regulação dos relógios circadianos. A informação da entrada do estímulo luminoso na retina transportado para o SNC, é coordenado pelo NSQ onde está localizado o relógio central responsável por regular ciclos sono-vigília, performances cognitivas e transmitir as informações para os relógios dos órgãos periféricos, permitindo assim a homeostasia corporal.

1.4. Importância do cortisol no ritmo circadiano

O eixo hipotálamo-hipófise-adrenal é considerado um importante circuito

neuroendócrino responsável pelo controlo de respostas ao stress, sendo a sua atividade

efetuada em resposta a hormonas excretadas pela glândula suprarrenal. No hipotálamo

são libertados sinais neuroquímicos provocados por uma resposta ao stress que estimulam

os neurónios do núcleo paraventricular (PVN) a libertar hormona libertadora de

corticotrofina (CRH) e arginina vasopressina (AVP). As hormonas libertadas possuem

como objetivo induzir a síntese da hormona adrenocorticotrófica (ACTH) e secreção na

hipófise, visto que a sua produção aumenta em períodos de stress. Por sua vez, a ACTH

induz a síntese e secreção na glândula SR de glucocorticóides (GC), nomeadamente o

cortisol (37), que interagem com recetores específicos do SNC e em vários tecidos-alvo

periféricos (38) (Figura 6). Assim, os GC em circulação desativam a atividade

neuroendócrina do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, através de um feedback negativo, de

maneira que preparam o corpo para lidar com estímulos e manter assim a homeostasia

(39).

INTRODUÇÃO

35


Figura 6. Mecanismo de ação eixo hipotálamo-hipófise-adrenal.

A glândula suprarrenal, é um relógio periférico que pode influenciar os ritmos dos

tecidos periféricos através da libertação de hormonas com propriedades moduladoras.

Enquanto que a medúla é responsável por libertar catecolaminas (nomeadamente

epinefrina e norepinefrina), o córtex da suprarrenal secreta mineralocorticóides,

glucocorticóides (CG) e esteróides sexuais (40).

Os GC são libertados com a ligação da hormona ACTH que é secretada pela

hipófise, ao recetor da melanocortina 2 (MCR2) na glândula suprarrenal. Após a ativação

do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, a ACTH liga-se ao recetor da hormona

adrenocorticotrofica (ACTHr), ativando a proteína G e posteriormente estimulando a

adenilciclase (AC) que catalisa a formação da adenosina 3',5'-monofosfato cíclico (cAMP).

Com a estimulação da atividade da cAMP, os fatores de transcrição nuclear da proteína

quinase (PKA), as proteínas de ligação ao elemento de resposta cAMP (cAMP response

element binding (CREB) e cAMP response element (CRE)) e o modulador da CRE (CREm)

também são ativados (Figura 7). Estes fatores são responsáveis pela modulação da

expressão dos genes envolvidos na síntese de GC (41).

INTRODUÇÃO

36


Figura 7. Síntese de gluocorticóides e posterior formação de proteína quinase.

Após a ativação dos vários fatores, a proteína reguladora aguda esteroideogénica

(StAR) atua como um transportador que regula a passagem do colesterol da membrana

mitocondrial externa para a membrana mitocondrial interna. É importante salientar que o

gene codificante da StAR é controlado pelo relógio específico da suprarrenal bem como

pelo heterodímero CLOCK: BMAL1 (42, 43). Na mitocôndria, o colesterol passa por várias

ações sequenciais mediadas por hidroxiesteróides desidrogenases e citocromos P450.

Este, começa por ser clivado pela enzima cyp11a1 e é convertido em pregnenolona. De

seguida, no retículo endoplasmático rugoso (RER), a pregnenolona é metabolizada pelas

enzimas 17-α-hidroxilase (cyp17) (presente apenas em espécies produtoras de cortisol) e

3-β-hidroxiesteróide desidrogenase (3β-HSD ou HSD3B) e é convertida em 17-α-

hidroxipregnenolona e 17-α-hidroxiprogesterona, respetivamente (44). Posteriormente, a

21-β-hidroxilase (cyp21) converte 17-α-progesterona em 11-desoxicortisol. Finalmente, na

mitocôndria e por ação de 11-β-hidroxilase (cyp11b1), o 11-desoxicortisol é transformado

em cortisol (41) (Figura 8).

Figura 8. Via da síntese do cortisol. Transporte do colesterol da membrana mitocondrial externa para a membrana mitocondrial interna pela proteína StAR. Na mitocôndria e reticulo endoplasmático, o colesterol passa por ações sequenciais até ser transformado em cortisol.

INTRODUÇÃO

37


O cortisol é uma hormona glucocorticóide diretamente envolvida com a adaptação

a respostas de stress e controlo da via do eixo neuro endócrino do hipotálamo-hipófise-

adrenal (ritmo circadiano). Possui também outras funções, nomeadamente, a regulação da

resposta imune, da função cerebral, da atividade cardiovascular e do metabolismo. É o

principal glucocorticóide presente em humanos e possui uma oscilação circadiana muito

característica. A hormona corticosteroide é considerada um índice útil para a atividade do

eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, pois a sua atividade aumenta no organismo

imediatamente após uma pessoa despertar (45, 46).

Num indivíduo saudável, os níveis de cortisol apresentam variações específicas ao

longo do dia. A sua concentração mais elevada observa-se aproximadamente 20-45

minutos após o indivíduo despertar e vai diminuindo ao longo do dia até atingir um valor

mínimo durante a noite (47). Por norma, o cortisol atinge o seu pico mais elevado por volta

das 9 horas da manhã, a partir das 14:30 e as 15:30 verificam-se uma diminuição dos

valores de cortisol, atingindo um valor mais baixo por volta da meia-noite,

independentemente do género. No entanto, é importante salientar que na presença de

determinadas patologias como o síndrome de Cushing (hipercortisolismo) ou na presença

de um tumor adrenal a produção de cortisol fica descontrolada e os seus níveis

anormalmente elevados, não sendo possível observar uma variação circadiana (Figura 9)

(48). É ainda de referir que indivíduos que façam trabalhos noturnos ou trabalhem por

sistema de turnos também podem apresentar um padrão de níveis de cortisol alterado (49,

50).

Figura 9. Variações dos níveis de cortisol ao longo de um dia (Adaptado de Fleming B. (51)).

Atualmente, sabe-se que na regulação da via do cortisol, estão envolvidos

mecanismos de regulação epigenéticos como é o caso dos microRNAs (miRNAs). Os

miRNAs apresentam um papel importante na modulação da produção do cortisol,

modulando a expressão dos genes envolvidos.

INTRODUÇÃO

38


1.5. microRNAs

Os miRNAs são pequenas moléculas de cadeia simples de RNA não codificante,

com aproximadamente 19-25 nucleotídeos de comprimento, que regulam a expressão de

genes através da degradação ou repressão da tradução de moléculas-alvo de RNA

mensageiro (mRNA) (52). Desta forma, poderão influenciar a regulação de processos

celulares fisiológicos de reação ao stress (53). Estes pequenos RNAs endógenos estão

envolvidos em várias funções no organismo tais como proliferação celular e apoptose,

metabolismo de gordura, diferenciação celular, regulação do sistema imunitário,

envelhecimento e também homeostasia da glicose. Adicionalmente, cada miRNA tem a

capacidade de regular até 100 mRNAs diferentes, o que torna a sua expressão dinâmica

(52).

O processo de síntese dos miRNAs inicia-se no núcleo, onde os genes dos miRNAs

são transcritos pela RNA polimerase II (RNA Pol II), resultando precursores de miRNAs de

grandes dimensões designados miRNAs primários (pri-miRNAs). Os pri-miRNAs sobre

ação da enzima Drosha, uma ribonuclease III associada à proteína do domínio dsRNA

(double-stranded ribonucleic RNA), conhecida como DGCR8 (DiGeorge syndrome critical

region), dão origem a miRNAs precursores (pré-miRNAs). Os pré-miRNAs são

transportados para o citoplasma com o auxílio da proteína exportina-5 (XPO5). No

citoplasma, os pré-miRNAs são processados pela RNAse III dicer (enzima que cliva

moléculas de cadeia dupla de RNA) resultando numa cadeia de miRNA madura e a sua

cadeia complementar. De seguida, a dicer associa-se à transactivation-responsive RNA-

binding protein (TRBP) juntamente com proteínas argonautas (AGO). Ao mesmo tempo,

que acontece esta associação, as cadeias vão desenrolando e o miRNA maduro é

incorporado no RNA-induced silencing complex (RISC). O miRNA guia assim, o RISC

(complexo multiproteico) para o RNA mensageiro complementar (mRNA alvo) (54). (Figura

10).

INTRODUÇÃO

39


Figura 10. Representação esquemática da biogénese de microRNAs

Dependendo do grau de complementaridade entre os miRNAs e a sequência do

mRNA alvo, o silenciamento pode ocorrer de duas formas: degradação do mRNA alvo

(quando a complementaridade é total) ou por repressão da tradução (quando a

complementaridade é parcial) (55, 56) (Figura 11).

Figura 11. Mecanismo de ação dos miRNAs (Adaptado de Teixeira AL e colaboradores (52)).

INTRODUÇÃO

40


1.6. microRNAs envolvidos na via do cortisol e sua importância para as ciências

forenses

Na prática forense, um dos maiores dogmas para o perito legista é a determinação

da hora da morte de um indivíduo. Determinar a hora da morte, é um grande desafio,

principalmente no caso de cadáveres pouco conservados, no entanto é possível

estabelecer a sequência de acontecimentos (através do estudo de processos físicos como

o livor mortis, tanatoquímicos como as alterações oftalmológicas , microbiológicos como a

decomposição, físico-químicos como a rigidez cadavérica, entre outros) que ocorreram

após a morte através do intervalo post-mortem (IPM) (57). O IPM corresponde ao intervalo

de tempo que decorre entre a morte de um indivíduo e a descoberta do respetivo cadáver

(58). A determinação do IPM permite auxiliar na resolução de muitos crimes, identificar

vítimas e suspeitos, aceitar ou rejeitar álibis, fornecer uma estimativa da altura da morte e

é essencial para o preenchimento do atestado de óbito (59). Contudo, a estimativa muitas

vezes não é precisa e fiável uma vez que os cadáveres são suscetíveis à ação de fatores

extrínsecos como a temperatura, humidade, pH e fatores intrínsecos como a idade do

indivíduo, género ou patologias associadas (60).

Atualmente, realizam-se estudos que se centram no potencial dos miRNAs para

obter uma estimativa exata do IPM (59, 61). O pequeno tamanho destes, permite que não

sejam tão suscetíveis à degradação mantendo-se estáveis ao longo do IPM,

simultaneamente estas moléculas são colhidas em quantidade e qualidade suficiente para

a análise, mesmo que tenham sido expostas a condições adversas como é o caso de

variações de pH e múltiplos ciclos de congelação/descongelação (59, 60). Os miRNAs

também são moléculas capazes de regular vários constituintes de uma única via (como por

exemplo a via do cortisol), de modo que, a soma de todos esses efeitos podem resultar em

alterações pronunciadas no geral (62). Deste modo, a sua estabilidade ao longo do IPM

permite que a quantificação de miRNAs sensíveis ao ritmo circadiano (um importante

regulador da via do cortisol e consequentemente do ciclo sono-vigília) diferencie de uma

maneira exata o período do dia (manhã, tarde ou noite) em que ocorreu uma morte e assim

pode auxiliar na inclusão ou exclusão de possíveis suspeitos a um local de crime (63).

Segundo a literatura, no decorrer da produção de cortisol, a modificação pós-

transcrição por miRNAs desempenha um papel bastante significativo pois, verifica-se uma

inibição da expressão de miRNAs por knockdown da enzima Dicer (62). Esta inibição leva

ao aumento da produção do cortisol, implicando que a esteroidogénese é regulada

INTRODUÇÃO

41


negativamente por miRNAs. Outro estudo refere que entre os miRNAs cuja expressão

aumentou significativamente após knockdown da enzima Dicer, são assinalados os hsa-

miR-24 e hsa-miR-10b que regulam negativamente cyp11b1, e o hsa-miR-320a-3p que

regula negativamente cyp11a1 e cyp17a1 (64).

Por isso, mostra-se interessante estudar o potencial de miRNAs envolvidos nas vias

de produção do cortisol como biomarcadores de ritmo circadiano e assim associá-los com

os níveis de cortisol, nas 3 fases do ciclo circadiano (manhã, tarde e noite).

OBJETIVOS

OBJETIVOS

45

miRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano

2. Objetivos

2.1. Objetivo principal

Estudo do potencial de miRNAs envolvidos nas vias de produção do cortisol como

biomarcadores de ritmo circadiano em amostras de sangue e saliva.

2.2. Objetivos específicos

• Revisão da literatura de modo a selecionar os miRNAs envolvidos na via de

produção do cortisol com potencial para serem usados como biomarcadores do

ritmo circadiano em amostras de sangue e saliva.

• Estudo do perfil de miRNAs selecionados em amostras de sangue periférico e saliva

e estabelecimento da sua associação com os níveis de cortisol, nas 3 fases do ciclo

circadiano (manhã, tarde e noite) numa população de 20 indivíduos saudáveis

provenientes do Norte de Portugal.

MATERIAIS E MÉTODOS


49


3. Materiais e métodos

3.1. Seleção do perfil de microRNAs

Inicialmente realizou-se uma revisão da literatura com recurso à Pubmed

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/). Numa primeira fase, pesquisaram-se as seguintes

palavra-chave “microRNA biomarker in cortisol”; “microRNA in glucocorticoid action”;

“MicroRNA cortisol regulator”; “microRNAs in circadian rhythm” e “microRNAs as a stress

biomarker”, obtendo-se um total de 794 artigos. Destes, foram selecionados aqueles que

incluíssem pelo menos um dos seguintes critérios: estudos realizados em amostras de

sangue periférico ou saliva em indivíduos, estudos com informações relativas à influência

de miRNAs na via de cortisol, estudos que associam níveis de stress com expressão de

miRNAs e artigos publicados a partir de 2010. Foram exluídos todos os artigos que

envolviam o estudo de diferentes patologias, tendo resultado desta seleção 7 artigos

científicos.

3.2. População em estudo

Foram realizadas colheitas de sangue e saliva em 20 indivíduos voluntários,

caucasianos e saudáveis (6 homens e 14 mulheres) provenientes do Norte de Portugal. As

amostras de sangue periférico foram obtidas por punção venosa ante cubital em tubos com

EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) e em tubos com ativador de coágulo (para

análise bioquímica do cortisol) ao início da manhã (aproximadamente 8 horas) e à tarde

(aproximadamente 15 horas). As amostras de saliva foram recolhidas através de um kit

salivette à noite (aproximadamente 24 horas) (Tabela 1). Todas as colheitas foram

realizadas após consentimento esclarecido e informado escrito, de acordo com os

princípios da Declaração de Helsínquia. Após a colheita as amostras, foram submetidas a

um processamento segundo um protocolo padronizado e estabelecido pelo laboratório. O

primeiro passo foi registar as amostras. Para cada amostra foi também atribuído um código

de forma a que as amostras fossem aleatorizadas.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/


50


Tabela 1. Colheita das amostras biológicas

N Média idade Amostra Modo colheita Período dia

14 Mulheres 25,5 anos

Sangue periférico

Tubo EDTA Manhã

Tarde

Tubo com ativador de

coágulo

Manhã

Tarde

Saliva Kit Salivette Noite

6 Homens 39,7 anos

Sangue periférico

Tubo EDTA Manhã

Tarde

Tubo com ativador de

coágulo

Manhã

Tarde

Saliva Kit Salivette Noite

3.3. Processamento de amostras

Após realizadas as colheitas das amostras, processaram-se os dois tipos de

amostra da seguinte forma: os kits salivette com as amostras de saliva foram centrifugados

durante 2 minutos a 1000 g, transferindo-se o sobrenadante para um eppendorf. Os tubos

com amostras de sangue periférico foram centrifugados a 2500 rpm durante 5 minutos.

Após a centrifugação, foi recolhido 1 mL de plasma para um eppendorf, 1 mL de sangue

total para outro eppendorf e 200 µL de sangue para extração de miRNAs para outro

eppendorf devidamente identificados e armazenados a -20 ºC. O restante sangue foi

transferido para um tubo cónico à qual foi adicionado cloreto de amónio, fosfato de

hidrogénio e EDTA (AKE 1X) para a lise de eritrócitos, até perfazer 50 mL. As amostras

foram refrigeradas durante 20 minutos e centrifugadas durante 10 minutos a 2500 rpm. O

sobrenadante foi descartado, o pellet de leucócitos ressuspendido em AKE 1X e foi

centrifugado durante 10 minutos a 2500 rpm. De seguida, o sobrenadante foi novamente

descartado e o pellet de leucócitos ressuspendido em PBS 1X (solução salina tamponada

com fosfato) para lavagem celular. Foi centrifugado mais uma vez nas mesmas condições,

o sobrenadante foi descartado e o pellet de leucócitos ressuspendido em TripleExtractor

(Grisp-Research Solutions®) e armazenado a -80ºC.


51


3.4. Extração de microRNAs

A extração de miRNAs das amostras de saliva e sangue periférico foi realizada com

o GRS microRNA Purification kit, após adaptação das especificações do procedimento

laboratorial (Grisp Research Solutions®). Este método de extração é eficiente e rápido para

a purificação de miRNAs, com baixa contaminação de grandes moléculas de RNA e DNA

genómico. Nas amostras extraídas de sangue periférico começou-se por adicionar 600 µL

de tampão de lise de eritrócitos e incubou-se durante 5 minutos à temperatura ambiente.

De seguida foi adicionado 200 µL de tampão de lise e ressuspendeu-se. Incubou-se

novamente durante 10 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente foi adicionado 20

µL de tampão de miRNAs, 220 µL de fenol-clorofórimo e centrifugou-se a 15.000g por 3

minutos permitindo assim a separação de 3 fases: fase transparente correspondente aos

miRNAs, anel branco correspondente ao DNA e deposição no fundo do eppendorf

correspondente às proteínas. Colheu-se a fase transparente e procedeu-se para a

purificação dos miRNAs seguindo o protocolo do kit. Relativamente às amostras de saliva,

também foram adicionados 200 µL de tampão de lise e ressuspendeu-se. Incubou-se

novamente durante 10 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente foi adicionado 35

µL de tampão de miRNAs, 385 µL de fenol-clorofórmio e centrifugou-se a 13.000g por 10

minutos permitindo assim a separação das 3 fases. Os restantes passos foram seguidos

tendo em conta as instruções do fabricante, sendo que o principal objetivo deste kit é utilizar

sais caotrópicos e várias concentrações de etanol para permitir a ligação seletiva de RNA

de tamanhos específicos à matriz da coluna. Os materiais contaminados são removidos

com um tampão de lavagem e de seguida a coluna é centrifugada. De seguida, o RNA

purificado é eluído com tampão de eluição livre de ribonucleases (RNAses).

Após a extração, para avaliar a integridade e qualidade do miRNA presente em

cada amostra, estas foram quantificadas pelo Qubit™ 4 Fluorometer. Este equipamento

para além de fazer uma deteção rápida e muito precisa, é suficiente 1 µL de amostra para

ser realizada a sua quantificação.

3.5. Síntese de cDNA

Depois de devidamente quantificadas, procedeu-se à síntese de DNA

complementar (cDNA). A síntese de cDNA do RNU-48 e dos miR-21 e miR-144-5p foi

realizada através da utilização do kit TaqMan™ microRNA reverse Transcription (Applied

Biosystems®). A síntese de cDNA para os restantes miRNAs selecionados foi realizada


52


através do kit TaqMan™ Advanced miRNA cDNA synthesis (Applied Biosystems®). O uso

do kit TaqMan™ Advanced miRNA cDNA synthesis (Applied Biosystems®) assegura: uma

elevada sensibilidade, permitindo assim também uma quantificação de miRNAs de baixa

expressão (especialmente em amostras biológicas como soro, plasma e tecidos);

flexibilidade, uma vez que, possui uma etapa de RT universal que cria modelos universais

de cDNA para todos os miRNAs presentes na amostra de forma a simplificar o processo

de síntese de cDNA e necessita apenas de uma pequena quantidade de amostra.

3.6. Quantificação por PCR tempo real

Para avaliar os níveis de expressão dos miRNAs foram realizadas quantificações

relativas por PCR quantitativo em tempo real por ser um método capaz de gerar dados

quantitativos precisos, ser rápido devido à diminuição dos tempos dos ciclos de

amplificação e ao uso de equipamento com alta sensibilidade para a deteção da

fluorescência. O PCR em tempo real associa a metodologia de PCR convencional com um

sistema de deteção e quantificação de fluorescência produzida nos ciclos de amplificação

no decorrer da reação, ou seja, determina para cada amostra utilizada o número de ciclos

no qual a fluorescência acumulada ultrapassa a sua baseline: o Ct (cycle threshold).

Durante a amplificação, as amostras foram sujeitas a temperaturas de 95ºC durante 10

minutos e depois a 40 ciclos de 95ºC durante 15 segundos, seguida de 60ºC durante 1

minuto.

As reações foram realizadas no aparelho StepOne™ qPCR Real-Time. A mistura

de reação foi feita com os seguintes componentes: H2O, 1X TaqMan® Fast Advanced

Master Mix (Applied Biosystems®), 1X sondas específicas para amplificar os miRNA alvo

(Taqman® microRNA Expression Assays®, miR-21, miR-144-5p e Taqman® Advanced

microRNA Assays®, miR-10a, miR-10b, miR-16, miR-20, miR-24) e o controlo endógeno

RNU48 (Applied Biosystems®) juntamente com as amostras de cDNA (5µL por amostra).

Todas as quantificações foram realizadas em duplicado e foi incluído um controlo negativo

de maneira a controlar possíveis contaminações.

3.7. Quantificação dos níveis de cortisol sérico e salivar

A quantificação dos níveis de cortisol foi efetuada com a colaboração do Serviço de

Química Clínica do Departamento de Diagnóstico Laboratorial do IPO-Porto, de acordo


53


com os procedimentos de rotina do mesmo. A quantificação dos níveis de cortisol foi

realizada com recurso ao teste ElecsysCortisol II® (Cobas®).

3.8. Análise estatística

De seguida foram feitas as análises das curvas de amplificação utilizando o

StepOne™ (Applied Biosystems®) com a mesma linha de base e limite definido para cada

placa, de forma a gerar valores de cycle threshold (Ct) para todos os miRNAs presentes

em cada amostra.

No final, a análise estatística foi realizada com recurso ao software estatístico

IBM®SPSS®Statistics for Windows (Versão 25.0), de maneira a avaliar potenciais

diferenças na expressão dos miRNAs estudados. Para avaliar a diferença dos níveis de

expressão dos vários miRNAs analisados, calculou-se o fold-change ou método de Livak

através da fórmula (65):

𝟐−∆∆𝑪𝒕 ⟷ ∆∆Ct = ∆Ct (tarde) - ∆Ct (manhã)

∆Ct = Ct (miRNA target) - Ct (endógeno)

RESULTADOS

RESULTADOS

57


4. Resultados

4.1. Frequências de deteção dos microRNAs estudados em amostras de sangue e

saliva

Na população em estudo, observou-se que todos os miRNAs analisados foram

detetados em ambos os fluídos biológicos (sangue e saliva) apresentando frequências de

deteção muito variáveis, com exceção do hsa-miR-144-5p que não foi detetado na saliva.

No período da manhã, podemos verificar que todos os miRNAs foram detetados no

sangue total. Na figura 12 verifica-se que o hsa-miR-20 (figura 12d), o hsa-miR-21 (figura

12e) e hsa-miR-24 (figura 12f) foram os miRNAs com maior frequência de deteção, a variar

entre os 80 e 90%, neste período do dia. Contrariamente, o hsa-miR-10b (figura 12b) foi o

miRNA com menor frequência de deteção (15%), nesse mesmo período do dia.

Ao analisarmos, as frequências correspondentes ao período da tarde, podemos

também concluir que todos os miRNAs também foram detetados no sangue total.

Verificando-se que o hsa-miR-16 (figura 12c), hsa-miR-20 (figura 12d) e o hsa-miR-24

(figura 12f) foram os mais frequentes, com uma taxa de deteção de 80%). Por outro lado,

verificámos que o hsa-miR-10b (figura 12b) e o hsa-miR-21 (figura 12e) apresentam a

menor frequência de deteção (30%).

Relativamente à colheita realizada no período da noite, podemos observar que três

miRNAs apresentam uma frequência máxima de deteção (100%) nas amostras de saliva,

nomeadamente o hsa-miR-16 (figura 12c), o hsa-miR-21 (figura 12e) e o hsa-miR-24 (figura

12f). No entanto, o hsa-miR-10a (figura 12a), o hsa-miR-10b (figura 12b) apresentam

baixas frequências (20%, 10%) e o hsa-miR-144-5p (figura 12g) não apresentou frequência

de deteção.

Deste modo, verificámos que o miRNA mais frequente quando considerado os três

períodos do dia foi o hsa-miR-24, sendo o hsa-miR-10b o miRNA menos frequente nas

amostras de sangue e saliva.

RESULTADOS

58


Figura 12. Frequência de deteção (%), dos miRNAs em estudo ao longo do dia.

RESULTADOS

59


4.2. Níveis de cortisol e quantificação relativa dos microRNAs nas amostras de

sangue e saliva

De forma a estudar a dinâmica de expressão dos miRNAs em estudo ao longo do

dia, foi determinado em simultâneo os níveis de cortisol de modo a estabelecer inferências

relacionadas com o ritmo circadiano humano. Na população em estudo, verificamos uma

variação dos níveis de cortisol ao longo do dia, sendo os valores mais elevados verificados

no período da manhá (média de cortisol da população 26,12 µg/dL), diminuindo ao longo

do dia (média de cortisol da população no períoda da tarde 14,03 µg/dL) e atingindo os

valores mais baixos à noite (0,17 µg/dL).

Podemos visualizar na figura 13, que à medida que os níveis de cortisol vão

diminuindo ao longo do dia, os níveis dos miRNAs vão aumentando, com exceção do hsa-

miR-21 que se verifica uma lenta e pequena diminuição entre o período da manhã e da

tarde e um acentuado aumento entre o período da tarde e da noite.

O hsa-miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-24 (figura 13a, 13c, 13f, respetivamente)

apresentam um aumento gradual e constante ao longo do dia. No entanto, não se verifica

o mesmo comportamento nos outros miRNAs.

O hsa-miR-10b (figura 13b) apresenta um aumento lento entre os períodos da

manhã e tarde mas um aumento mais acentuado do período da tarde para a noite. Pelo

contrário, tal como referido anteriormente, o hsa-miR-21 (figura 13e) apresenta uma

pequena e lenta diminuição entre os períodos da manhã e tarde mas à semelhança com o

hsa-miR-10b verifica-se um aumento mais acentuado entre os períodos da tarde e noite.

Os restantes miRNAs, nomeadamente o hsa-miR-20 (fig 13d) e hsa-miR-144-5p (fig

13g), apresentam inicialmente uma dinâmica semelhante (um aumento acentuado) entre a

manhã e a tarde. Porém, verifica-se um aumento mais lento no hsa-miR-20 entre a tarde e

a noite enquanto que não há deteção de hsa-miR-144-5p no mesmo período.

RESULTADOS

60


Figura 13.Níveis do cortisol e miRNAs ao longo do dia.

RESULTADOS

61


De acordo com os resultados, podemos verificar um aumento dos níveis de

expressão do hsa-miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-24 nas amostras de sangue colhidas

no período da tarde, comparativamente aos níveis de expressão detetados nas amostras

de sangue colhidas no período da manhã. Sendo este aumento de 75,6 (P=0,013), 26,7

(P=0,018) e de 135,6 (P=0,002), respetivamente (Tabela 2).

Tabela 2. Valores de fold-change e pvalue para os hsa-miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-24.

hsa-miR Fold-change P

hsa-miR-10a 75,6 0,013

hsa-miR-16 26,7 0,018

hsa-miR-24 135,3 0,002

DISCUSSÃO

DISCUSSÃO

65


5. Discussão

Com o presente estudo pretende-se avaliar o potencial dos miRNAs associados à

via de produção do cortisol como biomarcadores do ritmo circadiano. Atualmente, os

miRNAs têm-se tornado alvo de estudo na área das ciências forenses pois a sua análise

fornece informações úteis, principalmente em amostras que já se encontram degradadas

(66). Na Medicina Legal, continua a ser um grande desafio a determinação da hora exata

de morte de um cadáver. Como tal, é utilizado o intervalo post-mortem (IPM) que fornece

uma estimativa do intervalo que ocorre entre a morte e a descoberta do respetivo cadáver

para auxiliar o perito forense (58). Estudos que se centram no estudo do potencial dos

miRNAs para obter uma estimativa do IPM demonstram que, o seu pequeno tamanho

torna-se uma vantagem na sua utilização em relação ao mesmo tipo de estudos que

analisam amostras de DNA, uma vez que estes não são tão suscetíveis à degradação por

fatores físicos e químicos, mantendo-se estáveis durante longo períodos de tempo (59-61).

Simultaneamente a esta característica, a quantidade e qualidade destas moléculas

continua a ser suficiente para análise molecular mesmo que estas tenham sido expostas a

condições adversas, como é o caso de variações de pH e temperatura (60). Deste modo,

a elevada estabilidade dos miRNAs poderá permitir a análise da sua dinâmica associada

à via de produção do cortisol possibilitando que seja fornecida uma estimativa da altura do

dia (manhã, tarde ou noite) da morte de um indivíduo, uma vez que os níveis de cortisol

apresentam uma ritmicidade diária. O conhecimento sobre o período do dia em que ocorreu

a morte, poderá auxiliar a investigação criminal, permintindo inclusive restringir possíveis

suspeitos ou encontrar possíveis testemunhas oculares, o que facilitará o conhecimento do

evento.

Da análise dos níveis de expressão dos hsa-miR-10a, hsa-miR-10b, hsa-miR-16,

hsa-miR-20, hsa-miR-21, hsa-miR-24 e hsa-miR-144-5p em amostras de sangue periférico

e saliva, observou-se que estes apresentaram oscilação mediante o período do dia em que

foram colhidas. Verificou-se que os hsa-miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-24 apresentaram

um aumento de expressão ao longo do dia, contrariamente aos níveis de cortisol, que foram

diminuindo ao longo do mesmo, tal como o esperado.

Um estudo realizado por Beech e colaboradores relacionou o aumento dos níveis

de stress agudo com o aumento de expressão de hsa-miR-10a utilizando amostras de

sangue, tendo sido colocada a hipótese deste miRNA ser influenciado por condições de

stress agudo (67). Contudo, este autores não conseguiram estabelecer qualquer relação

DISCUSSÃO

66


entre o o stress agudo e os níveis de cortisol (67). Esta evidência sugere que poderão

existir outros mecanismos moleculares responsáveis pelo variação dos níveis deste

miRNA. Por outro lado, um estudo realizado por Zhang e colaboradores admite que o uso

de Acarbose, um fármaco inibidor de α-glucosidade, regula o metabolismo da glicose ao

diminuir a glicose pós-pandrial e que esta diminuição resulta no aumento de expressão do

hsa-miR-10a (68). Numa situação normal, o aumento dos níveis de cortisol traduz-se num

aumento da glicose no sangue. Os autores sugerem que a Acarbose diminui os níveis de

glicose no sangue devido ao aumento da expressão de hsa-miR-10a (68). Adicionalmente,

Kim e colaboradores reportaram que o hsa-miR-10a regula a expressão da Lanosterol

sintase (LSS). Na última etapa de síntese de colesterol, a LSS é responsável por converter

o Esqualeno em Lanosterol, permitindo ativar a síntese do colesterol (69). Deste modo, o

aumento do hsa-miR-10a irá resultar numa diminuição de LSS e, consequentemente numa

inibição da síntese de colesterol (70). Logo, colocamos a hipótese que o aumento do hsa-

miR-10a, ao diminuir os níveis de LSS, inibe a síntese de colesterol, o que irá resultar na

diminuição dos níveis de cortisol. Deste modo, esta relação inversa entre os níveis de hsa-

miR-10a e os níveis de cortisol estão de acordo com os nossos resultados, sugerindo que

o hsa-miR-10a será um potencial biomarcador do período do dia em que a amostra foi

colhida e/ou recolhida.

Honda e colaboradores, propuseram que outros dos miRNAs que poderão ser

afectados pelo stress são o hsa-miR-16 e hsa-miR-144-5p. Este estudo, realizado na

população estudantil Japonesa, observou um aumento dos níveis de hsa-miR-16 e hsa-

miR-144-5p no sangue e na saliva, como resposta ao stress após a realização de um

exame (71). Contudo, tal como o verificado no estudo de Beech e colaboradores, também

neste estudo não foi observada qualquer alteração nos níveis de cortisol (71). Por outro

lado, estes autores admitem que o aumento do hsa-miR-16 poderá resultar na diminuição

da expressão do gene Wnt family member 4 (wnt4) (71). O wnt4 atua na via de produção

do cortisol, aumentando a sua produção após atuar como regulador positivo da cyp17 e

cyp21 (72). A cyp17 e cyp21 têm como principal função na via do cortisol, converter a

pregnenolona em 17-α-hidroxipregnenolona e a 17-α-hidroxiprogesterona em 11-

desoxicortisol, respetivamente (72). Logo, colocamos a hipótese que o aumento do hsa-

miR-16 consequentemente irá diminuir os níveis de expressão de wnt4, o que se traduzirá

numa diminuição da produção de cortisol. Deste modo, esta relação inversa entre hsa-miR-

16 e os níveis de cortisol estão de acordo com os nossos resultados, sugerindo que o hsa-

miR-16 também será um potencial biomarcador do período do dia em que a amostra foi

colhida e/ou recolhida.

DISCUSSÃO

67


Relativamente ao hsa-miR-144-5p, os resultados demonstraram em simultâneo

uma diminuição dos níveis do cortisol e um aumento da sua expressão entre os períodos

da manhã e da tarde no sangue, contudo este não foi detetado no período da noite na

saliva. Hill e colaboradores sugerem que uma função importante do sono é a defesa contra

o stress oxidativo (73). É no período do sono, à noite, que os níveis de cortisol diminuem.

Um estudo realizado por Sangokoya e colaboradores, afirma que o hsa-miR-144 regula

diretamente o Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NFR2), um importante regulador

que modula a resposta ao stress oxidativo (74). Por outro lado, os autores admitem que o

aumento do hsa-miR-144-5p está associado a níveis reduzidos de NRF2, o que leva a uma

redução da tolerância ao stress oxidativo (74). Logo, colocamos a hipótese que é durante

o período de sono que existe uma resposta ao stress oxidativo, e consequentemente

haverá um aumento de NFR2. Visto que o hsa-miR-144-5p regula negativamente a ação

do NFR2, isso irá implicar que não haja expressão do hsa-miR-144-5p durante a noite.

Sendo esta a razão pela qual não conseguimos detetar este miRNA à noite. Deste modo,

esta relação inversa entre os níveis de cortisol e hsa-miR-144-5p e, a não deteção deste

miRNA no período da noite, estão de acordo com os nossos resultados, sugerindo que o

hsa-miR-144-5p também será um potencial biomarcador do período do dia em que a

amostra foi colhida e/ou recolhida.

Relativamente ao hsa-miR-24, vários estudos reportam que está implicado na

regulação negativa da cyp11b1 (62, 64, 75). Alguns artigos observaram que o aumento da

expressão de hsa-miR-24 se traduz na inibição da atividade da enzima cyp11b1 (62, 64,

75). A cyp11b1 tem como principal função na via do cortisol, converter o 11-desoxicortisol

em cortisol Sendo o hsa-miR-24 um regulador negativo de cyp11b1, e estando esta enzima

diretamente envolvida com a produção de cortisol, como consequência do aumento da

expressão deste miRNA, também haverá uma diminuição dos níveis de cortisol. Esta

associação também foi observada no presente estudo, uma vez que o aumento do hsa-

miR-24 foi acompanhado pela diminuição dos níveis de cortisol. Deste modo, admitimos

que o hsa-miR-24 também poderá ser um útil indicador do período do dia em que a amostra

foi colhida e/ou recolhida.

Na figura 14, é possível verificar de uma forma mais elucidativa a relação dos hsa-

miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-24 com a via do cortisol De acordo com os resultados

obtidos, podemos admitir que os hsa-miR-10a, hsa-miR-16, hsa-miR-24 e hsa-miR-144-5p

poderão ser biomarcadores úteis no que respeita à determinação do espaço temporal em

que uma amostra de sangue foi colhida/ recolhida, podendo ser fortes candidatos a serem

incluídos num perfil de miRNAs a estudar a quando de uma determinação do IPM.

DISCUSSÃO

68


Figura 14. Relação dos hsa-miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-24 com a regulação da via da síntese do cortisol.

.

CONCLUSÃO E

PERSPETIVAS FUTURAS

CONCLUSÃO E PERSPETIVAS FUTURAS

71


6. Conclusão e perspetivas futuras

Na Medicina Legal, continua a ser um grande desafio a determinação da hora exata

de morte de um cadáver. Como tal, é utilizado o IPM que permite auxiliar na resolução de

muitos crimes, identificar vítimas e suspeitos, aceitar ou rejeitar álibis, fornecer uma

estimativa da altura da morte e é essencial para o preenchimento do atestado de óbito (59).

No entanto, a determinação do IPM muitas vezes não é precisa e fiável uma vez que o

cadáver muitas vezes é exposto a condições adversas, como é o caso de variações de pH

e temperatura (60). A análise de miRNAs tornou-se um campo crescente para estudo nas

ciências forenses, uma vez que é descrito que o seu pequeno tamanho torna-se uma

vantagem na sua utilização pois estas moléculas não são tão suscetíveis à degradação por

fatores físicos e químicos, mantendo-se estáveis durante longo períodos de tempo (59-61).

Deste modo, a elevada estabilidade dos miRNAs poderá permitir a análise da sua dinâmica

associada à via de produção do cortisol possibilitando que seja fornecida uma estimativa

da altura do dia (manhã, tarde ou noite) em que ocorreu uma morte e assim restringir

possíveis suspeitos ou encontrar possíveis testemunhas oculares num local de crime.

O presente estudo analisou o potencial dos hsa-miR-10a, hsa-miR-10b, hsa-miR-

16, hsa-miR-20, hsa-miR-21, hsa-miR-24 e hsa-miR-144-5p com associação à via de

produção do cortisol como biomarcadores do ritmo circadiano em amostras de sangue e

saliva, assim como estabeleceu a sua dinâmica em diferentes fases do ciclo diário (manhã,

tarde ou noite).

Os resultados do presente estudo mostraram que o método utilizado (qPCR)

apresenta inúmeras vantagens para a análise de amostras em contextos forenses, pois

requer pouca quantidade e qualidade de amostra inicial e a técnica laboratorial é simples

e rápida, comparativamente aos outros métodos disponíveis, reduzindo assim a

possibilidade de contaminações e erros. É possível concluir que tanto o sangue como a

saliva são bons fluídos biológicos que permitem a quantificação relativa de miRNAs alvo,

uma vez que todos os miRNAs em estudo foram detetados (com exceção do hsa-miR144-

5p na saliva). É de salientar que, em comparação ao sangue, a colheita da saliva é

realizada por um método não invasivo tornando-se mais vantajoso. Da análise dos níveis

de expressão, verificam-se alterações entre os três períodos do dia para todos os miRNAs.

No entanto, o hsa-miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-24 demonstraram um aumento de

expressão ao longo do dia, contrariamente aos níveis de cortisol, que foram diminuindo ao

longo do dia, tal como o esperado. Relativamente ao hsa-miR-144-5p, este também

demonstrou um aumento de expressão entre o período da manhã e da tarde mas não foi

detetado nas amostras de saliva à noite. Conclui-se que o hsa-miR-10a, hsa-miR-16, hsa-

CONCLUSÃO E PERSPETIVAS FUTURAS

72


miR-24 e o hsa-miR-144-5p poderão ser biomarcadores úteis no que respeita à

determinação do espaço temporal em que uma amostra foi colhida, podendo ser fortes

candidatos a serem incluídos num perfil de miRNAs a estudar a quando de uma

determinação do IPM.

Em estudos futuros, o presente estudo deveria ser replicado num maior número de

indivíduos, de modo a validar as associações encontradas. Adicionalmente também seria

interessante o estudo da expressão destes miRNAs em amostras de sangue periférico

durante o período da noite e em amostras de saliva durante o período da manhã e tarde,

de modo a complementar os resultados obtidos.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS


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