métodos de estudo em histologia

Métodos de estudo em histologia


Prof. Dr. Caio Maximino

Marabá/PA-2015


Preparação de lâminas histológicas

Preparaçãode lâminas

Coloração

Histo- ecitoquímica

Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica

● O tecido pode ser preparado pode ser in vivo ou até mesmo morto;

● Mais comum: preparado histológico permanente (lâminas histológicas).

COLETA FIXAÇÃO PROCESSAMENTO DESIDRATAÇÃO

DIAFANIZAÇÃO INCLUSÃO MICROTOMIA COLAGEM

COLORAÇÃO MONTAGEM


Coleta da amostra

Obtido principalmente por meio de:

1) Biópsia cirúrgica – através de uma incisão cirúrgica no órgão ou tecido;

2) Biópsia endoscópica – usada para órgãos ocos (estômago, intestino, etc.) através de endoscopia;

3) Biópsia por agulha – a amostra (cilindro) é obtida pela punção do órgão (fígado, pulmão), sem precisar abrir a cavidade natural;


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica


Coleta da amostra

4)Cirurgias amplas – a amostra corresponde a peças grandes (ex. tumores) ou órgãos (ex. mama, útero);

5)Necrópsia – procedimento utilizado para estudo anatômico de todos os órgãos ou tecidos, no animal morto.

NOTA: Amostras de tamanho grande devem ser clivadas, reduzindo a sua espessura – facilita a penetração do FIXADOR. Tamanho final em torno de 4mm.


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica


Fixação

● Base para uma boa preparação histológica;

● Deve ser completa e adequada– A amostra deve ser imerso rapidamente no fixador; – O volume de fixador deve ser no mínimo dez vezes maior que o

volume da peça coletada.

● Objetivos:● Inibir ou parar a autólise tecidual;● Coagular ou endurecer o tecido; ● Proteger, através do endurecimento, os tecidos moles no manuseio e

procedimentos técnicos posteriores; ● Preservar os vários componentes celulares e tissulares; ● Melhorar a diferenciação óptica dos tecidos; ● Facilitar a subsequente coloração.


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica


Fixação


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica

FÍSICA QUÍMICACALOR OU FRIO FIXADORES QUÍMICOS

Função de insolubilizar as proteínas dos tecidos


Fixadores químicos

Fixador Efeito Exemplos

Reticuladores (aldeídos) Formação de ligações covalentes ancora proteinas de citoesqueleto

Formaldeído (formalina tamponada)Glutaraldeído

Precipitadores (álcoois) Reduzem a solubilidade das proteínas e atrapalham interações hidrofóbicas

EtanolMetanolAcetona

Oxidantes Permitem a formação de ligações cruzadas em cadeias laterais

Tetróxido de ósmioDicromato de potássioÁcido crômico

Mercuriais ? B-5Fixador de Zenker

Picratos Reagem com histonas e proteínas alcalinas, formando precipitado

Ácido pícrico


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica


Fixadores

Alvo Fixador ideal Fixador a evitar

Proteínas Formalina tamponada, PFA

OsO4

Enzimas Secções congeladas Fixadores químicos

Lipídeos Secções congeladas, OsO4/glutaraldeído

Fixadores alcoólicos, formalina tamponada

Ácidos nucléicos Fixadores alcoólicos Fixadores aldeídos

Mucopolissacarídeos Secções congeladas Fixadores químicos

Aminas biogênicas Solução de Bouin, formalina tamponada

Glicogênio Fixadores alcoólicos OsO4


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica


Etapas para inclusão

● Processamento: – Impregnação do tecido: sustentar células e outras estruturas.

● Desidratação: – Remoção da água para que o material de inclusão seja

perfundido pelo tecido;

– Álcoois etílico, butílico, metílico e isopropílico, a acetona, o éter, o clorofórmio e o óxido propileno: 70% - 80% - 90% - 100%.

● Diafanização: clarificação– Xilol, clorofórmio: permite a retirada de água e álcool –

permite que a parafina impregne o tecido.


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica


Inclusão

● Retirada total do diafanizador e penetração do meio de inclusão nos vazios deixados pela água e gordura.

● Preparação para o corte:– Endurece o tecido – consistência adequada para o

corte.

● Meios de inclusão: OCT, TBS (congelamento), parafina, celoidina, epóxi


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica


Microtomia

● Micrótomo para parafina: Secções 5-20 µm

● Vibrátomo: Material sem inclusão e a fresco, >30 µm

● Micrótomo de congelamento: Material congelado, >30 µm

● Criostato: Material congelado, 10-40 µm

● Ultramicrótomo: Material incluído em resina, > 1 nm


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica


Micrótomo para parafina


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica

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egia

s/6-

tecn

icas

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Vibrátomo


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica

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Cortes a frio


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica

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tecn

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Coloração para microscopia de luz

● Técnica tintorial utilizada para facilitar o estudo dos tecidos sobre a microscopia;

● Os tecidos não corados têm pouca diferenciação óptica;

● A maioria dos corantes se comporta como compostos ácidos ou básicos:

– Basófilos: se coram bem com corantes básicos;

– Acidófilos: se coram bem com corantes ácidos


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica



Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica

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tecn

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Coloração para microscopia de luz

Básicos:Azul de toluidinaAzul de metileno

Hematoxilina

Ácidos:Orange G

Fucsina ácidaEosina

Ácidos nucléicosGlicosaminoglicanas

Glicoproteínas ácidas

MitocôndriasGrânulos de secreção

Proteínas citoplasmáticasColágeno


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica


Principais corantes biológicos – Uso geral


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica

● Hematoxilina– Uso geral quando pareada com

eosina– Núcleo: Laranja, ciano ou verde– Citoplasma: Azul, marrom ou preto– Ácidos nucléicos: azul; RE: azul

● Eosina– Uso geral quando pareada com

hematoxilina– Citoplasma: Rosa– Hemácias: Laranja ou rosa– Fibras colágenas, reticulares ou

elásticas: Rosa

● Azul de toluidina

– Núcleo: Azul

– Citoplasma: Azul

– Hemácias: Azul

– Fibras colágeas: Azul

– Grânulos de mastócitos: Púrpura



Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica

Principais corantes biológicos - Tricrômios

● Tricrômio de Masson– Tecido conectivo– Núcleo: Preto– Citoplasma: Vermelho ou rosa– Hemácias: Vermelho– Fibras colágenas: Azul ou verde– Cartilagem: Azul/verde; Músculo: Vermelho

● Tricrômio de Mallory– Tecido conectivo– Núcleo: Vermelho– Citoplasma: Vermelho claro– Hemácias: Laranja– Fibras colágenas: Azul escuro– Queratina: laranja; cartilagem: azul: matriz

óssea: azul escuro

● AZAN de Heidenhain

– Distinção de células e componente extracelulares

– Núcleo: Azul ou preto

– Citoplasma: Rosa

– Hemácias: Vermelho

– Fibras colágenas: Azul

– Fibras musculares: Vermelho; cartilagem: azul; matriz óssea: azul


Contraste de ultrafinos


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica

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tecn

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Montagem

● Depois de corados – montagem:– Soluções crescentes de álcool – remoção da água. A

desidratação aumenta a sobrevida do preparado;

● Banho em xilol ou bálsamo do Canadá;

● Coloca-se uma gota do meio de montagem o corte;

● Revestimento com lâmínula;

● Vedação.


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica


Histo- e citoquímica

● Métodos usados para localizar estruturas celulares ou moléculas usando atividade enzimática

● Procedimentos geralmente realizados sobre tecido não-fixado ou com pouca fixação

● Secção em criostato ou vibrátomo para evitar efeito do calor ou da parafina sobre atv. enzimática


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica


Outros usos

● Fosfatases: Quebram a ligação entre PO4- e um álcool

em moléculas fosforiladas

● Desidrogenases: Transferem H de um substrato a outro. Utilizado para identificar mitocôndrias.

● Peroxidases: Promovem a oxidação de 3,3'-diaminobenzidina (DAB). Usado principalmente para marcar outras proteínas em IHQ.


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica


IHC e IHQ

● Exploram interação anticorpo-antígeno para localizar proteínas específicas que não tenham necessariamente atividade enzimática

● A reação pode ser revelada usando anticorpos conjugados com enzimas (p. ex., AP e HRP) com fluoróforos.


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica


Hibridização in situ


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica

● Usada para determinar a presença de uma sequência de DNA ou mRNA

● Útil principalmente na ausência de anticorpos específicos

● Ferramenta essencial para diagnósticos patológicos, principalmente câncer


Hibridação in situ


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica



Coloração


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Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica


Microscopia de fluorescência


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/fluorescence.html



Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica


Compostos fluorescentes

● DAPI e Hoechst: Azul; liga-se ao DNA

● Faloidina: Liga-se a filamentos de actina

● Fluoresceína, FITC, Texas Red: Fluoróforos, normalmente conjugados a anticorpos

● Proteínas fluorescentes (GFP, dsRed)

● Moléculas autofluorescentes: NAD(P)H, colágeno, triptofano, lipofuscina


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica


Compostos fluorescentes


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica

"FluorescentCells" by http://rsb.info.nih.gov/ij/images/. Licensed under Public Domain via Wikimedia Commons - https://commons.wikimedia.org/wiki/File:FluorescentCells.jpg#mediaviewer/File:FluorescentCells.jpg


Microscopia de contraste de fase

● Explora pequenas alterações no comprimento do trajeto óptico para revelar materiais de índices refrativos diferentes

● Utilizada para observar células em cultura, microorganismos, e fatias finas de tecido


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica


Microscopia de contraste de fase


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica


Microscopia eletrônica


Coloração


Imuno

Hibridação

Microscopiade luz

Fluorescência

Contrastede fase

Eletrônica



Coloração


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Eletrônica

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