MICROPROPAGAÇÃOMICROPROPAGAÇÃO

INTRODUÇÃOINTRODUÇÃO

• Em 1902, Haberlandt postulou a Em 1902, Haberlandt postulou a totipotênciatotipotência celular; celular;

• Esta idéia, associada com a hipótese do Esta idéia, associada com a hipótese do balanço hormonal, proposta por SKOOG & balanço hormonal, proposta por SKOOG & MILLER (1957), tem tornado possível o MILLER (1957), tem tornado possível o estudo da morfogênese “in vitro” e sua estudo da morfogênese “in vitro” e sua aplicação mais prática, a aplicação mais prática, a micropropagação.micropropagação.

CONCEITOCONCEITO• Micropropagação é o desenvolvimento de Micropropagação é o desenvolvimento de

novas plantas em um meio artificial sob novas plantas em um meio artificial sob condições assépticas, a partir de pequenos condições assépticas, a partir de pequenos propágulos (explantes); propágulos (explantes);

• Para as frutíferas, as partes mais Para as frutíferas, as partes mais empregadas são ápices caulinares, micro-empregadas são ápices caulinares, micro-estacas, embriões, calos celulares;estacas, embriões, calos celulares;

• A cultura de tecidos difere dos métodos A cultura de tecidos difere dos métodos tradicionais, a micropropagação emprega tradicionais, a micropropagação emprega propágulos pequenos, controle asséptico, propágulos pequenos, controle asséptico, controle do meio ambiente e rápida controle do meio ambiente e rápida multiplicação das frutíferas, quando multiplicação das frutíferas, quando comparada com os métodos tradicionais.comparada com os métodos tradicionais.

FASES DA MICROPROPAGAÇÃOFASES DA MICROPROPAGAÇÃO• A rápida multiplicação em cultura de tecido A rápida multiplicação em cultura de tecido

pode ocorrer devido:pode ocorrer devido:1.1. A um aumento da formação de brotações A um aumento da formação de brotações

axilares, seguido do enraizamento individual axilares, seguido do enraizamento individual destas brotações;destas brotações;

2.2. À produção de brotações adventícias, também À produção de brotações adventícias, também seguida de enraizamento destas brotações;seguida de enraizamento destas brotações;

3.3. À embriogênese de células somáticas.À embriogênese de células somáticas.• DEBERG & MAENE (1981) enfatizam que cinco DEBERG & MAENE (1981) enfatizam que cinco

fases são importantes para a micropropagação fases são importantes para a micropropagação eficiente de uma espécie, sendo elas:eficiente de uma espécie, sendo elas:

ESTÁDIO 0: FASE PREPARATIVAESTÁDIO 0: FASE PREPARATIVA• Esta fase compreende o cultivo das matrizes Esta fase compreende o cultivo das matrizes

em condições especiais de higiene;em condições especiais de higiene;

• Deve-se ter plantas matrizes crescendo em Deve-se ter plantas matrizes crescendo em vasos ou outros recipientes, em casa de vasos ou outros recipientes, em casa de vegetação com cobertura de vidro ou plástico;vegetação com cobertura de vidro ou plástico;

• Não se deve fazer uso da irrigação por Não se deve fazer uso da irrigação por aspersão, mas fornecer água para as plantas aspersão, mas fornecer água para as plantas diretamente no vaso por capilaridade.diretamente no vaso por capilaridade.

ESTÁDIO 0: FASE PREPARATIVA ESTÁDIO 0: FASE PREPARATIVA (cont.)(cont.)

• O impacto deste estádio inicial aparentemente não limita O impacto deste estádio inicial aparentemente não limita somente a condição sanitária da planta, mas também a somente a condição sanitária da planta, mas também a percentagem de sobrevivência na fase seguinte;percentagem de sobrevivência na fase seguinte;

• Recomenda-se, ao coletar o propágulo, desprovê-lo de Recomenda-se, ao coletar o propágulo, desprovê-lo de suas folhas para, em seguida, usar agentes esterilizantes. suas folhas para, em seguida, usar agentes esterilizantes. No entanto, as cicatrizes deixadas pela retirada das folhas No entanto, as cicatrizes deixadas pela retirada das folhas tornam-se uma porta aberta para a entrada de patógenos; tornam-se uma porta aberta para a entrada de patógenos;

• Assim, empregando-se esta fase, pode-se desinfestar o Assim, empregando-se esta fase, pode-se desinfestar o material sem a retirada das folhas que conterão um material sem a retirada das folhas que conterão um menor número de inóculos, o que, conseqüentemente, menor número de inóculos, o que, conseqüentemente, redundará em uma maior sobrevivência.redundará em uma maior sobrevivência.

• Alguns parâmetros afetam sensivelmente a planta matriz Alguns parâmetros afetam sensivelmente a planta matriz de onde será coletado o propágulo. Entre eles, podem ser de onde será coletado o propágulo. Entre eles, podem ser citados:citados:

LUZLUZ

• Os segmentos foliares provenientes Os segmentos foliares provenientes de plantas estoques (matrizes) de plantas estoques (matrizes) tratadas com luz vermelha produzem tratadas com luz vermelha produzem mais brotações por explante do que mais brotações por explante do que plantas não-tratadas.plantas não-tratadas.

TEMPERATURATEMPERATURA

• Tem sido mostrado que plantas Tem sido mostrado que plantas lenhosas podem ser induzidas a lenhosas podem ser induzidas a surtos de novos crescimentos surtos de novos crescimentos quando colocadas em temperaturas quando colocadas em temperaturas de 4 a 5 ºC por um período de tempo de 4 a 5 ºC por um período de tempo equivalente àquele necessário para a equivalente àquele necessário para a quebra natural de dormência.quebra natural de dormência.

PRÉ-TRATAMENTO COM PRÉ-TRATAMENTO COM REGULADORES DE CRESCIMENTOREGULADORES DE CRESCIMENTO

• A reatividade do explante logo após o estádio A reatividade do explante logo após o estádio 0, ou seja, no estádio 1, pode ser controlada 0, ou seja, no estádio 1, pode ser controlada por um tratamento apropriado com por um tratamento apropriado com reguladores de crescimento da planta estoque, reguladores de crescimento da planta estoque, das fontes de explantes ou próprio explante.das fontes de explantes ou próprio explante.

• Manipulações podem mudar a fisiologia das Manipulações podem mudar a fisiologia das estacas de árvores velhas, de tal forma que estacas de árvores velhas, de tal forma que elas se tornam propícias para uma propagação elas se tornam propícias para uma propagação clonal comercial. Embora útil para a clonal comercial. Embora útil para a propagação comercial, os propágulos não se propagação comercial, os propágulos não se comportam de forma juvenil semelhante aos comportam de forma juvenil semelhante aos seedlings.seedlings.

ESTÁDIO 1: INÍCIO DO CULTIVOESTÁDIO 1: INÍCIO DO CULTIVO• A finalidade deste estádio é iniciar o A finalidade deste estádio é iniciar o

cultivo ascênico. Nesta fase, deve ser cultivo ascênico. Nesta fase, deve ser dada atenção para:dada atenção para:

• EXPLANTE: a escolha recai geralmente nas EXPLANTE: a escolha recai geralmente nas gemas apicais ou axilares. O estádio de gemas apicais ou axilares. O estádio de desenvolvimento do explante é de suma desenvolvimento do explante é de suma importância. A idade da planta matriz, a importância. A idade da planta matriz, a idade fisiológica do explante ou seu idade fisiológica do explante ou seu estádio de desenvolvimento, assim como estádio de desenvolvimento, assim como seu tamanho, podem determinar o seu tamanho, podem determinar o sucesso deste procedimento.sucesso deste procedimento.

• REAÇÕES DE HIPERSENSIBILIDADE: Quando REAÇÕES DE HIPERSENSIBILIDADE: Quando os tecidos são expostos a condições de os tecidos são expostos a condições de estresse, o metabolismo de compostos estresse, o metabolismo de compostos fenólicos é estimulado. Isto leva a reações de fenólicos é estimulado. Isto leva a reações de hipersensibilidade, tais como a liberação do hipersensibilidade, tais como a liberação do conteúdo nas células danificadas, as reações conteúdo nas células danificadas, as reações nas células vizinhas, mas, sem mostrar nas células vizinhas, mas, sem mostrar sintomas de danos, e/ou a morte prematura sintomas de danos, e/ou a morte prematura de células específicas no lugar do ferimento de células específicas no lugar do ferimento ou o lugar de infecção.ou o lugar de infecção.

• De um modo geral, de acordo com RHODES & De um modo geral, de acordo com RHODES & WOOLTORTON (1978), há três tipos possíveis WOOLTORTON (1978), há três tipos possíveis de resposta ao estresse ou dano: Oxidação de resposta ao estresse ou dano: Oxidação de compostos fenólicos pré-formados, de compostos fenólicos pré-formados, ocorrendo a formação de quinonas e material ocorrendo a formação de quinonas e material polimerizado, síntese de monofenóis e síntese polimerizado, síntese de monofenóis e síntese de derivados de polifenóis.de derivados de polifenóis.

SÍNTESE DE MONOFENÓISSÍNTESE DE MONOFENÓIS • Pode levar ao acúmulo de maiores Pode levar ao acúmulo de maiores

quantidades de produtos pré-formados nos quantidades de produtos pré-formados nos tecidos não danificados ou ao tecidos não danificados ou ao aparecimento de novos produtos que aparecimento de novos produtos que desempenham um papel no mecanismo de desempenham um papel no mecanismo de proteção do tecido contra a contaminação proteção do tecido contra a contaminação (fitoalexinas). O papel destes produtos já (fitoalexinas). O papel destes produtos já mencionados pode ser o de formar uma mencionados pode ser o de formar uma barreira física contra a invasão (lignina), ou barreira física contra a invasão (lignina), ou um inibidor de crescimento microbiano um inibidor de crescimento microbiano (quinonas, fitoalexinas).(quinonas, fitoalexinas).

COMPOSTOS FENÓLICOSCOMPOSTOS FENÓLICOS • Um grupo especial de compostos fenólicos são Um grupo especial de compostos fenólicos são

as auxinas protetoras (antioxidantes que inibem as auxinas protetoras (antioxidantes que inibem a oxidação do AIA catalizado pelas peroxidases). a oxidação do AIA catalizado pelas peroxidases).

• Numa planta intacta, há um gradiente na Numa planta intacta, há um gradiente na inibição da degradação enzimática do AIA que é inibição da degradação enzimática do AIA que é inversamente proporcional à idade do tecido. inversamente proporcional à idade do tecido. Isto mostra que a inibição diminui em direção à Isto mostra que a inibição diminui em direção à base do caule, ou a concentração de auxinas base do caule, ou a concentração de auxinas protetoras é maior nas folhas mais novas e nos protetoras é maior nas folhas mais novas e nos internódios. internódios.

• De um modo geral, os fenólicos são produtos De um modo geral, os fenólicos são produtos facilmente oxidados. Tais produtos podem ser facilmente oxidados. Tais produtos podem ser fitotóxicos, ou mesmo aumentar os processos de fitotóxicos, ou mesmo aumentar os processos de oxidação, porque depois de ocorrer a oxidação, oxidação, porque depois de ocorrer a oxidação, eles se tornam oxidantes muito fortes. eles se tornam oxidantes muito fortes.

COMPOSTOS FENÓLICOS (cont.)COMPOSTOS FENÓLICOS (cont.)

• Pelo que foi visto, fica claro que, com Pelo que foi visto, fica claro que, com respeito ao cultivo de tecidos, os respeito ao cultivo de tecidos, os objetivos são de dois tipos: primeiro, objetivos são de dois tipos: primeiro, deve-se tentar ter as auxinas protetoras deve-se tentar ter as auxinas protetoras dentro do tecido para estimular o dentro do tecido para estimular o crescimento; após, deve-se limitar a crescimento; após, deve-se limitar a biossíntese de compostos fenólicos, ou biossíntese de compostos fenólicos, ou quando eles são liberados no meio de quando eles são liberados no meio de cultura, deve-se aumentar o período cultura, deve-se aumentar o período necessário para iniciar sua oxidação. necessário para iniciar sua oxidação.

COMPOSTOS FENÓLICOS (cont.)COMPOSTOS FENÓLICOS (cont.)• GEORGE & SHERRINGTON (1984) mostram alguns passos GEORGE & SHERRINGTON (1984) mostram alguns passos

para se evitar o escurecimento do tecido e do meio, na para se evitar o escurecimento do tecido e do meio, na fase 1 da micropropagação:fase 1 da micropropagação:

1.1. Remoção dos compostos fenólicos produzidos (lixiviação, Remoção dos compostos fenólicos produzidos (lixiviação, adsorção com carvão ativado ou polivinilpirrolidona);adsorção com carvão ativado ou polivinilpirrolidona);

2.2. Modificação do potencial redutor (agentes redutores ou Modificação do potencial redutor (agentes redutores ou menos oxigênio disponível);menos oxigênio disponível);

3.3. Inativação (agentes quelantes) ou redução da atividade Inativação (agentes quelantes) ou redução da atividade da enzima fenolase (baixo pH, escuridão, entre outros).da enzima fenolase (baixo pH, escuridão, entre outros).

4.4. Nem todo antioxidante é eficaz nesta fase (o ácido Nem todo antioxidante é eficaz nesta fase (o ácido ascórbico);ascórbico);

5.5. O manganês (MnO manganês (Mn++++, um cofator de peroxidases) e o cobre , um cofator de peroxidases) e o cobre (Cu(Cu++++, parte da complexa enzima fenolase), podem , parte da complexa enzima fenolase), podem estimular a oxidação de fenóis. estimular a oxidação de fenóis.

ESTÁDIO 2: MULTIPLICAÇÃOESTÁDIO 2: MULTIPLICAÇÃO• Nesta fase, cultivam-se brotações com a finalidade de Nesta fase, cultivam-se brotações com a finalidade de

aumentar o número de estacas. Aqui, podem ocorrer aumentar o número de estacas. Aqui, podem ocorrer inúmeros subcultivos até atingir um número de inúmeros subcultivos até atingir um número de brotações que serão enraizadas. Pretende-se, nesta brotações que serão enraizadas. Pretende-se, nesta fase, obter brotações alongadas e aptas para a fase de fase, obter brotações alongadas e aptas para a fase de enraizamento;enraizamento;

• Para a maioria das frutíferas, o método mais usado é o Para a maioria das frutíferas, o método mais usado é o da formação adventícia de caules (facilita grandemente da formação adventícia de caules (facilita grandemente e de forma rápida o aumento de propágulos); e de forma rápida o aumento de propágulos);

• Para cada espécie, no entanto, tem-se que determinar Para cada espécie, no entanto, tem-se que determinar se este sistema produz plantas com as mesmas se este sistema produz plantas com as mesmas características genéticas da planta-mãe; características genéticas da planta-mãe;

• A calogênese axilar também é empregada na A calogênese axilar também é empregada na micropropagação e garante a obtenção de indivíduos micropropagação e garante a obtenção de indivíduos com idêntica composição genética da planta matriz.com idêntica composição genética da planta matriz.

Figura 1: diagrama da produção de mudas advindas da micropropagação de gemas terminais e axilares.

ESTÁDIO 2: MULTIPLICAÇÃO (cont.)ESTÁDIO 2: MULTIPLICAÇÃO (cont.)

• Nessa fase, uma dosagem excessiva de Nessa fase, uma dosagem excessiva de citocinina ou a escolha inadequada de uma citocinina ou a escolha inadequada de uma citocinina poderá ser responsável pelo citocinina poderá ser responsável pelo aparecimento de plantas epigenéticas que só aparecimento de plantas epigenéticas que só poderão ser avaliadas no final do processo; poderão ser avaliadas no final do processo;

• RANCILLAC et al (1987) observaram que um RANCILLAC et al (1987) observaram que um número elevado de subcultivos do número elevado de subcultivos do morangueiro “in vitro” resulta em sérios morangueiro “in vitro” resulta em sérios distúrbios, tais como ausência ou fraco distúrbios, tais como ausência ou fraco enraizamento, formação excessiva de flores, enraizamento, formação excessiva de flores, frutos pequenos e deformados e plantas frutos pequenos e deformados e plantas heterogêneas.heterogêneas.

ESTÁDIO 3: ALONGAMENTO E ESTÁDIO 3: ALONGAMENTO E INDUÇÃO DE RAIZ OU INDUÇÃO DE RAIZ OU DESENVOLVIMENTODESENVOLVIMENTO

• Nem sempre o alongamento das brotações é Nem sempre o alongamento das brotações é necessário. Às vezes, a simples transferência das necessário. Às vezes, a simples transferência das brotações para um meio com ausência de citocininas brotações para um meio com ausência de citocininas é o suficiente para causar alongamento. A auxina é o é o suficiente para causar alongamento. A auxina é o regulador de crescimento utilizado na fase de indução regulador de crescimento utilizado na fase de indução de raízes; de raízes;

• As auxinas mais amplamente utilizadas nesta fase As auxinas mais amplamente utilizadas nesta fase são: AIB (ácido indolbutírico). AIA (ácido indolacético) são: AIB (ácido indolbutírico). AIA (ácido indolacético) e ANA (ácido naftalenacético). A etapa após a indução e ANA (ácido naftalenacético). A etapa após a indução radicular é a iniciação radicular, que geralmente não radicular é a iniciação radicular, que geralmente não precisa ocorrer em presença de auxina;precisa ocorrer em presença de auxina;

• McCOMB & NEWTON (1981) sugeriam o emprego de McCOMB & NEWTON (1981) sugeriam o emprego de substratos inertes para esta fase de enraizamento, ao substratos inertes para esta fase de enraizamento, ao invés do ágar comumente empregado.invés do ágar comumente empregado.

ESTÁDIO 4: TRANSFERÊNCIA PARA ESTÁDIO 4: TRANSFERÊNCIA PARA AS CONDIÇÕES DE CASA DE AS CONDIÇÕES DE CASA DE

VEGETAÇÃOVEGETAÇÃO• As plântulas que durante todo o tempo cresceram As plântulas que durante todo o tempo cresceram

em condições totalmente artificiais, agora passam em condições totalmente artificiais, agora passam para condições naturais (FASE CRÍTICA);para condições naturais (FASE CRÍTICA);

• Essa mudança, por ser brusca, deve ocorrer Essa mudança, por ser brusca, deve ocorrer paulatinamente: paulatinamente: - As folhas das plantas micropropagadas - As folhas das plantas micropropagadas apresentam uma menor quantidade de ceras apresentam uma menor quantidade de ceras epicuticulares que, associada à pouca epicuticulares que, associada à pouca funcionabilidade dos estômatos, as torna funcionabilidade dos estômatos, as torna suscetíveis a grandes perdas de água por suscetíveis a grandes perdas de água por transpiração (1 a 2 semanas sombrite e transpiração (1 a 2 semanas sombrite e nebulização em casa de vegetação ou telado).nebulização em casa de vegetação ou telado).

PRODUÇÃO DE FRUTÍFERAS LIVRES PRODUÇÃO DE FRUTÍFERAS LIVRES DE ENFERMIDADESDE ENFERMIDADES

• As frutíferas de um modo geral são As frutíferas de um modo geral são propagadas vegetativament(clones);propagadas vegetativament(clones);

• Problema: vírus, o que leva a uma Problema: vírus, o que leva a uma queda contínua na produtividade;queda contínua na produtividade;

• A limpeza clonal ocorre com o A limpeza clonal ocorre com o emprego de técnicas tais como:emprego de técnicas tais como:

TERMOTERAPIATERMOTERAPIA• As plantas matrizes ou estoques são colocadas As plantas matrizes ou estoques são colocadas

em ambiente com temperatura elevada, em ambiente com temperatura elevada, geralmente acima de 30ºC (varia de acordo geralmente acima de 30ºC (varia de acordo com a espécie e variedade) por um período com a espécie e variedade) por um período mínimo de 20 dias, mas, preferivelmente, mínimo de 20 dias, mas, preferivelmente, acima de 40 dias. Este tempo é necessário para acima de 40 dias. Este tempo é necessário para inativar o vírus ou micoplasma presente na inativar o vírus ou micoplasma presente na planta;planta;

• Concomitantemente, ocorre crescimento das Concomitantemente, ocorre crescimento das brotações da planta estoque, que brotações da planta estoque, que provavelmente não acusarão a presença do provavelmente não acusarão a presença do vírus;vírus;

• Estas brotações são então retiradas e poderão, Estas brotações são então retiradas e poderão, após o enraizamento, servir de fonte de após o enraizamento, servir de fonte de material vegetativo material vegetativo livre de víruslivre de vírus..

CULTURA DE MERISTEMACULTURA DE MERISTEMA

• Neste caso, faz-se a retirada do Neste caso, faz-se a retirada do meristema, tecido de gemas vegetativas, meristema, tecido de gemas vegetativas, terminais ou axilares;terminais ou axilares;

• Este tecido é transferido para um meio de Este tecido é transferido para um meio de cultura contendo reguladores de cultura contendo reguladores de crescimento, onde, através do processo de crescimento, onde, através do processo de diferenciação, ocorrerá a formação de diferenciação, ocorrerá a formação de brotações que seguirão as etapas já brotações que seguirão as etapas já mencionadas anteriormente.mencionadas anteriormente.

Figura 2: Diagrama da cultura de meristema: a Figura 2: Diagrama da cultura de meristema: a limpeza clonal poderá ser obtida no final deste limpeza clonal poderá ser obtida no final deste processo.processo.

TERMOTERAPIA SEGUIDA DE TERMOTERAPIA SEGUIDA DE CULTURA DE MERISTEMACULTURA DE MERISTEMA

• Este processo é um dos mais seguros Este processo é um dos mais seguros para se obter a limpeza clonal. As para se obter a limpeza clonal. As plantas passam por um período de plantas passam por um período de termoterapia que se sucede à termoterapia que se sucede à retirada do meristema, o qual é retirada do meristema, o qual é inoculado em um meio de cultura inoculado em um meio de cultura semelhante ao anterior.semelhante ao anterior.

MICROENXERTIAMICROENXERTIA• Este processo é empregado para aquelas Este processo é empregado para aquelas

espécies que não podem ser submetidas a espécies que não podem ser submetidas a temperaturas elevadas e, principalmente, para temperaturas elevadas e, principalmente, para as espécies que, ao serem multiplicadas “in as espécies que, ao serem multiplicadas “in vitro”, apresentam uma reversão ao estádio de vitro”, apresentam uma reversão ao estádio de juvenilidade. Neste caso, o meristema coletado juvenilidade. Neste caso, o meristema coletado é enxertado em porta-enxerto crescido “in é enxertado em porta-enxerto crescido “in vitro”;vitro”;

• Este processo apresenta um baixo rendimento; Este processo apresenta um baixo rendimento; • É comumente empregado para os citrus, É comumente empregado para os citrus,

podendo também ser usado para a cultura da podendo também ser usado para a cultura da ameixeira e pessegueiro.ameixeira e pessegueiro.

Figura 3: Diagrama da técnica de microenxertia “in vitro” Figura 3: Diagrama da técnica de microenxertia “in vitro” para obtenção de plantas isentas de vírus e micoplasmas.para obtenção de plantas isentas de vírus e micoplasmas.

OBRIGADOOBRIGADO