avaliaÇÃo de biomarcadores reprodutivos, …
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO MATO GROSSO
CAMPUS UNIVERSITÁRIO DO ARAGUAIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA E PARASITOLOGIA BÁSICAS E
APLICADAS
NÁGILLA ORLEANNE LIMA DO CARMO
AVALIAÇÃO DE BIOMARCADORES REPRODUTIVOS, BIOQUÍMICOS
E IMUNOLÓGICOS EM RATAS WISTAR IMUNOSSUPRIMIDAS PELO
MICOFENOLATO DE SÓDIO, ANTES E DURANTE A PRENHEZ
BARRA DO GARÇAS-MT
2015
NÁGILLA ORLEANNE LIMA DO CARMO
AVALIAÇÃO DE BIOMARCADORES REPRODUTIVOS, BIOQUÍMICOS
E IMUNOLÓGICOS EM RATAS WISTAR IMUNOSSUPRIMIDAS PELO
MICOFENOLATO DE SÓDIO, ANTES E DURANTE A PRENHEZ
Básicas e Aplicadas do Instituto de Ciências Biológicas e da
Saúde do Campus Universitário do Araguaia/UFMT, como
exigência parcial para obtenção do título de Mestre em
Imunologia e Parasitologia.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Kleber Eduardo de Campos
COORIENTADOR: Prof. Dr. Gustavo Tadeu Volpato
BARRA DO GARÇAS-MT
BARRA DO GARÇAS-MT
2015
Dissertação apresentada ao PPG em Imunologia e Parasitologia
Básicas e Aplicadas do Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde
do Campus Universitário do Araguaia/UFMT, como exigência
parcial para obtenção do título de Mestre em Imunologia e
Parasitologia.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Kleber Eduardo de Campos
COORIENTADOR: Prof. Dr. Gustavo Tadeu Volpato
DEDICATÓRIA
Aos meus pais Sebastião e Isabel e minha irmã Francielly, que sempre tiveram ao meu lado
pelos caminhos da vida, me acompanhando, apoiando em todas as etapas até aqui conquistadas, e
principalmente acreditando em mim e me dando suporte para tornar meus sonhos em realidade.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por sempre me conceder sabedoria nas escolhas dos
melhores caminhos, coragem para acreditar, força para não desistir e proteção para me amparar.
Serei eternamente grata por fazer que seus planos na minha vida sejam sempre maiores do que eu
poderia supor, que mesmo em certas situações por eu não entender o seu silêncio sei que coloca
em meu coração a paciência e a fé em acreditar que algo de melhor virá. Por ter colocado em meu
caminho pessoas tão especiais, que não mediram esforços em me ajudar durante a realização deste
trabalho e no decorrer da minha vida. A estas pessoas aqui meus sinceros agradecimentos.
Aos meus pais serei eternamente grata. Vocês que tudo me deram e que de muito se
privaram para que eu pudesse chegar onde cheguei. Pelo amor que sempre me dedicaram e por
todo apoio que me proporcionaram aqui vai o meu amor e reconhecimentos eternos. Esta conquista
também é de vocês!!!
À minha irmã Francielly pelo apoio e carinho nessa longa caminhada.
Ao meu namorado Alexandre Moeller, pelo amor e carinho presente em todas as horas, pelo
apoio e incentivo nas escolhas que eu faço, pela paciência em me acompanhar, ouvir minhas
lamentações e me compreender.
Ao Prof. Dr. Kleber Eduardo de Campos, pela orientação e contribuição na minha formação
pessoal e profissional. Por compartilhar sua experiência para que minha formação fosse também
uma aprendizado de vida, meu carinho e meu agradecimento.
Ao Prof. Dr. Gustavo Tadeu Volpato, pela coorientação, apoio e experiência em ciência
transmitida.
À Prof. Madileine Américo, pela amizade, incentivos e ensinamentos que ficarão sempre
guardados.
Ao FisioTox pelo fornecimento dos animais e com isso proporcionar a realização de
inúmeras pesquisas e pelos maravilhosos dias que passei, sendo nos trabalhos, nas conversas, nos
lanches, nas festinhas, cada momento foi prazeroso.
Às meninas do “quarteto fantástico” (Loyane Almeida, Thaigra Soares e Rafaianne
Querioz), pela verdadeira amizade e companheirismo que construímos nesses seis anos. Pelos
auxílios nos trabalhos e principalmente por estarem comigo nesta caminhada tornando-a mais fácil
e agradável. Pelas risadas, inúmeros lanches, tentativas loucas para emagrecer, fofocas e por tantos
momentos.
À Elisângela Miranda e Gilsielle Benício, que me ajudaram e colaboraram diretamente com
a realização deste trabalho. Pela maravilhosa contribuição, dedicação e boa vontade.
À todos os alunos que fazem parte da família FisioTox, em especial aqueles que me
ajudaram de alguma forma na realização deste trabalho. À todos alunos da equipe do Prof. Kleber,
pela ajuda, troca de experiências e conhecimentos. E a pós-graduanda Carolina Abreu Miranda
pelo parceria, amizade e por sempre me salvar nos GTT.
Aos animais que participaram involuntariamente desta pesquisa.
À Universidade Federal do Mato Grosso, instituição pela qual conclui a graduação e agora
a pós-graduação. À todos os professores do PPGIP, pelo ensinamento e dedicação, cada um de
forma especial contribuiu para a conclusão desse trabalho e consequentemente para minha
formação profissional.
Às professoras Maria do Carmo Borges Teixeira e Eliane Suchara por integrarem a banca
examinadora e por contribuírem com seus conhecimentos e experiências.
As minhas eternas amigas, Bryzza Cavalcante e Suelen Mendes, valeu pelo apoio e pela
amizade de mais de vinte anos.
À Fapemat pelo bolsa concedida durante o período do mestrado.
Por fim, gostaria de agradecer aos meus amigos e familiares, pelo carinho e pela
compreensão nos momentos em que a dedicação aos estudos foi exclusiva, a todos que
contribuíram direta ou indiretamente para que esse trabalho fosse realizado, meu eterno
AGRADECIMENTO!!!
“Quando as riquezas começam a vir, vem com tal rapidez, em tal abundância, que a gente se
pergunta onde se escondiam durante todos aqueles anos estéreis.”
(Napoleon Hill)
RESUMO
A utilização de medicamentos na gestação deve ser vista com cautela, sobretudo devido às
implicações na saúde materno-fetal. Dentre os medicamentos conhecidos, o imunossupressor
Micofenolato de sódio (MMS) é utilizado a fim de evitar possíveis rejeições dos tecidos e órgãos
transplantados, inibindo a proliferação de linfócitos T e B. O objetivo deste estudo é avaliar os
efeitos da imunossupressão materna pelo MMS no perfil reprodutivo, bioquímico e imunológico
em ratas. Para isto, foram divididas em três grupos: ratas tratadas com água (CONT, n=10), ratas
tratadas via oral com MMS (20mg/Kg) diariamente por 15 dias até o diagnóstico positivo de
prenhez (MICO-1, n=10) e ratas tratadas via oral com MMS (20mg/Kg) diariamente por 15 dias,
antes e durante os 21 dias de prenhez (MICO-2, n=10). Foram avaliados o peso corpóreo, glicemia,
consumo de água e de ração, todos semanalmente (antes e durante a prenhez). No 17° dia de
prenhez, foi realizado o Teste Oral de Tolerância à Glicose (TOTG) e no 21° dia, as ratas foram
anestesiadas e mortas por decapitação, para mensurar o peso relativo dos órgãos maternos, as
determinar os índices reprodutivos (Índice de fertilidade, de parto, de prenhez e número de recém-
nascidos vivos e reabsorções), análises bioquímicas séricas (parâmetros lipídicos e transaminases
hepáticas) e análise imunológica (TNF placentário e leucograma) em todos os grupos. A
significância estatística foi considerada quando p<0,05. No período pré-prenhez, embora não
ocorreram alterações nos valores de peso corpóreo, o tratamento com MMS diminuiu o consumo
alimentar e hídrico e elevou a glicemia, porém seu uso contínuo na gestação (MICO-2) fez com
que diminuísse o valor de peso corpóreo, mantendo um quadro de hiperglicemia leve (cerca de
170mg/dL), com TOTG normais. Além disso, no mesmo grupo estudado houve outros efeitos
negativos, incluindo ratas mortas, reabsorções totais de fetos, peso relativo de fígado, baço
(acompanhado de taxa de leucócitos) e gordura periovariana aumentados, taxas lipídicas séricas
diminuídas (colesterol e frações lipoprotéicas, triglicerídios e alanina aminotransferase). O uso
contínuo de MMS na gestação pode ser considerado tóxico, prejudicando a saúde materno-fetal,
por levar a hiperglicemia, perdas fetais e disfunção esplênica interferindo no metabolismo lipídico
e imunológico. Isso faz com que seu uso não seja livremente recomendado na gestação, devendo
ser substituído por outro imunossupressor.
Palavras-chave: Imunossupressão, Micofelonato de sódio, Gestação, Ratas Wistar, Metabolismo
lipídico, Intolerância à glicose.
ABSTRACT
The use of medication during pregnancy should be taken with caution, especially because of its
implications for maternal and fetal health. The mycophenolate sodium (MMS) is used to avoid
possible rejection of transplanted tissues and organs by inhibiting T and B lymphocyte
proliferation. Objective of this study was to evaluate the effects of maternal immunosuppression
by MMS on reproductive, biochemical and immunological profile in rats. The rats were divided
into three groups: rats treated with water (CONT = 10) rats orally treated with MMS (20mg/Kg)
daily for 15 days until a positive diagnosis of pregnancy (MICO-1 = 10) and rats orally treated with
MMS (20mg/Kg) daily for 15 days prior to and during 21 days of pregnancy (MICO-2 = 10). It
was evaluated body weight, blood glucose, and water and food intake weekly (before and during
pregnancy). On the 17th day of pregnancy it was performed the Oral Tolerance Glucose Test
(OGTT) and on day 21 the rats were anesthetized and killed by decapitation and thus measured the
relative maternal organs, determinations of reproductive parameters (Index fertility, childbirth,
pregnancy and number of live births and resorption), serum biomarkers (lipid parameters and liver
transaminases) and immunological profile (placental and serum TNF) in all groups. Statistical
significance was p <0.05. In the pre-pregnancy period, although there were no changes in body
weight values, the continuous treatment with MMS decreased food and water consumption and
also increased blood glucose (MICO-2). During pregnancy period, these rats presented a reduction
of the body weight, maintaining a mild hyperglycemia level (about 170 mg/dL) with normal OGTT.
Furthermore, in the same study group showed other negative effects, including dead rats, total
resorption of fetuses increased relative weight of liver, spleen (including leukocytes rate) and also
periovarian fat. Moreover, it reduced rates serum lipid (cholesterol and lipoprotein fractions,
triglycerides and alanine aminotransferase). The continued use of MMS during pregnancy can be
considered toxic, damaging the maternal and fetal health, lead to hyperglycemia, fetal loss and
splenic dysfunction interfering with lipid metabolism and immune profile. This study shows that
MMS use is not recommended during pregnancy freely and should be replaced by another
immunosuppressant.
Keywords: Immunosuppression, Mycofelonate sodium, Pregnancy, Wistar rats, Lipid metabolism,
Glucose intolerance.
LISTA DE FIGURAS
Figura 01: Rata da linhagem Wistar -------------------------------------------------------------- 19
Figura 02: Tratamento via oral (gavage) --------------------------------------------------------- 20
Figura 03: Esfregaço vaginal na fase estro com espermatozoides ---------------------------- 21
Figura 04: Pontos de implantação no útero com ausência de fetos -------------------------- 23
Figura 05: Câmara de Neubauer para contagem de leucócitos ------------------------------- 25
Figura 06: Demonstração da técnica para o leucograma e as células analisadas ----------- 25
Figura 07: Teste oral de tolerância à glicose (TOTG) em ratas controle (CONT), ratas
não tratadas (MICO-1) e tratadas (MICO-2) com MMS na dose de 20mg/Kg durante o
período de prenhez. Os dados foram expressos com média ± desvio-padrão ----------------
30
Figura 08: Médias glicêmicas ± desvio-padrão da área sob a curva (ASC) em ratas
controle (CONT), ratas não tratadas (MICO-1) e tratados (MICO-2) com Micofenolato de
Sódio na dose de 20mg/Kg durante a prenhez ---------------------------------------------------
31
LISTA DE TABELAS
Tabela 01: Parâmetros fisiológicos em ratas controle (CONT) e tratadas com MMS na
dose de 20mg/Kg antes do período da gestação --------------------------------------------------
27
Tabela 02: Parâmetros fisiológicos em ratas controle (CONT) não tratadas (MICO-1) e
tratadas (MICO-2) com MMS na dose de 20mg/Kg durante o período de prenhez ---------
29
Tabela 03: Performance reprodutiva de ratas controle (CONT) não tratadas (MICO-1) e
tratadas (MICO-2) com MMS na dose de 20mg/Kg durante o período de prenhez---------
32
Tabela 04: Peso relativo dos órgãos de ratas controle (CONT), não tratadada (MICO-1)
e tratadas (MICO-2) com MMS na dose de 20mg/Kg durante o período de prenhez -------
33
Tabela 05: Parâmetros bioquímicos e imunológico (TNF placentário) de ratas controle
(CONT), não tratadas (MICO-1) e tratadas (MICO-2) com MMS na dose de 20mg/Kg
durante o período de prenhez -----------------------------------------------------------------------
33
Tabela 06: Leucograma de ratas controle (CONT), não tratadas (MICO-1) e tratadas
(MICO-2) com MMS na dose de 20mg/Kg durante o período de prenhez -------------------
34
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ALT – Alanina aminotransferase
AST – Aspartato aminotransferase
GI – Gastrintestinal
HDL – Lipoproteína de alta densidade
IMPDH – Inosina Monofostato Desidrogenase
MMS – Micofenolato de Sódio
MMF – Micofenolato de Mofetil
MPA – Ácido Micofenólico
NK – Célula Natural Killer
RN – Recém nascidos
TNF – Fator de necrose tumoral
TOTG – Teste Oral de Tolerância a Glicose
VLDL – Lipoproteína de muita baixa densidade
SUMÁRIO
1. Introdução ---------------------------------------------------------------------------------- 13
2. Objetivo -------------------------------------------------------------------------------------
2.1 Objetivo Geral -------------------------------------------------------------------------
2.2 Objetivos Específicos -----------------------------------------------------------------
18
18
18
3. Materiais e Métodos -----------------------------------------------------------------------
3.1. Animais ----------------------------------------------------------------------------
3.2. Grupos Experimentais -----------------------------------------------------------
3.3. Sequência Experimental -------------------------------------------------------------
3.3.1. Período de Tratamento Prévio -------------------------------------------
3.3.2. Período de Acasalamento -------------------------------------------------
3.3.3. Período de Prenhez --------------------------------------------------------
3.3.4. Avaliação da Toxicidade -------------------------------------------------
3.4. Resolução da Prenhez -----------------------------------------------------------
3.5. Coleta de Material e Parâmetros Reprodutivos ------------------------------
3.6. Teste de Confirmação dos Sítios de Implantação e de Reabsorções ------
3.7. Análises Séricas Materna -------------------------------------------------------
3.8. Análises Estatística --------------------------------------------------------------
19
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20
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24
26
4. Resultados ---------------------------------------------------------------------------------- 27
5. Discussão ----------------------------------------------------------------------------------- 35
6. Conclusão ----------------------------------------------------------------------------------- 40
7. Referências Bibliográficas --------------------------------------------------------------- 41
8. Anexos -------------------------------------------------------------------------------------- 47
13
1. INTRODUÇÃO
A gestação normal está associada a uma reorientação das propriedades biológicas,
acarretando em acentuadas mudanças no organismo materno, incluindo a composição bioquímica
e também em seu perfil imunológico para se adaptar a presença fetal (BELARMINO et al., 2009;
SINZATO et al., 2012). Com isso, cuidados extras devem ser tomados durante este período a fim
de evitar malformações fetais e também casos de abortos (SINZATO et al., 2012).
Além disso, há uma necessidade aumentada de nutrientes essenciais, pois o inadequado
aporte energético da gestante pode levar a uma competição entre a mãe e o feto, limitando a
disponibilidade dos nutrientes necessários ao adequado crescimento fetal (DAMASCENO et al.,
2011). Portanto, a literatura é consensual ao reconhecer que o estado nutricional materno é
indicador de saúde e qualidade de vida tanto para a mulher quanto para o desenvolvimento fetal,
uma vez que a única fonte de nutrientes do concepto é constituída pelas reservas nutricionais e
ingestão alimentar materna (MELO et al., 2007). Devido às adaptações fisiológicas que ocorrem
na gravidez, alguns marcadores bioquímicos apresentam-se naturalmente alterados, sem que isso
seja motivo para o aparecimento de patologias (VITOLO, 2008).
A placenta humana desempenha um papel central na regulação do crescimento fetal, sendo
esta capaz de oferecer nutrientes para o feto (MOLTENI et al., 1978; GICHANGI et al., 1993).
Este órgão proporciona a difusão de nutrientes e oxigênio do sangue materno para o sangue fetal,
além da difusão de excretas fetais de volta para a mãe. É captado para o feto glicogênio, proteínas,
lipídios e alguns minerais necessários para seu desenvolvimento embrionário (SINZATO et al.,
2012).
O metabolismo lipídico na gestação apresenta predomínio da lipólise materna e intolerância
à glicose, a fim de auxiliar o desenvolvimento fetal e como consequência, encontram-se elevados
níveis lipídicos no sangue (SAUNDERS et al., 2002; CAMPOS et al., 2007). O metabolismo
lipídico apresenta maiores ajustes no terceiro trimestre da gestação (período catabólico), para que
o organismo materno utilize lipídios armazenados para a manutenção das necessidades energéticas
no estado pós-absortivo. Isso minimiza o catabolismo proteico e preserva a glicose e os
aminoácidos essencialmente para o feto. A mobilização dos depósitos de gordura do tecido adiposo
é estimulada, aumentando os níveis plasmáticos de ácidos graxos livres e de glicerol. No fígado,
os ácidos graxos livres são convertidos em triglicérides e retornam à circulação na forma de
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lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDLs). O glicerol é o principal substrato para a
gliconeogênese, conservando aminoácidos para o feto (DUGGLEBY & JACKSON, 2002;
PRENTICE & GOLDBERG, 2009).
De acordo com as alterações bioquímicas descritas durante o período catabólico
gestacional, é de suma importância a avaliação do perfil bioquímico geral materno durante a
gestação, pois as sutis alterações bioquímicas podem afetar o desenvolvimento biológico e até vital
do feto.
Deve-se também levar em conta as alterações no sistema imunológico materno, já que o
sucesso gestacional depende da equilibrada interação entre populações celulares e mediadores
presentes na unidade materno-fetal, sendo determinante a participação da decídua neste processo
(DAHER & MATTAR, 2009), como por exemplo, Fator de Necrose Tumoral (TNF) e as demais
citocinas. Para que a gestação venha a termo, é necessário que o organismo da mãe suporte ao
desenvolvimento de “um corpo estranho” (neste caso, o concepto) no seu interior (PASTORE et
al., 2012). Sabe-se que há uma intrincada rede imunorregulatória que precisa ser acionada para que
o organismo materno possa tolerar esta nova presença, permitindo a implantação e manutenção do
concepto até o nascimento (MICHELON et al., 2006). Diversos estudos demonstram que o padrão
imunológico é variável ao longo da gestação e que seus efeitos observados dependem da
concentração, da dose e do período expostos (DAHER et al., 1999).
Segundo Luppi et al. (2002), com o avanço da gestação, há uma ativação progressiva do
sistema imunológico inato materno, caracterizada pelo aumento no número de granulócitos
circulantes, por uma maior atividade fagocítica destes granulócitos, pela mudança no perfil de
antígenos de superfície expressos pelos monócitos e pela produção seletiva de citocinas por estas
mesmas células. Conforme o mesmo estudo, nesse período também ocorre uma supressão do
sistema imunológico adaptativo, marcada pela diminuição na ativação dos linfócitos T, a qual é
evidenciada pela diminuição na produção de citocinas pró-inflamatórias. A soma deste conjunto
de fatores torna a gestante tolerante aos antígenos paternos expressos pelo feto, o que possibilita a
aceitação do mesmo e a manutenção da gravidez (LUPPI et al., 2002). Além disso, fatores
imunomodulatórios para a tolerância e regulação do desenvolvimento fetal e formação da placenta,
como hormônios e citocinas, agem no organismo materno atuando em células Natural Killer
uterinas (NK), na atividade dos linfócitos T regulatórios e no reconhecimento das moléculas do
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Complexo Principal de Histocompatibilidade paterno (expressas pelo embrião) (MICHELON et
al., 2006).
O TNF sintetizado no aparelho reprodutor feminino parece ser importante para a
manutenção/diferenciação placentária, para o desenvolvimento embrionário e para o parto. Por
outro lado, TNF pode promover trombose impedindo a irrigação necessária para o
desenvolvimento fetal, podendo causar até necrose no embrião (WEGMANN et al., 1993).
Portanto, os níveis de TNF são importantes no transcorrer do período gestacional (ABBAS et al.,
2012).
Tendo em vista a vulnerabilidade do processo reprodutivo frente a substâncias químicas,
pesquisas com medicamentos que possam afetar a reprodução humana despertam grande interesse
científico. O desenvolvimento de estratégias de imunossupressão durante as últimas quatro décadas
reflete um enorme progresso em compreender os mecanismos celulares e moleculares que medeiam
a rejeição do enxerto (KAHAN, 2009).
O marco inicial do progresso no resultado dos transplantes se deu na década de 80, com a
liberação do uso de ciclosporina (ARMENTI, 2004). A partir deste evento, uma série de novos
imunossupressores vêm sendo pesquisados, alguns já em uso clínico e outros ainda em fase de
estudo experimental e pré-clínica. Devido ao número de fármacos disponíveis, a imunossupressão
atual é individualizada para cada tipo de transplante, baseando-se nas variáveis do receptor e do
doador de órgãos (RAMOS, 2007).
Os imunossupressores atuais utilizados são classificados em: inibidores da calcineurina
(Tacrolimo e Ciclosporina); agentes anti-proliferativos (Azatioprina, Micofenolato Mofetil e
Micofenolato de Sódio); inibidores da mTOR (Sirolimo e Everolimo) e; corticosteroides
(Prednisona) (US, 2013).
O ácido micofenólico (MPA) tem se mostrado uma ferramenta muito útil em tratamento
com imunossupressores desde a sua introdução em 1995. O micofenolato de mofetil (MMF) é uma
pró-droga do ácido micofenólico (MPA), que foi isolado a partir de uma espécie de fungo
Penicillium (ALISSON & EUGUI, 2005). MMF é uma formulação de MPA, que melhorou os
resultados de curto e longo prazo no transplante renal, mas está associado a complicações
gastrintestinais (GI) que podem levar à redução da dose ou a interrupção do tratamento, com um
consequente impacto negativo sobre a incidência de perda do enxerto, sendo relatada em até 45%
dos pacientes, bem como evidência de que estas complicações podem resultar numa diminuição na
16
adesão à medicação e sobrevida do paciente (BEHREND, 2001). Com revestimento entérico,
Micofenolato de Sódio (MMS) é uma formulação do MPA, que proporciona a mesma eficácia de
benefícios como MMF, com o potencial de reduzir os graves sintomas gastrintestinais (GI) e assim
mantendo a segurança do paciente (BJARNASON, 2001).
MMF é o único entre os medicamentos de transplante que tem capacidade de inibir a
atividade de linfócitos T e B (LU et al., 2008; BAO et al., 2008). Inibe a proliferação de linfócitos
T, diminuindo a produção de Guanosina, e em última análise, a síntese de DNA, também tem
mostrado aumentar a apoptose em linfócitos T humanos, especificamente em linfócitos T ativados
(ALISSON, 2005). Tal como acontece com os linfócitos T, inibe a via de inibição de IMPDH
(Inosina Monofosfato Desidrogenase), e assim a síntese de linfócitos B (EUGGI et al., 1991). MMF
progressivamente tornou-se o mais comum imunossupressor adjuvante para tacrolimus (MEIER-
KRIESCHE et al., 2006), e provavelmente mudou o perfil cardiovascular do inibidor da
calcineurina. A descoberta de MMF, provou ser um adição útil no arsenal da imunossupressão.
Distúrbios GI (dispepsia, diarreia) e supressão da medula óssea são os seus principais efeitos
adversos, o que requer a redução da dose ou mesmo retirada (LESLIE et al., 2007).
As células "T", as células "B" e células GI, utilizam a via de salvamento para completar o
ciclo celular, tendo preso a produção / proliferação de células T e B, desta forma Micofenolato de
Sódio confere imunossupressão. A proliferação de células GI é também afetada, causando uma
diminuição em formação de vilosidades e desse modo uma redução na sua absorção (AIYANGAR
et al., 2010). Portanto, enquanto que a inibição de IMPDH pode desempenhar um bom papel,
processos adicionais podem estar envolvidos na mediação dos efeitos gastrintestinais (DAVIES et
al., 2007).
Modelos animais são representados com uma excelente ferramenta e muito bem aplicados
para representar o organismo humano (QUINN, 2005). Entre as características para um bom
modelo animal, estão: simplicidade, baixo custo, fácil manipulação e que principalmente, seja
possível a observação de mudanças no funcionamento geral do organismo para que se obtenha
resultados conclusivos (MERWIND-LADET et al., 2009). Um modelo de grande potencial para
estudos são os ratos, em especial o Rattus novegicus albinus, da linhagem Wistar, devido a
semelhança da sua fisiologia com a do ser humano (PIRET & THAKKER, 2011).
Embora, os resultados muitas vezes teratogênicos em animais não traduzem a teratologia
humana, mesmo em doses equivalentes em humanas, com a metade de todas as gestações não
17
planejadas, muitas mulheres engravidam durante o uso de medicação (SIFONTIS et al., 2006;
PÉRGOLA et al., 2001; PEREZ-AYRTES et al., 2008; LE RAY et al., 2004). Há pouca
informação disponível sobre o efeitos tóxicos e teratogênicos do Micofenolato de Sódio no estudo
relacionado com a fertilidade e a gestação da mulher, embora o conhecimento aumentou
recentemente como mais mulheres mantidas em terapia imunossupressora para transplantes de
órgãos sólidos optaram por engravidar.
Para compreender os mecanismos envolvidos no tratamento com imunossupressores no
perfil bioquímico e imunológico materno, torna-se de grande interesse desenvolver um modelo
experimental com ratas prenhes tratadas com Micofenolato de Sódio antes da gestação, a fim de
estudar seus efeitos biológicos positivos e/ou negativos na gestação, podendo talvez influenciar ou
não o desenvolvimento fetal.
18
2. OBJETIVOS
2.1 Geral
Avaliar os efeitos da imunossupressão materna pela administração de Micofenolato de
Sódio no perfil reprodutivo, bioquímico e imunológico em ratas Wistar prenhes.
2.2 Específicos
Analisar a influência do tratamento com Micofenolato de Sódio nos seguintes parâmetros:
• Parâmetros ponderais maternos:
- Peso (g)
- Consumo alimentar (g) e hídrico (mL)
- Glicemia (mg/dL)
• Pesos relativos de órgãos maternos :
- Rins (g/100g pc)
- Baço (g/100g pc)
- Fígado (g/100g pc)
- Coração (g/100g pc)
- Gordura periovariana (g/100g pc)
• Índices reprodutivos:
- Índice de fertilidade feminina (%)
- Índice de prenhez (%)
- Índice de parto (%)
• Análises bioquímicas:
- Colesterol total (mg/dL)
- Triglicerídeos (mg/dL)
- Lipoproteínas: Densidade alta (HDL) e de Densidade muito baixa (VLDL), todos em mg/dL
- Transaminases hepática: Alanina aminotransferase (ALT) e Aspartarto aminotrasnferase (AST),
todos em U/L
• Análises imunológicas
- TNF
- Leucograma (%)
19
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Animais
Foram utilizadas 41 ratas Wistar adultas em idade reprodutiva (90 dias de vida),
provenientes do Laboratório de Fisiologia de Sistemas e Toxicologia Reprodutiva (FisioTox) –
Campus Universitário do Araguaia-UFMT (Figura 01). Estas ratas permaneceram em gaiolas
coletivas de polietileno com capacidade máxima de cinco animais, em temperatura ambiente
regulada em 25°C±2, fotoperíodo de 12 horas e umidade relativa entre 45% a 55%, recebendo água
filtrada e ração ad libitum. Além disso, todos os procedimentos experimentais realizado neste
estudo foram seguidos pelo Guia de Experimentação Animal e aprovados pelo Comitê de Ética no
Uso de Animais desta Universidade, protocolo 23108.045215/2014-39 (Anexo).
3.2. Grupos experimentais
Todas as ratas foram distribuídas aleatoriamente em dois grupos experimentais primários:
- Grupo controle (CONT) (n=10): ratas que receberam diariamente por via oral, água
filtrada, no mesmo volume que o grupo tratado (MICO) de acordo com o peso. Apenas para sofrer
as mesmas condições que as ratas do outro grupo.
- Grupo tratado (MICO) (n=31): ratas tratadas via oral com MMS (20 mg/Kg)
diariamente por no mínimo 15 dias, até o diagnóstico de prenhez.
Figura 01: Rata da linhagem Wistar
20
De acordo com o dignóstico positivo de prenhez, essas ratas foram divididas em três grupos
experimentais:
- Grupo controle (CONT) (n=10): ratas que receberam diariamente por via oral, água
filtrada, no mesmo volume que o grupo MICO-2, de acordo com o peso.
- Grupo tratado 1 (MICO-1) (n=10): ratas que receberam diariamente por via oral, água
filtrada, no mesmo volume que o grupo MICO-2, de acordo com o peso.
- Grupo tratado 2 (MICO-2) (n=12): ratas tratadas via oral com MMS (20 mg/Kg)
diariamente durante os 21 dias de prenhez.
3.3. Sequência experimental
3.3.1 Período de tratamento prévio
As ratas dos grupos MICO-1 e MICO-2 foram tratadas diariamente com Micofenolato de
Sódio (MMF) na dose de 20 mg/Kg, via oral (gavage) por no mínimo 15 dias e o grupo CONT
água (Figura 02). De acordo com Nielsen et al. (2003), após duas semanas de tratamento as ratas
já são diagnosticadas imunossuprimidas, e desta forma, foram colocadas para acasalamento. Foram
avaliados semanalmente o peso corpóreo, consumo alimentar e hídrico e glicemia.
3.3.2 Período de acasalamento
Este período compreendeu uma duração máxima de 7 dias. As ratas foram distribuídas
quatro a quatro em gaiolas de polietileno, com cama de maravalha, na presença de um macho
saudável no final da tarde. Na manhã subsequente, os machos foram retirados e os esfregaços
Figura 02: Tratamento via oral (gavage)
21
vaginais coletados pela introdução de hastes flexíveis com pontas de algodão embebido em solução
fisiológica a 0,9%. A presença de espermatozóides e as características da fase estro do ciclo estral
confirmam o diagnóstico de prenhez, sendo considerado o dia zero (Figura 03). Esta fase é
caracterizada como a fase estrogênica máxima, onde são encontradas apenas células queratinizadas
(VOLPATO et al., 2008; DAMASCENO et al., 2011). O medicamento foi administrado até o
dignóstico de prenhez e durante este período as que não apresentaram diagnóstico positivo de
prenhez foram excluídas.
3.3.3 Período de prenhez
Durante os 21 dias de prenhez, ocorreu o tratamento por via oral (gavage). Para o grupo
CONT e MICO-1, foi administrada água destilada apenas para provocar o estresse fisiológico. Para
o grupo MICO-2, as ratas prenhes receberam diariamente MMS, na dose e período já descritos no
item 2.
Foram mensurados semanalmente o peso corpóreo, consumo alimentar e hídrico e glicemia,
antes e durante a prenhez. No 17° dia de prenhez, para avaliação do desenvolvimento da
intolerância à glicose foi utilizada um marcador empregado rotineiramente na clínica, – teste oral
de tolerância à glicose (TOTG) em todas as ratas. Após jejum prolongado (em torno de 6 horas),
Figura 03: Esfregaço vaginal na fase estro com espermatozóides
22
foi coletada uma gota de sangue para determinação glicêmica por glicosímetro convencional
Prestige IQ® (tempo 0 = jejum). Em seguida, os ratas receberam solução de glicose (200 g/L) via
intragástrica (gavage) na dose de 2,0 g/Kg peso corpóreo. A glicemia foi determinada nos
intervalos 30, 60 e 120 minutos após a administração da solução (MOURA et al., 2002). A resposta
da glicose durante o TOTG foi avaliado pela estimativa total obtida na área sob a curva (ASC)
(CAMPOS et al., 2007).
3.3.4. Avaliação da toxicidade
Durante todo o período experimental, as fêmeas foram examinadas para avaliar sinais
clínicos indicativos de toxicidade materna, tais como piloereção, movimentos estereotipados,
alteração da motilidade do animal, diarréia, perda de peso, redução de consumo de alimento, perdas
sanguíneas vaginais e mortes.
3.4. Resolução da prenhez
Na manhã do 21º dia de prenhez (das 8 às 10 horas da manhã), as ratas foram anestesiadas
com pentobarbital sódico (Hypnol®) a 3% e, posteriormente, submetidas à eutanásia por
decapitação. O sangue total foi colhido para análises de bioquímica, os órgãos (coração, fígado,
baço, rins e gordura periovariana) foram submetidos a pesagem e houve a maceração das placentas
e coleta do sobrenadante para análises imunológicas.
3.5. Coleta de material e Parâmetros reprodutivos
A partir da pesagem dos órgãos foi realizado o cálculo do peso relativo de acordo com a
seguinte equação matemática: [(peso do órgão / peso corporal) x 100]. Após os procedimentos da
coleta de material biológico de todos os grupos (sangue), foram estimados índices reprodutivos
maternos. Os índices de fertilidade, prenhez e de parto foram utilizados para avaliar o efeito do
tratamento com MMS sobre a fertilidade, viabilidade da prenhez e do parto, respectivamente. Os
índices foram apresentados de acordo com os seguintes cálculos matemáticos sugeridos por Clegg
et al. (2001).
Para o cálculo do Índice de fertilidade feminina foram utilizados os números de ratas que
pariram normalmente e o número de ratas postas para acasalamento com machos no período
noturno:
23
Índice de fertilidade feminina= N° de fêmeas que pariram x 100
N° total de fêmeas
A fim de determinar o Índice de parto, foram utilizados os números de ratas que pariram
normalmente e o número de ratas prenhes (diagnóstico positivo de prenhez pelo exame histológico
de esfregaço vaginal):
Índice de parto= N° de fêmeas que pariram x 100
N° de fêmeas prenhes
Para se estimar o Índice de prenhez, foram utilizados os números de ratas que apresentaram
RN vivos e também o número de ratas prenhes (diagnóstico positivo de prenhez pelo exame
histológico de esfregaço vaginal):
Índice de prenhez= N° de ratas-mães com RN vivos x 100
N° de fêmeas prenhes
3.6.. Teste para confirmação dos sítios de implantações e de reabsorções
No caso de ausência de desenvolvimento fetal ou de pontos de implantações visíveis, o
útero foi então colocado em reativo de Salewski (1964) para coloração dos pontos de implantação
(Figura 8).
Figura 04: Pontos de implantação no útero com ausência de fetos
24
3. 7. Análises séricas materna
Para determinação dos parâmetros bioquímicos, as amostras de sangue coletadas foram
colocadas em tubos de ensaio livres de anticoagulante e então centrifugados a 3500rpm por 10
minutos, o sobrenadante foi coletado como soro e estocado a –80ºC. Para a avaliação da contagem
total de leucócitos foi coletado sangue em tudo com anticoagulante EDTA.
Todos os parâmetros bioquímicos foram mensurados por técnicas utilizando-se a
espectrofotometria de luz, pelo analisador bioquímico Bioplus-2000. As concentrações dos níveis
séricos de Colesterol total (mg/dL), Triglicerídios (mg/dL), HDL-C (mg/dL) (Lipoproteína de alta
densidade) e as transaminases hepáticas ALT (U/L) (Alanina aminotransferase) e AST (U/L)
(Aspartato aminotransferase) foram determinados pelo método enzimático (YOUNG et al., 2000).
Todos os parâmetros foram mensurados pelos Kits de determinação bioquímica da Wiener®.
O valor estimado do nível sérico do VLDL-C (Lipoproteína de densidade muito baixa) foi
determinado baseado nas determinações das concentrações séricas de Triglicerídeos, pelo cálculo
estabelecido por Fridewald et al. (1972), em mg/dL.
VLDL (mg/dL) = Triglicerídios (mg/dL)
5,0
Para análise do perfil de citocinas neste estudo foram coletado o sobrenadante dos tecidos
placentários os quais foram armazenados a uma temperatura de – 80 ºC, que posteriormente foram
avaliados através do método enzyme-liked immunoabsorbent assay (DuoSet ELISA) de captura (R
& D System, Inc., Minneapolis, USA) que se baseia na interação anticorpo-antígeno TNF. Para a
dosagem de citocinas no tecido placentário, uma amostra do tecido foi coletada e macerada,
acrescido de 1 ml de PBS (Tampão fosfato salino). Após a homogeneização, foi centrifugado a
3500 rpm por 10 minutos seguindo metodologia adaptada de LOURENÇO (2009).
No leucograma, para a contagem total de leucócitos, as amostras de sangue com
anticoagulante EDTA foram diluídas (1:20) em solução de TURK (ácido acético a 3%) (STIBBE
et al., 1985). Os leucócitos foram contados em Câmara de Neubauer com auxílio do microscópio
óptico (Figura 05). O resultado foi obtido com a equação matemática:
Leucócitos x mm3 de sangue = Lc. x 20 x 10
25
4
Na qual:
Lc= número total de leucócitos contados em 4mm2 ;
4= fator de conversão para 1mm3;
20= fator de conversão da diluição utilizada;
10= fator de conversão para 1mm3 (profundidade da lâmina).
Para contagem diferencial de leucócitos foi utilizada a metodologia do esfregaço sanguíneo.
Para coloração do esfregaço foi utilizado o kit Panótico Rápido LB (Laborclin Ltda, BR). Os
diferentes elementos foram determinados por contador eletrônico KACIL com teclas
correspondentes a cada tipo de célula (LEANDRO et al., 2006). (Figura 06).
Figura 06: Demonstração da técnica para o leucograma e as células analisadas.
Figura 05: Câmara de Neubauer para contagem de leucócitos
26
3.8. Análise estatística
Para comparação dos valores encontrados nos parâmetros reprodutivos, foi utilizado o teste
de Qui-quadrado, com 5% limite de significância. Em relação os valores médios encontrados nos
parâmetros séricos analisados, foram empregados análises de variância (ANOVA), seguidas do
Teste de Comparações Múltiplas de Tukey, considerando 5% como limite de significância.
(VIEIRA et al.,1997).
27
4. RESULTADOS
Inicialmente foram utilizadas 31 ratas em tratamento com Micofenolato de Sódio, porém
13 vieram a óbito, sendo 10 antes do período gestacional e 3 durante a prenhez, todas do grupo
MICO-2. Além disso, 6 delas não apresentaram diagnóstico positivo de prenhez, tendo os dados
coletados destas ratas descartadas.
A Tabela 01 mostra os dados obtidos semanalmente, durante a fase de tratamento prévio à
gestação. Em relação ao peso corpóreo não houve diferença significativa entre os grupos CONT e
MICO. Porém, quanto ao consumo alimentar e hídrico, houve uma diminuição em relação ao grupo
CONT, e aumento no índice glicêmico.
Tabela 01: Parâmetros fisiológicos em ratas controle (CONT) e tratadas com MMS na dose de
20 mg/Kg antes do período da gestação.
Parâmetros CONT (n=10) MICO (n=22)
Peso corpóreo (g)
Dia 0 246,1±13,8 255,2±14,9
Dia 7 247,3±11,6 256,4±14,7
Dia 14 250,9±8,0 257,2±15,4
Consumo alimentar (g)
Dia 0 17,5±4,3 14,4±3,7#
Dia 7 16,3±2,3 13,2±1,5#
Dia 14 18,6±2,4 15,2±1,2#
Consumo hídrico (mL)
Dia 0 35,0±9,4 33,0±4,2
Dia 7 36,1±5,2 31,7±2,8#
Dia 14 39,4±1,6 35,5±6,8#
Índice glicêmico (mg/dL)
Dia 0 101,0±7,3 99,0±8,5
Dia 7 99,6±6,4 109,3±13,2*#
Dia 14 99,7±7,6 120,0±13,7*#
*diferença significativa comparado ao dia 0 do seu próprio grupo (Teste t de Student) # diferença significativa comparado ao grupo controle; (Teste t de Student)
28
A Tabela 02 mostra os mesmos parâmetros fisiológicos mensurados durante a gestação nos
grupos experimentais, tratados durante a prenhez com água (CONT e MICO-1) ou com 20mg/Kg
de MMS (MICO-2). Em comparação com o dia 0, houve aumento do peso corpóreo nos grupos
CONT e MICO-1 nos dias 14 e 21, sendo no dia 7 aumento mensurado apenas no grupo MICO-1.
O tratamento contínuo com MMS (MICO-2) durante a prenhez fez com que o peso aumentasse até
o 14° dia, mas não até 21 dia. Além disso, as ratas dos grupos MICO-1 e MICO-2 apresentavam
maior peso corpóreo nos dias 0 e 7, mas no dia 14 apenas no grupo MICO-1, em comparação ao
grupo CONT. Contudo, houve uma diminuição de peso corpóreo nos dias 7 e 21 do grupo MICO-
2 em relação aos outros grupos e também uma queda deste valor apenas em comparação as ratas
CONT.
O consumo alimentar também foi alterado na prenhez e/ou durante o tratamento. No grupo
CONT e MICO-1 houve aumento no consumo em todas as semanas em relação ao dia zero e o uso
contínuo do medicamento (MICO-2) resultou em diminuição significativa do consumo apenas no
último dia de prenhez. De forma quase similar, o consumo hídrico também foi alterado, pois
aumentou progressivamente nas semanas subsequentes do grupo CONT em comparação ao
primeiro dia de prenhez. O consumo hídrico do grupo MICO-1 também aumentou nos dias 7 e 14
de prenhez. O uso prévio de MMS fez com que aumentasse o consumo de água no primeiro dia de
prenheez (MICO-1 e MICO-2), porém no transcorrer da gestação o consumo diminuiu.
O uso de MMS alterou drasticamente os valores glicêmicos dos grupos estudados. Tanto os
grupos CONT e MICO-1 apresentaram diminuição glicêmica apenas no último dia de prenhez, em
relação ao dia 0, enquanto que o (MICO-2) tratado antes e durante a prenhez fez com que a glicemia
fosse aumentada em valores compatíveis com o estado de hiperglicemia leve.
29
Tabela 2: Parâmetros fisiológicos em ratas controle (CONT) não tratadas (MICO-1) e tratadas
(MICO-2) na dose de 20 mg/Kg durante o período de prenhez.
*diferença significativa comparado ao seu próprio grupo # diferença significativa comparado ao grupo controle diferença significativa comparado entre os dois grupos tratados
(p<0,05 – ANOVA seguida do Teste de comparações múltiplas de Tukey)
Parâmetros CONT MICO-1 MICO-2
Peso corpóreo (g)
Dia 0 243,8±14,5 264,7±4,8# 252,5±14,9#
Dia 7 246,3±14,5 282,4±3,5*# 268,4±11,5#
Dia 14 276,3±13,4* 312,3±15,0*# 272,9±13,3*
Dia 21 333,1±16,2* 363,5±16,3*# 256,8±13,3#
Consumo alimentar (g)
Dia 0 15,5±1,7 19,8±2,9# 16,4±5,5
Dia 7 19,0±1,0* 23,1±3,7 20,7±5,2
Dia 14 22,8±2,9* 25,6±6,2 22,5±4,0
Dia 21 20,5±2,2* 26,3±5,0 18,9±7,6
Consumo hídrico (mL)
Dia 0 31,0±1,9 37,0±6,7# 46,0±5,6#
Dia 7 41,5±4,1* 46,2±9,1 48,7±8,7
Dia 14 49,0±1,9* 52,2±7,0* 42,5±10,6
Dia 21 49,6±3,2* 52,0±9,1* 37,2±8,7#
Índice glicêmico (mg/dL)
Dia 0 102,5±3,1 116,8±9,2 161,1±22,2#
Dia 7 101,0±8,3 109,3±14,9 166,9±36,5#
Dia 14 94,3±3,5 101,5±10,6 179,4±52,2#
Dia 21 87,1±10,2* 80,5±15,6* 190,2±64,7#
30
As curvas glicêmicas do teste oral de tolerância à glicose (TOTG) de todos os grupos
experimentais estão apresentadas na Figura 07. Comparando-se os tempos glicêmicos 0 e 120
minutos em cada curva, não foram encontradas diferenças significativas p>0,05. Comparando-se
valores glicêmicos no mesmo intervalo de tempo, o tratamento contínuo de MMS (MICO-2)
aumentou mais que duas vezes sua glicemia (p<0,05). Em relação à Figura 08, a quantidade de
glicose percorrida no sangue em 120 minutos foi muito maior que os outros grupos, mostrando que
a hiperglicemia leve se manteve durante o teste.
Figura 07 – Teste oral de tolerância à glicose (TOTG) em ratas controle (CONT), ratas não tratadas
(MICO-1) e tratadas (MICO-2) com MMS na dose de 20mg/Kg durante o período de prenhez. Os
dados foram expressos com média ± desvio-padrão. # diferença significativa comparada ao controle (tempo 0) (p<0,05 – ANOVA seguida do Teste de Tukey) diferença significativa comparada entre o grupo tratado e não tratado (p<0,05 – ANOVA seguida do Teste de Tukey).
0
50
100
150
200
250
0 30 60 120
Gli
cem
ia (
mg/d
L)
Tempo (minutos)
CONT
MICO-1
MICO-2
# # # #
31
Figura 08 – Médias glicêmicas ± desvio-padrão da área sob a curva (ASC) em ratas controle
(CONT), ratas não tratadas (MICO-1) e tratados (MICO-2) com Micofenolato de Sódio na dose de
20mg/Kg durante a prenhez.
#diferença significativa comparada ao controle (tempo 0) (p<0,05 – ANOVA seguida do Teste de Tukey) diferença significativa comparada entre o grupo tratado e não tratado (p<0,05 – ANOVA seguida do Teste de
Tukey).
A Tabela 03 mostra a performance reprodutiva das ratas. Das 10 ratas do grupo CONT,
100% alcançaram o período final, tiveram ninhadas com recém-nascidos (RN) vivos e nenhuma
veio a óbito durante o período de tratamento. Contudo, os grupos MICO-1 e MICO-2 apresentaram
resultados diferenciados, sendo que, no grupo MICO-1, das 14 ratas utilizadas, apenas 10 tiveram
resultado positivo de prenhez, com reabsorções fetais (incluindo-se RN vivos). Quanto ao grupo
MICO-2, das 17 ratas utilizadas, 15 tiveram diagnóstico positivo de prenhez, 03 morreram durante
o tratamento e as outras 12 tiveram reabsorção total.
Com relação a fertilidade feminina, o índice de parto e índice de prenhez no grupo CONT
foi 100%. Os animais do grupo MICO-1 apresentaram diminuição do Índice de fertilidade (37,5%).
O tratamento durante a prenhez (MICO-2) interferiu em todos esses índices, com ausência de
recém-nascidos no processo de laparotomia.
0,0
5000,0
10000,0
15000,0
20000,0
25000,0
30000,0
CONT MICO-1 MICO-1
Gli
cem
ia (
mg/d
L/1
20 m
in)
#
32
Tabela 03. Performance reprodutiva de ratas controle (CONT) não tratadas (MICO-1) e tratadas
(MICO-2) no período de prenhez com Micofenolato de Sódio na dose de 20 mg/Kg.
CONT MICO-1 MICO-2
Ratas utilizadas 10 31
Ratas acasaladas 10 10 15
Ratas com gestação completa
Ratas mortas
Ratas com reabsorção total
Ratas com reabsorção e
recém-nascidos vivos
Ratas com gestação inalterada
10
0
0
02
08
10
0
0
10
0
0*
03*
12*
0
0
Índice de fertilidade 100% 62,5%# 0%#
Índice de parto 100% 100% 0%#
Índice de prenhez 100% 100% 0%#
#diferença significativa comparada ao controle (tempo 0) (p<0,05 – Teste de Qui-quadrado) diferença significativa comparada entre o grupo tratado e não tratado (p<0,05 – Teste de Qui-quadrado).
A tabela 04 mostra a média do peso relativo dos órgãos dos grupos. É possível verificar que
os animais pertencentes ao grupo MICO-1 apresentaram um aumento do peso do fígado em relação
ao grupo CONT. Quanto ao grupo MICO-2, em comparação ao MICO-1, houve aumento do
coração e baço, com diminuição do valor hepático. Já a comparação entre MICO-2 e CONT
mostrou uma diminuição no peso do fígado e da gordura periovariana, porém, houve aumentou do
baço e rim direito.
33
Tabela 04: Peso relativo dos órgãos de ratas controle (CONT), não tratadas (MICO-1) e tratadas
(MICO-2) durante a prenhez na dose de 20mg/Kg de Micofenolato de Sódio.
Órgãos CONT MICO – 1 MICO – 2
Coração (g) 0,33 ± 0,02 0,31 ± 0,03 0,35 ± 0,03
Fígado (g) 3,83 ± 0,38 4,4 ± 0,41# 3,04 ± 0,30#
Baço (g) 0,18 ± 0,02 0,19 ± 0,03 0,24 ± 0,03#
Rim direito (g) 0,28 ± 0,02 0,30 ± 0,02 0,32 ± 0,04#
Rim esquerdo (g)
Gordura Periovariana (g)
0,28 ± 0,02
1,35 ± 0,43
0,28 ± 0,02
1,04 ± 0,24
0,30 ± 0,02
0,92 ± 0,35#
#p<0,05 – diferença estatisticamente significativa comparado ao grupo controle (ANOVA seguida do Teste de
comparações múltiplas de Tukey). diferença estatisticamente significativa entre os grupos tratados
Os parâmetros bioquímicos avaliados no final da prenhez estão apresentados na Tabela 05.
Os níveis séricos de Colesterol Total, Triglicerídios, liporoteínas HDL e VLDL, e também da
atividade enzimática da ALT do grupo MICO-2 apresentaram diminuição de seus valores
comparado entre os grupos CONT e MICO-1. O grupo MICO-1 apresentou apenas uma diminuição
dos níveis séricos da lipoproteína VLDL comparado ao grupo CONT. Quanto aos parâmetros
imunológicos, a concentração de TNF placentário do MICO-1 teve uma diminuição em relação ao
grupo CONT.
Tabela 05: Parâmetros Bioquímico de ratas controle (CONT), não tratadas (MICO-1) e tratadas
(MICO-2) durante a prenhez na dose de 20mg/Kg de Micofenolato de Sódio.
CONT MICO – 1 MICO – 2
Colesterol (mg/dL) 83,5±10,8 78,5±5,4 54,6±7,6#
Triglicérides (mg/dL) 146,0±28,9 180,2±80,0 51,4±8,9#
HDL(mg/dL) 55,0±2,2 51,4±8,9 39,1±5,7#
VLDL(mg/dL) 29,2±5,7 15,2±1,0# 10,2±2,1#
ALT (U/L) 70,7±9,3 72,0±4,1 57,7±12,0#
AST (U/L) 186,2±50,2 153,3±38,0 172,5±26,4
TNF placentário 100,3±24,5 40,8±14,9* -
#p<0,05 – diferença estatisticamente significativa comparado ao grupo controle (ANOVA seguida do Teste de
comparações múltiplas de Tukey). diferença estatisticamente significativa entre os grupos tratados
34
A Tabela 06 mostra o leucograma de todos os grupos experimentais. Embora não foram
encontradas alterações na contagem de linfócito, neutrófilo e eosinófilo, o tratamento com MMS
prévio à prenhez fez com que aumentasse as taxas de monócitos e leucócitos totais e o uso contínuo
de MMS na prenhez aumentou o número de leucócitos totais.
Tabela 06: Leucograma de ratas controle (CONT), não tratadas (MICO-1) e tratadas (MICO-2)
durante a prenhez na dose de 20mg/Kg de Micofenolato de Sódio.
CONT MICO-1 MICO-2
Linfócito (%) 59,6 ± 7,8 61,1 ± 3,1 63,0 ± 5,0
Neutrófilo (%) 35,4 ± 7,5 34,4 ± 1,1 31,6 ± 4,9
Eosinófilo (%) 1,1 ± 0,9 0,9 ± 0,9 0,8 ± 0,9
Monócito (%) 3,5 ± 1,5 5,5 ± 1,4* 4,7 ± 1,5
Leucócitos Totais (103/mm3) 8,2 ± 1,03 12,0 ± 0,72* 12,5 ± 2,8* *p<0,05 – diferença estatisticamente significativa comparado ao grupo controle (ANOVA seguida do Teste de comparações múltiplas de Tukey)
35
5. DISCUSSÃO
A terapêutica medicamentosa durante a gestação tem sido objeto de estudos que
possibilitam estimular a relação risco/benefício de farmacoterapias para gestante e para o feto.
Embora seja reconhecido que menos de 1% dos efeitos congênitos são causados por exposições a
drogas terapêuticas (FRIEDMAN et al., 1990; WEBSTER & FREEMAN, 2001), vários estudos
utilizando diferentes desenhos e números amostrais alertam para o fato de que gestantes continuam
expostas a um grande número de medicações (FONSECA et al., 2002). Evidências sobre os
potencias efeitos na gestação com o uso de imunossupressores mais antigos estão bem
estabelecidos (HOELTZENBEIN, 2012, HOU, 2013), no entanto, informações sobre efeitos de
imunossupressores mais recentes, ainda é escasso.
Sabe-se que alterações da fisiologia materna são capazes de interferir no desenvolvimento
do embrião/feto, ativando funções fisiológicas. Estes abrangem alterações de sinais respiratórios,
atividade motora, convulsão, reflexos, sinais oculares, sinais cardiovasculares, salivação,
piloereção, tônus muscular, analgesia e sinais gastrintestinais e diurese (HAYES, 1994). Sinais de
toxicidade sistêmica podem ser definidos pela diminuição considerável no consumo de água e
ração, associado às alterações comportamentais, apatia, além da redução da massa corpórea e da
evolução ponderal (CUNHA, 2009). Neste estudo foram observados vários sinais toxicológicos
como piloereção, tremores, efeitos sobre a respiração e movimentação, diarréia, perda de peso,
redução de consumo alimentar e hídrico (Tabela 01) e 31% de mortes dos animais durante o
tratamento, com isso, mostrando que o MMS, em seu uso isolado, pode ser prejudicial em vários
sistemas orgânicos.
O monitoramento do peso corpóreo durante o tratamento provê um índice do estado geral
de saúde dos animais (US EPA, 1996). As alterações no peso corpóreo de animais tratados com
xenobióticos podem refletir em efeitos tóxicos, e têm sido utilizadas como indicadores de efeitos
adversos de medicamentos e produtos químicos, especialmente se tal perda for maior do que 10%
do peso inicial (SUBRAMANION, 2011). Neste estudo, as ratas tratadas no período anterior a
prenhez não mostraram mudanças em relação ao peso (Tabela 01). Entretanto, em relação ao
consumo alimentar e hídrico houve uma ingesta menor em relação ao grupo CONT, sendo que a
análise da ingestão de alimentos e água em uma experimentação animal é importante para
36
investigar a segurança das substâncias estudadas com intuito terapêutico (MUKINDA & EAGLES,
2010). Estes resultados indicam a ocorrência de um certo efeito tóxico do medicamento.
Estes parâmetros avaliados já apresentam alterações antes do período gestacional, uma vez
que seu uso durante tal período geralmente é mais agravante na saúde materno-fetal, devido as
inúmeras alterações e vulnerabilidade do organismo neste período. A gestação é caracterizada por
aumento progressivo do ganho de peso materno, decorrente do crescimento do feto e de seus anexos
(em torno de 40%) e também de adaptações próprias do organismo (os 60% restantes),
caracterizadas por um controle biológico próprio materno de um anabolismo no início e
catabolismo ao final da gestação (RUDGE et al., 2000). O perfil de peso mostrou-se alterado entre
os dias de gestação, tendo um ganho gradual até o final da mesma, fato esperado devido ao ganho
normal de peso que ocorre durante este período (CAMPOS et al., 2008), sendo proporcional no
grupo CONT e MICO-1, mostrando que o tratamento anterior a gravidez não veio a prejudicar o
decorrer da gestação.
Já com relação ao grupo MICO-2 o tratamento mostra um outro perfil de peso corpóreo,
uma vez que houve uma diminuição significativa a partir do 14° dia de prenhez em relação ao
grupo CONT e MICO-1. Este período é caracterizado após a organogênese fetal, uma vez que
interferentes exógenos (como o MMS) compromete seu desenvolvimento, podendo provocar
anomalias ou malformações, culminando em perdas fetais (VOLPATO et al., 2009)
Assim como o peso corpóreo, a redução do consumo de alimentos é indício de toxicidade
materna (YAO et al., 2007). Podemos dizer que a diminuição do consumo no grupo MICO-2 foi
devido a um efeito tóxico provocado pelo medicamento ou por alguma propriedade anorexígena
que altere o catabolismo pela via da leptina ou ainda por estimular o sistema nervoso simpático
(RIVEST & RICHARD, 1990). Além disso, não poderia também ser descartado a sugestão de que
o baixo consumo alimentar e hídrico (Tabela 2) se deve ao mau desenvolvimento fetal apresentado
indiretamente pela perda de peso materno no grupo MICO-2.
Outro parâmetro avaliado do início do tratamento até o final da prenhez foi a glicemia. Foi
observado que com a interrupção do MMS, sua glicemia voltou a níveis normais, enquanto que seu
uso continuou aumentando semanalmente, caracterizando um estado de hiperglicemia leve, entre
161 a 190 mg/dL (ADA, 2014).
A hiperglicemia gestacional não controlada é potencialmente prejudicial tanto para a mãe
como para o feto, resultando em uma maior necessidade de partos por cesariana, nascimento de
37
crianças maiores, com excesso de gordura, maior risco de mortalidade infantil e fetal, e um elevado
risco de hipoglicemia do bebê imediatamente após o nascimento (METZGER et al., 2008, 2010).
Gestações normais são associadas com o quadro de intolerância à glicose, que se inicia em
meados da 24ª semana, estendendo-se até o parto, uma condição em que os tecidos periféricos
diminuem a captação glicêmica (METZGER et al., 2007). A fim de estudar a presença desta
intolerância à glicose, foi avaliado neste estudo o Teste de Tolerância Oral a Glicose (TOTG) no
17° dia de prenhez (Figura 7), sendo um método sensível e especifico para seu diagnóstico, pois é
capaz de mimetizar os eventos fisiológicos após uma refeição, sendo até mais indicado do que a
glicemia de jejum (NETO et al., 2011; BORAI et al., 2011; SIEGEL et al., 1980).
O formato da curva mostra a capacidade de absorção e retorno glicêmico durante o TOTG,
demonstrando o desempenho da insulina endógena nos tecidos periféricos (CAMPOS et al., 2007).
Se a glicemia se mantiver elevada após 2 horas da ingestão de glicose, indica que as células estão
intolerantes à glicose (diminuição do retorno glicêmico), pois estas não estão sendo captadas
(MELLO et al, 2001; VALERIO et al., 2006, CAMPOS et al., 2007). Os resultados deste estudo
mostraram que apesar da hiperglicemia leve encontrada em ratos tratados na gestação com MMS,
[e confirmada com a elevação da área sob a curva (Figura 8)], o teste de TOTG apresenta-se normal,
pois o formato da sua curva glicêmica é semelhante ao do grupo CONT. Este grupo tratado possui
característica semelhante às gestantes com complicação diabética na clínica, designadas de Grupo
IIA de Rudge (hiperglicemia de jejum e TOTG normal) (RUDGE & CALDERON, 2006).
A American National Transplantation Pregnancy Registry (NTPR) avaliou 2000 casos de
mulheres grávidas com o uso de imunossupressores. A incidência de defeitos congênitos nos
nascidos vivos mostrou ser semelhante à população em geral, exceto para gestação com o uso do
ácido micofenólico (MPA), apresentando 23% de defeitos congênitos (COSCIA et al., 2010). A
terapia imunossupressora baseada em Ciclosporina ou Tacrolimo, com ou sem esteróides e
Azatioprina pode ser utilizado em mulheres transplantadas durante a gestação, mas Micofenolato
de Mofetila e Sirolimus, não são recomendados com base nas atuais informações fornecidas
(EBPGRN, 2002; HIRACHAN et al., 2012).
O Micofenolato de Mofetila (MMF) está associado com uma alta incidência de
malformações estruturais (COSCIA et al., 2010). Em um estudo de 26 gestações com MMF, 15
tiverem RN vivos e malformação foi relatado em 4 casos (26,7%) (SIFONTIS et al., 2006). Ou
seja, dependendo do período de gestação nos quais substancias tóxicas entram em contato com o
38
organismo materno, essa exposição pode resultar em diferentes respostas que variam desde um
efeito anti-implantação, alterações funcionais ou morfológicas, retardo geral de desenvolvimento,
incidência de malformações até letalidade (DAMASCENO et al., 2008). O grupo MICO-1 da
Tabela 3 não foi totalmente prejudicado, pois seu tratamento prévio com MMS à gestação pode ter
influenciado em alguns aspectos, já que todas as ratas por mais que tiveram RN vivos, apresentaram
também reabsorções. No caso do MICO-2 os resultados foram mais graves, pois durante a prenhez
houveram morte em três ratas, seis não ficaram prenhes e todas as remanescentes apresentaram
reabsorção total, sem filhote algum da próxima geração. Todos estes resultados reforçam o alto
grau de toxicidade deste medicamento apenas na gestação.
Outros sinais de toxicidade podem se expressar pela alteração da massa relativa dos órgãos,
alterações hematológicas e bioquímicas sanguíneas (GONZALEZ & SILVA, 2003). Muitos
medicamentos empregados rotineiramente na clínica podem apresentar, como reação colateral
indesejável, a agressão hepática, preocupando seu uso contínuo (BERTOLAMI, 2005). Neste
estudo, houveram dois perfis hepáticos na Tabela 04, pois o tratamento prévio à gestação aumentou
o peso relativo hepático, ao final da gestação, enquanto que o tratamento contínuo do mesmo fez
com que diminuísse seu valor. Alterações teciduais comprometem em sua funcionalidade, sendo
que por exemplo a hepatotoxicidade prejudica a metabolização de xenobióticos, além de causar
desnutrição proteica e diminuição no ganho de peso decorrente da interferência no aproveitamento
de aminoácidos (OSWEILER, 1998). Porém, em conjunto com os demais parâmetros apresentados
fica demonstrado o efeito tóxico deste medicamento, sendo talvez mais evidente no grupo MICO-
2.
O baço, que se destaca pelas funções de filtração e hematopoiética, também participa do
controle metabólico (PETROIANU et al., 2006). Existem evidências que explicam os possíveis
mecanismos implicados na regulação dos lipídios plasmáticos pelo baço (AVIRAM et al., 1986;
ASAI et al., 1988; SCHMIDT et al., 1997; GOLDFARD et al., 1991; LE-NA et al., 1988). Os
macrófagos esplênicos acumulariam grande quantidade de gordura, mediante aumento da
fagocitose com consequente hipolipidemia. Outra explicação para tal redução lipídica (mostrado
nos níveis séricos de triglicerídios, HDL e VLDL na Tabela 05) seria o efeito imunitário do sistema
mononuclear fagocitário contra estruturas encontradas nas lipoproteínas HDL e LDL, resultando
em sua depuração plasmática (GOLFARD et al, 1991; LE-NA et al, 1988).
39
Além disso, Caligiuri et al. (2002) afirmaram que o baço influencia no metabolismo lipídico
por meio de linfócitos B capazes de produzir anticorpos anti-LDL-colesterol oxidado. Esse
complexo antígeno-anticorpo seria retirado da circulação por macrófagos teciduais, incluindo os
esplênicos. O baço participaria não apenas da depuração dos imunocomplexos, mas também da
produção de anticorpos anti-LDL-colesterol oxidado, por conter a maior parte dos linfócitos B de
memória e por ser o principal local de apresentação antigênica e produção de anticorpos
(GONÇALVEZ et al., 2014), fato este relacionado com os resultados deste estudo, a dose de
20mg/Kg de MMS levou uma hipertrofia esplênica (Tabela 04) acompanhado pela não-diminuição
de linfócitos e consequentemente aumento de leucócitos totais (Tabela 6).
O TNF é uma das citocinas fundamentais no início da gestação, atuando no fenômenos de
implantação do blastocisto e, de maneira adversa, nas perdas de primeiro trimestre. Com a evolução
da gestação, tende a diminuir a sua concentração no organismo materno (DENNEY et al., 2011;
RAGHPATHY, 2001; PERAÇOLI et al., 2007; COUGHLAN et al., 2001). E com o uso de MMS
que foi administrado antes do período de prenhez veio interferir nesse período, comprovando o
efeito do imunossupressor.
40
6. CONCLUSÃO
De acordo com os dados apresentados, este estudo nos permite concluir que o uso de
Micofelonato de Sódio prévio à gestação pode ser indicado pois não possui toxicidade severa,
incluindo poucos efeitos colaterais. Entretanto, seu uso contínuo é considerado tóxico,
prejudicando a saúde materno-fetal, por levar a hiperglicemia, perdas fetais e disfunção esplênica
interferindo no metabolismo lipídico e imunológico. Isto faz com que seu uso não seja livremente
recomendado na gestação, devendo ser substituído por outro imunossupressor.
41
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