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Mecanismos de Formação de Heterocromatina

Mestranda Larissa M. de Andrade

Orientador Prof. Dr. Mateus Mondin

LGN 5799 - SEMINÁRIOS EMGENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil

Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php

O que é Heterocromatina

Emil Heitz (1928) descreveu a heterocromatinacomo o material nuclear que se mantém

condensado em todo o ciclo celular, ao contráriodo resto do cromossomo, que apresenta um ciclo

de condensação-descondensação

(Grewal e Jia, 2007)

• Classificação da heterocromatina:

Heterocromatina facultativa: ocorre em apenas um doscromossomos do par, e é ativo em apenas um curto períodode tempo do ciclo de vida; mantendo-se epigeneticamentereprimidos e heterocromáticos no restante da vida doindivíduo

Heterocromatina constitutiva: ocorre no par de cromossomoshomólogos, e não é transcrito devido à sua composição doDNA

Introdução

(Sumner, 2003)

• Localização:

Centromérica: Praticamentetodos os cromossomos têmblocos de heterocromatina naregião centromérica e estesblocos podem variar emtamanho entre grande e muitopequeno

Exemplo: Arabidopsis

Introdução

(Sumner, 2003)

Humanos

Milho

Aguiar-Perecin, M. L. R. et al., 2000

Introdução

Intersticial e Terminal: são menos comuns; comuns em plantas com cromossomos grandes e insetos

Altamente condensada

Baixa

Final da fase S

Baixa frequência

Baixa

• Aparência na intérfase

• Densidade de gene

• Replicação

• Recombinação meiótica

• Acessibilidade a nuclease

Características da Heterocromatina:

Introdução

(Sumner, 2003)

Introdução

é composta por seqüências de DNA repetitivo que tem pouca ou nenhuma atividade

silenciadas por modificações covalentes no DNA ou nas histonas;

Auxilia na recombinação entre elementos repetitivos;

Auxilia no controle da segregação dos centrômeros;

Promove interações entre regiões de cromatina;

Características da Heterocromatina:

• Formação e manutenção integram 2 tipos de informações:

localização cromossômica e nuclear

presença e densidade de elementos de DNA repetitivo


são os principais alvos de formação da heterocromatina

encontrados em centrômeros, telômeros e ‘knobs'

seqüências de DNA satélite e elementos transponíveis

Introdução

Mecanismos de Formação da Heterocromatina

Metilação do DNA

Interferênciapor RNA

Modificações nas Histonas

Metilação do DNA

• A metilação é uma modificação comum no DNA doseucariotos Carbono 5 da citosina (5- methylcytosine,5mC)

Metilação do DNA

http://www.scq.ubc.ca/human-cloning-science-fiction-or-reality/

• Em Plantas ocorre predominantemente nos sítios GC, mastambém em sítios CHG e CHH (onde H é A, T, or C)

• O nível de 5-MC é variável em Plantas:

6% das citosinas em Arabidopsis (Kakutani et al. 1999)

25% das citosinas em Milho (Papa et al. 2001)

Metilação do DNA

(Teixeira et al., 2009)

Metilação do DNA

• Está ausente ou quase ausente na levedura, moscas enematóides

• A interação entre a metilação do DNA e a metilação dehistonas é bem estabelecida em animais e plantas

• Em Plantas, os transposons são metilados, os quais resultamna regulação dos genes vizinhos

(Lippman & Martienssen, 2004)

(Lippman e Martienssen, 2004;Vaughn et.al, 2007)

• Os blocos de heterocromatina estão metilados e hipometilados

O repeat de 178 pb associado a CEN na cromatina sãohipometilados em comparação com o mesmo repeatlocalizado na heterocromatina pericentromérica em milho eArabidopsis

Epigenetic Modification of Centromeric Chromatin: Hypomethylation of DNA Sequences in the CENH3-Associated Chromatin in Arabidopsis thaliana and Maize

5-MC em Arabidopsis

• Marca cromocentros

• Sinais com centros ocos em alguns núcleos

• Os centros ocos são ocupados por cromatina associada a CENH3

• As seqüências de DNA na cromatina CENH3 são hipometiladascomparada as seqüências de DNA da cromatina pericentromérica

5-MC em Milho

• Redução significativa do sinal de metilação foi observada nosdomínios ocupado por CENH3

• As seqüências de DNA na cromatina CENH3 são hipometiladascomparada as seqüências de DNA da cromatina pericentromérica


• Conclusões:

• Em Arabidopsis e no Milho os repeats associadoscom a cromatina CENH3 são hipometiladas emcomparação com o mesmo repeat localizado nasregiões pericentromérica

• Os resultados sugerem que a metilação do DNAdesempenham um papel importante nademarcação epigenética da cromatina CENH3



• As modificações nas histonas ocorrem, normalmente, nascaudas N-terminais

(Lippman e Martienssen, 2004)

• Muitas destas alterações são específicas para:o Heterocromatina: metilação de histonas H3 na lisina 9o Eucromatina: metilação de histonas H3 na lisina 4


http://chemistry.gsu.edu/faculty/Zheng/pictures/nucleosome.jpg

• As modificações estão implicadas na regulação dos genes,formação e manutenção das heterocromatinas

• Histonas são modificadas em muitos sítios: Há mais de 60resíduos diferentes de modificações em histonas que foramdetectados por meio de anticorpos específicos


(Fuchs et al., 2008)

(Kouzarides, 2007)

• Há 3 tipos de metilação:


(Sumner, 2003)

• A heterocromatina é, normalmente, transcricionalmente inativa

• hipoacetilada nas histonas H3 e H4;• hipometilada na lisina 4 da H3;• altamente metilada na lisina 9 da histona H3

em levedura, Drosophila, mamíferos e Arabidopsis

(Jasencakova et. al, 2003)


• Proteínas que auxiliam na formação da heterocromatina

Essas proteínas não foram descritas em

Plantas, mas estudos mostram que

existem proteínas análogas


(Sumner, 2003)

• Essas proteínas (Swi6p, HP1) quando ligada a H3K9 me2, servecomo uma plataforma de montagem de fatores modificadores dacromatina que são envolvidos na estabilização (manutenção) edisseminação de heterocromatina




(Grewal e Jia, 2007; Jasencakova et. al, 2003)

• Esta estratégia geral da metilação da histona, funcionandocomo uma âncora para recrutar efetores, não se restringe aheterocromatina, sendo utilizados em loci eucromático, ondeH3K4me e H3K36me recrutam HDAC para a remodelação dacromatina

Bandeiras vermelhas indicam H3 metilada na lisina 9 HMT - Histona metiltransferaseHDAC – Histona deacetilase

“Código de Histonas”


(Jasencakova et. al, 2003)

A alta diversidade de modificações de histonas, bem comoo elevado número de resíduos que podem ser modificadosdentro de caudas das histonas, e a correlação dasalterações individuais com vários processos nucleares,levam à hipótese de que combinações específicas demodificações de histonas fornecem um código de histonas,que determina funções específicas

Comparar a distribuição das modificações de histonas aolongo dos cromossomos durante o ciclo celular em espéciesde plantas que diferem no tamanho do genoma e na filogenia

Padrões de distribuição das modificações nas histonas não são conservados entre as plantas

Chromosomal histone modification patterns – from conservation to diversity

• Arabidopsis - 160 Mbp/1C

Eucromatina: marca específica da eucromatina, enquanto que onucléolo e o cromocentros permanecem não marcados

Heterocromatina: anticorpos contra as marcas de metilaçãomostra sinais específicos preferencialmente no cromocentros


• H. vulgare – 5100 Mbp/1C (Orientação de Rabl):

Eucromatina: marcas de metilação específicas mostram umaredução gradual da marcação dos telômeros em direção aopólo centromérico

Heterocromatina: marcas de metilação mostram uma reduçãode intensidades de sinal detectável nas regiões eucromáticas


FISH com sondas para centrômeros (BAC7 -cyan) e os telômeros(HvT01 - verde)


• Vicia faba - 740 Mb/1C

Eucromatina: marcas específicas de eucromatina são ausentesnos conjuntos de heterocromatina

Heterocromatina: marcas específicas apresentam umadistribuição dispersa



• Dinâmica do ciclo celular e a intensidade de acetilação em váriosresíduos de lisina da H3 e H4 em domínios distintos dacromatina:

A intensidade de acetilação em eucromatina e heterocromatinaaumenta durante a replicação


• A distribuição cromossômica das modificações (acetilação emetilação) podem variar ao longo do ciclo celular, bem comodentro e entre grupos de eucariontes

possibilidade de divergência evolutiva na leitura do "código das histonas”

• Conclusões:

a metilação da H3K4 me2 são restritas a eucromatina

H3K9me1, 2, e H3K27me1 H4K20me1 são marcas conservadas daheterocromatina e exibem padrões de distribuição diferentesdependendo do tamanho do genoma


Silenciamento de RNA

RNA de interferência

• Conceito:


É um mecanismo encontrado em uma grande variedade de eucariontes, e sua principal

característica é a utilização de pequenas moléculas de RNA (21-28 nucleotídeos) que conferem alta

especificidade a seqüência homóloga

• Histórico:

Plantas: descrito em Petunia

Animais: Fire e colaboradores (1998) descreveram omecanismo em Caenorhabditis elegans como "interferênciapor RNA ” (RNAi)

RNAi foi originalmente definido como um mecanismo desilenciamento pós-transcricional

• A maquinaria de RNAi é composta por: RNA-dependente deRNA polimerase (RdRP), Dicer (Dcr) e Argonauta (Ago)

Silenciamento de RNA

(Almeida e Allshire, 2005; Novina e Sharp, 2004)



• Atuação do RNAi está envolvida na manutenção daheterocromatina em sítios de:

o elementos transponíveis (‘jumping genes’)

o DNAs repetitivos (incluindo transgenes)

(Lippman e Martienssen, 2004; Novina e Sharp, 2004)

Garantem a estabilidade do genoma


altera a estrutura da cromatina

Recrutamento de: •Histona Metiltransferase•De novo DNA metiltransferase•Proteínas que modificam cromatina

Mecanismo

(Vaucheret, 2006)

Heterochromatin siRNA: hc-siRNA


Heterocromatina em Plantas

• A heterocromatina em plantas envolve RNAi, mas a metilaçãono DNA e modificações são fatores importante na sua formação;

• 90%-95% dos siRNAs (pequenos RNAi) em Arabidopsiscorrespondem a transposons e sequências repetitivas, nasquais as histonas e o DNA são facilmente metilados;

DNA metiltransferases e histonas deacetilases

RNAi e metiltransferasesdas histonas

participam da formação e manutenção da heterocromatina


Conclusão

• As modificações nas histonas e a metilação do DNA sãomecanismos interdependentes na formação e manutenção daheterocromatina

• O papel da metilação do DNA na formação daheterocromatina foi reconhecido antes das modificações dashistonas

• Diferenças na indexação heterocromatina correspondem adiferenças na composição de seqüência ao longo doscromossomos e, conseqüentemente, diferenças naorganização do cromossomo



(Lippman & Martienssen, 2004)

• Nas plantas, transposons são inativos e altamente metilados,

enquanto genes raramente têm qualquer metilação do DNA

• A heterocromatização dos elementos móveis serve como ummecanismo de defesa, silenciando sua atividadepotencialmente deletéria

• Tem papel na regulação da expressão gênica durante odesenvolvimento e diferenciação celular

Conclusão

(Rabinowicz et al., 2005)

Conclusão

• Estes 3 mecanismos grande importância no processo evolutivo das plantas

http://www.nature.com/scitable/nated/content/19804/10.1038_nature02625-f1_mid_1.jpg

Referencial Bibliográfico

• ALMEIDA, R. E ALLSHIRE, R.C. 2005 RNA silencing and genome regulation.TRENDS in Cell Biology 15: 251- 258.

• FUCHS, J et al. 2006 Chromosomal histone modification patterns – fromconservation to diversity. TRENDS in Plants Science 11:199-208.

• GREWAL, S. I. S. e JIA, S. 2007 Heterochromatin revisited. Nature Reviews8: 35-46.

• GRAFI G, ZEMACH, A e PITTO, L 2007 Methyl-CpG-binding domain (MBD)proteins in plants. Biochimica and Biophysica Acta 1769:287-294.

• JASENCAKOVA, Z. et al. 2000 Histone H4 Acetylation of Euchromatin andHeterochromatin Is Cell Cycle Dependent and Correlated with ReplicationRather Than with Transcription. The Plant Cell 12: 2087-2100.

• JASENCAKOVA, Z.; MEISTER, A. E SCHUBERT, I. 2001 Chromatinorganization and its relation to replication and histone acetylation duringthe cell cycle in barley. Chromosoma 110: 83-92.

• LIPPMAN, Z. and MARTIENSSEN, R. 2004 The role of RNA interference inheterochromatic silencing. Nature 431: 364-370.

• NOVINA,C.D. e SHARP, P.A. 2004 The RNAi revolution. Nature 430: 161-164.

• RABINOWICZ, P.D. et al. 2005 Differential methylation of genes andrepeats in land plants. Genome Research 15:1431–1440.

• RICHARDS, E.J. 2006. Inherited epigenetic variation -revisiting softinheritance Nature Reviews 7: 395-401.

• SUMNER, A. 2003 Chromosomes Organization and Functions. BlackwellScience Ltd. Cap 7- pag.:84-96.

• VAUCHERET, H. 2006 Post-transcriptional small RNA pathways in plants:mechanisms and regulations. Genes Dev. 20: 759-771.

Referencial Bibliográfico

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