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MARTHA EUGENIA URÁN JIMÉNEZ
Paracoccidioides lutzii: estudo de alguns mecanismos de patogenicidade
Tese apresentada à Faculdade de
Medicina da Universidade de São
Paulo para obtenção do título de
Doutor em Ciências
Programa de: Dermatologia
Orientador: Prof. Dr. Carlos Pelleschi
Taborda
(Versão corrigida. Resolução CoPGr 6018/11, de 1 de novembro de 2011. A
versão original está disponível na Biblioteca da FMUSP)
SÃO PAULO
2015
MARTHA EUGENIA URÁN JIMÉNEZ
Paracoccidioides lutzii: estudo de alguns mecanismos de patogenicidade
Tese apresentada à Faculdade de
Medicina da Universidade de São
Paulo para obtenção do título de
Doutor em Ciências
Programa de: Dermatologia
Orientador: Prof. Dr. Carlos Pelleschi
Taborda
(Versão corrigida. Resolução CoPGr 6018/11, de 1 de novembro de 2011. A
versão original está disponível na Biblioteca da FMUSP)
SÃO PAULO
2015
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Preparada pela Biblioteca da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
reprodução autorizada pelo autor
Urán Jiménez, Martha Eugenia
Paracoccidioides lutzii : estudo de alguns mecanismos de patogenicidade /
Martha Eugenia Urán Jiménez. -- São Paulo, 2015.
Tese (doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Programa de Dermatologia.
Orientador: Carlos Pelleschi Taborda.
Descritores: 1.Micologia 2.Paracoccidioides/imunologia
3.Paracoccidioidomicose 4.Conídios 5.Camundongos Knockout 6.Micélio
7.Leveduras
USP/FM/DBD-108/15
Gracias a Dios y “…Gracias a la vida que me ha dado tanto…”,
Violeta del Carmen Parra Sandoval (1966).
A la memoria de mi papá, por ser una persona amplia de pensamientos
que me animó a experimentar cosas nuevas en la vida.
A mi mamá por enseñarme los caminos más correctos de la vida,
a mi hermanita por ser mi confidente y complice, a Susana y Samuel por qué la
vida es más sencilla si se mira con ojos de niño y a toda mi familia y mis
amigos por creer en mí, más de lo que muchas veces creo en mi misma.
Agradecimentos
Acho que aqui vai ser em “Martunhol”. Olha vai ser tarefa difícil escrever
obrigada para cada um com os nomes, mais como fala em português “vai que
vai”.
Ao Professor Dr. Carlos Pelleschi Taborda, que mais do que professor é
um amigo. Que aceitou uma ideia louca de trabalhar de novo com conídios no
Brasil. E agora todos sabemos, até você professora Vera, porque não dá certo
cultivar os conídios sem as condições adequadas.
Profe Carlos! Obrigada por ter me proporcionado um grande crescimento
profissional em todos os níveis.
A você, Professora Dra. Vera Calich, agradeço de coração a
oportunidade de trabalhar no seu laboratório. Obrigada pelos ensinamentos.
Aos Professores (as), Gilda del Negro, Gil Benard, Nilton Lincopan,
Eduardo Bagagli, Sandro Rogério de Almeida, Kelly Ishida, e à Dra Shikanai
obrigada pela acessoria e pelo apoio em vários aspectos deste trabalho.
E a todos os professores da Faculdade de Medicina e os do
Departamento de Microbiologia e imunologia do ICB. Muito obrigada pelos
ensinamentos.
E obrigada aos professores da banca: Adriana Pardini Vicentini Moreira,
Elaine Guadelupe Rodrigues, Gilda Maria Barbaro Del Negro e Dr. Gil Benard.
Por terem aceitado o convite.
Gracias a los amigos en especial a Julito y Ori por haberme recebido en
esta ciudad y brindarme no solo hospedaje sino tambiém su amistad, a Isa y
Cami que aunque “lejos” en esta gran ciudad son una parte de mis raíces y da
estabilidad e a o meu “marido por conveniencia” Buffoni, obrigada pela
paciência.
As minhas amigas “professoras de português” Márcia Pinto da Silva e
Renata Amélia Bueno, pelas experiências e conhecimentos. Pelas sugestões e
pela disposição para me ensinar. Muito obrigada!
A Luquete porque nos entendemos muito bem, pelas boas e produtivas
discussões científicas, pelos experimentos loucos e bizarros a meia noite e
pelas novas e boas brejas, com a parceria da Cris.
A todos os colegas e amigos (as) do laboratório FDP (Fungos Dimorficos
Patogênicos) Glauce Rittner, Fernanda Dias, Adriana Menezes, Luciana
Thomaz, Felipe Augusto, Diego Rossi, Thor A. Sessa, Marcelo Valdemir, Elúzia
Peres, Mariana Doprado, Aline Santana, e Shila (agora eu não sei o que somos
irmãs, amigas ou confidentes. Gracias corazón pela sua companhia e ouvidos).
A Cleison vou deixar no meio. Igual! Ele não se decide se é japonês,
“preto” ou brasileiro... kkkk (mesmo que ele apareça no livro da imigração
japonesa no Brasil).
E também para todos os meus amigos do laboratório da faculdade de
medicina, Donha Antonia, Marcia, Gloria, Aline, Dulce, Leticia, Edna,
Claudinha, Celia, Sonia, Monica, Roseli, Vivi, Renata, Aliete, Maurinho!!!,
Antonio, Fabio, João, Danilo e Rafael, as meninas novas, também muito
obrigada a todos!
Aos meus amigos (as) de aqui e de lá,,, Denise, Pricila, Maita, Tatiani,
Felipe, Alexy, pelo convívio e bons dias. E os colegas Tatiana, Rodrigo, Inarei,
Ed, Victor, Tania, Silvia, Claudia e Elizeu. Obrigada pelo apoio.
A Andrea Glatt do citômetro pelos ensinamentos que foram muitos e
pela boa disposição para ensinar. A Paulo da patologia, muito obrigada
também.
Aos técnicos dos biotérios tanto da medicina como do ICB. A Andrea
Calvento pelo apoio incondicional nos primeiros experimentos no IMT. A
Millitão e Adilamar do biotério central da Med. A Silvia e a Marcio do biotério de
imuno e a Carlos Augusto da Silva de nosso laboratório. Obrigada a todos pelo
apoio e cuidado dos animais durante todos esses anos.
As secretárias da Pós-Graduação do Departamento de Dermatologia.
Em memória da senhora Eli Maria. E obrigada Marcia Pia, pela paciência, e a
todas as secretarias da Fac de Med e do ICB.
A Valeria da Biblioteca obrigada pela ajuda, agilidade, eficácia e
gentileza no atendimento, especialmente nestes últimos dias de stress.
E finalmente, porém não menos importante, a todas as pessoas que
estão sempre com a gente e que muitas vezes nem percebemos. Eles que com
seu trabalho permitem que o nosso possa ser feito. Aos funcionários da sala de
esterilização e a Zé pela colaboração e apoio técnico. Aos porteiros e
seguranças que a meia noite cuidavam de mim e pediam os taxis. A João e
López (eletricistas), as meninas da limpeza e todos aqueles que contribuíram
direta e indiretamente para a realização deste trabalho.
Agradecimentos às instituições responsáveis pelo apoio financeiro.
Programa PEC-PG, administrado conjuntamente pelo Departamento
Cultural (CD) do Ministério das Relações Exteriores – MRE, pela Coordenação
de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES e pelo Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq, no acordo de
Cooperação Educacional, Cultural ou de Ciência e Tecnologia com a Colombia
(processo 6005101) pela bolsa como aluna de doutorado no Brasil. Duração de
48 meses.
Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP
2011/17267-4 - Projeto de Pesquisa - Regular Linha de Fomento Programas
Regulares / Auxílios a Pesquisa / Projeto de Pesquisa / Projeto de Pesquisa -
Regular - Fluxo Contínuo. Área de Alocação de Recursos Saúde. Duração de
24 meses. Pelo financiamento do projeto original.
Programa ENLAZA MUNDOS da “Alcaldía de Medellín” na convocatoria
2010/2. Pela bolsa de apoio como estudante no exterior 2011 - 2012.
Unidad de Micología Médica y Experimental de la Corporación para
Investigaciones Biológicas (CIB), Medellín – Colombia, por ser o meu avalista
ante as instituicoes internacionais.
Y como diría mi papá:
“tenemos más cosas por agradecer que por pedir”
Normalização adotada
Esta tese está de acordo com as seguintes normas vigentes no
momento desta publicação:
Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals
Editors (Vancouver)
Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias.
Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Elaborado por Anneliese
Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F. Crestana, Marinalva
de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valeria Vilhena. 3ª ed. São Paulo:
Serviço de Biblioteca e Documentação; 2011.
Abreviatura dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals
Indexed in Index Medicus.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO GERAL ................................................................................ 1
1.1. Paracoccidioidomicose (PCM) .............................................................. 1
1.2. Gênero Paracoccidioides ...................................................................... 2
1.3. Ecologia e Bolor .................................................................................... 3
1.4. Resposta Imune na PCM ...................................................................... 5
1.4.1. Resposta imune inata ..................................................................... 5
1.4.2. Resposta imune adaptativa ............................................................ 7
1.5. Tratamento ............................................................................................ 9
1.6. Glicoproteína de 43 kDa (gp43) ............................................................ 9
1.7. Peptídeo P10 e uso como imunomodulador ....................................... 10
1.8. Modelos experimentais da PCM ......................................................... 12
2. JUSTIFICATIVA ......................................................................................... 14
3. OJETIVOS ................................................................................................. 16
3.1. Objetivo Geral ..................................................................................... 16
3.2. Objetivos Específicos .......................................................................... 16
4. MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................... 18
4.1. Condições Gerais da Experimentação Animal e Regulamentos de
segurança. .................................................................................................... 18
4.1.1. Animais ............................................................................................ 18
4.1.2. Microrganismo, regulamentos de segurança, condições de cultivo e
manutenção. ................................................................................................. 19
4.2. Ensaios in vitro: Culturas e purificação dos conídios e ensaios in vitro
sobre a transformação e o crescimento de Paracocccidioides spp .............. 20
4.2.1. Produção de conídios ................................................................... 20
4.2.2. Coleta e purificação de conídios ................................................... 21
4.2.3. Purificação dos conídios pelo método de lã de vidro .................... 22
4.2.5. Efeito do peptídeo P10 sobre a transformação de conídios para
levedura e número de UFC de leveduras de Pb60855 e Pb01 .................. 23
4.3. Ensaios ex vivo: fagocitose, atividade fungicida, expressão de
moléculas de superfície e produção de citocinas em macrófagos selvagens
(WT) ou nocautes (KO) infectados com conídios e leveduras de
Paracocccidioides spp. ................................................................................. 24
4.3.1. Coleta e viabilidade dos propágulos ............................................. 24
4.3.2. Preparação dos propágulos marcados com FITC ........................ 24
4.3.3. Lavado peritoneal (LP) e contagem de células ............................. 25
4.3.4. Análise da fagocitose por citometria de fluxo ............................... 26
4.3.5. Marcação dos macrófagos para expressão de moléculas por
citometria de fluxo e produção de citocinas no sobrenadante das culturas
de macrófagos. .......................................................................................... 26
4.3.6. Determinação de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) de co-
culturas com macrófagos ........................................................................... 27
4.4. Ensaios in vivo, desenvolvimento de um modelo experimental em
camundongo com Paracoccidioides lutzii – isolado Pb01. ............................ 28
4.4.1. Inóculo para infecção no modelo experimental ............................ 28
4.4.2. Infecção intratraqueal (i.t.) ............................................................ 28
4.4.3. Infecção intranasal com propágulos. ............................................ 29
4.4.4. Sacrifício e coleta de material biológico ........................................ 29
4.4.5. Soro e lavado broncoalveolar (LBA) ............................................. 29
4.4.6. UFC e citocinas de macerado de pulmão de camundongos
infectados .................................................................................................. 30
4.4.7. ELISA para quantificação de citocinas em sobrenadantes dos
macerados de pulmão, LBA e sobrenadante de co-cultura de macrófagos...
...................................................................................................... 31
4.4.8. Análise histológica ........................................................................ 31
4.5. Análise estatística .................................................................................. 31
5. RESULTADOS .......................................................................................... 33
5.1. Ensaios in vitro: Culturas e purificação dos conídios e ensaios in vitro
sobre a transformação e o crescimento de Paracocccidioides spp .............. 33
5.1.1. Culturas e purificação dos propágulos. ......................................... 33
5.1.2. Ensaios in vitro sobre a transformação e o crescimento de
Paracocccidioides spp ............................................................................... 36
5.2. Ensaios ex vivo: fagocitose, atividade fungicida, expressão de
moléculas de superfície e produção de citocinas em macrófagos selvagens
(WT) ou nocautes (KO) infectados com conídios e leveduras de
Paracocccidioides spp. ................................................................................. 40
5.2.1. Ensaios de Fagocitose ................................................................. 40
5.2.2. Atividade fungicida dos macrófagos de animais da linhagem
C57Bl/6, selvagens (WT) ou nocautes (KO), sobre as leveduras de P.
brasiliensis (Pb18) e P. lutzii (Pb01). ......................................................... 44
5.2.3. Expressão de moléculas de superfície de macrófagos peritoneais
selvagens (WT) e nocautes (KO) em cultura celular. ................................ 50
5.2.4. Produção de citocinas no sobrenadante de culturas de macrófagos
peritoneais selvagens (WT) e nocautes (KO), ativados ou não com IFN- e
infectados ou não com leveduras de Pb18 e Pb01 e conídios de Pb18. ... 56
5.3. Ensaios in vivo, desenvolvimento de um modelo experimental em
camundongo com Paracoccidioides lutzii – isolado Pb01. ............................ 66
5.3.1. Determinação do número total de unidades formadoras de colônia
(UFC) no macerado de pulmão. ................................................................ 66
5.3.2. Determinação de citocinas em lavado broncoalveolar (LBA) e no
macerado de pulmão. ................................................................................ 67
5.3.3. Análise histopatológica ................................................................. 73
6. DISCUSSÃO .............................................................................................. 77
6.1. Culturas e purificação dos propágulos. ............................................... 77
6.2. Efeito do P10 in vitro, sobre a transformação e o crecimento de
Paracocccidioides spp. ................................................................................. 78
6.3. Ensaios de fagocitose de propágulos de Paracoccidiodes spp. .......... 78
6.4. Atividade fungicida dos macrófagos de animais C57Bl/6 selvagens
(WT) ou nocautes (KO) sobre propágulos de Paracoccidioides. .................. 79
6.5. Expressão de moléculas de superfície de macrófagos WT e KO, em
cultura celular. ............................................................................................... 80
6.6. Produção de citocinas no sobrenadante de culturas de MO ............... 81
6.7. Modelo Experimental em Paracoccidioides lutzii ................................ 83
7. CONCLUSÕES .......................................................................................... 85
8. ANEXOS .................................................................................................... 87
9. REFERÊNCIAS ......................................................................................... 95
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Bolor de isolados de Paracoccidioides spp. Isolados Pb18, Pb01 e Pb60855 crescidos em meio sintético McVeigth-Morton Modificado (A), e em ágar água para produção de conídios de Pb01 (B); Pb18 (C) e Pb60855 (D). ..........................................................................................................................34 Figura 2. Precipitação mensal, dados da média climatológica mensal (mm) de janeiro de 2012 até janeiro de 2014. ...............................................................35 Figura 3. Compêndio de dados meteorológicos, janeiro de 2012 até janeiro de 2015. ................................................................................................................35 Figura 4. Transformação de conídio para levedura in vitro. ............................37 Figura 5. Unidades formadoras de colônia (UFC) após a transformação de conídios para leveduras de dois isolados de Paracoccidioides spp. ...............38 Figura 6-A. Efeito do peptídeo P10 sobre a transformação de conídios em leveduras. .........................................................................................................39 Figura 6-B. Efeito do peptídeo P10 sobre a transformação de conídios em leveduras. .........................................................................................................39 Figura 7. Fagocitose de conídios de P.brasiliensis, isolado Pb18, por macrófagos da linhagem C57BL/6 selvagens e nocautes. ..............................41 Figura 8. Fagocitose de conídios e leveduras de P.brasiliensis (isolado Pb18) por macrófagos da linhagem C57Bl/6 selvagens e nocautes para TLR-2, TLR-4, dectina-1, MyD88 ou Nalp3. .............................................................................42 Figura 9. Fagocitose de leveduras de P.brasiliensis (isolados Pb18) e P. lutzii (isolado Pb01) por macrófagos da linhagem C57BL6 selvagens e nocautes para TLR-2, TLR-4, dectina-1, MyD88 ou Nalp3. .............................................43 Figura 10. Análise de leveduras de P. brasiliensis (Pb18) e P. lutzii (Pb01) aderidas ou fagocitadas por macrófagos peritoneais selvagens ou nocautes para TLR-2, TLR-4, dectina-1, MyD88 e Nalp3. ...............................................44 Figura 11. Unidades formadoras de colônias (UFCs) recuperadas de macrófagos peritoneais de camundongos da linhagem C57Bl/6 selvagens (WT), infectados com leveduras de P. brasiliensis (Pb18) e P. lutzii (Pb01). ...45 Figura 12. Unidades formadoras de colônias (UFCs) recuperadas de macrófagos peritoneais de camundongos C57Bl/6, selvagens ou nocautes para TLR-2, infectados com leveduras de P. brasiliensis (Pb18) e P. lutzii (Pb01). ..........................................................................................................................46
Figura 13. Unidades formadoras de colônias (UFC) recuperadas de macrófagos peritoneais de camundongos C57Bl/6, selvagens ou nocautes para TLR-4, infectados com leveduras de P. brasiliensis (Pb18) e P. lutzii (Pb01)...............................................................................................................47 Figura 14. Unidades formadoras de colônias (UFCs) recuperadas de macrófagos peritoneais de camundongos C57Bl/6, selvagens ou nocautes para dectina-1, infectados com leveduras de P. brasiliensis (Pb18) e P. lutzii (Pb01). ..........................................................................................................................48 Figura 15. Unidades formadoras de colônias (UFC) recuperadas de macrófagos peritoneais de camundongos C57Bl/6, selvagens ou nocautes para NALP3, infectados com leveduras de P. brasiliensis (Pb18) e P. lutzii (Pb01). .........................................................................................................................49 Figura 16. Unidades formadoras de colônias (UFCs) recuperadas de macrófagos peritoneais de camundongos C57Bl/6, selvagens ou nocautes para MyD88, infectados com leveduras de P. brasiliensis (Pb18) e P. lutzii (Pb01). .........................................................................................................................50 Figura 17. Expressão de dectina-1 e receptor de manose em macrófagos peritoneais (F4/80+/CD11b+) de camundongos C57Bl/6 selvagens (WT) ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras de Pb18 e Pb01 ou conídios de Pb18. ...........................................................................................51 Figura 18. Expressão de TLR-2 e TLR-4 em macrófagos peritoneais (F4/80+/CD11b+) de camundongos C57Bl/6 selvagens (WT), ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras Pb18 e Pb01ou conídios de Pb18. .........................................................................................................................52 Figura 19. Expresão de TLR-2 (A), TLR-4 (B) e Dectina-1 (C) em macrófagos peritoneais (F4/80+/CD11b+) de camundongos C57Bl/6 selvagens (WT), ativados ou não com IFN-, incubados com leveduras de Pb18 e Pb01. .........................................................................................................................53 Figura 20. Expressão de MHC de classe II em macrófagos peritoneais (F4/80+/CD11b+) de camundongos C57Bl/6 selvagens (WT)(F4/80+/CD11b+), ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras (Pb18 e Pb01) ou conídios de Pb18...............................................................................................54 Figura 21. Expressão de CD80 e CD86 em macrófagos peritoneais (F4/80+/CD11b+) de camundongos C57Bl/6 selvagens (WT), ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras de Pb18 e Pb01 ou conídios de Pb18. .........................................................................................................................54 Figura 22. Porcentagem de células (A) e intensidade média da fluorescência (FMI) (B) de MHC de classe II em macrófagos peritoneais (F4/80+/CD11b+) de
camundongos C57Bl/6 selvagens (WT) e nocautes (KO), ativadas ou não com IFN- e infectados com as duas espécies de Paracoccidioides spp. ...............55 Figura 23. Porcentagem de células que expressam CD80 e/ou CD86 em macrófagos peritoneais (F4/80+/CD11b+) de camundongos C57Bl/6 selvagens (WT) e nocautes (KO), ativados ou não com IFN-, e infectados com duas espécies de Paracoccidioides spp....................................................................56 Figura 24 A. Produção de IFN- sobrenadante de cultura de MOs WT ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras (Pb18 e Pb01) ou conídios (Pb18). ............................................................................................................58 Figura 24 B. Produção de IFN- no sobrenadante de cultura de MOs Dectina-KO ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras (Pb18 e Pb01) ou conídios (Pb18). ..............................................................................................58 Figura 25. Produção de GM-CSF no sobrenadante de cultura de MOs WT ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras (Pb18 e Pb01) ou conídios (Pb18). ..............................................................................................59
Figura 26 A. Produção de IL-6no sobrenadante de cultura de MOs WT ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras (Pb18 e Pb01) ou conídios (Pb18). ..............................................................................................60 Figura 26 B. Produção de IL-6 no sobrenadante de cultura de MOs Dectina-1-KO ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras (Pb18 e Pb01) ou conídios (Pb18). ..............................................................................................60 Figura 27 A. Produção de TNF-α no sobrenadante de cultura de MOs WT ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras (Pb18 e Pb01) ou conídios (Pb18). ..............................................................................................61 Figura 27 B. Produção de TNF-α no sobrenadante de cultura de MOs nocautes para TLR-4 ou Dectina-1, ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras (Pb18 e Pb01) ou conídios (Pb18). ................................................62 Figura 28. Produção de IL-1 no sobrenadante de cultura de MOs WT ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras (Pb18 e Pb01) ou conídios (Pb18). ............................................................................................................63 Figura 29. Produção de IL-10 no sobrenadante de cultura de MOs WT ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras (Pb18 e Pb01) ou conídios (Pb18). ............................................................................................................63 Figura 30 A. Produção de IL-12p70 no sobrenadante de cultura de MOs WT ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras (Pb18 e Pb01) ou conídios (Pb18)................................................................................................64
Figura 30 B. Produção de IL12p70 no sobrenadante de cultura de MOs TLR-2 e Dectina-1-KO ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras (Pb18 e Pb01) ou conídios (Pb18)..................................................................................65 Figura 31. Produção de MIP-2 no sobrenadante de cultura de macrófagos WT ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras (Pb18 e Pb01)..........65 Figura 32. Produção de IL-12p40 no sobrenadante de cultura de MOs WT ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras (Pb18 e Pb01).................................................................................................................66 Figura 33. Determinação do número total de Unidades Formadoras de Colônias no macerado de pulmão de camundongos C57BL6 infectados intratraquealmente com 1x106 leveduras viáveis de P. lutzii isolado Pb01......67 Figura 34. Produção de citocinas de perfil pró-inflamatoria em LBA e macerado de pulmão de camundongos C57BL6 infectados com 1x106 leveduras viáveis de P. lutzii isolado Pb01, no período agudo (0hs até 1sem pós-infecção). A. mostra o perfil de citocinas no LBA e B. mostra o perfil em macerado de pulmão. ............................................................................................................68 Figura 35. Níveis de citocinas no macerado de pulmão de camundongos C57BL6 infectados com 1x106 leveduras viáveis de P. lutzii isolado Pb01. Valores de P<0.001 (***), P<0.01 (**) e P < 0.05 (*)........................................70 Figura 36. Esquema representativo do perfil de citocinas no macerado de pulmão de camundongos C57BL6 infectados com 1x106 leveduras viáveis de P. lutzii isolado Pb01, avaliados de 0h até 12 semanas pós-infecção.............71 Figura 37. Níveis de citocinas de GM-CSF e MCP-1 no lavado broncoalveolar (LBA) de camundongos C57BL6 infectados com 1x106 leveduras viáveis de P. lutzii isolado Pb01. Valores de P<0.001 (xxx), P<0.01 (xx) e P < 0.05 (x)......72 Figura 38: Corte histológico, corado por HE ou Grocott, de pulmão de camundongos C57Bl/6 infectados com 1x106 leveduras de Pb01 pela via intratraqueal. .....................................................................................................74 Figura 39. Cortes histológicos de pulmão de Camundongos C57Bl/6 foram infectados por via intranasal com 1x106 conídios de P. lutzii – Pb01 e sacrificados após 12 semanas de infecção. .....................................................75 Figura 40. Cortes histológicos de pulmão de Camundongos C57Bl/6 foram infectados por via intranasal com 1x106 conídios de P. lutzii – Pb01 e sacrificados após 12 semanas de infecção. Cada corte histológico de pulmão representa um camundongo (n=5) - linhas 1 e 2. Na linha 3, os cortes histológicos de pulmão de camundongos C57Bl/6 utilizados como controles e inoculados, também por via intranasal, com 60 ul de cloreto de sódio. Lâminas foram coradas por HE........................................................................................76
LISTA DE ANEXOS E TABELAS
Anexo 1. Folhas Comitês de Ética.................................................................87
Anexo 2. Meios de Cultura usados para o crescimento dos fungos..........89
Anexo 3. Relação de Fluorocromos e anticorpos utilizados para
Citometria de fluxo .........................................................................................92
Anexo 4. Relação dos kits de ELISA utilizados para determinação de
citocinas e quimiocinas de camundongo .....................................................94
Tabela 1. Estoque de vitaminas. ......................................................................90
Tabela 2. Estoque de traços de elementos. .....................................................90
Tabela 3. Preparação do MMcM.......................................................................91
Tabela 4. Relação de Fluorocromos e anticorpos utilizados para Citometria de
fluxo...................................................................................................................92
Tabela 5. Relação dos kits de ELISA utilizados para determinação de citocinas
e quimocinas de camundongo. .........................................................................94
Tabela 6. Resumo Geral sobre a produção de citocinas no sobrenadante de
culturas de MO quando infectados com conídios ou leveduras de
Paracoccidioides spp.........................................................................................82
LISTA DE ABREVIATURAS
A/Sn: linhagens de camundongos resistentes à infecção com P. brasiliensis
Ac(s): Anticorpo(s)
Ag(s): antígeno(s)
APC: Célula apresentadora de antígeno
B10.A: linhagens de camundongos suscetíveis à infecção com P. brasiliensis
LBA: líquido da lavagem broncoalveolar
BALB/c: linhagens de camundongos albinos medianamente suscetíveis à
infecção com P. brasiliensis
C57BL/6: linhagens de camundongos medianamente suscetíveis à infecção
com P. brasiliensis
BHI: infusão de cérebro e coração
CD11b: Marcador de expressão celular para monócitos e células mielóides ou
Mac-1
CD80 / CD86: “Cluster of Differentiation 80 or 86” ou Molécula coestimuladora
presente em MO, CD, linfócito B, liga-se ao CD28 e CTLA4
D.O.: Densidade óptica
CD: Célula dendrítica
Dectina-1: Receptor de beta-glucanas
DHN: 1,8-dihydroxy-naphthaleno
ELISA: “Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay”
FACS: “Fluorescence-Activated-Cell-Sorting”
FITC: Isotiocinato de fluoresceína
FSC: “Forward-scattered light”
GM-CSF: “Granulocyte-Macrophage-Colony-Stimulating-Factor”, ou factor
estimulador de colônias de granulócitos y macrófagos
gp43: glicoproteína de 43 kDa exocelular de P. brasiliensis
H2O2: peróxido de hidrogênio
i.n.: intranasal
i.p.: intraperitoneal
i.t.: intratraqueal
in vitro: expressão latina que designa todos os processos biológicos que têm
lugar fora dos sistemas vivos, no ambiente controlado e fechado de um
laboratório.
ex vivo: refere-se a experiências ou medições sobre tecido biológico ou um
organismo num meio artificial fora do corpo.
in vivo: refere-se à experimentação feita dentro de um organismo vivo.
IFN-γ: Interferon gama
IgG: imunoglobulina G
IgM: imunoglobulina M
IL-10: Interleucina 10
IL-12: Interleucina 12
IL-6: Interleucina 6
IL-1b: Interleucina 1 beta
IL-23: Interleucina 23
IMA: imunidade mediada por anticorpos
iNOS, NOS2: óxido nítrico sintasa inducible o II
KO: “knockout” ou deficient, nocaute
L- Epinephrine: Epinephrina, (R)-(−)-3,4-Dihydroxy-α-(methylaminomethyl)
benzyl alcohol, L-Adrenalina
L-DOPA: 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanina
LPS: lipopolisacáride de bactéria GRAM negativa
MMcM: Meio de cultura “Modiffied McVeigh-Morton”
MCP-1: “Monocyte-Chemotactic-Protein-1”, ou quimiocina (C-C) ligante 2
MHC-II: Complexo principal de histocompatibilidade classe II
MIP-2: Proteína inflamatoria del macrófago 2
MIP2-alpha: “Macrophage-Inflammatory-Protein-2-alpha”, ou quimiocina (C-X-
C) ligante 2, proteína beta reguladora do crescimento (Gro-beta)
MØ(s): Macrófago (s)
MR: Receptor de manose
MyD88: Myeloid differentiation primary response gene 88 ou Proteína
adaptadora
NF-κB: “nuclear factor kappa-light-chain-enhancer” ou fator nuclear Kb
NO: óxido nítrico
D.O.: densidade óptica
O2-: singlete de oxigênio
OH: radical hidroxila
ONOO-: peroxinitrito
P. brasiliensis: Paracoccidioides brasiliensis
P. lutzii: Paracoccidioides lutzii
PAMP(s): “Pathogen-Associated-Molecular-Patters”, padrões de
reconhecimento de patógenos.
PBS: solução salina fosfatada
PC: células peritoneais
PCM: paracoccidioidomicose
PE: “Phycoerythrin”
PerCP: “Peridinin chlorophyll protein”
PI: “Propidium iodide”
PKA: proteína quinase A
PMN: neutrófilo polimorfonuclear
PRR: “Pattern recognition receptor”, receptores de reconhecimento de padrões.
rIFN-γ: Interferon gama recombinante
RNAm: ácido ribonucleico mensageiro
RNI: Radicais intermediários do nitrogênio
ROI: Radicais intermediários do oxigênio
RPMI: meio de cultura RPMI 1640
SFB: Soro fetal bovino
SIDA: Síndrome de imunodeficiência adquirida
SMV: meio sintético ou quimicamente definido McVeigh-Morton
SSC: “Side-scattered light”
TGF-b:” Transforming growth factor beta” Fator de transformação do
crescimento.
Th1 / Th17 / Th2 / Th3: subtipos de linfócitos T auxiliares (CD4+)
TLR: “Toll-Like-Receptor” ou subtipo de receptores de padrões de
reconhecimento de patógenos
TNF-α: “Tumor necrosis factor alpha”, Fator de necrose tumoral, cachexina.
Treg: subtipos de linfócitos T auxiliares (CD4+) reguladores / supressores
UFC: Unidades formadoras de colônias
PFA: Paraformaldeido
pH: potencial hidrogeniônico
DODAB: Dioctadecyl-dimethylammonium bromide
i.t.: intratraqueal
P10: peptídeo P10 sintético de sequência derivada de gp43
DMSO: Dimetilsulfóxido
Ig: imunoglobulina
L-DOPA: L-3,4 dihidroxifenilalanina
ConA: concanavalina A
SDS-PAGE: “Sodium-Docecyl-Sulfate PolyAcrilamide-Gel”, eletroforese em gel
de poliacrilamida, contendo duodecil sulfato de sódio.
LISTA DE SÍMBOLOS
< menor
= igual a
> maior que
°C Graus Celcius
CO2 Dióxido de carbono
g “Relative centrifugue force-gravities”, gravidade.
h(s) hora(s)
H2O água
HCl ácido clorídrico
kDA Kilodalton
kg quilograma
M molar
mg miligramas
ml mililitro
μl microlitro
mM milimolar
p probabilidade estatística
pg picograma
RPM rotações por minuto
s segundo
U Unidades Internacionais
μg microgramas
min minutos
LISTA DE SIGLAS
ABNT - Associação Brasileira de Normas Técnicas
ASM - “American Society of Microbiology”
ATCC - “American Type Culture Collection”
BVS - Biblioteca Virtual em Saúde
CDC - Center for Disease Control
IAG/USP - Instituto de Astronomia, Geofisica e Ciencias Atmosféricas
IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
ISSO - International Standardization Organization
OMS - Organização Mundial da Saúde
OPAS - Organização Panamericana da Saúde
USP - Universidade de São Paulo
RESUMO
Urán Jiménez ME. Paracoccidioides lutzii: Estudo de alguns mecanismos de
patogenicidade [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São
Paulo; 2015.
A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença granulomatosa sistêmica,
causada por Paracoccidioides spp., (P. brasiliensis e P. lutzii).
Geograficamente limita-se à América Latina com áreas endêmicas estendendo-
se desde o México até a Argentina, constituindo uma das micoses sistêmicas
de maior incidência na região e afetando principalmente trabalhadores rurais. O
maior número de pacientes com PCM tem sido relatado principalmente no
Brasil, na Colômbia e na Venezuela. A incidência, frequência, prevalência e
número de casos reais desta micose encontra-se subestimada e pouco se
conhece em relação à nova espécie descrita – P. lutzii. A maioria dos estudos
em P. lutzii foram focados em genética, especiação e na geração de novos
antígenos para melhorar a especificidade e sensibilidade dos testes
sorológicos. As preparações antigênicas tradicionais são feitas a partir de
isolados de P. brasiliensis, as quais atualmente são deficientes para
reconhecer 100% dos casos da doença, devido aos soros de pacientes
infectados com P. lutzii não serem reativos com estes antígenos, diminuindo
assim a sensibilidade. Raros são os trabalhos focados na biologia de P. lutzii e
nos fatores de virulência que podem ser comparados com P. brasiliensis nos
modelos experimentais. A nossa proposta de estudo foi avaliar alguns aspectos
in vitro e in vivo relacionados com a patogenicidade e destacamos: a fagocitose
e a morte intracelular de P. lutzii por macrófagos peritoneais, de camundongos
nocautes (KO) e selvagens para PRRs (TLR2, TLR4 e Dectina) e para
ativadores intracelulares (MyD88 e NALP3). Paralelamente a este estudo,
animais foram infectados com leveduras de P. lutzii e comparados com os
modelos de infecção já estabelecidos com leveduras (Pb18) e conídios (ATCC-
Pb60855) de P. brasiliensis. Nossos dados indicam similaridade ao que ocorre
com P. brasiliensis, a fagocitose de P. lutzii depende de TLR2, TLR4 e Dectina-
1. Resultados semelhantes também foram observados na expressão de
moléculas envolvidas na co-estimulação e apresentação de antígenos (MHC II,
CD80 e CD86). Contudo, a morte intracelular de leveduras de P. lutzii é
claramente dependente de TLR4, e a produção de citocinas IL-6, MIP-2, IFN- e
IL-12p40 são importantes para o controle das leveduras pelos macrófagos. No
modelo experimental empregando-se P. lutzii, camundongos machos C57BL/6
(6-7 semanas) foram infectados intratraquealmente com 1x106 leveduras
viáveis do isolado de P. lutzii Pb01. Encontramos duas fases da doença, a
primeira de 0 hora até 2 a 4 semanas pós-infecção e a segunda de 4 até 12
semanas. As leveduras parecem ser contidas na primeira semana de infecção
e posteriormente não encontramos leveduras nos macerados de pulmão,
diferente do modelo de BALB/c infectado com conídios de ATCC-Pb60855 no
qual as UFC são recuperadas até a semana 16 pós-infecção. Com relação aos
níveis de citocinas, encontramos no lavado broncoalveolar e macerado de
pulmão um perfil misto Th1/Th2, porém marcado por citocinas pró-inflamatórias
no primeiro período e citocinas regulatórias tipo Th2 no segundo período (IL-
12p70, IL-23, IL-10), similar ao descrito nos modelos de P. brasiliensis
infectados tanto com conídios como com leveduras. No entanto, no primeiro
período da doença, em camundongos C57BL/6, parece levar a uma carga
inflamatória maior, que reflete nas citocinas e mantém seus níveis até o
período crônico: TNF-α, MIP-2 e GM-CSF, esta última regulada positivamente
tanto em experimentos in vitro como in vivo. Também observamos que a partir
das 48 horas pós-infecção encontramos níveis aumentados de IL-12p70 até o
período crônico, onde junto com a IL-23, parecem ser as responsáveis pela
diminuição da infecção no período tardio. Esta é a primeira vez que se
descreve um modelo experimental com P. lutzii (isolado Pb01) indicando um
perfil imunopatológico com pequenas diferenças que comparado ao P.
brasiliensis, porém de importância na patogenicidade da doença e auxiliando
na compreensão das diferentes formas da doença no modelo experimental.
Descritores: 1.Micologia 2.Paracoccidioides/imunologia
3.Paracoccidioidomicose 4.Conídios 5.Camundongos Knockout 6.Micélio
7.Leveduras
ABSTRACT
Urán Jiménez, ME. Paracoccidioides lutzii: study of some mechanisms of
pathogenicity [thesis]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de
São Paulo”; 2015.
Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease
caused by Paracoccidioides spp. (P. brasiliensis and P. lutzii), geographically, is
limited to Latin America with endemic areas from Mexico to Argentina, as one of
the systemic mycoses with the highest incidence in the region, mainly affecting
rural workers. The largest number of patients with PCM has been mainly
reported in Brazil, Colombia and Venezuela. The true incidence of this mycosis
is underestimated in Brazil and little is known about the new species described -
P. lutzii. Most studies in P. lutzii were focused on genetics, speciation and the
generation of new antigens to improve the specificity and sensitivity of
serological tests. Currently, traditional antigenic preparations, prepared with
isolates of P. brasiliensis, are inefficient. There are few studies focused on P.
lutzii biology and virulence factors that can be compared with P. brasiliensis in
experimental models. Our study aimed to evaluate some in vitro and in vivo
aspects related to pathogenicity: phagocytosis and intracellular killing of P. lutzii
by peritoneal macrophages from knockout (KO) for PRRs (TLR2, TLR4 and
Dectin) and intracellular activators (MyD88 and NALP3). In addition, animals
were infected with P. lutzii yeast and compared with the well-established
models of infection with yeast cells (Pb18) and conidia (ATCC Pb60855) from
P. brasiliensis. Our data indicate that similarly to what happens with the
phagocytosis of P. brasiliensis, P. lutzii phagocytosis is dependent on TLR2,
TLR4 and Dectin-1. Other molecules, involved in co-stimulation and
presentation of antigens such as MHC II, CD80 and CD86 were also shown to
participate in the P. lutzii-host interaction. However, intracellular killing of P.
lutzii yeast cells was clearly dependent on TLR4, and the production of
cytokines as IL-6, MIP-2, IFN- and IL-12p40 were important for the control of
the yeast by macrophages. In the experimental model of P. lutzii, male C57BL/6
mice (6-7 weeks) were infected intratracheally with 1x106 viable yeasts of the
isolate Pb01like. We found two phases of the disease, the first from the
inoculation to 2 or 4 weeks after infection and the second from 4 to 12 weeks.
Yeast appear to be contained within the first week of infection and subsequently
are also absent from macerated lung, differently from the model of BALB/c mice
infected with ATCC Pb60855 conidia in which CFUs were detected up to week
16 post-infection. We found a mixed Th1/Th2 pattern (IL-12p70, IL-23, IL-10) in
bronchoalveolar lavage and lung, with the predominance of proinflammatory
cytokines in the first phase and predominance of regulatory Th2 cytokines in the
second phase, reproducing findings of P. brasiliensis infection models produced
with both conidia and yeast. However, in the first period of the disease in
C57BL/6 mice there was a higher inflammatory burden, reflected by the high
cytokine levels (TNF-alpha, MIP-2 and GM-CSF), the latter in particular
because it was positively regulated both in vitro and vivo), that persisted
through the chronic period. We also observed that starting from 48 hours post-
infection to the chronic period there were increased levels of IL-12p70, which
together with IL-23 appeared to be responsible for the reduction of infection in
the late period. This is the first time that an experimental model with P. lutzii
(Pb01) is described, showing an immunological profile with only slight
differences compared to the P. brasiliensis model. The present study details
important aspects of the pathogenesis of the disease due to different species of
Paracoccidioides and helps to understand the different forms of presentation in
experimental models.
Descriptors: 1.Mycology 2.Paracoccidioides/immunology
3.Paracoccidioidomycosis 4.Conidia 5.Mice, Knockout 6.Mycelium 7.Yeats
Introdução Geral 1 Martha E. Urán J.
1. INTRODUÇÃO GERAL
1.1. Paracoccidioidomicose (PCM)
Paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença granulomatosa sistêmica,
causada pelas espécies do fungo termodimórfico Paracoccidioides spp., (P.
brasiliensis e P. lutzii). Geograficamente limita-se à América Latina com as
áreas endêmicas estendendo-se desde o México até a Argentina, constituindo
uma das micoses sistêmicas que mais predominam na região e afetando
principalmente trabalhadores rurais (1-3). O maior número de casos tem sido
relatado no Brasil, na Colômbia e na Venezuela (4, 5), e os dados da incidência
de PCM causada por P. lutzii ainda encontra-se subestimada tanto no Brasil
como nos outros paises (6).
A espécie mais pesquisada tem sido P. brasiliensis, a qual normalmente
atinge o hospedeiro humano via trato respiratório pela inalação de propágulos
presentes no ar, que alcançam o epitélio pulmonar alveolar e se transformam
em parasitas leveduriformes, gerando diferentes formas clínicas da
paracoccidioidomicose (7). Uma vez estabelecida, a doença pode desenvolver-
se em duas formas clínicas, dependendo da evolução e localização das lesões:
forma aguda (tipo juvenil), que afeta indivíduos dos dois sexos e progride
rapidamente, se disseminando através do sistema linfático; e a forma crônica
(tipo adulto) que afeta principalmente homens adultos nos quais o quadro
clínico mais comum é a fibrose pulmonar (1, 7, 8). A diferença entre as formas
clínicas da doença e a ocorrência da infecção assintomática estão associadas
com vários fatores como sexo, padrão genético, idade, situação imunológica,
assim como as características infecciosas do agente, principalmente a
virulência (7). O órgão afetado primariamente é o pulmão, observando-se
fibrose em 90% dos doentes na forma crônica e em 10% dos pacientes com a
PCM aguda/subaguda (9, 10). Entretanto, quando a micose não é
diagnosticada e tratada oportunamente, pode levar a formas disseminadas
graves e letais, com rápido e progressivo envolvimento dos pulmões,
Introdução Geral 2 Martha E. Urán J.
tegumento, gânglios, baço, fígado, suprarenais e órgãos linfóides do tubo
digestivo (11).
O desenvolvimento de sequelas pós-tratamento, em sua maioria sequelas
pulmorares, é um grande desafio terapêutico nesta micose. Foi demonstrado
que mais da metade dos pacientes da forma crônica apresentavam alterações
radiológicas pulmonares pós-tratamento (9, 12).
Dados epidemiológicos sugerem que a espécie P. lutzii, conhecida
também como “cluster Pb01-like”, é endêmica da região Centro-Oeste
brasileira, mais especificamente dos Estados de Mato Grosso e Goiás, e que o
epicentro da PCM por P. lutzii é a região centro-oeste do Brasil, com poucos
casos relatados e dispersos fora desta área. Como foi falado, a instalação da
doença ocorre pela inalação de conídios, portanto a ocupação desta área
geográfica é um fator de risco para a aquisição da PCM por P. lutzii,
confirmando esta relação à falta de casos em outras áreas. A incidência
diferenciada de espécies nesta área também tem relação com a capacidade de
crescimento do fungo na natureza, o tipo de exposição dos pacientes,
resistência ou suscetibilidade à infecção ou até mesmo os erros de diagnóstico
geral relativos ao tipo de antígenos ou à técnica usada.
Do mesmo modo, não fica claro a existência de uma correlação entre a
sensibilidade aos medicamentos e o quadro clínico da PCM causada por P.
lutzii, quando relatamos melhores respostas terapêuticas ao trimetoprim-
sulfametoxazol (13). E somente um caso atípico de PCM com fungemia fatal
causada por P. lutzii foi relatada na literatura até o presente (14).
1.2. Gênero Paracoccidioides
Paracoccidioides spp. é um fungo da ordem Onygenales filamentoso
hialino e termodimórfico. Atualmente é sabido que Paracoccidioides está
dividido filogeneticamente em duas espécies Paracoccidioides brasiliensis
(espécies críticas S1, PS2, PS3, PS4) e Paracoccidioides lutzii (espécie
filogeneticamente recém descoberta que inclui os isolados do grupo "Pb01-
like") (6, 15, 16).
Introdução Geral 3 Martha E. Urán J.
Na forma de bolor, encontra-se em temperaturas de 18 a 25ºC. As
colônias apresentam um crescimento lento, (aproximadamente 3 semanas) e
são constituídas por micélios aéreos finos, ramificados e providos de septos;
somente se observam clamidósporos laterais e intercalares em poucas
culturas, algumas vezes é possível notar a presença de estruturas reprodutoras
assexuais “conídios” (10, 17). Para conseguir culturas de bolor capazes de
produzir conídios é necessário usar meios pobres em nutrientes (ágar água ou
ágar dextrose-sais), e incubá-los por 2-3 meses a temperaturas entre 17° a 20º
C (18): nestas condições é possível obter artroconídios intercalares e laterais
(menores que 5 μm). Os conídios apresentam dimorfismo térmico e têm
capacidade de produzir tubos germinativos entre 24 e 96 horas, ao serem
incubados a temperaturas mais baixas (20-22º C); e assim mesmo, ao elevar a
temperatura a 36º C, podem se transformar em leveduras com múltiplos
brotamentos, depois de 120 -132 horas da incubação (com até 40 μm diâmetro)
(19).
Acredita-se que a infecção por Paracoccidioides spp acontece
principalmente pela inalação desses conídios, os quais com a prescença de
uma temperatura maior no hospedeiro (aumento da temperatura) recebem um
estímulo e se transformam em leveduras nos alvéolos pulmonares, tal como foi
comprovado experimentalmente em camundongos (20), e que essa mudança
na morfologia é considerada fundamental para o estabelecimento da infecção
(1, 21). Esta transformação no hospedeiro pode ser inibida ou dimimuída pela
presença dos estrógenos, explicando assim a diferença na incidência da
doença entre homens e mulheres (22-24).
1.3. Ecología e Bolor
Existem poucos dados a respeito da forma em que o fungo encontra-se
na natureza. Acredita-se que as formas de bolor e os conídios (forma infectante
- saprofítica) encontram-se na natureza, local onde o hospedeiro
provavelmente se infecta por inalação ou trauma (principalmente nos isolados
com genótipo PS2 e que posteriormente dentro dos tecidos do hospedeiro
Introdução Geral 4 Martha E. Urán J.
ocorre o dimorfismo térmico, levando a formação da forma patogênica (forma
parasítica), a levedura (25, 26).
As leveduras já foram observadas em muitos animais e tecidos, sem
encontrar uma reprodutividade nestes dados (26). Entretanto, existe uma alta
incidência de infecção de Paracoccidioides spp., em tatus (Dasypus
novemcinctus), uma espécie que habita o solo, típica da América do Sul;
indicando que além de transportar o fungo, o tatu pode desenvolver a doença
(26-28). De maneira importante, foi mostrado atualmente que Paracoccidioides
spp., foi isolado de amostras de aerosois obtidas perto da entrada das tocas
dos tatus e correlacionado com as culturas dos tecidos destes animais
(Dasypus novemcinctus). A sequência das regiões ITS destes isolados mostrou
similaridade com Paracoccidioides lutzii (29). O fungo já tinha sido isolado
anteriormente a partir de amostras do solo, sem relação epidemiológia de
importância (30, 31).
Fatores ecológicos também foram associados à presença de pacientes
com PCM na Colômbia, onde a correlação entre a idade do paciente e as
características dos locais de residência foram similares, tais como: posição
geografica entre 1000 a 1499 m acima do nível do mar, com uma alta taxa de
precipitação anual entre 2000 a 2999 mm; temperatura media anual entre 17 e
24ºC, abundantes fontes hídricas, e presença de plantações de café e tabaco
(32). Este tipo de correlação com culturas agrícolas de café já havia sido
descrito anteriormente por Silva-Vergara et al. (1998) no Estado de Minas
Gerais - Brasil (33).
Posteriormente, demostrado que não só as caraterísticas ecológicas dos
locais comuns aos pacientes com PCM são importantes, mas também a
qualidade do solo e as características ambientais. In vitro foi demostrada a
importância destas características para aumentar a capacidade de crescimento
e produção de conídios em areia e solo argiloso, contendo alto teor de água
(34). Estes dados laboratoriais foram confirmados com análises de variáveis
climáticas ambientais, onde as correlações foram baseadas nos casos novos
de PCM aguda (AF), na zona endêmica de Botucatu no Estado de São Paulo,
com as variáveis climáticas: precipitação, temperatura do ar, umidade relativa e
absoluta, armazenamento de água pelo solo, e anormalidades climáticas
Introdução Geral 5 Martha E. Urán J.
relativas ao fenômeno do “El Niño”; os autores mostraram que existe uma
correlação positiva que favorece o crescimento do fungo após o aumento de
armazenamento de água no solo por longo prazo e que uma maior produção
de esporos está relacionada ao aumento da umidade absoluta do ar (35, 36).
Estes dados não só são importantes para a análise eco-epidemiológica da
doença, mas também deve-se entender que estas condições influenciam
necessariamente as culturas a serem feitas para se obter um adequado
crescimento e esporulação do fungo in vitro.
1.4. Resposta Imune na PCM
1.4.1. Resposta imune inata
Paracoccidioides spp., apresenta uma estrutura complexa de proteínas,
glicoproteínas, polissacarídeos, lipídeos e polipeptídeos que reúnem condições
físico-químicas e biológicas para atuarem como antígenos (37, 38), os quais
são reconhecidos pela primeira linha de defesa composta pelas células da
resposta imune inata: monócitos, macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, e
células natural killer (NK), que desempenham um papel central na resistência
(39).
O reconhecimento inicial de microrganismos é mediado por receptores
celulares expressos em células efetoras da imunidade inata, denominados
receptores de reconhecimento de padrões (PRRs). Assim, a interação entre
moléculas de superfície dos patógenos (PAMPs) e receptores homólogos
presentes na membrana celular das APCs, modula a fagocitose, ativam as
células e conseqüentemente induz a produção de citocinas. Trabalhos têm
demonstrado a importância da estimulação de receptores toll-like 2 e 4 (TLR2 e
TLR4), receptores de manose (MR) e dectina-1 com a participação do MyD88
culminando com produção de citocinas pró-inflamatórias (40-42). A IL-18 é uma
citocina indutora de IFN- e possui uma ação importante, por ser capaz de
promover tanto uma resposta do tipo Th1 como Th2, dependendo do contexto
Introdução Geral 6 Martha E. Urán J.
de estimulação e do micro-ambiente de citocinas. Em trabalho recente, foi
demonstrado que a IL-18 possui uma ação importante sobre o aumento da
expressão de MR em monócitos humanos e o reconhecimento de P.
brasiliensis via MR causaria aumento do crescimento fúngico no interior da
célula (43). Assim, os macrófagos ativados por IFN-γ aumentam a produção de
óxido nítrico (NO), potencializando assim a atividade microbicida dos
macrófagos (44, 45) e também a modulação da expressão dos receptores de
padrões de reconhecimento TLR2, TLR4, MR, e a produção de citocinas pró e
anti-inflamatórias (43, 46).
Estudos recentes levaram à caracterização mais precisa dos macrófagos,
que podem ser classificados em duas subpopulações: os macrófagos M1 e M2.
As células M1 apresentam alta produção de iNOS, IL-23, IL-12, CXCL8 e
CXCL9, já as células M2 apresentam alta produção de IL-10, CD206 e CD301.
Além disso, diferem também quanto à capacidade microbicida, atividade anti-
tumoral e capacidade de desenvolver granulomas. Ainda são escassos os
dados sobre o papel dos macrófagos (M1 ou M2) em infecções fúngicas, mas
na PCM existem evidências que apontam para a presença de diferentes
populações de macrófagos (47). Estudos anteriores revelaram a presença de
TNF-alfa e IL-23 produzidas por macrófagos nas lesões de pacientes com a
forma adulta, que apresentam granulomas formados por células gigantes
produtoras de óxido nítrico. Ao contrário, pacientes com a forma juvenil
apresentam granulomas frouxos, com macrófagos produtores de IL-10 e
poucas células gigantes, sugerindo a predominância de tipos diferentes de
macrófagos nas duas formas clínicas.
Os neutrófilos exercem um importante papel imunoprotetor na fase inicial
da defesa. Foi demostrado que a depleção desses em diferentes linhagens
genéticas gera um aumento nos níveis de anticorpos, que é dependente do
isotipo e pode apresentar um papel imunoprotetor ou imunoregulador (48). Em
estudos experimentais recentes têm sido demonstrado que a infecção com P.
brasiliensis ativa as células dendríticas (CDs) e leva estas a migrar para a
região dos nódulos linfáticos, para a posterior ativação de uma resposta
protetora do tipo Th1 (49).
Introdução Geral 7 Martha E. Urán J.
1.4.2. Resposta imune adaptativa
Ainda não estão claros quais fatores determinam a resposta imune
adaptativa gerada na PCM, mas é possível que os eventos ocorridos durante o
primeiro contato com o fungo desempenhem um papel relevante. No entanto,
pouco se conhece da relação que existe entre o reconhecimento dos padrões
antigênicos do fungo pelas células APC que leva a uma adequada ativação da
imunidade adaptativa e controle da doença.
Porém a imunidade mediada por células desempenha papel significante
na defesa do hospedeiro contra a infecção por P. brasiliensis, resultando na
formação de granulomas fibróticos como método de contenção do fungo (7, 41,
50-53). Entretanto, níveis elevados de anticorpos específicos e a ativação
policlonal das células B estão associados com as formas mais graves da
doença (54).
Os granulomas maduros são compostos por macrófagos, células
epitelióides, células gigantes, geralmente circundados por linfócitos T CD4+ e
CD8+ e alguns linfócitos B. (55). Os antígenos fúngicos são processados e
epitopos peptídicos são apresentados para reconhecimento pelos receptores
dos linfócitos T. No caso de CDs produtoras de IL-12, células T auxiliares
subpopulação 1 (Th1) são induzidas a proliferarem e produzirem IFN-γ e TNF-α,
IL-12 e IL-18. Os linfócitos B também podem ser ativados por células T
antígeno-independentes, sendo que neste caso os antígenos são geralmente
representados por estruturas de carboidratos (56). A estimulação de células
Th1 produtoras de IFN-γ pode, simultaneamente, ativar a produção de
anticorpos potencialmente protetores e ativar células T CD8+ em adição a
ativação de células fagocíticas.
Pacientes com a forma menos severa da doença, apresentam resposta
imune celular preservada e baixos títulos de anticorpos, o granuloma é
compacto e associado ao baixo número de células fúngicas. Já na PCM aguda
ou sub-aguda, existe uma deficiência na resposta imune celular com a
presença de altos títulos dos anticorpos específicos não protetores. Estudos
histopatológicos indicam, neste grupo de pacientes, a presença de um
processo inflamatório inespecífico e as lesões tornam-se difusas com
Introdução Geral 8 Martha E. Urán J.
granulomas frouxos, mal organizados, contendo ainda numerosos fungos
viáveis em seu interior (1). Dados clínicos e experimentais indicam que este
tipo de paciente apresenta uma inibição da imunidade celular contra o agente
infeccioso, que permite o crescimento do fungo (7, 50, 51, 53, 57).
A formação do granuloma é uma das respostas do hospedeiro mais
importante para conter o fungo que não foi eliminado pela resposta citotóxica e
que é necessária para evitar a disseminação do fungo para outros órgãos. Na
PCM experimental, o modelo que chega mais próximo da fisiopatologia da
fibrose pulmonar desenvolvida nos pacientes, tem sido o modelo induzido com
conídios (partículas da forma saprofítica do fungo) em camundongos
medianamente suceptíveis BALB/c; entretanto, outros modelos têm
demonstrado a formação dos granulomas com o inóculo de leveduras (forma
parasitária ou patogênica) nos quais a conformação celular e a contenção do
fungo neste modelo não seja tão efetiva, possivelmente devido às
caracteristicas iniciais de resposta immune do hospedeiro para manter um
contínuo fluxo celular para o tecido afetado; que em teoria devem-se à resposta
imune inata desencadeada pelos conídios (por suas características estruturais
e químicas); dessa forma, esse tópico ainda precisa de mais pesquisas. Deve-
se também, a sua evasão do sistema imune até conseguir a transformação
total e multibrotamento do fungo no tecido do hospedeiro e promover uma
segunda resposta a uma forma nova (estrutural e quimicamente) da levedura
(49); que o hospedeiro deve controlar seguidamente para evitar a
disseminação. Alguns autores têm reportado que para a permanência de uma
adequada resposta celular protetora é necessário manter a densidade e
afinidade dos ligantes das células T e que a natureza destas interações pode
gerar respostas específicas e duradouras para o reconhecimento dos
antígenos (58, 59). Por estes motivos é importante entender o mecanismo pelo
qual o hospedeiro consegue gerar um granuloma com capacidad de conter o
fungo.
Introdução Geral 9 Martha E. Urán J.
1.5. Tratamento
Inicialmente cabe lembrar as dificuldades de tratamento dos pacientes,
pois, dependendo da evolução da doença, podem ser utilizados vários
antifúngicos, tais como: sulfamídicos (associação sulfametoxazol/trimetoprim,
sulfadiazina), azólicos (cetoconazol, fluconazol e itraconazol) e anfotericina B.
O itraconazol é o antifúngico de preferência no tratamento das formas com
severidade leve e moderada, é usado em menor período de tempo, apresenta
toxicidade baixa, produz 90% de cura e uma taxa de recidiva de 0-15% (60).
Entretanto, em muitos locais do Brasil, a combinação sulfametoxazol-
trimetoprim é a alternativa mais utilizada na terapêutica ambulatorial dos
pacientes com PCM (11) e, portanto, os períodos de tratamento são
prolongados (≥1 ano), pode ter um efeito tóxico, levando à supressão da
medula óssea com trombocitopenia e leucopenia (61), e em regra, há
necessidade de se manter a terapêutica antifúngica mesmo na presença de
melhora clínica, para evitar recidivas (11).
Desta forma, abordagens imunológicas que restabeleçam a resposta
imune específica protetora, como terapia adjunta, reduzindo o tempo de
tratamento são necessárias com urgencia (7, 62, 63).
A vacinação terapêutica com antígenos fúngicos ou com a transferência
passiva de anticorpos monoclonais pode induzir a resposta imune celular em
adição ao efeito protetor da quimioterapia permitindo, eventualmente, controlar
as recidivas e a redução da fibrose sequelar (64).
Porém, tem sido estudada uma seleção de componentes imunogênicos
que possam levar à proteção do hospedeiro em vários modelos vacinais, como
uma ferramenta poderosa na luta contra as micoses (65).
1.6. Glicoproteína de 43 kDa (gp43)
A glicoproteína de 43 kDa (gp43) possui 416 aminoácidos e é expressa
de forma constitutiva na fase micelial e leveduriforme do fungo (66), sendo
Introdução Geral 10 Martha E. Urán J.
constituída por uma única cadeia de oligossacarídeos (67, 68). Anticorpos
contra esta glicoproteína são encontrados no soro de quase o 100% dos
pacientes com PCM (infectados com o P. brasiliensis) (69), sendo utilizada
também no monitoramento dos pacientes que recebem tratamento (70). Tem
sido vista como o principal marcador sorológico da PCM, aumentando a
especificidade e a sensibilidade dos testes sorológicos (71, 72).
A glicoproteína contém epitopos que tem a capacidade de produzir uma
resposta imune celular (DTH) em cobaias (73, 74) e em humanos (75). Além de
ser imunodominante para produção de anticorpos, a gp43 tem a capacidade de
estimular linfócitos T CD4+ Th1 produtores de IFN-γ e IL-2 (76), assim como
também pode estimular a imunidade inata mediante interação com monócitos,
modulando a expressão dos receptores de padrões de reconhecimento TLR2,
TLR4, MR e a produção de citocinas pró e anti-inflamatórias(43).
1.7. Peptídeo P10 e uso como imunomodulador
Diferentes peptídeos que contém o domínio HTLAIR induziram a
proliferação de linfócitos de camundongos sensibilizados com a gp43 purificada
ou infectados intratraquelmente com P. brasiliensis. Entre esses peptídeos, um
trecho específico de 15 aminoácidos denominado como P10, com a sequência
QTLIAIHTLAIRYAN, foi responsável pela ativação das células T e da proteção
contra PCM em camundongos BALB/c. A linfoproliferação induzida por P10 ou
pela gp43 envolve a produção de IL-2 e IFN-γ pelos linfócitos T CD4+. O efeito
protetor do peptídeo é devido principalmente à resposta imune celular mediada
por IFN-γ e, diferente da gp43, o P10 não induz a resposta humoral (76).
O hexapeptídeo HTLAIR tem demostrado ser o core essencial para á
resposta imune celular, porém em P. lutzii existe uma importante mutação em
neste domínio (15) o que praticamente extingue a capacidade protetora (77).
As imunizações com P10 em camundongos BALB/c os levam a uma
infecção pulmonar 200 vezes menos intensa que os animais não imunizados
(64, 76, 78). Análise através do programa TEPITOPE verifica a probabilidade
de HLA-DR de caucasianos reconhecerem diferentes peptídeos, demonstrou
Introdução Geral 11 Martha E. Urán J.
que o P10 é um peptídeo promíscuo, sendo um importante candidato vacinal
(79).
Este peptídeo, quando associado às drogas comumente utilizadas no
tratamento da paracoccidioidomicose, apresenta um efeito aditivo no modelo
experimental utilizando camundongos BALB/c, o que demonstra a capacidade
do peptídeo P10 em auxiliar na diminuição do tempo de tratamento desta
micose (80). Esses resultados foram também observados em camundongos
anérgicos submetidos à quimioterapia e imunizados com o peptídeo,
apresentando uma resposta Th1 protetora com incremento significativo nos
níveis de IFN-γ e IL-12 (80, 81).
Os adjuvantes são moléculas compostas ou complexos de
macromoléculas que aumentam o potencial e a longevidade da resposta imune
específica contra um antígeno, tendo uma baixa toxicidade e um efeito
imunológico de longa duração (82). Contudo, os adjuvantes podem ser
classificados de acordo com a capacidade estimuladora da imunidade de tipo
Th1 (celular) ou Th2 (humoral). Os adjuvantes podem atuar como estimuladores
tanto da imunidade inata como adaptativa e podem ser classificados de acordo
com o tipo de receptor de ligação (83).
Aplicação de micropartículas e nanopartículas como adjuvantes tem sido
fortemente estudada baseando-se em que os antígenos se aderem à superfície
deste tipo de partículas, demostrando resultados promissórios devido a que as
micropartículas catiônicas são tomadas efetivamente, tanto pelos macrófagos
como pelas células dendríticas induzindo nelas também a maturação (84-86).
Acredita-se que o tamanho dessas partículas tenha um papel importante na
atividade imunogênica, já que as partículas menores (<10μm) são
significativamente mais imunogênicas do que as de maior tamanho (87). Isto
ocorre possivelmente devido a uma maior captação das partículas menores
pelas APCs (88). Partículas entre 40-50nm tem uma capacidade
significativamente maior na indução de respostas Th1 quando comparadas com
partículas maiores (>500nm), as quais são mais adequadas na indução de
respostas Th2 e de anticorpos (89).
A associação do P10 com adjuvantes como CFA (76, 81), alumen, MPLA
(80), flagelina (90), nanopartículas de PLGA (91) e lipídeo catiônico
Introdução Geral 12 Martha E. Urán J.
dioctadecyl-dimethylammonium bromide “DODAB” (92) mostram uma redução
significativa da carga fúngica em pulmões de camundongos infectados i.t. com
P. brasiliensis, sendo promissores para o tratamento da PCM experimental.
Por último, as células dendríticas autólogas geradas a partir do sangue
periférico são um método seguro e promissor no tratamento de várias doenças,
entre elas, câncer e doenças infecciosas. Na PCM experimental, nosso grupo
demostrou que células dendríticas pulsadas com P10 apresentam um alto
potencial na vacinação devido a capacidade de rápida proteção contra o
desenvolvimento da PCM, assim como no tratamento da doença estabelecida.
Em camundongos, a administração de células dendríticas pulsadas com o
peptídeo antes (via subcutânea) e depois (via subcutânea e intravenosa) da
infecção intratraqueal com P. brasiliensis, diminui a carga fúngica nos pulmões.
E os níveis de IFN-γ e IL-12 foram incrementados ao mesmo tempo que houve
uma redução na produção de IL-10 e IL-4, em comparação com os grupos de
animais não imunizados e àqueles que não foram tratados com as células
pulsadas (93).
1.8. Modelos experimentais da PCM
Os modelos experimentais da PCM têm múltiplas variações, entre elas, a
linhagem do camundongo (Resistência e susceptibilidade relativa aos genes do
MHC) é uma fator importante. As linhagens podem ser: susceptíveis (B10A,
CBA), intermediárias (C3HeB/Fe, C57BL/6, BALB/c) e resistentes (A/Sn, DBA,
A/J, C3H/He).
Outra das grandes variações do modelo é relativa a virulência dos
isolados considerando, da menor à maior virulência, os seguintes isolados:
Pb265, Pb192, Pb01, Pb60855 e Pb18. Quando as leveduras foram inoculadas
pela via intravenosa e avaliadas pela frequência da presença de lesões
extrapulmonares e aumento da resposta celular e humoral, estas diferenças
mostram a pequena relação que existe com os níveis da fração de
galactomanana e proteínas presentes nas análises da parede celular dos
diferentes isolados. Posteriormente outras aproximações foram avaliadas,
Introdução Geral 13 Martha E. Urán J.
mediante a inoculação intranasal ou intratraqueal de conídios, frações de bolor,
paredes ou leveduras viáveis achando diferenças somente no perfil
inflamatório, similar ao que acontece com a via de administração do inóculo,
entendendo que a via intranasal mimetiza as condições ambientais em que a
infecção acontece, porém a distribuição da doença no modelo não é
homogênea. Na via intratraqueal consegue-se que a patogenia do modelo seja
mais homogênea e reprodutível.
Finalmente, o fator que mais claramente influencia o modelo é o gênero
dos animais (fêmeas ou machos) que, como nos humanos, as fêmeas tem uma
resistência natural à infecção pela influência dos hormônios sexuais (20, 22,
94-97). Todos eles, de um jeito ou de outro, participam no entendimendo da
patogênese da doença, através da selecção e estudo do modelo experimental.
Justificativa 14 Martha E. Urán J.
2. JUSTIFICATIVA
A produção de conídios do fungo tem sido pouco explorada pelos
pesquisadores, na atualidade a produção de conídios de Paracoccidioides spp.,
é realizada atualmente por poucos laboratórios na América Latina. Dois grupos
de pesquisa (um do Brasil e outro da Colômbia) se destacam pela obtenção de
conídios em cultura por diferentes técnicas. Apesar das diferenças, ambos
concordam que as culturas necessitam de condições ambientais especiais e
tempo para conseguir o amadurecimento do bolor até a obtenção e purificação
das partículas infectantes de maneira padronizada para uso nos modelos
experimentais. Entre as condições mais importantes para obtenção dos
conídios estão: umidade superior a 60%, temperatura inferior a 25°C e privação
de nutrientes no meio (18, 19, 21, 34-36, 98).
Portanto, consideramos importante adquirir a tecnologia para a produção
de conídios e estabelecer, em nosso laboratório, o protocolo para obtenção de
conídios de Paracoccidioides spp. para reproduzir o modelo de PCM crônica e
de fibrose pulmonar induzida com estes propágulos, além de testar o peptídeo
P10 neste modelo.
É sabido que P. brasiliensis interage com células apresentadoras de
antígenos (APCs) alterando suas principais funções biológicas. Entre as APCs,
os macrófagos são células que desempenham um papel importante na indução
e regulação da resposta inflamatória. Estas células são capazes de reconhecer
padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs) através da expressão
de receptores de reconhecimento padrões (PRRs). Assim, as interações entre
moléculas de superfície dos patógenos, algumas delas do tipo lectinas ou
oligossacarídeos que contêm esses resíduos de açúcar acessíveis na parede
das células fúngicas, com os receptores presentes na membrana celular do
macrófago desencadeiam a ativação dos diferentes TLRs (2 ou 4), modulam a
fagocitose, ativam a célula e, conseqüentemente, levam à produção de
citocinas inflamatórias.
Trabalhos têm demonstrado a importância da estimulação de receptores
toll-like 2 e 4 (TLR2 e TLR4), receptores de manose (MR) e dectina-1 de
Justificativa 15 Martha E. Urán J.
monócitos, tanto em infecções bacterianas como fúngicas, culminando com
indução de produção de várias citocinas.
É importante determinar quais são os possíveis PRRs implicados no
reconhecimento dos conídios e alguns dos mecanismos envolvidos para que as
células APC sejam efetivas apresentadoras e ativadoras do sistema imune,
para gerar uma resposta proliferativa de linfócitos e produção de citocinas.
Inicialmente se projetou um estudo baseado no uso dos conídios para
avaliar o efeito do peptídeo P10 como monoterapia ou combinado com
antifúngicos no modelo de fibrose pulmonar experimental, utilizando conidios
de P. brasiliensis inoculados pela via intranasal em camundongos BALB/c
machos. Este efeito seria determinado pela redução da carga fúngica,
diminuição da fibrose pulmonar e do tempo do tratamento. Porém as culturas
de conídios não produziram a quantidade necessária para o desenvolvimento
de um modelo experimental e se modificou o projeto, levando assim à
comparar a resposta imune que os conídios induzem nos macrófagos de
linhagens selvagens e nocautes de algumas moléculas do sistema imune inato
e a capacidade dos conídios ou leveduras de P. lutzii de induzir doença em
camundongos intermediários (C57Bl/6).
Portanto, foi estabelecida uma associação com o grupo coordenado pela
Professora Dra. Vera Calich para a realização de ensaios com camundongos
nocautes na determinação da participação de alguns dos componentes da
resposta imune inata gerada pelos propágulos de Paracoccidiodes spp.
Avaliamos os mecanismos de fagocitose e producção de citocinas com os
macrófagos de camundongos nocautes (TLR2, TLR4, Dectina, MyD88 e
NALP3) da linhagem C57BL6 quando infectados por diferentes propágulos do
fungo, sejam conídios ou leveduras de Pb18 e leveduras das duas espécies de
Paracoccidiodes brasiliensis e Paracoccidiodes lutzii.
Objetivos 16 Martha E. Urán J.
3. OJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Determinar os possíveis PRRs implicados no reconhecimento, fagocitose,
ativação e produção de citocinas quando em contato com partículas fúngicas,
conídios ou leveduras de Pb18 ou leveduras das duas espécies, P. brasiliensis
(Pb18) e P. lutzii (Pb01), além de tentar compreender alguns dos mecanismos
da imunopatologia de P. lutzii no modelo experimental in vivo.
3.2. Objetivos Específicos
- Establecer a capacidade de produção de conídios de P. brasiliensis
(Pb18) e de P. lutzii (Pb01) em meios de cultura pobres e determinar sua
capacidade de transformação quando comparados com o isolado Pb60855.
- Determinar a resposta imune inata mediada por macrófagos frente aos
propágulos fúngicos de Paracoccidioides spp. na geração de uma resposta
imunomoduladora em camundongos nocautes para diferentes moléculas.
- Determinar os possíveis PRRs implicados no reconhecimento,
fagocitose, ativação e produção de citocinas quando em contato com partículas
fúngicas, conídios ou leveduras de Pb18 ou leveduras das duas espécies P.
brasiliensis (Pb18) e P. lutzii (Pb01), mediante o uso de camundongos
selvagens ou nocautes.
- Analisar alguns dos mecanismos imunopatológicos da doença induzida
por leveduras viáveis de P. lutzii (Pb01), inoculadas por via intranasal em
camundongos intermediários para a doença (C57Bl/6) no modelo experimental
in vivo.
Objetivos 17 Martha E. Urán J.
Para um melhor entendimento os métodos, resultados e discussão foram
divididos em três blocos, da seguinte forma:
1- Culturas e purificação dos conídios e ensaios in vitro na transformação e
o crescimento de Paracocccidioides spp.
2- Experimentos ex vivo focados na fagocitose, atividade fungicida,
expressão de moléculas de superfície e produção de citocinas em
macrófagos selvagens (WT) ou nocautes (KO) infectados com conídios
e leveduras de Paracocccidioides spp.
3- Desenvolvimento de Modelo Experimental em camundongo infectados
com Paracoccidioides lutzii – isolado Pb01.
Materiais e Métodos 18 Martha E. Urán J.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Condições Gerais da Experimentação Animal e Regulamentos
de segurança.
4.1.1. Animais
Foram utilizados camundongos machos da linhagem C57Bl/6, com idades
entre 6 e 8 semanas, selvagens ou nocautes para as seguintes moléculas:
TLR-2, TLR-4, Dectina-1, MyD88 ou Nalp-3. Os camundongos selvagens foram
obtidos do Biotério de Camundongos Isogênicos do Instituto de Ciências
Biomédicas da Universidade de São Paulo e do Biotério Central da Faculdade
de Medicina da Universidade de São Paulo. Os animais nocautes foram obtidos
pela colaboração com a Prof.ª Dr.ª Vera Calich, do Departamento de
Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo,
onde foram criados sob condições livres de patógenos e mantidos no biotério
de animais de experimentação do referido departamento.
Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados com animais
anestesiados segundo as regulamentações nacionais e internacionais de
pesquisa envolvendo animais de experimentação (lei federal 11.794). Os
procedimentos foram realizados no Biotério de Experimentação Animal do
Instituto de Medicina Tropical de São Paulo – USP. A eutanásia foi realizada
pelo uso de câmara de CO2, método aprovado por comitês nacionais e
internacionais de ética e experimentação animal. O protocolo de pesquisa do
projeto (nº 165/11) foi aprovado pela CEUA do Comitê de Ética em Pesquisa
da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, em sessão de
08/06/2011 e pelo protocolo de experimentação N° 76/04/CEEA da Professora
Vera Calich. (Anexo 1.)
Materiais e Métodos 19 Martha E. Urán J.
4.1.2. Microrganismo, regulamentos de segurança, condições de
cultivo e manutenção.
Paracoccidioides spp. é designado pelo “health and safety document from
the Advisory Committee on Dangerous Pathogens, Categorization of pathogens
according to hazard and categories of containment" (Executive, 2013 #9187)
como um patógeno das categorias II e III, que precisa ser manipulado em
laboratório de contenção categoria III em fluxo de segurança microbiológica de
classe II.
Foram usados quatro isolados de Paracoccidioides spp., P. brasiliensis
isolado ATCC60855 (original de um paciente da Colômbia e depositado na
American Type Culture Collection (Manassas, Va.)). Estes isolados estão
sequenciados (99) e a maioria dos estudos baseiam-se na purificação de
conídios que foram reportadas previamente (18, 100, 101).
P. brasiliensis, isolado Pb18 tradicionalmente usado em modelos
experimentais no Brasil considerado um isolado de alta virulência (102), e
Pb01, atualmente considerado uma nova espécie, Paracoccidioides lutzii (103).
Estes isolados também encontran-se sequenciados (99).
O isolado de P. brasiliensis Pb339 tradicionalmente tem sido usado para a
produção de antígenos (104) e deste foi sequenciada e caraterizada a
glicoproteína de 43 kDa (76). Em nosso trabalho será usado como controle da
produção de exoantígeno em alguns dos experimentos.
Todos os isolados foram mantidos na forma de levedura a 37°C em meio
rico (BHI suplementado com glicose ou Sabouraud suplementado com
asparagina e tiamina, SAT). A forma de bolor dos mesmos foi mantida em meio
mycosel e quimicamente definido MMcM (Sintetico McVeigth-Morton
Modificado) a 18°C para a obtenção de conídios. (Anexo 2.)
Materiais e Métodos 20 Martha E. Urán J.
4.2. Ensaios in vitro: Culturas e purificação dos conídios e ensaios
in vitro sobre a transformação e o crescimento de
Paracocccidioides spp
4.2.1. Produção de conídios
O processo de produção de conídios deve ser realizado por um
profissional com conhecimento sobre o manuseio dos fungos dimórficos
térmicos e os riscos e as medidas de segurança que devem ser tomadas em
todo o processo, além de conhecer os procedimentos adequados em caso de
acidente dentro ou fora dos fluxos de segurança.
De igual forma, deve conhecer a manipulação dos equipamentos de
segurança e as técnicas envolvidas no processo.
A água usada deve ser sempre de boa qualidade, pois o crescimento do
fungo nesta fase depende da água e dos poucos componentes a serem
adicionados. Igualmente, os reagentes devem ser de boa qualidade e com
garantia de pureza.
Um dos mais importantes pontos de controle é cuidar da contaminação
em todos os passos do processo, vigiando a mesma com bactérias ou outros
fungos, e controle adequado de ácaros.
O fungo cresce em fase de bolor até alcançar a fase de crescimento
exponencial, tomando cuidado para que não seja iniciado a produção de
enzimas autolíticas, típicas de culturas de Paracoccidiodes. Estas enzimas
cortam e destroem o bolor e, desta forma, as placas de conídios não
apresentam suficiente esporulação.
É importante ressaltar que o liquidificado de bolor que estava em fase de
crescimento exponencial é cultivado em ágar pobre (ágar água ou dextrose
sais) vai manter seu metabolismo ativo para conseguir conter seu material
genético e formar os conídios que como bem é sabido, são a forma de
reprodução assexual e de resistência às adversidades ambientais; e entender
que o bolor de Paracoccidioides tem que amadurecer para formar os conídios,
Materiais e Métodos 21 Martha E. Urán J.
diferente de outros fungos dimórficos, como histoplasma o qual produz
constantemente bolor e conídios conjuntamente.
O isolado ATCC 60855 do fungo dimórfico P. brasiliensis deve ser
mantido em forma de bolor em ágar mycosel e passado por animal (suspensão
de conídios ou bolor i.v.) pelo menos uma vez por ano para manter sua
virulência
Quando for necessária a amplificação das culturas, repica-se do ágar
mycosel para o meio MMcM em tubos com tampa de rosca, para evitar
contaminações com ácaros e garantir melhor assepsia geral. As culturas
devem ser incubadas a 18°C em câmara de umidade controlada e repicadas a
cada 2-3 semanas.
Quando se obtém abundante crescimento do fungo, o mesmo é lavado
com 5 ml de MMcM líquido com ajuda de alça descartável.
O lavado de cultivo de bolor de 4-5 tubos é depositado em 75 ml de meio
MMcM líquido em balão erlenmeyer de vidro com tampa de rosca ou com
tampão de algodão frouxo, para facilitar a respiração e segue-se incubação de
10-15 dias a 18°C, com agitação constante a 150 RPM.
Passado este período, o crescimento do bolor é coletado e liquidificado 5
vezes de 10 segundos, com intervalos de 10 segundos; 1,5 – 2 ml deste
liquidificado é vertido em placas que contem ágar água (bacto agar 1.3%) ou
ágar dextrose sais (bacto agar 1,3%, dextrose 0,01%, NaCl 0,01%, asparagina
0,01% e KH2PO4 0,01%) (Anexo 2.) e incubado a 18°C com umidade de 68%
por um período de 3-4 meses. Durante as duas primeiras semanas de cultivo,
deve verificar-se que o inóculo tenha secado e o bolor começado a crescer,
nesse momento, as placas são vedadas completamente pelos cantos com
esparadrapo hospitalar e dispostas invertidas (ágar para acima).
4.2.2. Coleta e purificação de conídios
A coleção dos conídios para experimentação normalmente é feita por dois
métodos: o método de lã de vidro e a purificação por gradientes de percoll (18,
Materiais e Métodos 22 Martha E. Urán J.
100, 101). Nós trabalhamos somente com purificação por lã de vidro, que é a
metodologia mais apropriada para o trabalho com modelo animal.
As placas que foram selecionadas para coletar e purificar os conídios foram
lavadas com 5 ml de Cloreto de Sódio 0,9% (Baxter) com 0,01% de Tween-20,
100 U penicilina e 100 mg estreptomicina por ml.
O crescimento micelial foi removido com alça descartável e a suspensão
resultante coletada em erlenmeyers de tampa contendo pérolas de vidro de 3
mm aproximadamente, cobrindo 0,5 cm da superfície do erlenmeyer. Os
frascos foram submetidos à agitação em shaker a 250 RPM por 45 min à 18°C.
Em seguida, a suspensão foi centrifugada 1500xg a 4°C por 30 min. Para
optimização do desprendimento dos conídios do bolor, o precipitado foi
suspenso em 10 ml de PBS 1X e sonicado duas vezes em 7 Hz por 15
segundos em gelo.
4.2.3. Purificação dos conídios pelo método de lã de vidro
Seringas de vidro de 50 ml foram empacotadas com aproximadamente 10
cm de lã de vidro (Pyrex fibre glass, 8 mm; Corning Glasswork, Corning, NY,
USAEUA). As seringas com lã foram lavadas duas vezes com PBS 1X esteril e
depois a suspensão celular foi filtrada e coletada. Novamente, as seringas
foram lavadas duas vezes com PBS 1X e o filtrado centrifugado a 1500xg
(3000 – 3500 RPM) à 4°C por 45 min. O precipitado de conídios foi lavado 3
vezes com PBS 1X.(105).
4.2.4. Determinação da viabilidade dos conídios
Os conídios utilizados para infectar os camundongos foram obtidos pelo
método tradicional de lã de vidro, como descrito por Restrepo et al. (1986)(18).
As partículas fúngicas (leveduras e conídios) foram contadas em
hemocitômetro e a sua viabilidade avaliada pela coloração de brometo de etídio
e diacetato de fluoresceína (106) ou Azul de Trypan. A ausência de
contaminação foi avaliada pela cultura da suspensão em caldo de infusão de
Materiais e Métodos 23 Martha E. Urán J.
coração e cérebro (BHI) incubado a 37°C e verificada sua capacidade de
transformação in vitro durante 72-96hs.
4.2.5. Efeito do peptídeo P10 sobre a transformação de conídios para
levedura e número de UFC de leveduras de Pb60855 e Pb01
Os conídios obtidos foram deixados em incubação em Sabouraud
Dextrose-Asparagina-Tiamina (SAT) a 37°C em atmosfera com 5% de CO2 em
placas de 24 poços na concetração de 1x106 conídios/1000 ul para avaliar a
capacidade in vitro de transformação de conídio em levedura. A transformação
foi acompanhada pelo microscópio invertido a cada 24hs por 7dias.
O peptídeo P10 foi adicionado conjuntamente na cultura dos conídios em
uma concentração inicial de 2µg/ml em diluições duplas até 0.0312µg/ml.
No último dia (7º dia) o conteúdo de cada poço foi homogeneizado e as
diluições feitas para cultivar 100 ul de cada diluição. As culturas das UFC foram
incubadas a 37°C em atmosfera com 5% de CO2 e 95% de umidade durante 4
semanas, onde foram realizadas contagens semanais das unidades fúngicas
(Anexo 2.). O valor de UFC foi expresso como UFC/ml, portanto:
UFC de co-culturas: nº de-colônias x diluição x 10
Onde:
nº de-colônias: é o número total de colônias que foram contadas por cada
placa cultivada
Diluição: é o número correspondente ao valor da diluição que foi realizada
para cada cultura de UFC (1:10, 1:50)
10: corresponde ao valor do volume que foi cultivado. Por exemplo, se cada
poço tem 1000 ul e somente 100 ul do volume total foi cultivado, somente 10
partes do volume foi testado.
Para verificar o efeito do P10 sobre a transformação dos conídios se
testou uma concentração maior de P10 a 4µg/ml de 1x106 conídios/1000 ul, e
se analizou principalmente o efeito sobre a transformação determinado o
Materiais e Métodos 24 Martha E. Urán J.
número de células multibrotantes para o qual foi considerado como levedura
simples aquela com uma ou duas células (uma levedura com um brotamento),
e as leveduras multibrotantes aquelas que tenham vários brotamentos (uma
levedura com dois o mais brotamentos).
4.3. Ensaios ex vivo: fagocitose, atividade fungicida, expressão de
moléculas de superfície e produção de citocinas em macrófagos
selvagens (WT) ou nocautes (KO) infectados com conídios e
leveduras de Paracocccidioides spp.
4.3.1. Coleta e viabilidade dos propágulos
Leveduras de P.brasiliensis ou P. lutzii foram mantidos em meio SAT
(Anexo 2.) com repique a cada 7 dias a 37 ºC. O fungo foi lavado três vezes
utilizando solução salina hospitalar (Baxter). Após a decantação das partículas
maiores, foi feita a contagem das leveduras em câmara de Neubauer. A
viabilidade das leveduras foi determinada através do corante Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA). Todos os procedimentos foram realizados com
suspensão fúngica com viabilidade entre 90 e 95%. Os conídios foram
purificados como descrito anteriormente.
A concentração do fungo para o inóculo foi ajustada de acordo com as
necessidades de cada experimento.
4.3.2. Preparação dos propágulos marcados com FITC
Para a análise da fagocitose por citometria de fluxo, os macrófagos foram
infectados com leveduras ou conídios viáveis previamente marcados com
500ug/ml de FITC em cloreto de sódio 0,9% (Baxter) e incubados por 1 hora a
37°C, com duas lavagens com soro fisiológico (3500 rpm, a 4°C por 15min).
Materiais e Métodos 25 Martha E. Urán J.
Posteriormente, os inóculos foram ajustados para as infecções das células
(Anexo 5.).
4.3.3. Lavado peritoneal (LP) e contagem de células
Camundongos pré-inoculados i.p. com 3 ml de tioglicolato a 3% por 72 h
foram sacrificados de acordo com as normas do comitê de ética em carta de
aprovação do projeto nº 165/11. O peritônio foi exposto e lavado pela injeção
de 10 ml de cloreto de sódio 0,9% (Baxter) ou meio de cultura RPMI simples
frio. O número total de células do LP foi determinado por contagem em câmara
de Neubauer após uma diluição de 1:10 com Azul de Trypan, usado como
corante para avaliar a viabilidade celular. As suspensões celulares foram
mantidas em gelo e centrifugadas a 1200 rpm, à 4°C por 10 min e suspensas
em 10 ml de meio de cultura RPMI suplementado com 10% de soro fetal
bovino. As células foram ajustadas para 1x106 células/ml e utilizadas nos
ensaios de fagocitose, atividade fungicida, produção de citocina e expressão de
moléculas de apresentação, co-estimuladoras e alguns receptores de
reconhecimento padrão de membrana.
Um volume de 500 ul de células foi dispensado em cada poço de placas
de 24 poços. As culturas foram incubadas por 2 horas em estufa à 37°C, com
5% de CO2 e 95% de umidade. As células não aderentes foram removidas por
aspiração completa do meio de cultura e à monocamada aderente foi
adicionado meio de cultura suplementado com ou sem estímulo de IFN- (20
ng/ml) (107). O número de células não aderentes foi determinado por uma nova
contagem e o valor final de células aderentes na placa foi corrigido. Os
macrófagos foram infectados com a suspensão de leveduras, em uma relação
levedura – macrófago de 1:25 (107, 108).
Materiais e Métodos 26 Martha E. Urán J.
4.3.4. Análise da fagocitose por citometria de fluxo
A determinação da aderência/fagocitose também foi realizada através da
análise por citometria de fluxo. As culturas de macrófagos ativados ou não com
IFN- foram infectadas (relação de 1:25) (107, 108) com leveduras ou conídios
viáveis que foram previamente marcados com FITC. A concentração de células
foi ajustada para dispensar 100ul por cada poço.
Após o tempo estimado para fagocitose (6h), o sobrenadante de cada
poço foi desprezado e 500ul de RPMI frio foi adicionado. As placas foram
deixadas 5-10 minutos sobre gelo para facilitar o desprendimento, com a ajuda
de um scraper (embolo de seringa de tuberculina) as células foram totalmente
desprendidas e depositadas nos tubos de citometria para marcar as células
com o anticorpo anti-F4/80 (Pacific Blue) (Anexo 3.). O procedimento de
marcação de citometria foi realizado como descrito. As leituras foram feitas em
citômetro de fluxo (FACSCanto II™, BD Biosciences, EUA). O queenching foi
realizado com Azul de Trypan (100 ul de 250 ug/ml por tubo) para excluir a
fluorescência do fungo aderido e estimar o valor real de fungo fagocitado. Os
resultados foram analisados com o programa FlowJo V.X (Tree Star Inc., EUA)
e expressos como frequência das células (porcentagem) duplo positivas para
F4/80-Pacific Blue e FITC.
4.3.5. Marcação dos macrófagos para expressão de moléculas por
citometria de fluxo e produção de citocinas no sobrenadante
das culturas de macrófagos.
Após 36 horas de co-cultura dos macrófagos com as partículas fúngicas,
o sobrenadante foi retirado, centrifugado e estocado para posterior
determinação de citocinas (Anexo 4.). Em cada poço foi adicionado 500 ul de
tampão de citometria gelado (PBS com 2% de soro fetal bovino e 1% de azida
sódica) e as placas foram mantidas sobre gelo por 5-10 min para facilitar o
desprendimento celular. Com ajuda de um scraper (embolo de seringa de 1ml),
Materiais e Métodos 27 Martha E. Urán J.
as células foram totalmente desprendidas e depositadas nos tubos de
citometria para marcar as células com os anticorpos para determinação da
expressão de algumas moléculas as quais foram divididas em dois painéis para
evitar a interferência dos fluorocromos (Anexo 3.). Após marcação, as células
foram incubadas por 1 hora a 4°C no escuro, lavadas 2 vezes com tampão de
citometria (250g por 5 min) e ressuspensas em 200 uL de paraformaldeido
(PFA) 2% em PBS.
4.3.6. Determinação de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) de
co-culturas com macrófagos
Após 36 horas de co-cultura dos macrófagos com as partículas fúngicas,
o sobrenadante foi retirado, centrifugado e estocado para posterior
determinação de citocinas. As placas permaneceram por 5-10 min em contato
com gelo e em cada poço foi adicionado 1 ml de H2O destilada estéril filtrada e
fria, para estourar os macrófagos. O conteúdo de cada poço foi
homogeneizado e as diluições feitas para cultivar 100 ul de cada diluição. As
culturas das UFC foram incubadas a 37°C em atmosfera com 5% de CO2 e
95% de umidade durante 4 semanas, onde foram realizadas contagens
semanais das unidades fúngicas. O valor de UFC foi expresso como UFC/ml,
portanto:
UFC de co-culturas: nº de colônias x diluição x10
Onde:
nº de colônias: é o número total de colônias que foram contadas por cada
placa cultivada
Diluição: é o número correspondente ao valor da diluição que foi realizada
para cada cultura de UFC (1:10, 1:50)
10: corresponde ao valor do volume que foi cultivado. Por exemplo, se cada
poço tem 1000 ul e somente 100 ul do volume total foi cultivado, somente 10
partes do volume foi testado.
Materiais e Métodos 28 Martha E. Urán J.
4.4. Ensaios in vivo, desenvolvimento de um Modelo Experimental
em camundongo com Paracoccidioides lutzii – isolado Pb01.
4.4.1. Inóculo para infecção no modelo experimental
Conídios de P. brasiliensis ATCC60855 foram utilizados em inóculo de
4×106 conídios / 60 ul de acordo com as referências (20, 100, 105) (20, 100).
Leveduras de P.brasiliensis isolado Pb18 foram utilizadas em inóculo de
3x105 leveduras/50 ul (109).
Com relação às leveduras de P. lutzii, isolado Pb01, até o presente
estudo não existia um modelo experimental para este isolado. Testes prévios
mostraram que o isolado Pb01 parece ser menos virulento. Igualmente, nos
casos reportados de PCM causados por P. lutzii, os pacientes parecem ter um
melhor prognóstico. Dados prévios, realizados em nosso laboratório,
mostraram alguns avanços no modelo experimental, porém, utilizando
camundongos da linhagem BALB/c. Para o nosso modelo, usamos
camundongos C57BL/6, com um inóculo de 1x106 leveduras/50 ul.
4.4.2. Infecção Intratraqueal (i.t.)
A concentração das leveduras foi ajustada e os animais foram
anestesiados por via intraperitoneal, com 300 μL de solução contendo 80
mg/kg-1 de ketamina (Divisão Vetbrands Saúde Animal, Sespo, SP) e 10 mg/kg-
1 de xilazina (Rompun, Bayer, São Paulo, SP, Brasil). Quando os animais se
apresentaram insensíveis à dor (após cerca de 10 minutos), foi realizada uma
incisão longitudinal na pele do pescoço, facilitando a exposição da traqueia
para a inoculação do fungo. Foram usadas seringas de 1 mL (Becton
Dickinson, Brasil) para a inoculação. Após a sutura, os animais foram mantidos
aquecidos até acordarem da anestesia.
Materiais e Métodos 29 Martha E. Urán J.
4.4.3. Infecção intranasal com propágulos.
Para a infecção com propágulos foi adotado o modelo da infecção
intranasal descrito previamente (20, 100, 105). Os animais foram anestesiados
e, quando se apresentaram insensíveis à dor, os conídios, cuja concentração
foi ajustada para 4x106 células/60µl, foi administrada intranasalmente (i.n.) em
duas doses de 30µl, para evitar bronco-aspiração pelos animais. Nesta infeção
somente foram usados conídios de Pb60855 e Pb01.
4.4.4. Sacrifício e coleta de material biológico
Os camundongos foram sacrificados de acordo com as normas do comitê
de ética em carta de aprovação do projeto nº 165/11.
Tendo em consideração que a distribuição da infecção experimental nos
camundongos não acontece de maneira homogênea em virtude da fisiologia do
pulmão, não se pode retirar somente uma parte do pulmão do animal, deve-se
analisar a totalidade, tanto para determinação de UFC para histopatologia (97).
Portanto, de acordo com esta informação, cada grupo experimental tinha
dois subgrupos, o primeiro, para retirada de sangue e uso dos tecidos para
histologia e, o segundo, para coleta de sangue e lavado bronco-alveolar (LBA),
e o pulmão foi retirado e homogeneizado para determinação de UFC e
citocinas.
4.4.5. Soro e Lavado Bronco-Alveolar (LBA)
Após a eutanásia dos animais, o sangue foi coletado individualmente do plexo
axilar e o soro foi separado por centrifugação a 750 x g durante 15 minutos e
em seguida congelado a - 20°C. Para obter os LBAs, a traqueia dos animais foi
exposta e uma pequena incisão longitudinal foi feita. Uma agulha foi inserida na
traqueia e 1 ml de meio RPMI 1640 frio foi injetado para fazer a lavagem dos
pulmões, sendo depois aspirado. As LBAs foram centrifugadas a 750 x g por 5
Materiais e Métodos 30 Martha E. Urán J.
minutos. As frações de sobrenadantes foram separadas individualmente e
armazenadas a - 20°C até uso.
4.4.6. UFC e citocinas de macerado de pulmão de camundongos
infectados
Após o sacrifício dos animais, os órgãos completos foram destinados para
UFC e determinação de citocinas em sobrenadante de tecidos. Os órgãos
foram homogeneizados em 5 ml de PBS 1x estéril com o auxílio de um
homogeneizador (T 18 basic ULTRA-TURRAX by IKA®). Parte desta amostra,
1ml, foi retirada para diluições em água destilada estéril fria, para a
determinação de UFC em meio BHI-suplementado. As placas foram incubadas
a 37°C em atmosfera com 5% de CO2 e 95% de umidade durante 4 semanas.
Durante este período, foram realizadas contagens semanais das unidades
fúngicas. O valor de UFC foi expresso como UFC/ml, portanto:
Formula para determinar UFC total / órgão: nº de-colônias x diluição x10 x 5
Onde:
nº de-colônias: é o número total de colônias que foram contadas por cada
placa cultivada
Diluição: é o número correspondente ao valor da diluição que foi realizada
para cada cultura de UFC (1:10, 1:50)
10: corresponde ao valor do volume que foi cultivado. Portanto, se foram
obtidos 1000 ul do macerado total do pulmão e somente 100 ul do volume total
foi cultivado, somente 10 partes do volume foi testado.
5: é o volume total em que o pulmão foi homogeneizado, portanto, para
apresentar o valor total de UFC por pulmão esta correção deve ser feita.
Materiais e Métodos 31 Martha E. Urán J.
4.4.7. ELISA para quantificação de citocinas em sobrenadantes dos
macerados de pulmão, LBA e sobrenadante de co-cultura de
macrófagos.
Os sobrenadantes das co-culturas dos macrófagos, o lavado
broncoalveolar (LBA) e os sobrenadantes dos macerados de pulmão dos
camundongos foram estocadas a - 20°C até a determinação da presença e
concentração das citocinas e quimiocinas pelo método de ELISA. Para estas
detecções, foram utilizados os kits de reagentes da BD Bioscience e R&D
systems (Anexo 4.), com as referências correspondentes.
A metodologia foi realizada de acordo com as instruções do fabricante e
as leituras foram feitas em espectrofotômetro com filtro de 450 nm.
4.4.8. Análise histológica
Os animais selecionados para as análises histológicas foram submetidos
à perfusão cardíaca com 10 ml de formalina de Carson, para garantir
eliminação de boa parte do sangue e fixação profunda dos tecidos, a fim de
obter melhor armazenamento até serem processados. Os tecidos foram
retirados e submergidos em 10 ml de formalina de Carson em tubos de vidro e
enviados para a realização da análise histopatológica (hematoxilina e eosina,
tricômico de Massom e coloração de prata-metenamina por Grocott). O
processamento e coloração foram realizados no laboratório de Histologia do
Departamento de Imunologia da Universidade de São Paulo.
4.5. Análise estatística
Os resultados foram analisados utilizando-se o software GraphPad Prism
5.0 (GraphPad Inc., San Diego, CA) e a análise de variância (ANOVA, Two-way
ANOVA ou Multiple Comparison Test) foi realizada seguida do pós-teste de
Materiais e Métodos 32 Martha E. Urán J.
Bonferroni. O resultado foi considerado significativo quando o p<0,05. As
comparações utilizando análise de variância ou t de student foram feitas entre
os diferentes tratamentos quando os grupos foram comparados.
Foi utilizado o software FlowJo V.X (Tree Star Inc., EUA) para análise da
expressão dos receptores de membrana obtidos por FACS Canto II (BD) e os
dados numéricos analisados por GraphPad Prism 5.0.
Resultados 33 Martha E. Urán J.
5. RESULTADOS
5.1. Ensaios in vitro: Cultura, e purificação de conídios e ensaios in
vitro focados na transformação e no crescimento de
Paracocccidioides spp
5.1.1. Culturas e purificação dos propágulos.
Foram utilizados três isolados de Paracoccidioides spp.: P. brasiliensis
isolado ATCC60855 (original de um paciente da Colômbia e depositado na
American Type Culture Collection (Manassas, Va.)), P. brasiliensis isolado
Pb18 (tradicionalmente usado em modelos experimentais, sendo considerado
como um isolado de alta virulencia) e Pb01 (atualmente considerado uma nova
espécie, Paracoccidioides lutzii).
Para manipulação destes três isolados foi adaptado um laboratório
equipado com um fluxo laminar tipo II-B e equipamentos de segurança. Além
disso, a temperatura da sala foi mantida entre 18-21°C para facilitar as
condições de crescimento do fungo.
As culturas foram mantidas em crescimento contínuo em meio
quimicamente definido (98) (Figura 1), nas condições de temperatura (18°C) e
umidade (68%) controladas (estufa de umidade controlada). Outros lotes de
culturas foram mantidos a 18-19°C em estufa tipo BOD sem controle de
umidade (a umidade foi facilitada pelo uso de bandejas de água destilada em
seu interior).
As culturas que não foram armazenadas na estufa de umidade controlada
ficaram expostas às condições ambientais medianamente controladas dentro
da sala, numa faixa de temperatura de 18-21°C e mudanças anuais de
umidade de 65 até 25%. Estes valores, medidos com um termohigrômetro
dentro da sala, estão correlacionados com os dados da média mensal de
umidade relativa, precipitação mensal, dias com umidade relativa (UR) abaixo
Resultados 34 Martha E. Urán J.
de 30% e número de dias com garoa, reportados pela estação meteorológica
do Instituto de Astronomia, Geofísica e Ciências Atmosféricas da Universidade
de São Paulo (IAG/USP) no seu Boletim climatológico anual. (Figuras 2 e 3).
Figura 1. Isolados na forma de bolor de Paracoccidioides spp. Isolados Pb18, Pb01 e Pb60855 crescidos em meio sintético McVeigth-Morton Modificado (A) e em ágar água para produção de conídios de Pb01 (B); Pb18 (C) e Pb60855 (D).
A
B C D
Resultados 35 Martha E. Urán J.
Figura 2. Precipitação mensal, dados da média climatológica mensal (mm) de janeiro de 2012 até janeiro de 2014. Tomados dos Boletins climatológicos anuais e trimestrais da estação meteorológica do IAG/USP - Seção Técnica de Serviços Meteorológicos Instituto de Astronomia, Geofísica e Ciências Atmosféricas Universidade de São Paulo.
Figura 3. Compêndio de dados meteorológicos - janeiro de 2012 à janeiro de 2015. Os dados referentes a precipitação mensal (média climatológica mensal) (mm), Umidade relativa média mínima mensal, Número de dias/mês com umidade relativa (UR) abaixo de 30% e número de dias/mês com garoa de janeiro de 2012 até janeiro de 2015. Tomados dos Boletins climatológicos anuais e trimestrais da estação meteorológica do IAG/USP - Seção Técnica de Serviços Meteorológicos Instituto de Astronomia, Geofísica e Ciências Atmosféricas Universidade de São Paulo.
Resultados 36 Martha E. Urán J.
5.1.2. Ensaios in vitro focados na transformação e no crescimento de
Paracocccidioides spp
5.1.2.1. Transformação de conídio para levedura in vitro
Posterior à purificação dos conídios, foi comparado o tempo de
transformação entre os isolados Pb01 e Pb60855 (Figura 4). O isolado
Pb60855 apresentou transformação mais rápida de conídio para levedura do
que o isolado Pb01, de 4 e 7 dias, respectivamente. Contudo, durante o
processo de transformação do isolado Pb01, observou-se que as leveduras são
maiores e apresentam número maior de brotamentos quando comparado com
o isolado Pb60855.
Analisamos paralelamente o tempo de recuperação das Unidades
Formadoras de Colônia (UFC) após a transformação de conídios para levedura
dos isolados Pb01 e Pb60855, para verificar não somente a capacidade de
transformação como também a proliferação in vitro. Os resultados indicam que
também há diferenças significantes. Na primeira semana de cultura das UFCs
foi observada recuperação acima de 80% para o isolado Pb01 (Figura 5A),
enquanto no isolado Pb60855 foi menor que 10% (Figura 5B). Somente na
terceira semana de acompanhamento das culturas foi observada recuperação
acima dos 99% das colônias deste isolado (Figura 5). Estes dados revelam
que, embora o isolado Pb01 demore mais horas para se transformar em
levedura multibrotante, essas por sua vez proliferam mais rapidamente quando
comparado com o isolado 60855.
Resultados 37 Martha E. Urán J.
Figura 4. Transformação de conídio para levedura in vitro. A figura mostra a transformação de conídios para leveduras dos isolados Pb60855 e Pb01 em diferentes tempos a 37°C.
Resultados 38 Martha E. Urán J.
Figura 5. Unidades Formadoras de Colônia (UFC) após a transformação de conídios para leveduras de dois isolados de Paracoccidioides. As contagens de UFC foram feitas semanalmente por quatro semanas e os resultados expressos em porcentagem de recuperação das UFCs dos isolados Pb01 (A) e Pb60855 (B). Cada cor representa a semana em que as UFC foram recuperadas: primeira semana – azul; segunda semana- vermelho; terceira semana - verde. A B
Estes dados não foram reproduzíveis no segundo experimento,
possivelmente a qualidade dos conídios varia de lote a lote e também devido à
mudança de umidade. Tendo em consideração a não reprodutibilidade destes
dados, não só pela transformação in vitro como também a sua capacidade de
transformar em co-culturas com células APC (células dendriticas e
macrófagos), não será possível chegar a uma conclusão entre os isolados
representativos das espécies, com relação a diferenças na capacidade de
transformação e geração da fase patogênica do fungo.
5.1.2.2. Efeito do peptídeo P10 in vitro na transformação e no
crescimento de Paracocccidioides spp.
Observamos que o peptídeo P10, na concentração de 4µg/ml no meio de
cultura MMcM gerou redução da porcentagem das células multibrotantes,
depois da transformação dos conídios em leveduras (1 semana de cultura) em
ambos os isolados (Pb01 e Pb60855) (Figura 6B). Já concentrações
crescentes do peptídeo P10 (4µg/ml ate 0.031µg/ml) tem um efeito diferente
sobre a recuperação das UFC destes isolados, favorecendo o crescimento de
Pb01 e retardando o de Pb60855 (Figura 6A).
Resultados 39 Martha E. Urán J.
Figura 6-A. Efeito do peptídeo P10 sobre a transformação de conídios em
leveduras. UFC obtidas com o isolado Pb60855 e Pb01.
Figura 6-B. Efeito do peptídeo P10 sobre a transformação de conídios em leveduras (características morfológicas). O gráfico abaixo indica a porcentagem de leveduras simples ou com multibrotamentos dos isolados Pb01 e Pb60855, na presença de P10 no meio de cultura à 37°C em uma relação de 100% de UFC.
Resultados 40 Martha E. Urán J.
5.2. Ensaios ex vivo: fagocitose, atividade fungicida, expressão de
moléculas de superfície e produção de citocinas em macrófagos
de camundongos selvagens (WT) ou nocautes (KO) infectados
com conídios e leveduras de Paracocccidioides spp.
5.2.1. Ensaios de Fagocitose
5.2.1.1. Fagocitose de conídios e leveduras de Paracoccidioides
brasiliensis (isolado Pb18) por citometria de fluxo.
Uma vez analisada a capacidade germinativa in vitro, foi testada a
capacidade de infecção dos conídios em macrófagos peritoneais de
camundongos da linhagem C57Bl/6 (medianamente suscetíveis à
paracoccidioidomicose) selvagens (WT) ou nocautes (KO) para algumas
moléculas de reconhecimento como TLR2, TLR4 e Dectina-1 ou moléculas
acopladoras e de ativação intracelular como MyD88 e NALP3. Neste caso
foram testados pareadamente os propágulos do isolado Pb18 devido ao fato
desse isolado ser usado na maioria das análises com células de camundongos
KO (107).
Observamos que macrófagos ativados com 20ng/ml de IFN- (107)
apresentam uma capacidade fagocítica aumentada em até 50% quando
comparados a macrófagos não ativados. Dados estes que são correlacionados
com resultados anteriores obtidos por Gonzalez (2000) para conídios
(Pb60855) e por Fierotti (2010) para leveduras (Pb18). (Figura 7.).
Resultados 41 Martha E. Urán J.
Figura 7. Fagocitose de conídios de P.brasiliensis, isolado Pb18, por macrófagos da linhagem C57BL/6 selvagens e nocautes. O ensaio de fagocitose foi realizado por citometria de fluxo e expresso como frequência percentual de células duplo-positivas para Pacific Blue (F4/80) e FITC (conídios). P < 0.05 (x), P<0.001 (xxx).
Em geral observamos que os macrófagos ativados com IFN- WT ou KO
fagocitam muito mais os conídios quando comparados com leveduras. Em
nossos estudos, observamos que, na ausência de TLR-4, a fagocitose dos
conídios é reduzida de maneira estatisticamente significativa, tanto em células
não ativadas quanto ativadas, demostrando a importância desta molécula.
Quando analisamos a fagocitose dos macrófagos WT frente aos KO para
Dectina-1, MyD88 ou NALP3 encontramos um desempenho similar quanto aos
macrófagos WT: a fagocitose aumenta quando os macrófagos são ativados
com IFN-, diferente aos MOs KO-TLR4. (Figura. 7.).
5.2.1.2. Fagocitose diferencial entre leveduras de Paracoccidioides
brasiliensis (isolado Pb18) e Paracoccidioides lutzii (isolado
Pb01) por citometría de fluxo.
Após verificar o padrão de reconhecimento de conídios e leveduras de P.
brasiliensis (isolado Pb18) por macrófagos peritoneais, comparamos se havia
Resultados 42 Martha E. Urán J.
alguma diferença entre as espécies P. brasiliensis (Pb18) e P. lutzii (Pb01). Ao
comparar a fagocitose entre as duas especies, não observamos diferenças
estatísticas quanto à fagocitose por macrófagos WT ou KO para as diferentes
moléculas. Porém, da mesma forma que os conídios, o TLR-4 parece ser a
molécula mais importante no reconhecimento tanto de Pb18 quanto de Pb01.
(Figura 8.).
Figura 8. Fagocitose de conídios e leveduras de P.brasiliensis (isolado Pb18) por macrófagos da linhagem C57Bl/6 selvagens e nocautes para TLR-2, TLR-4, dectina-1, MyD88 ou NALP3. O ensaio de fagocitose foi realizado por citometria de fluxo e os resultados obtidos foram expressos como frequência percentual de células duplo-positivas para Pacific Blue (F4/80) e FITC (conídios ou leveduras).
A diferença resultante entre a primeira e a segunda leitura de fagocitose,
sem e com quenching com azul de Trypan, respectivamente, representa as
leveduras aderidas, mas não fagocitadas. Assim, valores elevados dessa
diferença significam que a maioria das leveduras estão aderidas na membrana
e poucas foram fagocitadas. Já valores baixos ou próximos de zero indicam
que quase todas as leveduras foram fagocitadas (Figura 10.).
Quando se compara a fagocitose de Pb18 por Mos-KO não ativados por
IFN- existe diferença estatística em todos os grupos exceto em dectina, sendo
favorável na ausência de TLR-2, TLR-4, MyD88 e NALP3. Nos MO nocautes
Resultados 43 Martha E. Urán J.
para TLR-4 possivelmente ficam muitas leveduras aderidas, porém, não
fagocitadas.
Figura 9. Fagocitose de leveduras de P. brasiliensis (isolados Pb18) e P. lutzii (isolado Pb01) por macrófagos da linhagem C57BL6 selvagens e nocautes para TLR-2, TLR-4, dectina-1, MyD88 ou NALP3. O ensaio de fagocitose foi realizado por citometria de fluxo e os resultados obtidos foram expressos como frequência percentual de células duplo-positivas para Pacific Blue (F4/80) e FITC (leveduras).
Quando comparamos os MOs ativados com IFN- encontramos
diferenças significativas entre Pb18 e Pb01, sugerindo que a efetiva ativação
dos MOs selvagens favorece a fagocitose das leveduras de P. lutzii (Pb01).
Além disso, quando comparamos a fagocitose de P. lutzii por
macrófagos ativados com IFN- e nocautes para algumas moléculas,
observamos que há uma relação favorável nos NALP3-KO e desfavorável nos
TLR4 e Dectina-KO, indicando que P. lutzii precisa destes dois padrões de
reconhecimento para entrar na célula do hospedeiro.
Resultados 44 Martha E. Urán J.
Figura 10. Análise de leveduras de P. brasiliensis (Pb18) e P. lutzii (Pb01) aderidas ou fagocitadas por macrófagos peritoneais selvagens ou nocautes para TLR-2, TLR-4, dectina-1, MyD88 e Nalp3. Valor da diferença resultante entre a primeira leitura de fagocitose e a segunda com azul de Trypan (quenching do FITC) representa as células que ficaram aderidas e não fagocitadas. Portanto, os valores altos significam que há muitas células aderidas e poucas fagocitadas e valores próximos a zero significam células fagocitadas.
5.2.2. Atividade fungicida dos macrófagos de animais da linhagem
C57Bl/6, selvagens (WT) ou nocautes (KO), sobre as leveduras
de P. brasiliensis (Pb18) e P. lutzii (Pb01).
Como observado anteriormente, a adição de IFN- parece não influenciar
fortemente a fagocitose das leveduras. Para entender melhor a função da
ativação por IFN-, avaliamos a atividade fungicida dos macrófagos sobre as
leveduras das duas espécies, P. brasiliensis e P. lutzii.
Podemos observar claramente que a ativação por IFN- aumenta
significativamente a morte intracelular das leveduras pelos macrófagos dos
animais selvagens (Figura. 11). Porém, não foi observada diferença estatística
quando comparamos as espécies de Paracoccidioides spp.
Resultados 45 Martha E. Urán J.
Figura 11. Unidades Formadoras de Colônias (UFCs) recuperadas de macrófagos peritoneais de camundongos da linhagem C57Bl/6 selvagens (WT), infectados com leveduras de P. brasiliensis (Pb18) e P. lutzii (Pb01). Abaixo encontra-se a análise estatística comparando células ativadas ou não com IFN- nos isolados de Paracoccidioides spp.
SEM IFN vs COM IFN P < 0.05 Summary
WT Yeast Pb 18 P < 0.05 *
WT Yeast Pl 01 P < 0.05 *
WT Lev Pb18 vs WT lev Pb01 P < 0.05 Summary
SEM IFN P > 0.05 Ns
COM IFN P > 0.05 ns
Macrófagos não ativados de animais TLR-2 e TLR-4 KO fagocitaram com
menos eficiência as leveduras de ambos os isolados (Figura 9 e 10), mas o
desenvolvimento intracelular de leveduras de Pb18 foi eficientemente
controlado. Interessante, quando essas células são ativadas com IFN- não é
observado um controle efetivo do crescimento das leveduras intracelulares
(Figura 12 e 13). Por outro lado, parece que ambos padrões de
reconhecimento são importantes para ativar os macrófagos e conseguir
controlar as leveduras de Pb01. Para o isolado Pb01, os macrófagos dos
animais TLR-4 KO fagocitaram as leveduras com menos eficiência (Figuras 9 e
10). No entanto, o crescimento intracelular não foi controlado pelas células,
mesmo em presença de IFN- (Figura 13). É importante esclarecer que apesar
da diminuição no índice de fagocitose as leveduras de Pb01 pareciam estar
Resultados 46 Martha E. Urán J.
aderidas e não fagocitadas pelos macrófagos TLR-4 KO, o que pode explicar
também o número aumentado de UFC para este experimento.
Figura 12. Unidades Formadoras de Colônias (UFCs) recuperadas de macrófagos peritoneais de camundongos C57Bl/6 selvagens ou nocautes para TLR-2, infectados com leveduras de P. brasiliensis (Pb18) e P. lutzii (Pb01). Abaixo se encontra a análise estatística comparando os macrófagos ativados ou não com IFN- ou os isolados de Paracoccidioides spp.
WT vs TLR2 Bonferroni's Multiple Comparison Test Significant? P < 0.05? Summary
WT Yeast Pb 18-SEM IFN vs TLR2 Yeast Pb 18-COM IFN P<0.01 **
WT Yeast Pb 18-SEM IFN vs TLR2 Yeast Pl 01-SEM IFN P<0.001 ***
WT Yeast Pb 18-SEM IFN vs TLR2 Yeast Pl 01-COM IFN P < 0.05 *
WT Yeast Pb 18-COM IFN vs TLR2 Yeast Pb 18-COM IFN P<0.01 **
WT Yeast Pb 18-COM IFN vs TLR2 Yeast Pl 01-SEM IFN P<0.001 ***
WT Yeast Pb 18-COM IFN vs TLR2 Yeast Pl 01-COM IFN P < 0.05 *
WT Yeast Pl 01-SEM IFN vs TLR2 Yeast Pb 18-COM IFN P<0.01 **
WT Yeast Pl 01-SEM IFN vs TLR2 Yeast Pl 01-SEM IFN P<0.001 ***
WT Yeast Pl 01-COM IFN vs TLR2 Yeast Pb 18-COM IFN P<0.01 **
WT Yeast Pl 01-COM IFN vs TLR2 Yeast Pl 01-SEM IFN P<0.001 ***
WT Yeast Pl 01-COM IFN vs TLR2 Yeast Pl 01-COM IFN P < 0.05 *
TLR2 Yeast Pb 18-SEM IFN vs TLR2 Yeast Pb 18-COM IFN P<0.01 **
TLR2 Yeast Pb 18-SEM IFN vs TLR2 Yeast Pl 01-SEM IFN P<0.001 ***
TLR2 Yeast Pb 18-SEM IFN vs TLR2 Yeast Pl 01-COM IFN P < 0.05 *
Resultados 47 Martha E. Urán J.
Figura 13. Unidades Formadoras de Colônias (UFC) recuperadas de macrófagos peritoneais de camundongos C57Bl/6, selvagens ou nocautes para TLR-4, infectados com leveduras de P. brasiliensis (Pb18) e P. lutzii (Pb01). Abaixo se encontra a análise estatística comparando macrófagos ativados ou não com IFN- ou os isolados de Paracoccidioides spp.
WT vs TLR4 Bonferroni's Multiple Comparison Test Significant? P < 0.05? Summary
WT Yeast Pb 18-SEM IFN vs TLR4 Yeast Pl 01-SEM IFN P<0.001 ***
WT Yeast Pb 18-COM IFN vs TLR4 Yeast Pl 01-SEM IFN P<0.001 ***
WT Yeast Pl 01-SEM IFN vs TLR4 Yeast Pl 01-SEM IFN P<0.001 ***
WT Yeast Pl 01-COM IFN vs TLR4 Yeast Pl 01-SEM IFN P<0.001 ***
TLR4 Yeast Pb 18-SEM IFN vs TLR4 Yeast Pl 01-SEM IFN P<0.001 ***
TLR4 Yeast Pb 18-COM IFN vs TLR4 Yeast Pl 01-SEM IFN P<0.001 ***
TLR4 Yeast Pl 01-SEM IFN vs TLR4 Yeast Pl 01-COM IFN P<0.001 ***
Os resultados indicam que, embora a ausência de dectina-1 não reduza o
número de leveduras fagocitadas (Figuras 9 e 10), essa molécula é muito
importante para a ativação dos macrófagos e na morte intracelular de ambos
os isolados estudados (Pb18 e Pb01) na presença ou ausência de IFN- (Figura
14).
Resultados 48 Martha E. Urán J.
Figura 14. Unidades Formadoras de Colônias (UFCs) recuperadas de macrófagos peritoneais de camundongos C57Bl/6, selvagens ou nocautes para dectina-1, infectados com leveduras de P. brasiliensis (Pb18) e P. lutzii (Pb01). Abaixo se encontra a análise estatística comparando macrófagos ativados ou não com IFN- ou os isolados de Paracoccidioides spp.
WT vs DECTINA Bonferroni's Multiple Comparison Test Significant? P < 0.05? Summary
WT Yeast Pb 18-SEM IFN vs DECTINA Yeast Pb 18-SEM IFN P < 0.05 *
WT Yeast Pb 18-SEM IFN vs DECTINA Yeast Pl 01-COM IFN P<0.001 ***
WT Yeast Pb 18-COM IFN vs DECTINA Yeast Pb 18-SEM IFN P<0.01 **
WT Yeast Pb 18-COM IFN vs DECTINA Yeast Pl 01-COM IFN P<0.001 ***
WT Yeast Pl 01-SEM IFN vs DECTINA Yeast Pb 18-SEM IFN P < 0.05 *
WT Yeast Pl 01-SEM IFN vs DECTINA Yeast Pl 01-COM IFN P<0.001 ***
WT Yeast Pl 01-COM IFN vs DECTINA Yeast Pb 18-SEM IFN P<0.01 **
WT Yeast Pl 01-COM IFN vs DECTINA Yeast Pl 01-COM IFN P<0.001 ***
DECTINA Yeast Pb 18-COM IFN vs DECTINA Yeast Pl 01-COM IFN P<0.001 ***
DECTINA Yeast Pl 01-SEM IFN vs DECTINA Yeast Pl 01-COM IFN P < 0.05 *
A ausência de NALP-3 não influenciou na fagocitose (Figuras 9 e 10) e
nem na ativação dos macrófagos para eliminação intracelular das leveduras
dos dois isolados (Figura 15).
Resultados 49 Martha E. Urán J.
Figura 15. Unidades Formadoras de Colônias (UFC) recuperadas de macrófagos peritoneais de camundongos C57Bl/6, selvagens ou nocautes para NALP3, infectados com leveduras de P. brasiliensis (Pb18) e P. lutzii (Pb01). Abaixo se encontra a análise estatística comparando macrófagos ativados ou não com IFN- e isolados de Paracoccidioides spp.
WT vs NALP3 Bonferroni's Multiple Comparison Test Significant? P < 0.05? Summary
WT Yeast Pb 18-SEM IFN vs NALP3 Yeast Pl 01-COM IFN P < 0.05 *
WT Yeast Pb 18-COM IFN vs WT Yeast Pl 01-SEM IFN P<0.001 ***
WT Yeast Pb 18-COM IFN vs NALP3 Yeast Pb 18-SEM IFN P<0.01 **
WT Yeast Pb 18-COM IFN vs NALP3 Yeast Pl 01-SEM IFN P<0.01 **
WT Yeast Pl 01-SEM IFN vs NALP3 Yeast Pb 18-COM IFN P<0.01 **
WT Yeast Pl 01-SEM IFN vs NALP3 Yeast Pl 01-COM IFN P<0.001 ***
NALP3 Yeast Pb 18-SEM IFN vs NALP3 Yeast Pb 18-COM IFN P < 0.05 *
NALP3 Yeast Pb 18-SEM IFN vs NALP3 Yeast Pl 01-COM IFN P<0.001 ***
NALP3 Yeast Pb 18-COM IFN vs NALP3 Yeast Pl 01-SEM IFN P<0.01 **
NALP3 Yeast Pl 01-SEM IFN vs NALP3 Yeast Pl 01-COM IFN P<0.001 ***
Embora os macrófagos dos animais MyD88-KO tenham apresentado uma
melhor eficiência na fagocitose das leveduras do isolado Pb18 (Figuras 8 e 9),
o crescimento intracelular não foi controlado na presença de IFN- (Figura 16).
Já macrófagos de animais MyD88-KO infectados com Pb01 apresentaram o
mesmo comportamento que os macrófagos selvagens ativados ou não com
IFN- (Figura 16).
Resultados 50 Martha E. Urán J.
Figura 16. Unidades Formadoras de colônias (UFCs) recuperadas de macrófagos peritoneais de camundongos C57Bl/6, selvagens ou nocautes para MyD88, infectados com leveduras de P. brasiliensis (Pb18) e P. lutzii (Pb01). Abaixo se encontra a análise estatística comparando macrófagos ativados ou não com IFN- ou os isolados de Paracoccidioides spp.
5.2.3. Expressão de moléculas de superfície de macrófagos
peritoneais selvagens (WT) e nocautes (KO) em cultura celular.
5.2.3.1. Receptores de reconhecimento de padrões (PRR), dectina,
receptores de manose, TLR-2 e TLR-4
Nas culturas de macrófagos WT (F4/80+/CD11b+) ativados ou não com
IFN- e infectados com conídios ou leveduras de Pb18 ou leveduras de Pb01, foi
encontrado maior porcentagem de células simples positivas para dectina-1,
população intermediária duplo-positivos para dectina-1 e receptor de manose, e
a menor população encontrada expressava somente receptores de manose.
Este efeito não foi modulado pela adição de IFN- (Figura 17).
Resultados 51 Martha E. Urán J.
Figura 17. Expressão de dectina-1 e receptor de manose em macrófagos peritoneais (F4/80+/CD11b+) de camundongos C57Bl/6 selvagens (WT) ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras de Pb18 e Pb01 ou conídios de Pb18.
Por outro lado, nas células infectadas tanto por conídos quanto por
leveduras, observou-se uma maior população simples positiva para TLR-2,
uma população intermediária duplo-positiva para TLR-2 e TLR-4, e uma
pequena população expressando apenas TLR-4 (Figura 18).
5.2.3.2. Expressão de moléculas em macrófagos peritoneais
selvagens (WT) infectados ou não com leveduras de Pb18 e
Pb01
Os resultados indicam que a frequência dos macrófagos WT
(F4/80+/CD11b+), TLR2+, TLR4+ ou Dectina1+ não apresentaram diferença
quando foram infectados com Pb18 ou de Pb01 (Figura 19 A, B e C). Quando
comparamos a expresão em células ativadas ou não com IFN-γ vemos que
somente as células (F4/80+/CD11b+) e Dectina1+ estiveram aumentadas
quando ativadas com IFN-γ (Figura 19 C). Já a expressão de TLR2 e TLR4 não
sofreu alteração em porcentagem, porém, o TLR2 teve diferenças quando
analisado por FMI (Figura 19 A).
Resultados 52 Martha E. Urán J.
Figura 18. Expressão de TLR-2 e TLR-4 em macrófagos peritoneais (F4/80+/CD11b+) de camundongos C57Bl/6 selvagens (WT), ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras Pb18 e Pb01ou conídios de Pb18.
5.2.3.3. Moléculas de apresentação antigênica (MHC de classe II) e
co-estimuladoras (CD80 e CD86).
Observamos que a porcentagem de macrófagos peritoneais
(F4/80+/CD11b+) de camundongos C57Bl/6 selvagens (WT) ativados com IFN-
e que expressam MHC de classe II foi maior em macrófagos infectados, tanto
com conídios de Pb18 quanto com leveduras de Pb18 e Pb01 (Figura 20).
Em relação às moléculas co-estimuladoras CD80 e CD86 encontramos
uma população duplo-positiva maior nas células ativadas com IFN-,
independente da infecção (levedura ou conídio) ou da espécie do fungo (Figura
21).
Na população de células simples-positivas para CD80 encontramos
aumento no grupo infectado com leveduras de Pb18 e Pb01 em relação aos
conídios de Pb18. Acreditamos que o estímulo com IFN- reduz a expressão de
CD80, mas ainda mantém a mesma proporção entre leveduras e conídios
(Figura 21). Na população de células simples-positivas para CD86 observamos
aumento na expressão desta molécula na presença de IFN-. Contudo, não há
diferenças significativas entre conídios e leveduras (Figura 21).
Resultados 53 Martha E. Urán J.
Figura 19. Expressão de TLR-2 (A), TLR-4 (B) e Dectina-1 (C) em macrófagos
peritoneais (F4/80+/CD11b+) de camundongos C57Bl/6 selvagens (WT),
ativados ou não com IFN-, incubados com leveduras de Pb18 e Pb01.
A- Expressão de TLR2
B- Expresão de TLR4
C- Expresão de Dectina-1
Resultados 54 Martha E. Urán J.
Figura 20. Expressão de MHC de classe II em macrófagos peritoneais (F4/80+/CD11b+) de camundongos C57Bl/6 selvagens (WT) (F4/80+/CD11b+) ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras (Pb18 e Pb01) ou conídios de Pb18.
Figura 21. Expressão de CD80 e CD86 em macrófagos peritoneais (F4/80+/CD11b+) de camundongos C57Bl/6 selvagens (WT) ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras de Pb18 e Pb01 ou conídios de Pb18.
Quando analisamos a expresão de moléculas de MHC de classe II por
macrófagos (F4/80+/CD11b+), tanto em selvagens (WT) como em nocautes
(KO), ativadas ou não com IFN-γ e infectada com leveduras das duas espécies
Resultados 55 Martha E. Urán J.
de Paracoccidioides spp., encontramos que a expressão de MHC de classe II
está reduzida nos macrófagos nocautes para TLR-2 e Dectina-1, tanto em
porcentagem como na intensidade média da fluorescência (Figuras 22 A - B).
Em relação às moléculas co-estimuladoras CD80 e CD86 observamos
que macrófagos nocautes para MyD88 e NALP3 apresentaram um aumento
significativo da população duplo-positiva, quando comparadas com os demas
macrófagos testados, independente da ativação e do tipo de infecção. O
mesmo perfil foi encontrado quando foi analisada a intensidade média de
fluorescência das mesmas (dados não mostrados).
Figura 22. Porcentagem de células (A) e Intensidade média da fluorescência (FMI) (B) de MHC de classe II em macrófagos peritoneais (F4/80+/CD11b+) de camundongos C57Bl/6 selvagens (WT) e nocautes (KO), ativadas ou não com IFN- e infectados com as duas espécies de Paracoccidioides spp.
A - Porcentagem de células que expressam moleculas de MHC de classe II
Resultados 56 Martha E. Urán J.
B - Intensidade media da fluorescência (FMI) de moléculas de MHC de classe II
Figura 23. Porcentagem de células que expressam CD80 e/ou CD86 em macrófagos peritoneais (F4/80+/CD11b+) de camundongos C57Bl/6 selvagens (WT) e nocautes (KO), ativados ou não com IFN-, e infectados com duas espécies de Paracoccidioides spp.
5.2.4. Produção de citocinas no sobrenadante de culturas de
macrófagos peritoneais selvagens (WT) e nocautes (KO),
ativados ou não com IFN- e infectados ou não com leveduras de
Pb18 e Pb01 e conídios de Pb18.
As citocinas foram detectadas no sobrenadante de culturas de
macrófagos selvagens (WT) e nocautes (KO), ativadas ou não com IFN-, e
Resultados 57 Martha E. Urán J.
incubados junto com leveduras (Pb18 e Pb01) ou conídios (Pb18) por 36 horas.
Estes sobrenadantes correspondem a três experimentos independentes, os
quais foram realizados em paralelo com aqueles de análise de UFC e
expressão das moléculas de membrana. Portanto, é possível inferir uma
relação direta da expressão das citocinas com a morte do fungo.
5.2.4.1. Produção de IFN-gama
Na análise da produção de IFN- nos sobrenadantes das culturas dos MOs
WT observamos que os conídios têm maior capacidade de induzir expressão
de IFN- do que as leveduras e que não existe diferença de produção desta
citocina entre o controle e os macrófagos infectados com as duas espécies de
leveduras de Paracoccidioides spp. (Figuras 24 A e B). Já em relação aos
nocautes, somente os MOs Dectina-1-KO apresentaram um aumento na
expressão de IFN- acima do expressado pelos MO Dectina-1-KO não
infectados, porém sem diferença entre as partículas com que foram infectados,
nem comparado com os MO WT. Este dado sugere que a mesma célula pode
estar induzindo um aumento da expressão do IFN- para ter um feedback
positivo de ativação sobre ela mesma (Figura 24B).
Resultados 58 Martha E. Urán J.
Figura 24 A. Produção de IFN- no sobrenadante de cultura de MOs WT ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras (Pb18 e Pb01) ou conídios (Pb18). A B
Figura 24 B. Produção de IFN- no sobrenadante de cultura de MOs Dectina-KO ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras (Pb18 e Pb01) ou conídios (Pb18).
5.2.4.2. Produção de GM-CSF
A infecção com leveduras de P. lutzii consegue aumentar a produção de
GM-CSF nos sobrenadantes dos MOs WT ativados com IFN- e, quando
analisadas outras co-culturas, encontramos uma diminuição da produção desta
Resultados 59 Martha E. Urán J.
citocina com relação ao controle WT, porém, com níveis aumentados em
relação aos controles não infectados dos respectivos MO-KO testados (Figura
25).
Figura 25. Produção de GM-CSF no sobrenadante de cultura de MOs WT ativados ou não com IFN- e incubados com (A) conídios vs leveduras (Pb18) ou (B) leveduras (Pb18 vs Pb01). A B
5.2.4.3. Produção de IL-6
Os conídios de Pb18 conseguiram diminuir a produção de IL-6 nas co-
culturas de MO-WT (Figuras 26 A). De modo similar, quando MO Dectina-1-KO
são infectados, a redução desta citocina está presente nos macrófagos
ativados deste KO quando comparados aos infectados com as leveduras
(Figuras 26 B).
Resultados 60 Martha E. Urán J.
Figura 26 A. Produção de IL-6no sobrenadante de cultura de MOs WT ativados ou não com IFN- e incubados com (A) conídios vs leveduras (Pb18) ou (B) leveduras (Pb18 vs Pb01). A B
Figura 26 B. Produção de IL-6 no sobrenadante de cultura de MOs Dectina-1-KO ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras (Pb18 e Pb01) ou conídios (Pb18).
Resultados 61 Martha E. Urán J.
5.2.4.4. Produção de TNF-α
Os conídios de Pb18 conseguiram aumentar a produção de TNF-α nas
co-culturas de MO-WT e os níveis desta molécula não variaram com relação ao
controle sem infecção quando as células foram infectadas com leveduras.
(Figuras 27 A).
Já nos MO nocautes para TLR-2 ou Dectina-1, os conídios conseguiram
induzir uma alta produção de TNF-α. Já as leveduras de P. lutzii conseguiram
atingir esses valores somente quando infectam MO TLR2-KO. Resultado
oposto foi obtido com MO Dectina-1-KO. As leveduras de Pb18 não pareceram
induzir nenhuma variação em qualquer das culturas de MO (Figuras 27 A e B).
Figura 27 A. Produção de TNF-α no sobrenadante de cultura de MOs WT ativados ou não com IFN- e incubados com (A) conídios vs leveduras (Pb18) ou (B) leveduras (Pb18 vs Pb01). A B
Resultados 62 Martha E. Urán J.
Figura 27 B. Produção de TNF-α no sobrenadante de cultura de MOs nocautes para TLR-4 ou Dectina-1, ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras (Pb18 e Pb01) ou conídios (Pb18).
5.2.4.5. Produção de IL-1
A produção de IL-1 foi regulada positivamente pela infecção por conídios
e leveduras, tanto nos MOs selvagens quanto nos nocautes, sem muita
diferença quando ativados ou não com IFN- (Figuras 28), com exceção dos MO
TLR2-KO que apresentaram uma baixa produção desta citocina.
Resultados 63 Martha E. Urán J.
Figura 28. Produção de IL-1 no sobrenadante de cultura de MOs WT
ativados ou não com IFN- e incubados com (A) conídios vs leveduras (Pb18)
ou (B) leveduras (Pb18 vs Pb01).
A B
5.2.4.6. Produção de IL-10
Esta citocina está presente apenas quando cultivos de macrófagos WT
não ativados com IFN- são infectados com leveduras de Pb01. Nas demais co-
culturas, os níveis desta citocina não superam os níveis dos controles, exceto
nos macrófagos de NALP3-KO, onde se nota um aumento de produção
(Figuras 29).
Figura 29. Produção de IL-10 no sobrenadante de cultura de MOs WT ativados ou não com IFN- e incubados com (A) conídios vs leveduras (Pb18) ou (B) leveduras (Pb18 vs Pb01). A B
Resultados 64 Martha E. Urán J.
5.2.4.7. Produção de IL-12p70
Os níveis desta citocina foram aumentados quando macrófagos WT foram
infectados com conídios e leveduras de Pb18. Porém, a infecção por P.lutzii
reduziu a produção desta citocina (Figuras 30 A). Já em macrófagos de TLR4-
KO a produção de IL-12p70 foi aumentada com conídios e leveduras de Pb01,
e em MOs Dectina-KO esta citocina esteve aumentada quando a infecção foi
realizada com leveduras de Pb18 (Figuras 30 B).
Figura 30 A. Produção de IL-12p70 no sobrenadante de cultura de MOs WT ativados ou não com IFN- e incubados com (A) conídios vs leveduras (Pb18) ou (B) leveduras (Pb18 vs Pb01). A B
Resultados 65 Martha E. Urán J.
Figura 30 B. Produção de IL12p70 no sobrenadante de cultura de MOs TLR-2 e Dectina-1-KO ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras (Pb18 e Pb01) ou conídios (Pb18).
Outras citocinas foram detectadas nos sobrenadantes de culturas de
macrófagos infectados somente com os isolados de Paracoccidioides spp. De
maneira interessante, o MIP-2 foi produzido somente quando os macrófagos,
não ativados, são infectados pelas duas espécies de Paracoccidioides spp.
(Figura 31) e a IL12p40 está aumentada, sem importar a ativação com IFN- ou
a levedura com que foram infectados.
Figura 31. Produção de MIP-2 no sobrenadante de cultura de macrófagos WT ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras (Pb18 e Pb01).
Resultados 66 Martha E. Urán J.
Figura 32. Produção de IL-12p40 no sobrenadante de cultura de MOs WT ativados ou não com IFN- e incubados com leveduras (Pb18 e Pb01).
5.3. Ensaios in vivo, desenvolvimento de um modelo experimental
em camundongo com Paracoccidioides lutzii – isolado Pb01.
5.3.1. Determinação do número total de Unidades Formadoras de
Colônia no macerado de pulmão.
Foi possível recuperar UFC apenas nos macerados de pulmões dos animais
infectados até a primeira semana pós-infeção. Posteriormente a esse tempo,
não se obteve crescimento das mesmas em cultura (Figura 33). É interessante
observar que já nas 48horas pós-infecção, havia redução de dez vezes na
contagem inicial de CFU e que esta diminuição continuou até o dia 7, chegando
a valores próximos de zero na recuperação do fungo nos macerados. Foi
obtida diferença estatística significativa quando se comparam todos os tempos.
Resultados 67 Martha E. Urán J.
Figura 33. Determinação do número total de Unidades Formadoras de Colônia no macerado de pulmão de camundongos C57BL6 infectados intratraquealmente com 1x106 leveduras viáveis de P. lutzii isolado Pb01.
Comparações multiples de Bonferroni P < 0.05? Valoração
0hs (3-6hs) vs 48hs (2d) Yes ***
0hs (3-6hs) vs 96hs (4d) Yes ***
0hs (3-6hs) vs 168hs (7d) Yes ***
5.3.2. Determinação de citocinas em lavado broncoalveolar (LBA) e no macerado de pulmão.
Para entender melhor o comportamento de citocinas no modelo e compará-las
com a carga fúngica, este foi dividido em duas partes: a fase aguda, que vai
desde 0hs (3-6hs) pós-infeção até a primeira semana; e a segunda fase, que
poderíamos denominar de fase de resolução (pela ausência de UFC), sendo
esta fase tardia, indo desde a quarta semana até a semana 12 pós-infecção.
Resultados 68 Martha E. Urán J.
5.3.2.1. Fase aguda do modelo experimental (0hs até 1 semana pós-
infecção).
Neste período foram encontrados níveis muito altos de citocinas pró-
inflamatórias, como a IL-6, IFN-, TNF-α, MCP-1 e MIP-2, sendo os níveis mais
altos encontrados no LBA. Para o macerado de pulmão, encontramos em
ordem de início de detecção, o MCP-1, IL-6, TNF-α e MIP-2. É importante
destacar que o IFN- somente foi produzido a níveis importantes no LBA,
indicando que esta molécula predomina diferencialmente no alvéolo como local
de entrada. Este fato nos leva a pensar que nesse primeiro local, onde as
células devem se ativar para fagocitar as leveduras que atingiram os alvéolos.
No LBA, a citocina com maior aumento foi a IL-6 que, como se sabe, é
produzida pelos macrófagos e pode se difundir aos tecidos com facilidade,
aumentando a resposta inflamatória local. É interessante notar que a primeira
citocina com detecção de aumento majoritário do tecido pulmonar foi à
quimiocina MCP-1 que recruta monócitos, células dendríticas e células T de
memória, que amparam o local de inflamação (Figura 34.).
Figura 34. Produção de citocinas de perfil pró-inflamatório em LBA e macerado de pulmão de camundongos C57BL6 infectados com 1x106 leveduras viáveis de P. lutzii (isolado Pb01), no período agudo (0hs até 1sem pós-infecção). A. mostra o perfil de citocinas no LBA e B. mostra o perfil em macerado de pulmão.
Resultados 69 Martha E. Urán J.
5.3.2.2. Fase tardia ou de resolução do modelo experimental (4 a 12
semanas pós-infecção).
5.3.2.2.1. Determinação em macerado de pulmão
Em geral, e como resumo do perfil de citocinas no macerado de pulmão,
observamos que as citocinas que foram determinadas se agruparam em três
para o período tardio, isso quando analisadas só aquelas que apresentaram
estatística significativa. O primeiro grupo foi representado por citocinas que
começaram com níveis baixos e foram aumentando ao longo do experimento
(GM-CSF, TNF-α, IFN-, MIP-2, IL12p70, IL-23) (Figura 35, A, B, C, D, E, F e
Figura 36). O segundo, apresentou aquelas que aumentaram no início,
diminuiram entre a primeira e segunda semana e, finalmente, aumentaram em
seguida (IL12p40, IL-1, IL-10, IL-6, IL-4) (Figura 35, G, H, I, J, K e Figura 35). O
último grupo só apresentou uma citocina como representante, o MCP-1 (Figura
35 - L), que teve a sua máxima expressão às 48 horas pós-infeção e foi
diminuindo gradualmente no transcorrer dos tempos estudados (Figura 36).
Resultados 70 Martha E. Urán J.
Figura 35. Níveis de citocinas no macerado de pulmão de camundongos C57BL6 infectados com 1x106 leveduras viáveis de P. lutzii isolado Pb01. Valores de P<0.001 (***), P<0.01 (**) e P < 0.05 (*).
Resultados 71 Martha E. Urán J.
Figura 36. Esquema representativo do perfil de citocinas no macerado de pulmão de camundongos C57BL6 infectados com 1x106 leveduras viáveis de P. lutzii isolado Pb01, avaliados de 0h até 12 semanas pós-infecção.
5.3.2.2.1. Determinação em lavado broncoalveolar (LBA)
Considerando os níveis de citocinas no LBA, não foi obtido um perfil
característico no período tardio. Para a MCP-1, foi visto que estava aumentado
na fase inicial, diminuiu na 4ª semana e logo aumentou novamente na 8ª
semana. Mas, vale ressaltar que a GM-CSF foi a citocina que teve os maiores
níveis quando mensurada à 0hs. É importante ressaltar que o período de
0horas correspondeu ao período de 3-6 horas devido ao fato de que a infecção
dos camundongos é realizada por cirurgia e inoculação intratraqueal, os
camundongos devem se recuperar da inoculação e da anestesia para depois
se realizar o sacrifício. Portanto, o valor de 0hs corresponderia ao que
verdadeiramente corresponde ao experimento in vitro de fagocitose (6 horas)
pelo qual não é estranho que algumas citocinas se expressem rapidamente em
resposta ao inóculo e à fagocitose inicial. Após este período, os níveis de GM-
CSF diminuem subitamente, possivelmente como resposta à alta carga de
citocinas pró-inflamatória no LBA e no tecido, porém os níveis aumentaram
novamente e são mantidos até a semana 12 (Figura 37).
Resultados 72 Martha E. Urán J.
Figura 37. Niveis de citocinas no lavado broncoalveolar (LBA) de camundongos C57BL6 infectados com 1x106 leveduras viáveis de P. lutzii isolado Pb01. Valores de P<0.001 (***), P<0.01 (**) e P < 0.05 (*).
Resultados 73 Martha E. Urán J.
5.3.3. Análise histopatológica
Nossos resultados indicaram que a infecção dos animais foi eficiente, pois
encontramos as leveduras nos pulmões dos animais C57Bl/6 após 3 horas de
infecção. No segundo dia, observamos uma resposta inflamatória que atingiu
mais de 50% da área pulmonar. Este infiltrado inflamatório parece reduzir-se e
ficar mais definido nas áreas peribronco-vascular, após 7 dias de infecção
(Figura 38). Os animais foram analisados após 12 semanas de infecção e
avaliada a presença de infiltrado granulomatoso nos pulmões.
5.3.3.1. Verificação do caráter infeccioso dos conídios de P. lutzii no
modelo experimental e análise dos tempos tardios.
Na verificação do modelo in vivo como o modelo clássico de conídios de
Pb60855, os nossos camundongos C57Bl/6 foram infectados por via intranasal
com 1x106 conidios de Pb01, conforme descrito previamente (20, 100, 105). Os
animais foram sacrificados em câmara de CO2 após 12 semanas de infecção.
Os tecidos de pulmões, fígado e baço foram removidos para serem
incorporados em blocos de parafina, cortados e corados com hematoxilina-
eosina e submetidos à análise histológica.
Conforme o previsto, a infecção com leveduras indicou uma resposta
mais homogênea em relação ao infiltrado inflamatório nos tecidos dos animais,
neste mesmo período de estudo, 12 semanas (Figura 39). Em relação aos
camundongos infectados com conídios, os tecidos desses animais após 12
semanas apresentaram resposta altamente diversa. Este resultado é esperado,
pois, no caso dos conídios eles precisam transformar-se em leveduras para
causar a doença. Observamos pulmões com pouco infiltrado inflamatório e
grandes áreas preservadas até granulomas frouxos ou compactados, ou centro
fúngico ativo (Figura 40).
Resultados 74 Martha E. Urán J.
Figura 38: Corte histológico, corado por HE ou Grocott, de pulmão de camundongos C57Bl/6 infectados com 1x106 leveduras de Pb01 pela via intratraqueal.
Resultados 75 Martha E. Urán J.
Figura 39. Cortes histológicos de pulmão de Camundongos BALB/c, C57Bl/6 e B10/A infectados por via intranasal com 1x106 conídios de P. brasiliensis (Pb60855) e sacrificados após 12 semanas de infecção (n=3). Animais controles foram inoculados, também por via intranasal, com 60 ul de cloreto de sódio (figura não mostrada). Lâminas foram coradas por HE.
Resultados 76 Martha E. Urán J.
Figura 40. Cortes histológicos de pulmão de Camundongos C57Bl/6 foram infectados por via intranasal com 1x106 conídios de P. lutzii – Pb01 e sacrificados após 12 semanas de infecção. Cada corte histológico de pulmão representa um camundongo (n=5) - linhas 1 e 2. Na linha 3, os cortes histológicos de pulmão de camundongos C57Bl/6 utilizados como controles e inoculados, também por via intranasal, com 60 ul de cloreto de sódio. Lâminas foram coradas por HE.
Discussão 77 Martha E. Urán J.
6. DISCUSSÃO
6.1. Culturas e purificação dos propágulos.
Apesar das dificuldades encontradas, foi possível purificar, pela primeira
vez, usando o meio quimicamente definido (ágar água dextrose e sais), os
conídios do isolado Pb18 e Pb01-like (P. lutzii – atualmente considerada uma
nova espécie) (Figura 1). Apesar de outros pesquisadores já terem descrito a
capacidade de esporulação dos isolados de Pb18 e Pb01-like (15, 110), esses
testes foram realizados no meio Soil Extract Agar (SEA) (111) ou ágar batata,
os quais não são meios apropriados para a produção em escala de conídios a
serem usados em experimentação ex-vivo ou in vivo.
Embora seja possível produzir conídios das diferentes espécies de
Paracoccidioides e propágulos (conídios ou leveduras) de P. lutzii, que
apresentam um tamanho relativamente maior quando comparados aos isolados
do clado S1 (Pb18), estes dados morfológicos não permitem fazer
caracterização de espécies, tal como foi demonstrado em trabalhos
preliminares (110, 112). Portanto, trabalhos focados neste sentido podem
ajudar na diferenciação de espécies que no momento apenas pode ser feita
através de metodologias moleculares ou por proteômica.
Apesar de ter estabelecido o sistema de produção de conídios de P.
brasiliensis e P. lutzii, foi observado que o controle de umidade é um fator
relevante para o crescimento adequado do fungo e que as condições
ambientais não controladas junto com as mudanças de umidade relativa do ar
no decorrer do ano, tem uma influência direta sobre o crescimento do bolor e
na produção dos conídios. Estes dados podem ser comparados com os dados
eco-epidemiológicos reportados por Barrozo LV, 2009 e 2010 (36, 113), já que
os locais com alta umidade relativa, abundância de vegetação, índice de
precipitação elevada e permeabilidade do solo associada a cursos de água são
considerados fatores favoráveis para a esporulação e dispersão aérea do
fungo.
Discussão 78 Martha E. Urán J.
6.2. Efeito do P10 in vitro sobre a transformação e o crecimento de
Paracocccidioides spp.
De acordo com o estudo de Sano, 1993 (114), que mostra que para
melhorar o crescimento fúngico em UFC foi adicionado sobrenadante de
cultura do isolado Pb192, considerado de baixa virulência em modelos animais.
É importante ressaltar que nestes filtrados encontram-se proteínas
extracelulares como gp43, enzimas e outros compostos do próprio meio de
cultura.
Também, sabe-se que a gp43 é uma molécula envolvida na adesão às
células do hospedeiro (115), e que o P10 não só tem efeito imunomodulador na
PCM, no modelo em camundongos, mas também no melanoma (Filipe
Menegatti de Melo, Manoela Tiago dos Santos e Elaine Guadalupe Rodrigues,
comunicação pessoal). Considerando que o fungo é também uma célula
eucariótica e que o P10 é um fragmento importante da gp43, levantamos a
hipótese de que esta molécula provavelmente poderia ter outras implicações no
“Quorum sensing” ou na formação de biofilmes do fungo, temas que ainda não
foram bem examinados.
6.3. Ensaios de fagocitose de propágulos de Paracoccidiodes spp.
Observamos que a fagocitose dos conídios, pela metodologia de
citometria de fluxo, apresenta um perfil igual ao descrito por Gonzales
(2003)(100), utilizando macrófagos peritoneais residentes, da linhagem
BALB/c, ativados com 50U/ml de IFN-, e usando o isolado de P. brasiliensis
60855. Porém, a capacidade fagocítica dos macrófagos de linhagens selvagem
medianamente suscetíveis (C57Bl/6 e BALB/c), são mais eficientes quando
ativados com IFN-. Por outro lado, esta capacidade não distingue entre os
propágulos infectantes com os quais foram infectados (leveduras ou conídios),
nem o tipo de isolado (Pb18, Pb60855 e Pb01). Estes dados devem ser
correlacionados com a capacidade fungicida dos macrófagos, quando a
Discussão 79 Martha E. Urán J.
medição de UFC se refere, devido ao fato dos dados prévios não serem
suficientes, nem conclusivos estatísticamente.
Demonstrou-se que na fagocitose dos conídios do isolado Pb18, o TLR4
é uma molécula importante para acessar na célula. No entanto, outras
moléculas de reconhecimento testadas como o TLR2 e Dectina, e que o
acoplador intracelular MyD88 não interferem no processo de reconhecimento
inicial dos conídios. Porém, os conídios são fagocitados com maior facilidade
pelos macrófagos dos animais KO em comparação com as leveduras de Pb18.
Da mesma forma que para os conídios, o TLR4 parece estar envolvido no
reconhecimento tanto de leveduras de Pb18 como de Pb01-like e não há
diferença no reconhecimento entre as espécies de P. brasiliensis e P. lutzii
pelos macrófagos testados.
Quando comparada a fagocitose de P. lutzii em células ativadas com IFN,
observa-se uma significância estatística favorável nos animais NALP3-KO e
desfavorável nos camundongos TLR4 e Dectina-KO, indicando que
provavelmente P. lutzii precisa destes padrões de reconhecimento para entrar
na célula do hospedeiro.
6.4. Atividade fungicida dos macrófagos de animais C57Bl/6
selvagens (WT) ou nocautes (KO) sobre propágulos de
Paracoccidioides.
Os padrões de reconhecimento TLR2 e TLR4 são importantes na
fagocitose das leveduras de ambos isolados, enquanto que, aparentemente, os
macrófagos de TLR4 permanecem com as leveduras aderidas na membrana,
porém, não fagocitadas. Em relação à contenção do desenvolvimento das
leveduras encontramos que TLR2, TLR4 e dectina são importantes fatores para
ativação de mecanismos que controlam o crescimento das leveduras, sendo a
dectina o mais importante, devido a que não se consegue o controle das CFU
nem na prescença de IFN-. No caso dos MOs TLR2 e TLR4-KO, os
macrófagos não ativados conseguem controlar a infecção de Pb18, mas não de
Pb01.
Discussão 80 Martha E. Urán J.
Os nossos resultados demonstraram que tanto a fagocitose como a morte
intracelular dependem de TLR-4 para o isolado Pb18, assim como de MyD88,
sugerindo que esse adaptador esteja sendo movimentado pela ativação de
outro TLR nessas células. A morte intracelular das leveduras depende também
da ativação de dectina. Embora os macrófagos KO para MyD88 e NALP3
apresentem uma menor capacidade fagocitica, eles conseguem controlar o
crescimento das leveduras tanto quanto os MOs selvagens. O MyD88 é uma
proteína intracelular, adaptador universal, para quase todos os TLR (com
exceção de TLR-3) para ativar o fator de transcrição NF-kB, que é importante
para a regulação da resposta imune. Nossos dados mostram que MyD88 é
fundamental na contenção do crescimento intracelular do fungo e está
correlacionado com os resultados prévios mostrados por outros autores (40,
42).
6.5. Expressão de moléculas de superfície de macrófagos WT e KO,
em cultura celular.
Não foram detectadas diferenças entre conídios e leveduras de P.
brasiliensis – Pb18 e P. lutzii – Pb01-like sobre a expressão de receptores de
reconhecimento de padrões, TLR-2 e TLR-4, dectina ou manose, em
macrófagos de camundogos C57Bl/6 infectados. Por outro lado, para a
expressão de moléculas envolvidas na apresentação de antígenos (MHC II,
CD80 e CD86) pelas células infectadas com conídios ou leveduras de ambos
isolados, foi observada uma diminuição da expressão em porcentagem, assim
como, em intensidade média de fluorescência de moléculas MHC classe II nos
MOs TLR2 e Dectina-KO, enquanto que a expressão de moléculas co-
estimuladoras CD80+/CD86+ somente aumentou nos MOs MyD88 e NALP3-
KO.
Embora os MOs MyD88 e NALP3-KO apresentam uma fagocitose
diminuída, eles conseguiram reduzir o número de UFC e expressar mais
moléculas de reconhecimento de padrões e também MHC e moléculas
coetimulatorias CD80+CD86+.
Discussão 81 Martha E. Urán J.
Além de não atingir uma adequada fagocitose do fungo, os MOs de TLR2 e
Dectina-KO não reduziram o número de UFC das leveduras fagocitadas, nem
expressão de moléculas de apresentação antigênica MHC classe II e
moléculas co-estimuladoras CD80+/CD86+, que são fatores importantes para a
entrada, contenção e apresentação do fungo pelos macrófagos.
6.6. Produção de citocinas no sobrenadante de culturas de MO
Os conídios de Pb18 mostraram ser um forte indutor de IFN-, TNF-alfa e
IL12p70 nos cultivos de MO-WT depois de 36hs de incubação, além do
aumento na expressão de algumas moleculas, foi possível a diferenciação de
leveduras de P. brasiliensis e P. lutzii (Tabela 6). Isto sugere que os conídios
estão induzindo o aumento da expressão dessas moléculas nos MOs, que
poderia ter um efeito feedback positivo mesmo sobre células ou para ativação,
recrutamento ou amadurecimento de outras células sobre seu entorno. É
conhecido que TNF-α e IFN- são potentes ativadores da resposta imune aguda
e da reação inflamatória, ativação do sistema complemento, ativação do
endotélio vascular, liberação de óxido nítrico e aumento da permeabilidade, o
que leva a uma dilatação e aumento da permeabilidade vascular, que conduz
ao recrutamento de outras células inflamatórias. IL12p70, além de estimular a
producção IFN-γ e TNF-α por outras células como as natural killer (NK),
também participa na diferenciação de células T native em células Th1. E
paralelamente, os conídios conseguem diminuir a quantidade de IL-6, além por
baixo dos valores das células não infectadas ativadas ou não com IFN-γ, sendo
este outro dos dados diferenciais entre a infecção com conídios e leveduras.
Portanto, a deficiência dos fatores testados com os MOs nocautes
demonstram que os padrões de reconhecimento de patógenos são moléculas
importantes para a ativação dos MOs, e que na ausência destas, os níveis de
TNF-αe IFN- não são produzidos nos mesmos níveis como os MOs WT,
quando infectados com conídios ou leveduras fungo.
Com relação às diferenças entre P. lutzii e P. brasiliensis observamos que
a infecção dos macrófagos com P. lutzii levou a um incremento dos níveis de
IL-10 e GM-CSF.
Discussão 82 Martha E. Urán J.
Outro dado relevante foi o fato de que a IL-1 esteve regulada
positivamente em todos os cultivos e com os diferentes tipos de infecção ou
ativação, em maior o menor grau, exceto nos MO TLR2-KO, portanto a
presença de TLR2 na infecção pode estar regulando positivamente o aumento
da IL-1.
Tabela 6. Resumo geral sobre a produção de citocinas no sobrenadante de culturas de MO quando infectados com conídios ou leveduras de Paracoccidioides spp.
As setas indicam aumento ou diminuição de uma ou várias vezes o valor
quando comparados com os níveis de citocinas de MO/WT não infectado. Entre
parenteses se explica se a mudança foi a uma condição especifica de ativação.
N/A=quando a citocina não foi determinada.
Discussão 83 Martha E. Urán J.
6.7. Modelo Experimental em Paracoccidioides lutzii
A maioria dos estudos em P. lutzii tem sido focados em análises
moleculares de genética ou em outros casos, na geração de novos antígenos
para melhorar o diagnóstico sorológico da doença. Neste estudo exploramos
um modelo experimental, em camundongos, que mostra pela primera vez o
perfil imunológico da doença experimental e como pode estar modulando
diferentes aspectos da doença.
Nosso grupo tentou realizar a infecção com diferentes inóculos e vias de
administração de Pb01-like em camundongos BALB/c, porém sem sucesso.
Quando utilizamos a linhagem C57Bl/6, que também é considerada
intermediária no modelo de sucetibilidade ao fungo, conseguimos estabelecer a
doença e iniciar o estudo com leveduras e conídios de P. lutzii – Pb01-like, na
concentração de 1x106 leveduras (intratraqueal) ou conídios (intranasal).
Estes primeiros fatossobre o modelo de P. lutzii é importante para poder
determinar se realmente existem diferenças na indução da doença pelas duas
espécies reportadas de Paracoccidioides spp.
Encontramos no perfil agudo (3hs, 2, 4 e 7 dias) um infiltrado
inflamatório similar ao reportado por outros autores (48, 100), quando
infectados com leveduras ou conídios em camundongos suscetíveis,
intermediários ou resistentes.
É interessante porque, comparativamente com os modelos animais de
Paracoccidioides, tanto infectados com conídios como com leveduras, os níveis
de UFC diminuiram também perto da primeira ou segunda semanas pós-
infecção, porém voltam a aparecer na 8a ou 12ª semana de infecção. Com isso,
podemos sugerir que a infecção por 1x106 leveduras viáveis de P. lutzii é
controlada efetivamente antes da segunda semana pós-infecção.
Encontramos os níveis de citocinas, quando determinadas no LBA,
aumentados e estatisticamente significativos na fase aguda, dados similares
estiveram presentes nos tempos agudos da doença na comparação com os
resultados reportados em P. brasiliensis (48, 100).
Nas citocinas, que foram determinadas no período tardio do modelo,
encontramos níveis altos e estatisticamente significativos no macerado do
pulmão, o que significa, como já foi descrito por outros pesquisadores, as
Discussão 84 Martha E. Urán J.
citocinas são expressas de forma órgão-dependente e diferencialmente no
tempo. E aquelas citocinas que regularam a infecção no alvéolo inicialmente na
fase tardia, foram expressas no macerado de pulmão. Este é o efeito
denominado como compartimentalização da resposta imune, e demostrado na
PCM experimental induzida com os conídios de Pb60855 (100) e em outras
doenças como pneumocistose(116).
Conclusões 85 Martha E. Urán J.
7. CONCLUSÕES
Estes resultados permitem demonstrar que condições adequadas de
temperatura e umidade são fatores críticos para a produção de conídios de
diferentes espécies de Paracoccidioides spp., em meios de cultura que
asseguram a qualidade dos conídios para experimentação com animais e
culturas celulares. Estes dados morfológicos não são garantia para
diferenciação entre as espécies. Novos estudos focados neste sentido, podem
ajudar na diferenciação de espécies que até agora, só pode ser feita por
metodologias moleculares.
A continuidade dos estudos relacionados com o efeito que o peptídeo P10
pode ter sobre o crescimento do próprio fungo ou diretamente sobre as células
do hospedeiro necessitam de investigação mais profunda.
Os nossos dados validam alguns dos estudos preliminares, nos quais, os
conídios e as leveduras de P. brasiliensis são fagocitados avidamente por
macrófagos de linhagens WT ativadas com IFN-, podendo associar que os
efeitos de reconhecimento pelo macrófago sejam similares frente as duas fases
do fungo.
Nossos dados de fagocitose de conídios e leveduras de P. brasiliensis e
P. lutzii indicaram que o TLR4 é o principal fator de reconhecimento, tanto de
fase como de espécie, e se correlacionam com os dados publicados por outros
pesquisadores, os quais sugerem que Paracoccidioides utiliza TLR2, TLR4 e
Dectina para ganhar acesso a macrófagos murinos, neutrófilos humanos e que
essa relação é refletida na produção de citocinas, podendo ser considerada
como um mecanismo patogênico na paracoccidioidomicose (107).
Nosso laboratório conseguiu estabelecer o sistema de produção de
conídios de Paracoccidioides brasiliensis e P. lutzii graças ao investimento em
equipamentos e reagentes apropriados, além de manter a umidade relativa
necessária, considerando que as condições ambientais na cidade de São
Paulo não são adequadas para o crescimento na fase de bolor, devido às
Conclusões 86 Martha E. Urán J.
mudanças de umidade relativa no decorrer do ano, o qual influencia
diretamente sobre o crescimento do fungo.
A variação anual da umidade influenciou nos resultados obtidos. A média
não superou os 60% e algumas semanas, nos meses mais secos, ficou inferior
a 30%. Nas condições laboratoriais registramos faixas de 25 a 50% UR
semelhantes aos índices locais reportados pelos centros de gerenciamento da
Prefeitura e do Estado de São Paulo.
Os experimentos preliminares mostraram que é possível produzir conídios
do isolado ATCC60855, o qual tem sido reportado como o isolado padrão para
produção de conídios. Obtivemos conídios de Pb18, assim como do isolado
Pb01 de Paracoccidioides lutzii. Purificamos pela primeira vez conídios destes
isolados e realizamos alguns experimentos preliminares tanto in vitro, ex vivo e
in vivo.
É imprescindível continuar com a produção de conídios para atingir os
objetivos originalmente estabelecidos no projeto, considerando que a
quantidade de conídios necessários para os experimentos in vivo é bem
elevada, 4x106 conídios por animal.
Anexos 87 Martha E. Urán J.
8. ANEXOS
Anexo 1. Folhas Comitês de Ética
Anexos 88 Martha E. Urán J.
Anexos 89 Martha E. Urán J.
Anexo 2.
Meios de Cultura usados para o crescimento dos fungos
Meio de cultura Sabouraud Dextrose-Asparagina-Tiamina (SAT)
P. brasiliensis é capaz de sintetizar de novo todos os nucleotídeos e os
aminoácidos, com a única exceção da asparagina (117). Portanto, para facilitar
a transformação in vitro de bolor para levedura é utilizado um meio rico com
suplemento de asparagina e tiamina (118, 119).
BBL Sabouraud Dextrose BD TM (caldo ou agar) quantidade recomendada pelo
fabricante
L-asparagina (0.14%)
tiamina (0.01%)
BHI-Suplementado, Meio de cultura para CFU.
O Meio BHI-suplementado usado foi descrito por Kurita et al. (1993) (49,
95), e foi modificado de acordo com as condições do laboratório, com bons
resultados na recuperação das UFC.
Brain Heart Infusion (BHI);
4% de Soro fetal bovino (Gibco) (substitui o soro de cavalo, Kurita et al 1993 );
0,5 % D-(+) glicose (Sigma-Aldrich);
EDTA (Sigma-Aldrich), 300 μM de concentração final;
5 % de sobrenadante filtrado de cultura de levedura de P.brasiliensis, isolado
Pb192 (crescido em BHI por 15 dias a 37°C e em agitação constante a 150
RPM);
1,5 % de ágar granulado DifcoTM (Becton Dickinson, co., Le Pont de Claix,
França).
Anexos 90 Martha E. Urán J.
Meio de cultura quimicamente definido, “Modiffied McVeigh-Morton”
(MMcM).
O meio quimicamente definido o “McVeigh-Morton” atualmente utilizado
para culturas de fungos foi modificado por Restrepo A and Jimenez B (1980)
(Restrepo, 1980 #2223) e passou a se denominar “Modiffied McVeigh-Morton”
(MMcM).
Tabela 1. Estoque de vitaminas.
Componentes Quantidade por 100 ml
Hidrocloreto de tiamina 6.0 mg
Niacina 6.0 mg
Pantotenato de Cálcio 6.0 mg
Inositol 1.0 mg
Biotina 0.1 mg
Riboflavina 1.0 mg
Ácido fólico 10 mg
Cloreto de colina 10 mg
Hidrocloreto de piridoxina 10 mg
Depois de preparado em água destilada estéril, deve ser filtrado em 0,25 um e
estocado a -20°C em tubos protegidos da luz. É sugerido estocar em volumes
de 10 ml (quantidade necessária para preparar 1L de MMcM). Não se
aconselha usar vitaminas que foram descongeladas por muito tempo.
Tabela 2. Estoque de traços de elementos.
Componente Quantidade per 100 ml
H3B03 5.7 mg
CuSO4-5H20 15.7 mg
Fe(NH4)2(SO4)2-6H20 140.4 mg
MnSO4-14H20 8.1 mg
(NH4)6-Mo7024-4H20 3.6 mg
ZnSO4-7H20 79.2 mg
Anexos 91 Martha E. Urán J.
Depois de preparado em água destilada estéril deve ser filtrado em 0,25 um e
estocado a -20°C. É sugerido estocar em volumes de 1ml (quantidade
necessária para preparar 1L de MMcM).
Estoque de penicilina-gentamicina
Concentração final no meio deve ser de:
Penicilina: 50 U/ml de meio de cultivo
Gentamicina: 16 ug/ml de meio.
Para preparação do estoque se utilizam antibióticos de uso hospitalar (ampolas
de 5.000.000 U de penicilina e 80 mg/ml de Gentamicina).
Diluir uma ampola de penicilina de 5.000.000 U/I em 80 ml de água estéril e
distribuir 8 ml por tubo e estocar (pode congelar -20°C), ajustar o volume a 10
ml com os 2 ml de gentamicina.
Deste estoque se usa 1ml por litro de meio (98, 120, 121)
Tabela 3. Preparação do MMcM
Componente Quantidade per litro
Glicose 10.0 g
KH2PO4 1.5 g
MgSO4-7H20 0.5 g
CaCl2-2H20 0.15 g
(NH4)2-SO4 2.0 g
L-Asparagina 2.0 g
L-Cistina 0.2 g
Suplementos Agar, Vitaminas, elementos traços e
antibióticos
Dissolver os primeiros 6 componentes (da glicose até a asparagina) em 1000
ml de água destilada sob agitação constante. Se aconselha dissolver um a um
os reagentes para não formar pedras de sal na solução.
A L-cistina é dissolvida em outro recipiente de vidro com NaOH 1N,
adicionando gota por gota até estar diluída completamente. Nesse momento
Anexos 92 Martha E. Urán J.
deve ser adicionada ao restante dos reagentes que já estão em solução e
agitação.
Ajustar o pH para 7,0 com NaOH 1N ou 6N gota por gota. Para ajustar o pH
não deve ser usado HCL (pode mudar a composição dos reagentes e precipitar
os sais). Portanto, o ajuste com NaOH 1N deve ser feito devagar.
Para preparar MMcM líquido deve-se deixar o agitador magnético dentro do
recipiente, para o procedimento de clareamento final. Para o preparo do meio
solido não é necessário agitar, apenas adiciona-se 13 g de bacto agar (1,3%)
Deve-se esterilizar a 121ºC por 15 min, a 121 libras de pressão.
Posteriormente, segue a agitação, clareamento, e então são adicionados as
vitaminas, traços e antibióticos.
Para o meio sólido, deve-se esfriar um pouco o meio, de forma a não inativar
as vitaminas e antibióticos antes de suplementar, sendo usado cada litro de
meio 10 ml do estoque de vitaminas, 1ml do estoque de traços e 1ml do
estoque de antibióticos. Depois disto, o meio pode ser distribuído em
recipientes estéreis.
Anexos 93 Martha E. Urán J.
Anexo 3.
Tabela 4. Relação de Fluorocromos e anticorpos utilizados para Citometria de
fluxo.
Painel de marcação para fagocitoses
FITC para marcar leveduras e conídios.
F4/80 Pacific Blue
Painel de expressão A
CD11b PE-Cy™7
F4/80 Pacific Blue
CD80 PerCP-Cy™5.5
CD86 (B7-2) APC
CD282 (TLR2) PE
TLR4/CD284 FITC
Painel de expressão B
CD11b PE-Cy™7
F4/80 Pacific Blue
Dectin-1/CLEC7A PE
MMR FITC
MHC Class II (I-A/I-E) APC
Anticorpos Fluorescência Clone Referência Marca
CD11b PE-Cy™7 M1/70 552850 BD Pharmingen
F4/80 Pacific Blue BM8 123124 Biolegend
CD80 PerCP-Cy™5.5 16-10A1 560526 BD Pharmingen
CD86 (B7-2) APC GL1 17-0862-82 eBioscience
CD282 (TLR2) PE 6C2 12-9021-82 eBioscience
TLR4/CD284 FITC MTS510 IMG-428C IMAGENEX
Dectin-1/CLEC7A PE 218820 FAB17561P R&D Systems
MMR FITC C068C2 141704 Biolegend
MHC-II (I-A/I-E) APC M5/114.15.2 17-5321-82 eBioscience
N/A FITC N/A F7250-50 Sigma-Aldrich
Anexos 94 Martha E. Urán J.
Anexo 4.
Tabela 5. Relação dos kits de ELISA utilizados para determinação de citocinas
e quimiocinas de camundongo.
Nome Marca Referência
IFN-gama BD Bioscience 551866
IL-6 BD Bioscience 555240
GM-CSF BD Bioscience 555167
IL-4 BD Bioscience 555232
MCP-1 BD Bioscience 555260
IL12p40 BD Bioscience 555165
IL12p70 BD Bioscience 555256
IL-10 BD Bioscience 555252
TNF-alfa BD Bioscience 555268
IL-1 eBioscience 88-7013-88
IL-23 eBioscience 88-7230-88
MIP-2 R&D Systems DY452E
Referências 95 Martha E. Urán J.
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