métodos de detecção de mutações dos genes -...
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Métodos de Detecção de Mutações dos genes
B-RAF e C-KIT em Melanomas
Dra Isabela Werneck da Cunha, MD phD Divisão de Patologia Molecular
Departamento de Anatomia Patológica [email protected]
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DNA
RNA
Proteínas
Funções celulares
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Detecção das mutações • Detecção de proteínas alteradas, supressas ou super-
expressas – Imunoistoquímica
• Aumento ou diminuição do mRNA – RT-PCR
• Análise do DNA
– PCR – Real time PCR – Sequenciamentos – Hibridização in situ (se alterações no numero de cópias ou translocações
de genes inteiros)
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O DNA – principais características
• Dupla-Fita
• Anti-Paralelas
• Complementares A T
C G
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Códon Códon Códon Códon Códon
aminoácidos
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4 nucleotídeos= 64 combinações diferentes de 3 em 3 (Temos 20 aminoácidos) Redundância: Vários códons codificam o mesmo aminoácido
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• Mutações em Melanoma
– BRAF – NRAS – KIT
• Vias similares • Mutualmente
exclusivas • Diferentes tipos de
Melanoma
Lazar AJ & Murphy GF, Robbins and Cotran´s Pathologic Basis of Disease
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Melanoma
•Diferentes vias moleculares
•Diferentes tratamentos
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Subtipos de Melanoma
Mike Davies, MDACC CSD, Chronic sun-damaged
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– GENE BRAF
– Gene da família das Kinases da via MAP kinase/ERKs
– Participa dos processos de divisão celular e diferenciação.
– A mutação leve a produção de uma proteína com atividade 10x maior que a selvagem, favorecendo proliferação celular, invasão, angiogênese e metástase.
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Mutação do BRAF vista em 66% dos melanomas (Davies et al.2002)
– 97% das mutações envolvem o codon 600 (GTG>GAG)
(Valina>Ac.Glutâmico) (V600E)
– Associação com resposta (78%) a tratamento de melanoma
metastático com inibidores de BRAF (vemurafenib) (Eggermount et al 2011).
(JaKob J et al, Cancer 2012)
GENE BRAF
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Targeted therapy for metastatic melanoma
Garnett MJ et al. Cancer Cell 2004;6:313–319; Wan PT et al. Cell 2004;116:855–887.
Zelboraf mode of action BRAF V600E
MEK
ERK
Arrested cell proliferation and survival
x Zelboraf
RAS-GTP
Growth factors
MAPK, Mitogen-activated protein kinase
BRAF
Normal cell proliferation and survival
MEK P
ERK P
Oncogenic BRAF signaling
BRAF V600E
Excessive cell proliferation and survival
MEK
ERK
P
P
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– Gene da família das Proteínas Tirosino-Kinases
– Participa dos processos de divisão celular e diferenciação.
– A mutação leve a produção de uma proteína constantemente ativa,
favorecendo proliferação celular, invasão, angiogênese e metástase.
–
Cytogenetic Location: 4q11-q12 Molecular Location on chromosome 4: base pairs 55,524,094 to 55,606,880
GENE KIT
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GENE KIT
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GENE KIT
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•Seleção dos casos •Extração do DNA •PCR de amplificação dos genes envolvidos •Real Time, sequenciamento, pirosequenciamento, análise de fragmentos, next sequencing generation, etc.....
•Análise dos dados
Pesquisa de Mutações
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Mistura de células tumorais e estromais: Necessidade de microdissecção.
Heterogeneidade intratumoral. DNA mutado misturado com DNA selvagem: Desafio para detectar baixas taxas de mutação.
Fixação tecidual pode levar a dano do DNA. Tecido necrótico pode não ter DNA amplificado.
Tipo de fixação e outras impurezas como melanina podem interferir na amplificação do DNA
% tumoral % cópias mutantes
% DNA amplificado
Tipo de fixação
A grande maioria dos melanomas para testes moleculares estão emblocados em parafina
Adaptado
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• PARA 1 litro • 100 ML DE FORMALDEIDO A 37% • 4,0 gramas de Fosfato de Sódio Monobásico NA H2 P04
H20 • 12,26 gramas de Fosfato de Sódio Bibasico Na2H PO4.7 H20 • 900 ml de Água destilada
• Acertar o PH = 7.2 a 7.4 com Hidróxido de Sódio NaOH=5 normal
Fixação do Material (formol tamponado a 10%)
FORMOL TAMPONADO A 10%
Formol tamponado 10%
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Confirmação Diagnóstica (checagem do material enviado)
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Seleção da amostra
• Microdissecção a laser
• Microdissecção manual /scrape
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Tumor content study Correct detection of V600E mutations in specimens with at least
15% tumor content and/or mutation level >5%
Specimen Tumor content* % mutation Test result 1 5%/5% 3% Mutation not detected 4 10%/10% 4% Mutation not detected 5 10%/10% 14% Mutation not detected 8 15%/15% 3% Mutation detected 12 20%/20% 28% Mutation detected 14 20%/20% 2% Mutation detected 17 30%/25% 20% Mutation detected 22 35%/35% 7% Mutation detected
26 40%/35% 7% Mutation detected
31 40%/45% 36% Mutation detected
cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Test. CE-IVD Package Insert. Roche Molecular Systems, Inc., USA. 2011.
*Tumor content for first and last of 12 adjacent 5µm sections from each specimen
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Impacto da quantidade relativa de estroma na sensibilidade de detecção de mutação do gene
KRAS (Macedo MP 2012)
• Lâminas histológicas submetidos a análise de imagens para estimar a proporção de tumor em relação ao estroma
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48% de células neoplásicas
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Impacto da quantidade relativa de estroma na sensibilidade de detecção de mutação do gene KRAS
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Extração do DNA
Inúmeros métodos Inúmeros kits
• Espectofotômetro • Mede quantidade e
qualidade do DNA obtido • Usar o DNA para realizar a
PCR.
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PCR
• Polymerase Chain Reaction (reação em cadeia da polimerase)
• Amplificação do DNA (criação de múltiplas cópias)
• Consiste em fazer cópias de DNA “in vitro”, usando os elementos básicos do processo de replicação natural do DNA.
• Pode ser usada para amplificar todo o gene ou somente parte de um gene
595 596 597 598 599 600 601 602 603 ........
Área de interesse
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DNA
PCR
Codon 600
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Sequenciamento Gênico
• Determinar a ordem das bases nitrogenadas A G C T da molécula de DNA
• Métodos: • Sanger – conceito de sequenciamento por ``Chain termination´´
• Pirosequenciamento: sequenciamento por síntese • Next sequencing generation • Análise de fragmentos, etc • RT-PCR
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Um Pouco de História.....
"for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids“
Nobel Prize in Chemistry - 1980
Frederick Sanger 1918-
Walter Gilbert 1932-
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c.1780 G>A, pD594N
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Pirossequenciamento
PPi ATP
Emissão de luz
Tempo
•Se baseia no conceito de liberação de pirofosfato após incorporação de cada nucleotídeo- conceito do sequenciamento por síntese •Mais sensível que Sanger •Quantitativo
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cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Test. CE-IVD Package Insert. Roche Molecular Systems, Inc., USA. 2011.
cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Test Based on TaqMan® PCR
Probe and primer binding Polymerization Fluorescence TaqMan® probe
Fluorophore
Quencher Amplifica
tion Cleavage products
Forward PCR primer
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Competitive landscape cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Test – comparison to
other methods
Feature cobas® BRAF test1
therascreen BRAF RGQ2 kit
Direct sequencing
Next generation sequencing PCR-based LDT
% tumor required
≥50% Undefined Undefined Undefined Undefined
DNA input required
125 ng/25 μl requires PCR titration Undefined Undefined Undefined
Sensitivity ≤5% FFPET 1–5% in cell line ~20% ~1%–5% Undefined
Storage conditions
2 to 8°C -18°C to -25°C Variable Variable Variable
Control/result interpretation
Automated Manual Manual Manual Manual
Workflow <8 hours ~16 hours ~3 days ~5 days ~16 hours
IVD platform CE-IVD, FDA approved RUO RUO RUO RUO
1cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Test. CE-IVD Package Insert. Roche Molecular Systems, Inc., USA. 2011; 2therascreen BRAF RGQ PCR Kit CE-IVD Handbook, Qiagen Manchester Ltd, UK, 2011.
LDT=Laboratory-developed test
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• Imuno-histoquímica – VE1 – Anticorpo monoclonal anti-BRAF
V600E • Representa a sequência de aa da
mutação V600E • aa 596-606: GLATEKSRWSG
– Negativo em: • Gene tipo-selvagem • Outras mutações do BRAF
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Assessment of BRAF V600E mutation status by immunohistochemistry with a mutation-specific
monoclonal antibody
David Capper • Matthias Preusser • Antje Habel • Felix Sahm • Ulrike Ackermann • Genevieve Schindler • Stefan Pusch • Gunhild
Mechtersheimer • Hanswalter Zentgraf • Andreas von Deimling
Acta Neuropathology (2011) 122:11–19
Immunohistochemical testing of BRAF V600E status in 1,120 tumor tissue samples of patients with brain metastases David Capper • Anna Sophie Berghoff • Manuel Magerle • Aysegu¨ l Ilhan • Adelheid Wo¨hrer • Monika Hackl • Josef Pichler • Stefan Pusch • Jochen Meyer • Antje Habel • Peter Petzelbauer • Peter Birner • Andreas von Deimling • Matthias Preusser Acta Neuropathology (2012) 123: 223 – 233
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Em resumo
• Condições pré analíticas – Tamanho/Tipo da amostra – DNA degradado (descalcificação) – Fixação inadequada
• Métodos (sensibilidade X especificidade)
Taxa de resultados inconclusivos: 2 a 3 % (dados americanos)