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Métodos de
Descalcificação
Dimitrius Leonardo Pitol. PhD
Técnico de Laboratório IV
FORP/USP
1 VI CONGRESSO REGIONAL DE
HISTOTECNOLOGIA, RIO DE JANEIRO
FIO CRUZ
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Processamento de Tecidos
mineralizados
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COROA
POLPA
DENTINA
Osso Cortical
ou
Compacto ou
Denso
Medula Óssea
vermelha
Osso Trabeculado
ou Esponjoso
Tecido Mineralizado
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3
33% de Matriz Orgânica
28% Colágeno do Tipo I
5% Osteonectina Osteocalcina
Proteoglicanas Sialoproteína
Proteína Morfogenética Óssea
Tecido mineralizado
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•Cálcio
•Fosfato
•Magnésio
•Potássio
•Sódio
•Citrato
•Matriz inorgânica
Métodos de descalcificação
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•Soluções ácidas diluídas.
•Soluções quelantes.
•Misturas de soluções acidas +
soluções quelantes.
Mecanismo de ação dos agentes
descalcificadores
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Ca++
Ca++
Ca++
Solução descalcificadora
Àcido (H+)
H3PO4 (acido fosfórico) + cloreto de cálcio + água
Ca++(PO4)6 (OH)2
Descalcificadores mais
utilizados
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• Acido nítrico 5%.
• Acido fórmico + citrato de sódio.
• EDTA (ácido etileno-diamino-tetracético).
• ETDA (tartarato de sódio e potássio, tartarato de
sódio Hcl.
ETDA
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EDTA. 0,7g
Tartarato de sódio e potássio. 8g
Tartarato de sódio. 0.14g
Hcl. 120ml
H2O destilada. 900ml
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FÊMUR ETDA DESCALCIFICADO
EM 24 HORAS
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ETDA EDTA
Cuidados com a descalcificação
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•Material bem fixado.
•Concentração.
•Volume do descalcificador.
•Trocas constantes.
•Ponto Ideal.
•Neutralizar o descalcificador.
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Tempo para a troca do
descalcificador
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Como saber o ponto ideal da
descalcificação ?
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Métodos mais utilizados
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•Método radiográfico.
•Flexibilidade do tecido.
•Utilização de alfinete.
•Método quantitativo.
Amônia Concentrada. Solução Saturada de Oxalato de Amônia. Trocar o Descalcificador a cada 24
horas e fazer o teste
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Método Quantitativo
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• Pegar 5ml de Descalcificador do fundo do Frasco.
• Acrescentar 1 ml de Amônia concentrada (Misturar).
• Acrescentar 0,1ml de Oxalato de amônia.
• Deixar por 10 minutos para verificar a presença de
cálcio.
• Se não formar precipitado acrescentar mais 0,1ml ,
com intervalo de 10 minutos.
• Até no Máximo 0,6 ml .
• Se não formar precipitado o tecido e considerado
descalcificado.
FLEXIBILIDADE OSSO 16
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Flexibilidade Dente VI CONGRESSO REGIONAL DE
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Cuidados depois de descalcificar
com EDTA
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Métodos para agilizar a descalcificação
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Métodos para agilizar a descalcificação
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Adesão dos cortes
• Ideal é cortes com 5
a 3µm.
•Lâminas silanizadas
•Poly-L- lisina.
• Albumina (não)
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Cortes seriados
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Hematoxilina Eosina
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Hematoxilina Eosina
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Tricômio Masson
ODONTOBLASTOS
DENTINA
POLPA DENTÁRIA
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Fase angiogênica inicial:
Proliferação dos vasos
sanguíneos, com formação
do coágulo.
Fase de formação de osso
novo: Tecido de granulação,
tecido conjuntivo e tecido
ósseo imaturo.
Sequência do processo de neoformação óssea
Sequência do processo de neoformação óssea
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Fase de crescimento: Formação de tecido ósseo imaturo e posterior mineralização.
Fase de reorganização: Trabéculas primárias do osso remodelam-se para formar uma camada esponjosa mais espessa e um tecido ósseo mais denso.
Historesina Leica
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Historesina
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• Diminuição do numero
de lavagens.
• Bloqueio de peroxidase
endógena.
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Adaptações no protocolo de
Imunohistoquímica
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Protocolo tecido ósseo
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• Diluição do anticorpo primário em BSA.
• Incubação do anticorpo por 2 horas.
• Uma lavagem de 5 minutos em PBS.
• Encubar com anticorpo secundário “conjugado” por 40 minutos.
• Uma lavagem de 5 minutos.
• Aplicação do DAB (Cromógeno) por 5 minutos.
• Uma lavagem em PBS por 5 minutos.
• Passar um minutos na hematoxilina, desidratar e montar com lamínula.
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Anticorpos
•MMP-9 Ab 19016 (CHEMICON)
•CD 34 Sc 9095 (SANTA CRUZ)
•CD 31 Ab 64543 (ABCAM)
•FGF BASIC Ab 16828 (ABCAM)
•VEGF R2 Ab2349 (ABCAM)
•VEGF Ab44714 (ABCAM)
•OSTEOCALCINA Sc 30044 (SANTA CRUZ)
•SIALOPROTEINA Ab 1851 (CHEMICON)
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VEGF R2
Calvária VEGFR 2 40X.
Diluição 1/50 micro-litros
Calvária VEGFR 2 CONTOLE NEGATIVO 40X.
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Osteocalcina
1/50
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1/ 2.500
Sialoproteina II
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36
TGF Beta
1 / 50
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37
1 / 50
MMP-9
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