Aluna: Glauce Moreno BarbosaDisciplina:Termogênese nos Seres Vivos

Novembro, 2012.

Beija-flor:◦ Família: Trochilidae◦ Gênero: Phaethornis◦ Espécie: Phaethornis ruber

Presente de São Paulo ao norte do Brasil.

Não possui tecido adiposo marrom não apresenta UCP1.

É capaz de atravessar longo período de heterotermia (altas taxas metabólicas).

Termogênese adaptativa◦ Produção de calor em resposta ao ambiente ou dieta.

‣ Em aves:o Principal tecido termogênico – músculo esqueléticoo Resposta metabólica induzida pelo frio - 3 a 8 vezes

taxa metabólica padrãoo Reposta metabólica provocada pelo vôo - 5 a 10 vezes

taxa metabólica padrão

Mecanismos Termogênicos em Pássaros◦ Em beija-flor: músculo peitoral é o principal candidato para

geração de calor.◦ Durante aclimatização ao frio: Ca+2ATPase e receptor

rianodine no retículo sarcoplasmático.

Estudos prévios com beija-flor

◦ Razão entre hidrólise de ATP e síntese de ATP, com liberação de Ca+2 do retículo sarcoplasmático do músculo peitoral – 2 vezes maior do que no retículo sarcoplasmático de músculo esquelético de coelho.

◦ Na presença de Ca+2, 2 vezes mais energia é convertida em calor no beija-flor.

Termogênese por não tremor em pássaros◦ Sua importância ainda é discutida, pois a principal

termogênese dos pássaros em resposta ao frio é por tremor.

◦ Estudos prévios demonstraram a presença de termogênese por não tremor em patos.

Determinação da taxa metabólica

Teulier, L. et al. The Journal of Experimental Biology, 2010.

LCT menor em patos aclimatados a 4ºC.

Capacidade para termogênese por não tremor é maior em patos aclimatados ao frio.

Teulier, L. et al. The Journal of Experimental Biology, 2010.

o Taxa de consumo de oxigênio durante estímulo máximo por ADP (estado 3), repouso (estado 4) e desacoplamento induzido por FCCP (estado 3 unc) foi maior nos patos aclimatizados a 4ºC.

o O consumo máximo de oxigênio (citocromo c oxidase) não foi alterado pela aclimatização ao frio.

Teulier, L. et al. The Journal of Experimental Biology, 2010.

Homólogo da proteína desacopladora em beija-flor da espécie Eupetomena macroura

◦ HmUCP – 304 aminoácidos, 32,8kDa. Homologia com UCP3 de humanos (72%).

◦ HmUCP - uptake de 3’.3-dihexil-oxacarbocianida iodide (DiOC6) - reduz potencial de membrana.

Vianna, C. et al. The American Physiological Society, 2001.

◦ HmUCP é encontrada principalmente no músculo peitoral. Em menor quantidade: coração, fígado, pulmão e rins. Não detectada no cérebro.

◦ Níveis de mRNA HmUCP diferentes de acordo com a condição fisiológica (eutermia, torpor e reaquecimento).

Vianna, C. et al. The American Physiological Society, 2001.

◦ taxa de consumo de O2 no torpor, retornando a níveis semelhantes a eutermia durante o reaquecimento.

Vianna, C. et al. The American Physiological Society, 2001.

Avaliar o processo de termogênese por não tremor no beija-flor da espécie Phaethornis ruber.

Determinar a alteração na taxa metabólica do beija-flor aclimatizado em duas temperaturas distintas.

Avaliar a presença de UCP (homóloga a UCP humana) e o papel da mitocôndria no músculo esquelético, após exposição do beija-flor a diferentes condições de temperatura.

Aclimatação do beija-flor Phaethornis ruber a diferentes temperaturas.

10 dias – fotoperíodos constantes luz – 8h escuridão - 16h

Condição 1Eutermia (35ºC – 40ºC)

Condição 2Torpor (10ºC – 15ºC)

Determinação da taxa metabólica do beija-flor◦ Calorimetria indireta – sistema de circuito aberto

Beija-flor em jejum overnight

Condições do experimento:Fluxo de ar atmosférico constante.Temperaturas (10 e 40ºC) controladas.

Variáveis a serem determinadas:Temperatura e pressão padrõesRazão entre consumo de O2 e produção de CO2

A relação entre taxa metabólica e temperatura ambiente deverá ser expressa como regressão linear determinar a temperatura crítica mais baixa (LCT).

Espera-se que a LCT seja menor no beija-flor submetido a temperatura (10-15ºC) do que ao aclimatizado a temperaturas maiores. Taxa metabólica maior quando aclimatizados a menores temperaturas durante longo período de tempo.

Análise da termogênese por não tremor

◦ Medida simultânea da taxa metabólica e da eletromiografia do músculo peitoral (termogênese por tremor).

Atividade por não tremor = taxa metabólica (determinada a temperatura limiar de tremor) – taxa metabólica no repouso

Espera-se que os pássaros aclimatados ao frio apresentem uma menor atividade muscular ( atividade eletromiográfica).

Nos pássaros aclimatados ao frio, espera-se que sua capacidade para termogênese por tremor seja maior.

Coleta do tecido muscular esquelético para isolamento mitocondrial

Isolamento mitocondrial

Dosar proteína total mitocondrial

Verificar expressão gênica de UCP por RT-PCR e expressão proteica por Western Blotting.

Maior quantidade de proteína total mitocondrial no músculo esquelético de beija-flor aclimatizado ao frio.

Padronizando-se a quantidade de proteína usada por ensaio, espera-se encontrar maior quantidade de UCP no músculo esquelético deste beija-flor.

Tampão de respiração

Adição dos substratos succinato e rotenona

Adição de ADP – estado de respiração ativa (estado 3)

Adição de oligomicina - taxa de respiração não fosforilada basal (estado 4)

Adição de FCCP – estado de respiração desacoplada (estado 3 desacoplado)

Mixotazol foi adicionado para inibir a respiração por succinato.

Adição de ascorbato - determinar a taxa de respiração máxima associada à atividade da citocromo c oxidase.

Aumento da taxa de consumo de oxigênio durante estímulo por ADP (estado 3), repouso (estado 4) e desacoplamento induzido por FCCP (estado 3 desacoplado ) em beija-flor aclimatizado ao frio.

Aumento da função mitocondrial associada ao desacoplamento em músculo esquelético após aclimatação ao frio.

Associar a superexpressão de UCPs no tecido muscular esquelético de beija-flor aclimatizado ao frio com ativação de receptores -adrenérgicos.

Correlacionar a superexpressão de UCPs com a redução da termogênese por tremor – estudo da ciclagem de Ca+2.

Os resultados esperados sugerem que, para a adaptação do beija-flor da espécie Phaetornis ruber a temperaturas reduzidas, é necessário o controle da expressão da proteínas desacopladora (homóloga a UCP) para a termogênese por não tremor.