proliferação celular nos linfomas caninos

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Braz. J. vet. Res. anim. Sci., São Paulo, v. 45, n. 4, p. 313-319, 2008

Proliferação celular nos linfomas caninos

1 - Curso de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, Área de PatologiaVeterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UniversidadeEstadual Paulista, Botucatu-SP2 - Departamento de Clínica Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária eZootecnia da Universidade Estadual Paulista, Botucatu-SP3 - Curso de Medicina Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza-CE4 - Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da UniversidadeEstadual Paulista, Botucatu-SP

Sara Maria de Carvalho eSUZANO1

Julio Lopes SEQUEIRA2

Adriana Wanderley de PinhoPESSOA3

Camila Dias PORTO1

Deílson Elgui de OLIVEIRA4

Correspondência para:Sara Maria de Carvalho e Suzano - Rua Doisde Dezembro, 72 ap. 805 Flamengo, Rio deJaneiro – RJ CEP 22220-040

Recebido para publicação: 30/03/2007Aprovado para publicação: 31/01/2008

Resumo

O estudo dos linfomas caninos além de abordar a classificaçãomorfológica e imunofenotípica necessita ser ampliado para que setenha a avaliação da cinética celular. Esta verificação só pode ser feitacom segurança quando são avaliados os parâmetros que indicam ataxa de proliferação celular. No homem, estes fatores têm influênciano prognóstico e no tratamento dos limfomas. Os 40 linfomasutilizados neste trabalho foram classificados de acordo com aclassificação de Kiel e a imunofenotipagem utilizou CD3 (linfócitosT) e CD79a (linfócitos B). A proliferação celular foi avaliada pelosmétodos de contagem dos AgNORs e Ki-67 (MIB-1) De acordocom a classificação de Kiel os linfomas de alto grau foram os maisfreqüentes, a imunofenotipagem mostrou a mesma freqüência delinfomas T e B. Quando avaliada a proliferação celular houve diferençasignificativa entre os linfomas de alto e baixo grau tanto pelo métododo AgNOR como do KI-67.(MIB-1), porém não foramestatisticamente entre os imunofenótipos Entre as neoplasias de altograu de malignidade a média de número de NORs por núcleo decélula neoplásica foi de 1,37 ± 0,32, e nos casos de baixo grau de 0,98± 0,36, de acordo com o KI-67 a média do percentual de célulaspositivas foi de 43,19% ± 19,01, e 14,09% ± 11,74 nos casos de altoe baixo grau, respectivamente.

Palavras-chaves:Linfoma.Canino.Proliferação.Ki-67.AgNORs.

Introdução

Os linfomas estão entre as neoplasiasmais freqüentes na espécie canina 1,2,3,4, e emestudos recentes pode-se observar anecessidade de avaliar, além da classificaçãomorfológica e o imunofenótipo, o índice deproliferação celular 5 .

A proliferação celular relacionadacom as neoplasias tem sido amplamenteestudada por mostrar boa correlação como comportamento biológico destes tumoresalém de a adicionar informações queorientam o tratamento e o prognóstico.6 Hámuitos métodos para a avaliação daproliferação celular, entre estes estão as

técnicas histoquímicas para a contagem dosAgNORs (Argyrophil Nucleolar OrganizerRegions) ou ainda a avaliaçãoimunoistoquímica, utilizando-se a marcaçãodo antígeno Ki-67 (MIB-1).

Os AgNORs são estruturasintranucleares, relacionadas com a síntese deproteínas nas células em proliferação. Ogrande número de AgNORs reflete um altoíndice de proliferação. Esses parâmetros têmsido utilizados com grande eficácia noslinfomas do homem e do cão. As neoplasiasde grau alto de malignidade possuem umnúmero maior de AgNORs e estesapresentam-se distribuídos difusamente nonúcleo enquanto os tumores de grau baixo

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de malignidade possuem AgNORsagregados dentro dos nucléolos.7

Métodos imunoistoquímicos têmsido empregados para a detecção deproteínas associadas à proliferação celulartanto nas neoplasias humanas como naMedicina Veterinária. 6,8 O principalmarcador das células em proliferação é oantígeno Ki-67 (MIB-1). 5,9

O antígeno Ki-67 (MIB-1) pode serdetectado em todas as fases do ciclo celularmenos na fase G0 .

10 Este tem relação diretacom a fração de crescimento de umapopulação celular e é considerado,atualmente, como o melhor marcadorimunoistoquímico de proliferação celular.8Esta determinação tem valor prognósticonos linfomas não-Hodgkin humanos, poisa análise desse índice pode estabelecer umfator independente para cada caso.11

Na espécie canina, a quantificação doantígeno Ki-67 (MIB-1) nos diferentesgrupos de linfomas, pode resultar em aumentona acurácia das classificações dos linfomascaninos. Alguns autores observaram umacorrelação positiva entre a proporção decélulas positivamente marcadas pelo Ki-67, amorfologia celular, o imunofenótipo e ograu de malignidade das neoplasias.12

Material e Método

Foram utilizados 40 casos de linfomascaninos, fixados em formalina 10% esubmetidos ao processamento histológicode rotina, corados pelo método daHematoxilina e Eosina (HE) e classificadosde acordo com a classificação morfológicade Kiel. Para a determinação doimunofenótipo, foram empregadosmarcadores linfóides para linfócitos T, oanticorpo policlonal anti-CD3 (Dako) nadiluição de 1:100 e para linfócitos B, oanticorpo monoclonal anti-CD79a (Dako)na diluição de 1:50.

A avaliação quantitativa de AgNORsfoi realizada por meio da contagem diretados pontos de AgNORs presentes nosnúcleos de 100 células em cada casoanalisado, em microscópio óptico na objetiva

de imersão.Foi utilizado para determinação do

índice de proliferação celular o anticorpoanti Ki-67 clone MIB-1, monoclonal(DAKO) na concentração de 1:50, Todas asamostras passaram pela recuperaçãoantigênica com solução tampão de citrato10 mM, pH 6,0, em forno de microondasdurante 15 minutos. O bloqueio daperoxidase endógena foi feito em soluçãode água oxigenada a 10 volumes por 15minutos. Os anticorpos primários foramincubados durante 18 horas na tempreraturade 4 ºC. O sistema de detecção utilizado foi okit EnVision Dual link (Dako) . Paravisualização da reação, as lâminas foramtratadas com solução de 3,3´diaminobenzidina(Liquid DAB – K3466 DakoCytomation)durante cinco minutos à temperatura ambiente.Os cortes foram contra-corados comhematoxilina de Harris, por 35 segundos.

Foi realizada a contagem de todas ascélulas presentes em cinco campos aleatóriosno aumento de 400 x do microscópioóptico. Nestes mesmos campos aleatóriosforam contadas as células positivas para cadaanticorpo e estabelecida o percentual decélulas positivas. Posteriormente, osresultados foram submetidos ao teste t(Student) a fim de verificar a diferença entrea média existente entre eles nos linfomas dealto e baixo grau de acordo com aclassificação de Kiel (grau de significânciaP < 0,05).

Resultados

Quando utilizada a classificação deKiel 13, foi observada a predominância doslinfomas de alto grau de malignidade, em29 casos (72,5%) seguidos por 11 casos delinfomas de baixo grau (27,5%) (Tabela 1).

No presente estudo obteve-se amesma freqüência de linfomas T e linfomasB, ocorrendo em 17 casos (42,5%), seguidospelos Linfomas T/B em seis casos (15%).Os 13 casos de linfomas T classificadoscomo de grau alto de malignidade, foramclassificados como imunoblásticos (Figura 1)e as neoplasias de grau baixo foram três casos

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de linfoma T pleomórfico e um linfocítico.Dentre os 17 casos de linfomas B, 11 casosforam de grau alto de malignidade e seiscasos foram de grau baixo de malignidade,sendo cinco centroblásticos, quatroimunoblásticos, dois Linfoblásticos, doiscentrocíticos-centroblasticos, doiscentrocíticos, um linfocítico e umlinfoplasmacítico

Dentre os 40 casos de linfomas, acontagem dos AgNORs foi realizada em 28casos, sendo 21 de grau alto de malignidade(Figura 2) e sete casos de grau baixo demalignidade. Obteve-se uma média denúmero de pontos de NORs por núcleo decélulas neoplásicas. Entre as neoplasias degrau alto de malignidade a média foi de 1,37± 0,32, e nos casos de baixo grau de 0,98 ±0,36, e distribuição dos pontos foi dispersapelo núcleo, correspondendo ao tipo II depadrão de distribuição.14 De acordo comTeste t (student) foi observada diferençaestatisticamente significativa (P< 0,05) entre

os grupos de graus alto e baixo demalignidade.

Entre as neoplasias de grau alto demalignidade (Figura 3), a média de célulasem proliferação marcadas pelo Ki-67(MIB-1) foi de 43,19% ± 19,01, e nos casosde grau baixo de 14,09% ± 11,74. Deacordo com Teste t (student) foi observadadiferença estatisticamente significativa

Tabela 1 - Linfomas de acordo com a classificação de Kiel 13

Figura 1 - Linfoma Imunoblástico (Kiel), canino. Ascélulas apresentam núcleo redondo com umúnico nucléolo central. HE

Figura 2 - Linfoma Imunoblástico , canino – múltiplosAgNORs distribuídos pelo núcleo das célulasneoplásicas e algumas células apresentandoum único ponto nuclear (1000x)

Figura 3 - Linfoma Imunoblástico (Kiel), canino –positividade para anticorpo anti- Ki-67 (MIB1), EnVision, DAB, contracorado comHematoxilina de Harris

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(P < 0,01) entre os grupos de alto e baixograu de malignidade.

Discussão

Os 40 casos de linfoma utilizadosneste trabalho foram classificados de acordocom a Classificação de Kiel 13, ondepredominaram os linfomas de grau alto(72,5%) em relação aos linfomas de graubaixo (27,5%). Este resultado é semelhanteao obtido por autores, que utilizaram estamesma classificação em material colhidopelo método da Punção Aspirativa porAgulha Fina 3,15 bem como nos trabalhos queutilizaram esta classificação em exameshistológicos 9,16,17,18,19 .

No que diz respeito à determinaçãodo imunofenótipo dos linfomas caninos oemprego dos anticorpos CD3 e CD79a,marcadores de células T e células B,respectivamente, tem permitido a utilizaçãode material fixado em formol e incluído emparafina.20,21,22 Determinação da origem Tou B dos Linfomas não-Hodgkin tem valorprognóstico e não pode ser definida pelamorfologia celular. 16,23 Os cães portadoresde Linfomas T respondem menos aotratamento quimioterápico e têm tempo desobrevida menor do que os cães portadoresde Linfomas B.23 Portanto, a classificaçãoimunocitoquímica dos linfomas torna-se umprocedimento importante para a definiçãodo comportamento clínico da neoplasia e suaresposta ao tratamento quimioterápico.2,8,9,12,18,23

Na casuística utilizada neste trabalhofoi observado o mesmo número de casoscom imunofenótipo T (CD3+/CD79a-) eimunofenótipo B (CD3-/CD79a+), sendo17 casos (42,5%) de cada imunofenótiposeguido pelos linfomas de imunofenótipoT/B (CD3+/CD79+) em 15% dos casos,resultados semelhantes aos encontrados emoutro estudo, com os mesmos anticorpos.22

Em trabalhos realizados anteriormente emnosso laboratório com material incluído emparafina 20 e em material citológico 15,detectaram a predominância dos linfomasde imunofenótipo T. Milner et al. 18 referemo mesmo tipo de achado, utilizando um

painel mais amplo de anticorpos. Afreqüência encontrada por estes autoresfoi de 60% de Linfomas T e 40% deLinfomas B.

No entanto, a maioria dos autores quetrabalhou com imunofenotipagem doslinfomas caninos relata a predominância dosLinfomas B em suas casuísticas, emboratambém ocorra grande variação nasfreqüências encontradas e na metodologiaempregada.2,9,12,18,24

A freqüência de Linfomas B varioude 55,1% a 77,7% nas casuísticas dos autoresque verificaram o predomínio desteimunofenótipo utilizando painéis deanticorpos amplos em material citológico ouincluído em parafina.3,9,19,24 Deve-se ressaltarque mesmo com o predomínio doimunofenótipo B, a freqüência dos LinfomasT pode ser alta, chegando a 42% dos casos.3

Índice de Proliferação Celularpelo método do Ki-67 (MIB-1)

Quando analisada a marcação comKi-67 para proliferação celular, pode-senotar diferença significativa dos índices deproliferação entre os grupos de graus alto ebaixo de malignidade e este resultadoconcorda com a literatura, tanto paralinfomas caninos como linfomas não-Hodgkin dos seres humanos.5,9,25,26,27

Em estudo que analisou 92 casos delinfomas caninos, observou que os linfomasde grau baixo de malignidade possuíamíndices de proliferação entre 3 e 16% e osde grau alto, entre 39 e 60%.12 No mesmotrabalho, os autores relatam que dentre oslinfomas de grau baixo, dois casosapresentaram média maior que os 21%,sendo o maior, um linfoma Centrocíticocom 30% de células positivas para omarcador Ki-67. Todos os linfomas de altograu apresentaram índice proliferativo maiorque o limite de 21%, sendo entãoestabelecido o limite percentual de 21% entreos tumores de graus alto e de baixo demalignidade.

No presente trabalho, a variação daproliferação entre os linfomas de baixoestava entre 1,67 e 34,5% e considerando os

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de grau alto, esta variou entre 24,4 e 80,53%.Utilizando o limite de 21% como parâmetropara dividir as neoplasias de acordo com ograu de malignidade, obteve-se três casosde grau baixo com percentual maior que olimite, sendo o maior um linfomaCentrocítico com 34,5% de célulasmarcadas e todos os de grau altoapresentaram o índice de proliferação maiorque 21%, sendo o menor, com 24,4% umlinfoma Imunoblástico.

Este mesmo parâmetro de percentualde células em proliferação de divisão doslinfomas em graus alto e baixo demalignidade foi estabelecido nos linfomasdos seres humanos em trabalhos comvalores de 20% e 26%.10,11

Os valores observados, na literaturaconsultada, para os índices proliferativosdemonstram que em alguns tipos citológicospodem ocorrer discrepâncias quanto a estesparâmetros e, portanto, o índice deproliferação celular deve ser analisadojuntamente com a classificação cito-histológica dos linfomas para estabelecer opadrão de comportamento da neoplasia. Oslinfomas de alto grau de malignidade, nasespécies humanas e caninas, com um altoíndice de proliferação celular tendem aresponder melhor a quimioterapia.9,26 Assimsendo, os índices proliferativos devem serconsiderados, principalmente, na análise decasos individuais da rotina de diagnóstico afim de auxiliar a escolha do tratamento.

Em nosso estudo, a média de númerode AgNORs intranuclear nos linfomas dealto grau de malignidade foi estatisticamentemaior que nos linfomas de grau baixo, oque corrobora os dados presentes naliteratura consultada.7,28,29

Embora o número maior deAgNORs nos linfomas de grau alto demalignidade que nos de baixo grau concordecom vários autores, as médias encontradasno neste estudo foram mais baixas que asmédias da literatura consultada. Os linfomasde baixo grau apresentaram uma media de0,98 ± 0,36 e os de alto grau, 1,37 ± 0,32.Estudo utilizando o mesmo tipo de material,encontrou para os linfomas de baixo grau,

em média um ponto de AgNOR por núcleoe nas neoplasias de alto grau, foram contadoscinco AgNORS por núcleo.14 Outro estudo,quando utilizaram material histológico ecitológico para contagem dos AgNORs,obtiveram nas amostras histológicas avariação de 2,2 a 3,0 nos linfomas de baixograu e 2,6 a 3,7 nos de alto grau.29 Estesmesmos autores relatam que estas diferençasnas médias de diversos trabalhos podemocorrer devido a alterações durante oprocessamento desde a fixação do material,processamento histológico até mesmodurante a coloração pela prata. A técnicautilizada para corar os linfomas deste estudoseguiu o mesmo padrão descrito pordiversos autores. No entanto, os tempos defixação do material, desparafinização edesidratação não foram padronizados noscasos resgatados do arquivo. Estas variaçõespodem interferir na impregnação da prata,formando grandes agregados ao invés depequenos pontos, isso leva a um excesso deprata intranuclear e reduz o número depontos contados nos núcleos interferindo namédia de AgNORs.29

Quando foram comparados osresultados deste trabalho com outro estudorealizado no mesmo laboratório nota-se quemesmo havendo diferenças entre os grausde malignidade, as médias deste trabalhoforam maiores que no presente estudo.22 Estadiferença pode ser devido ao tipo de materialutilizado por Pessoa22, que utilizou amostrascolhidas por meio de citologia aspirativa.Segundo Valdovich et al.29, mesmoutilizando amostras citológicas e histológicasdos mesmos casos, obtiveram númerosmaiores de AgNORs nos exames citológicose de acordo com estes autores, as células nasamostras citológicas apresentam-se íntegrase não fatiadas pelo micrótomo como naspreparações histológicas, por isso o númerode AgNORs seria maior e os NORspequenos seriam mais facilmentereconhecidos. Mesmo assim, o método decontagem do AgNORs, é de grande eficáciana determinação do grau de malignidade doslinfomas caninos, tanto nas amostrashistológicas como naquelas colhidas pela

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citologia aspirativa.Quando analisados os linfomas de

alto grau, os linfomas Centroblásticosapresentavam a maior média no númerode AgNORs, no presente trabalho,os tipos de neoplasia que mostraramas maiores quantidades depontos intranucleares foram oslinfomas Imunoblásticos, seguidos pelosCentroblásticos.14

O padrão de distribuiçãoencontrado em todos casos de linfomanesta pesquisa, corresponde ao tipo II, queapresenta vários aglomerados de NORsno núcleo. Alguns autores verificaram,estudando pacientes com leucemiascrônicas, que o prognóstico de leucemiaprogressiva estava relacionado com um

número maior de aglomerados de NORse as amostras com NORs únicos, ospacientes eram considerados estáveis . Onúmero de AgNORs nas células malignasé maior que nas hiperplásicas ou benignase está associado com a alta taxa deproliferação celular.14,29,30,31,32 Estes últimosautores obtiveram cerca de 80% dasneoplasias classificadas no padrão dedistribuição II e o padrão em todas asamostras de l infonodos normais oureativos possuem apenas um agregadopequeno.

Agradecimentos

Apoio financeiro FAPESP: processonº 04/08732-1.

Cell proliferation in canine lymphoma

Abstracts

Lymphoma studies deals with morphological classification andimmunophenotypic features and they have to be amplified for cellularkinetics evaluation. This evaluation can only be safely made, when theproliferative index are evaluated. In men the proliferation index have,most of the time, important influence in the neoplasia prognosisand treatment In this work it was used 40 canine lymphomas thatwere classified according to Kiel methods and immunophenotypewas achieved with CD3 (T lymphocyte) and CD79a (B lymphocyte).Cellular proliferation was evaluated by AgNORs and Ki-67 (MIB-1)According to Kiel classification system, high grade lymphomas weremore frequent and T and B lymphoma showed the samefrequency.When cellular proliferation was evaluated, there was asignificant difference between high grade and low grade lymphomasby AgNOR and Ki-67 (MIB-1) methods, but did not differ whencomparing immunophenotype. Among high grade malignancylymphomas the NORs medium number per cell nucleoli was 1.37±0.32 and in low grade was 0.98± 0.36, concerning Ki-67 the positivecellular percentual was 43.19% ± 19.01, e 14.09% ± 11.74 in high andlow grade, respectively

Key words:Lymphoma.Canine.Proliferation.Ki-67.AgNORs.

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proliferação celular nos linfomas caninos

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