microbiologia

nstituto Superior de Ciências da Saúde- Sul Manual Prático de Microbiologia

CAPÍTULO 3

Cultura e isolamento de bactérias 3.1 - Introdução

3.1.1 - Generalidades

A maior parte das técnicas bacteriológicas (conservação, isolamento, identificação, ou

contagem de bactérias), exigem a utilização de meios de cultura, sendo a composição

dos meios de cultura função dos conhecimentos sobre os princípios de nutrição

microbiana. Os meios de cultura devem conter, de uma forma utilizável, os nutrientes

necessários ao crescimento das bactérias, nomeadamente, macronutrientes (C, H, N, O,

P, S, K, Mg, Na, etc.), micronutrientes (Fe, Cu, Zn, etc.), e factores de crescimento (por

ex. vitaminas e aminoácidos). Para que se observe crescimento bacteriano há ainda que

incubar os meios em condições adequadas de pH, tensão de oxigénio e temperatura.

Somente em casos excepcionais, se pode identificar uma bactéria pelas suas

características morfológicas. É portanto essencial obtê-la em cultura em meio artificial

e, na hipótese de estarem presentes diversas espécies, separá-las ou isolá-las em cultura

pura, para se poderem efectuar testes de identificação de natureza bioquímica.

Para cultivar uma espécie bacteriana deve adicionar-se a um meio de cultura estéril

adequado uma pequena amostra contendo células vivas da espécie. A essa amostra

chama-se inóculo, e à adição desse inóculo ao meio, chama-se inoculação. O meio

inoculado é então incubado em condições convenientes de temperatura, humidade, etc.,

durante um certo tempo. Durante a incubação, as bactérias multiplicam-se e formam

uma cultura, o que se define como uma população de bactérias (organismos) que se

desenvolve num meio ou à sua superfície.

3.1.2 - Classificação dos meios de cultura

Os meios de cultura podem ser classificados em função da sua consistência, composição

e tipo de utilização.

a) Consistência

Existem meios de cultura em três estados físicos:

• líquido

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• semi-sólido

• sólido

Os meios líquidos, como os caldos nutritivos de crescimento, podem ser utilizados para

a multiplicação de microrganismos em estudos de fermentação e em vários testes

bioquímicos. Apresentam no entanto, dois inconvenientes: 1) as culturas desenvolvidas

não revelam em geral quaisquer características especiais e portanto o seu valor é

limitado na identificação de bactérias; 2) é impossível a separação de espécies

bacterianas que se encontrem em misturas.

Ao contrário dos meios líquidos, os meios sólidos e semi-sólidos contêm um agente

solidificante, normalmente o agar. O agar é um polissacárido complexo extraído de

uma alga marinha (agar-agar) e tem várias propriedades que o tornam um agente

solidificante ideal, incluindo ficar transparente no ponto de ebulição da água, não ser

um nutriente para a maior parte dos microrganismos e não ser metabolizado durante o

crescimento microbiano.

Os meios semi-sólidos (aos quais são adicionados geralmente 5 g/l de agar) podem ser

utilizados em estudos de fermentação, estudos de mobilidade bacteriana (ex.: meio

manitol-mobilidade) e na promoção do crescimento de bactérias anaeróbias.

Os meios sólidos (aos quais são adicionados geralmente 15 g/l de agar) permitem

observar as colónias das diferentes bactérias que se desenvolvem à superfície (e por

vezes no interior) do meio e que mostram muitas vezes aspecto e cor diferentes,

auxiliando a sua posterior identificação. São praticamente indispensáveis à obtenção de

culturas puras. São ainda utilizados para a conservação de culturas, e permitem observar

determinadas reacções bioquímicas específicas (ver meios diferenciais).

Uma colónia é um número elevado de células bacterianas em meio de cultura sólido que

é visível a olho nú como uma entidade discreta. Assume-se que uma colónia provém de

uma única célula e portanto representa um clone de uma cultura pura.

b) Composição

Os microrganismos podem ser cultivados utilizando dois tipos diferentes de meios. Os

meios sintéticos, ou quimicamente definidos que são compostos por produtos químicos

bem definidos e dissolvidos em água destilada em proporções determinadas, de modo a

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constituir uma solução de nutrientes devidamente tamponada (ex. meio de citrato de

Simmons), e os meios complexos, compostos por uma variedade de substâncias

nutricionalmente indefinidas, de origem animal, vegetal ou microbiana como por

exemplo, extracto de carne, peptonas, e extracto de levedura, que são naturalmente ricos

em nutrientes e vitaminas. Como exemplos destes meios têm-se as geloses de

McConkey, Drigalsky ou Endo.

c) Tipo de utilização

• Meios de isolamento

Os meios de isolamento permitem a obtenção de culturas puras e podem ser de vários

tipos:

Meios basais - Permitem o crescimento de bactérias pouco exigentes. Não existe um

meio de cultura universal (ex. caldo nutritivo, água peptonada, triptona sal, gelose

nutritiva).

Meios selectivos - Permitem o crescimento só de um tipo de bactérias em detrimento

das outras cujo crescimento é inibido. Torna-se útil, no caso de uma população

plurimicrobiana, porque permite favorecer a cultura preferencial de certas bactérias.

Meios diferenciais - São utilizados quando se pretende diferenciar entre vários

microrganismos presentes no meio de cultura. Por exemplo, no caso da gelose sangue,

dado que algumas bactérias produzem enzimas (hemolisinas) que vão lisar os glóbulos

vermelhos enquanto outras não; dependendo do padrão de hemólise pode-se distinguir

entre bactérias hemolíticas (Streptococcus pyogenes) e não hemolíticas.

Meios selectivos e diferenciais - Alguns meios de cultura são simultaneamente

selectivos e diferenciais. São sobretudo utilizados em microbiologia clínica e na área da

saúde pública, como por exemplo na determinação da qualidade da água ou num surto

de intoxicações alimentares. Temos como exemplos deste tipo de meio:

a. Gelose de McConkey - É um meio selectivo, uma vez que contém sais biliares e

cristal violeta que inibem o crescimento das bactérias Gram positivas, permitindo o

crescimento, apenas das bactérias Gram negativas. É diferencial porque a lactose está

presente neste meio e permite diferenciar entre as bactérias Gram negativas que utilizam

a lactose como substrato fermentativo e as que não utilizam. As bactérias Gram

negativas fermentadoras de lactose, tornam o meio ácido e o indicador de pH do meio

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de cultura (vermelho de metilo) em meio ácido fica vermelho. As bactérias Gram

negativas que não fermentam a lactose, não acidificam o meio, e este permanece da cor

original.

b. Gelose de Drigalsky - É um meio muito semelhante ao anterior e contém,

igualmente, lactose, indicador de pH (azul de bromotimol), cristal violeta (inibidor das

bactérias Gram positivas). Permite distinguir também entre bactérias Lac +

(fermentadoras de lactose) e Lac - (não fermentadoras de lactose). As primeiras

originam colónias de cor amarela (o pH do meio baixa devido à acumulação de produtos

de fermentação e o indicador “vira” para amarelo); as segundas originam colónias azuis

(a cor original do meio).

c. Meio de Chapman - É um meio selectivo para os estafilococos devido à elevada

concentração de cloreto de sódio (7.5 %) que somente aquelas bactérias suportam. Por

conter manitol (um poliálcool derivado de um açúcar - a manose) é também, diferencial

(por ex.) para Staphylococcus aureus, uma vez que as espécies potencialmente

patogénicas do género Staphylococcus são fermentadoras de manitol. A acumulação dos

produtos de fermentação acidifica o meio, e o indicador de pH (vermelho de fenol)

“vira” de vermelho (cor original do meio) para amarelo, originando colónias amarelas

rodeadas de um halo também amarelo. As espécies de estafilococos não fermentadoras

de manitol apresentam neste meio, colónias incolores (ex. S. epidermidis).

Meios enriquecidos - Os ambientes naturais são geralmente habitados por populações

de vários tipos de bactérias. Quando uma espécie com especial interesse e

nutricionalmemte exigente, se encontra presente num determinado produto mas em

número muito baixo, é fundamental a utilização de um meio muito rico

nutricionalmente e em que nenhum agente inibidor se encontre presente. Estes meios

enriquecidos são meios basais adicionados de produtos biológicos ricos em nutrientes

como o soro, ovo ou sangue. Exemplos: gelose sangue, gelose chocolate, “brain heart

infusion” (BHI).

Gelose Chocolate - É um meio enriquecido com sangue previamente sujeito a

aquecimento a 80ºC durante 20 minutos o que promove a lise dos glóbulos vermelhos e

lhe confere a cor castanha, responsável pelo nome atribuído. A lise dos glóbulos

vermelhos liberta para o meio extracelular, proteínas, cujos cofactores são importantes

factores de crescimento para bactérias muito exigentes (ex. o grupo heme é fundamental

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para o crescimento de Haemophilus influenzae, agente importante de meningites

bacterianas em crianças).

• Meios de enriquecimento

São meios líquidos, que favorecem o crescimento de determinadas espécies aumentando

a sua quantidade relativamente a outras, podendo conduzir depois a culturas puras por

sobreposição de espécies (ex. meio de enriquecimento para organismos fotoautotróficos

- meio sem fonte de carbono adicionada; ex. caldo de selenito de sódio para

enriquecimento de fezes em Salmonella e Shigella, agentes causadores de intoxicações

alimentares).

• Meios de transporte

Servem para o transporte de um determinado material biológico a partir do qual se

propõe isolar um ou mais organismos. É então importante manter a viabilidade dos

microrganismos nele existentes sem que haja multiplicação dos mesmos (durante um

período de 48 a 72 horas) e também a sua quantidade relativa no produto biológico para

que depois a inoculação dos meios origine resultados que reflictam a proporção relativa

dos microrganismos nesse produto biológico (ex. meio de Stuart).

• Meios de identificação

São meios que permitem pôr em evidência as características bioquímicas das bactérias

e, por conseguinte, resolver os problemas de identificação postos entre espécies (ex.

meio Clark-Lubs - permite distinguir entre bactérias que fazem a fermentação

butanodiólica da glucose e bactérias que fazem a fermentação ácida mista da glucose).

• Meios de conservação

São meios que permitem a manutenção das bactérias num estado de vida latente durante

meses, anos ou décadas.

3.1.3 - Reconstituição de meios de cultura (esquema geral)

a) Pesagem do meio liofilizado ou, no caso dos meios sintéticos, dos vários compostos

químicos.

b) Adição de água destilada.

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c) Dissolução completa dos componentes em banho-maria agitando periodicamente.

d) Esterilização (geralmente em autoclave).

e) Adição da fonte de carbono esterilizada por filtração, no caso dos meios sintéticos,

uma vez que soluções concentradas de glúcidos não devem ser submetidas a

temperaturas elevadas porque caramelizam.

f) Distribuição em tubos ou caixas de Petri após arrefecimento a 40 - 45º C.

3.1.4 - Técnicas de inoculação ou sementeira de meios de cultura sólidos

a) Inundação

É utilizada uma suspensão (que pode previamente ser submetida a várias diluições),

com que se inunda a superfície do meio sólido a usar. O excesso de inóculo é removido

por sucção a vácuo após agitação e a superfície do meio é deixada secar ao ar em

atmosfera asséptica.

b) Espalhamento

É utilizada para contagem de colónias e o inóculo (suspensão) é, neste caso, aplicado à

superfície de meio sólido com um espalhador em L ou, simplesmente, com uma pipeta

de Pasteur dobrada a quente, ou ainda por intermédio de uma zaragatoa.

c) Estrias

A inoculação por estrias é realizada com a finalidade de obter colónias isoladas, e

realiza-se à superfície de meio sólido, com uma ansa de Henle, a partir de uma

suspensão ou de uma colónia isolada (Fig. 3.1).

Figura 3. 1. Esquema

da inoculação de meios

de cultura sólidos pela

técnica das estrias.

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d) Incorporação

A inoculação por incorporação é utilizada para contagem de colónias à superfície e no

interior de meio sólido e realiza-se por incorporação do inóculo (suspensão) no meio,

enquanto quente (não mais do que 40ºC para não destruir o inóculo) e portanto ainda

liquefeito.

e) Picada central

Este tipo de inoculação é utilizado por exemplo, no estudo da mobilidade bacteriana e

realiza-se por picada central com a ansa de Henle, ou pipeta de Pasteur fechada, num

meio gelosado em tubo.

3.1.5 - Incubação dos meios de cultura inoculados

Após a inoculação e a devida identificação dos tubos ou caixas de Petri, os meios de

cultura devem ser incubados, isto é, colocados em estufas próprias para o efeito, em

condições adequadas de temperatura, humidade e tempo (geralmente em microbiologia

clínica, 37ºC/24h, uma vez que quase todos os agentes patogénicos são organismos

mesófilos).

3.1.6 - Leitura dos resultados

A observação dos resultados deve ser feita tendo em conta alguns aspectos como a

densidade da cultura, presença de pigmentos solúveis, a presença de odor característico

e o aspecto da cultura, e nomeadamente em meio sólido, a existência de colónias

isoladas e suas características particulares (ver 3.1.7).

3.1.7 - Aspecto das colónias crescidas em meio sólido (Fig. 3.2)

a) Tamanho

• colónias pequenas - diâmetro (d) < 1 mm

• colónias médias - 1.5 < d < 3 mm

• colónias grandes - d > 3 mm

b) Forma geral

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• desenho dos contornos:

bordos lisos regulares

bordos irregulares

bordos dentados

bordos com prolongamento

• forma de relevo:

lisas

convexas

semi-convexas

acuminadas

mamelonadas

umbilicadas

c) Transparência:

• transparentes

• translúcidas

• opacas

• lactescentes

d) Aspecto da superfície:

• colónias lisas

bordos regulares

superfície lisa e brilhante por vezes

consistência cremosa

suspensão homogénea

muitas vezes semi-convexas

• colónias rugosas

bordos muitas vezes dentados

superfície rugosa, baça

consistência pulvurulenta

suspensão heterogénea

sobretudo lisas

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• colónias mucosas

bordos lisos e regulares

convexas

superfície lisa e brilhante

suspensão heterogénea

e) Pigmentação:

A elaboração de um pigmento por certas bactérias pode ser um elemento precioso de

identificação. Exemplos:

Serratia marcescens - colónias vermelhas

Pseudomonas aeruginosa - colónias verdes azuladas (pigmentos - pioverdina e

piocianina)

Forma

Elevação

Margem

Ponto Circular Filamentosa Irregular Rizoidal Fuso

Achatada Elevada Convexa Pulverulenta Umbilical

Inteira Ondulada Lobulada Filamentosa EncaracoladaErusionada

Forma

Elevação

Margem

Ponto Circular Filamentosa Irregular Rizoidal Fuso

Achatada Elevada Convexa Pulverulenta Umbilical

Inteira Ondulada Lobulada Filamentosa EncaracoladaErusionada

Figura 3. 2. Representação esquemática da forma, elevação e margem das colónias

bacterianas obtidas em meio sólido.

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3.2 - Protocolos experimentais

Utilizando bactérias em meio líquido:

1) No meio de tripticase-soja-agar (TSA), inocular por espalhamento E. coli, utilizando

uma pipeta Pasteur como espalhador.

2) No meio de Drigalsky, dividir a placa em duas partes e inocular Proteus spp. e E. coli

por estrias, usando a ansa de Henle.

3) No meio de Chapman, dividir a placa em duas partes e inocular Staphylococcus spp.

e E. coli por estrias, usando a ansa de Henle.

4) Na gelose chocolate, dividir a placa em três partes e inocular por estrias, utilizando

uma zaragatoa as seguintes bactérias: E. coli, Proteus spp. e Staphylococcus spp.

5) Nos tubos de manitol-mobilidade, com a ansa de Henle, inocular Staphylococcus spp.

e Proteus spp por picada central.

Utilizando bactérias isoladas em meio sólido:

1) Com a ansa de Henle retirar 3 ou 4 colónias:

• de uma das bactérias inoculadas no meio de Drigalsky e suspender em soro

fisiológico (SF) ou meio BHI

• de uma das bactérias inoculadas no meio de Chapman e suspender em SF ou BHI

2) Com a ansa, tirar 4 ou 5 gotas das suspensões anteriores para lâminas, fazer

esfregaços, e realizar para cada uma a coloração de Gram.

3.3 – Resultados e discussão

3.3.1 - Classifique quanto à mobilidade as bactérias que inoculou no meio manitol-

mobilidade.

3.3.2 - Identifique as bactérias fermentadoras e não fermentadoras de lactose.

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3.3.3 - Identifique as bactérias fermentadoras e não fermentadoras de manitol.

3.3.4 - Identifique a morfologia e o modo de agrupamento das bactérias estudadas.

3.3.5 - Classifique as bactérias estudadas como Gram (+) ou Gram (-).

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