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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE GENÉTICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA

Análise cromossômica comparativa de duas espécies do gênero Coprophanaeus

(Coleoptera: Scarabaeidae).

Sárah Gomes de Oliveira

Recife, PE Fevereiro, 2008

Sárah Gomes de Oliveira

Análise cromossômica comparativa de duas espécies do gênero Coprophanaeus

(Coleoptera: Scarabaeidae).

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Genética da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Mestre em Genética.

Orientadora: Profª. Drª. Maria José de Souza

Lopes, Depto. de Genética, Centro de Ciências Biológicas, UFPE.

Co-Orientadora: Profª. Drª. Rita de Cássia de

Moura, Depto. de Biologia, Instituto de Ciências Biológicas, UPE.

Recife, PE Fevereiro, 2008

Oliveira, Sárah Gomes de Análise cromossômica comparativa de duas espécies do gênero Coprophanaeus (Coleóptera: Scarabaeidae). / Sarah Gomes de Oliveira. – Recife: A Autora, 2008.

103 fls. .: il.

Dissertação (Mestrado em Genética) – UFPE. CCB 1. Coleóptera 2. Coprophanaeus 3. Cariótipo 4. heterocromatina I.Título

595.76 CDU (2ª. Ed.) UFPE 595.76 CDD (22ª. Ed.) CCB – 2008 – 41

Aos meus pais, Manoel e Márcia,

dedico.

Agradecimentos

À minha família, pelas lições de esperança, por terem cultivado em mim o amor, a

compreensão e a alegria, me proporcionando a confiança necessária para realizar meus

objetivos. À minha mãe por sua imensa paciência e por seu incentivo em momentos diversos

e de forma incondicional. Ao meu pai, que me ensinou a ser forte e que me incentivou a

prosseguir, contagiando-me com seu amor. A meu irmão, por trazer luz e gosto para minha

vida. Você é a comprovação mais profunda de que vivi de ética, dignidade e amor. A minha

avó, por seus exemplos de honra, caráter e delicadeza. Por ser minha fada, enchendo meus

dias com luz, um amor especial...

À Profª Drª Maria José de Souza Lopes, pelos ensinamentos e exemplo profissional e

ético, pelo apoio, críticas, atenção, cuidado e por ter me incentivado a fazer sempre o melhor.

À Rita de Cássia de Moura, na qualidade de amiga e co-orientadora, minha gratidão pela

orientação que ultrapassa a Dissertação, bem como pelos tantos e inesquecíveis diálogos.

Às técnicas Cirlene e Francisca, pela cooperação, contribuindo para a concretização

deste trabalho.

Meus sinceros agradecimentos aos meus adorados amigos – tanto aos ‘velhos’ e

queridos quanto aos que se revelaram ao longo desse tempo. É difícil exprimir a beleza de

nossa amizade e o sentimento maravilhoso de tê-los ao meu lado.

Aos meus amigos e colegas de trabalho do Laboratório de Biodiversidade e Genética

de Insetos/UPE: Amanda, Celso, Cristiane, Fernando, Maria Clara, Mônica, Victor e Profª Drª

Marília de França Rocha, pela sincera solicitude e pela contribuição, em alegria e afeto.

Aos amigos e colegas de trabalho do Laboratório de Citogenética e Genética

Animal/UFPE: Adriana, Bárbara, Carolina, Danielle, Graci, Jefferson, Luzia, Marcela, Nara,

Thatiane, Tyago, Profª Drª Neide Santos e Profª Drª Vilma Loreto, pela confiança,

compreensão, generosa solidariedade e carinho desprendido. À Diogo pela amizade, constante

“chatice”, e pela ajuda para captura das imagens de fluorescência constantes neste trabalho. À

Merilane, Jéssica e Ituza, pela indescritível solidariedade e generosidade, que se traduziram

em entusiasmadas ajudas e longas e divertidas conversas. À Cibele (Bela), amiga de todas as

horas, pela sensibilidade e constantes brincadeiras; sem a sua cumplicidade e carinho teria

sido mais difícil. À Pollyanna pela grandeza de seu caráter e de seu coração, que permitiram

que tivéssemos o nosso “reencontro”.

Aos companheiros que me acompanharam nesta jornada. Em especial Carlos e

Edilene, pela amizade compartilhada por esse tempo e que deixou lembranças de momentos

dos quais me lembrarei com carinho.

Aos amigos integrantes do “G10”, que agora se transformou em uma verdadeira

comunidade: Cristiane (Cris), Danillo, Fernando (Paredez), Hugo, Marcelo (Coca), Mariana

(Mari Mari), Humberto, Nathália (Nath)... E todos os agregados (você também, Clara!). Por

fazerem “meu coração sorrir”. A Paulo (Pessoa) que, mesmo à distância fez chegar, de

diversas formas, seus incentivos e carinhoso cuidado. À minha eterna amiga Beatriz

(Pumbaa), pelas alegrias passadas e futuras. À Bruna, Iêda, Fabrício e Renato, por terem feito

a diferença em minha vida.

À Hugo pelo auxílio e pela compreensão quanto ao afastamento e ausência em alguns

momentos. Por estar sendo a pessoa que, com competência, tem me conduzido aos caminhos

da harmonia.

Ao Dr. Sérgio Ide, ao Dr. Fernando Zaguri Vaz-de-Mello e ao mestre Fernando

Augusto Barbosa Silva pela identificação taxonômica das espécies analisadas. Ao Prof. Dr.

Marcelo Guerra por disponibilizar o sistema de captura de imagens do Laboratório de

Citogenética Vegetal.

Ao CNPq pelo apoio financeiro através da concessão da bolsa de Pós-graduação,

durante o desenvolvimento deste trabalho.

“Não tenho medo nem de chuvas tempestivas nem de grandes ventanias soltas, pois eu também sou o escuro da noite.”

Clarice Lispector

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS

08

LISTA DE TABELAS

09

LISTA DE ABREVIAÇÕES

10

RESUMO

11

1. INTRODUÇÃO

12

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 142.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE A FAMÍLIA SCARABAEIDAE 142.2. CARACTERIZAÇÃO CARIOTÍPICA DE SCARABAEIDAE 182.2.1. MECANISMOS CROMOSSÔMICOS DE DETERMINAÇÃO DO SEXO EM SCARABAEIDAE

24

2.3. HETEROCROMATINA CONSTITUTIVA 282.3.1. HETEROCROMATINA CONSTITUTIVA EM SCARABAEIDAE 342.4. REGIÕES ORGANIZADORAS DE NUCLÉOLOS 452.4.1 REGIÕES ORGANIZADORAS DE NUCLÉOLOS EM SCARABAEIDAE

47

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

55

4. MANUSCRITO DE ARTIGO CIENTÍFICO ANÁLISE CITOGENÉTICA COMPARATIVA ENTRE COPROPHANAEUS (MEGAPHANAEUS) ENSIFER E COPROPHANAEUS (COPROPHANAEUS) CYANESCENS (COLEOPTERA: SCARABAEIDAE).

68

5. CONCLUSÕES

92

6. ABSTRACT

94

7. ANEXOS 957.1. INSTRUÇÕES PARA AUTORES - GENETICA 967.2. FOTOGRAFIAS DAS ESPÉCIES ANALISADAS 104

Lista de Figuras

Manuscrito Figura 1. Coloração convencional de cromossomos meióticos de Coprophanaeus (Megaphanaeus) ensifer (a), (c), (e) e (g), e Coprophanaeus (Coprophanaeus) cyanescens (b), (d), (f) e (g). (a)-(b) metáfases I, (c)-(d) anáfases I, e (e)-(h) metáfases II. Barra = 5 µm.

88

Figura 2. Bandeamento C (a)-(b) e coloração com AgNO3 (c)-(d) em metáfase II e metáfase I de Coprophanaeus (Megaphanaeus) ensifer, respectivamente (a) e (c), e metáfases I de Coprophanaeus (Coprophanaeus) cyanescens (b) e (d). Em (a) o cromossomo Y é mostrado em detalhe. As setas indicam cromossomos com blocos heterocromáticos adicionais, teloméricos e intersticiais. Barra = 5 µm.

89

Figura 3. Tríplice coloração (CMA3/DA/DAPI) em metáfases II de Coprophanaeus (Megaphanaeus) ensifer (a)-(b) e metáfases I de Coprophanaeus (Coprophanaeus) cyanescens (c)-(d). Em (a) as setas indicam blocos intersticiais. Em (a) e (b) o cromossomo Y é mostrado em detalhe. Barra = 5 µm.

90

Figura 4. FISH com sondas de DNAr 45S em metáfases I de Coprophanaeus (Megaphanaeus) ensifer (a)-(b) e Coprophanaeus (Coprophanaeus) cyanescens (c)-(d). Em (a) e (c) coloração com DAPI. As setas em (b) e (d) indicam os sítios de DNAr. Barra = 5 µm.

91

Lista de Tabelas

Revisão Bibliográfica Tabela 1. Meiofórmula e padrão de distribuição de heterocromatina constitutiva em diferentes subfamílias de Scarabaeidae.

40

Tabela 2. Meiofórmula e qualificação da heterocromatina constitutiva em diferentes subfamílias de Scarabaeidae.

44

Tabela 3. Meiofórmula, coloração com nitrato de prata (AgNO3) e hibridização in situ fluorescente (FISH) com sonda de DNAr em diferentes subfamílias de Scarabaeidae.

53

Lista de abreviações

2n Número diplóide

AgNO3 Nitrato de Prata

AT Adenina e Timina

CCB Centro de Ciências Biológicas

CMA3 Cromomicina A3

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

CS Complexo Sinaptonêmico

DA Distamicina A

DAPI 4’-6-diamidino-2-fenil-indol

DNA Ácido Desoxirribonucléico

DNAr Ácido Desoxirribonucléico Ribossômico

ETS Espaçadores Transcritos Externos

FISH Hibridização in situ fluorescente

GC Guanina e Citosina

HC Heterocromatina Constitutiva

HCl Ácido Clorídrico

HF Heterocromatina Facultativa

IGS Espaçadores Transcritos Externos

ITS Espaçadores Transcritos Internos

RNA Ácido Ribonucléico

RNAr Ácido Ribonucléico Ribossômico

RON Região Organizadora de Nucléolo

S Svedberg (medida de velocidade de sedimentação de uma partícula)

sp Espécie

X Cromossomo sexual X

Y Cromossomo sexual Y

Oliveira, S.G. Análise cromossômica comparativa de duas espécies de Coprophanaeus...

11

Resumo

Os cromossomos de Coprophanaeus (Megaphanaeus) ensifer e C. (Coprophanaeus)

cyanescens foram estudados através da coloração convencional, bandeamento C, impregnação

com nitrato de prata (AgNO3), fluorocromos base específicos e FISH. As espécies

apresentaram cariótipo simétrico, número diplóide de 2n=20 e morfologia meta-

submetacêntrica. As espécies C. (M.) ensifer e C. (C.) cyanescens mostraram mecanismos

sexuais do tipo XY e XYp, respectivamente. A análise da distribuição da heterocromatina

constitutiva (HC) nas duas espécies revelou cromossomos difásicos correspondendo aos

braços longos dos bivalentes autossômicos. Em adição, C. (M.) ensifer mostrou blocos

pericentroméricos em três bivalentes autossômicos e no X, bloco telomérico no par 9 e o Y

quase totalmente heterocromático. C. (C.) cyanescens apresentou cromossomo X quase

completamente heterocromático e o Y com pequeno bloco pericentromérico. A coloração

CMA3/DA/DAPI evidenciou blocos heterocromáticos CMA3+ positivos no bivalente sexual

de C. (C.) cyanescens, enquanto em C. (M.) ensifer foram visualizados blocos

pericentroméricos CMA3+ em todos os autossomos e no X, e intersticiais em três bivalentes

autossômicos. A coloração DAPI foi uniforme nas duas espécies. A impregnação com AgNO3

foi ineficiente para detecção de cromossomos portadores de RONs, entretanto, mostrou

afinidade pela HC. A FISH evidenciou sítios de DNAr na região telomérica de três bivalentes

autossômicos de C. (C.) cyanescens, e em sete bivalentes e no X de C. (M.) ensifer. As

diferenças e similaridades cariotípicas encontradas nas duas espécies são discutidas e

comparadas com dados descritos para outras espécies de Coleoptera.

Palavras-chave: Cariótipo, Coprophanaeus, heterocromatina, FISH, RON


12

1. Introdução

A ordem Coleoptera possui 370.000 espécies distribuídas mundialmente e se divide

em quatro subordens, Adephaga, Archostemata, Myxophaga e Polyphaga. Representa o grupo

de insetos mais abundante, compreendendo cerca de 40% das espécies de insetos e 30% dos

animais (Gaston, 1991; Hammond, 1992. Dentre as superfamílias de Polyphaga,

Scarabaeoidea se destaca pelo alto número de espécies e por possuir representantes

bioindicadores ambientais (Costa, 2000).

Apesar da diversidade do grupo e de sua importância ambiental, análises citogenéticas

ainda são escassas. A família Scarabaeidae é bastante conservada em relação ao número

diplóide 2n=20, mecanismo sexual Xyp e cromossomos meta-submetacêntricos. Dentre suas

subfamílias, Scarabaeinae tem sido considerada a menos conservada cariotipicamente (Smith

e Virkki, 1978).

Estudos realizados com o uso de bandeamento C em Scarabaeidae têm revelado a

heterocromatina constitutiva (HC) na região pericentromérica de cromossomos autossômicos,

podendo ocorrer também em regiões teloméricas e intersticiais; enquanto nos sexuais

freqüentemente está localizada na região pericentromérica ou ao longo de todo o

cromossomo. A coloração com fluorocromos base-específicos tem proporcionado a análise

qualitativa da HC, devido à sua capacidade de interação preferencial com regiões ricas em

pares de bases AT ou GC. Em Scarabaeidae, estudos realizados até o momento objetivando a

análise da distribuição e composição dos pares de bases da HC têm demonstrado grande

heterogeneidade (Vitturi et al., 2003; Moura et al., 2003; Angus et al., 2007).

A impregnação com nitrato de prata (AgNO3) permite a detecção de regiões

organizadoras de nucléolos (RONs) que estiveram ativas na interfase anterior, enquanto a

técnica de hibridização in situ fluorescente (FISH) tem sido utilizada para a detecção de sítios


13

de DNAr, possibilitando a determinação de RONs independentemente de sua atividade. Nos

representantes de Scarabaeidae, as RONs foram localizadas predominantemente em um par

autossômico, contudo, resultados bastante heterogêneos têm sido descritos para esta família

(Colomba et al., 2000a; Vitturi et al., 2003; Moura et al., 2003; Bione et al., 2005a).

Considerando a importância biológica de Scarabaeinae, a viabilidade de sua análise

cromossômica através da coloração convencional e uso de técnicas citogenéticas diferenciais,

a caracterização cariotípica do gênero Coprophanaeus contribuirá para um melhor

entendimento das implicações cariotípica-evolutivas deste grupo.

Este trabalho teve como objetivo analisar citogeneticamente duas espécies do gênero

Coprophanaeus (Scarabaeidae: Scarabaeinae), caracterizar os padrões de distribuição,

variabilidade e composição da heterocromatina constitutiva, determinar o padrão de

distribuição das RONs, bem como relacionar os dados citogenéticos obtidos com resultados

de outras espécies e gêneros relacionados. Os resultados obtidos contribuirão para um melhor

entendimento das características cromossômicas e dos mecanismos evolutivos envolvidos na

diferenciação deste grupo.


14

2. Revisão bibliográfica

2.1. Considerações gerais sobre a família Scarabaeidae

A ordem Coleoptera compreende cerca de 370.000 espécies mundialmente

distribuídas, e um grande número de seus representantes ocorre nas regiões tropicais em

especial na região Neotropical, conhecida como o maior repositório de coleópteros do planeta

(Crowson, 1967; Gaston, 1991; Hammond, 1992). Para esta região aproximadamente 7.000

gêneros e 80.000 espécies foram descritas, estando distribuídas em 127 famílias, das quais

aproximadamente 5.000 gêneros e 30.000 espécies ocorrem no Brasil (Costa et al., 1988).

Esta ordem se destaca por apresentar indivíduos com metamorfose completa e o primeiro par

de asas transformado em élitros – asas duras, córneas, utilizadas para dar sustentação ao vôo e

proteção das asas posteriores, membranosas, quando em repouso (Ratcliffe et al., 2002).

Os coleópteros estão distribuídos em quatro subordens, Archostemata, Adephaga,

Myxophaga e Polyphaga. Esta última compreende 90% das espécies descritas, sendo

considerada a subordem mais representativa (Costa, 2000; Vanin e Ide, 2002). Dentre as 18

superfamílias de Polyphaga, Scarabaeoidea destaca-se pelo alto número de espécies e por ter

representantes bioindicadores de ecossistemas de florestas tropicais (Vaz-de-Mello, 2000).

Scarabaeoidea compreende 13 famílias com distribuição mundial, sendo que dos seus 2.266

gêneros, 448 estão distribuídos na região Neotropical, e destes 241 ocorrem no Brasil

(Crowson, 1981; Lawrence e Newton, 1982; Lawrence e Britton, 1991; Scholtz e Browne,

1996; Lawrence et al., 1999; Costa, 2000). Representantes de Scarabaeoidea possuem

morfologia muito bem estudada, mostrando uma grande base de dados para estudo

filogenético (Browne e Scholtz, 1999). Entretanto, apesar da monofilia e da delimitação entre

seus principais grupos serem aceitas, existem controvérsias em relação às suas relações


15

filogenéticas, pois ainda não existe um consenso sobre o ‘status’ de seus principais grupos

(Vanin e Ide, 2002).

Scarabaeidae compreende a maior família de Scarabaeoidea, formando um grupo

cosmopolita de aproximadamente 2.000 gêneros e 25.000 espécies com ampla distribuição

mundial. Para a região Neotropical foram descritos 362 gêneros e 4706 espécies, dos quais

204 gêneros e 1.777 espécies ocorrem no Brasil. Dentre suas subfamílias Scarabaeinae é

muito diversificada, compreendendo cerca de 1.250 espécies distribuídas em 70 gêneros e 12

tribos com distribuição mundial (Hanski e Cambefort, 1991). No Brasil ocorrem mais de 700

espécies pertencentes a 49 gêneros, sendo que 149 espécies foram registradas no Nordeste

Brasileiro, das quais 26 para o Estado de Pernambuco (Vaz-de-Mello, 2000; Silva et al.,

2007).

Os representantes de Scarabaeinae são detritívoros e utilizam como recurso alimentar

principalmente fezes, carcaças e frutos em decomposição. São popularmente conhecidos

como “rola-bostas” e apresentam grande diversidade de espécies em regiões neotropicais.

Formam uma comunidade bem definida em termos taxonômicos e funcionais, dividida em

grupos de espécies denominados guildas (Hanski e Cambefort, 1991; Halffter e Favila, 1993).

A estrutura das guildas está relacionada com as estratégias de alocação de recursos

alimentares, o grau de generalização da dieta e o padrão temporal de atividade. Grupos de

espécies que vivem na mesma área, em geral, exploram distintos habitats ou microhabitats

(utilização espacial do ambiente) ou são ativos em tempos diferentes (utilização temporal do

ambiente). (Halffter e Favila, 1993). A estrutura das guildas possibilita a avaliação de

modificações naturais ou antrópicas que uma comunidade sofre através de um determinado

tempo, podendo-se utilizar estes insetos como bioindicadores de degradação ambiental

(Hanski e Cambefort, 1991; Halffter et al. 1992; Halffter e Favila, 1993; Davis et al., 2001).


16

Dentre as principais características que tornam este grupo um importante bioindicador

estão: a reciclagem dos excrementos e outros tipos de matéria orgânica; abundância de seus

representantes nos diferentes tipos de ecossistemas; formação de guildas; métodos de coleta

facilmente padronizados; sensibilidade a fatores físicos e biológicos, reagindo à degradação

de seu hábitat (Halffter e Favila, 1993). Outra importante característica é a especificidade de

hábitat dos Scarabaeinae, estando algumas espécies associadas a determinados fatores

ambientais, como tipo de vegetação, microclima e solo. Desta forma, a fragmentação das

áreas de mata e a transformação destes ambientes em áreas de pastagem pode alterar a

estrutura da comunidade e causar uma perda na diversidade de espécies (Favila e Halffter,

1997).

A alimentação e a reprodução de grande parte das espécies envolvem o transporte do

recurso alimentar para um local distante da fonte de origem, evitando a competição com

outros grupos de animais que utilizam os mesmos recursos. Portanto, atuam como inimigos

naturais para o controle biológico de moscas parasitas de bovinos, considerando que a

alocação dos recursos alimentares para o interior de túneis escavados no solo elimina o meio

de reprodução de algumas espécies de moscas hematófagas (Hanski e Cambefort, 1991).

Considerando as diferentes tribos de Scarabaeinae, Phanaeini se destaca com 150

espécies encontradas somente no Novo Mundo e distribuídas em 12 gêneros: Bolbites,

Coprophanaeus, Dendropaemon, Diabroctis, Gromphas, Homalotarsus, Megatharsius,

Oruscatus, Oxysternon, Phanaeus, Sulcophanaeus e Tetramereia (Philips et al., 2004). Para o

Brasil são descritos 10 gêneros e 74 espécies (Edmonds, 1972; Vaz-de-Mello, 2000).

Geralmente os representantes de Phanaeini possuem corpo grande e atrativo, de cor brilhante

e metálica, com ornamento cefálico e pronotal. Existem dúvidas a respeito do agrupamento

coerente da maior parte do gênero, devido a incertezas quanto aos seus limites e relações.


17

Contudo, a maior parte dos gêneros tem sua monofilia estabelecida, sendo quatro dos 12

gêneros monotípicos (Zunino, 1985; Philips et al., 2004).

A principal fonte de alimento dos Phanaeini são as fezes de animais herbívoros e

carniça (Edmonds, 1972; Alvarado, 2002). O grupo desta tribo considerado mais derivado

(Coprophaneus, Oxysternon, Phanaeus e Sulcophanaeus) constrói ninhos contendo uma ou

mais bolas, sendo que cada bola é construída independentemente uma da outra, colocadas

separadas em seus próprios compartimentos e cobertas por uma camada de solo. Existe

também a cooperação entre os sexos, embora isso não seja necessário para o sucesso

reprodutivo. Ancestrais de Phanaeini são presumivelmente organismos coprófagos, embora

muitas espécies derivadas sejam inteiramente necrófagas ou se alimentem raramente de

fungos e frutas. Por exemplo, muitas espécies de Coprophaneus alimentam-se de animais

mortos e algumas espécies de Phanaeus são ocasionalmente necrófagas (Philips et al., 2004).

O gênero Coprophanaeus d’Olsoufieff, 1994 é composto por três subgêneros:

Coprophanaeus, Megaphanaeus e Metallophanaeus. Em sua maioria inclui espécies

necrófagas, geralmente encontradas em cadáveres frescos nos períodos crepusculares a

noturnos, sobrevoando o alimento por curtos períodos de tempo e pousando exatamente sobre

o recurso alimentar (Halffter e Edmonds, 1982; Otronen, 1988; Gill, 1991; Endres et al.,

2005). Durante a nidificação, estas espécies constroem bolas a partir do recurso alimentar, que

abrigam e alimentam as larvas, aumentando as chances de sucesso reprodutivo (Edmonds,

1972; Halffter et al., 1974; Halffter e Edmonds, 1982; Endres et al., 2005).


18

2.2. Caracterização Cariotípica de Scarabaeidae

Estudos citogenéticos dentro da ordem Coleoptera ainda são escassos, restringindo-se

em sua maioria à descrição de número diplóide, morfologia cromossômica e mecanismo de

determinação sexual (Virkki, 1960; Yadav e Pillai, 1976; Yadav e Dange, 1991; Petitpierre,

1999; Machado et al., 2001). As possíveis causas das limitações apresentadas para o estudo

citológico estão associadas ao pequeno tamanho dos cromossomos, dificuldade na obtenção

de diferentes fases da meiose e diferenças nas fases de maturação da espermatogênese

(Virkki, 1967; Smith e Virkki, 1978).

Em Coleoptera, estudos citogenéticos têm sido realizados principalmente em

representantes da subordem Polyphaga. O cariótipo mais comum é 2n=20,Xyp, com

cromossomos meta-submetacêntricos. O número diplóide varia de 2n=4 (Chalcolepidius

zonatus – Elateridae) a 2n=64 (Disonychina bicarinata – Chrysomelidae) (Virkki, 1988;

Ferreira et al., 1984). Os mecanismos sexuais observados em representantes de Polyphaga

têm origem principalmente a partir de rearranjos cromossômicos (X0, XY, neo-XY, múltiplo)

ou por diferentes modos de associação entre os cromossomos X e y (Xyp, XYp, Xyr, Xyc)

(White, 1973; Smith e Virkki, 1978; Ferreira et al., 1984; Mesa e Fontanetti, 1985; Yadav et

al., 1990; Gálian et al., 2002; Rozék, et al., 2004).

A família Scarabaeidae tem destaque com cerca de 350 espécies estudadas

citogeneticamente. Essa família tem sido considerada conservada cariotipicamente, em

relação ao número diplóide 2n=20, mecanismo sexual Xyp e morfologia meta-

submetacêntrica (meiofórmula 9II+Xyp) (Yadav e Pillai, 1979; Yadav et al., 1979).

Entretanto, pode-se observar uma variabilidade cariotípica de 2n=8 (Eurysternus caribaeus –

Scarabaeinae) a 2n=30 (Autoserica assamensis – Melolonthinae) (Yadav et al., 1979; Cabral-

de-Mello et al., 2007). Por outro lado, sete diferentes tipos de mecanismos sexuais, XY, Xy,


19

Xyp, XYp, Xyr, neo-XY e X0 tem sido descritos (Virkki, 1960; Smith e Virkki, 1978; Yadav e

Pillai, 1979; Martins, 1994; Colomba et al., 2000a; Moura et al., 2003; Vitturi et al., 2003).

Dentre as subfamílias de Scarabaeidae, Dynastinae, Melolonthinae, Rutelinae e Scarabaeinae

possuem maior diversidade cariotípica e são melhor estudadas do ponto de vista

cromossômico (Yadav e Pillai, 1979).

Segundo Smith e Virkki (1978), a evolução do genoma em Coleoptera pode ocorrer

devido a rearranjos cromossômicos, mutação gênica, trocas relativas e/ou absolutas nas

freqüências gênicas. Em Scarabaeidae, a evolução cariotípica envolve comumente cinco tipos

de rearranjos: 1) fusão cromossomo sexual-autossomo; 2) fusão autossomo-autossomo; 3)

perda do cromossomo y; 4) fissão cêntrica de autossomo e 5) inversões pericêntricas (Yadav e

Pillai, 1979). Portanto, rearranjos cromossômicos permitiram mudanças a partir do cariótipo

2n=20 observado na maioria das espécies analisadas para a subordem Polyphaga.

Na subfamília Dynastinae foram relatados os números diplóides 2n=12, 16, 18, 19 e

20,também sendo descritos com registros de quatro mecanismos sexuais diferentes, Xyp, X0,

XY e neo XY (Smith e Virkki, 1978; Yadav et al., 1979; Martins, 1994; Vitturi et al., 2003;

Bione et al., 2005b). A maioria das espécies com número diplóide 2n=20, como Bothynus

striatellus, Eophileurus platypterus e Pentodon bispinifrons apresenta mecanismo sexual Xyp

(Yadav et al., 1979; Vidal, 1984). Coeloxis bicornis e Enema pan apresentaram redução do

número duplóide para 2n=18, resultante de inversão pericêntrica e fusão autossômica (Vidal,

1984; Martins, 1989). Martins (1994) observou o cariótipo 2n=14,Xyp em Phileurus sp.,

sugerindo que a redução no número cromossômico desta espécie envolve somente

autossomos, sendo originado a partir de três fusões cêntricas precedidas por inversões

pericêntricas ou perda de braços heterocromáticos. Entretanto, a presença de cromossomos

pequenos nesta espécie indica que houve perda de região de heterocromatina constitutiva.

Phyllognathus silencis apresentou fusões entre autossomos e sexuais, reduzindo o número


20

diplóide para 2n=18 e modificando o mecanismo sexual de Xyp para neo XY (Yadav et al.,

1979). Fusões entre autossomos e entre autossomo e sexuais foi observada em Arcophileurus

vervex vervex, modificando o cariótipo considerado modal dentro do grupo para 2n=16,neo-

XY (Vidal, 1984). A perda do cromossomo y foi observada em Pentodon bidens punctatum e

Pentondon sp., apresentando cariótipo 2n=19,X0 (Yadav et al., 1979; Vitturi et al., 2003).

A subfamília Melolonthinae apresenta números diplóides 2n=18, 19, 20, 21, 30 e seis

diferentes tipos de mecanismos sexuais: Xy, Xyp, XYp, Xyr, X0 e neo-XY. A maioria das

espécies estudadas citogeneticamente apresenta o cariótipo 2n=20,Xyp, como Diplotaxis

obscura, Lyogenes fuscus e Serica sericea (Smith e Virkki, 1978; Yadav e Pillai, 1979;

Moura et al., 2003). Entretanto, rearranjos cromossômicos têm sido observados em alguns de

seus representantes. Holotricha longipennis e Autoserica sp. apresentaram fusão entre

autossomos, que reduziu o número diplóide para 2n=18 (Yadav et al., 1979). A perda do

cromossomo y foi observada em outra espécie do gênero Aserica e três espécies de Apogonia,

que apresentaram cariótipo 2n=19,X0. Autoseria assamensis sofreu fissão dos autossomos e,

provavelmente alteração do tipo de associação entre os cromossomos sexuais, apresentando o

cariótipo 2n=30,Xy. Apogonia sp., por sua vez, provavelmente sofreu dissociação em um par

autossômico e posterior perda do cromossomo y, gerando o cariótipo 2n=21,X0 (Smith e

Virkki, 1978; Yadav et al., 1979; Yadav e Pillai, 1979).

Quatro diferentes números diplóides ocorrem em Rutelinae (16, 18, 20 e 22), havendo

três tipos de mecanismos sexuais (Xyp, Xyr e neo-XY) (Smith e Virkki, 1978, Yadav et al.,

1979). Em Macraspis dichroa ssp. cribata, Macraspis festiva, Papillia japonica, Pelidnota

pallidipennis e cinco espécies do gênero Anomala foram observados rearranjos do tipo fusão

entre pares autossômicos, que reduziram o número diplóide de 20 para 18 (Yadav e Pillai,

1979; Yadav et al., 1979; Vidal, 1984; Bione et al., 2005b). Adorrhinyptia dorsalis, duas

espécies do gênero Anomala e dez de Adoretus apresentaram número diplóide 2n=22,Xyp


21

(Yadav e Pillai, 1979; Yadav et al., 1979). Adorrhinyptia sp. apresentou variação em relação

ao número diplóide, sendo observado 2n=16, 18 ou 20 (Yadav et al., 1979). Pelidnota

sumptuosa mostrou redução do número cromossômico de 2n=20 para 2n=18. Esta redução

pode ser explicada pela ocorrência de duas inversões pericêntricas e posteriores fusões

envolvendo os autossomos e cromossomos sexuais, formando o sistema neo-XY (Martins,

1994).

A subfamília Scarabaeinae é menos conservada cariotipicamente, apresentando

variação no número diplóide de 2n=8 a 2n=24, e seis mecanismos sexuais (XY, Xyp, XYp,

Xyr, neo-XY e X0) (Smith e Virkki, 1978; Yadav et al., 1979; Cabral-de-Mello et al., 2007).

A variabilidade cromossômica observada em Scarabaeinae foi originada a partir de rearranjos

cromossômicos, que modificaram o cariótipo 2n=20,Xyp e a morfologia cromossômica meta-

submetacêntrica considerados modal e primitivo para o grupo (Yadav e Pillai, 1977; Smith e

Virkki, 1978; Bione et al., 2005a). Dentre as subfamílias de Scarabaeidae, as alterações

cromossômicas têm sido relatadas com maior freqüência em Scarabaeinae, sendo esta a

subfamília de maior diversidade cariotípica do grupo (Smith e Virkki, 1978; Bione et al.,

2005a, b; Angus et al., 2007).

Rearranjos cromossômicos são bastante comuns em Scarabaeinae, contudo, as

estratégias de evolução cromossômica nas diversas tribos são diferentes. A tribo

Onthophagini é bastante conservada em relação ao número diplóide, com apenas duas

espécies apresentando variação em relação ao cariótipo modal 2n=20. O gênero Onthophagus

é o melhor estudado até o momento, apresentando diferentes mecanismos sexuais (Xy, Xyp,

Xyr e neo-XY), sendo que a maioria das espécies analisadas possui número diplóide 2n=20

(Smith e Virkki, 1978; Yadav e Pillai, 1979).

Em contraste com Onthophagini, as tribos Canthonini, Coprini, e Phanaeini, são

bastante diversas cariotipicamente, devido principalmente a rearranjos do tipo fusão. Em


22

Cantharsius sp., Canthon indigaceus, Eucranium arachnoides, Glyphoderus sterquilinis,

Phanaeus prox. yucatanus, três espécies do gênero Copris, duas de Dichotomius e diferentes

espécies do gênero Canthochilum foram descritos rearranjos do tipo fusão entre autossomos.

Este rearranjo gerou a redução do número diplóide de 20 para 14 nas espécies pertencentes ao

gênero Copris e em P. prox. yucanatus, bem como redução para 18 nas demais. A presença

do número diplóide 2n=18 e do par 1 consideravelmente maior observados em Isocopris

inhiata, por exemplo, pode ser explicada por mecanismo de inversão seguido de fusão. A

diminuição do número diplóide observada não estava relacionada com alterações dos

mecanismos sexuais (Smith e Virkki, 1978; Yadav e Pillai, 1979; Vidal, 1984; Bione et al.,

2005a).

Outros representantes de Canthonini, Coprini e Phanaeini apresentam fusões entre

autossomos e entre autossomos e cromossomos sexuais, como é o caso de Phanaeus daphnis,

Phanaeus igneus, Phanaeus mexicanus e Phanaeus vindex, todas com 2n=12, bem como de

Deltochilum valgum, com 2n=14. Além da redução do número diplóide, estas espécies

apresentaram modificação do mecanismo sexual de Xyp para neo-XY (Smith e Virkki, 1978;

Yadav e Pillai, 1979; Vidal, 1984). Este processo de modificação do número diplóide e do

mecanismo sexual para neo-XY envolve, provavelmente, inversões pericêntricas, gerando

cromossomos acrocêntricos, seguidas de fusões cêntricas entre autossomos e fusão

autossomo-X (Vidal, 1984). Até o momento, Eurysternus caribaeus é a única espécie de

Eurysternini analisada citogeneticamente. Essa espécie apresenta o menor número

cromossômico para a família com 2n=8. A redução ocorreu provavelmente por inversões

pericêntricas e fusões entre autossomos (Cabral-de-Mello et al., 2007).

Rearranjos do tipo fissão, inversões pericêntricas e perdas do cromossomo y também

podem ser evidenciados nas tribos Phanaeini, Coprini e Canthonini. Inversões pericêntricas

foram responsáveis pela morfologia acrocêntrica de quatro pares autossômicos de Diabroctis


23

mimas e todos os cromossomos do complemento de Bubas bison. A morfologia

cromossômica predominantemente acrocêntrica não tem sido relatada com freqüência para

representantes de Scarabaeidae (Colomba et al., 1996; Bione et al., 2005a; Colomba et al.,

2006). Dois processos de fissão geraram o cariótipo 2n=24,Xyp em Oniticellus spinipes (=

Tiniocellus spinipes), enquanto Copris fricator provavelmente sofreu dissociação em um par

autossômico e posterior perda do cromossomo y, gerando o cariótipo 2n=21,X0 (Smith e

Virkki, 1978; Yadav et al., 1979).

Variação de polimorfismo cromossômico foi observada nas espécies Bubas bubalus,

Euonthophagus amyntas, Onthophagus vacca, O. similis e O. gazella, que apresentaram

cariótipo 2n=20,Xy+B (Wilson e Angus, 2005; Angus et al., 2007). Em E. amyntas o

cromossomo B não foi visualizado em todas as células, e quando presente era semelhante ao y

em relação ao tamanho e à morfología acrocêntrica. O. vacca mostrou um cromossomo B

subacrocêntrico e de tamanho aproximado ao do par 9. Quando analisado pela técnica de

bandeamento C, o cromossomo B revelou um grande bloco centromérico de heterocromatina,

em contraste com a pequena banda centromérica observada nos autossomos e no cromossomo

X. O. similis mostrou um cromossomo B metacêntrico, com tamanho aproximadamente de

duas vezes o comprimento do y. A presença de cromossomos B nestas espécies foi a única

variação no número de cromossomos (Wilson e Angus, 2005). Cromossomos B

heterocromáticos foram observados em todos os espécimes analisados de todas as populações

de Bubas bubalus, variando em número de três a nove cromossomos (Angus et al., 2007). Em

Scarabaeoidea o alto número de cromossomos B também foi encontrado em Aphodius lividus,

onde pôde ser observada a ocorrência de nove cromossomos B heterocromáticos. Entretanto,

enquanto em Bubas bubalus os cromossomos B são principalmente grandes, até duas vezes o

comprimento dos maiores autossomos, em A. lividus estes são pequenos, comparáveis em

tamanho ao cromossomo y. Cromossomos B grandes também foram observados em


24

Pterostichus nigrita e P. rhaeticus (Carabidae) (Angus et al., 2000; Angus et al., 2004; Angus

et al., 2007).

A origem de cromossomos B parece ser bastante variável e ocorre a partir de vários

mecanismos evolutivos. Estudos recentes envolvendo isolamento, clonagem e

seqüenciamento de DNA repetitivo localizado em cromossomos B têm sugerido que a origem

desses cromossomos está relacionada com os elementos básicos do complemento

cromossômico (Camacho et al., 2000). As propriedades e efeitos dos B dependem de

processos de co-adaptação com o genoma padrão, bem como de sua estrutura, origem e

modificações durante a evolução (Camacho et al., 1997). Contudo, nos representantes de

Scarabaeinae ainda não existem conclusões acerca da origem e função deste cromossomo,

bem como do papel na evolução destes genomas.

2.2.1. Mecanismos cromossômicos de determinação do sexo em Scarabaeidae

Segundo White (1973) e Smith e Virkki (1978) a ordem Coleoptera apresenta uma

grande diversidade de sistemas cromossômicos de determinação sexual, estando estes

divididos em dois grupos: os sistemas ortodoxos e os não ortodoxos. Os sistemas ortodoxos,

por sua vez, dividem-se em aquiasmáticos (Xyp, XY, Xnyp, Xynp, Xyc, X0) e quiasmáticos,

que por sua vez apresentam sistemas simples (Xyr, neo-XY) e múltiplos (X1X

2Y, XY

1Y

2,

XnYn e XpneoYp). Os não ortodoxos representam aqueles sistemas nos quais os cromossomos

sexuais perderam a capacidade de pareamento de forma convencional e mantêm-se como

univalentes. Os cromossomos sexuais do sistema ortodoxo apresentam dois tipos de

comportamento durante a meiose, um no qual a separação dos sexuais ocorre tardiamente na

anáfase I e outro em que os sexuais se encontram distantes entre si e em relação aos

autossomos.


25

O cariótipo com 2n=20 e sistema sexual Xyp (2n=20,Xyp) exibindo todos os

cromossomos metacêntricos, tem sido proposto como ancestral para os representantes da

subordem Polyphaga e encontrado na maioria das famílias estudadas citogeneticamente

(Yadav e Pillai, 1979; Galián e Lawrence, 1993; Rozek et al., 2004).

No sistema do tipo Xyp, o X e o y representam os cromossomos sexuais e a letra “p”

indica a forma de associação desses cromossomos durante a meiose, a qual foi originalmente

comparada a um pára-quedas (Smith e Virkki, 1978). Neste sistema, o cromossomo X

representa o dossel do pára-quedas e o cromossomo y, conectado ao X por estruturas

semelhantes a dois fios tênues, correspondendo ao pára-quedista. No mecanismo Xyp o

cromossomo Xp geralmente é um metacêntrico de tamanho médio e o cromossomo yp

é um

metacêntrico extremamente pequeno. Nos casos em que os cromossomos X e Y são

relativamente grandes e de tamanho similar, o mecanismo é denominado XYp (White, 1973;

Mesa e Fontanetti, 1985).

Existem diferentes evidências para explicar a forma de associação do bivalente sexual

Xyp durante a meiose, as opiniões nos primeiros estudos realizados em Coleoptera oscilavam

entre uma associação nucleolar ou quiasmática entre estes cromossomos (White, 1973; Smith

e Virkki, 1978). Entretanto, a hipótese de associação quiasmática entre os bivalentes Xyp tem

sido questionada. De acordo com White (1973) não existem evidências da formação do

quiasma no bivalente Xyp, devido à compactação e tamanho reduzido deste bivalente durante

a metáfase I.

O mecanismo de determinação do sexo Xyp tem sido frequentemente observado em

representantes da Scarabaeidae (Colomba et al., 1996; Moura et al., 2003). As espécies

Lyogenes fuscus, Phyllophaga (Phytatus) vestita e P. (Phyllophaga) aff. capillata

(Melolonthinae) analisadas por Moura et al. (2003), bem como Lygirus ebenus, Strategus

surinamensis hirtus (Dynastinae), Geniates borelli, Macraspis festiva e Pelidnota


26

pallidipennis (Rutelinae) estudadas por Bione et al. (2005b) apresentaram o mecanismo

sexual Xyp. Esse sistema também foi observado em sete das quinze espécies de Scarabaeinae

analisadas por Angus et al. (2007).

O sistema Xyr (r de “road-shaped”) de determinação sexual ocorre em baixa

freqüência (2,4%) em Coleoptera. A ocorrência deste mecanismo está relacionada com a

pequena quantidade de heterocromatina nos cromossomos X e y, acarretando uma associação

com configuração em forma de bastão. Esse sistema tem sido observado em diferentes

espécies das famílias Chrysomelidae, Coccinelidae, Hydrophilidae, Meloidae, Scarabaeidae,

Silphidae, Staphilinidae e Tenebrionidae (Smith e Virkki, 1978; Yadav e Pilai, 1979). Para

Scarabaeidae, este mecanismo foi descrito para as espécies Cantharsius sp., Diginthophagus

bonasus e Onthophagus dama (Smith e Virkki, 1978). Por outro lado, o sistema de

determinação sexual XY, em Scarabaeidae, foi observado em Bubas bison, Eurysternus

caribaeus e Paragymnopleurus sinuatus (Smith e Virkki, 1978; Colomba et al., 1996; Cabral-

de-Mello et al., 2007).

Aproximadamente 14% das espécies de Coleoptera possuem mecanismo X0,

originando número diplóide ímpar devido a ausência do y (Machado et al., 2001; Proença et

al., 2002; Vitturi et al., 2003). O sistema X0 de determinação sexual representa o segundo

mais freqüente em Coleoptera, contudo, não tem sido relatado com freqüência para

representantes de Scarabaeidae. Neste sistema o cromossomo X apresenta comportamentos

diferentes, no primeiro tipo, pré-reducional, as cromátides irmãs do cromossomo X se

separam na primeira divisão meiótica dos machos. No segundo, pós-reducional, as cromátides

irmãs do cromossomo X se separam na segunda divisão meiótica (Smith e Virkki, 1978).

Existem evidências mostrando que o sistema X0 de determinação sexual originou-se a

partir do sistema Xyp, através da perda do cromossomo yp. Esta derivação pode ter ocorrido

pela progressiva heterocromatinização do cromossomo yp, tornando-o inerte e geneticamente


27

obsoleto, ou pela “degeneração” deste cromossomo, envolvendo transferência de material

genético para os autossomos (Gambardella e De Vaio, 1978; Machado et al., 2001; Vitturi et

al., 2003). Contudo, o mecanismo X0 pode ser originado de outras formas, dentre as quais se

destaca translocação não recíproca envolvendo o cromossomo y e um autossomo e a perda do

y devido à uma associação fraca com o cromossomo X (Machado et al., 2001; Proença et al.,

2002; Vitturi et al., 2003).

Em Scarabaeidae, como em muitos outros organismos, o sistema neo-XY tem origem

a partir do sistema X0, envolvendo fusão cêntrica entre o cromossomo X e um autossomo,

ambos acrocêntricos. Neste caso, o homólogo do autossomo fusionado ao X passa a funcionar

como cromossomo Y. Outra explicação para o surgimento deste mecanismo é a fusão de

braços eucromáticos entre autossomo e cromossomo X (ambos metacêntricos), a eliminação

de um dos centrômeros e dos braços heterocromáticos dos cromossomos translocados,

originando o cromossomo sexual neo-X. Caso a origem do sistema neo-XY ocorra a partir do

sistema Xyp, o yp é eliminado ou os seus genes são translocados para o neo-Y ou para outros

autossomos (Smith e Virkki, 1978).

O mecanismo XY se caracteriza pela associação dos sexuais, durante a meiose, sem a

formação uma configuração diferencial (White, 1973; Smith e Virkki, 1978). Tem sido

proposto que o sistema de determinação sexual XY está presente em cerca de 2% das espécies

de Coleoptera descritas até o momento, estando distribuído entre gêneros bastante diversos

dentro de Scarabaeidae (Smith e Virkki, 1978; Wilson e Angus, 2005).


28

2.3. Heterocromatina Constitutiva

Cromatina é o complexo de DNA, RNA e proteínas que se encontra dentro do núcleo

celular das células eucarióticas. O DNA está compactado na forma de cromatina para

diminuir o tamanho da molécula e permitindo maior controle dos genes. A disposição da

cromatina dentro do núcleo e o seu grau de condensação variam de um tipo celular para outro

e são característicos de cada célula. O mesmo tipo celular pode apresentar a cromatina com

vários graus de condensação, de acordo com o estágio funcional da célula (Cheung et al.,

2000; Sumner, 2003). Grande parte da cromatina é localizada na periferia do núcleo,

possivelmente pelo fato de uma das principais proteínas associadas com a heterocromatina

ligar-se a uma proteína da membrana nuclear interna (Sumner, 2003).

Durante o ciclo celular a cromatina apresenta diferentes níveis de condensação,

resultantes da interação do DNA com proteínas histônicas ou não-histônicas. Portanto, de

acordo com suas características a cromatina é diferenciada em eucromatina e heterocromatina.

As regiões cromossômicas geneticamente ativas e que sofrem condensação e descondensação

em fases específicas do ciclo celular são denominadas eucromatina (Sumner, 1990). O

conceito de heterocromatina foi introduzido por Heitz (1928 apud Dillon, 2004) como uma

forma de descrever segmentos cromossômicos ou cromossomos inteiros, que mantêm um

estado condensado durante a intérfase do ciclo celular mitótico. A definição proposta foi

puramente morfológica, identificando regiões de cromossomos mitóticos que mantiveram

uma estrutura compacta durante a intérfase, e exibiram uma condensação diferencial, ou

heteropicnose positiva na prófase (Sumner, 2003).

Existem dois tipos distintos de heterocromatina, a facultativa e a constitutiva. A

heterocromatina facultativa (HF) corresponde a regiões cromossômicas que apresentam

diferenciação picnótica e de condensação entre os homólogos durante o ciclo celular e inativa


29

em tecidos somáticos. A heterocromatina constitutiva (HC) corresponde àquela que ocorre em

porções homólogas do par cromossômico, permanecendo condensada durante todo o ciclo

celular e estando inativa em ambos os homólogos (Henikoff, 2000; Sumner, 2003).

A HF apresenta condensação somente em certos tipos de células ou em estágios

especiais do desenvolvimento. O caso mais conhecido é dos cromossomos X de fêmeas de

mamíferos: um cromossomo X é ativo e eucromático, enquanto o outro é inativo constituindo

a cromatina sexual ou corpúsculo de Barr na intérfase (Lyon, 1968). A inativação ocorre a

partir de um centro de inativação, e se espalha por todo o cromossomo, exceto o segmento

distal do braço curto (Heard et al., 1997; Heard, 2004). Outro exemplo de HF é observado nos

pulgões coccídeos (Homoptera). No início do desenvolvimento, embriões machos e fêmeas

possuem complemento cromossômico diplóide eucromático. Nas células somáticas e

germinativas de fêmeas todos os cromossomos permanecem eucromáticos e funcionais

durante toda a ontogenia. Entretanto, nos embriões que se tornarão machos, o complemento

cromossômico haplóide de origem paterna se torna heterocromático após a sexta divisão da

clivagem. Em divisões celulares subseqüentes este conjunto de cromossomos aparece como

cromocentro em núcleos interfásicos na maioria dos tecidos. O embrião masculino é originado

a partir de imprintig genômico, que distingue entre complementos cromossômicos de origem

materna e paterna. Os machos são funcionalmente haplóides devido à heterocromatização, e

durante a espermatogênese o complemento heterocromático é eliminado e somente os

cromossomos eucromáticos de origem materna são incluídos no esperma (Brown e Nur, 1964;

Bongiorni et al., 1999; Bongiorni et al., 2001).

A HC permanece condensada em todos os tipos celulares, possui replicação tardia,

alto grau de metilação e baixo de acetilação, pequeno acesso a nucleases, pequenas regiões

codificantes, pouca ou nenhuma recombinação meiótica, sendo composta predominantemente

de DNA altamente repetitivo, também chamado DNA satélite (Wallrath, 1998; Dillon, 2004;


30

Grewal e Jia, 2007). Este DNA se caracteriza por ser composto de uma seqüência básica que

se repete inúmeras vezes em tandem. Com relação à composição do DNA, pode-se afirmar

que existe uma correlação entre DNA satélite e regiões heterocromáticas, porém nem toda

heterocromatina é composta por DNA altamente repetitivo (Yan e Jiang, 2007).

O DNA satélite pode variar na composição de bases, sendo ricos em AT ou GC, e no

comprimento da repetição. Alguns segmentos heterocromáticos possuem seqüências

repetitivas médias, como elementos transponíveis (Sumner, 1990; Rouzic et al., 2007). A

metilação da citosina é uma característica importante para a condensação da heterocromatina.

Elevados níveis de metilação são encontrados no DNA satélite de muitas plantas e mamíferos,

enquanto a desmetilação da citosina causa a descondensação da HC (Sumner, 1990).

A heterocromatina constitutiva pode conter genes e outras seqüências funcionais do

DNA, podendo assim ser consideradas como funções principais deste material genômico:

susceptibilidade de rearranjos, organização centromérica e proteção às regiões eucromáticas

do genoma (Sumner, 1990, 2003; Grewal e Jia, 2007). A presença da heterocromatina pode

ocasionar variegação, ausência de crossing-over, pareamento cromossômico não-homólogo,

alteração da distância entre os genes no mapa físico e genético e alteração no número de

quiasmas (John e King, 1985; Karpen, 1994; Sumner, 2003).

A associação entre blocos de HC pode influenciar o padrão de ocorrência e localização

de quiasmas, podendo alterar o número de quiasmas por bivalente (mesmo em outros

cromossomos sem HC). Em geral, a presença de um bloco de HC inibe a formação de

quiasmas em sua vizinhança. A ausência de crossing-over na heterocromatina frequentemente

está associada com a falta ou atraso da formação do complexo sinaptonêmico (CS), podendo

também ocorrer diferenças na estrutura do CS em regiões heterocromáticas. Entretanto, em

alguns casos, a heterocromatina aumenta o número de quiasmas e, em algumas espécies, a HC

não tem nenhum efeito significativo na distribuição ou no número de quiasmas. A


31

heterocromatina de cromossomos homólogos permanece associada durante o ciclo celular, da

prófase até a metáfase I, sugerindo que a recombinação homóloga pode conduzir a segregação

mesmo na ausência de quiasmas, e a HC mantém o alinhamento dos cromossomos durante a

meiose. Ainda não se estabeleceu como ocorre o controle da meiose, embora a

heterocromatina possa ter efeitos no emparelhamento meiótico, nos processos de segregação

cromossômica, como a formação de cinetócoro, união e separação de cromátides-irmãs

(Dernburg et al., 1996; Sumner, 2003).

Quanto à sua distribuição no cariótipo, a HC se acumula em locais específicos ou

sítios similares (John, 1988; Henikoff, 2000; Sumner, 2003; Yan e Jiang, 2007). Está

geralmente presente em regiões centroméricas e pericentroméricas dos cromossomos (Lohe e

Hilliker, 1995). A HC também é encontrada em regiões terminais, podendo ocorrer menos

comumente como blocos intersticiais. Distribuição, tamanho, variabilidade e composição de

DNA da HC são características essenciais para a caracterização do cariótipo de uma espécie.

Blocos de HC podem variar em tamanho sem nenhum efeito óbvio no organismo, embora a

quantidade de heterocromatina possa ter efeitos no nível cromossômico. Espécies

proximamente relacionadas podem não diferir na quantidade de heterocromatina, enquanto

blocos heterocromáticos podem variar em relação à composição de bases e tamanho em uma

espécie e entre homólogos no mesmo indivíduo (John, 1988; Wallrath, 1998; Henikoff, 2000;

Sumner, 2003;).

Diferentes tipos de seqüências repetitivas estão associadas as regiões de HC. Essas

seqüências podem assumir uma forma compacta (α) ou dispersa (β). A α-heterocromatina

geralmente tem localização nas regiões pericentroméricas e está formada por DNA satélite,

que é o componente majoritário, elementos transponíveis e genes que codificam o RNA

ribossômico. A β-heterocromatina está localizada nas regiões de transição entre a


32

heterocromatina e a eucromatina e está formada majoritariamente por elementos transponíveis

(Koryakov et al., 1999; Adams et al., 2001).

A origem da HC pode estar relacionada com: a) trocas desiguais entre cromátides

irmãs na linhagem germinativa (facilitadas pelo fato da mesma seqüência se repetir em

tandem); b) qualquer evento que amplie o número de cópias de um gene ou seqüência de

DNA acima do nível característico do organismo; c) movimento de material genético de um

loco para outro (transposição) (John e King, 1977; Hirning et al, 1989; Li, 1991).

A HC possui ainda a característica de coloração diferencial quando submetida a

tratamentos cromossômicos específicos (bandeamentos). Embora a heteropicnose ocorra

freqüentemente, essa não é uma característica diagnóstica e a inatividade gênica nem sempre

ocorre (John, 1988). O bandeamento C é o método de análise mais comum da

heterocromatina e consiste em expor o material biológico a uma solução básica e em seguida

a uma incubação em solução salina a temperatura elevada (Sumner, 1972). Apesar do padrão

de bandas C indicar a localização da heterocromatina ele não fornece informações a respeito

da natureza da HC em termos de composição de bases, e é inespecífico com relação ao DNA

satélite (John, 1988; Sumner, 1990).

O uso de fluorocromos base-específicos na análise de heterocromatina tem sido

importante na caracterização de diferenças moleculares entre espécies. Esta metodologia

utiliza corantes fluorescentes que se ligam ao DNA e podem ser específicos para pares de

bases AT ou GC, permitindo diferenciar qualitativamente a heterocromatina constitutiva, bem

como verificar a sua eqüilocalidade e variabilidade (Schweizer, 1976; John et al., 1985).

Corantes como Hoechst 33258 e 4’-6-diamino-fenilindol (DAPI) ligam-se

especificamente a pares de bases AT, enquanto os fluorocromos específicos para GC mais

comumente utilizados são a Cromomicina A3 e a Mitramicina (Schweizer, 1981). O uso

combinado de fluorocromos base epecíficos com contra-corantes tem sido utilizado para


33

melhor qualificar a heterocromatina quanto à riqueza de pares de bases AT ou GC deste tipo

de material cromossômico. Exemplos destes corantes não fluorescentes são a Distamicina A

(DA) com preferência pelas seqüências ricas em AT, e a Actinomicina D (AMD) com

especificidade para pares de bases GC (Schweizer, 1976; Schweizer, 1981).

O bandeamento por enzimas de restrição envolve o uso de várias DNAses na digestão

dos cromossomos, atuando na extração diferencial de DNA (Bianchi et al., 1985). As enzimas

de restrição caracterizam-se por reconhecer as seqüências especificas do DNA e orientar o seu

corte por essas seqüências. Existem três tipos de enzimas de restrição, que diferem entre si por

sua estrutura, co-fatores requeridos e maior ou menor especificidade pela seqüência. Com

relação à especificidade, a enzima de restrição do tipo I corta o DNA ao acaso a uma distância

igual ou superior a 1.000 pares de bases da seqüência de reconhecimento; as do tipo II cortam

dentro ou imediatamente ao lado da seqüência; as do tipo III cortam de 24 a 26 pares de bases

a partir da seqüência (Gingeras, 1991).

A hibridização in situ fluorescente (FISH) com sondas de DNA satélite também pode

ser utilizada para detectar famílias específicas de DNA que compõe a HC (Mravinac et al.,

2004; 2005a,b; Pons, 2004; Pons et al., 2002). Para a localização do DNA satélite é necessária

a extração do DNA genômico da espécie, e o DNA total é digerido com diferentes

endonucleases de restrição. Os fragmentos de restrição são então separados e selecionados.

Posteriormente os fragmentos com maior quantidade de DNA são eluídos e inseridos em

plasmídeos para clonagem. A partir da clonagem, os clones recombinantes são selecionados

através da técnica de Southern Blot, estando o fragmento de interesse marcado com

digoxigenina. Para a técnica de FISH a sonda de DNA repetitivo usualmente é marcada com

digoxigenina (Lohe et al., 1993; Samrook e Russel, 2001).


34

2.3.1. Heterocromatina Constitutiva em Scarabaeidae

Na ordem Coleoptera o estudo da heterocromatina constitutiva (HC) tem evidenciado

uma grande variabilidade em relação à distribuição, quantidade e heterogeneridade. A HC

ocorre preferencialmente nas regiões pericentroméricas e, em menor proporção, blocos são

observados nas regiões distal e intersticial em cromossomos autossômicos, enquanto que nos

cromossomos sexuais estão localizados na região pericentromérica ou ao longo de todo o

cromossomo (Juan e Petitpierre, 1989; Colomba et al., 1996; Vitturi et al., 1999; Gregory et

al., 2003; Pons, 2004; Rozek et al., 2004; Colomba et al., 2006).

A técnica de bandeamento C tem sido utilizada para analisar o padrão de distribuição

da heterocromatina constitutiva em Scarabaeidae, entretanto, a qualificação da HC com o uso

de fluorocromos base específicos ainda é escassa. Até o momento, foram estudadas por

bandeamento C e fluorocromos base específicos preferencialmente algumas espécies das

subfamílias Dynastinae, Melolonthinae, Rutelinae e Scarabaeinae (Vidal e Nocera, 1984;

Vitturi et al., 2003; Moura et al., 2003; Bione et al., 2005b).

O padrão de distribuição de HC observado em algumas espécies de Scarabaeidae, em

geral é pericentromérico. Contudo, também têm sido descritos blocos instersticiais, como em

Enema pan; teloméricos, em Bubas bison e cromossomos difásicos, observados em

Diabroctis mimas e Isocopris inhiata (Vidal e Giacomozzi, 1978; Colomba et al., 1996;

Bione et al., 2005a). Cromossomos são considerados difásicos quando possuem um braço

eucromático e outro totalmente heterocromático, podendo ou não envolver o centrômero

(Smith e Virkki, 1978; Bione et al., 2005a). Em geral o cromossomo X apresenta-se quase

completamente heterocromático, embora algumas espécies possuam blocos paracêntricos,

pericentroméricos e subteloméricos. Como pode ser observado nas Tabelas 1 e 2, estudos


35

realizados até o momento com relação à distribuição e composição de bases de HC têm

mostrado uma grande heterogeneidade.

Em Dynastinae, a HC ocorre predominantemente em regiões pericentroméricas de

autossomos e o cromossomo X é quase completamente heterocromático. Entretanto, blocos

heterocromáticos também têm sido observados em outras regiões cromossômicas. Em Lygirus

ebenus foi observada a presença de blocos pericentroméricos em todos os autossomos, um

bloco telomérico em um pequeno bivalente autossômico e o X quase completamente

heterocromático, enquanto a espécie Enema pan possui blocos intersticiais e teloméricos.

Blocos pericentroméricos também foram observados em todos os cromossomos de Pentodon

bidens punctatum, e em Strategus surinamensis hirtus blocos pericentroméricos foram

visualizados em oito bivalentes autossômicos e o cromossomo X foi quase completamente

heterocromático (Vidal e Giacomozzi, 1978; Bione et al., 2005b). A qualificação da

heterocromatina foi analisada nas espécies Pentodon bidens punctatum e Strategus

surinamensis hirtus através da tríplice coloração CMA3/DA/DAPI. P. bidens punctatum

mostrou blocos pericentroméricos CMA3+ e DAPI neutro em todos os cromossomos, e S.

surinamensis hirtus apresentou oito bivalentes autossômicos e o cromossomo X marcado com

o CMA3, e um pequeno bivalente autossômico sem marcação (Moura et al., 2003; Vitturi et

al., 2003; Bione et al., 2005b).

Lyogenes fuscus, Phyllophaga (Phylatus) vestita e P. (Phylophaga) aff. capillata

(Melolontinae) apresentaram blocos de HC pericentroméricos em todos os bivalentes

autossômicos e o X quase inteiramente heterocromático. As três espécies apresentaram

heterogeneidade quanto aos pares de bases AT/GC. L. fuscus apresentou blocos ricos em

pares de bases AT, enquanto P. (Phylatus) vestita mostrou blocos com riqueza para AT e GC,

e P. (Phyllophaga) aff. capillata blocos ricos em GC no bivalente sexual e em um pequeno

bivalente autossômico (Moura et al., 2003).


36

Em Geniates borelli, Macraspis festiva e Pelidnota pallidepennis (Rutelinae) a HC foi

visualizada na região pericentromérica dos cromossomos autossômicos e ao longo do

cromossomo X. Estudos cromossômicos utilizando fluorocromos evidenciaram blocos

pericentroméricos CMA3+ em todos os cromossomos de Geniates borelli, enquanto Pelidnota

pallidipennis mostrou blocos DAPI+ em oito bivalentes autossômicos, blocos CMA3+ em um

bivalente autossômico e no cromossomo X (Bione et al., 2005b).

Scarabaeinae representa uma subfamília com ampla variabilidade da HC. Diferentes

estudos têm mostrado a localização de blocos de HC teloméricos, centroméricos,

subteloméricos e cromossomos difásicos. Entretanto, apesar da diversidade, a maioria das

espécies analisadas apresentou blocos localizados na região pericêntrica (Vidal e Henestrosa,

1984; Vidal e Nocera, 1984; Colomba et al., 1996; Wilson e Angus, 2005; Angus et al.,

2007). Estudos cromossômicos utilizando fluorocromos base específicos foram realizados em

um pequeno número de espécies, entretanto, os resultados são bastante distintos e a

heterocromatina tem se caracterizado como um material cromossômico com alta variabilidade

e heterogeneidade (Colomba et al., 1996; Colomba et al., 2000a; Bione et al., 2005a;

Colomba et al., 2006).

Wilson e Angus (2005) analisaram o padrão de bandeamento C em 17 espécies de

Onthophagini. Os resultados indicaram que esta tribo é conservada em relação à quantidade e

distribuição da HC. O gênero Onthophagus é o melhor estudado, e blocos heterocromáticos

estão localizados preferencialmente nas regiões centroméricas de autossomos e sexuais,

podendo ocorrer pequenas variações de tamanho. Onthophagus hirtus apresentou blocos

centroméricos médios em todos os bivalentes, com marcação maior e mais evidente no

cromossomo X. Em O. vacca foram observados blocos centroméricos em todos os

autossomos e no cromossomo X, com uma marcação mais extensa no B. O cariótipo desta

espécie mostrou uma constrição secundária na base do braço curto do bivalente 5 e um


37

polimorfismo no bivalente autossômico 3, envolvendo uma inversão pericêntrica na região

heterocromática.

Em O. opacicollis foram evidenciados blocos centroméricos em todos os autossomos e

no cromossomo y. No X o bloco heterocromático localizado na constrição secundária do

braço curto se estendeu até a região intersticial do braço longo. Em Euonthophagus

atramentarius foram observados blocos heterocromáticos nas constrições secundárias dos

bivalentes 2 e 3. E. amyntas apresentou cromossomo X heterocromático e três bivalentes

autossômicos difásicos, com a HC distribuída nos braços longos (Wilson e Angus, 2005).

Grande diversidade de distribuição da HC foi evidenciada em representantes da tribo

Onitini. Bubas bison apresentou cromossomos com blocos intersticiais e teloméricos em todos

os autossomos, exceto nos bivalentes 1 e 2, que mostraram somente blocos teloméricos

(Colomba et al., 1996; Colomba et al., 2006). A HC desta espécie mostrou riqueza em pares

de bases AT, contrastando com o padrão observado na maioria dos representantes de

Scarabaeidae, em que a HC é extensivamente corada com CMA3 (Colomba et al., 1996;

Vitturi et al., 1999; Colomba et al., 2000a; Moura et al., 2003; Vitturi et al., 2003).

Em Bubas bubaloides foram visualizados blocos centroméricos nos bivalentes 1-4 e

no cromossomo X, e pericentroméricos nos bivalentes 5-7. Bubas bubalus mostrou blocos

centroméricos de HC e cromossomos B heterocromáticos, variando em número de três a nove

cromossomos. Os cromossomos B variam em tamanho e quantidade de heterocromatina em

diferentes indivíduos das populações analisadas. Na população que apresentou três

cromossomos B foram observados blocos de HC envolvendo todo o braço longo, blocos

intersticiais e cromossomos totalmente heterocromáticos. Grande variação de tamanho foi

visualizado na população com sete cromossomos B, revelando pequenos blocos intersticiais,

teloméricos, além de blocos intersticiais que se expandem até a região proximal. População

com nove cromossomos B mostrou cromossomos grandes e heterocromáticos, com pequena


38

variação de tamanho. Apesar da ampla diversidade de cromossomos B observada no

complemento cromossômico de B. bubalus, outras espécies do gênero não apresentam

cromossomos supernumerários. Os resultados do bandeamento C observados em Caccobius

schreberi indicaram ausência de blocos heterocromáticos (Angus et al., 2007).

Padrões distintos de distribuição de HC foram descritos para duas espécies da tribo

Gymnopleurini. Gymnopleurus sturmi mostrou blocos centroméricos e pericentroméricos nos

bivalentes autossômicos 1, 2, 3a e 4; blocos subteloméricos nos bivalentes 6-9 e no

cromossomo X; blocos centroméricos nos bivalentes 3b e 5 e não foi observada nenhuma

marcação no y. A heterocromatina nesta espécie apresentou riqueza em pares de bases GC,

exibindo blocos CMA3+ nos autossomos e no cromossomo X (Colomba et al., 2000a). Os

resultados para G. geoffroyi mostraram blocos centroméricos em todos os bivalentes e o

cromossomo y inteiramente heterocromático (Angus et al., 2007). Grande heterogeneidade

também foi visualizada nos representantes de Oniticellini. Euoniticellus fulvus mostrou blocos

centroméricos em todos os cromossomos, e o bivalente 6 com braço longo heterocromático.

Euoniticellus pallipes apresentou blocos de HC exclusivamente no braço curto do par 2

(Wilson e Angus, 2005).

As duas espécies da tribo Phanaeini analisadas pelo bandeamento C apresentaram

cromossomos difásicos. Em Bolbites ornitoides foram observados oito bivalentes

autossômicos difásicos e um bloco pericentromérico em um bivalente autossômico (Vidal,

1980 apud Virkki, 1983). Os braços curtos dos bivalentes 2, 4 e 7 de Diabroctis mimas

também foram difásicos, e blocos teloméricos foram observados nos bivalentes 1 e 3 e o

cromossomo X foi quase completamente heterocromático (Bione et al., 2005a).

A tribo Coprini apresentou grande diversidade cariotípica entre os gêneros estudados.

Isocopris inhiata apresentou cromossomos difásicos (braços curtos dos pares 3-5 e 7), blocos

teloméricos no par 6 e o cromossomo X quase completamente heterocromático (Bione et al.,


39

2005a). A HC de I. inhiata mostrou marcação DAPI+, não seguindo o padrão observado em

Scarabaeidae, em que as espécies predominantemente mostram riqueza em pares de bases GC

(Colomba et al., 1996; Vitturi et al., 1999; Colomba et al., 2000a; Moura et al., 2003; Vitturi

et al., 2003). Os representantes do gênero Copris mostraram um padrão de distribuição da HC

bastante conservado. Copris lunaris e C. hispanus apresentaram blocos centroméricos em

todos os bivalentes. Entretanto, em C. sinicius foi evidenciado blocos centroméricos em todos

os cromossomos, e o y quase inteiramente heterocromático. Heliocopris gigas apresentou

autossomos e cromossomo X quase completamente heterocromático, e y totalmente

heterocromático (Angus et al., 2007). Os cromossomos de H. gigas são notáveis pela grande

quantidade de heterocromatina. Não há registro de nenhum outro representante de

Scarabaeoidea que possua heterocromatinização tão extensa, contudo, um padrão similar foi

observado em Peltodytes caesus (Adephaga: Haplidae) (Powell e Angus, 2006; Angus et al.,

2007).

Entre os representantes da tribo Scarabaeini somente duas espécies foram analisadas

pela técnica de bandeamento C. Scarabaeus laticollis apresentou blocos centroméricos em

todos os autossomos e no X, e o cromossomo y inteiramente heterocromático. Em S. cristatus

os resultados indicaram blocos heterocromáticos nas constrições secundárias (Angus et al.,

2007). Em representantes de Eucraniini foi observada variação no padrão de distribuição da

HC principalmente em relação aos cromossomos sexuais. Eucranium arachnoides mostrou

blocos pericentroméricos nos bivalentes 2, 3, 5 e 7, pericentromérios e teloméricos nos

bivalentes 4, 6 e 8, e no cromossomo X. O bivalente 1 e o y não apresentaram marcação. Em

Glyphoderus sterquilinus foram observados blocos pericentroméricos nos bivalentes 1 e 3-8.

O bivalente 2 e os sexuais não apresentaram nenhuma marcação (Vidal e Nocera, 1984).


40

Tabela 1. Meiofórmula e padrão de distribuição de heterocromatina constitutiva em diferentes subfamílias de Scarabaeidae.

Subfamília/Espécie Meiofórmula Bandeamento C Ref.

Dynastinae

Enema pan Blocos intersticiais e teloméricos. 1

Lygirus ebenus 9II + Xyp Blocos pericentroméricos em todos os cromossomos; bloco telomérico em um pequeno par autossômico; X quase completamente heterocromático.

10

Pentodon bidens punctatum

9II + Xyp Blocos pericentroméricos em todos os cromossomos.

8

Strategus surinamensis hirtus

9II + Xyp Blocos pericentroméricos em oito pares autossômicos; X quase completamente heterocromático.

10

Melolonthinae

Lyogenes fuscus 9II + Xyp Blocos pericentroméricos nos autossomos; sexuais quase completamente heterocromáticos.

7

Phyllophaga (Phyllophaga) aff. capillata

9II + Xyp Blocos pericentroméricos nos autossomos; sexuais quase completamente heterocromáticos.

7

P. (Phytalus) vestita 9II + Xyp Blocos pericentroméricos nos autossomos; sexuais quase completamente heterocromáticos.

7

Rutelinae

Geniates borelli 9II + Xyp Blocos pericentroméricos nos autossomos; X quase completamente heterocromático.

10

Macraspis festiva 8II + Xyp Blocos pericentroméricos nos autossomos; X quase completamente heterocromático.

10

Pelidnota pallidepennis

8II + Xyp Blocos pericentroméricos nos autossomos; X quase completamente heterocromático.

10


41

Scarabaeinae

Bolbites ornitoides 9II + Xyp Bloco pericentromérico em um par autossômico e oito pares difásicos.

2

Bubas bison 9II + XY Blocos intersticiais e teloméricos em todos os autossomos, exceto pares 1 e 2 que têm somente blocos teloméricos.

5, 12

B. bubaloides 9II + Xy Blocos centroméricos nos pares 1-4 e X, e pericentroméricos nos pares 5-7.

12

B. bubalus 9II + Xy + B Blocos centroméricos, cromossomo B heterocromático.

12

Canthon muticus 99II + XYp Padrão complexo de distribuição 3

Copris hispanus 9II + XY Blocos centroméricos em todos os cromossomos.

12

Copris lunaris 9II + Xy Blocos centroméricos em todos os cromossomos.

12

C. sinicius 6II + Xyp Blocos centroméricos em todos os autossomos e no X, y heterocromático.

12

Diabroctis mimas 9II + Xyp Pares 2, 4 e 7 difásicos; blocos teloméricos nos pares 1 e 3; X quase completamente heterocromático.

9

Eucranium arachnoides

8II + Xyp Blocos pericentroméricos nos pares 2, 3, 5 e 7; pericentroméricos e teloméricos nos pares 4, 6, 8 e no X. O par 1 e o y não apresentaram marcação.

4

Euoniticellus fulvus 9II + Xy Blocos centroméricos em todos os cromossomos, par 6 com braço longo heterocromático.

11

E. pallipes 9II + Xyp Bloco heterocromático no braço curto do par 2. Demais pares não apresentaram marcação.

11

Euonthophagus amyntas

9II + Xy + B Pares 4, 5, 8 e cromossomo X difásico. 11


42

E. atramentarius 9II + Xy Bloco heterocromático na constrição secundária dos pares 2 e 3. Demais pares não apresentaram marcação.

11

Glyphoderus sterquilinus

8II + Xyp Blocos pericentroméricos nos pares 1, 3-8. O par 2 e os sexuais não apresentaram nenhuma marcação.

4

Gymnopleurus geoffroyi

9II + Xyp Blocos centroméricos em todos os cromossomos, y heterocromático.

12

G. sturmi 9II + XY Blocos centroméricos e pericentroméricos nos cromossomo 1, 2, 3a e 4; subteloméricos nos pares 6-9, e no X; centroméricos nos cromossomos 3b e 5; nenhuma marcação no y.

6

Heliocopris gigas 9II + Xyp Bivalentes autossômicos e X quase completamente heterocromático, y totalmente heterocromático.

12

Isocopris inhiata 8II + Xyp Pares 3-5 e 7 difásicos; blocos teloméricos no par 6; X quase completamente heterocromático.

9

Onthophagus albicornis

9II + Xy Blocos centroméricos grandes com algumas variações de tamanho em todos os cromossomos.

11

O. coenobita 9II + Xy Blocos centroméricos em todos os autossomos e no X.

11

O. gazella 9II + Xy + B Blocos centroméricos pequenos em todos os autossomos e no X, telomérico no y.

11

O. hirtus 9II + Xy Blocos centroméricos médios em todos os cromossomos, X possui marcação maior e mais forte.

11

O. joannae 9II + Xy Blocos centroméricos em todos os autossomos e no X, par 2 com marcação mais evidente.

11

O. lucidus 9II + Xy Blocos centroméricos em todos os cromossomos.

11


43

O. opacicollis 9II + Xy Blocos centroméricos em todos os cromossomos, no X o bloco se estende da constrição do braço curto até a parte basal do braço longo.

11

O. ovatus 9II + Xy Blocos centroméricos em todos os cromossomos, marcações mais fracas nas constrições secundárias nos pares 4, 5 e possivelmente no 7.

11

O. ruficapillus 9II + Xy Blocos centroméricos pequenos, blocos fracos nas constrições secundárias dos pares 4 e 8.

11

O. similis 9II + Xy + B Blocos centroméricos em todos os cromossomos, exceto no y.

11

O. stylocerus 9II + Xy Blocos centroméricos, ausente no par 3 e mais evidente no 8.

11

O. vacca 9II + Xy + B Blocos centroméricos em todos os autossomos e no X, marcação mais extensa no B.

11

Paracopris ramosiceps 8II + Xyp Autossomo 8 e cromossomo X com regiões claras.

12

Scarabaeus cristatus 9II + Xyp Blocos heterocromáticos nas constrições secundárias.

12

S. laticollis 9II + Xy Blocos centroméricos em todos os autossomos e no X, y heterocromático.

12

(1) Vidal e Giacomozzi, 1978; (2) Vidal, 1980 apud Virkki, 1983; (3) Vidal e Henestrosa, 1984; (4) Vidal e Nocera, 1984; (5) Colomba et al., 1996; (6) Colomba et al., 2000a; (7) Moura et al., 2003; (8) Vitturi et al., 2003; (9) Bione et al., 2005a; (10) Bione et al., 2005b; (11) Wilson e Angus, 2005; (12) Angus et al., 2007.


44

Tabela 2. Meiofórmula e qualificação da heterocromatina constitutiva em diferentes subfamílias de Scarabaeidae.

Subfamília/Espécie Meiofórmula Fluorocromos Ref.

Dynastinae

Pentodon bidens punctatum

9II + Xyp Blocos pericentroméricos CMA3+ e

DAPI+ em todos os cromossomos. 4

Strategus surinamensis hirtus

9II + Xyp Oito bivalentes autossômicos e X CMA3

+; um par autossômico sem marcação.

6

Melolonthinae

Lyogenes fuscus 9II + Xyp Blocos DAPI+. 3

Phhyllophaga (Phyllophaga) aff. capillata

9II + Xyp CMA3+ no sexual e em um bivalente

autossômico pequeno. 3

P. (Phytalus) vestita 9II + Xyp Blocos pericentroméricos CMA3+ e

DAPI+. A coloração com DAPI+ é mais intensa.

3

Rutelinae

Geniates borelli 9II + Xyp Pequenos blocos pericentroméricos CMA3

+ nos autossomos e no X. 6

Pelidnota pallidipennis

8II + Xyp Blocos pericentroméricos DAPI+ em oito bivalentes autossômicos; bloco CMA3

+ em um bivalente autossômico e no cromossomo X.

6

Scarabaeinae

Bubas bison 9II + XY Blocos DAPI+. 1, 7

Gymnopleurus sturmi 9II + XY Blocos CMA3+ nos pares autossômicos e

no cromossomo X. 2

Isocopris inhiata 8II + Xyp Blocos DAPI+. 5

(1) Colomba et al., 1996; (2) Colomba et al., 2000a; (3) Moura et al., 2003; (4) Vitturi et al., 2003; (5) Bione et al., 2005a; (6) Bione et al., 2005b; (7) Colomba et al., 2006.


45

2.4. Regiões Organizadoras de Nucléolos

O nucléolo é o sítio de formação dos ribossomos e está localizado nos cromossomos

denominados organizadores nucleolares. Esta organela consiste de cinco componentes: o

centro fibrilar, o componente fibrilar denso, o componente granular, o vacúolo nuclear e a

cromatina associada ao nucléolo. No centro fibrilar estão localizados o DNA ribossômico

(DNAr), a RNA polimerase I e os fatores de transcrição para RNA ribossômico (RNAr); o

componente fibrilar denso está situado ao redor do centro fibrilar, e contém os pré-RNAr

recentemente transcritos e as enzimas envolvidas no processamento pós-transcrição. O

restante do nucléolo é preenchido pela região granular, contendo pequenas partículas que

representam os pré-ribossomos, prontos para serem transportados para o citoplasma. O

vacúolo nucleolar contém o material nucleoplasmático e a superfície externa do nucléolo

apresenta massas de cromatina condensada nas regiões peri e intranucleolar, provavelmente

conectadas ao DNA do centro fibrilar (Miller, 1981; Goessens, 1984; Jordan, 1991; Sumner,

2003).

As regiões organizadoras de nucléolos (RONs) são responsáveis pela organização

nucleolar durante a intérfase celular e foram caracterizadas pela primeira vez por McClintock

em 1934. Estas regiões contêm os principais genes envolvidos na produção de RNAr, sendo

responsáveis pela formação dos nucléolos e consistindo de sítios de DNAr (Schwarzacher e

Wachtler, 1983; Raska et al., 2004).

O RNAr é o componente primário dos ribossomos, que são organelas produtoras de

proteínas celulares. Quatro tipos de RNAr são descritos em eucariotas: 5S, 5,8S, 18S e 28 S

(Sumner, 2003). A maioria dos RNAs encontrados em uma célula típica são do tipo RNAr, e

estes são codificados por múltiplas cópias de genes. O DNAr apresenta genes organizados

dentro de duas famílias multigênicas distintas, compostas de segmentos repetidos em tandem


46

que são denominados DNAr 45S e 5S. O DNAr 45S compreende os genes que codificam os

RNAr 18S, 5.8S e 28S, os quais estão separados por espaçadores transcritos internos (ITS) e

externos (IGS ou ETS). O ETS é um dos principais responsáveis pelas diferenças encontradas

no tamanho dos cístrons entre espécies distintas. Os ITSs são geralmente compostos de

seqüências repetitivas ricas em pares de bases GC, o que justifica a detecção das regiões

organizadoras de nucléolos através do emprego de fluorocromos GC-específicos (Torres et

al., 1990; King, 1991).

Os sítios ativos de DNAr 45S mostram uma coincidência posicional com as RONs nos

cromossomos. Ao contrário do DNA ribossômico 45S, o DNAr 5S transcreve o RNAr 5S que

migra para o nucléolo e se junta ao RNAr 5,8S e 28S. Este DNA é composto de unidades

repetitivas em tandem de aproximadamente 120 pares de bases, intercaladas por um espaçador

não-transcrito (NTS). A região codificante do DNAr 5S é extremamente conservada, mesmo

entre organismos filogeneticamente distantes, enquanto os NTSs apresentam-se muito

heterogêneos, variando de tamanho entre as espécies (Long e Dawid, 1980; Pendás et al.,

1993).

Somente as RONs ativas participam da formação do nucléolo e geralmente variam

entre as espécies em relação ao número, tamanho e atividade em cada ciclo celular. Durante a

intérfase, ocorre um fenômeno denominado fusão nucleolar, e as RONs de mais de um

cromossomo podem participar da formação de um nucléolo (Schwarzacher e Wachtler, 1983).

Goodpasture e Bloom (1975) desenvolveram uma técnica de impregnação com nitrato

de prata (AgNO3) para visualização de RON através da microscopia óptica. O uso desta

técnica acarreta extração de DNA, RNA e histonas, sugerindo que a impregnação não é da

RON propriamente dita, mas de proteínas ácidas que possuem elevada afinidade pela prata

(Schwarzacher e Wachtler, 1983; Trere, 2000). Portanto, a especificidade desta técnica deve-

se à sua afinidade por proteínas ácidas presentes na RON que esteve funcionalmente ativa na


47

intérfase anterior (Pendás et al., 1993; Coghill et al., 2007). A impregnação AgNO3 pode

auxiliar o estudo tanto do nucléolo e das RONs como também de cores, complexo

sinaptonêmico, cinetócoros, centríolos adjunto das espemátides e, em alguns casos, detecta

diferenças entre estados da heterocromatina (Sumner, 2003).

A utilização da impregnação AgNO3 em conjunto com a hibridização in situ

fluorescente (FISH) com sonda ribossômica tem auxiliado no estudo da variabilidade e da

atividade das RONs. A FISH com sonda de seqüências de DNAr (18S, 28 S e 25S) tem sido

utilizada para localizar cistrons de DNAr independente de sua atividade, evidenciando as

seqüências que codificam RNAr (Pendás et al., 1993; Zijlstra et al., 1996).

2.4.1 Regiões Organizadoras de Nucléolos em Scarabaeidae

A determinação do número e da localização de regiões organizadoras de nucléolos

(RONs) constitui um parâmetro para a caracterização cromossômica das espécies, pois estas

regiões estão sempre presentes nos cromossomos e podem apresentar um padrão de

distribuição evolutivamente conservado para um grupo de organismos. Alterações no padrão

de distribuição das RONs podem indicar ocorrência de rearranjos cromossômicos e fornecer

dados sobre as estratégias de diferenciação cariotípica entre espécies relacionadas (White,

1973; Miller, 1981; Schwarzacher e Wachtler, 1983; Jordan, 1991; Trere, 2000).

A identificação dos cromossomos portadores de RONs em diferentes famílias de

Coleoptera tem possibilitado comparações cariotípicas entre espécies relacionadas em estudos

taxonômicos e evolutivos. Por outro lado, também tem favorecido o estabelecimento da

arquitetura molecular dos cromossomos e melhor compreensão do modo de associação de

cromossomos sexuais durante a meiose, especialmente daqueles pertencentes ao sistema de

determinação sexual do tipo Xyp (Petitpierre, 1996; Rozek et al., 2004). Durante o ciclo


48

celular, do diplóteno à metáfase I, o lúmen do bivalente sexual Xyp pode ser preenchido por

uma substância protéica ou por resíduos nucleolares que possuem afinidade pela prata (Virkki

et al., 1990). Esta substância pode funcionar como um elemento de adesão entre os sexuais,

controlando a disjunção e garantindo a orientação e a segregação corretas destes

cromossomos (Virkki et al., 1990, 1991).

O método de impregnação com AgNO3, contudo, não tem sido eficiente para a

detecção de RONs em diferentes representantes de Coleoptera. Nesta ordem, a HC pode

apresentar grande afinidade pela prata, levando a ocorrência de marcações de proteínas

argirofílicas que não estão associadas aos organizadores nucleolares. Este é o caso de

Thorectes intermedius (Geotrupidae), em que todas as regiões coradas pelo nitrato de prata

reagem positivamente ao bandeamento C, impossibilitando a detecção das RONs ativas

(Vitturi et al., 1999). Entretanto, em algumas espécies a impregnação AgNO3 tem sido eficaz.

Em Diabrotica speciosa (Chrysomelidae), Epicauta atomaria (Meloidae) e Palembus

dermestoides (Tenebrionidae), por exemplo, a HC não apresentou afinidade pela prata, e a

impregnação com AgNO3 foi eficiente na localização das RONs (Almeida et al., 2000;

Schneider et al., 2002).

Em representantes da família Scarabaeidae os estudos sobre RONs ainda são escassos.

Entretanto, a condição d um par de autossomos como organizador nucleolar tem sido a mais

comum (Colomba et al., 2000a; Moura et al., 2003). Três tipos básicos de RONs podem ser

observados no complemento cromossômico desta família: a) RON restrita ao cromossomo X,

b) RON restrita aos autossomos e c) RON presente tanto em autossomos quanto no X (Moura

et al., 2003; Vitturi et al., 2003; Bione et al., 2005a). A impregnação com AgNO3 tem sido

utilizada em conjunto com a hibridização in situ fluorescente (FISH) para a detecção de sítios

de DNAr. O estudo destas regiões, nesta família, tem contribuído para a caracterização

cariotípica de várias espécies. Em algumas espécies desta família as RONs foram localizadas


49

em um par autossômico, no cromossomo X, e também em autossomos e no X. A Tabela 3

apresenta dados sobre o padrão de distribuição de RONs em representantes de diferentes

subfamílias de Scarabaeidae.

Resultados bastante heterogêneos em relação ao número e distribuição das RONs, bem

como a afinidade da heterocromatina pela prata, têm sido descritos. Em Dynastinae a espécie

Lygirus ebenus apresentou um par autossômico portador de RON, e a marcação foi visível do

final do paquíteno ao início do diplóteno. Os blocos de heterocromatina constitutiva (HC) dos

autossomos e dos cromossomos sexuais também mostraram grande afinidade pela AgNO3. Na

espécie Strategus surinamensis hirtus a RON foi observada no bivalente sexual, e nenhuma

afinidade entre a prata e regiões heterocromáticas foi visualizada (Bione et al., 2005b). Em

Pentodon bidens punctatum não foi possível detectar as RONs com o uso de AgNO3,

entretanto, a FISH revelou a presença de sítios de DNAr no cromossomo X (Vitturi et al.,

2003).

A impregnação com nitrato de prata revelou um par portador de RON nas espécies

Lyogenes fuscus, Phyllophaga (Phylatus) vestita e Phyllophaga (Phyllophaga) aff. capillata

(Melolonthinae), sendo que para Phyllophaga (Phyllophaga) aff. capillata a marcação foi

positiva em um bivalente autossômico e nas demais espécies no bivalente sexual, que

permaneceu corado durante diferentes fases da meiose. A FISH confirmou a localização das

RONs, ocorrendo marcação em um autossomo pequeno de Phyllophaga (P.) capillata, e nos

cromossomos X de L. fuscus e Phyllophaga (P.) vestita. O nitrato de prata marcou também a

HC dos bivalentes autossômicos das três espécies, sugerindo um comportamento argirofílico

da heterocromatina (Moura et al., 2003).

Em Geniates borelli, Macraspis festiva e Pelidnota pallidepennis (Rutelinae) a técnica

de FISH mostrou a localização de sítios de DNAr no cromossomo X, coincidindo com os

resultados obtidos pela impregnação com AgNO3. Contudo, a impregnação AgNO3 também


50

mostrou que nas três espécies os bivalentes sexuais permaneceram marcados pelo nitrato de

prata após o desaparecimento do nucléolo, e massas amorfas que correspondem a proteínas

argirofílicas foram evidenciadas nos autossomos de G. borelli e P. pallidepennis (Bione et al.,

2005b).

As regiões organizadoras de nucléolos estão localizadas predominantemente em um

par autossômico em representantes de Scarabaeinae. Esta subfamília é a mais diversa

cariotipicamente, e possui a maior variabilidade em relação à determinação do número e

atividade das RONs (Colomba et al., 1996; Colomba et al., 2000a; Moura et al., 2003; Vitturi

et al., 2003; Bione et al., 2005a, b).

Os dados de FISH com sondas de DNAr mostraram polimorfismos para o número de

cromossomos portadores de RONs em Gymnopleurus sturmi. Sinais de hibridização foram

detectados na região telomérica de quatro ou cinco autossomos subtelocêntricos médios. Estes

sinais também foram polimórficos em relação ao tamanho (Colomba et al., 2000a). Em um

indivíduo macho de Dorcus parallelipipedus (Lucanidae) e um de Thorectes intermedius

(Geotrupidae), os sinais de hibridização com sondas de DNAr também mostraram tamanhos

diferentes, sugerindo a ocorrência de polimorfismo estrutural do DNAr (Colomba et al.,

2000b). A impregnação com AgNO3 em G. sturmi não foi eficaz na detecção de atividade das

RONs, pois a prata mostrou afinidade pela HC, corando tanto a heterocromatina constitutiva

quanto a heterocromatina associada ás regiões organizadoras de nucléolos. Por sua vez, as

regiões heterocromáticas mostraram riqueza em pares de bases GC, indicando que somente

uma parcela da região heterocromática CMA3+ está relacionada com a RON (Colomba et al.,

2000a).

Análise com FISH revelou sítios de DNAr em um par autossômico de Isocopris

inhiata e em dois pares e no cromossomo X de Diabroctis mimas. Os bivalentes autossômicos

envolvidos na organização nucleolar em D. mimas participam da formação do cromocentro,


51

sugerindo que conjuntos de DNAr poderiam ter se deslocado para outros cromossomos que

também formam o cromocentro. Outra explicação para a presença de três pares portadores de

RONs é a ocorrência de fissão autossômica seguida pela translocação dos sítios ribossômicos

(Bione et al., 2005a). Massas amorfas obtidas pela impregnação AgNO3 correspondendo às

proteínas argirofílicas foram observadas no bivalente Xyp de D. mimas e I. inhiata, do início

da prófase ao final do paquíteno ou início do diplóteno. Essa impregnação também detectou

blocos similares àqueles observados por bandeamento C durante as diferentes fases da

meiose, e o bivalente sexual permaneceu marcado pela prata após o desaparecimento do

nucléolo, possivelmente devido à presença de proteínas argirofílicas associadas à HC (Bione

et al., 2005a).

A utilização da FISH com sondas de DNAr em Bubas bison detectou genes de RNAr

localizados nos telômeros de quatro bivalentes autossômicos (Colomba et al., 1996; Colomba

et al., 2006). O complemento cromossômico de B. bison apresenta um número elevado de

cromossomos portadores de RONs comparado à outras espécies de Scarabaeoidea, onde os

sítios ribossômicos estão situados em pequenas regiões heterocromáticas de um ou dois pares

do cromossomo (Vitturi et al., 1999; Colomba et al., 2000b). O padrão de impregnação com

AgNO3 em B. bison mostrou marcação na região telomérica de oito bivalentes autossômicos,

coincidindo com os blocos heterocromáticos evidenciados pelo bandeamento C. Estes

resultados indicam que uma parcela considerável do DNA heterocromático positivo para prata

está associada aos sítios ribossômicos (Colomba et al., 1996; Colomba et al., 2006). Para a

maioria dos representantes de Scarabaeidae é observado resultado semelhante, sendo a

heterocromatina predominantemente corada pelo nitrato de prata (Colomba et al., 1996;

Colomba et al., 2000a; Moura et al., 2003; Vitturi et al., 2003).

As RONs de B. bison também apresentam coloração DAPI+ em contraste com a

maioria dos resultados disponíveis para Scarabaeidae, que evidenciaram marcações CMA3+


52

(Colomba et al., 2000a; Moura et al., 2003; Bione et al., 2005b; Colomba et al. 2006). A

predominância de pares de bases AT observada em B. bison também foi descrita para outros

representantes de Scarabaeidae e podem estar relacionadas com a reação da heterocromatina

ao tratamento com AgNO3 nestas espécies (Moura et al., 2003; Vitturi et al., 2003; Bione et

al., 2005a, b). Provavelmente, incluem a presença de proteínas argirofílicas associadas ao

DNA heterocromático, que podem ou não estar relacionada aos sítios ribossômicos (Colomba

et al. 2006).

Possivelmente a HC presente em escarabeídeos pertence a uma classe particular de

heterocromatina em relação àquela verificada em invertebrados, e estudos adicionais são

necessários para estabelecer sua composição bioquímica e sua reação positiva ao nitrato de

prata (Colomba et al., 2000a, b; Moura et al., 2003; Vitturi et al., 2003; Bione et al., 2005a, b;

Colomba et al., 2006).


53

Tabela 3. Meiofórmula, impregnação com nitrato de prata (AgNO3) e hibridização in situ fluorescente (FISH) com sonda de DNAr em diferentes subfamílias de Scarabaeidae.

Subfamília/Espécie Meio fórmula AgNO3 FISH Ref.

Dynastinae

Lygirus ebenus 9II + Xyp Um par autossômico portador de RON.

Marcação da HC. 6

Pentodon bidens punctatum 9II + Xyp

Marcação das regiões heterocromáticas e teloméricas de alguns autossomos.

Cromossomo X 4

Strategus surinamensis hirtus 9II + Xyp

Bivalente sexual portador de RON. 6

Melolonthinae

Lyogenes fuscus 9II + Xyp Bivalente sexual portador de RON.

Marcação da HC. Cromossomo X 3

Phyllophaga (Phylophaga) aff. capillata

9II + Xyp Um par autossômico portador de RON.

Marcação da HC.

Um autossomo pequeno. 3

P. (Phytalus) vestita 9II + Xyp Bivalente sexual portador de RON. Marcação da HC. Cromossomo X 3

Rutelinae

Geniates borelli 9II + Xyp Bivalente sexual portador de RON.


Macraspis festiva 8II + Xyp Bivalente sexual portador de RON. Cromossomo X 6

Pelidnota pallidepennis 8II + Xyp Bivalente sexual portador de RON.


Scarabaeinae

Bubas bison 9II + XY Marcação da HC. Oito autossomos. 1, 7

Diabroctis mimas 9II + Xyp Marcação da HC. Dois autossomos médios e cromossomo X.

5


54

Gymnopleurus sturmi 9II + XY Marcação da HC.

Quatro ou cinco autossomos médios portadores de RONs

2

Isocopris inhiata 8II + Xyp Marcação da HC. Um autossomo 5

(1) Colomba et al., 1996 (1); (2) Colomba et al., 2000a; (3) Moura et al., 2003; (4) Vitturi et al., 2003; (5) Bione et al., 2005a; (6) Bione et al., 2005b; (7) Colomba et al., 2006.


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68

4. Manuscrito de artigo científico

Análise citogenética comparativa entre Coprophanaeus (Megaphanaeus) ensifer e

Coprophanaeus (Coprophanaeus) cyanescens (Coleoptera: Scarabaeidae).

Manuscrito a ser encaminhado à revista

Genetica ISSN 1573-6857

Dordrecht, Holanda


69

Análise citogenética comparativa entre Coprophanaeus (Megaphanaeus) ensifer e Coprophanaeus (Coprophanaeus) cyanescens (Coleoptera: Scarabaeidae). Sárah Gomes de Oliveira1,2 Rita de Cássia de Moura1 Maria José de Souza2,*

1Laboratório de Biodiversidade e Genética de Insetos, Departamento de Biologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade de Pernambuco (UPE), Recife, PE, Brasil; 2Laboratório de Citogenética e Genética Animal, Departamento de Genética, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, PE, Brasil; *Autor para correspondência (Fone: +55-81-2126-8620; Fax: +55-81-2126-8520; E-mail: mjslopes.ufpe yahoo com.br)

Palavras-chave: Besouro, cariótipo, evolução cromossômica, FISH, heterocromatina

Resumo

Os cromossomos de Coprophanaeus (Megaphanaeus) ensifer e C. (Coprophanaeus)

cyanescens (Scarabaeidae) foram estudados por coloração convencional, bandeamento C,

coloração com nitrato de prata (AgNO3), fluorocromos base específicos e hibridização in situ

fluorescente (FISH) com sondas de DNAr 45S. As espécies apresentaram cariótipo simétrico,

número diplóide de 2n=20 e morfologia meta-submetacêntrica. C. (M.) ensifer apresentou

mecanismo sexual XY e C. (C.) cyanescens do tipo pára-quedas (XYp). A análise da

heterocromatina constitutiva (HC) nas duas espécies revelou cromossomos difásicos. A

coloração CMA3/DA/DAPI evidenciou blocos heterocromáticos CMA3+ restritos aos sexuais

em C. (C.) cyanescens, enquanto em C. (M.) ensifer foram visualizados blocos

pericentroméricos CMA3+ em todos os autossomos e no X, e intersticiais em três bivalentes

autossômicos. A coloração DAPI foi uniforme para ambas as espécies. A coloração com

AgNO3 foi ineficiente para detecção de RONs, contudo, mostrou afinidade por regiões

heterocromáticas. A FISH revelou a presença de sítios de DNAr 45S na região telomérica de

três bivalentes autossômicos de C. (C.) cyanescens e em sete bivalentes e no X de C. (M.)

ensifer. Nossos resultados contribuíram para a melhor compreensão da evolução dos

cromossomos e descrição de marcadores cromossômicos no gênero Coprophanaeus.


70

Introdução

A família Scarabaeidae constitui o maior grupo dentro da superfamília Scarabaeoidea

(Coleoptera), compreendendo aproximadamente 2.000 gêneros e 25.000 espécies descritas

com ampla distribuição mundial. Para a região Neotropical foram descritos 362 gêneros e

4706 espécies, dos quais 204 e 1.777, respectivamente, ocorrem no Brasil (Costa, 2000; Vaz-

de-Mello, 2000). Em Scarabaeidae, a subfamília Scarabaeinae se destaca por compreender

cerca de 6.000 espécies distribuídas em 12 tribos, cujos representantes são importantes

bioindicadores, atuando na reciclagem de matéria orgânica (Hanski & Cambefort, 1991;

Halffter & Favila, 1993; Lawrence & Newton, 1995). No Brasil ocorrem mais de 700 espécies

pertencentes a 49 gêneros, destas apenas 149 foram registradas no Nordeste Brasileiro e 26

para o Estado de Pernambuco (Vaz-de-Mello 2000; Silva et al., 2007). Considerando as

diferentes tribos de Scarabaeinae, Phanaeini se destaca com 150 espécies encontradas

somente no Novo Mundo e distribuídas em 12 gêneros: Bolbites, Coprophanaeus,

Dendropaemon, Diabroctis, Gromphas, Homalotarsus, Megatharsius, Oruscatus,

Oxysternon, Phanaeus, Sulcophanaeus e Tetramereia (Philips et al., 2004). Para o Brasil

foram registrados 10 gêneros e 74 espécies (Edmonds, 1972; Vaz-de-Mello, 2000; Silva et al.,

2007).

O gênero Coprophanaeus foi descrito por d’Olsoufieff (1924) e é composto pelos

subgêneros Coprophanaeus, Megaphanaeus e Metallophanaeus. Em sua maioria inclui

espécies necrófagas, geralmente encontradas em cadáveres frescos nos períodos crepusculares

a noturnos, sobrevoando o alimento por curtos períodos de tempo e pousando exatamente

sobre o recurso alimentar (Halffter e Edmonds, 1982; Otronen, 1988; Gill, 1991; Endres et al.,

2005). Durante a nidificação, estas espécies constroem bolas a partir do recurso alimentar, que


71

abrigam e alimentam as larvas, aumentando as chances de sucesso reprodutivo (Edmonds,

1972; Halffter et al., 1974; Halffter e Edmonds, 1982; Endres et al., 2005).

Em Coleoptera estudos citogenéticos têm sido realizados principalmente em

representantes da subordem Polyphaga. O cariótipo predominante é 2n=20,Xyp, com

cromossomos meta-submetacêntricos. O número diplóide varia de 2n=4 (Chalcolepidius

zonatus – Elateridae) a 2n=64 (Disonychina bicarinata – Chrysomelidae) (Ferreira et al.,

1984; Virkki, 1988). Os mecanismos sexuais observados em representantes de Polyphaga têm

origem principalmente a partir de rearranjos cromossômicos (X0, XY, neo-XY, múltiplo) ou

diferentes modos de associação entre os cromossomos X e y (Xyp, XYp, Xyr, Xyc) (White,

1973; Smith & Virkki, 1978; Ferreira et al., 1984; Mesa & Fontanetti, 1985; Yadav et al.,

1990; Gálian et al., 2002; Rozék et al., 2004).

A família Scarabaeidae destaca-se com cerca de 350 espécies estudadas

citogeneticamente, tem sido considerada conservada cariotipicamente, em relação ao número

diplóide 2n=20, mecanismo sexual Xyp e morfologia meta-submetacêntrica (meiofórmula

9II+Xyp) (Moura et al., 2003; Bione et al., 2005a, b). Entretanto, modificações no cariótipo

modal em representantes deste grupo têm sido descritas, com uma variação do número

diplóide de 2n=8 (Eurysternus caribaeus – Scarabaeinae) a 2n=30 (Autoserica assamensis –

Melolonthinae) e seis diferentes tipos de mecanismos sexuais, XY, Xyp, XYp, Xyr, neo-XY e

X0 (Smith & Virkki, 1978; Yadav et al., 1979; Yadav & Pillai, 1979; Martins, 1994; Colomba

et al., 2000; Moura et al., 2003; Vitturi et al., 2003; Cabral-de-Mello et al., 2007).

Dentre as subfamílias de Scarabaeidae, Dynastinae, Melolonthinae, Rutelinae e

Scarabaeinae possuem maior diversidade cariotípica e são as melhores estudadas do ponto de

vista cromossômico (Martins, 1994; Moura et al., 2003; Vitturi et al., 2003; Bione et al.,

2005b; Angus et al., 2007). Em Scarabaeinae o número diplóide primitivo 2n=20 e o

mecanismo sexual Xyp ocorrem em mais de 50% das espécies estudadas. Apesar desta


72

conservação cariotípica, os números diplóides 2n=8, 12, 14, 18, 20, 21, e 24 e os mecanismos

sexuais Xy, Xyp, XY, Xyr, neo-XY e X0 foram descritos para seus representantes devido à

ocorrência de diferentes rearranjos cromossômicos ao longo de sua evolução (Smith & Virkki,

1978; Yadav et al., 1979; Hanski & Cambefort, 1991; Bione et al., 2005a; Cabral-de-Mello et

al., 2007).

O padrão de distribuição de HC observado em algumas espécies de Scarabaeidae, em

geral é pericentromérico. Entretanto, também têm sido descritos blocos intersticiais, como em

Enema pan; teloméricos, em Bubas bison e cromossomos difásicos, observados em Bolbites

ornitoides (Vidal, 1980 apud Virkki, 1983). Em geral o cromossomo X apresenta-se quase

completamente heterocromático, embora algumas espécies possuam blocos paracêntricos,

pericentroméricos e subteloméricos (Vidal & Nocera, 1984, Colomba et al., 2000, Vitturi et

al., 2003, Bione et al., 2005b). O uso dos fluorocromos base específicos CMA3 e DAPI em

representantes de Dynastinae, Melolonthinae, Rutelinae e Scarabaeinae revelou uma grande

heterogeneidade quanto à composição de bases AT/GC presentes nas bandas C das espécies

analisadas (Moura et al., 2003; Vitturi et al., 2003; Bione et al., 2005b).

Em Scarabaeidae a técnica de coloração com AgNO3 tem sido utilizada em conjunto

com a hibridização in situ fluorescente (FISH) para a detecção de sítios de DNAr. A

ocorrência de uma ou duas RONs tem sido a condição mais freqüente. Contudo, em algumas

espécies desta família as RONs foram localizadas em um par autossômico, ou no

cromossomo X, ou conjuntamente em autossomos e no X (Colomba et al., 2000, Vitturi et al.,

2003, Moura et al., 2003, Bione et al., 2005a, b, Colomba et al., 2006).

Neste trabalho realizamos uma análise cromossômica comparativa entre duas espécies

de Coprophanaeus, visando aprofundar os conhecimentos sobre evolução cromossômica

dentro de Scarabaeidae e contribuir para um melhor entendimento das implicações

cariotípica-evolutivas do grupo.


73

Material e métodos

Espécimes

Cromossomos meióticos foram obtidos em diferentes espécimes machos de

Coprophanaeus (Megaphanaeus) ensifer (GERMAR, 1824) e C. (Coprophanaeus)

cyanescens (OLIVIER, 1789) oriundos de diferentes localidades da região nordeste do Brasil.

Cinqüenta e três indivíduos de C. (C.) cyanescens foram coletados em área de pastagem no

Município de Caruaru (08° 425’ S, 035° 151’ W); e cinco indivíduos de C. (M.) ensifer em

remanescentes de Mata Atlântica em Aldeia, município de Paudalho (07° 53’ 48’’ S, 35° 10’

47’’ W), Pernambuco. Um espécime de C. (M.) ensifer e um de C. (C.) cyanescens foram

coletados em Andaraí (12° 48’ 25’’ S, 41° 19’ 51’’ W), Chapada da Diamantina, Bahia.

Preparações cromossômicas

Os folículos testiculares foram fixados em solução Carnoy (etanol e ácido acético, 3:1)

e para as preparações citológicas foi utilizada a técnica de esmagamento de folículos

testiculares. Os exemplares foram analisados citologicamente por coloração com orceína

lacto-acética a 2%. O bandeamento C foi feito segundo Sumner (1972), com modificações. As

lâminas foram mergulhadas em uma solução ácida (HCl 0,2N) por 30 minutos à temperatura

ambiente, seguida por soluções básica (Ba(OH)2) por 35 a 120 segundos e solução salina (2x

SSC) por 45 minutos, ambas a 60°C. As lâminas foram coradas com Giemsa 5% durante 5

minutos.

A análise qualitativa da HC foi realizada através da tríplice coloração com

CMA3/DA/DAPI (Cromomicina A3/Distamicina A/4’6-diamino-2’-fenilindol) de acordo com


74

Schweizer (1976), com algumas modificações. Cada lâmina foi corada com 2 gotas de CMA3

(0,5 mg/ml) por 60 minutos, duas gotas de solução de Distamina A (0,1 mg/ml) por 40

minutos e duas gotas da solução de DAPI (0,5 mg/ml) por 20 minutos à temperatura

ambiente. Após cada tratamento as lâminas foram lavadas com água destilada e secas a

temperatura ambiente. As lâminas foram montadas com meio constituído por glicerol/tampão

Macllvaine/MgCl2.

A impregnação com nitrato de prata (AgNO3) seguiu o protocolo descrito por Rufas et

al. (1985), com modificações. As lâminas foram mergulhadas em solução salina (2x SSC) em

banho-maria a 60°C durante 10 minutos, e posteriormente lavadas com água destilada. Cada

lâmina foi tratada com uma gota da solução AgNO3/água formicada (0,1g/0,1ml) em câmara

úmida por dois minutos.

A hibridização in situ fluorescente (FISH) foi realizada segundo protocolo de

Moscone et al. (1996), utilizando sonda de DNAr 45S de Arabidopsis thaliana marcada

através de nick translation com digoxigenina e detectada com anticorpo anti-digoxigenina de

ovelha ligado ao fluorocromo FITC. A amplificação do sinal foi realizada com o uso do

anticorpo anti-ovelha de coelho conjugado ao FITC (743, Dako). As preparações

cromossômicas foram contra-coradas com DAPI (2μg/ml) e montadas com Vectashield H-

1000 (Vector).

As células foram fotografadas no sistema de capturada de imagens Cytovision

(System) acoplado ao microscópio Olympus BX51 e as pranchas foram organizadas nos

programas Corel Photo-Paint 12 e Adobe Photoshop CS2.


75

Resultados

A espécie Coprophanaeus (Megaphanaeus) ensifer apresentou número diplóide de

2n=20, cromossomos meta-submetacêntricos e mecanismo sexual do tipo XY, com

meiofórmula 9II+XY (Figura 1a-d). Em C. (Coprophanaeus) cyanescens o número

cromossômico observado foi 2n=20, cromossomos meta-submetacêntricos e mecanismo

sexual XYp, com meiofórmula 9II+XYp (Figura 1e-h). Nas duas espécies o cariótipo foi

simétrico, com os cromossomos diminuindo em ordem gradativa de tamanho.

A distribuição da heterocromatina constitutiva (HC) observada em Coprophanaeus

(M.) ensifer revelou um padrão que corresponde a cromossomos difásicos referentes aos

braços longos dos bivalentes autossômicos. Três bivalentes autossômicos de tamanho médio

apresentaram blocos intersticiais. O menor bivalente autossômico mostrou bloco telomérico.

O cromossomo X possui bloco pericentromérico e o Y é quase totalmente heterocromático

(Figura 2a). O padrão de bandeamento C de Coprophanaeus (C.) cyanescens correspondeu a

bivalentes autossômicos difásicos, o cromossomo X é quase completamente heterocromático,

e o cromossomo Y possui um pequeno bloco pericentromérico de HC (Figura 2b).

Em C. (M.) ensifer a coloração CMA3/DA/DAPI evidenciou blocos centroméricos de

heterocromatina constitutiva CMA3 positivos em todos os autossomos e no cromossomo X,

apresentando também marcações intersticiais em três bivalentes autossômicos de tamanho

médio, e nenhuma marcação foi observada no Y (Figura 3a). Em C. (C.) cyanescens, um

bloco de heterocromatina constitutiva CMA3 positivo foi visualizado no bivalente sexual

(Figura 3c). A coloração DAPI foi uniforme em todos os cromossomos do complemento das

duas espécies estudadas (Figura 3b, d).

A coloração com AgNO3 nas duas espécies foi ineficiente para detecção das

RONs, contudo, mostrou afinidade pela HC, revelando pequenos blocos pericentroméricos em


76

todos os bivalentes autossômicos das duas espécies analisadas (Figura 2c-d). Em adição, C.

(M.) ensifer mostrou o bivalente sexual quase inteiramente corado pelo nitrato de prata

(Figura 2c), enquanto C. (C.) cyanescens apresentou blocos teloméricos AgNO3 em três

bivalentes autossômicos e na região pericentromérica dos cromossomos sexuais (Figura 2d).

A hibridização in situ fluorescente (FISH) com sonda ribossômica permitiu a

identificação de sítios de DNAr na região pericentromérica de sete bivalentes autossômicos e

no cromossomo X de C. (M.) ensifer (Figura 4a-b). Nessa espécie os cromossomo portadores

de RONs, quando comparados entre si, apresentaram variação quanto ao tamanho dos sinais

de hibridização. Em C. (C.) cyanescens os sítios de DNAr foram localizados em regiões

teloméricas de três bivalentes autossômicos (Figura 4c-d). Nas duas espécies analisadas foi

observado um bivalente autossômico com o sinal de hibridização em apenas um dos

homólogos do par (Figura 4b, d).

Discussão

Segundo Yadav & Pillai (1979) a variação cariotípica em Scarabaeidae decorre

principalmente de cinco diferentes rearranjos cromossômicos, como fusão autossomo-

autossomo (A-A), fusão autossomo-cromossomo X (A-X), perda do cromossomo y, fissão de

autossomos e inversões pericêntricas. Contudo, o número cromossômico apresentado por C.

(Megaphanaeus) ensifer e C. (Coprophanaeus) cyanescens (2n=20), tem sido descrito em

cerca de 65% dos representantes da subfamília Scarabaeinae, sendo considerado primitivo

para a subordem Polyphaga (Smith & Virkki, 1978; Yadav & Pillai, 1979; Vidal, 1984;

Wilson & Angus, 2005; Angus et al., 2007).

O padrão cariotípico observado em C. (M.) ensifer neste trabalho foi similar ao

descrito por Martins (1994). Anteriormente esta espécie era classificada como pertencente ao


77

gênero Phanaeus. Nossos dados cariotípicos corroboram a inclusão da espécie para o gênero

Coprophanaeus, considerando que Phanaeus possui redução do número diplóide para 2n=14

(P. yucatanus) e 2n=12 (P. vindex, P. daphnis, P. igneus, P. mexicanus) (Smith & Virkki,

1978; Yadav & Pillai, 1979; Vidal, 1984).

Os cromossomos X e Y envolvidos na formação do mecanismo sexual do tipo XYp

observado em C. (C.) cyanescens possuem tamanhos similares. Este mecanismo é incomum

para Coleoptera, e foi descrito pela primeira vez para Scarabaeidae por Moura et al. (2003)

em Phyllophaga (Phyllophaga) aff. capillata (Melolonthinae). Segundo Mesa & Fontanetti

(1985) a ocorrência do mecanismo XYp pode ser originado de duas formas: (1) um estágio

inicial na origem do Xyp no qual os cromossomos sexuais possuem tamanhos similares ou (2)

a partir de um Xyp por adição de HC no cromossomo y. Por outro lado, o mecanismo XY,

observado em Coprophanaeus (M.) ensifer tem sido encontrado em outras espécies de

Scarabaeinae, como relatado em Bubas bison, Copris hispanus, Gymnopleurus sturmi e

Phanaeus igneus (Smith & Virkki, 1978; Martins, 1994; Colomba et al., 2000; Colomba et.

al, 1996; Angus et al., 2007). Neste tipo de mecanismo sexual ocorre pareamento do X e Y

durante a meiose. Segundo Martins (1994), a origem do mecanismo XY em Phanaeus (M.)

ensifer (= Coprophanaeus (M.) ensifer) possivelmente ocorreu por fusão entre um bivalente

autossômico e os sexuais, seguida pela fissão de um outro par autossômico, desse modo

retornando à condição metacêntrica e ao número diplóide original.

O padrão de distribuição de HC em Coprophanaeus (M.) ensifer e Coprophanaeus

(C.) cyanescens é similar com relação aos cromossomos difásicos, entretanto, difere quanto

aos blocos teloméricos em C. (M.) ensifer e em relação ao padrão observado nos

cromossomos sexuais. A presença de cromossomos difásicos nas duas espécies analisadas

difere do padrão pericentromérico de HC predominante em Scarabaeinae (Bione et al., 2005a;

Vitturi et al., 2003; Moura et al., 2003). Por outro lado, a grande quantidade de HC e a


78

ocorrência de cromossomos difásicos observada nas espécies de Coprophanaeus também

foram descritas em três espécies da tribo Phanaeini, Bolbites ornitoides, Diabroctis mimas e

Isocopris inhiata (Vidal, 1980 apud Virkki, 1983; Bione et al., 2005a). Entretanto, essas três

espécies analisadas apresentaram braços curtos difásicos, diferente das espécies de

Coprophanaeus cujo padrão difásico envolve os braços longos.

A grande quantidade de HC observada nos autossomos de C. (M.) ensifer e C. (C.)

cyanescens pode ser explicada pela expansão de DNA repetitivo no genoma destas espécies,

envolvendo amplificação destas seqüências através de conversão gênica, crossing-over

desigual, replicação circular e replicação slippage (Charlesworth et al., 1994; Hancock, 1999;

Li et al., 2002). A quantidade e variabilidade de HC apresentada entre os diferentes

representantes de Scarabaeidae podem estar relacionadas com as diferenças na localização e

no número de seqüências de DNA satélite. Alguns genomas podem conter diversas famílias

de DNA satélite e com repetitividade diferente, como foi relatado para Cicindela maroccana e

C. campestris (Cicindelidae) (Galián & Vogler, 2002).

O padrão de HC observado através do bandeamento C em Coprophanaeus (C.)

cyanescens para os cromossomos sexuais é bastante semelhante ao comumente relatado para

Scarabaeidae, em que o cromossomo X é quase totalmente heterocromático e o Y

eucromático (Vitturi et al., 2003; Moura et al., 2003; Bione et al., 2005b; Angus et al., 2007).

Por outro lado, o padrão de distribuição da HC observado nos cromossomos sexuais de

Coprophanaeus (M.) ensifer difere dos relatados em Diabroctis mimas e Isocopris inhiata,

que apresentam o cromossomo X completamente heterocromático (Moura et al., 2003, Bione

et al., 2005a, b). As espécies Copris sinicius e Scarabaeus laticollis (Phanaeini) (Angus et al.,

2007) compartilham com Coprophanaeus (M.) ensifer a marcação centromérica de HC no

cromossomo X e Y totalmente heterocromático.


79

O padrão de qualificação da HC, visualizado pela coloração CMA3/DA/DAPI, revelou

uma ampla diferença entre as duas espécies analisadas. Em Coprophanaeus (M.) ensifer,

blocos CMA3 positivos foram observados em todos os cromossomos. Contudo, os blocos

marcados foram menores quando comparados com aqueles marcados pelo bandeamento C,

indicando que nem toda HC foi CMA3 positiva nesta espécie. Por outro lado, C. (C.)

cyanescens revelou que os blocos de HC positivos para CMA3 estão restritos ao bivalente

sexual. Blocos pericentroméricos CMA3+ também foram visualizados em todos os

cromossomos de Geniates borelli (Rutelinae), em oito bivalentes autossômicos e no

cromossomo X de Strategus surinamensis hirtus (Dynastinae), em um bivalente autossômico

e no cromossomo X de Phylophaga (Phylophaga) aff capilata (Melolontinae) e em todos os

bivalentes autossômicos e no cromossomo X de Gymnopleurus sturmi (Scarabaeinae)

(Colomba et al., 2000; Moura et al., 2003; Vitturi et al., 2003; Bione et al., 2005b).

Bubas bison e Isocopris inhiata (Phanaeini) mostraram riqueza em pares de bases AT,

diferindo do padrão observado nas espécies de Coprophanaeus analisadas e do comumente

relatado para Scarabaeidae, em que as espécies predominantemente mostram riqueza em pares

de bases GC (Colomba et al., 1996; Vitturi et al., 1999; Colomba et al., 2000; Vitturi et al.,

2003). A marcação positiva para CMA3 restrita ao bivalente sexual, como observada em C.

(C.) cyanescens não foi relatada para nenhuma outra espécie de Scarabaeidae.

Padrões de distribuição de RONs têm sido usados para comparações cariotípicas entre

espécies relacionadas em diferentes grupos de Coleoptera. Entretanto, a coloração AgNO3,

diferente da hibridização in situ fluorescente (FISH), não tem sido muito eficiente para a

detecção de RONs. Por outro lado, a coloração AgNO3 tem permitido a marcação de blocos

de HC, correspondendo geralmente ao padrão obtido pelo bandeamento C. Esse padrão de

marcação decorre da grande afinidade do nitrato de prata, por proteínas argirofílicas

associadas à HC. Nas duas espécies de Coprophanaeus analisadas neste trabalho e em


80

Thorectes intermedius (Geotrupidae) todas as regiões impregnadas pelo AgNO3

correspondem aos blocos de HC (Vitturi et al., 1999). Resultados semelhantes têm sido

descritos em Lyogenes fuscus, Phyllophaga (Phylatus) vestita, P. (Phyllophaga) aff. capillata

(Melolonthinae), Geniates borelli e Pelidnota pallidepennis (Rutelinae), corroborando a

afinidade entre o nitrato de prata e as regiões heterocromáticas (Moura et al., 2003; Bione et

al., 2005b). Em Lygirus ebenus (Dynastinae), as regiões heterocromáticas dos autossomos e

dos cromossomos sexuais também mostraram grande afinidade pelo AgNO3 (Bione et al.,

2005b).

Em todos os cromossomos do complemento de C. (C.) cyanescens e nos bivalentes

autossômicos de C. (M.) ensifer os blocos heterocromáticos AgNO3 positivos são menores do

que aqueles observados pela técnica de bandeamento C, sugerindo a presença de uma

heterocromatina heterogênea. A presença de blocos heterocromáticos AgNO3 positivos no

bivalente sexual XYp de C. (C.) cyanescens também foi observado em Diabroctis mimas e

Isocopris inhiata (Bione et al., 2005a). Contudo, em C. (M.) ensifer os cromossomos sexuais

foram quase totalmente marcados pela AgNO3, indicando que nesta espécie toda a

heterocromatina destes cromossomos apresenta afinidade pelo nitrato de prata.

O padrão de FISH com sinais teloméricos em três bivalentes autossômicos, observado

em C. (C.) cyanescens, não tem sido descrito para Scarabaeidae. Nesta família, a ocorrência

de uma ou duas RONs pericentroméricas representa a condição mais freqüente (Vitturi et al.,

2003; Moura et al., 2003; Bione et al., 2005a, b). A espécie Bubas bison (Scarabaeinae)

possui sítios de DNAr localizados em quatro bivalentes autossômicos e se destaca quando

comparada com outras espécies de Scarabaeidae por apresentar o maior número de RONs

descrito para a família (Colomba et al., 1996, 2006). Em C. (M.) ensifer sete bivalentes

autossômicos e o cromossomo X foram identificados como portadores de RONs, com

variação no tamanho do sinal de hibridização, sendo este resultado inédito para Coleoptera.


81

Nesta ordem, uma ampla variabilidade no número de cromossomos portadores de RONs foi

descrita para o gênero Zabrus (Carabidae). Dentre as 19 espécies analisadas três apresentaram

apenas um bivalente autossômico portador de RONs, enquanto as espécies Zabrus

(Iberozabrus) ambiguus, Z. (I.) castroi e Z. (I.) vasconicus mostraram seis bivalentes

autossômicos portadores de sítios de DNAr. Foram sugeridas três possibilidades que podem

explicar a origem do elevado número de RONs observado neste gênero: 1) associação da HC

com regiões de DNAr, ocasionando rearranjos nestas regiões cromossômicas, 2) presença de

cromossomo B como uma possível fonte de sítios de DNAr para outros cromossomos do

cariótipo e 3) presença de elementos transponíveis, ocasionando pequenos rearranjos

cromossômicos (Sánchez-Gea et al., 2000).

Em C. (M.) ensifer e C. (C.) cyanescens são necessários estudos moleculares

específicos para detecção de sítios ribossômicos, visando explicar o elevado número de

cromossomos portadores de sítios de DNAr descritos para estas espécies. A variação no

tamanho do sinal de hibridização visualizado em C. (M.) ensifer pode estar relacionada à

ocorrência de diferentes números de repetições da seqüência ribossômica, como descrito para

Gymnopleurus sturmi (Colomba et al., 2000).

Em C. (M.) ensifer as RONs estão localizadas em regiões de heterocromatina

constitutiva CMA3 positiva, enquanto em C. (C.) cyanescens as regiões portadoras de RONs

são neutras para pares de bases AT e GC. Em Scarabaeidae a maioria dos resultados relatados

evidenciaram marcações CMA3 positivas associadas às RONs, constatando que as seqüências

espaçadoras de DNAr geralmente possuem riqueza em pares de bases GC (Colomba et al.,

2000; Moura et al., 2003; Bione et al., 2005b).

Nossos resultados mostram que as duas espécies de Coprophanaeus possuem

cariótipos similares e considerados comuns para Scarabaeidae, exceto pela ocorrência dos

mecanismos sexuais XY e XYp. Entretanto, uma análise citogenética molecular de outros


82

membros do gênero Coprophanaeus é necessária para melhor compreensão dos padrões

evolutivos ocorrentes neste gênero, bem como uma análise mais refinada das seqüências de

DNA satélite e dos sítios de DNAr.

Agradecimentos

Os autores são gratos ao Dr. Sérgio Ide, ao Dr. Fernando Zagury Vaz-de-Mello e ao

biólogo Fernando Augusto Barbosa Silva pela identificação taxonômica das espécies

analisadas neste trabalho, à Cirlene Maria da Silva e Francisca Tavares de Lira pela

assistência técnica, ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico –

CNPq e ao PPP/MTC/CNPq/CT-INFRA/FACEPE (Projeto nº. 006/2003) pelo auxílio

financeiro.

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92

5. Conclusões

1. O número cromossômico 2n=20 e a ocorrência de cromossomos meta-

submetacêntricos observados em Coprophanaeus (Megaphanaeus) ensifer, C. (C.)

cyanescens coincidiu com o padrão comum para a família Scarabaeidae;

2. O mecanismo sexual XY, observado em C. (M.) ensifer possivelmente se originou a

partir da fusão entre um bivalente autossômico e os sexuais, seguida pela fissão de um

outro par autossômico;

3. O mecanismo sexual do tipo XYp observado em C. (C.) cyanescens representa uma

variação do mecanismo sexual Xyp, no qual o cromossomo Y possui tamanho similar

ao X, provavelmente originado a partir de rearranjos cromossômicos;

4. Coprophanaeus (M.) ensifer e C. (C.) cyanescens apresentaram cromossomos

difásicos, com braços autossômicos inteiramente heterocromáticos, diferindo do

padrão pericentromérico comumente observado em Scarabaeidae;

5. A marcação CMA3 positiva restrita ao bivalente sexual de C. (C.) cyanescens difere

dos padrões descritos para Scarabaeidae e reforça a ampla heterogeneidade observada

nos representantes desta família;

6. A coloração com AgNO3 não foi eficiente para a identificação dos cromossomos

portadores de RONs. Contudo, revelou afinidade pelas regiões heterocromáticas nas

duas espécies analisadas;

7. Os diferentes padrões observados com a utilização do bandeamento C, coloração

AgNO3 e fluorocromos base específicos sugerem a presença de uma heterocromatina

heterogênea em C. (M.) ensifer e C. (C.) cyanescens;

8. Coprophanaeus (C.) cyanescens apresentou sítios de RNAr revelados pela FISH na

região telomérica de três bivalentes autossômicos, diferindo da maioria dos


93

representantes de Scarabaeidae, nos quais a ocorrência de uma ou duas RONs tem sido

a condição mais freqüente;

9. Coprophanaeus (M.) ensifer apresentou o maior número de cromossomos portadores

de RONs descrito para Coleoptera e a variação no tamanho do sinal de hibridização

decorre possivelmente de diferentes repetições no número de sítios de DNAr.


94

6. Abstract

The chromosomes of Coprophanaeus (Megaphanaeus) ensifer and C. (Coprophanaeus)

cyanescens were studied using conventional staining, C-banding, staining with silver nitrate

(AgNO3), base specific fluorochromes and FISH. The species presented symmetrical

karyotype, diploid number of 2n=20 and meta-submetacentric morphology. The species C.

(M.) ensifer and C. (C.) cyanescens showed, respectively, sexual mechanisms of the type XY

and XYp. The analysis of the distribution of constitutive heterochromatin (CH) in the two

species revealed diphasic chromosomes corresponding to the long arms of the autosomal

bivalents. In addition, C. (M.) ensifer showed pericentromeric blocks in three autosomal

bivalents and in the X, telomeric block in the pair 9 and Y almost totally heterochromatic. C.

(C.) cyanescens presented X chromosome almost completely heterochromatic and Y with

small pericentromeric block. The staining CMA3/DA/DAPI evidenced heterochromatic blocks

CMA3 positive in the sexual bivalent of C. (C.) cyanescens, while in C. (M.) ensifer

pericentromeric blocks CMA3+ were visualized in all the autosomes and in the X, and

interstitial in three autosomal bivalents. The DAPI staining was uniform in the two species.

The staining with AgNO3 was inefficient for detection of chromosomes bearers of NORs,

however, showed affinity for the CH. FISH evidenced sites of DNAr in the telomeric

autosomal area of three bivalents of C. (C.) cyanescens, and in seven autosomal bivalents and

in the X of C. (M.) ensifer. The karyotypic differences and similarities found in the two

species are discussed and compared with data described for other Coleoptera species.

Key-words: Coprophanaeus, heterochromatin, NOR, FISH


95

7. Anexos


96

7.1. Anexo I Instruções para autores

Revista Genetica

ISSN 1573-6857

Dordrecht, Holanda


97

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than 40 words should be set off clearly, either by indenting the left−hand margin or by using a smaller typeface. Use double quotation marks for direct quotations and single quotation marks for quotations within quotations and for words or phrases used in a special sense. Number the pages consecutively with the first page containing: Title page

The title page should list in order: the title of the manuscript; the authors names and their institutional affiliations with concise addresses; the name, address, telephone and fax numbers, and E−mail address.

Abstract

The abstract should consist of a single paragraph of approximately 200 words which summarizes the subject. References should not be cited in the abstract.

Key words

Please provide 5 to 10 key words or short phrases in alphabetical order. Abbreviations

Abbreviations and their explanations should be collected in a list. Text

Four levels of headings should be used in the text. The first level should be bold−faced, freestanding and positioned flush to the left margin. This heading level should be reserved for blocks or text that constitute a major fraction of the article (e.g. Materials and methods). The second level of headings should be italics, freestanding, flush left. This heading level is used to group two or more closely related third−level heads in long−papers. The third level headings is the most frequently used subhead. It is italics, flush left with no white line underneath and is used to initiate the first paragraph of a sub−topic. The fourth level heading is paragraph−initiating italic followed by a colon. Desired location of tables and figures should be indicated in the margins. Text citations with three or fewer authors should include all names while those with four or more authors should cite the first author and et al. Only articles that are published or in press should be cited. Citations of personal communications or unpublished results should list all names and initials. Numbers of ten or less should be written in full unless part of a date, a fraction or decimal, a percent or a unit of measurement.

Taxonomic names

Taxonomic names of genera and lower taxa should be italicized. Authors are requested to mention the authorities of any taxa named in the articles.

Appendices

This section should be reserved for large bodies of data of mathematical derivations that would disrupt the main text.

Cross−Referencing

In the text, a reference identified by means of an author‘s name should be followed by the date of the reference in parentheses and page number(s) where appropriate. When there are more than two authors, only the first author‘s name should be mentioned, followed by


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‘et al.‘. In the event that an author cited has had two or more works published during the same year, the reference, both in the text and in the reference list, should be identified by a lower case letter like ‘a‘ and ‘b‘ after the date to distinguish the works. Examples: Winograd (1986, p. 204) (Winograd , 1986a, b) (Winograd, 1986; Flores et al., 1988) (Bullen, Beauchamp & Bennett, 1990)

Acknowledgements

Acknowledgements of people, grants, funds, etc. should be placed in a separate section before the References.

References 1. Journal article: Smith J, Jones M Jr, Houghton L et al (1999) Future of health insurance. N Engl J Med 965:325–329 2. Inclusion of issue number (optional): Saunders DS (1976) The biological clock of insects. Sci Am 234(2):114–121 3. Journal issue with issue editor: Smith J (ed) (1998) Rodent genes. Mod Genomics J 14(6):126–233 4. Journal issue with no issue editor: Mod Genomics J (1998) Rodent genes. Mod Genomics J 14(6):126–233 5. Book chapter: Brown B, Aaron M (2001) The politics of nature. In: Smith J (ed) The rise of modern genomics, 3rd edn. Wiley, New York 6. Book, authored: South J, Blass B (2001) The future of modern genomics. Blackwell, London 7. Book, edited: Smith J, Brown B (eds) (2001) The demise of modern genomics. Blackwell, London 8. Chapter in a book in a series without volume titles: Schmidt H (1989) Testing results. In: Hutzinger O (ed) Handbook of environmental chemistry, vol 2E. Springer, Berlin Heidelberg New York, p 111 9. Chapter in a book in a series with volume title: Smith SE (1976) Neuromuscular blocking drugs in man. In: Zaimis E (ed) Neuromuscular junction. Handbook of experimental pharmacology, vol 42. Springer, Berlin Heidelberg New York, pp593–660 10. Proceedings as a book (in a series and subseries): Zowghi D et al (1996) A framework for reasoning about requirements in evolution. In: Foo N, Goebel R (eds) PRICAI'96: topics in artificial intelligence. 4th Pacific Rim conference on


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artificial intelligence, Cairns, August 1996. Lecture notes in computer science (Lecture notes in artificial intelligence), vol 1114. Springer, Berlin Heidelberg New York, p 157 11. Proceedings with an editor (without a publisher): Aaron M (1999) The future of genomics. In: Williams H (ed) Proceedings of the genomic researchers, Boston, 1999 12. Proceedings without an editor (without a publisher): Chung S-T, Morris RL (1978) Isolation and characterization of plasmid deoxyribonucleic acid from Streptomyces fradiae. In: Abstracts of the 3rd international symposium on the genetics of industrial microorganisms, University of Wisconsin, Madison, 4–9 June 1978 13. Paper presented at a conference: Chung S-T, Morris RL (1978) Isolation and characterization of plasmid deoxyribonucleic acid from Streptomyces fradiae. Paper presented at the 3rd international symposium on the genetics of industrial microorganisms, University of Wisconsin, Madison, 4–9 June 1978 14. Patent: Name and date of patent are optional Norman LO (1998) Lightning rods. US Patent 4,379,752, 9 Sept 1998 15. Dissertation: Trent JW (1975) Experimental acute renal failure. Dissertation, University of California 16. Institutional author (book): International Anatomical Nomenclature Committee (1966) Nomina anatomica. Excerpta Medica, Amsterdam 17. Non-English publication cited in an English publication: Wolf GH, Lehman P-F (1976) Atlas der Anatomie, vol 4/3, 4th edn. Fischer, Berlin. [NB: Use the language of the primary document, not that of the reference for "vol" etc.!] 18. Non-Latin alphabet publication: The English translation is optional. Marikhin VY, Myasnikova LP (1977) Nadmolekulyarnaya struktura polimerov (The supramolecular structure of polymers). Khimiya, Leningrad 19. Published and In press articles with or without DOI: 19.1 In press Wilson M et al (2006) References. In: Wilson M (ed) Style manual. Springer, Berlin Heidelberg New York (in press) 19.2. Article by DOI (with page numbers) Slifka MK, Whitton JL (2000) Clinical implications of dysregulated cytokine production. J Mol Med 78:74–80. DOI 10.1007/s001090000086 19.3. Article by DOI (before issue publication with page numbers) Slifka MK, Whitton JL (2000) Clinical implications of dysregulated cytokine production. J Mol Med (in press). DOI 10.1007/s001090000086 19.4. Article in electronic journal by DOI (no paginated version)


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Slifka MK, Whitton JL (2000) Clinical implications of dysregulated cytokine production. Dig J Mol Med. DOI 10.1007/s801090000086 20. Internet publication/Online document Doe J (1999) Title of subordinate document. In: The dictionary of substances and their effects. Royal Society of Chemistry.Available via DIALOG. http://www.rsc.org/dose/title of subordinate document. Cited 15 Jan 1999 20.1. Online database Healthwise Knowledgebase (1998) US Pharmacopeia, Rockville. http://www.healthwise.org. Cited 21 Sept 1998 Supplementary material/private homepage Doe J (2000) Title of supplementary material. http://www.privatehomepage.com. Cited 22 Feb 2000 University site Doe J (1999) Title of preprint. http://www.uni-heidelberg.de/mydata.html. Cited 25 Dec 1999 FTP site Doe J (1999) Trivial HTTP, RFC2169. ftp://ftp.isi.edu/in-notes/rfc2169.txt. Cited 12 Nov 1999 Organization site ISSN International Centre (1999) Global ISSN database. http://www.issn.org. Cited 20 Feb 2000 Figures

All photographs, graphs and diagrams should be referred to as a 'Figure' and they should be numbered consecutively (1, 2, etc.). Multi−part figures ought to be labeled with lower case letters (a, b, etc.). Please insert keys and scale bars directly in the figures. Relatively small text and great variation in text sizes within figures should be avoided as figures are often reduced in size. Figures may be sized to fit approximately within the column(s) of the journal. Provide a detailed legend (without abbreviations) to each figure, refer to the figure in the text and note its approximate location in the margin. Please place the legends in the manuscript after the references.

Tables

Each table should be numbered consecutively (1, 2, etc.). In tables, footnotes are preferable to long explanatory material in either the heading or body of the table. Such explanatory footnotes, identified by superscript letters, should be placed immediately below the table. Please provide a caption (without abbreviations) to each table, refer to the table in the text and note its approximate location in the margin. Finally, please place the tables after the figure legends in the manuscript.

Proofs Proofs will be sent to the corresponding author by e−mail (if no e−mail address is available or appears to be out of order, proofs will be sent by regular mail). Your response, with or without corrections, should be sent within 72 hours. Please do not make any changes to the PDF file. Minor corrections (+/− 10) should be sent as an e−mail attachment to:

ftp://ftp.isi.edu/in-notes/rfc2169.txt.%20Cited%2012%20Nov%201999

ftp://ftp.isi.edu/in-notes/rfc2169.txt.%20Cited%2012%20Nov%201999


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[email protected]

Always quote the four−letter journal code and article number and the DO No. from your proof in the subject field of your e−mail. Extensive corrections must be clearly marked on a printout of the PDF file and should be sent by first−class mail (airmail overseas). Offprints 50 offprints of each article will be provided free of charge. Additional offprints (both hard copies and PDF files) can be ordered by means of an offprint order form supplied with the proofs. Page Charges and Colour Figures No page charges are levied on authors or their institutions except for colour pages. Up to two (2) colour pages (irrespective of the number of individual figures on them) will be published free of charge if the Editor and Referees consider this essential. Additional colour pages will be charged accordingly. Copyright Authors will be asked, upon acceptance of an article, to transfer copyright of the article to the Publisher. This will ensure the widest possible dissemination of information under copyright laws. Permissions It is the responsibility of the author to obtain written permission for a quotation from unpublished material, or for all quotations in excess of 250 words in one extract or 500 words in total from any work still in copyright, and for the reprinting of figures, tables or poems from unpublished or copyrighted material. Springer Open Choice In addition to the normal publication process (whereby an article is submitted to the journal and access to that article is granted to customers who have purchased a subscription), Springer now provides an alternative publishing option: Springer Open Choice. A Springer Open Choice article receives all the benefits of a regular subscription−based article, but in addition is made available publicly through Springers online platform SpringerLink. To publish via Springer Open Choice, upon acceptance please click on the link below to complete the relevant order form and provide the required payment information. Payment must be received in full before publication or articles will publish as regular subscription−model articles. We regret that Springer Open Choice cannot be ordered for published articles. www.springer.com/openchoice Additional Information Additional information can be obtained from: Genetica Springer Van Godewijckstraat 30 P.O. Box 17 3300 AA Dordrecht The Netherlands

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http://www.springer.com/


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7.2. Anexo II

Fotografias de espécimes machos do gênero Coprophanaeus analisadas citogeneticamente neste trabalho. a) Coprophanaeus (Megaphanaeus) ensifer e b) Coprophanaeus (Coprophanaeus) cyanescens. Barra = 0,5

análise cromossômica comparativa de duas … do tipo xy e xyp, respectivamente. a análise da...

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