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MARIA LUÍSA LOBO FERREIRA DA COSTA
(Bolseira de Doutoramento pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia,
Aluna de Doutoramento pelo Instituto de Higiene e Medicina Tropical, da Universidade Nova de Lisboa)
EPIDEMIOLOGIA E CARACTERIZAÇÃO DE
ESPÉCIES IMPLICADAS NA MICROSPORIDIOSE
HUMANA EM PORTUGAL POR ANÁLISE
PARASITOLÓGICA E MOLECULAR
LISBOA
2010
“Posso ter defeitos, viver ansioso e ficar irritado algumas vezes mas não esqueço de que minha vida é a maior empresa do mundo, e posso
evitar que ela vá à falência.
Ser feliz é reconhecer que vale
a pena viver apesar de todos os desafios, incompreensões e períodos
de crise.
Ser feliz é deixar de ser vítima dos
problemas e se tornar um autor da própria história. É atravessar
desertos fora de si, mas ser capaz de encontrar um oásis no recôndito da
sua alma.
É agradecer a Deus a cada manhã
pelo milagre da vida. Ser feliz é não ter medo dos próprios
sentimentos.
É saber falar de si mesmo.
É ter coragem para ouvir um "não".
É ter segurança para receber uma crítica, mesmo que injusta.
Pedras no caminho?
Guardo todas, um dia vou construir um castelo…”
Fernando Pessoa
ii
iii
Dissertação de candidatura ao grau de Doutor em
Ciências Biomédicas, especialidade de Parasitologia, pela
Universidade Nova de Lisboa, Instituto de Higiene e
Medicina Tropical.
iv
v
A presente dissertação foi realizada sob a orientação da Professora
Doutora Olga Maria Guerreiro de Matos, na Unidade de Protozoários
Oportunistas/VIH e Outras Protozooses, do Instituto de Higiene e Medicina
Tropical, da Universidade Nova de Lisboa, e na “Division of Parasitic Diseases”
do “Centers for Disease Control and Prevention”, EUA. A doutoranda usufruiu
de uma Bolsa de Doutoramento da Fundação para a Ciência e a Tecnologia e
Fundo Social Europeu no âmbito do Quadro Comunitário de Apoio (referência
SFRH/BD/34674/2007).
vi
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Aos meus pais,
cujos corações guardo para
sempre, junto ao meu.
Adriano e Adília
viii
ix
Agradecimentos
À Professora Doutora Olga Matos, que amavelmente aceitou orientar o presente
trabalho, expresso não só a minha gratidão pela maneira como desde o início apoiou e
incentivou a minha formação e valorização profissional e a todas as oportunidades que
me proporcionou, mas também pela sua compreensão e amizade ao longo do período
complicado que atravesso nos últimos anos.
Ao Professor Doutor Francisco Antunes, agradeço a amabilidade de ter acedido
fazer parte da comissão tutorial deste trabalho de doutoramento, mas principalmente
agradeço todos os valiosos ensinamentos, profissionais ou de vida em geral, sempre
com a boa disposição que o caracteriza, assim como a confiança que tem em mim
depositado e todo o apoio e oportunidades que me concedeu.
Ao Doutor Lihua Xiao, agradeço a extraordinária oportunidade de me ter
recebido no seu laboratório, em Atlanta, os ensinamentos, a pronta disponibilidade e a
preciosa ajuda que me concedeu, durante o decorrer deste trabalho.
Ao Professor Doutor Jorge Gaspar, agradeço a amabilidade de ter acedido fazer
parte da comissão tutorial deste trabalho de doutoramento, e de toda a disponibilidade e
apoio que sempre demonstrou ao ser solicitado, acrescentando sempre uma visão
humorística às questões científicas.
À Professora Doutora Maria Amélia Grácio, que muito contribuiu para despertar
o interesse pela Parasitologia Médica, um obrigado especial pela amabilidade que
sempre me votou.
Ao Professor Doutor Virgilio de Rosário, agradeço a consideração e
disponibilidade que me concedeu.
Ao Doutor Bruno de Souza, da UEI de Epidemiologia Biostatística pelo tempo e
simpatia que amavelmente me disponibilizou para esclarecer as minhas dúvidas no
tratamento estatístico dos dados obtidos neste estudo.
A todos os colegas que passaram pela Unidade de Protozoários
Oportunistas/VIH e Outras Protozooses, que partilharam comigo alegrias e tristezas,
que aturaram o meu mau humor pela manhã, em especial ao residente e amigo
Engenheiro Francisco Esteves, e às minhas amigas Margarida Alves e Marina Costa
agradeço todo o apoio, carinho e amizade. Ao Dr. António Amorim, e à Dr.ª Vera
x
Codices o meu reconhecimento pela ajuda, e pela amizade e votos de um óptimo
trabalho de doutoramento.
Aos meus familiares que tenho vindo a “negligenciar”, em especial à Ana, à Tia
Carmo e ao Luís, agradeço todo o carinho e apoio moral que me têm dado durante este
longo período.
A todos os que, de algum modo, contribuíram para a minha chegada ao fim desta
etapa e que, por falha não intencional, não foram aqui mencionados, o meu sincero
agradecimento.
xi
Publicações
A partir do conjunto de resultados, obtidos no decurso do presente projecto de
doutoramento, foram publicados os seguintes trabalhos, em revistas de circulação
internacional com arbitragem científica:
LOBO ML, TELES A, BARÃO DA CUNHA M, HENRIQUES J, LOURENÇO AM, ANTUNES F,
MATOS O. Microsporidia detection in stools from pets and animals from the Zoo.
Journal of Eukariotic Microbiology, 2003 , vol 50, suppl,:581-582
SULAIMAN IM, MATOS O, LOBO ML, XIAO L. Identification of a new microsporidian
parasite related to Vittaforma corneae in humans in Portugal. Journal of Eukariotic
Microbiology, 2003, vol 50, suppl.:586-590
MATOS O, LOBO ML, TELES A, ANTUNES F. Is Microsporidial infection in animals a
potencial source for human microsporidiosis?. Southeast Asian Journal of Tropical
Medicine and Public Health ,2004, 35 (Suppl 1): 48-53
LOBO ML, XIAO L, CAMA V, MAGALHÃES N, ANTUNES F, MATOS O. Identification of
potentially human-pathogenic Enterocytozoon bieneusi genotypes in various birds. Appl
Environ Microbiol. 2006 Nov; 72(11):7380-2.
LOBO ML, XIAO L, CAMA V, STEVENS T, ANTUNES F, MATOS O. Genotypes of
Enterocytozoon bieneusi in Mammals in Portugal. J Eukaryot Microbiol. 2006 Nov; 53
Suppl 1:S61-4.
LOBO ML, SILVEIRA H, RAMOS S, XIAO L, MATOS O. Characterization of a Pathogen
Related to Vavraia culicis Detected in a Laboratory Colony of Anopheles stephensi. J
Eukaryot Microbiol. 2006 Nov; 53 Suppl 1:S65-7.
xii
Magalhães N, Lobo ML, Antunes, F, Matos, O. Aves e cães como potencial fonte de
infecção zoonótica por microsporídeos para o homem. Revista Portuguesa de Ciências
Veterinárias. 2006; 101 (557-558): 69-75.
A partir dos resultados desta dissertação, foram apresentados trabalhos em
reuniões científicas, cujos resumos foram publicados em livros de resumos ou em
revistas nacionais, ou internacionais, com comité de leitura:
LOBO ML, TELES A, MATOS O, BARÃO DA CUNHA M, HENRIQUES J, LOURENÇO AM,
ANTUNES F. Infecção por Microsporidia em animais em Portugal.[Abstract CO37] Acta
Parasitológica Portuguesa, 2003; 10(1): 68-69
MATOS O, LOBO ML, TELES A, ANTUNES F. Is Microsporidial infection in animals a
potencial source for human microsporidiosis?. [Abstract] 4th Seminar on Food and
Water-borne Parasitic Zoonoses. 2nd International Meeting on Gnathostomiasis. Joint
International Tropical Medicine Meeting 2003, 221
MATOS O, LOBO ML, XIAO L, MAGALHÃES N, TELES A, ANTUNES F. Human and
animal microsporidiosis, in Portugal. NATO Advanced Research Workshop “Emergent
Pathogens in the 21st Century: First United Workshop on Microsporidia from
Invertebrate and Vertebrate Hosts”. Folia Parasitologica, 2005, 52(1/2): S7A
LOBO ML, MAGALHÃES N, HENRIQUES J, ANTUNES F, MATOS O. Animais de
companhia como potenciais fontes de infecção zoonótica por microsporídeos para o
homem [resumo CO - 16]. Acta Parasitológica Portuguesa, 2005, 12 (1-2): 47-48.
LOBO ML, XIAO L, CAMA V, ANTUNES F, MATOS, O. Frequency of microsporidian spores
among HIV-positive and HIV-negative patients. [resumo 62.044]. International Journal of
Infectious Diseases, 2006, 10 (Suppl 1): S298.
LOBO ML, XIAO L, CAMA V, ANTUNES F, MATOS, O. Genotypes of Enterocytozoon
bieneusi in mammals in Portugal [PL64]. Nineth International Workshops on
xiii
Opportunistic Protists (IWOP-9) and International Conference on Anaerobic Protists
(ICAP), Lisboa, Portugal, 2006. Livro de resumos: 66-67.
LOBO ML, SILVEIRA H, RAMOS S, XIAO L, MATOS O. Occurrence of Vavraia culicis
related pathogen in a laboratory colony of Anopheles stephensi [PO20]. Nineth
International Workshops on Opportunistic Protists (IWOP-9) and International
Conference on Anaerobic Protists (ICAP), Lisboa, Portugal, 2006, Livro de resumos:
40.
LOBO ML, XIAO L, CAMA V, STEVENS T, ANTUNES F, MATOS O. Mamíferos como
potenciais fontes de infecção zoonótica por Enterocytozoon bieneusi (Microsporidia)
[Abstract CO 14] Acta Parasitológica Portuguesa, 2006; 13 (1-2): 92-93
LOBO ML, XIAO L, CAMA V, STEVENS T, ANTUNES F, MATOS O. Genotypes of
Enterocytozoon bieneusi in Mammals in Portugal [Abstract 138A]. J Eukaryot
Microbiol. 2007 Mar-Apr; 54 (2): 47S.
LOBO ML, XIAO L, ANTUNES F, MATOS O. Species and Genetic Diversity of
Microsporidian Parasites among HIV-Positive and HIV-Negative Patients [Abstract P-
1885] 47th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy,
Chicago, Illinois, USA., 2007, Livro de resumos: 473.
MATOS O., LOBO ML., TELES A. & ANTUNES F. Is microsporidial infection in animals a
potential source for human microsporidiosis? In: Proceedings of the workshop on
waterborne human microsporidia. Frank W. Schaefer III e H. D. Alan Lindquist
(editores). U. S. Environmental Protection Agency, 2007, Cap 3: 57-66.
LOBO ML, XIAO L, ANTUNES F, MATOS O. “Enterocytozoon bieneusi and Vittaforma-
like: Detection and genotyping in HIV-positive and negative patients from Portugal.”
[resumo PO54]. X International Workshops on Opportunistic Protists (IWOP-10),
Boston, Massachusetts, USA, 2008. Livro de resumos: 84.
xiv
LOBO ML, XIAO L, ANTUNES F, MATOS O. “Occurrence of Cryptosporidium, Giardia,
and Microsporidia in water supplies in Portugal.” [resumo PO28]. X International
Workshops on Opportunistic Protists (IWOP-10), Boston, Massachusetts, USA, 2008.
Livro de resumos: 49.
LOBO ML XIAO L, ANTUNES F, MATOS O. “Enterocytozoon bieneusi e Vittaforma-like
(Microsporidia): Detecção e genotipagem em doentes seropositivos para VIH e em
imunocompetentes, em Portugal.” [resumo OA08] Congresso Nacional de Doenças
Infecciosas e Microbiologia Clínica, SIDA e Parasitologia (IX Congresso Nacional de
Doenças Infecciosas/Microbiologia Clínica, 7º Congresso Nacional sobre Sida, XII
Congresso Português de Parasitologia), Vilamoura, Portugal, 2008. Livro de resumos:
15.
LOBO ML F, XIAO L, WAAP H, GASPAR J, ANTUNES F, MATOS O. MATOS O.
“Ocorrência de Cryptosporidium, Giardia, Microsporidia, e Besnoitia spp. Em água de
consumo, em Portugal.” [resumo OA13] Congresso Nacional de Doenças Infecciosas e
Microbiologia Clínica, SIDA e Parasitologia (IX Congresso Nacional de Doenças
Infecciosas/Microbiologia Clínica, 7º Congresso Nacional sobre Sida, XII Congresso
Português de Parasitologia), Vilamoura, Portugal, 2008. Livro de resumos: 18.
MARTINHO, F, LOBO ML, MATOS O. “Aves silvestres como reservatórios de alguns
agentes com potencial zoonótico em Portugal” [resumo PA32] Congresso Nacional de
Doenças Infecciosas e Microbiologia Clínica, SIDA e Parasitologia (IX Congresso
Nacional de Doenças Infecciosas/Microbiologia Clínica, 7º Congresso Nacional sobre
Sida, XII Congresso Português de Parasitologia), Vilamoura, Portugal, 2008. Livro de
resumos: 52.
LOBO ML, XIAO L, ANTUNES F, MATOS O. “Microsporidia as Potential Pathogens in
HIV-positive and Immunocompetent Portuguese.” [resumo P-377]. 49th Interscience
Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC), San Francisco, CA,
USA., 2009. Abstract book.
xv
LOBO ML, XIAO L., ANTUNES F., MATOS O. Human pathogenic microsporidia: detection
and genotyping in HIV-positive and negative patients from Portugal [abstract PO6].
Eleventh International Workshops on Opportunistic Protists (IWOP-11), Hilo, Hawaii,
USA, 2010. Abstract book: 26.
xvi
xvii
Resumo
Os agentes responsáveis pela microsporidiose e, designados, genericamente, por
microsporidia são parasitas intracelulares obrigatórios, ubíquos na natureza. Os
microsporidia inicialmente reconhecidos como agentes patogénicos de insectos e peixes,
emergiram nas últimas décadas como um importante grupo de microrganismos
responsáveis por infecção no Homem, associada à pandemia da sida. Encontram-se
descritas na literatura mais de 1200 espécies de microsporidia, mas apenas um número
reduzido é considerado infectante para o Homem. Entre os microsporídios mais
prevalentes, responsáveis por infecção humana, encontram-se as espécies
Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, Encephalitozoon hellem e
Encephalitozoon cuniculi. Recentemente foi identificada em Portugal, uma nova espécie
patogénica para o Homem - Vittaforma-like, em doentes seropositivos para VIH e em
imunocompetentes.
No Homem, os microsporídios causam desde patologia gastrintestinal a
infecções disseminadas variando os aspectos patogénicos da doença consoante a espécie
envolvida assim como com a resposta imunitária do hospedeiro. Já foram descritos
portadores assintomáticos de microsporídios, quer em imunodeficientes quer em
imunocompetentes
Actualmente, são ainda escassos os dados epidemiológicos sobre esta parasitose,
e poucos os estudos disponíveis sobre os animais identificados como potenciais
hospedeiros dos parasitas infectantes para o Homem. Mais recentemente, o contacto
com água infectada passou a ser considerado um factor de risco associado à
microsporidiose humana.
A recente aplicação de técnicas moleculares ao diagnóstico e caracterização dos
microsporidia, permitindo o reconhecimento de diferenças intraespecíficas, tem
contribuído para uma melhor compreensão da epidemiologia destes parasitas.
O presente trabalho tem como objectivos: (i) determinar a frequência de infecção
de microsporidia patogénicos para o Homem, numa população de seropositivos e
seronegativos para VIH, em animais em estreito contacto com humanos e em água de
abastecimento público, a fim de identificar, não só os parasitas infectantes para o
Homem, como, também, os seus possíveis reservatórios zoonóticos e ambientais; (ii)
xviii
caracterizar geneticamente as espécies e genótipos de microsporidia identificados na
população humana, animal e em amostras de água de consumo público; (iii) avaliar a
importância dos microsporidia na Saúde Pública Humana em Portugal.
No intuito de dar prossecução ao presente estudo, de modo a cumprir os objectivos
propostos, foram adoptadas metodologias de diagnóstico e caracterização genética dos
microsporidia, seleccionadas após extensa pesquisa bibliográfica. Todas as amostras
foram analisadas simultaneamente pela técnica parasitológica de coloração Gram-
Chromotrope e por PCR, com excepção das amostras fecais de animais silváticos de
vida livre e da água de consumo público, que atendendo às reduzidas quantidades de
amostra disponíveis, só foram estudadas pelas técnicas moleculares.
Para o presente trabalho foi efectuado um estudo retrospectivo e prospectivo,
englobando 1989 amostras fecais de 856 doentes (adultos e crianças) seropositivos e
seronegativos para VIH. A percentagem de doentes seropositivos para VIH estudados
foi de 65,5% (561/856) e seronegativos para VIH foi de 34,5% (295/856). Do total de
doentes (586 do sexo masculino e 270 do sexo feminino), 675 eram adultos e 181
crianças. Dos doentes analisados 57,6% apresentavam diarreia e 42,4% não
apresentavam quadro diarreico. Nove (3,1%) dos 295 seronegativos para VIH
apresentavam outras causas de imunossupressão. Uma frequência de infecção por
microsporidia de 12,0% (103/856) foi observada nas fezes da população humana
estudada, sendo que 13,9% e 8,5% das amostras fecais pertenciam a seropositivos e a
seronegativos para VIH, respectivamente. A percentagem de crianças e adultos
positivos para microsporidia foi de 18,8% e 10,2%, respectivamente. Os resultados
obtidos permitiram determinar uma associação significativa entre a presença de infecção
por microsporidia e os seropositivos para VIH, facto este que não constituiu um dado
surpreendente em virtude do carácter oportunista largamente atribuído a esta doença,
por outros autores. Foram identificados esporos de microsporídios nas fezes de doentes,
que, embora sendo seronegativos para VIH, apresentam outro tipo de deficit
imunológico. Através das técnicas de PCR, identificaram-se duas espécies de
microsporídios nas amostras fecais dos doentes estudados no presente trabalho. E.
bieneusi foi detectada em 6,3% (54/856) e Vittaforma-like em 6,8% (58/856) dos
doentes estudados. Na análise dos dados obtidos, não se verificou que a infecção por
microsporidia, em geral, nem, especificamente, por nenhuma das duas espécies
xix
identificadas nas fezes estivesse, significativamente, associada a doentes com quadro
diarreico. A caracterização genética da região ITS rRNA de 48 isolados de E. bieneusi
obtidos de humanos, de um total de 54 amplificados por PCR, permitiu identificar seis
genótipos diferentes, Tipo IV (37,5%), Peru 6 (29,2%), D (12,5%), A (8,3%), C (6,3%)
e PtEbII (6,3%). Até à data os genótipos A e C só foram identificados no Homem. Em
contrapartida os genótipos Tipo IV, Peru 6 e genótipo D já foram descritos numa vasta
gama de hospedeiros, incluído o Homem e outros animais (inclusive em cães, gatos e
ruminantes em Portugal). A caracterização genética dos 58 isolados de Vittaforma-like
revelou a presença de dois genótipos diferentes, previamente descritos em humanos:
Isolado 5830 (39 amostras) e Isolado 5843 (19 amostras), com frequências de 67,2% e
32,8%, respectivamente.
Para o estudo de microsporidia em amostras de urina, foram recolhidos 69
amostras, retrospectivamente e durante o decurso do trabalho, pertencentes a 69 doentes
(59 doentes seropositivos para VIH [85,5%] e 10 doentes seronegativos para VIH
[14,5%] sendo 44 adultos (63,8%) e 25 crianças (36,2%). Do total de amostras de urina
48 (69,6%) eram de doentes do sexo masculino e 21 (30,4%) de doentes do sexo
feminino. Foram identificados microsporídios em 1,5% (1/69) das amostras de urina,
correspondente a um seropositivo para VIH (1,7%). A espécie identificada na urina foi
E. intestinalis e a caracterização da sequência de um fragmento da região SSU rRNA
revelou total homologia com diversas sequências previamente descritas em humanos e
outros animais.
Para a identificação e caracterização de microsporídios em secreções
pulmonares, foram analisadas 200 amostras, recolhidas retrospectivamente e durante o
decorrer do estudo correspondentes a 124 expectorações induzidas (EI) e 76 lavados
broncoalveolares (LBA). As amostras pertenciam a 150 doentes seropositivos para VIH
(75%) e a 50 seronegativos para VIH (25%), sendo 129 (64,5%) do sexo masculino e 71
(35,5%) do sexo feminino. A percentagem de infecção por microsporidia foi de 1,0%
(2/200) em secreções pulmonares da população estudada. Dois seropositivos (1,3%)
apresentavam microsporídios, nomeadamente num LBA e numa EI. E. cuniculi e
Vittaforma-like foram identificadas nos referidos espécimes. A caracterização da SSU
rRNA para E. cuniculi revelou 99% de homologia genética nesta sequência com outras
sequências previamente descritas em humanos para E. cuniculi, e para a espécie
xx
Vittaforma-like registou-se homologia genética com o Isolado 5830, previamente
descrito em humanos em Portugal. Ambos os achados constituem os primeiros registos
desta espécie em secreções pulmonares no Homem em Portugal.
A detecção e caracterização dos microsporidia em animais, incluiu estudos
retrospectivos e prospectivos em amostras fecais de: 66 animais de companhia (oito
cães e 58 gatos) e 50 cães errantes albergados em canis; 100 bovinos, provenientes de
explorações leiteiras de várias regiões de Portugal; 103 animais cativos no Jardim
Zoológico de Lisboa (75 espécies de mamíferos, 9 espécies de répteis e 9 espécies de
aves); 134 pequenos mamíferos capturados nos concelhos de Moura e Aljustrel, Baixo
Alentejo (52 insectívoros de espécie Crocidura russula e 80 roedores Mus spretus e
dois Apodemus sylvaticus); 39 aves exóticas de gaiola de diversas espécies pertencentes
às Ordens Psittaciformes e Passeriformes (31 de um criador de aves e oito de agregados
familiares) e 52 pombos urbanos (Ordem Columbiformes), da região da grande Lisboa.
A maioria dos animais dos diversos grupos estudados não apresentava sintomatologia.
Nos diversos grupos de animais estudados foram identificados microsporidia em
amostras fecais de 8,6% de cães, 15,5% de gatos 40,7% de aves de gaiola e pombos
urbanos, 6,0% de bovinos e 1,9% de animais silváticos em cativeiro (Jardim
Zoológico).
E. bieneusi foi identificada nas amostras fecais de cães e gatos analisados, cuja
caracterização das sequências ITS rRNA dos 14 isolados de E. bieneusi, amplificados
por PCR, veio revelar a presença de seis genótipos distintos: TipoIV, PtEbIV, Peru6, D,
PtEbVIII e PtEbIX. Os genótipos PtEbIV, PtEbVIII e PtEbIX, foram descritos pela
primeira vez no decurso deste estudo. Nos cães foram identificados os genótipos D
(20%; 1/5), Peru6 (60,0%; 3/5) e PtEbIX (20%;1/5) e nos gatos os genótipos TipoIV
(77,8%), PtEbIV (11,1%) e PtEbVIII (11,9%). Verificou-se associação com
significância estatística da infecção pelo genótipo Tipo IV ao grupo dos gatos,
relativamente aos cães estudados. Também nos bovinos, a espécie E. bieneusi foi
identificada nas seis amostras positivas estudadas registando-se três genótipos diferentes
(dois dos quais já previamente reportados): TipoIV (50%; 3/6), PtEbXI (33,3%; 2/6) e J
(16,7%; 1/6) (AF135837). O genótipo PtEbXI foi caracterizado pela primeira vez no
decurso deste estudo. A espécie E. bieneusi foi identificada nas amostras fecais de dois
mamíferos do jardim Zoológico: o saguim de face branca (Callithrix geoffroyi) e o
xxi
cavalo de Timor (Tragelaphus strepsiceros strepsiceros) e a genotipagem através da
região ITS rRNA dos isolados de E. bieneusi permitiu caracterizar, pela primeira vez,
durante o decurso deste trabalho, dois genótipos distintos: PtEbV (cavalo de Timor) e
PtEbXII (saguim de face branca). A análise da diversidade genética da região ITS rRNA
dos 10 genótipos diferentes de E. bieneusi identificados num total de 22 isolados de
cães, gatos, bovinos e animais do Jardim Zoológico (um primata não humano e um
bovídeo) estudados permitiu verificar a presença na maioria destes mamíferos (cães,
gatos e bovídeos) de genótipos patogénicos para o Homem e de outros genótipos
específicos de hospedeiro (cão, gato, bovinos e primata não humano), que,
possivelmente, não terão impacte na saúde pública humana. Nos 134 pequenos
mamíferos (Crocidura russula, Mus spretus e Apodemus sylvaticus não foi observado
nenhum animal com infecção por microsporidia.
As espécies E. bieneusi e E. hellem foram identificadas, em 35,2% (32/91) e
13,2% (12/91), respectivamente, das aves de gaiola e pombos de parques públicos de
Lisboa estudadas. Registou-se co-infecção por ambas as espécies. Ambos os
microsporidia foram identificados nas três Ordens de aves: Psittaciformes (E. bieneusi-
12,5%; E. hellem- 12,5%); Passeriformes (E. bieneusi- 14,3%; E. hellem- 42,9%) e
Columbiformes (E. bieneusi- 51,9%; E. hellem- 6,9%). Contudo, nos pombos
(Columbiformes) registou-se uma elevada frequência de infecção por E. bieneusi,
estatísticamente significativa, comparativamente à observada nas outras duas Ordens de
aves. Para a espécie E. hellem a percentagem mais elevada de infecção nos
Passeriformes (42,9%; 3/7), não apresentou significância estatística. A caracterização do
locus ITS rRNA, dos 32 isolados, pertencentes à espécie E. bieneusi, revelou a presença
do genótipo Peru6 descrito pela primeira vez em humanos, no Peru, e foi caracterizado
pela primeira vez o genótipo PtEbII muito semelhante ao Peru6, com uma única
alteração nucleotídica (G para A) junto da extremidade 3’ do fragmento amplificado por
PCR. Em pombos registou-se a presença simultânea dos dois genótipos. Nos 12
isolados de E. hellem identificados nas amostras fecais e/ou conteúdo intestinal e numa
raspagem da traqueia da população de aves analisada, e caracterizados com recurso à
sequenciação nucleotídica do fragmento do gene da SSU rRNA, verificou-se 99% a
100% de homologia genética das sequências obtidas com sequências do gene da SSU
rRNA, previamente reportadas no homem e em aves (genótipos 1 e 2). No interior das
xxii
regiões alvo, registaram-se três locais polimórficos, que permitem agrupar em três tipos
diferentes as 12 sequências dos isolados de E. hellem obtidos neste estudo: PtEhI
(genótipo1, previamente descrito); PtEhII (99% homologia genética com genótipo 2) e
PtEh III (99%de homologia genética com PtEhII).
No presente trabalho, também com o intuito de determinar a presença de esporos
de microsporídios, foram analisadas 184 amostras de água, de locais de amostragem
envolvidos no processo conducente ao abastecimento de água da cidade de Lisboa (175
amostras processadas de acordo com o método 1623 da USEPA e purificadas por
separação imunomagnética [IMS] para os géneros Cryptosporidim spp. e Giardia e
nove sem IMS). Cento e seis eram amostras de água tratada (42 captações subterrâneas,
25 captações superficiais, 39 de água de abastecimento), provenientes de três Estações
de Tratamento e reservatórios de água de abastecimento da cidade de Lisboa, e 69 eram
amostras de águas não tratadas, obtidas em captações superficiais (30 amostras) e na
captação subterrânea (30 amostras com IMS e nove sem IMS). As espécies E. bieneusi e
Vittaforma-like foram identificadas em água de abastecimento da cidade de Lisboa,
tanto na água de origem superficial como subterrânea. A genotipagem de Vittaforma-
like revelou a presença de um genótipo Isolado 5830, descrito em humanos, em
Portugal. Também o genótipo Tipo IV de E. bieneusi, potencialmente infectante para o
homem e outros animais, foi identificado em água tratada com origem subterrânea.
Em conclusão, o presente trabalho permitiu demonstrar a presença de espécies
e/ou genótipos de microsporidia patogénicos para o Homem em seropositivos e
seronegativos para VIH, em animais e em águas de consumo público, em Portugal.
Também na nossa população humana, tal como descrito na literatura, a infecção por
estes parasitas, , parece afectar os grupos mais susceptíveis, como os doentes com
imunossupressão, crianças e idosos. Por outro lado, a identificação dos mesmos
genótipos de microsporidia, com destaque para os genótipos de E. bieneusi, em
humanos e animais, sugere a ocorrência de transmissão zoonótica através de animais em
estreito contacto com o Homem. Dos resultados obtidos verificou-se que, quer para os
humanos, quer para os animais não foi observada associação directa entre a infecção por
microsporidia e a presença de sintomatologia, nomeadamente de diarreia, sugerindo a
existência, em ambos os grupos populacionais estudados, de portadores crónicos
assintomáticos e salientando a sua importância no ciclo de transmissão destes parasitas.
xxiii
Em suma a análise dos dados deste estudo sugere um papel relevante a nível da
Saúde Pública, para os microsporidia circulantes, entre a população portuguesa,
evidenciando a necessidade de implementar a pesquisa de microsporídios no
diagnóstico de rotina, com recurso a métodos de referência bem definidos e adequados à
sua utilização nos laboratórios de rotina. A metodológica adoptada neste estudo,
nomeadamente as técnicas de PCR e sequenciação de DNA, traduziu-se numa
abordagem eficaz para atingir os objectivos propostos.
Esperamos que os resultados obtidos neste estudo, contribuam para clarificar a
epidemiologia da microsporidiose em Portugal, mais precisamente, os processos
envolvidos na circulação e transmissão destes microrganismos oportunistas à população
susceptível
xxiv
xxv
Abstract
Microsporidia are small eukaryotic, obligate intracellular parasites with a
widespread occurrence in animals. There are over 1200 species of microsporidia, but
only a few have been identified as cause of human diseases. Before onset of the AIDS
pandemic, microsporidia infections had only been described in few cases, but by the
expansion of the pandemic, microsporidia came increasingly under attention.
The most frequent human infecting microsporidia species are Enterocytozoon
bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, Encephalitozoon hellem and Encephalitozoon.
cuniculi. Recently it has been identified in Portugal, a new species pathogenic to
humans - Vittaforma-like, in HIV-positive patients and in immunocompetent persons.
These emerging opportunistic organisms have now become important pathogens that
can cause a broad spectrum of intestinal and disseminated pathologies depending on the
infectious species involved and also on the immune status of the host. Microsporidia
asymptomatic carriage was already described among both imunossupressed and
immunocompetent population.
The epidemiology of human microsporidia infections is still unclear in many
aspects. Routes of transmission and sources of human microsporidia infections have
been difficult to ascertain. However, the four most common human microsporidian
species have been reported in a wide range of domestic and wild animals. Thus, it has
been debated for some time now whether animals could be a source of infection of
microsporidiosis to humans. More recently, a risk factor consistently associated with
human microsporidiosis in epidemiological studies is the contact with water.
The use of molecular methods has provided new tools to detect and characterize
microsporidia, and the finding of previously unrecognized intraspecific genetic
differences has improved our understanding of the epidemiology and zoonotic
transmission of microsporidia.
This study intended to: (i) confirm the occurrence and determine the frequency
of infection of human patogenic microsporidia in HIV-positive and negative patients, in
several animals species with close contact with humans (pet dogs, cats and birds,
bovines, captive animals from the zoo and pigeons from public parks) and in
environmental samples (water), in order to identify, not only the microsporidian species
xxvi
enrolled in Portuguese human infection, but also to determine potential animal
reservoirs and environmental sources of infection; (ii) to characterize the parasites
found at the genotype level; (iii) to evaluate the public health significance of
microsporidia in Portugal.
The frequency of microsporidia, genetic diversity, distribution of genotypes and
the relationship between observed genotypes and different parameters of infection
among humans, animals and environmental samples enrolled in the study were
investigated using SSU rRNA and ITS-based PCR, followed by DNA sequencing.
In order to achieve the objectives proposed in this study were adopted
methodologies for diagnosis and genetic characterization of microsporidia, selected
after an extensive literature search. All samples were analyzed by both the
parasitological Gram-Chromotrope staining and PCR-techniques, with the exception of
fecal samples from free-living animals and water for public consumption. Water
samples due to the small amount of samples available, have only been studied by
molecular techniques..
For the present work it was carried out a retrospective and prospective study,
comprising 1989 fecal samples from 856 patients (adults and children), HIV-positive
and negative. The percentage of HIV-positive and negative patients studied was 65.5%
(561/856) and 34.5% (295/856), respectively. Of all patients (586 males and 270
females), 675 were adults and 181 children. Of the patients studied 57.6% had diarrhea
and 42.4% had no diarrhea. Nine (3.1%) of the 295 HIV-negative had other causes of
immunosuppression. A frequency of infection with microsporidia of 12.0% (103/856)
was observed in the feces of human population studied; being 13.9% and 8.5% of the
fecal samples from HIV-positive and HIV-negative patients, respectively. Percentages
of 18.8% and 10.2% of positive children and adults, respectively were observed. The
results obtained indicated a significant association between the presence of
microsporidia infection and HIV-positive patients. This data was not a surprising fact
due to the opportunistic nature attributed to this disease. Microsporidia infection was
identified in the feces of patients, which, although HIV-negative, have another type of
immunedeficiency. Overall, the infection with microsporidia was significantly
associated with patients with diarrhea. E. bieneusi was identified in 6.3% (54/856) and
Vittaforma-like in 6.8% (58/856) of the fecal samples from the patients studied. Genetic
xxvii
characterization of the ITS rRNA region was performed on 48 isolates of E. bieneusi
obtained from humans, from a total of 54 amplified by PCR. Six different genotypes
were identified, Type IV (37.5%), Peru 6 (29.2%), D (12.5%), A (8.3 %), C (6.3%) and
PtEbII (6.3%). So far, the genotypes A and C were identified only in humans. In
contrast, Type IV, Peru 6 and D genotypes have been described in a wide range of
hosts, including humans and other animals (including dogs, cats and ruminants in
Portugal). A total of 58 isolates of Vittaforma-like were characterized genetically
revealing the presence of two different genotypes, previously described in humans:
Isolated 5830 (39 samples) and isolate 5843 (19 samples), with frequencies of 67.2%
and 32.8 %, respectively.
Urine samples both collected retrospectively and during the course of the study
were obtained from 69 patients corresponding to 59 (85.5%) HIV-positive patients and
10 (14.5%) HIV-negative patients. Of the total sample, 48 (69.6%) were males and 21
(30.4%) females and 44 (63,8%) were adults and 25 (36,2%) children. Microsporidia
were identified in 1.5% (1/69) of the urine samples, corresponding to one HIV-positive
patient (1.7%; 1/59). The species identified in the urine was E. intestinalis, and
characterization of the sequence of a fragment of the SSU rRNA showed total
homology with several sequences previously described in humans and other animals.
For the identification and characterization of microsporidia were analyzed 200
pulmonary secretions, collected retrospectively and during the course of the study,
corresponding to 124 induced sputa (IS) and 76 bronchoalveolar lavage (BAL) fluids.
The samples were collected from 150 (75%) HIV-positive patients and from 50 (25%)
HIV-negative patients. The proportion of men and women corresponding to the samples
studied was 64.5% and 35.5% respectively. The percentage of microsporidia infection
was 1.0% in pulmonary secretions of the population studied. Two HIV-positive patients
(1.3%) had microsporidia in a BAL and an EI. E. cuniculi and Vittaforma-like were
identified in these specimens. Characterization of SSU rRNA for E. cuniculi revealed
99% homology in this gene sequence with other sequences previously described in
humans for E. cuniculi, and for the species Vittaforma-like there was genetic homology
with the isolate 5830 that was previously described in humans in Portugal. Both
findings are the first records of this species in pulmonary secretions in humans in
Portugal.
xxviii
The detection and characterization of microsporidia in animals, included
retrospective and prospective studies in fecal samples: 66 companion animals (eight
dogs and 58 cats) and 50 stray dogs housed in kennels, 100 cattle from dairy farms in
various regions of Portugal, 103 captive animals in Lisbon Zoo (75 species of
mammals, nine species of reptiles and nine9 species of birds), 134 small mammals
captured in the municipalities of Aljustrel and Moura and Baixo Alentejo (52
insectivores Crocidura Russula and rodents 80 Mus spretus and two Apodemus
sylvaticus) and 39 exotic birds cage of several different species belonging to the orders
Psittaciformes and Passeriformes (31 from a poultry farmer and eight pets) and 52 urban
pigeons (order Columbiformes), from the Lisbon area. Most animals in each group did
not display symptoms. In the several groups of animals studied microsporidia were
identified in fecal samples from dogs (8.6%), cats (15.5%), caged birds and pigeons
(40.7%), bovine (6.0%) and silvatic animals (zoo)(1.9%). E. bieneusi was identified in
fecal samples from cats and dogs. The characterization of the ITS rRNA sequences of 14
isolates of E. bieneusi, has revealed the presence of six different genotypes: TypeIV,
PtEbIV, Peru6, D, and PtEbVIII PtEbIX. Genotypes PtEbIV, PtEbVIII and PtEbIX
were first described during this study. Genotypes D (20%, 1/5), Peru6 (60.0%, 3/5) and
PtEbIX (20%, 1/5) were identified in dogs, and TypeIV (77.8%), PtEbIV (11.1%) and
PtEbVIII (11.9%) were identified in cats. There was a statistically significant
association of infection with genotype Type IV to the group of cats. In cattle, E.
bieneusi was identified in the six positive samples. The genetic characterization
revealed three different genotypes (including two previously reported): TypeIV (50%,
3/6), PtEbXI (33.3%, 2/6) and J (16.7% 1/6). Genotype PtEbXI was characterized for
the first time during this study. The species E. bieneusi was identified in feces of two
mammals from the zoo: the white-fronted marmoset (Callithrix geoffroyi) and horse
Timor (Tragelaphus strepsiceros strepsiceros). ITS rRNA genotyping of the two E.
bieneusi isolates allowed characterizing for the first time during the course of this work,
two distinct genotypes: PtEbV (horse Timor) and PtEbXII (white-fronted marmoset).
Analysis of genetic diversity of the ITS rRNA of 10 different genotypes of E. bieneusi
identified in 22 isolates from dogs, cats, cattle and animals from the zoo (a non-human
primate and bovid) demonstrated the presence in most of these mammals (dogs, cats
and cattle), of genotypes pathogenic to humans and other host specific genotypes (dog,
xxix
cat, cattle, and nonhuman primate), which possibly have no impact on human health. In
the fecal samples of the 134 small mammals (Crocidura Russula, Mus spretus and
Apodemus sylvaticus) studied no microsporidian spores were detected.
The species E. bieneusi and E. hellem were identified in 35.2% (32/91) and
13.2% (12/91), respectively, of caged birds and pigeons from public parks in Lisbon
studied. Co-infection by both microsporidia species were observed in avian samples.
Both microsporidia were identified in three orders of birds studied: Psittaciformes (E.
bieneusi-12.5%; E. hellem-12.5%), Passeriformes (E. bieneusi-14.3%; E. hellem-42,
9%) and Columbiformes (E. bieneusi-51.9%; E. hellem-6.9%). However, in pigeons
(Columbiformes) there was a high frequency of infection by E. bieneusi, statistically
significant compared to that observed in the other two orders of birds. For E. hellem the
highest percentage of infection in the Passeriformes (42.9%; 3/7) was not statistically
significant. The characterization of the ITS rRNA locus of the 32 isolates belonging to
the species E. bieneusi, revealed the presence of genotype Peru6 first described in
humans in Peru, and it has been characterized for the first time PtEbII genotype, very
similar to Peru6, with a single nucleotide change (G to A) near the 3 'end of the
fragment amplified by PCR. The simultaneous presence of the two genotypes was
observed in two pigeons. The genetic sequences obtained from the 12 isolates of E.
hellem identified in fecal samples and/or intestinal contents and a scraping of the
trachea of the bird population, analyzed and characterized using the nucleotide
sequencing of the gene fragment of SSU rRNA, showed 99% to 100% homology with
sequences of the SSU rRNA gene, previously reported in humans and birds (genotypes
1 and 2). Within the target regions, there were three polymorphic sites, which allow to
group the 12 isolates of E. hellem from this study into three different sequences: PtEhI
(genotype1 previously described); PtEh II (99% genetic homology with genotype 2) and
PtEh III (99% of genetic homology with PtEhII).
In the present study 184 water samples were analyzed. These water samples
corresponded to sampling sites involved in the process leading to the water supply of
Lisbon (175 samples processed according to the USEPA 1623 method and purified by
immunomagnetic separation [IMS] and nine without IMS): 106 treated water samples
collected at water treatment plants (25 surface and 42 groundwater source and 39
finished water samples from six main entrance points to the city of Lisbon water
xxx
supply), as well as 69 raw water samples, obtained in the surface (30 samples) and
groundwater source (30 and nine samples with IMS and without IMS treatment,
respectively). The species E. bieneusi and Vittaforma-like were identified in water
supply of the city, both on the surface and groundwater sources. Genotyping of
Vittaforma-like revealed the presence of a genotype (Isolate 5830), described in humans
in Portugal. The Type IV E. bieneusi genotype, potentially pathogenic for man and
other animals, was detected in treated water from groundwater source.
In conclusion, this study confirmed the presence of species or genotypes of
microsporidia pathogenic to humans in HIV-positive and negative patients, in animals
and in water for public consumption in Portugal. Microsporidia infection, as described
in the literature in this study, also appears to affect the most susceptible population,
such as patients with immunosuppression, children and the elderly. The identification
of human infecting microsporidia genotypes, both in humans and animals, in what
concerns the species E. bieneusi suggests zoonotic transmission from animals in close
contact with humans. It was not observed a direct association between infection with
microsporidia and the presence of symptoms, including diarrhea (for both humans and
animals), suggesting the existence in both populations of asymptomatic chronic carriers,
and emphasizing their importance in the transmission cycle of these parasites.
In summary, the analysis of data from this study suggests an important role at
Public Health for the microsporidia circulating among the Portuguese population,
highlighting the need to implement the diagnosis of microsporidia in routine
laboratories, using standard methods well-defined and suitable for use in these
laboratories. The methodology adopted in this study, namely the PCR and DNA
sequencing techniques, resulted in an effective approach to achieve the proposed
objectives. We hope that the results of this study will contribute to clarify the
epidemiology of microsporidiosis in Portugal, more precisely, the processes involved in
the circulation and transmission of opportunistic microorganisms to susceptible
population.
xxxi
Lista de abreviaturas
% – Percentagem
% (m/v) – Percentagem massa/volume
ºC – Grau Celsius
5S rRNA – Sequência pequena do RNA ribossómico da subunidade grande
ribossomal
5.8S rRNA – Sequência pequena do RNA ribossómico da subunidade grande
ribossomal
18S rRNA – Subunidade pequena do RNA ribossómico
26S rRNA – Sequência grande do RNA ribossómico da subunidade grande
ribossomal
A, C, G, T – Bases orgânicas constituintes dos nucleótidos (adenina, citosina,
guanina e timina)
α TUB – Alfa tubulina
AcM – Anticorpo monoclonal
ADP – Adenosina difosfato
ASD – Estudo do espectro do vírus da imunodeficiência humana em adultos e
adolescentes, do inglês Adult and Adolescent Spectrum of HIV Disease
ATP – Adenosina trifosfato
β TUB – Beta tubulina
BSA – Albumina sérica bovina, do inglês bovine serum albumin
CDC – Centro de controlo e prevenção de doenças dos Estados Unidos da
América, do inglês Centers for Disease Control and Prevention.
CT – Ciclo limite de amplificação, do inglês threshold cycle
DNA – Ácido desoxirribonucleico, do inglês desoxiribonucleic acid
dNMP – Desoxirribonucleótido monofosfato
ddNTP – Didesoxirribonucleótido trifosfato
dNTP – Desoxirribonucleótido trifosfato
dsDNA – Ácido desoxirribonucleico em cadeia dupla, do inglês double strand
DNA
xxxii
EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético
EF3 – Factor de elongação 3, do inglês elongation factor 3
EI – Expectoração induzida
ELISA – Teste imunoenzimático especifico, do inglês enzyme-linked
immunosorbent assay
E.U.A. – Estados Unidos da América
EXO – Exonuclease I
g – Grama
g – Aceleração gravitacional (unidade de força centrífuga relativa)
H+ – Ião hidrogénio
HAART – Terapêutica anti-retrovírica potente, do inglês Highly Active
AntiRetroviral Therapy
HCl – Ácido clorídrico
IF – Imunofluorescência
IFI – Imunofluorescência indirecta
IgG – Imunoglobulina do tipo G
IgM – Imunoglobulina do tipo M
IL-1β – Interleucina 1 beta
IL-6 – Interleucina 6
IL-8 – Interleucina 8
IFN-γ – Interferão gama
ITS – Espaçadores internos transcritos, do inglês internal transcribed
spacers, do operão nuclear do RNA ribossómico
Kb – Quilobases
kDa – Quilodaltons
kV – Quilovolt
L – Litro
λ – Lambda
LBA – Lavado broncoalveolar
LO – Lavado oral
mg – Miligrama
Mg2+
– Ião magnésio
xxxiii
Mb – Milhões de pares de bases
MgCl2 – Cloreto de magnésio
ml – Mililitro
MLG – Genótipo multilocus, do inglês multilocus genotype
mm – Milímetro
mM – Milimolar
mm3 – Milímetro cúbico
mmHg – Milímetros de mercúrio
mRNA – Ácido ribonucleico mensageiro, do inglês messenger ribonucleic acid
MSG – Glicoproteínas major de superfície, do inglês major surface
glycoproteins
LSU rRNA – Subunidade grande do RNA ribossómico, do inglês
mithocondrial large subunit ribossomal RNA
SSU rRNA – Subunidade pequena do RNA ribossómico, do inglês
mithocondrial small subunit ribossomal RNA
N – Número
NJ – Método de análise de semelhanças, do ingles Neighbour Joining
ng – Nanograma
nm – Nanómetro
nmol – Nanomol
nt – Nucleótido
O2 – Oxigénio molecular
OH – Grupo hidroxilo
OMS – Organização Mundial de Saúde
P – Probabilidade
PaO2 – Pressão parcial do oxigénio
pb – Pares de base
PBS – Tampão fosfato salino, do inglês phosphate buffered saline
PCA – Análise de componentes principais, do inglês principal componente
analysis
PCR – Reacção de polimerização em cadeia, do inglês polymerase chain
reaction
xxxiv
PFGE – Electroforese em campo pulsado, do inglês pulsed-field gel
electrophoresis
RFLP – Análise de fragmentos de restrição, do inglês restriction fragment
length polymorphism
RNA – Ácido ribonucleico, do inglês ribonucleic acid
rRNA – Ácido ribonucleico ribossómico, do inglês ribosomal ribonucleic acid
RT-PCR – Reacção de polimerização em cadeia em tempo real, do inglês real time
polymerase chain reaction
SCID – Imunodeficiência severa combinada, do inglês Severe combined
immunodeficiency
Sida – Síndroma de imunodeficiência adquirida
SNP – Polimorfismo de base única, do inglês single nucleotide polymorphim
SPSS – Programa informático de análise estatística, do inglês statistical
package for social sciences
SSCP – Análise de polimorfismos por conformação de DNA em cadeia
simples, do inglês single strand conformation polymorphysm
TA – Temperatura de hibridação, do inglês annealing temperature
TAE – Tampão tris-acetato-EDTA
TATA – Sequência característica da região promotora de genes, constituída por
timina e adenina
TBE – Tampão tris-Borato-EDTA
TCD4+ – Linfócitos T com receptores do agrupamento de diferenciação 4, do
inglês cluster of differentiation 4
TCD8+ – Linfócitos T com receptores do agrupamento de diferenciação 8, do
inglês cluster of differentiation 8
TE – Tampão tris-HCl-EDTA
TLR2 – Receptor do tipo toll 2, do inglês toll-like receptor 2
TNF-α – Factor de necrose tumoral alfa
Tris-HCL – Tris(hidroximetilo)aminometano-ácido clorídrico
tRNA – Ácido ribonucleico de transcrição, do inglês transcription ribonucleic
acid
U – Unidade
xxxv
UDG – Uracilo-DNA glicosidase
UCS – Região conservada, do inglês upstream conserved region
UTR – Região não transcrita, do inglês untranslated region
UV – Ultravioleta
V – Volt
VIH – Vírus da imunodeficiência humana
W – Watt
χ2 – Teste do Chi-quadrado
μl – Microlitro
m – Micrómetro
xxxvi
xxxvii
Índice geral
Página
Agradecimentos …….............................................................................................. ix
Publicações …………............................................................................................. xi
Resumo ……........................................................................................................... xvii
Abstract ……........................................................................................................... xxv
Lista de abreviaturas ……....................................................................................... xxxi
Índice geral ……...….............................................................................................. xxxvii
Índice de figuras ……............................................................................................. xlv
Índice de quadros …................................................................................................ xlvii
PRIMEIRA PARTE
(Introdução Geral aos Microsporidia) .………………...........................1
1. Perspectiva histórica …..………………………………………..…................. 3
2. Classificação taxonómica e biologia dos microsporídios................................ 7
2.1. Taxonomia ………………………………………………................... 7
2.1.1 A descoberta e visão inicial sobre a evolução dos
microsporídios …………………………………………..…..….12
2.1.2 Os Archezoa e primeiros dados moleculares dos
microsporídios …………………………………….….……...…13
2.1.3 Uma ligação aos fungos ………………………………….…..…15
2.2 Morfologia e Ciclo de vida …………………………………………....18
2.2.1 Morfologia dos microsporídios ………………………………....18
2.2.2 Ciclo de Vida …………………………………………….……..21
3. Espectro clínico e patogenia no Homem …………………………….……….28
3.1 Infecções por espécies de microsporidia mais frequentes .......................28
3.1.1 Infecção por Enterocytozoon bieneusiI ………………..……......30
3.1.2 Infecção por Encephalitozoon intestinalis ……………….…..….31
3.1.3. Infecção por Encephalitozoon hellemi ………………………….31
3.2. Infecções por espécies de microsporidia menos frequentes …………...33
3.2.1 Infecção por Anncaliia spp. ……………………………..……….33
xxxviii
3.2.2. Infecção por Microsporidium spp. ……………………………...34
3.2.3. Infecção por Nosema ocularum ……………………………..….34
3.2.4 Infecção por Pleistophora sp. …………………………………...34
3.2.5. Infecção por Trachipleistophora spp. ……………………….….35
3.2.6. Infecção por Vittaforma corneae ……………………………….35
4. Imunologia …………………………………………............................................37
4.1.Resposta Imunológica .................................……………….....................38
4.1.1 Relações parasita-hospedeiro …………………………………....39
4.1.2 Mecanismos de resistência do hospedeiro ……..……………..…40
4.1.2.1 Imunidade humoral ………………………………….......40
4.1.2.2 Imunidade celular ………………………………………..41
4.1.3 Especificidade de hospedeiro ……………………………………42
5. 5. Diagnóstico da microsporidiose ………………...............................................44
5.1. Diagnóstico presuntivo ……………………..………………...................44
5.2. Diagnóstico definitivo ………..................................................................44
5.2.1 Microscopia electrónica de transmissão ………………………...45
5.2.2 Microscopia óptica ……………………………………………….46
5.2.2.1 Exame histológico ao microscópio óptico …………….…46
5.2.2.2 Diagnóstico citológico e exame de fezes ………………...47
5.2.2.2.1 Coloração pelo tricrómio modificado ……….…48
5.2.2.2.2 Coloração pelo Gram – Chromotrope ……….....49
5.2.2.2.3 Coloração por fluorocromos …………………...49
5.2.3. Técnicas de imunofluorescência indirecta com anticorpos
mono e policlonais …………………………………………….50
5.2.4 Testes serológicos ………………………………………………51
5.2.5 Isolamento em culturas celulares …………………………….....53
5.2.6 Modelos animais …………………………………………….….54
5.2.7 Métodos moleculares ………………………………………..….55
6. Tratamento da microsporidiose humana …………...........................................67
6.1. Tratamento da infecção intestinal ……. …..……………........................68
6.2. Tratamento da infecção ocular ................................................................70
7. Controlo e prevenção da microsporidiose ………..............................................71
A B
xxxix
8. Epidemiologia da microsporidiose Diagnóstico ……......................................73
8.1.Distribuição geográfica e prevalência no Homem .……………............73
8.1.1 Distribuição geográfica e prevalência no Homem
da espécie Entrocytozoon bieneusi ……………………………...74
8.1.2 Distribuição geográfica e prevalência no Homem
da espécie Encepalitozoon intestinalis…………………………….78
8.1.3 Distribuição geográfica e prevalência no Homem
da espécie Encephalitozoon cuniculi …………………………….79
8.1.4 Distribuição geográfica e prevalência no Homem
da espécie Encephalitozoon hellem ………………………………81
8.1.5 Grupos específicos da População humana, em
risco de microsporidiose ………………………………………….81
8.2. A microsporidiose noutros animais ……….............................................86
8.2.1. Mamíferos ………………………………………………………..86
8.2.2. Aves …………………………………………………………..….89
8.3. Fontes de Infecção e Modos de transmissão ….......................................91
8.3.1. Transmissão inter-humana (vertical e horizontal) .....................91
8.3.2. Transmissão Zoonótica .............................................................93
8.3.3. Transmissão hídrica ………………..……................................96
8.3.4. Transmissão através de alimentos contaminados ......................98
8.3.5. Transmissão aérea ……………………………………………..99
8.3.6. Transmissão por vectores (insectos) ………………………….100
9. Epidemiologia Molecular ……………………………........................................102
9.1. Identificação da diversidade genética de Enterocytozoon
bieneusi ………………………………………………………………….102
9.2. Identificação de diversidade genética de Encephalitozoon
cuniculi ………………………………………………………………….107
9.3. Identificação de diversidade genética de Encephalitozoon
hellem ……………………………………………………………………108
9.4. Identificação de diversidade genética de Encephalitozoon
intestinalis ………………………………………………………………..108
xl
SEGUNDA PARTE
(Caracterização Epidemiológica de Microsporidiose em Portugal ) .... 111
CapítuloI – Objectivos Gerais…………………………………………………...113
Capítulo II – Material e Métodos ….....................................................................117
1. População estudada ………………………………………………….........118
1.1. População humana …………………………………………………....118
1.1.1. Amostras Fecais ..........................................................................118
1.1.2. Amostras de Urina ……………………………………………..119
1.1.3. Secrecções pulmonares ………………………………………...120
1.2. População animal ……………………………...……...………............121
1.2.1. Cães e gatos ……………...........................................................121
1.2.2. Gado bovino de explorações leiteiras ........................................122
1.2.3 Animais silváticos em cativeiro …………………………..........122
1.2.4 Animais silváticos de vida livre ……..…………………...........124
1.2.5 Aves exóticas de gaiola e pombos urbanos .................................125
1.3. Amostras ambientais ............................................................................126
1.4. Definição do critério de positividade ....................................................128
2. Processamento e concentração de amostras fecais, urina e secrecções
pulmonares (expectoração induzida e lavados broncoalveolares) ….….128
2.1. Amostras fecais ....................................................................................128
2.2 Amostras de urina ……………………………….................................129
2.3 Secreções pulmonares ...........................................................................129
2.3.1 Expectoração induzida (EI) .......................................................130
2.3.2 Lavado broncoalveolar (LBA) ……….......................................130
2.4 Obtenção do conteúdo intestinal e exsudado traqueal post mortem
de um grupo de aves ………..……...…................................................131
3. Coloração diferencial ..............................................................................132
3.1 Coloração pelo Gram-Chromotrope (GC) …………………................132
3.1.1 Quantificação da carga parasitária ………………………….....133
4. Extracção de DNA .....................................................................................134
xli
5. Diagnóstico molecular das espécies Enterocytozoon bieneusi,
Encephalitozoon intestinalis, Encephalitozoon cuniculi,
Encephalitozoon hellem e Vittaforma-like .............................................. 136
5.1 Amplificação de DNA genómico de microsporídios no geral ..........138
5.2 Amplificação de DNA genómico de Encephalitozoon intestinalis,
Encephalitozoon cuniculi, Encephalitozoon hellem ...........................139
5.3 Amplificação e caracterização genética de DNA genómico de
Enterocytozoon bieneusi ……….........................................................141
5.3.1 Amplificação de DNA genómico de Enterocytozoon
bieneusi ………………………………………………….……141
5.3.2 Desenvolvimento e optimização de uma nova técnica de PCR
nested …...................................................................................142
5.3.3 Caracterização génetica dos isolados de Enterocytozoon
bieneusi ……………………………………………………….144
5.4 Caracterização Genética de uma nova espécie de microsporídio -
Vittaforma-like ..................................................................................145
5.4.1 Detecção da espécie Vittaforma-like …………….………….145
5.4.2 Amplificação de DNA genómico de Vittaforma-like .............146
5.5 Visualização do DNA amplificado ……………..............................147
6. Purificação e Sequenciação dos fragmentos amplificados
por PCR ………………………………………………………………..148
6.1 Análise da diversidade genética da região ITS rRNA de
E. bieneusi de animais (mamíferos) ……..........................................152
7. Análise estatística ...................................................................................153
Capitulo III - Detecção e caracterização genética de microsporidia
em humanos (seropositivos e seronegativos para VIH) ..............155
1. Introdução ……….……………..…………………..….………….........157
2. Resultados ………………………...……………….………...………….158
2.1 Detecção e identificação de microsporídios em amostras fecais,
amostras de urina e secreções pulmonares de doentes infectados
por VIH ..............................................................................................158
2.1.1 Microsporidia em amostras fecais ...........................................158
xlii
2.1.1.1 Seropositivos para o VIH ...………………………….162
2.1.1.2 Seronegativos para VIH .………………………….…164
2.1.1.3 Caracterização genética dos isolados de
Enterocytozoon bieneusi e Vittaforma-like ……….…165
2.1.2 Microsporidia em amostras de urina …..…………………….171
2.1.2.1 Seropositivos para ..VIH …………………………...171
2.1.2.2 Seronegativos para VIH ………….………………...172
2.1.3 Microsporidia em secreções pulmonares ……………….….172
2.1.3.1 Seropositivos para VIH …..………………………...173
3. Discussão ………………………...……………….………..…………….175
Capitulo IV - Detecção e caracterização genética de microsporidia
em animais ……………………………………………………….....187
1. Introdução ……….…………….………………….….…………...….….189
2. Resultados ………………………...……………….…………………….190
2.1 Detecção e identificação de microsporídios em animais ....................190
2.1.1 Ocorrência e identificação de microsporídios
em animais domésticos - cães e gatos e cães errantes .............190
2.1.2 Ocorrência e identificação de microsporídios em bovinos .….191
2.1.3 Ocorrência e identificação de microsporídios em animais
silváticos em cativeiro (Jardim Zoológico de Lisboa) ……….192
2.1.4 Ocorrência e identificação de microsporídios em animais
silváticos de vida livre …………………….………………….193
2.1.5 Diversidade genética da região ITS rRNA de
Enterocytozoon bieneusi na população de animais estudada ...195
2.2 Microsporidia em aves exóticas de gaiola e pombos
urbanos de Lisboa .…………………………………………………...197
2.2.1 Ocorrência e identificação de microsporídios ………………..197
2.2.2 Caracterização genética dos isolados de Enterocytozoon
bieneusi e Encephalitozoon hellem ...………………………...199
3. Discussão ………………………...……………….…..………………….203
xliii
Capitulo V - Detecção e caracterização genética de microsporidia
em amostras ambientais ………………………………………...…..213
1. Introdução ……….…………….……………….….………….…..............215
2. Resultados ………………………...……………….…..………….…........216 2.1 Detecção e identificação de microsporídios em água
subterrânea e superficial, tratada e não tratada ....................................216
3. Discussão ………………………...………………...….…………….........217
Capitulo VI – Conclusão ……………….……………………………………….....221
Capitulo VII – Referências bibliográficas ………………………………………..229
xliv
xlv
Índice de figuras
Página
Figura 1. Fotografia de Karl Wilhelm von Nägeli (1817-1891) e capa
da publicação aludindo à sua palestra sobre N. bombysis,
em 1857 ................................................................................................. 3
Figura 2. Fotografia de microscopia electrónica de varrimento de esporos de
microsporidia em cultura in vitro .......................................................... 7
Figura 3. Diagrama e fotografia de microscopia electrónica de transmissão
da estrutura interna de um esporo de microsporídio ............................. 19
Figura 4. Fotografias de microscopia electrónica de varrimento do
esporo de microsporida com o filamento polar exteriorizado
injectando o esporoplasma na célula .................................................... 21
Figura 5. Representação esquemática do ciclo de vida de dois géneros de
Microsporidia patogénicos para o Homem (Enterocytozoon
bieneusi e Encephalitozoon spp.) .......................................................... 24
Figura 6. Secção de jejuno intestinal infectado por E. bieneusi. .......................... 30
Figura 7. Fotografia de esporos de Encephalitozoon cuniculi em esfregaço
de secreção pulmonar, corados pela técnica do calcoflúor; Fotografia
de esporos de Encephalitozoon. intestinalis, em esfregaço de cultura,
corados por Gram-Chromotrope ............................................................ 47
Figura 8. Fotografia de esporos de microsporidia, em esfregaço fecal,
corado por Gram-Chromotrope …………………………………......... 159
Figura 9. Fotografias dos produtos de PCR de isolados de E. bieneusi e
Vittaforma-like, após separação por electroforese em gel de agarose .... 160
Figura 10. Fotografia do produto de PCR do isolado de E. intestinalis após
separação por electroforese em gel de agarose ………………............171
Figura 11. Fotografias de esporos de E. cuniculi, em esfregaço de lavado
brocoalveolar, corado por Gram-Chromotrope ................................... 172
xlvi
Figura 12. Fotografia do produto de PCR do isolado de E. cuniculi ................... 174
Figura 13. Relação filogenética entre os genótipos de E. bieneusi
identificados nos mamíferos e outros genótipos de E. bieneusi,
inferida pela análise de sequências do gene ITS rRNA ........................ 196
Figura 14. Fotografia de esporos de Encepalitozoon hellem em esfregaço da
Mucosa traqueal de um papagaio cinzento (Psittacus erithacus).
Coloração pelo Gram-Chromotrope ……………………….................198
xlvii
Índice de quadros
Página
Quadro I. Espécies de microsporidia mais frequentes descritas como
infectantes para o Homem ………………………………………........ 8
Quadro II. Espécies de microsporidia menos frequentes descritas como
infectantes para o Homem …............................................................... 9
Quadro III. Microsporídios patogénicos para o Homem, e respectivos
locais de infecção …........................................................................... 29
Quadro IV. Revisão de primers utilizados no diagnóstico molecular de
Microsporidia …................................................................................. 61
Quadro V. Terapêutica das microsporidioses ……....………………………....... 68
Quadro VI. Diversos estudos de prevalência de E. bieneusi em seropositivos
para VIH, em África, América, Austrália e Ásia ……………........... 75
Quadro VII. Diversos estudos de prevalência de E. bieneusi em
seropositivos para VIH, na Europa ................................................. 76
Quadro VIII. Casos exporádicos de infecção por E. cuniculi, confirmados
por técnicas de biologia molecular ……...……………………...... 80
Quadro IX. Casos reportados de infecção por microsporidia em doentes
transplantados .. ……………………………………………………...84
Quadro X. Alguns reservatórios animais das espécies de microsporidia mais
frequentes infectantes para o Homem .................................................. 94
Quadro XI. Alguns reservatórios animais das espécies de
microsporidia menos frequentes infectantes para o Homem ……...... 95
Quadro XII. Genótipos de E. bieneusi caracterizados pela sequência da
região ITS rRNA, decritos no Homem ............................................. 104
Quadro XIII. Genótipos de Enterocytozoon bieneusi caracterizados pela
região ITS e descritos em animais de companhia (cães e gatos) ...104
xlviii
Quadro XIV. Genótipos de Enterocytozoon bieneusi caracterizados pela
sequencia da região ITS rRNA, decritos no Homem e outros
animais …........................................................................................ 105
Quadro XV. Genótipos de Enterocytozoon bieneusi caracterizados pela
sequência da região ITS rRNA e descritos em diversos grupos de
hospedeiros …………………………………………………….….. 106
Quadro XVI. Genótipos de Enterocytozoon bieneusi caracterizados pela
sequência da região ITS rRNA e descritos em gado bovino e
suínos .............................................................................................. 106
Quadro XVII. Hospedeiros e distribuição geográfica das estirpes de
E. cuniculi ……………………………………………………...... 107
Quadro XVIII. Mamíferos do Jardim Zoológico de Lisboa cujas
fezes foram submetidas a técnicas parasitológicas e
moleculares para identificação de microsporídios …………....... 123
Quadro XIX. Aves do Jardim Zoológico de Lisboa cujas fezes foram
submetidas a técnicas parasitológicas e moleculares para
identificação de microsporídios ……………………………...….... 124
Quadro XX. Répteis do Jardim Zoológico de Lisboa cujas fezes foram
submetidas a técnicas parasitológicas e moleculares, para
identificação de microsporídios …………………………….…...... 124
Quadro XXI. Critério para a determinação da carga parasitária dos
isolados de microsporídios, englobados no presente
estudo ……………………………………………………….….... 133
Quadro XXII. Sequências nucleotídicas e características dos primers
utilizados na amplificação e sequenciação directa do gene
SSU rRNA de microsporídios ………………………………….... 138
xlix
Quadro XXIII. Condições das reacções de PCR do gene SSU rRNA de
microsporídios ………………..................................................... 139
Quadro XXIV. Sequências nucleotídicas e características dos primers
utilizados na amplificação e sequenciação directa do gene
SSU rRNA de E. intestinalis, E. cuniculi e E. hellem ………...... 140
Quadro XXV. Condições das reacções de PCR do gene SSU rRNA de
E. intestinalis, E. cuniculi e E. hellem ………………...……….... 141
Quadro XXVI. Sequências nucleotídicas e características dos
primers (AL4037/AL4039 e AL4038/AL4040)
utilizados na amplificação e sequenciação directa da região
SSU ITS LSU rRNA, de E. bieneusi por PCR nested ………....... 141
Quadro XXVII. Condições das reacções de PCR nested
(primers AL4037/AL4039 e AL4038/AL4040) para
amplificação da região região SSU ITS LSU rRNA,
de E. bieneusi ….......................................................................... 142
Quadro XXVIII. Sequências nucleotídicas e características dos
primers (MLLF1/MLLR1 e MLLF2/MLLR2) utilizados
na amplificação e sequenciação directa da região
SSU ITS LSU rRNA, de E. bieneusi por PCR nested ……..... 143
Quadro XXIX. Condições das reacções de PCR nested
(primers MLLF1/MLLR1 e MLLF2/MLLR2 para
amplificação da região região SSU ITS LSU rRNA,
de E. bieneusi ……………………………….…………….…..... 144
Quadro XXX. Sequências nucleotídicas e características dos primers
utilizados na amplificação e sequenciação directa do gene
SSU rRNA de Vittaforma-like ………………………………....… 146
Quadro XXXI. Condições das reacções de PCR do gene SSU rRNA de
Vittaforma-like. ............................................................................ 147
l
Quadro XXXII. Distribuição das frequências de microsporidia, em relação
à idade e género dos doentes englobados no estudo ….…........ 161
Quadro XXXIII. Distribuição das frequências de microsporidia, em relação
à serologia para VIH e presença ou ausência de diarreia,
dos doentes englobados no estudo …………………………... 162
Quadro XXXIV. Distribuição das frequências de microsporidia, em relação
à idade, género e quadro clínico, em seropositivos para
VIH …………………………………………………………... 163
Quadro XXXV. Distribuição das frequências de microsporidia, em relação
à idade, género e quadro clínico, em seronegativos
para VIH …................................................................................ 165
Quadro XXXVI. Dados demográficos, clínicos, laboratoriais e
epidemiológicos dos seropositivos para VIH com
microsporidia nas amostras fecais, cujos isolados
foram caracterizados no presente trabalho .................................167
Quadro XXXVII. Dados demográficos, clínicos, laboratoriais e
epidemiológicos dos seronegativos para VIH com
microsporidia nas amostras fecais, cujos isolados
foram caracterizados no presente trabalho ………………..... 170
Quadro XXXVIII. Dados demográficos, clínicos, laboratoriais e epidemiológicos
dos dois doentes, cujos isolados de E. cuniculi e Vittaforma-like
foram caracterizados no presente trabalho …....................... 173
Quadro XXXIX. Dados dos animais – cães, gatos, gado bovino e animais
silváticos em cativeiro, identificados com microsporidia
e cujos isolados foram caracterizados no presente
trabalho …………………………………………….……….... 194
Quadro XL. Dados das diversas espécies de aves identificadas com
microsporidia e cujos isolados foram caracterizados no
presente trabalho ………………………………………………....... 202
li
Quadro XLI. Ocorrência de microsporidia em amostras de água tratada e
não tratada em locais de amostragem envolvidos no processo
conducente ao abastecimento de água da cidade de Lisboa ….......217
- Primeira parte –
INTRODUÇÃO GERAL AOS MICROSPORIDIA
1.PERSPECTIVA HISTÓRICA
1.PERSPECTIVA HISTÓRICA
- 3 -
1. PERSPECTIVA HISTÓRICA
Os microsporídios, são eucariotas, parasitas intracelulares obrigatórios, ubíquos
na natureza, considerados agentes patogénicos emergentes, no Homem e nos animais.
Após o advento da pandemia da síndrome da imunodeficiência adquirida (sida), as
infecções por microsporidia, passaram a ser objecto de vários estudos, que conduziram a
um conhecimento mais profundo, sobre os diversos aspectos clínicos, terapêuticos e de
diagnóstico laboratorial destes microrganismos. Apesar dos progressos alcançados nos
últimos anos, a epidemiologia das doenças causadas por microsporídios ainda não é
bem conhecida.
Durante a primeira metade do século XIX, uma grave epidemia, conhecida por
pebrina (que no dialecto do sul de França quer dizer doença da pimenta), afectou a
indústria europeia de sericicultura, particularmente em França e Itália. Naquela época,
foram vários os investigadores, entre os quais o famoso Louis Pasteur, que
direccionaram estudos com o objectivo de identificar o responsável pela enfermidade no
bicho-da-seda (Bombyx mori) [Wittner 1999; Franzen 2008]. O agente em causa, foi
designado Nosema bombycis, pelo microbiologista suisso Karl Wilhelm von Nägeli
(1857) [Nageli 1857] (Figura 1).
Figura 1. Fotografia de Karl Wilhelm von Nägeli (1817-1891) e capa da publicação
aludindo à sua palestra sobre N. bombysis, em 1857. Adaptado de [Franzen 2008]
1.PERSPECTIVA HISTÓRICA
- 4 -
Mais tarde, foram descritas novas doenças provocadas por estes microrganismos,
noutros hospedeiros, com particular relevância em abelhas e nalgumas espécies de
peixes [Canning & Lom 1986; Canning & Hollister 1987; Canning & Hollister 1992b;
Franzen 2008].
O primeiro registo de microsporídios em mamíferos, data de 1922, em que
Wright e Craighead descreveram a infecção em coelhos de laboratório, que
apresentavam sintomatologia nervosa [Wright & Craighead 1922; Franzen 2008]. No
ano seguinte, a espécie E. cuniculi, foi considerada por Levaditi e colaboradores
[Levaditi et al. 1923; Franzen 2008], como o microsporídio associado à encefalite dos
lagomorfos.
Embora, reconhecidos como agentes patogénicos, em diversas espécies de
animais, o primeiro caso de infecção no Homem por microsporídios só foi registado em
1959. Matsubayashi e colaboradores descreveram um caso de microsporídiose num
rapaz de nove anos de idade com manifestações neurológicas [Matsubayashi et al. 1959;
Franzen 2008]. O agente envolvido, inicialmente, foi considerado como sendo
pertencente ao género Encephalitozoon. Alguns autores, mais tarde, atribuíram a
infecção da criança, à espécie Encephalitozoon cuniculi [Wittner 1999]. No período que
se seguiu até 1984, foram ocasionais e pouco valorizados pela comunidade científica, os
registos de microsporidiose no Homem.
Em Junho de 1981, era reconhecida pela primeira vez a sida. Esta pandemia,
veio alterar profundamente o nível de interesse, dedicado aos microsporídios, até essa
data. Assim, uma nova visão sobre estes organismos, como agentes emergentes de
infecções oportunistas no Homem, ganha terreno após os primeiros registos. Em 1985,
Desportes e colaboradores, descreviam, pela primeira vez, uma nova espécie de
microsporídio, nos enterócitos de um doente com sida, associado a diarreia persistente e
infecção sistémica: Enterocytozoon bieneusi [Desportes et al. 1985]. Quase
simultaneamente, outros dois grupos de investigadores reportaram a identificação do
mesmo organismo [Dobbins, III & Weinstein 1985; Modigliani et al. 1985].
Em 1991, foi identificada a espécie Encephalitozoon hellem, a partir de lesões de
queratoconjuntivite, em três doentes com sida [Didier et al. 1991b]. A descoberta de
uma segunda espécie do género Encephalitozoon, com recurso a uma nova metodologia
1.PERSPECTIVA HISTÓRICA
- 5 -
de diagnóstico, questionou a etiologia dos casos clínicos anteriormente descritos, e
atribuídos a E. cuniculi.
Uma terceira espécie, Encephalitozoon intestinalis, inicialmente denominada
Septata intestinalis [Cali et al. 1993], foi isolada em doentes com sida, em 1993, como
agente de diarreia aguda, nefrite e ainda colecistite. Dois anos mais tarde, as dúvidas
dissiparam-se quanto à patogenicidade de E. cuniculi, ao identificar-se uma infecção
disseminada por este parasita, num doente com sida [De Groote et al. 1995].
A terapêutica anti-retrovírica potente (HAART, acrónimo anglo-saxónico para
highly active antiretroviral therapy), administrada aos doentes infectados por vírus da
imunodeficiência humana (VIH), parece ter reduzido a frequência da microsporidiose
intestinal, entre este grupo da população [Goguel et al. 1997; Conteas et al. 2000; Miao
et al. 2000; van Hal et al. 2007]. Contudo, em países em vias de desenvolvimento, tem
vindo, a observar-se o registo de um crescente número de casos de microsporidiose. A
elevada prevalência de VIH/sida entre a população, destas regiões, na maioria sem
acesso a terapêutica anti-retrovírica, associados à existência de precários sistemas de
saúde no terreno são apontadas como potenciais causas deste aumento [Endeshaw et al.
2006].
Actualmente, estão descritas na literatura, mais de 1200 espécies de
microsporídios, pertencentes a 150 géneros [Wittner 1999; Didier & Weiss 2006]. Nos
últimos anos, a espécie com maior número de casos reportados foi E. bieneusi, seguida
de E. intestinalis, E. hellem e E. cuniculi, sendo as duas primeiras consideradas como os
principais agentes de microsporidiose intestinal. Cerca de 14 espécies de
microsporídios, são reconhecidas como infecciosas para o Homem [Wittner 1999;
Franzen 2008]. Porém, à medida que aumenta o interesse por estes microrganismos, e
novas e mais eficazes metodologias de diagnóstico são desenvolvidas, verifica-se um
aumento crescente de registos de novas espécies potencialmente patogénicas.
A ocorrência de microsporidiose encontra-se intimamente ligada à infecção
VIH/sida, todavia têm sido descritos, um número crescente de casos de infecção
intestinal em seronegativos para VIH, mas que possuem um grau variável de
imunossupressão, como o que se verifica em transplantados de órgãos, doentes com
neoplasias, ou com patologias auto-imunes. Igualmente, os registos de casos de
microsporidiose em crianças, idosos, e viajantes são cada vez mais frequentes, assim
1.PERSPECTIVA HISTÓRICA
- 6 -
como, a descrição de microsporídios em portadores assintomáticos [Didier & Weiss
2006].
Embora nas últimas décadas, o reconhecimento gradual da importância dada a
estes microrganismos, tenha proporcionado avanços significativos, nas diversas
vertentes que abrangem o estudo dos microsporídios, reflectindo-se no aumento
exponencial de publicações presentes na “National Library of Medicine”
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi), são ainda, muitas as lacunas, que
envolvem este grupo de importantes organismos emergentes. É, então, de prever, que
exista um longo caminho a percorrer, tendo por objectivo, a clarificação da biologia e
epidemiologia da microsporidiose, fundamental para avaliação dos factores de risco,
identificação de alvos terapêuticos e estratégias de prevenção e controlo desta infecção
oportunista emergente.
2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA E BIOLOGIA DOS MICROSPORÍDIOS
- 7 -
2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA E BIOLOGIA DOS MICROSPORÍDIOS.
2.1. TAXONOMIA
Os microsporídios, são microrganismos eucariotas, unicelulares, de distribuição
ubiquitária, com relevância médica, bem como importância comercial, ao nível de
determinadas indústrias. Estes microrganismos pertencem ao filo Microsporidia
Balbiani 1882 [Balbiani 1882; Wittner 1999], constituído por mais de 1200 espécies,
que parasitam membros de todos os filos animais, e entre as quais 14 espécies são
consideradas infectantes para o Homem [Didier 2005; Didier & Weiss 2006]. O termo
microsporidia é, também, utilizado como designação não taxonómica para estes
parasitas intracelulares obrigatórios. Na Figura 2 podem ser observados esporos de
quatro espécies de microsporídios patogénicos para o Homem em fotografias de
microscopia de varrimento.
Figura 2. Fotografia de microscopia electrónica de varrimento de esporos de
microsporidia em cultura in vitro. (A) E. hellem; (B) Anncaliia algerae; (C) E. cuniculi;
(D) E. intestinalis. Adaptado de [Visvesvara et al. 1999b]
2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA E BIOLOGIA DOS MICROSPORÍDIOS
- 8 -
Nos Quadros I e II, é apresentado um resumo das 14 espécies de microsporidia
consideradas infectantes para o Homem, as suas classificações originais e/ou as
actualmente consideradas válidas, assim como o primeiro registo da infecção no
Homem.
Quadro I. Espécies de microsporidia mais frequentes descritas como infectantes para o
Homem. Adaptado de [Didier 2005].
ESPÉCIES REFERÊNCIAS
MAIS FREQUENTES
Enterocytozoon bieneusi
Designação taxonómica actual [Desportes et al. 1985] Primeiro registo no Homem [Desportes et al. 1985]
Encephalitozoon (sin. Septata)
intestinalis
Designação taxonómica original [Cali et al. 1993] Designação taxonómica actual [Hartskeerl et al. 1995] Primeiro registo no Homem [Cali et al. 1991c]
Encephalitozoon hellem
Designação taxonómica actual [Didier et al. 1991a] Primeiro registo no Homem [Friedberg et al. 1990]
Encephalitozoon cuniculi
Designação taxonómica actual [Levaditi et al. 1923]
Primeiro registo no Homem [Bergquist et al. 1984a; Bergquist et al. 1984b]
2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA E BIOLOGIA DOS MICROSPORÍDIOS
- 9 -
Quadro II. Espécies de microsporidia menos frequentes descritas como infectantes para
o Homem. Adaptado de [Didier 2005].
ESPÉCIES REFERÊNCIAS
MENOS FREQUENTES
Anncaliia (sin. Nosema e Brachiola)
algerae
Designação taxonómica original [Vavra & Undeen 1970; Lowman et al. 2000] Designação taxonómica actual [Franzen et al. 2006] Primeiro registo no Homem [Visvesvara et al. 1999a]
Anncaliia (sin. Nosema e Brachiola)
connori
Designação taxonómica original [Cali et al. 1998] Designação taxonómica actual [Franzen et al. 2006] Primeiro registo no Homem [Matsubayashi et al. 1959; Margileth et al. 1973; Weiser 1993]
Anncaliia (Sin. Nosema-like e
Brachiola) vesicularum
Designação taxonómica original [Cali et al. 1996; Cali et al. 1998]; Designação taxonómica actual [Franzen et al. 2006] Primeiro registo no Homem [Cali et al. 1996]
Microsporidium africanum (sin.
Nosema sp.)
Designação taxonómica original [Pinnolis et al. 1981] Designação taxonómica actual [Canning & Lom 1986]
Primeiro registo no Homem [Pinnolis et al. 1981]
Microsporidium ceylonensis (sin.
Nosema sp.)
Designação taxonómica original [Sprague 1977] Designação taxonómica actual [Canning & Lom 1986] Primeiro registo no Homem [Ashton & Wirasinha 1973]
Nosema ocularum Designação taxonómica actual [Cali et al. 1991a] Primeiro registo no Homem [Bryan et al. 1991]
Pleistophora ronneafiel (sin.
Pleistophora sp)
Designação taxonómica actual [Cali & Takvorian 2003]
Primeiro registo no Homem [Ledford et al. 1985]
Trachipleistophora antropophtera Designação taxonómica actual [Vavra et al. 1998] Primeiro registo no Homem [Yachnis et al. 1996]
Trachipleistophora hominis Designação taxonómica actual [Hollister et al. 1996b] Primeiro registo no Homem [Field et al. 1996]
Vittaforma corneae (sin. Nosema
corneum)
Designação taxonómica original [Shadduck et al. 1990] Designação taxonómica actual [Silveira & Canning 1995] Primeiro registo no Homem [Davis et al. 1990]
2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA E BIOLOGIA DOS MICROSPORÍDIOS
- 10 -
Dado que, até há alguns anos atrás, eram parcos os conhecimentos sobre estes
organismos, as classificações atribuídas aos microsporídios eram simples e artificiais.
Tradicionalmente, a classificação das espécies de microsporidia fundamenta-se
nas características ultra estruturais e ecológicas, incluindo as dimensões e morfologia
dos esporos e o número de voltas do filamento polar, no ciclo de vida, no tipo de inter-
face parasita-hospedeiro, e no ciclo de desenvolvimento no interior do hospedeiro
[Franzen 2008].
Ao nível estrutural, os microsporidia caracterizam-se por uma redução
significativa, ou mesmo por ausência de determinados constituintes típicos dos
organismos eucariotas, tais como, mitocôndrias, um clássico aparelho de Golgi e
flagelos. A sua organização celular simplificada, tem dificultado o estabelecimento das
relações evolutivas entre os microsporidia e os outros eucariotas, dado que estes
parasitas, não possuem algumas das características, habitualmente usadas, para esse tipo
de comparações. De início, estas características, conduziram à teoria, que considerava
que os microsporídios, divergiam de uma forma ancestral eucariota, antes das células
eucariotas terem adquirido as mitocôndrias (teoria endosimbiótica) [Li et al. 1996]. Os
primeiros estudos bioquímicos e moleculares deste grupo, vierem reforçar esta hipótese.
No entanto, durante a última década, surgiram evidências divergentes,
suportadas por novos dados moleculares. Como resultado destes estudos, foi insinuado a
existência de uma proximidade de parentesco, entre os microsporidia e os fungos.
Sugeriu-se que, características que haviam sido, no início, interpretadas como
primitivas, não são mais do que meras adaptações especializadas inerentes ao seu ciclo
de vida parasitário obrigatório.
Estes parasitas, ao constituirem-se simultaneamente, como organismos simples,
embora também demonstrando um elevado grau de complexidade, têm gerado extensas
e controversas revisões sobre a sua origem evolutiva. Se por um lado, os microsporídios
perderam determinadas características, habitualmente, utilizadas para a comparação
entre eucariotas, por outro lado encontram-se tão adaptados ao parasitismo intracelular,
que acabaram por desenvolver diversas características exclusivas deste grupo de
organismos.
2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA E BIOLOGIA DOS MICROSPORÍDIOS
- 11 -
Durante os últimos 150 anos, a classificação dos microsporídios em diferentes
sistemas taxonómicos, tem-se revelado bastante instável. Com particular relevância, nas
últimas três décadas, a aplicação da microscopia electrónica e de metodologia
molecular, vieram despoletar novas questões sobre a taxonomia dos microsporidia.
Simultaneamente, verificou-se um interesse gradual nestes organismos, como agentes
patogénicos, oportunistas, no Homem, em especial, nos doentes com imunussupressão
[Weiss 2001; Franzen 2008].
Em 1909, Stempell eleborou, pela primeira vez, uma classificação de
microsporídios em que estes eram distinguidos dos mixosporídios, grupo com o qual,
até então, eram frequentemente confundidos. Posteriormente, esta classificação foi
alterada por Léger e Hesse, em 1922 e Kudo [Kudo 1925], vigorando atémeados da
década de 70 [Sprague 1977]. No final deste período, já existiam inúmeras publicações
com dados obtidos de microscopia electrónica, consequentemente tornava-se preemente
ocorrer uma reestruturação da classificação até então utilizada. Os primeiros modelos
modernos foram propostos por Weiser [Weiser 1976] e Sprague [Sprague 1977]. Este
último autor propôs a designação de Filo Microspora, bem como reclassificou as
espécies-tipo em géneros, segundo aspectos inerentes ao desenvolvimento do ciclo de
vida do parasita. Nos anos seguintes, Sprague propôs um segundo modelo, que serviria,
posteriormente, de suporte às classificações de Larsson e de Canning , contudo não
existiam critérios em relação aos taxa superiores á família [Wittner 1999]. Em 1992,
numa revisão elaborada por Sprague e colaboradores foram introduzidos na taxonomia,
como critério principal, os aspectos referentes à divisão nuclear, sem que isso
implicasse profundas alterações em ralação à definição dos taxa família e género.
Assim, o modelo proposto tornou-se complexo e de difícil utilização, constantando-se
um uso preferencial do modelo proposto por Canning.
Com o acumular de evidências moleculares durante a última década do século
XX, constatou-se que os microsporídios são aparentados com os fungos. Cavalier-Smith
transferiu o filo Microsporidia Balbiani 1882, para o sub-Reino Eomycota Cavalier-
Smith, em 1998 e subdividiu o filo em duas classes: Minisporea e Microsporea. Esta
última classe é composta por duas sub-classes: Pleistophorea (microsporídios com
divisão em plasmotomia e diferenciação de um único tipo de esporo) e disporea (fissão
2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA E BIOLOGIA DOS MICROSPORÍDIOS
- 12 -
binária e diferenciação de dois tipos de esporos) [Cavalier-Smith 1998]. Por outro lado
as análises moleculares filogenéticas revelaram-se inconsistentes chegando mesmo a ser
proposta a sua subdivisão em três classes, Aquasporidia, Marinosporidia e Terrasporidia
reflectindo o habitat de cada grupo [Vossbrinck & brunner-Vossbrinck 2005].
Quando se comparam as árvores filogenéticas, baseadas na sequência
nucleotídica do DNA, com as classificações clássicas, sustentadas em critérios
fenotípicos, verifica-se que as relações de semelhança entre os géneros e espécies, se
alteram. A tendência actual da taxonomia moderna, é reavaliar os dados sobre a
morfologia, fisiologia e ecologia e integrá-los com a informação genómica, no que se
denomina por taxonomia polifásica [Rosselló-Mora & Amann 2001], podendo daqui
resultar novos critérios para a delimitação dos grupos taxonómicos. A concordância de
resultados, obtida pela utilização independente dos diferentes critérios, proporciona
maior grau de certeza nas afinidades estabelecidas e na evolução sequencial de
determinado grupo de organismos.
Apesar dos avanços, dos últimos anos, na direcção de estabelecer a origem
evolutiva dos microsporídios, um número elevado de questões permanecem por
esclarecer. A clarificação da taxonomia dos microsporídios, é essencial para se atingir
maior percepção da epidemiologia destes parasitas, possibilitando o controlo da sua
transmissão.
Em seguida será efectuada uma abordagem sumária, às diversas classificações
taxonómicas que têm sido atribuídas aos microsporídios e, alguns dos fundamentos que
as suportam.
2.1.1. A descoberta e visão inicial sobre a evolução dos microsporídios.
Em 1857, N. bombycis a primeira espécie de microsporidia, identificada por
Nägeli, foi descrito como sendo semelhante a uma levedura e, incluido no grupo dos
fungos, mais propriamente nos Schizomycetes [Franzen 2008]. Curiosamente, esta
classificação inicial não anda muito longe da que é, actualmente, proposta por alguns
autores. No entanto, a descrição de Nagëli, não resultaria de um conhecimento
detalhado do organismo mas, certamente, das noções limitadas sobre a biodiversidade e
nomenclatura primitiva dos microrganismos, à data. Esta classificação inicial, como
2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA E BIOLOGIA DOS MICROSPORÍDIOS
- 13 -
fungo, foi revista, rapidamente, acompanhando o crescimento de um sistema
taxonómico mais complexo, que levava em conta o grupo dos protistas. Balbiani, em
1882, incluiu o microsporídio Nosema, no grupo dos protozoários, Sporozoa. Este
grupo, constituido por um conjunto de parasitas com produção de esporos, incluia
diversos organismos, hoje em dia, reconhecidos como membros dos Apicomplexa
(alveolados), os Haplosporidia, e um subgrupo designado como Cnidosporidia. Estes
últimos, compreendem os Mixosporidia (animais), os Actinomicidia (protistas de
origem desconhecida), os Helicosporidia (algas verdes), e os Microsporidia [Kudo
1947; Corradi & Keeling 2009].
Apesar das incongruências, face aos conhecimentos actuais, estas classificações
foram importantes, na tentativa de compreender a origem evolutiva dos microsporídios,
na medida em que acabaram por ser reconhecidos como um grupo natural, constituído
por parasitas intracelulares, com um mecanismo exclusivo de infecção do hospedeiro. O
mais inportante foi, sem dúvida, a inclusão no Filo Cnidosporidia. À medida que
ocorreram avanços ao nível da microscopia que permitiram uma ligação entre os
subgrupos dos cnidosporídios, tornou-se claro que a posição dos microsporidia teria de
ser revista [Lom & Vavra 1961].
2.1.2. Os Archezoa e primeiros dados moleculares dos microsporídios.
A análise dos microsporídios através da microscopia electrónica, permitiu não
só, a descoberta de características únicas dos esporos, como também revelou a ausência
de outras, que são uma constante nos organismos eucariotas (mitocôndrias, aparelho de
Golgi clássico, peroxissomas e flagelos) [Vavra & Larsson 1999; Corradi & Keeling
2009].
Ao nível molecular, os microsporídios possuem genomas de dimensões
reduzidas, sendo o mais pequeno o de E. intestinalis, com 2.3 Mpb. Simultâneamente,
verificou-se nos microsporídios, a presença de subunidades ribossomais semelhantes às
dos procariotas [Vossbrinck et al. 1987; Katinka et al. 2001]. Com base nestes
argumentos, os microsporídios eram vistos como um grupo primitivo de organismos
eucariotas. Esta visão articulava-se com a integração dos microsporídios, nos Archezoa,
proposta por Thomas Cavalier-Smith (1983) [Cavalier-Smith 1983; Corradi & Keeling
2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA E BIOLOGIA DOS MICROSPORÍDIOS
- 14 -
2009] e, na qual, era postulado que a origem da célula eucariota deverá ter precedido a
origem simbiótica da mitocôndria. Assim, diversas linhas de organismos eucariotas
haviam divergido antes da ocorrência desta endosimbiose. No total, foram identificadas
quatro linhas eucariotas, e incluídas no novo sub-reino Archezoa: Archamoebae,
Metamonada, Parabasali, e Microsporidia [Cavalier-Smith 1983; Cavalier-Smith 1987;
Corradi & Keeling 2009]. Assumiu-se que constituíam um grupo parafilético, em que os
microsporidios eram colocados no ramo mais ancestral dos eucariotas, pelo facto de
serem os únicos que não possuíam estruturas microtubulares do tipo 9+2 (estruturas
cilíndricas organizadas em tripletos de nove microtúbulos ligados entre si, que ocorrem
geralmente em número de duas) [Patterson 1994; Corradi & Keeling 2009].
Pouco depois, da inclusão nos Archezoa, surgem os primeiros dados moleculares
para a espécie, Vairimorpha necatrix, correspondentes à sequenciação do gene
conservado que codifica a pequena, e a grande subunidade do ácido ribonucleico
ribossómico (SSU e LSU rRNA, siglas anglo-saxónicas para small subunit ribosomal
ribonucleic acid e large subunit ribosomal ribonucleic acid, respectivamente)
[Vossbrinck et al. 1987]. Curiosamente, estes dados vieram adicionar evidências à
hipótese de integração nos Archezoa. Em primeiro lugar, nas diversas análises
filogenéticas efectuadas com base na SSU rRNA, nas quais eram incluídos diversos
membros de outras linhas de eucariotas, a espécie V. necatrix surge, no ramo inicial dos
eucariotas [Vossbrinck et al. 1987]. Facto este, consistente com a previsão postulada
pela hipótese dos Archezoa que considerava os microsporídios como uma linha
ancestral (uma condição para ser um amitocondriado primitivo). Em segundo lugar,
verificou-se que, ao contrário do que acontece noutras linhas de eucariotas, nos
microsporídios, as subunidades 5.8S e LSU do rRNA encontram-se fundidas numa
molécula única, tal como ocorre nos procariotas [Vossbrinck et al. 1987]. Mais um
facto, interpretado como sendo outra característica primitiva dos microsporidia.
A determinação de sequências de diferentes genes e as análises filogenéticas
estabelecidas a partir destes novos dados, vierem conferir um maior peso à ideia que
atribui uma origem ancestral aos microsporidia. O estudo dos genes que codificam a
isoleucil aminoacil sintetase do ácido ribonucleico de transcrição (tRNA, sigla anglo-
saxónica para transcription ribonucleic acid) e os factores de elongação 1-alfa e 2
2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA E BIOLOGIA DOS MICROSPORÍDIOS
- 15 -
reforçam esta classificação [Brown & Doolittle 1995; Kamaishi et al. 1996a; Kamaishi
et al. 1996b; Brown & Doolittle 1999].
Até então, a classificação da origem evolutiva dos microsporidia, aparentava
estar mais ou menos esclarecida, residindo as duas questões fundamentais, apenas, na
determinação da sua posição entre o grupo dos Archezoa, e na localização temporal da
sua ancestralidade.
2.1.3 Uma ligação aos fungos.
Apesar da acumulação de evidências, a origem primitiva dos microsporidia
continuou a suscitar dúvidas entre a comunidade científica. A capacidade de adaptação
destes parasitas assim como a elevada divergência das sequências dos seus genes
constituem características problemáticas, com possibilidade de serem mal interpretadas.
Um ciclo de vida intracelular obrigatório, pode potencialmente conduzir á
redução e/ou perda de diversos organelos e estruturas celulares, tais como as
mitocôndrias, os peroxissomas, centríolos, ou os ribossomas. Acrescente-se que, os
rRNA possuem muitas delecções de modo que, é possível que a fusão das subunidades
5.8S com a LSU resultasse de uma regressão, pela perda de uma sequência [Cavalier-
Smith 1993; Corradi & Keeling 2009]. Sabe-se também, que taxas elevadas de
divergência de sequências dos genes, podem originar um artefacto filogenético,
conhecido por “atracção de ramificações-longas” (da expressão anglo-saxónica para
long-branch attraction), arrastando errôneamente, os microsporidia para a base da
árvore filogenética.
Inicialmente, a proposta que sugeria os microsporidia com ligação de parentesco
aos fungos, surgiu da ocorrência de semelhanças no ciclo de vida [Flegel &
Pasharawipas 1995], da presença de quitina na parede do esporo (embora também possa
ser encontrada noutros filos para além dos fungos), e do dissacárido trealose
(dissacárido não reduzível, composto usado para armazenamento de energia), em ambos
os grupos de organismos. Mais recentemente, a perspectiva evolutiva proporcionada por
diversos estudos moleculares evidencia, esta proximidade ao Reino Fungi: a
sequenciação dos genes conservados que codificam para as proteínas - e - tubulina
[Edlind et al. 1994; Keeling & Doolittle 1996; Edlind et al. 1996; Muller 1997]; a
2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA E BIOLOGIA DOS MICROSPORÍDIOS
- 16 -
identificação de quitinases semelhantes às dos fungos [Hinkle et al. 1997]; e a análise
filogenética das proteínas de ligação à TATA-box [Fast et al. 1999]; assim como, a
sequenciação de genes codificantes da grande subunidade da RNA polimerase II [Hirt et
al. 1999], da proteína de choque térmico de 70-kDa (HSP70, sigla anglo-saxónica para
heat shock protein 70-kDa) [Hirt et al. 1997; Germot et al. 1997; Peyretaillade et al.
1998b], da glutamil sintetase [Brown & Doolittle 1999], ou das subunidades - e - da
piruvato desidrogenase E1 [Fast & Keeling 2001]. Mais recentemente, a primeira
caracterização do genoma total de um microsporídio E. cuniculi, veio reforçar a ligação
entre os dois grupos [Katinka et al. 2001].
Acresce, a identificação, nos microsporidia, de mais de uma dúzia de genes que
codificam para proteínas mitocondriais e a localização da proteína HSP70, no
remeniscente mitocondrial, o mitossoma [Williams et al. 2002; Tsaousis et al. 2008;
Goldberg et al. 2008; Lee et al. 2008; Williams et al. 2008a; Williams et al. 2008b],
consistentes com a presença de mitocôndrias, confere rubustez à ideia, de que estes
parasitas seriam de início organismos mais especializados que, embora tivessem
perdido, posteriormente estes organelos, possuem, ainda, algumas evidências genéticas
do seu passado.
Diversos autores, abandonaram então, a teoria de que, os microsporidia
constituíam uma linha primitiva dos eucariotas, para os passarem a considerar como
organismos especializados, que terão evoluído a partir de ancestrais com mitocôndrias,
e que apresentam na sua constituição determinadas características celulares e
moleculares que os ligam ao grupo dos fungos.
No final dos anos 90, do século passado a possibilidade de proximidade de
parentesco entre os microsporidia e os membros do reino Fungi começou a ter
aceitação, entre a comunidade científica [Weiss et al. 1999]. Actualmente, os debates
centralizam-se em decidir se, na realidade, estes organismos partilharam o mesmo
ancestral com os fungos ou, se então, derivaram dos fungos. Todavia, não foi possivel
ainda, obter uma resposta concreta para estas dúvidas, uma vez que as análises
filogenéticas são estabelecidas a partir de genes únicos, e que incluem habitualmente,
apenas uma pequena fracção da diversidade quer dos microsporidia, quer dos fungos.
Na verdade, o sucesso dos métodos moleculares nos estudos filogenéticos e de
sistemática dependem em grande parte das moléculas escolhidas para a análise.
2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA E BIOLOGIA DOS MICROSPORÍDIOS
- 17 -
Idealmente, a resolução do problema, passaria pela utilização, de um conjunto de
dados multigénicos, com uma ampla representação taxonómica. Porém, até à data só foi
possível o estudo do genoma de um grupo restrito de microsporidia, e dentre estes, a
caracterização só foi obtida para um reduzido número de genes (<2000). Se a estas
limitações, adicionarmos a elevada divergência das sequências determinadas [Katinka et
al. 2001; Slamovits et al. 2004], torna-se difícil, não só efectuar reconstruções
filogenéticas moleculares, como as torna extremamente incertas [Hirt et al. 1999;
Thomarat et al. 2004]. Mais recentemente, recorreu-se a uma abordagem diferente, com
base na conservação da ordem dos genes [Lee et al. 2008]. Verificou-se, que apesar das
sequências dos genes dos microsporidia evoluírem muito rapidamente, a ordem dos
genes dentro do próprio genoma, é altamente conservada [Slamovits et al. 2004;
Corradi et al. 2007]. Estes resultados sugerem uma ligação aos zigomicetes, visto que
ambos os grupos partilham uma elevada taxa de conservação no ordenamento dos
genes. Ao contrário do que se observa, quando se compara esta taxa de ordenamento
genético, com outros grupos de fungos, como por exemplo, dos basidiomicetes [Dyer
2008; Lee et al. 2008].
A hipótese dos microsporidia terem pelo menos uma proximidade de parentesco
com o reino Fungi, parece estar a ser adoptada por um número crescente de autores
[Hibbett et al. 2007]. Têm sido desenvolvidos esforços com o intuito de obter dados
relativos ao genoma de outros microsporídios, e de continuar a análise comparativa
entre os genomas das diversas espécies e outros organismos, de modo a clarificar as
forças com impacte, na redução e compactação genómica, em relação à filogenia e
evolução destes parasitas. A recente aplicação da comparação de análises filogenéticas
moleculares gerou novas considerações, sobre a classificação taxonómica de diversas
espécies, dentro dos microsporidia, estabelecida, previamente, com base em
características ultraestruturais, biológicas, bioquímicas ou de habitat [Vossbrinck &
brunner-Vossbrinck 2005; Larsson 2005].
A validade da classificação taxonómica dos microsporidia tem sido, diversas
vezes questionada. À medida que vão sendo descritos e analisados aspectos moleculares
de um crescente número destes parasitas, torna-se mais elevada a probabilidade de
ocorrerem, no futuro, novas alterações no esquema de classificação do grupo [Baker et
al. 1995].
2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA E BIOLOGIA DOS MICROSPORÍDIOS
- 18 -
Verificada a ausência de consenso, entre os diversos membros da comunidade
científica [Dong et al. 2010], como tal, não parecem estar, ainda, reunidas todas as
condições para elaborar uma classificação definitiva para os microsporidia.
2.2. MORFOLOGIA E CICLO DE VIDA
2.2.1. Morfologia dos microsporídios
Os microsporídios são organimos eucariotas unicelulares, parasitas intracelulares
obrigatórios, de diversos grupos de animais (em particular invertebrados e peixes),
incluindo o Homem. Caracterizam-se pela ausência de algumas características típicas
dos eucariotas, nomeadamente os ribossomas (70S), as sub-unidades ribossomais (30S e
50S) e os rRNA que são do tamanho dos encontrados nos procariotas e, por outro lado,
não possuem um rRNA com a subunidade 5.8S separada da LSU. Além disso, não têm
mitocôndrias, peroxissomas e um aparelho de Golgi clássico [Vossbrinck et al. 1987;
Canning & Hollister 1992b; Didier 1998; Weiss & Vossbrinck 1999]. Todavia, estes
organismos são verdadeiros eucariotas com núcleo onde ocorre separação
cromossómica por fusos mitóticos [Vossbrinck et al. 1987], bem como poliadenilação
do ácido ribossómico mensageiro (mRNA, sigla anglo-saxónica para menssenger
ribosomal ribonucleic acid), tal como se observa em todos os organismos eucariotas
estudados.
Os esporos são o único estádio, do ciclo de vida, que sobrevive no exterior do
seu hospedeiro, e a sua forma é mais ou menos constante entre as espécies do mesmo
género. Os esporos maduros, de microsporídios infectantes dos mamíferos, apresentam
em geral uma forma oval e piriforme e reduzidas dimensões, medindo entre 1,0 – 3,0
m de comprimento e 1,5 – 4,0 m de largura [Didier 1998; Cali & Takvorian 1999]. O
esporo maduro de E. bieneusi, é o mais pequeno de todos os esporos de microsporídios,
medindo apenas 1,1-1,6 x 0,7-1,0 m. O endosporo e o exosporo são relativamente
delgados quando comparados com outros microsporídios. A Figura 3, representa o
diagrama e fotografia de microscopia electrónica de transmissão onde se podem
observar as principais estruturas internas do esporo de um microsporídio.
2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA E BIOLOGIA DOS MICROSPORÍDIOS
- 19 -
Figura 3. (A) Diagrama e (B) fotografia de microscopia electrónica de transmissão da
estrutura interna de um esporo de microsporídio. Adaptado de [Franzen 2008].
A necessidade absoluta de células hospedeiras para a sobrevivência e
multiplicação dos microsporídios, implica a existência de um mecanismo eficaz de
penetração na célula hospedeira, desempenhado pelo aparelho de extrusão. Destaque-se
entre os constituintes deste aparelho, o filamento polar: a característica que define um
organismo, como sendo um microsporidia. Este organelo consiste numa estrutura
tubular enrolada em hélice, dentro do esporo maduro. O polaroplasto e o vacúolo
completam o aparelho de extrusão.
O filamento polar parte do disco de adesão ou saco polar, junto do pólo anterior
do esporo, formando uma espiral com várias voltas até à região posterior do esporo
[Cali & Takvorian 1999]. O número de voltas do filamento polar varia entre as espécies.
A título de exemplo, na espécie E. bieneusi, o filamento polar descreve seis
voltas, que quando visualizadas ao microscópio electrónico de transmissão, surgem em
duas filas de três espiras; nas espécies do género Encephalitozoon, o filamento polar
descreve entre três a oito voltas, organizadas numa fila única de espiras. Sob
determinadas condições (alterações na pressão osmótica), o filamento emerge para o
exterior, passando a designar-se por tubo polar e injecta o conteúdo do esporo
2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA E BIOLOGIA DOS MICROSPORÍDIOS
- 20 -
(esporoplasma) no interior de uma célula hospedeira, sem contudo destruir a membrana
desta.
O tubo polar estendido, tem entre 50-100 m de comprimento e parece originar-
se a partir do retículo endoplasmático e das vesículas golgi-like [Cali & Takvorian
1999].
O disco de adesão encontra-se na região mais anterior do esporo, e constitui a
estrutura mais rica em hidratos de carbono dos microsporídios, sendo responsável pela
coloração ácido-resistente. Em posição posterior ao disco de adesão encontra-se um
conjunto de membranas lamelares, denominadas de polaroplasto. Este é rico, também
em hidratos de carbono, e é contíguo com a membrana externa do filamento polar. O
polaroplasto irá mais tarde constituir a membrana exterior do esporoplasma [Cali &
Takvorian 1999].
Na extremidade posterior do filamento polar encontra-se o núcleo que pode ser
único como no caso dos géneros Encephalitozoon, Enterocytozoon, Pleistophora e
Trachipleistophora, ou, por outro lado, binucleado como nos casos dos géneros
Anncalliia, Thelohania e Vittaforma).
Apesar de eucariotas, os microsporidia possuem ribossomas semelhantes aos dos
procariotas, como já foi referido anteriormente. Os esporontes e esporoblastos (formas
proliferativas) são ricos em retículo endoplasmático liso e rugoso [Cali & Takvorian
1999].
O vacúolo posterior fornece, por vezes, uma característica de diagnóstico na
identificação de microsporídios, em produtos biológicos, através da microscopia óptica.
Este vacúolo tem origem, na coalescência tardia da maturação do esporo, das vesículas
de Golgi, após a formação do filamento polar. A sua função é desconhecida, embora tal
como acontece com o polaroplasto, aumenta de volume antes da germinação [Cali &
Takvorian 1999].
A envolver o esporoplasma (conjunto do núcleo [s], citoplasma com ribossomas
e retículo endoplasmático) e o sistema de extrusão, encontra-se, uma membrana
plasmática ou plasmalema revestida por uma parede resistente. Esta parede possui uma
camada externa fina, densa aos electrões, o exosporo, constituída, essencialmente, por
glicoproteínas e, ainda, uma camada interna espessa, transparente aos electrões, o
endosporo, de natureza quitinosa [Kotler & Orenstein 1998; Cali & Takvorian 1999].
2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA E BIOLOGIA DOS MICROSPORÍDIOS
- 21 -
A região anterior do endosporo, junto ao disco de adesão, é menos espessa do
que a restante porção desta camada. A parede do esporo permite aos microsporídios,
possuir um elevado grau de resistência em condições ambientais adversas [Cali &
Takvorian 1999; Koudela et al. 1999].
2.2.2 Ciclo de Vida
O ciclo de vida dos microsporidia, embora apresente variabilidade nalgumas
fases do desenvolvimento, conforme as espécies do parasita, genericamente, caracteriza-
se por três fases: infectante, proliferativa e esporogónica.
Fase infectante. A fase infectante, corresponde à etapa extracelular, metabolicamente
inactiva, do ciclo de vida do microsporídio. Compreende a libertação da forma
infectante, o esporo, a sua passagem pelo meio exterior, assim como os factores
ambientais necessários para o accionar do mecanismo de extrusão, que conduzem à
subsequente penetração numa célula hospedeira adequada (Figura 4).
Figura 4. Fotografias de microscopia electrónica de varrimento do esporo de
microsporida com o filamento polar exteriorizado injectando o esporoplasma na célula
Adaptado de [Franzen 2008].
2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA E BIOLOGIA DOS MICROSPORÍDIOS
- 22 -
O esporo pode conservar a sua infecciosidade por longos períodos, durante a sua
permanência no meio exterior. Diversos factores, tais como, temperatura, humidade,
radiação, ou mesmo o material em que são depositados, podem influênciar a viabilidade
dos esporos, no exterior do hospedeiro. Também o tipo de produto biológico (fezes,
urina ou secreções pulmonares) em que são eliminados os esporos pode influenciar a
sua sobrevivência. Por exemplo, os esporos em amostras fecais ou em cadáveres secos
sobrevivem menos de seis meses se mantidos à temperatura ambiente, mas em meio
aquoso frio podem manter-se infecciosos por mais de um ano [Kramer 1970; Cali &
Takvorian 1999]. Um estudo demonstrou que, um em cada seis esporos de
Encephalitozoon, mantém a sua infecciosidade após 24 meses de conservação a 4ºC
[Kucerova-Pospisilova et al. 1999].
Em regra, a infecção estabelece-se, após a inalação ou ingestão dos esporos de
microsporídia, sendo as células epiteliais, que limitam o tracto gastrintestinal e
respiratório os locais mais comuns para a infecção primária [Orenstein 1991; Didier
1998]. Segue-se o processo de germinação do esporo sob factores ambientais
favoráveis. A interacção de diversos factores activa um conjunto sequencial de eventos
que culminam com o aumento da pressão hidrostática no interior do esporo. Esta
pressão parece ser suficiente para accionar o mecanismo de extrusão dos
microsporídios. Na presença de iões de cloro e em meio alcalino ocorre entrada de iões
de sódio e/ou potássio no esporo. Por sua vez, estes iões irão accionar quer a entrada de
cálcio, através de canais iónicos na membrana, quer a activação da enzima trealase. O
dissacárido trealose é então, clivado em moléculas mais pequenas, aumentando o
potencial da pressão osmótica, e permitindo a entrada de água no esporo que interage
com estas moléculas. É desta interacção que parece resultar a força que possibilita a
extrusão do filamento polar. Como foi referido, o influxo de cálcio, através de canais
iónicos na parede do esporo, parece desempenhar um papel importante, na
exteriorização do filamento polar, durante a germinação. Dado que já foi demonstrado
que o tratamento com bloqueadores dos canais de cálcio (i.e. nifedipina) inibem a
exteriorização e a infecção de células hospedeiras, in vitro, este mecanismo pode vir a
fornecer um potencial alvo para o tratamento da microsporidiose [Fedorko & Hijazi
1996; Didier 1998].
2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA E BIOLOGIA DOS MICROSPORÍDIOS
- 23 -
Após a germinação do esporo (exteriorização do filamento polar) e a injecção do
seu conteúdo (esporoplasma) no interior da célula hospedeira, o organismo entra numa
fase proliferativa, designada por merogonia, seguida por um processo de diferenciação
em esporos, denominado esporogonia. Os esporos libertados podem continuar a
replicar-se no hospedeiro (autoinfecção), quer infectando as células adjacentes às
parasitadas, quer disseminando-se para outros tecidos.
Os esporos são, também eliminados com a urina, fezes ou secreções
respiratórias, podendo, então ser transmitidos a novos hospedeiros [Franzen & Muller
1999b; Weber et al. 1999b].
As variações no desenvolvimento e na interface parasita-hospedeiro, durante o
ciclo de vida dos microsporídeos são numerosas e determinam o grupo taxonómico a
que pertence um determinado microsporídia [Cali 1991].
O ciclo de vida dos microsporidia infectantes do Homem Enterocytozoon
bieneusi e Encephalitozoon spp., encontra-se esquematizado na Figura 5.
2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA E BIOLOGIA DOS MICROSPORÍDIOS
- 24 -
Figura 5. Representação esquemática do ciclo de vida de dois géneros de microsporidia
patogénicos para o Homem, um que se desenvolve em contacto directo com o citoplasma da
célula hospedeira (E. bieneusi) e o outro que ocorre dentro de um vacúolo parasitóforo
(Encephalitozoon spp.). (A) Esporo vazio após injectar através do tubo polar o esporoplasma no
citoplasma da célula hospedeira. (B1 a D1) Desenvolvimento intracelular de E. bieneusi em
contacto directo com citoplasma da célula hospedeira. (E1) Esporos maduros; (B2 a D2)
Desenvolvimento do ciclo de Encephalitozoon spp dentro de um vacúolo parasitóforo no
citoplasma da célula hospedeira. (E2) Libertação dos esporos maduros no citoplasma da célula
hospedeira após ruptura da membrana do vacúolo; (a1 a e1 e b2 a e2) Fotografias de
microscopia electrónica de transmissão de diferentes estádios do ciclo de vida de E. bieneusi e
Encephalitozoon spp., respectivamente. Adaptado de [Franzen 2008].
2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA E BIOLOGIA DOS MICROSPORÍDIOS
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Fase proliferativa ou merogonia. O processo de merogonia inicia-se após a penetração
do esporoplasma numa célula hospedeira susceptível. Os primeiros estádios deste
processo designam-se de merontes, sendo por norma células esféricas, maiores que os
esporos maduros, ou, ainda, elongadas quando já se encontram em divisão. Em geral,
apresentam pouca diferenciação do citoplasma e possuem uma membrana plasmática
[Cali & Takvorian 1999]. A divisão dos merontes ocorre por fissão binária
(Encephalitozoon, Anncaliia, Thelohania, Vittaforma) ou por cariocinese, antes da
citocinése, resultando em células multinucleadas, designadas por plasmodia merogonial
(Enterocytozoon, Pleistophora, Trachipleistophora). A merogonia pode verificar-se em
contacto directo com o citoplasma da célula hospedeira (Anncaliia, Enterocytozoon), no
interior de um vacúolo parasitóforo derivado da célula hospedeira (Encephalitozoon),
dentro de um revestimento de material amorfo depositado pelo parasita (Pleistophora,
Trachipleistophora, Thelohania), ou, então, apenas com o organismo individual
intimamente envolvido por retículo endoplasmático (Vittaforma) [Cali & Takvorian
1999].
Fase esporogónica. O processo de esporogonia inicia-se com o desenvolvimento dos
merontes em esporontes que se caracterizam por possuir uma camada superficial
bastante densa aos electrões [Franzen & Muller, 1999; Didier et al., 1998]. Este
revestimento irá, mais tarde, originar a camada exterior, o exosporo, da parede do
esporo [Franzen & Muller, 1999]. Os esporontes multiplicam-se por fissão binária ou
múltipla e dividem-se em esporoblastos (estruturas ovóides, nas quais já se podem
reconhecer organelos) que irão desenvolver-se até ao estádio de esporo maduro. Os
esporontes podem ser uni-nucleados ou diplocarióticos. O número de divisões nucleares
e celulares que ocorrem nos esporontes varia consoante o género do microsporídio. São
observados três tipos de divisão: cariocinese ligada a citocinése, também descrita como
fissão binária, conduzindo à formação de dois esporoblastos, que por metamorfose
produzem dois esporos (ex. Anncaliia, Encephalitozoon); a citocinése não se encontra
ligada à cariocinese ocorrendo a repetição da divisão nuclear no interior da célula sendo
produzidos quatro núcleos (Tetramicra). Pode ainda verificar-se a ocorrência de
múltiplas divisões nucleares dentro da célula, constituindo estádios plasmodiais
multinucleados, que ao dividirem-se por plasmotomia podem produzir entre oito
2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA E BIOLOGIA DOS MICROSPORÍDIOS
- 26 -
(Vairimorpha) a mais de 100 esporos (Pleistophora). Alguns dividem-se, directamente,
em esporoblastos, por fissão binária, enquanto outros constituem estádios plasmodiais
multinucleados [Cali & Takvorian 1999; Franzen & Muller 1999b].
Enquanto os merontes, esporontes e esporoblastos apresentam intensa actividade
metabólica, nos esporos maduros, aquela é muito limitada [Cali & Takvorian 1999].
Ciclos secundários de infecção verificam-se após a ruptura das células infectadas
do hospedeiro, em que são libertados, quer os esporos maduros, quer outras formas
imaturas. Embora o esporo maduro seja considerado o estádio infectante, outras formas
ainda que imaturas, podem ser, também, infectantes ou, por outro lado, podem ter
atingido um determinado grau de desenvolvimento, suficiente para completar a sua
diferenciação no exterior da célula hospedeira e tornarem-se infectantes mais tarde [Cali
& Takvorian 1999].
Os microsporídios, de início, podem ser eliminados com as fezes ou com as
secreções respiratórias, ou auto-infectar o hospedeiro (in loco ou disseminando). O
parasita infecta novas células, injectando directamente, o conteúdo do esporo.
Recentemente, foi sugerido um processo alternativo, em que a entrada na célula
hospedeira ocorre por fagocitose do esporo do parasita, em que o tubo polar é utilizado
para escapar aos fagossomas e, infectar o citoplasma, da célula hospedeira [Franzen
2004; Franzen et al. 2005b] .
As infecções por E. bieneusi localizam-se, primeiro no intestino delgado,
apesar de também ocorrer envolvimento do tracto biliar [Yachnis et al. 1996; Cali &
Takvorian 1999]. Por outro lado, refira-se, também, que foram identificados esporos
deste parasita em secreções pulmonares de doentes imunodeficientes [del et al. 1997a].
Salvo algumas excepções, os géneros Pleistophora e Anncaliia, parasitam, em primeiro
lugar, o músculo esquelético e o estroma da córnea, respectivamente [Cali & Takvorian
1999]. O género Encephalitozoon, para além de infectar os enterócitos do intestino
delgado, parasita os macrófagos, disseminando-se no hospedeiro. Localizações
secundárias da infecção incluem (mas não são limitadas) o rim, fígado, baço, cérebro,
peritoneu e epitélio nasal. Os esporos de Encephalitozoon, são eliminados, também pela
urina (quando ocorre envolvimento renal), e pelas secreções respiratórias [Cali &
Takvorian 1999; Kotler & Orenstein 1999].
2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA E BIOLOGIA DOS MICROSPORÍDIOS
- 27 -
Aparentemente, todos os tecidos do hospedeiro parecem ser vulneráveis à
infecção de, pelo menos, um género de microsporidia [Cali & Takvorian 1999].
3.ESPECTRO CLÍNICO E PATOGENIA NO HOMEM
- 28 -
3. ESPECTRO CLÍNICO E PATOGENIA NO HOMEM
3.1. INFECÇÕES POR ESPÉCIES DE MICROSPORIDIA MAIS FREQUENTES
Antes da pandemia da sida, eram raros os casos descritos de infecções por
microsporídios, em humanos: desde o primeiro registo de um caso em 1959 e, até 1985,
apenas foram reportados seis casos de infecção [Bryan et al. 1991]. Dois dos casos
verificaram-se em doentes imunocomprometidos, enquanto os restantes observaram-se
em pessoas presumivelmente imunocompetentes ou de estado imunológico
desconhecido.
Quando os microsporídios foram identificados pela primeira vez, no contexto da
infecção por VIH-1 e diarreia, especulou-se se estes organismos seriam verdadeiros
agentes patogénicos, visto que também eram detectados em pessoas sem quadro
diarreico, ou quaisquer outros sintomas típicos associados à microsporidiose. Estas
observações, parecem reflectir, o papel preponderante do sistema imunológico do
hospedeiro, na expressão de sinais clínicos durante a infecção. Os doentes com sida e
contagem de linfócitos TCD4+ inferior a 100 cel/mm3 têm uma maior probabilidade de
desenvolver diarreia persistente, perda de peso e dor abdominal associada à infecção por
E. bieneusi e E. intestinalis. Enquanto os seropositivos para VIH, submetidos a
terapêutica anti-retrovírica, ou os seronegativos para VIH, mas com sistemas
imunológicos imaturos e/ou sem exposição prévia aos parasitas, como por exemplo os
de crianças, ou os viajantes para zonas endémicas, desenvolvem apenas quadros de
diarreia autolimitada [Tumwine et al. 2005; Wichro et al. 2005]. Estes achados,
sugerem a ocorrência de infecções persistentes ou de portadores assintomáticos, em
imunocompetentes.
A replicação dos microsporídios, nas vilosidades do epitélio do intestino
delgado, associada a uma redução da altura das vilosidades e, da sua área de superfície,
parece contribuir para a má-absorção que conduz à diarreia [Kotler & Orenstein 1999;
Weber et al. 2000; Morpeth & Thielman 2006; Wiwanitkit 2006]. Dois factores,
inerentes às lesões intestinais, são importantes para que ocorra má-absorção: a
diminuição da área de superfície da mucosa e a maturidade das vilosidades intestinais,
visto que ambos os parâmetros são importantes nos processos de absorção. A taxa de
3.ESPECTRO CLÍNICO E PATOGENIA NO HOMEM
- 29 -
absorção para qualquer nutriente, que atravesse a membrana, está associada com a área
de superfície da mucosa, a distância de difusão à membrana de absorção e o gradiente
de concentração que se verifica ao longo da membrana. A área de superfície da mucosa
é uma função do número de vilosidades intestinais, que por sua vez está dependente das
taxas de produção e perdas celulares. Estas taxas encontram-se em circunstâncias
normais, estritamente reguladas, de modo a manter a homeoestase [Johnson 1988;
Kotler & Orenstein 1999].
As 14 espécies de microsporidia patogénicas para o Homem, e os respectivos
locais de infecção, encontram-se sumariados no Quadro IV.
Quadro III. Microsporídios patogénicos para o Homem, e respectivos locais de
infecção. Adaptado de [Didier & Weiss 2006].
ESPÉCIES LOCALIZAÇÃO DAS PATOLOGIAS
Mais frequentes
Enterocytozoon bieneusi
Intestino delgado, vias biliares, aparelho respiratório
Encephalitozoon intestinalis Intestino delgado, vias biliares, aparelho respiratório, ossos, pele, disseminada
Encephalitozoon hellem
Globo ocular, aparelho respiratório, aparelho urinário, disseminada
Encephalitozoon cuniculi
Disseminada, olho, aparelho respiratório, aparelho urinário, fígado, peritoneu, cérebro
Menos frequentes
Anncaliia algerae Córnea e músculo esquelético
Anncaliia connori Disseminada
Anncaliia vesicularum Estroma da córnea, músculo esquelético
Microsporidium africanum Estroma da córnea
Microsporidium ceylonensis Estroma da córnea
Nosema ocularum Estroma da córnea
Pleistophora ronneafiel Músculo esquelético
Trachipleistophora antropophtera Córnea, disseminada
Trachipleistophora hominis Músculo esquelético, córnea (células epiteliais e do estroma)
Vittaforma corneae Estroma da córnea, íris e aperelho urinário
3.ESPECTRO CLÍNICO E PATOGENIA NO HOMEM
- 30 -
3.1.1. Infecção por Enterocytozoon bieneusi
A infecção por E. bieneusi, exprime-se clinicamente como uma síndrome de má-
absorção. Os sintomas consistem em diarreia aquosa crónica, intermitente, em geral,
sem muco nem sangue. Os doentes apresentam perda de peso lenta e progressiva. A
febre não está associada à infecção por E. bieneusi [Eeftinck Schattenkerk et al. 1991;
van & Dankert 1996; Kotler & Orenstein 1998] . Observam-se lesões sobretudo ao nível
do duodeno e do jejuno as quais se caracterizam microscopicamente, pela atrofia das
vilosidades intestinais, hiperplasia das criptas de Lieberkühn e infiltração linfocitária
[Shadduck & Orenstein 1993]. E. bieneusi propaga-se, essencialmente, nas células
epiteliais do topo das vilosidades intestinais e nas vias biliares À medida que a infecção
progride, os enterócitos sofrem diversas alterações, tornando-se o epitélio
progressivamente cúbico e, numa fase mais avançada, pleomórfico. O núcleo do
enterócito perde a polaridade basal e verifica-se um aumento da cromaticidade. O
citoplasma torna-se gradualmente mais vesiculado [Orenstein 1991; Kotler & Orenstein
1999] (Figura 6)
Figura 6. Secção de jejuno intestinal infectado por E. bieneusi. Na imagem, obtida por
microscopia electrónica de transmissão no interior do enterócito vesiculado podem
observar-se diversos esporos maduros (×9813). Adaptado de [Kotler & Orenstein 1999].
3.ESPECTRO CLÍNICO E PATOGENIA NO HOMEM
- 31 -
Apesar de E. bieneusi se propagar preferencialmente no intestino, encontram-se
descritas algumas infecções extra-intestinais: infecções ao nível das vias biliares e
vesícula de doentes com colangiopatia, no fígado, canal pancreático assim como no
aparelho respiratório [Weber et al. 1992b; del et al. 1997a; Lores et al. 1999; Weber et
al. 2000; Botterel et al. 2002; Sodqi et al. 2004].
3.1.2. Infecção por Encephalitozoon intestinalis
E. intestinalis representa a segunda espécie de microsporidia patogénico, mais
frequente no Homem. Clinicamente, E. intestinalis, tal como se verifica para E.
bieneusi, também se encontra associada a síndrome de má-absorção [Kotler & Orenstein
1999]. Esta espécie tem capacidade de invadir as células epiteliais do intestino delgado
e do intestino grosso. Simultaneamente com a multiplicação enteroepitelial, a mucosa
do intestino, também pode ser atingida ao nível da lâmina própria, incluindo as células
endoteliais de pequenos vasos e macrófagos [Cali et al. 1993; Chu & West 1996].
Tipicamente as infecções provocadas por E. intestinalis tendem a disseminar,
havendo registos de infecções em quase todos os sistemas de órgãos, incluindo aparelho
urinário, vesícula biliar, conjuntiva e aparelho respiratório [Cali et al. 1993; Molina et
al. 1995; Kotler & Orenstein 1999]. Orenstein e colaboradores descreveram um caso de
infecção pulmonar fatal, o qual ocorreu num doente transplantado de medula óssea
[Orenstein 2003; Orenstein et al. 2005].
E. intestinalis é sensível à terapêutica com albendazol, ao contrário de E.
bieneusi, constituindo a distinção das espécies uma importante informação para o
clínico [Chu & West 1996; Didier & Weiss 2006].
3.1.3. Infecção por Encephalitozoon hellem
E. hellem é descrita como a terceira espécie de microsporidia, causadora de
patologia no Homem [del et al. 2001b]. A maior parte dos casos clínicos de infecção
por esta espécie, correspondem a patologia ocular em doentes com sida, envolvendo a
córnea e a conjuntiva [Cali et al. 1991b; Didier et al. 1991b; Schwartz et al. 1993a;
Friedberg & Ritterband 1999]. As lesões da córnea causadas por E. hellem, são
3.ESPECTRO CLÍNICO E PATOGENIA NO HOMEM
- 32 -
superficiais, ao contrário das queratites associadas a outras espécies de microsporidia,
que atingem as camadas do estroma da córnea [Cali et al. 1991a; Schwartz et al. 1992;
Friedberg & Ritterband 1999]. A diminuição da acuidade visual, a sensação de corpo
estranho, lacrimejo, olho seco, fotofobia e olho vermelho são os sinais e sintomas desta
infecção [Cali et al. 1991a; Didier et al. 1991b; Didier et al. 1996a; Conners et al. 2004]
[Schwartz et al. 1993a].
Em doentes infectados por VIH, esporos de E. hellem foram isolados nas vias
respiratórias superiores e em secrecções respiratórias, embora sem qualquer quadro
clínico associado [Hollister et al. 1993; Weber et al. 1993; Scaglia et al. 1998b].
Contudo, também estão descritas infecções sintomáticas do aparelho respiratório, em
doentes com sida, atribuídas a esta espécie [Schwartz et al. 1993b; Deplazes et al.
1998].
Os esporos de E. hellem foram, também, detectados na urina [Weber et al. 1993;
Didier et al. 1996a]. Durante a autópsia a um doente com sida, que havia apresentado
disúria e hematúria no seu historial clínico, foram observadas, extensas lesões nos rins,
ureteres e bexiga, atribuídas a E. hellem [Schwartz et al. 1992]. Müller e colaboradores
identificaram E. hellem, em amostras fecais de viajantes, com quadro diarreico,
regressados de Singapura [Muller et al. 2001].
3.1.4. Infecção por Encephalitozoon cuniculi
Actualmente, encontram-se descritos 15 casos de infecção disseminada por E.
cuniculi, em doentes com sida [Gamboa-Dominguez et al. 2003]. As manifestações
clínicas dependem da localização das infecções. E. cuniculi já foi isolado nos aparelhos
respiratório, urinário e gastrintestinal, no sistema nervoso central e no globo ocular
(córnea e conjuntiva) [De Groote et al. 1995; Franzen et al. 1995b; Weber et al. 1997;
Rossi et al. 1998].
E. cuniculi infecta células epiteliais e endoteliais, assim como, macrófagos e
fibroblastos de vários tecidos e órgãos [Weber et al. 1992b]. A queratoconjuntivite e a
rinosinusite, parecem constituir as patologias mais frequentes [De Groote et al. 1995;
Rossi et al. 1998].
3.ESPECTRO CLÍNICO E PATOGENIA NO HOMEM
- 33 -
3.2. INFECÇÕES POR ESPÉCIES DE MICROSPORIDIA MENOS FREQUENTES
Outros casos de interesse, correspondem à infecção no Homem, por espécies de
microsporidia menos frequentes: infecção da córnea num doente com sida por T.
anthropopthera [Juarez et al. 2005]; um caso fatal de miosite, numa mulher, com artrite
reumatóide, e diabetes, causada por A. algerae, um miscrosporídio que habitualmente
infecta mosquitos [Coyle et al. 2004; Visvesvara et al. 2005; Franzen et al. 2006]. Este
último caso, suscita a possibilidade de transmissão dos microsporidia, por vectores.
O número de casos de microsporidiose ocular também tem vindo a aumentar,
nomeadamente entre os utilizadores de lentes de contacto [Theng et al. 2001; Sridhar &
Sharma 2003; Chan et al. 2003; Kodjikian et al. 2005; Joseph et al. 2005; Fogla et al.
2005; Kakrania et al. 2006; Joseph et al. 2006; Sagoo et al. 2007].
3.2.1. Infecção por Anncaliia spp.
A espécie Anncaliia algerae [Lowman et al. 2000] é sobejamente conhecida
como um agente patogénico de insectos, nomeadamente de mosquitos [Vavra &
Undeen 1970], sendo apontada como um potencial agente de controlo biológico destes
insectos [Mathis et al. 2005]. Há três registos de infecção por A. algerae. O primeiro
caso, refere-se a uma queratite num imunocompetente com 67 anos de idade, que
apresentava diminuição da acuidade visual, olho vermelho e prurido [Visvesvara et al.
1999a]. No segundo caso, o microsporídio foi isolado a partir de biópsia do tecido
muscular da coxa, associado a mialgia, miastenia e ao aumento dos níveis séricos da
creatina quinase, de um doente com diabetes e artrite reumatóide submetido a
terapêutica imunossupressora [Coyle et al. 2004]. A espécie A. algerae foi também
isolada de lesões na pele, de uma criança com leucemia linfocítica aguda [Kucerova et
al. 2004]
Estão descritos mais dois casos de infecção humana, por outras espécies
pertencentes ao género Anncaliia: Anncallia connori [Bergquist et al. 1984a]
(originalmente designada por Nosema connori e depois como Brachiola connori) [Cali
et al. 1998], numa criança imunodeprimida, que desenvolveu infecção disseminada por
3.ESPECTRO CLÍNICO E PATOGENIA NO HOMEM
- 34 -
este agente [Margileth et al. 1973], e a espécie Anncallia vesicularum, envolvendo um
doente com sida, com lesões no tecido muscular esquelético [Cali et al. 1998].
3.2.2. Infecção por Microsporidium spp.
O género Microsporidium foi criado para albergar os microsporídios, ainda com
classificação por definir. Encontram-se neste género as espécies Microsporidium
africanum (sin. Nosema sp.) e Microsporidium ceylonensis (sin. Nosema sp.), que foram
isoladas no estroma da córnea de dois seronegativos para VIH [Ashton & Wirasinha
1973; Pinnolis et al. 1981]. Em ambos os doentes, a infecção causou úlceras na córnea,
que levaram à perda de visão [Canning et al. 1998; Kotler & Orenstein 1999].
3.2.3. Infecção por Nosema ocularum
A infecção por Nosema ocularum, foi descrita no estroma da córnea, num
seronegativo para o VIH, que apresentava inflamação e diminuição da acuidade visual,
do olho esquerdo [Cali et al. 1991a].
3.2.4. Infecção por Pleistophora sp.
Estão descritas três infecções por Pleistophora sp., em doentes com sida [Kotler
& Orenstein 1999]. O primeiro caso foi registado em 1985, tendo sido identificado à
data, o microsporídio, apenas até ao género. Mais tarde, este isolado veio a constituir a
primeira descrição da espécie Pleistophora ronneafiei [Ledford et al. 1985; Cali &
Takvorian 2003]. Os restantes isolados, apenas, foram identificados até ao género. Estes
microsporídios, foram isolados no tecido muscular esquelético, em doentes que
apresentavam mialgia e miastenia [chupp et al 1993].
3.ESPECTRO CLÍNICO E PATOGENIA NO HOMEM
- 35 -
3.2.5. Infecção por Trachipleistophora spp.
O género Trachipleistophora alberga as espécies T. anthropophthera [Vavra et
al. 1998] e T. hominis [Hollister et al. 1996b]. A espécie T. hominis, foi identificada em
dois doentes com sida e num imunocompetente africano, imigrante no Reino Unido
[Field et al. 1996; Hollister et al. 1996b; Rauz et al. 2004; Curry et al. 2005]. Nos
doentes com sida, esta espécie provocou infecção no tecido muscular esquelético, para
além de, num deles, ter causado infecção do epitélio da córnea. No imunocompetente
observou-se uma infecção localizada no estroma da córnea.
T. anthropophthera, foi identificada em três doentes com sida, dois dos quais
manifestavam sintomas neurológicos [Yachnis et al. 1996; Vavra et al. 1998; Juarez et
al. 2005; Pariyakanok & Jongwutiwes 2005]. As autópsias destes dois doentes,
permitiram isolar a espécie no cérebro e em vários outros órgãos. Pelo contrário,
observou-se no terceiro doente, uma infecção localizada, ao nível do epitélio da córnea.
Uma nova avaliação de dois casos de miosite atribuídos inicialmente a
Pleistophora spp. [Chupp et al. 1993; Grau et al. 1996], apontou para que, em ambos os
casos, se tratasse de uma infecção por Trachipleistophora [Curry et al. 2005].
3.2.6. Infecção por Vittaforma corneae
Encontram-se descritas quatro infecções por V. corneae (originalmente
designada por Nosema corneum) [Shadduck et al. 1990; Davis et al. 1990; Silveira &
Canning 1995; Mittleider et al. 2002; Rauz et al. 2004], em que apenas uma delas se
reporta a um doente africano com sida [Deplazes et al. 1998]. Nos três casos de
imunocompetentes oriundos dos EUA, a infecção circunscreveu-se ao estroma da
córnea. A sintomatologia englobava fotofobia e diminuição da acuidade visual. No
doente com sida, identificaram-se esporos de V. corneae na urina, sugerindo que este
microsporídio tenha a capacidade de se propagar noutros órgãos.
Em Portugal, foi identificada uma nova espécie - Vittaforma-like, geneticamente
relacionada com V. corneae, nas fezes de 22 doentes infectados por VIH e de três
3.ESPECTRO CLÍNICO E PATOGENIA NO HOMEM
- 36 -
crianças, seronegativas para VIH. Todos os infectados manifestavam um quadro
diarreico [Sulaiman et al. 2003c].
4.IMUNOLOGIA
- 37 -
4. IMUNOLOGIA
As infecções parasitárias continuam a ser causa a de morbilidade e mortalidade
significativas a nível mundial, independente do estado imunológico dos doentes.
Estima-se que existam aproximadamente cerca de 340 espécies de parasitas
potencialmente infectantes para o Homem, sendo a maioria das pessoas infectadas
residentes em regiões do globo em vias de desenvolvimento [Stark et al. 2009]. Os
parasitas intestinais são considerados a causa mais comum de doenças parasitárias,
associadas a uma significativa morbilidade e mortalidade.
Os factores de risco associados à probabilidade de contrair uma infecção
parasitária são idênticos quer se trate da população imunocompetente, quer da
população imunodeficiente. Qual será, então o papel do sistema imunológico, nas
infecções parasitárias? Na verdade, o sistema imunológico, através de determinadas
respostas localizadas ou sistémicas, tem um papel preponderante na forma do
estabelecimento da infecção, no controlo da infecção após o estabelecimento, limitando
a gravidade e a disseminação da doença, e ajudando na eliminação ou controlo do
parasita [Stark et al. 2009]. Sendo assim, os hospedeiros imunossuprimidos, encontram-
se mais susceptíveis a contrair a infecção após serem expostos ao parasita, desenvolvem
doença com maior gravidade, têm maior probabilidade de desenvolver infecção
disseminada e não têm capacidade de erradicar os parasitas, passando ao estado de
portadores crónicos. Todos estes parâmetros conduzem à elevada morbilidade e
mortalidade entre este grupo específico de doentes. No entanto, a maioria dos
imunossuprimidos não diferem dos imunocompetentes na sua apresentação, sendo o
grau de deficiência imunitária o determinante principal da gravidade da infecção e da
sua evolução. Acrescenta-se, ainda, que a reconstituição imunitária através da
introdução de terapêutica eficaz ou da remoção e/ou redução da dose de fármacos
imunossupressores, pode dar a estes doentes uma maior capacidade de combater o
agente infeccioso como acontece com os imunocompetentes.
O número de doentes com inmunossupressão, aumenta mundialmente, a cada
ano que passa, associado à dispersão do VIH, estimando-se que surgam diariamente, em
diversas regiões do globo, cerca de 14000 novas infecções [Barsoum 2006]. O que
complica este problema é que a maioria destas novas infecções ocorre em regiões, nas
4.IMUNOLOGIA
- 38 -
quais o acesso a terapia anti-retrovirica é limitado, levando a que os doentes evoluam
rapidamente para estados de profunda imunossupressão (ex, sida). Pelo contrário, nas
regiões mais desenvolvidas o número de pessoas com imunossupressão continua a
aumentar, mas como resultado da crescente administração de potentes fármacos
imunossupressores, no tratamento de doenças auto-imunes ou em doentes submetidos a
transplantes de medula e/ou órgãos [Bachur et al. 2008]
4.1. RESPOSTA IMUNOLÓGICA
A maioria dos organismos patogénicos desenvolveu mecanismos de evasão ao
sistema imunológico do hospedeiro. Sendo assim, a ocorrência de infecção e/ou a sua
persistência no organismo, estabelece-se da interacção entre o hospedeiro (sistema
imune) e o parasita.
O desenvolvimento de uma infecção por microsporídios encontra-se dependente
da contagem absoluta do número de células TCD4+, com níveis baixos deste número
associados a doença mais grave, com manifestações atípicas e com elevado risco de
infecções disseminadas [Weber et al. 1999a; Attili et al. 2006; Stark et al. 2009]. Por
outro lado a administração de terapêutica eficaz e o restabelecimento do sistema
imunitário, por exemplo ao aumentar os níveis de TCD4+ acima das 200 céls/mm3, o
risco de contrair e/ou desenvolver microsporidiose [Stark et al. 2009]. A imunidade
mediada por células parece ser importante na protecção contra a infecção pelos
microsporidia. Na verdade, uma resposta de citoquinas Th1 eficaz, que se caracteriza
pela produção de citoquinas como a interleucina-2 (IL-2), a citoquina interferão gamma
(-IFN, da sigla anglo-saxónica para gamma interferon) e a citoquina factor de necrose
tumural alpha (TNF-, da sigla anglo-saxónica para alpha tumor necrosis factor),
activação de macrófagos e de mecanismos citotóxicos é importante na resposta imune à
infecção. No entanto o papel das respostas imunes humorais à infecção humana pelos
microsporídios, ainda não se encontra clarificado [Didier et al. 1994].
Em regra, E. bieneusi, parasita em primeiro lugar, os enterócitos do intestino
delgado (jejuno e duodeno) e/ou as células epiteliais do tracto biliar, do hospedeiro. À
sua replicação estão associadas a atrofia ou perda das vilosidades dos enterócitos,
4.IMUNOLOGIA
- 39 -
malabsorção da D- xilose, hiperplasia das criptas, diminuição da actividade de enzimas
(dissacaridase), ou infiltração mononuclear, entre outras [Schmidt et al. 1997; Kotler &
Orenstein 1998].
As espécies do género Encephalitozoon ao infectarem, de inicio os enterócitos
do intestino delgado causam inflamação e subsequente dano às células intestinais. No
entanto, estes organismos através da infecção de macrófagos, podem ter a capacidade de
disseminar e de parasitar qualquer tecido do hospedeiro. Lesões granulomatosas
ocorrem nas áreas afectadas, consistindo em infiltrados de macrófagos, neutrófilos,
linfócitos ou células plasmáticas, sendo detectados níveis elevados da citoquina TNF-α
nas fezes de indivíduos com co-infecção sida/microsporidiose, os quais parecem
contribuir para a emaciação associada a esta parasitose, nestes doentes [Didier &
Bessinger 1999].
As respostas imunitárias e as lesões associadas à microsporidiose, dependem do
tipo de relação parasita-hospedeiro que se estabelece [Didier & Bessinger 1999].
4.1.1. Relações parasita-hospedeiro. Três tipos de relação parasita-hospedeiro, são
observadas entre os mamíferos infectados por microsporídios [Didier & Bessinger
1999]:
(I) hospedeiros jovens que desenvolvem patologia aguda, muitas vezes letal;
(II) adultos imunocompetentes que desenvolvem infecções crónicas e assintomáticas,
em que o hospedeiro sobrevive e o parasita persiste;
(III) hospedeiros imunocomprometidos que desenvolvem infecções patentes graves, que
podem ser letais.
A transmissão transplacentária da infecção por E. cuniculi em cães, raposas azuis
norueguesas e macacos são, muitas vezes letais. Estes animais revelam distúrbios
neurológicos, tais como ataxia, paralesia, convulsões, podendo morrer de síndroma de
emaciação ou de hemorragia cerebral, em poucos meses. De início, o parasita, parece
replicar-se devido à imaturidade do sistema imunitário do hospedeiro [Didier &
Bessinger 1999].
Os carnívoros adultos (raposas azuis e cães domésticos), infectados pelos
microsporídios, desenvolvem respostas de hipersensibilidade (tipo III) e
4.IMUNOLOGIA
- 40 -
hipergamaglobulinemia, as quais contribuem para a patologia renal (via formação de
complexos imunes) [Didier & Bessinger 1999].
A maioria dos casos de microsporidiose ocorre como resultado de transmissão
horizontal e se os hospedeiros forem imunocompetentes, desenvolvem-se, apenas,
infecções transitórias que evoluem, espontaneamente para a cura mas que persistem
como infecções crónicas latentes.
Em hospedeiros imunodeprimidos, tais com ratinhos atímicos ou em seropositivos
para VIH, com níveis de linfócitos T CD4+ menores ou iguais a 100 céls/mm3, a
susceptibilidade à microsporidiose é evidente, evoluindo a doença muitas vezes para a
morte [Didier et al., 1998]. Desconhece-se se estas infecções nos indivíduos
seropositivos para VIH são o resultado de uma reactivação de uma infecção latente ou
de uma primo-infecção.
4.1.2. Mecanismos de resistência do hospedeiro. O sistema imunitário do hospedeiro
parece desempenhar um importante papel no controlo da microsporidiose animal e
humana dado que quer nos animais quer nos humanos, imunocompetentes, apesar de se
registar sintomatologia, ocorre, em geral, evolução para a cura expontânea, enquanto
nos imunocomprometidos, a microsporidiose pode ser fatal para o hospedeiro.
Um sistema imunitário competente, nos hospedeiros dos microsporídios, parece ser
crítico, na relação equilibrada parasita-hospedeiro.
4.1.2.1. Imunidade humoral
Em animais de laboratório (macacos rhesus e ratinhos), imunologicamente
competentes, expostos aos antigénios de microsporídios, os níveis da imunoglobulina
IgM desenvolvem-se em três semanas, enquanto os níveis da IgG atingem um pico entre
as cinco e seis semanas, persistindo em geral durante toda a vida do hospedeiro
[Schmidt & Shadduck 1983; Didier et al. 1998; Didier & Bessinger 1999]. Em humanos
imunocompetentes, registou-se a expressão de anticorpos contra E. cuniculi, embora
não tenha sido possível determinar se a presença de anticorpos estava correlacionada
com uma verdadeira infecção dado que os microsporídios não foram, nunca
identificados [Didier & Bessinger 1999].
4.IMUNOLOGIA
- 41 -
O desenvolvimento de anticorpos contra os microsporídios, por animais (macacos
rhesus seropositivos para VIS, ratos SCID) e por humanos imunodeprimidos, é variável
e com pouco valor de diagnóstico. Esta variabilidade observa-se, também, nos níveis de
produção de anticorpos contra os microsporídios em seronegativos para VIH, sem
história de microsporidiose. Esta variabilidade parece ter ligação com o estado do
sistema imunitário do hospedeiro, quando ocorre a primo-infecção [Didier et al. 1991a;
Didier et al. 1991b].
Com base em estudos em modelos animais, foram associadas duas funções
protectoras à produção de anticorpos específicos contra os microsporídios, isto é,
actuando como opsoninas para facilitar a fagocitose mediada pelo macrófago, ou como
anticorpos específicos, contra E. cuniculi, produzidos por ratos murino, fixando o
complemento e induzindo a morte do parasita in vitro [Didier & Bessinger 1999].
Acresce que, embora a actividade dos anticorpos, por si só, não confira protecção à
microsporidiose [Weber & Bryan 1994] devendo co-existir, então, com outros
mecanismos protectores, encontra-se descrito que podem prolongar a sobrevivência de
ratinhos SCID (sigla anglo-saxónica para severe combined immune deficiency),
infectados por E. cuniculi por via oral [Sak et al. 2006].
Algumas das respostas por anticorpos, contribuem, provavelmente, para a
patologia, como se observa, nos casos das raposas azuis e cães infectados por E.
cuniculi que desenvolvem doença associada à presença de complexos imunes.
4.1.2.2. Imunidade celular
A morte de ratinhos com deplecção de linfócitos TCD4+, e TCD8+, infectados
experimentalmente com microsporídios, vem consolidar a hipótese de que a resistência
à doença letal se encontra dependente dos linfócitos T funcionais, no hospedeiro
[Moretto et al. 2004].
Na verdade, a transferência de linfócitos T sensibilizados, confere protecção a
ratinhos, e os doentes com níveis baixos de contagem de linfócitos TCD4+ (tal como
acontece nos doentes com sida) são particularmente susceptíveis à microsporidiose
[Asmuth et al. 1994; Didier & Bessinger 1999].
4.IMUNOLOGIA
- 42 -
Em estudos com ratos murino verificou-se que a citoquina IFN-γ promove a
activação de macrófagos, para eliminação dos microsporídios, parecendo possuir um
papel importante na resistência à microsporidiose in vivo [Didier & Bessinger 1999],
1998].
Sharpstone e colaboradores, verificaram que os níveis de -TNF, detectados nas
fezes, eram significativamente mais elevados, em indivíduos infectados por VIH com
microsporidiose intestinal do que em seropositivos para VIH sem microsporidiose,
atribuindo-lhe um possível papel na patogénese da infecção intestinal por microsporidia.
O tratamento, com um inibidor da citoquina -TNF, a talidomida, resultou no alívio da
sintomatologia do doente (redução do número de dejecções) e no aparecimento de
formas anormais de microsporídios [Sharpstone et al. 1997].
Estudos mais recentes, recorrendo ao uso do modelo murino, ou a estudos ex-
vivo no homem, realçaram a importância de citoquinas pró-inflamatórias (Th1), tais
como IFN-γ, TNF-α, assim como o papel do óxido nítrico observado na resistência a
Encephalitozoon spp. [Salat et al. 2004; Franzen et al. 2005a]. Após administração oral
de E. cuniculi a ratinhos, observa-se um rápido aumento dos linfócitos TCD8+
intraepiteliais. Estas células parecem participar nas respostas pró-inflamatórias via
produção e actividade citotóxica do IFN-γ, assim como contribuir para a regulação
imune, através da secrecção interleucina-10 (IL-10) [Moretto et al. 2004].
Pouco se conhece ainda, sobre o papel que os linfócitos T, desempenham nos
humanos com microsporidiose. Contudo, parece existir uma correlação com os níveis de
células TCD4+ e o risco de infecção por microsporidia [Orenstein 1991].
4.1.3. Especificidade de hospedeiro. A especificidade do hospedeiro parece ter, em
parte, um papel na resistência ou susceptibilidade à infecção, com algumas espécies de
microsporidia que infectam os mamíferos. Entre as cerca de mil espécies de
microsporidia, muito poucas são infectantes para os mamíferos. Algumas destas
espécies, foram descritas, apenas, em humanos (i.e. E. intestinalis). À medida que as
pesquisas avançam e se disponibilizam métodos mais aperfeiçoados de diagnóstico,
muitos destes microsporídios poderão vir a ser registados também em hospedeiros não
humanos.
4.IMUNOLOGIA
- 43 -
No entanto, deve ocorrer um certo grau de especificidade do hospedeiro, dado o
número de tentativas frustradas, de transmissão, experimental, de E. bieneusi, em
inúmeras estirpes de ratinhos imunodeficientes (atímicos, SCID; beije). A genética do
hospedeiro puderá desempenhar, também, algum papel, na susceptibilidade/resistência à
microsporidiose [Didier & Bessinger 1999]. Outro factor que pode influenciar a
especificidade do hospedeiro, diz respeito à própria temperatura corporal do hospedeiro.
Na verdade para, pelo menos, duas espécies de microsporidia, a temperatura constitui
um importante factor limitante, restritivo da gama de hospedeiros, bem como do local
de infecção [Didier & Bessinger 1999]. Um microsporídio parasita de insectos, A.
algerae, em cultura celular de rim de suíno, embora seja infectante, não sobrevive mais
do que três dias a 37 º C. Todavia, este parasita cresce indefinidamente quer em cultura
celular de rim de porco quer em células MDCK, mantidas a temperaturas entre os 25-
27º C. Também E. hellem, agente de doença humana, reconhecido em diversas espécies
de aves, cuja temperatura corporal ronda os 41º C, parece replicar-se in vitro, muito
mais rapidamente a 41º C do que a 37º C [Didier et al. 1991c]. Também E. hellem,
agente de doença humana, reconhecido em diversas espécies de aves, cuja temperatura
corporal ronda os 41º C, parece replicar-se in vitro, muito mais rapidamente a 41º C do
que a 37º C [Didier & Bessinger 1999]. Estas observações têm de certo modo um
interesse epidemiológico, na medida em que vários dos doentes com sida e infectados
por E. hellem tinham periquitos domésticos, contribuindo este facto para apoiar a
hipótese de as infecções por esta espécie constituírem zoonoses [Didier & Bessinger
1999].
Devido à ausência de culturas in vitro e de em modelo animal para E. bieneusi,
ainda não foi possível estudar a resposta imunitária que confere protecção, à infecção
por este microsporídio. A ocorrência de infecções naturais por E. bieneusi encontra-se
descrita em macacos rhesus e macacos cauda-de-porco, representando os únicos
modelos animais que mimetizam as infecções que se podem observar quer em doentes
imunodeficientes quer em imunocompetentes [Green et al. 2004; Drosten et al. 2005].
5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE
- 44 -
5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE
5.1. DIAGNÓSTICO PRESUNTIVO
Os sinais e sintomas que acompanham as infecções por microsporídios, não são
suficientemente claros, para que o seu diagnóstico possa ser baseado no quadro clínico.
Contudo, o diagnóstico presuntivo da microsporidiose humana justifica-se em doentes
infectados por VIH, assim como com outras causas de imunossupressão, que
apresentam um quadro clínico de diarreia persistente, malabsorção, emaciação e
contagem de linfócitos T CD4+ inferior a 100 céls/mm3 [Weber et al. 1999b].
5.2. DIAGNÓSTICO DEFINITIVO
O diagnóstico da microsporidiose, no Homem, depende da identificação dos
esporos, em produtos biológicos, nomeadamente em amostras de fezes, urina, sucos
duodenal e biliar, exsudado da conjuntiva e nasal, expectoração, lavado broncoalveolar
ou biópsia dos tecidos. A identificação dos esporos nestas amostras é, contudo, uma
tarefa árdua, para o investigador, devido ao facto destes organismos terem dimensões
reduzidas, possuírem um fraco e variável poder da coloração e, ainda, causarem escassa
resposta inflamatória nos tecidos infectados, facilitando a dissimulação da infecção. O
desenvolvimento de métodos de diagnóstico laboratorial sensíveis, específicos e
rápidos, tem sido objecto de recentes estudos.
De início, para o diagnóstico definitivo da microsporidiose, recorria-se ao
auxílio da microscopia electrónica. Nos últimos anos assistiu-se ao desenvolvimento de
novos métodos de coloração, apropriados para a microscopia óptica. Contudo, apesar
dos avanços nesta área, a diferenciação das espécies de microsporídia é, em regra,
impossível através destes métodos. Visando a diferenciação das espécies,
desenvolveram-se técnicas de imunofluorescência com anticorpos monoclonais anti-
microsporidia, embora os anticorpos utilizados nestes métodos, só recentemente,
tenham começado a ser comercializados. Até, há bem pouco tempo, estes anticorpos
monoclonais só se encontravam disponíveis nos laboratórios de investigação.
Analogamente, embora os sistemas de cultura celular, permitam a cultura de algumas
5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE
- 45 -
espécies de microsporidia in vitro, a cultura celular não é uma técnica de rotina
adequada, dado ser demasiado demorada e laboriosa.
Para a detecção de anticorpos anti-microsporidia têm sido desenvolvidos vários
testes serológicos, sendo ainda, desconhecida a sensibilidade e especificidade destes
testes. Por outro lado, refira-se que estes métodos não são apropriados para o
diagnóstico da infecção em doentes imunocomprometidos.
Recentemente, a aplicação de novas técnicas moleculares, no estudo da
microsporidiose humana, tem vindo a revelar-se como uma promissora metodologia, no
diagnóstico dos vários quadros clínicos provocados pelos microsporídios.
5.2.1. Microscopia electrónica de transmissão
O diagnóstico definitivo da microsporidiose fundamenta-se na observação dos
microsporídios em biópsias de tecidos, nos fluídos corporais (urina, exsudado nasal,
expectoração, lavado broncoalveolar, suco duodenal e biliar, líquido cefalorraquidiano)
ou, ainda, em amostras de fezes, observadas por microscopia electrónica de transmissão
(MET). A visualização da ultra-estrutura dos esporos, com o seu característico
filamento polar é diagnóstica [Weber et al. 1999b]. Esta técnica permite a identificação
dos microsporídios ao nível do género ou, mesmo, da própria espécie, com base nas
características morfológicas dos esporos ou das suas formas proliferativas, no método
de divisão e, ainda, na natureza da interface entre o parasita e a célula hospedeira.
Todavia, nem todas as espécies de microsporidia, podem ser caracterizadas
exclusivamente com recurso à morfologia. A diferenciação entre as três espécies do
género Encephalitozoon só é possível através de uma análise molecular e aos seus
antigénios. Contudo a MET continua a ser considerada a técnica padrão, para
confirmação do diagnóstico e identificação de microsporidia [Weber et al. 1999b].
Todos os estádios do ciclo de vida do parasita podem ser encontrados nos
tecidos infectados, enquanto que nos fluídos corporais e nas fezes, em geral, apenas se
podem observar os esporos [Fedorko & Hijazi 1996].
A detecção de microsporídios por MET é bastante específica, sendo, contudo, uma
técnica de fraca sensibilidade, inerente à reduzida quantidade de amostra que pode ser
examinada. Outras das desvantagens, associadas a este método, incluem a necessidade
5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE
- 46 -
de recorrer a procedimentos invasivos (biópsia) para observar as formas intracelulares, e
por se tratar de uma metodologia demasiado laboriosa e onerosa [Fedorko & Hijazi
1996; Didier 1998; Franzen & Muller 1999b]. Por outro lado, não é fácil encontrar
microscópios electrónicos em laboratórios de rotina.
5.2.2. Microscopia óptica
O exame histológico de biópsias, ou por citologia de fluídos corporais e de fezes,
por microscopia óptica, permite o diagnóstico dos vários quadros clínicos da
microsporidiose mas, na grande maioria dos casos, é muito difícil a identificação da
espécie ou do género dos microsporídios.
5.2.2.1. Exame histológico ao microscópio óptico
As reduzidas dimensões dos organismos, bem como a escassez de resposta
inflamatória dos tecidos infectados, tornam difícil a detecção dos microsporídios por
microscopia óptica. A sua visualização depende de um contraste entre os esporos e os
restantes constituintes celulares.
Os parasitas, em tecidos corados pela hematoxilina-eosina, passam
despercebidos, mesmo a patologistas experientes [Didier 1998; Weber et al. 1999b;
Franzen & Muller 1999b].
Em contrapartida, nas colorações Gram e Warthin-Starry modificado, os esporos
exibem a propriedade de birrefracção, que os diferencia de outras inclusões
intracelulares. As colorações Brown-Brenn ou Brown-Hopps, aparentam alguma
utilidade na identificação de microsporídios em secções de tecido embebidas em
parafina [Lamps et al. 1998; Franzen & Muller 1999b], corando os esporos maduros de
Gram-positvo. Os esporos de vermelho tendem a ser os imaturos [Garcia 2002].
Técnicas de coloração fluorescente com branqueadores ópticos são rápidas e
fáceis de efectuar em tecidos, apresentando elevada sensibilidade e podendo ser
combinadas com outros métodos de coloração [Franzen et al. 1995a; Franzen & Muller
1999b].
5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE
- 47 -
A coloração de tecidos com o tricrómio modificado-Cromotrope 2R, ou a
Warthin-Starry são utilizadas, também, embora ambas as técnicas sejam demoradas e de
difícil interpretação [Weber et al. 1992c; Fedorko & Hijazi 1996].
Secções semifinas de material de biópsia, embebidas em resina, coradas com
uma vasta gama de corantes (hematoxilina-eosina, Giemsa, azul de toluidina, fucsina
básica), são métodos úteis para a visualização dos microsporídios, não sendo contudo
usados por rotina, na maioria dos laboratórios [Franzen & Muller 1999b]. Na Figura 7
podem ser observados esporos de microsporídios corados pela técnica do calcoflúor e
do Gram-Chromotrope.
5.2.2.2. Diagnóstico citológico e exame de fezes.
A identificação dos microsporídios pela microscopia óptica, em amostras obtidas
por processos não invasivos, tem constituído um forte desafio aos investigadores. Os
esporos de microsporidia podem ser detectados em diversos fluídos corporais e em
amostras de fezes [van et al. 1994a; Weber et al. 1999b].
A parede dos esporos é constituída por uma camada externa (exosporo)
proteinácea e por uma camada interna (endosporo) quitinosa. Várias colorações, tais
como, Gram, Giemsa, tricrómio ou fluorescentes têm sido experimentadas na coloração
dos microsporídios. No diagnóstico citológico, as colorações por Giemsa (ou por Gram
B
Figura 7. (A) Fotografia de esporos de E. cuniculi em esfregaço de secreção pulmonar,
corados pela técnica do calcoflúor; (B) Fotografia de esporos de E. intestinalis, em
esfregaço de cultura, corados por Gram-Chromotrope. (×1000). Originais de autora.
5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE
- 48 -
não são apropriadas, visto que não permitem a distinção entre os microsporídios e
outros microrganismos presentes nas amostras de produtos biológicos (i.e.
enterobactérias, com tamanho, forma e características de coloração semelhantes aos
microsporídios) [Fedorko & Hijazi 1996; Weber et al. 1999b]. Só após o
desenvolvimento de colorações especiais fluorescentes ou baseadas no reagente
chromotrope 2R tornou-se rotineiro o exame microscópico de fluídos corporais para o
diagnóstico dos microsporídios.
5.2.2.2.1. Coloração pelo tricrómio modificado.
A técnica de tricrómio modificada, desenvolvida por Weber e colaboradores
[Weber et al. 1992a], é o método mais comum, utilizado nos laboratórios de diagnóstico
para a detecção de microsporídios em fezes, urina e muco [Didier 1998; Sparfel et al.
1998; Amato et al. 1999; Weber et al. 1999b]. A modificação à técnica de tricrómio
consiste em decuplicar a concentração de chromotrope 2R, um dos componentes da
solução do tricrómio. Os esporos de microsporídios, observados com uma ampliação
1000, apresentam a sua parede celular corada de rosa, e nalguns pode ver-se uma cinta
rosada que divide os esporos, diagonalmente ou equatorialmente [Weber et al. 1992a].
As leveduras podem corar de um modo semelhante, mas distinguem-se dos
microsporídios, por serem de maiores dimensões e corarem mais intensamente. As
bactérias que coram com a mesma cor, podem-se distinguir dos microsporídios, pela
forma não oval (coco ou bastonete), e pela coloração homogénea que apresentam
[Weber et al. 1992a].
Esta técnica tem como desvantagens ser lenta e apresentar dificuldades na
detecção dos esporos se estes se encontrarem em pequeno número na amostra. Todavia,
algumas modificações implementadas por vários autores, como alterações na
temperatura e no tempo de coloração [Kokoskin et al. 1994; Didier et al. 1995a],
decréscimo no nível de ácido fosfotúngstico e substituição do contracorante [Ryan et al.
1993] têm como propósito acelerar o processo e proporcionar um melhor contraste entre
os esporos e o fundo.
5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE
- 49 -
5.2.2.2.2. Coloração pelo Gram - Chromotrope
Moura e colaboradores [Moura et al. 1997], desenvolveram a técnica Gram-
Chromotrope a quente, com vantagens acrescidas na coloração dos microsporídios para
microscopia óptica. Neste método, as amostras são coradas em soluções de violeta de
cristal e iodo, usadas na coloração Gram e, ainda, pela solução do tricrómio modificado,
aquecida entre os 50 ºC a 55º C. O tempo de duração da técnica fica reduzido apenas a
cinco minutos.
Os esporos de microsporídios, ficam, então, corados de violeta escuro sobre um
fundo verde claro. A solução Chromotrope, realça a cinta que rodeia habitualmente o
esporo, e ajuda a minimizar a coloração gram-variável, que algumas espécies de
microsporídios apresentam, quando coradas com a coloração Gram (Figura 7).
5.2.2.2.3. Coloração por fluorocromos
Para a detecção de microsporídios na urina, fezes ou muco, podem ser usados
agentes quimiofluorescentes, sendo o Uvitex 2B, calcoflúor e o fungifluor (formulação
de Calcoflúor em 10% de KOH), os corantes de primeira linha [Conteas et al. 1996;
Didier 1998; Goodgame et al. 1999; Franzen & Muller 1999b; Weber et al. 1999b]. Os
fluorocromos possuem elevada afinidade para a camada quitinosa (endosporo) do
esporo, sendo estes identificados pelo seu tamanho, forma e características de
fluorescência (halos ovais azul turquesa brilhantes sob luz ultravioleta) [Weber et al.
1999b] (Figura 7). Por vezes, verifica-se uma intensidade variável da coloração dos
esporos, presentes numa amostra, brilhando uns mais do que os outros [Luna et al.
1995]. A metodologia desta técnica é fácil e rápida, mas o exame requer um
microscópio de fluorescência com um filtro de excitação com comprimentos de onda
entre os 350-380 nm e, ainda, de lentes potentes com objectiva de 1000. Estes métodos
com fluorocromos, são descritos nalguns estudos como sendo mais sensíveis do que os
que utilizam o tricrómio, no entanto podem corar leveduras, dando origem a falsos
positivos [Weber & Bryan 1994; Luna et al. 1995; DeGirolami et al. 1995; Chioralia et
5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE
- 50 -
al. 1998; Weber et al. 1999b; Matos et al. 2002]. Todavia, existem outros estudos, que
não corroboram estes resultados [Didier et al. 1995a; Ignatius et al. 1997]. Num
aspecto, vários autores estão de acordo, as duas técnicas devem ser utilizadas
simultaneamente, de forma a potenciar o diagnóstico correcto, especialmente nos
produtos biológicos com baixa carga parasitária [DeGirolami et al. 1995; Didier et al.
1995a; Ignatius et al. 1997].
A concentração dos fluídos corporais torna-se necessária, dado, por vezes, o
pequeno número de microsporídios nas amostras biológicas. As técnicas de
concentração, para detecção dos esporos de microsporídios, geram alguma polémica.
Alguns autores observaram que técnicas de concentração, tais como a concentração com
acetato de formalina-éter ou diferentes métodos de flutuação, conduzem a uma perda
substancial dos esporos, logo a resultados falso negativos. Outros, porém, verificaram
que as técnicas de sedimentação água-éter ou a centrifugação de amostras de fezes
tratadas com KOH, aumentavam a possibilidade de identificação dos esporos de
microsporídios. Uma destas técnicas de concentração deverá ser, então, aplicada às
amostras de fezes [Weber et al. 1999b].
5.2.3. Técnicas de imunofluorescência indirecta com anticorpos mono e policlonais
A técnica de imunofluorescência indirecta (IFI), associada a anticorpos específicos
anti-microsporídios, marcados com fluoresceína, tem sido utilizada no diagnóstico e
diferenciação de espécies destes parasitas. Os anticorpos poli e monoclonais foram
usados, também, para análise de várias espécies de microsporidia por Western-blot
[Weber et al. 1999b].
Ensaios com anticorpos imunofluorescentes, envolvendo antisoro policlonal contra
E. hellem, E. cuniculi e E. intestinalis, produzido quer em ratinhos, quer em coelhos,
revelaram que várias das espécies de microsporídios apresentavam reacções cruzadas
imunológicas. As reacções cruzadas, observadas, quer entre diferentes espécies de
microsporídios, quer com bactérias e fungos, constituem um factor limitante desta
técnica [Zierdt et al. 1993; Aldras et al. 1994].
Até à data, já foi conseguida a produção de anticorpos que reconhecem E. hellem
[Aldras et al. 1994], E. cuniculi, E. intestinalis [Beckers et al. 1996] e E. bieneusi
5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE
- 51 -
[Accoceberry et al. 1999]. A maior parte destes anticorpos monoclonais são específicos
de antigénios existentes nos esporos [Aldras et al. 1994]. Porém, outros autores,
utilizam simultaneamente, anticorpos monoclonais que reagem com as proteínas do
filamento polar e anticorpos monoclonais que reconhecem antigénios da superfície dos
esporos [Beckers et al. 1996]. Alguns destes anticorpos monoclonais são específicos de
espécie, enquanto outros reagem com a parede do esporo ou com o filamento polar de
várias espécies de microsporidia.
Embora estas técnicas sejam úteis na diferenciação dos microsporídios, nas
diferentes amostras biológicas, existem estudos, que lhe atribuem um baixo grau de
sensibilidade, quando comparadas com outras técnicas. Assim, Didier e colaboradores
[Didier et al. 1995a], ao compararem três técnicas, nomeadamente tricrómio
modificado, coloração pelo calcoflúor e um teste fluorescente com anticorpo policlonal,
verificaram que este último era o método menos sensível para detectar os esporos de
microsporídios em amostras de fezes, de urina e de fluído duodenal. Estes autores
propõem que se faça um rastreio das amostras a testar com o calcoflúor, confirmando,
posteriormente as amostras positivas com a técnica do tricrómio modificado. No
entanto, como estes métodos não permitem a identificação da espécie de microsporidia,
os anticorpos específicos de espécie, deverão ser utilizados para fornecer identificações
definitivas.
5.2.4. Testes serológicos
Entre os diversos testes serológicos, com vista à detecção de anticorpos das classes
IgG e IgM contra os microsporídios nos humanos, incluem-se a IFI e o teste
imunoenzimático específico (ELISA, sigla do anglo-saxónico enzyme linked
immunosorbent assay) [Singh et al. 1982; Kucerova-Pospisilova & Ditrich 1998;
Kucerova-Pospisilova et al. 2001; Kucerova-Pospisilova et al. 2003; Omura et al.
2007], contraimunoelectroforese ou o Western-blotting. A sensibilidade e especificidade
destes métodos, na detecção de anticorpos anti-microsporidia, é, contudo, ainda,
desconhecida dado não existirem estudos comparativos disponíveis [Fedorko & Hijazi
1996; Didier & Weiss 2006]. Alguns destes testes, são utilizados na detecção de
anticorpos em diversas espécies animais [Singh et al. 1982; Weber et al. 1999b].
5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE
- 52 -
Em seropositivos e seronegativos para VIH [van et al. 1997], têm sido registados
anticorpos contra E. cuniculi [van et al. 2004] e E. intestinalis. Contudo, não existem
certezas se a presença de anticorpos são o resultado de uma verdadeira infecção, de
exposição antigénica sem estabelecimento do parasita, de reacções cruzadas com outras
espécies de microsporídios ou, ainda, de uma reacção não específica.
Nalguns estudos, demonstrou-se um aumento das taxas de seropositividade para E.
cuniculi, em habitantes de regiões tropicais e que apresentam doenças endémicas dessas
mesmas regiões. Em doentes com malária e com shistosomose, as taxas de
seropositividade para E. cuniculi foram de 4,7 % e 9,1 %, respectivamente [Hollister &
Canning 1987].
Com base num estudo em homossexuais suecos verificou-se que 10 em 30
indivíduos (33%) possuiam anticorpos contra E. cuniculi, e que todos os doentes
seropositivos para E. cuniculi tinham visitado uma região tropical [Hollister et al. 1991;
Fedorko & Hijazi 1996; Franzen & Muller 1999b] . Por outro lado, refira-se que foram
observadas taxas elevadas de seroprevalência de anticorpos contra E. intestinalis entre
um grupo de dadores de sangue alemães, de mulheres grávidas francesas e de doentes
com várias patologias infecciosas e não infecciosas, 8%, 5% e 4%, respectivamente
[van et al. 1997]. Em 2010, no Japão, foi publicado um estudo seroepidemiologico, em
380 pessoas saudáveis, em que a prevalência de anticorpos IgM anti-E. cuniculi da
proteína do tubo polar, detectada foi de 36,3% [Omura et al. 2007]. Recentemente, a
presença de anticorpos contra E. cuniculi foi detectada em 0.9% de humanos, 52% de
suínos, 2% de gado bovino, 9% em ovelhas e 15 % em cães. No mesmo estudo, foram
detectados anticorpos contra E. intestinalis em 6% de humanos, 51% de suínos, 11% de
gado bovino e 6% de cães [Malcekova, dados não publicados].
Os métodos serológicos não constituem ferramentas apropriadas de diagnóstico
para a microsporidiose, dado que, pelo menos, metade das amostras de soro de
indivíduos sem história de infecção por microsporídios, possuem títulos positivos
[Didier et al. 1991b; Fedorko & Hijazi 1996; Weber et al. 1999b]. Associadas às
técnicas serológicas, identificam-se outros problemas, nomeadamente a fraca resposta
imunológica em imunocomprometidos ou, ainda, a probabilidade de diferentes
microsporídios (patogénicos e não patogénicos) possuírem antigénios comuns que
5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE
- 53 -
gerem reacções cruzadas, ou memo de reacções cruzadas com outros organismos
(fungos) [Fedorko & Hijazi 1996; Thomarat et al. 2004; Furuya et al. 2009].
No entanto, dado que tem vindo a aumentar o número de casos de infecção por
microsporídios em, imunocompetentes, como crianças, viajantes e idosos, têm vindo a
ser dados passos no sentido do desenvolvimento de métodos serológicos, que utilizam a
totalidade do parasita, ou proteínas do tubo polar ou da parede do esporo, como
antigénios, nomeadamente para os microsporídios que não crescem em cultura [van et
al. 2004; Xu & Weiss 2005; Polonais et al. 2005; Peek et al. 2005; Taupin et al. 2006].
Já foi demonstrado que, a resposta serológica, que se observa nos humanos é, em parte,
resultado da exposição aos glicoepitopos constituintes do tubo polar [Xu & Weiss 2005;
Notermans et al. 2005; Peek et al. 2005]. Este tipo de metodologia na abordagem ao
diagnóstico da microsporidiose, pode vir a permitir a detecção de infecções subclínicas
em portadores, que podem transmitir a infecção a grupos populacionais de risco (ex:
doentes transplantados), ou que podem eles próprios, vir a sofrer reactivação do
organismo, em virtude de desenvolverem algum grau de imunocomprometimento (ex:
envelhecimento).
5.2.5. Isolamento em culturas celulares
Os microsporídios são parasitas intracelulares obrigatórios e, como tal, não
podem ser isolados nos meios de cultura tradicionais, utilizados para as bactérias e
fungos.
Undeen, em 1975, estabeleceu pela primeira vez, um microsporídio, A. algerae
numa linha celular de mamífero, nomeadamente em células de rim de suíno, a 26 ºC
[Undeen 1975; Franzen 2008]. Diversas espécies de microsporidia têm sido cultivadas
com sucesso, em linhas celulares de mamíferos, nomeadamente em células de rim de
macaco e de coelho (Vero e RK13), em fibroblastos de pulmão de fetos humanos
(MRC-5), células MDCK e, ainda, em várias outras linhas celulares [Weber et al.
1999b].
Entre as espécies que crescem em cultura in vitro, obtidas a partir de uma
variedade de amostras biológicas humanas, incluem-se as três espécies do género
Encephalitozoon (E. cuniculi, E. intestinalis e E. hellem), para além de V. corneae, A.
5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE
- 54 -
algerae, T. hominis, e T. anthropophthera [Shadduck 1969; Vavra et al. 1972; Didier et
al. 1991a; Visvesvara 2002; Garcia 2002; Juarez et al. 2003; Juarez et al. 2005]. Até à
data, E. bieneusi foi possível, apenas, manter em cultura, durante um curto período de
tempo (seis meses) [Visvesvara et al. 1995; Weber et al. 1999b].
A detecção de microsporídios em células de cultura infectadas pode levar entre três
a 10 semanas [van et al. 1994b; Visvesvara et al. 1995].
As culturas in vitro permitem estudar, por exemplo, os aspectos biológicos dos
microsporídios, potenciar o desenvolvimento de reagentes imunológicos para o
diagnóstico e diferenciar espécies, para além de proporcionarem um meio adequado
para ensaios farmacológicos [van et al. 1994b; Weber et al. 1999b; Snowden et al.
2000; Leitch & Ceballos 2008; Choudhry et al. 2009].
Análises moleculares, ultraestruturais, bioquímicas e antigénicas, combinadas com
culturas in vitro, têm servido para confirmar determinadas infecções provocadas por
espécies de microsporidia, já identificadas, bem como para definir novas espécies
[Franzen & Muller 1999b].
Contudo, o isolamento de microsporídios in vitro, não tem relevância como
método de diagnóstico de rotina, embora seja um instrumento importante no contexto da
investigação. Apenas os laboratórios especializados mantêm culturas celulares de
microsporídios [Weber et al. 1999b].
5.2.6. Modelos animais
Vários modelos animais foram desenvolvidos para o estudo das infecções por
microsporídios [Silveira et al. 1993; Snowden et al. 1998; Franzen & Muller 1999b;
Snowden et al. 2000]. A maioria destes modelos utiliza E. cuniculi, como agente
patogénico, visto este organismo ser reconhecido como causa importante de infecções
latentes em roedores de laboratório. BALB/c e C57B1/6, estirpes de ratinhos atímicos
infectados intraperitonealmente com E. cuniculi, E. hellem ou V. corneae, foram
utilizados como modelos animais [Schmidt & Shadduck 1983].
Num estudo, para testar a eficácia do albendazol em E. cuniculi, in vivo, utilizou-se
um modelo animal, com ratinhos SCID infectados por via oral com esporos daquele
parasita. Verificou-se que ratinhos imunocompetentes infectados por E. cuniculi
5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE
- 55 -
desenvolviam apenas infecção crónica assintomática. Macacos rhesus, infectados com o
vírus da imunodeficiência dos símios (VIS), foram infectados por via oral, com E.
cuniculi, E. hellem e V. corneae e mais recentemente com E. bieneusi (via oral)
[Franzen & Muller 1999b].
Até à data, foi possível infectar animais em laboratório, a partir de isolados de E.
bieneusi de origem humana, nomeadamente macacos rhesus [Tzipori et al. 1997; Green
et al. 2004], porquinhos gnotobióticos [Kondova et al. 1998], ambos com
imunodeficiência, ratos Sprague-Dawley [Accoceberry et al. 1997a] e coelhos da Nova
Zelândia [Accoceberry et al. 1997b]. Em qualquer destes grupos de animais estudados,
mais uma vez, apenas de observou infecção crónica assintomática, à semelhança do que
outros autores haviam registado em suínos imunocompetentes, infectados naturalmente
[Breitenmoser et al. 1999]. Diversas tentativas de infectar ratinhos imunodeficientes,
assim como imunocompetentes, revelaram-se infrutíferas durante algum tempo [Didier
et al. 1998]. No entanto, Feng e colaboradores desenvolveram potenciais modelos
animais (roedores) para estudos da espécie E. bieneusi [Feng et al. 2006]. Estes estudos,
permitiram a transmissão do parasita isolado de humanos com sucesso, e o
estabelecimento de infecção crónica durante 18 semanas, em diversos modelos de
roedores imunodeficientes.
Porém, não foi ainda desenvolvido, um modelo animal experimental adequado,
que tenha a capacidade de mimetizar a patologia intestinal, que ocorre nos doentes
infectados por VIH.
Não obstante, os modelos animais constituem uma importante base para o
desenvolvimento e a avaliação de métodos de diagnóstico, produção em massa do
parasita, para o estudo de respostas imunológicas [Omalu et al. 2007], de candidatos a
vacinas, de estratégias de tratamento [Snowden et al., 2000] ou da investigação sobre
vias de transmissão [Cox et al. 1979], sendo, também, essenciais à produção de
anticorpos poli e monoclonais contra os microsporídios.
5.2.7. Métodos moleculares
Os métodos moleculares aplicados em todas as áreas do estudo dos seres vivos
têm contribuído para um conhecimento mais aprofundado em todos os domínios da
5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE
- 56 -
biologia. Em filogenia e sistemática contribuíram para uma nova organização dos seres
vivos ao nível da megasistemática.
Ao longo da última década, verificou-se uma aplicação gradual, das técnicas
moleculares, ao diagnóstico e caracterização dos microsporídios. Esta metodologia, tem
como objectivo, a detecção de uma determinada sequência do ácido nucleico, ou de um
antigénio específico. Enquanto, nos laboratórios de rotina, o diagnóstico de primeira
linha é feito com recurso aos métodos de microscopia, nos últimos 15 anos, as técnicas
moleculares têm sido, essencialmente, desenvolvidas e aplicadas nos centros de
investigação.
Vários autores têm descrito técnicas de amplificação de ácido
desoxirribonucleico (DNA, da sigla anglo-saxónica para deoxyribonucleic acid), por
reacção em cadeia da polimerase (PCR, da sigla anglo-saxónica para polymerase chain
reaction), a fim de detectar a presença de microsporídios em amostras biológicas e
ambientais, ultrapassando as limitações de sensibilidade e especificidade apresentadas
pelas técnicas acima descritas [Ombrouck et al. 1997; Weber et al. 1999b]. O limiar de
detecção de microsporídios numa amostra de fezes, através de microscopia óptica, varia
entre a presença de 10 e 106 esporos/g de fezes, enquanto a PCR permite detectar
concentrações da ordem dos 102 esporos/g de fezes [Rinder et al. 1998a]. Como tal,
estudos epidemiológicos, que envolvam, apenas, a utilização da microscopia óptica,
podem conduzir a dados que não reflitam uma correcta avaliação da prevalência de
microsporídios. Porém, são necessários, ainda, mais estudos para avaliar estes
parâmetros e os valores preditivos destes métodos.
A sensibilidade da reacção de PCR para a detecção de microsporídios depende
de diversos factores, tais como o número de cópias da região do genoma a amplificar ou
a presença de constituintes fecais inibidores da reacção [Weber et al. 1999b; Carey et al.
2004]. Assim, os sais biliares, a bilirrubina, os metabolitos de fármacos, o DNA de
outros microrganismos ou polissacáridos complexos de origem vegetal que sequestrem
o ião magnésio, de cuja concentração depende a actividade da enzima Taq DNA
polimerase, ou que mimetizem o comportamento do DNA, reduzem a eficiência e a
sensibilidade da reacção de PCR [Monteiro et al. 1997; Weber et al. 1999b]. Para
ultrapassar este problema são necessários métodos de extracção de DNA genómico
eficazes na remoção daqueles inibidores fecais. Os ácidos nucléicos podem ser extraídos
5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE
- 57 -
de amostras biológicas, tais como biópsias de tecidos, raspagens da córnea, aspirados
duodenais, urina, material embebido em parafina, assim como de culturas in vitro, ou de
amostras em lâmina coradas [Chan & Koh 2008], através de uma variedade de kits
comerciais. Podem ser também aplicadas técnicas de uso rotineiro em laboratórios,
como seja a digestão pela proteinase K, seguida de um protocolo de extracção com
fenol-clorofórmio e precipitação por etanol [Ghosh & Weiss 2009].
Por outro lado, é da máxima importância que a extracção de DNA seja precedida
da eficiente destruição da parede dos esporos, uma vez que esta é muito resistente e que
a sua lise incompleta compromete todo o processo de extracção e, consequentemente, o
rendimento da reacção de PCR. O isolamento e amplificação de DNA, a partir de
amostras de fezes, constitui em geral, um maior desafio, tendo por vezes de recorrer-se
à disrupção mecânica e/ou condições de extracção mais agressivas [Ghosh & Weiss
2009]. Alguns dos métodos descritos na literatura, incluem a submissão da amostra ao
hipoclorito de sódio 0,5%, à quitinase [Fedorko & Hijazi 1996], liticase [Raynaud et al.
1998], tiocianato de guanidina [Kock et al. 1997; Talal et al. 1998], ditiotreitol
[Katzwinkel-Wladarsch et al. 1996], ou à fervura [Ombrouck et al. 1996]. Em geral,
como já foi referido, as amostras fecais têm um número elevado de inibidores das
enzimas polimerases, que são difíceis de remover pelos métodos acima referidos. De
modo a potenciar a eficácia de remoção de inibidores, pode recorrer-se à diluição das
amostras a estudar [Ombrouck et al. 1997], ou ao tratamento com tiocianato de
guanidina [Ghosh & Weiss 2009].
A aplicação da técnica da PCR, ao diagnóstico de um parasita, está condicionada
pela informação disponível sobre o seu genoma. Os microsporídios que infectam o
Homem, constituem um grupo de agentes patogénicos emergentes, e embora seja
reduzida a informação genética disponível até à data, novos dados não páram de surgir.
Os primeiros dados sobre os microsporídios obtidos através dos métodos
moleculares, vieram complementar o conhecimento das características eucariotas
únicas, destes parasitas, salientando a sua semelhança aos organismos procariotas.
Verificou-se, a presença de ribossomas do tipo 70S, rRNA 16S e 23S e, na ausência de
uma região espaçadora transcrita 2 (ITS2, da sigla anglo-saxónica para internal
transcribed spacer) observa-se a fusão da região 5.8S com a subunidade grande (23S)
do rRNA [Weiss & Vossbrinck 1999].
5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE
- 58 -
Também através das técnicas moleculares tem sido possível estudar e avaliar o
tamanho do genoma dos microsporídios, tendo-se verificado que comparativamente a
outros eucariotas, os microsporídios possuem genomas pequenos, numa gama de
tamanhos que podem oscilar entre os 2,3 Mb e os 19,5 Mb. Os genomas de E. cuniculi e
E. intestinalis apresentam apenas 2,9 Mb, e 2.3 Mb, respectivamente, constituindo,
assim, esta última espécie, entre os microsporídios o parasita com o genoma mais
pequeno [Biderre et al. 1995; Peyretaillade et al. 1998a].
Ainda são poucos os genes localizados nos cromossomas dos microsporidia e
este mapeamento foi feito, apenas, para um número limitado de espécies [Franzen &
Muller, 1999]. Actualmente, entre os microsporidios mais estudados, o número de
cromossomas varia entre os oito e os 18 [Weiss 2000; Metenier & Vivares 2001].
As reduzidas dimenções do genoma dos microsporídios, sugerem que estes
microrganismos desenvolveram estratégias de compactação da informação genética (por
exemplo, semelhante à organização do genoma de vírus), e/ou perderam informação
genética das vias metabólicas, dependendo exclusivamente de fontes celulares do
hospedeiro, para estes compostos. Até á data, a espécie E. cuniculi é a única cujo
genoma se encontra totalmente sequenciado [Biderre et al. 1995], e no qual se pode
comprovar esta redução genómica. Na verdade, sugere-se que, o ciclo de vida
obrigatório intracelular, deste parasita tenha induzido a perda de diversos genes, cujas
funções podem vir a ser desempenhadas pela célula hospedeira. Esta espécie de
microsporidia, possui um número reduzido de genes, cerca de 2000, desconhecendo-se,
todavia a função de mais de metade. [Vivares & Metenier 2000; Katinka et al. 2001].
Para além da redução quantitativa de genes, os que permaneceram, ficaram circunscritos
a um espaço limitado, quer pela redução do tamanho total dos genes (por exemplo
devido à escassez de intrões), quer pela redução significativa das regiões espaçadoras
intergénicas [Katinka et al. 2001; Slamovits et al. 2004].
O DNA que codifica o RNA dos ribossomas é constituído por genes que
codificam respectivamente a SSU e a LSU. O produto do gene 16S, que é RNA e não
uma proteína, combina-se com proteínas para formar a pequena subunidade dos
ribossomas (SSU) A grande subunidade dos ribossomas é formada por proteínas e pelo
produto do gene 5,8S, 23S e 5S [Weiss 2000].
5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE
- 59 -
O gene 16S rRNA é uma região muito conservada e muito estável em todos os
organismos sendo utilizada em estudos filogenéticos ao nível da megasistemática
[Weiss & Vossbrinck 1999].
Ao contrário do que se observa nos outros eucariotas, nos microsporídios, só
existe uma unica região intergénica (ITS) localizada entre o gene 16S e o 5.8S ligado ao
gene que codifica para a LSU. Esta região do DNA, por ser uma zona não codificante
acumula mutações mais rapidamente, sendo muito utilizada para identificar e
caracterizar espécies ao nível de um determinado género [Weiss & Vossbrinck 1999].
O RNA e as proteínas ribossomais desempenham um papel essencial na
manutenção da estrutura e integridade dos ribossomas sendo o RNA fundamental no
processo de síntese proteica em todas as células o que lhe confere uma extraordinária
importância e conservação em todos os organismos vivos [Weiss & Vossbrinck 1999].
As sequências do gene do rRNA, depositadas no GenBank são para a maioria
dos microsporídios a única informação genética disponível. O número de sequências,
nesta base de dados, aumentou de cerca de 200, em 1999, para aproximadamente 6000,
na actualidade [Weiss & Vossbrinck 1999]. Assim, a maioria dos métodos moleculares
de detecção e identificação de microsporídios, baseados na amplificação pela PCR e
descritos na literatura, foram desenvolvidos com base na região do genoma que codifica
para os ribossomas (rDNA), mais concretamente na região SSU, ITS e LSU rRNA. A
disponibilidade de acesso público destas sequências, caracterizadas pela presença de
regiões conservadas e outras variáveis, veio assim constituir-se como uma ferramenta
importante, por vezes a única, para a caracterização genética destes parasitas. A
clonagem da SSU do rDNA de Vairimorpha nacatrix, um microsporídio associado a
doenças com impacte económico na agricultura [Vossbrinck et al. 1987], constitui o
primeiro registo da utilização desta região genómica, com sucesso, pelo desenho de
oligonucleótidos iniciadores (primers), específicos, no interior desta mesma sequência
de nucleótidos.
Primers tendo como sequências alvo as regiões conservadas do gene do rRNA,
resultaram na amplificação do DNA e obtenção de informação genética de diversos
microsporídios patogénicos para o homem: E. cuniculi, E. hellem, E. intestinalis, E.
bieneusi e V. corneae [Franzen & Muller 1999b; Menotti et al. 2003b]. No genoma de
E. cuniculi, estes genes de rRNA estão presentes em mais de 20 cópias [Katinka et al.
5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE
- 60 -
2001], fornecendo um acréscimo na sensibilidade (relativamente a genes de cópia
única), quando se pretende a amplificação de DNA do parasita em amostras biológicas
ou ambientais. A região ITS do rRNA, apresenta uma elevada variabilidade, sendo
adequada para a caracterização genotípica de algumas espécies de microsporídios, com
destaque, para E. bieneusi.
Assim, para o diagnóstico e identificação de espécies de microsporídios
infectantes para os humanos [Fedorko & Hijazi 1996; da Silva et al. 1996; Didier et al.
1996a; Gatti et al. 1997], bem como para os animais [Malone & McIvor 1995; Malone
& McIvor 1996], têm sido desenvolvidas diversas técnicas de PCR para amplificação de
diferentes regiões do gene que codifica a SSU rRNA e a LSU rRNA, bem como da região
do espaço intergénico (ITS), cujos estudos foram revistos por Weiss e Vossbrink [Weiss
& Vossbrinck 1999], e por Franzen e Müller [Franzen & Muller 1999b].
No Quadro IV, encontram-se compiladas as diversas sequências de primers
utilizados na amplificação dos microsporídios (adaptado de [Weiss & Vossbrinck
1999]). Enquanto que alguns primers foram desenhados para amplificar uma gama
alargada de microsporídios, incluindo as principais espécies infectantes para o homem
e, designados habitualmente na literatura por pan-específicos, outros permitem a
identificação da espécie envolvida.
Para além da detecção e identificação directa de diversos microsporídios, a
técnica de PCR, associada a outros métodos de biologia molecular, como o
polimorfismo do comprimento de fragmentos de restrição (RFLP, sigla anglo-saxónica
para restriction fragment length polymorphism), ou a determinação da sequência
nucleotídica de fragmentos de DNA amplificado, possibilita, também, a identificação da
espécie e/ou genótipo dos parasitas [Weiss & Vossbrinck 1999].
5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE
- 61 -
Quadro IV. Revisão de primers utilizados no diagnóstico molecular de microsporidia. Adaptado de [Ghosh & Weiss 2009].
ESPÉCIES SEQUÊNCIA (5’→3’) PRIMER /SONDA TA/TM (ºC) AMPLICÃO (pb) REF.
Primers usados em PCR
Anncaliia algerae ACTCCGGTAACGTGTGATGTG NALGf2 55 180 [Visvesvara et al. 1999a] TACAAAGCATGATCCCAGTCT NALGR1 Anncaliia algerae GCCGTTTCCGAAGTTGG NAGf 50 192 [Cali et al. 1998] ATATCGACGGGACTCTCACC NAG178r Encephalitozoonidae e Ent. bieneusi CACCAGGTTGATTCTGCCTGAC PMP1 (V1)
60
Eb 250 [Fedorko & Hijazi 1996]
CCTCTCCGGAACCAAACCTG PMP2 Ec 268
Ei 270
Eh 279
Encephalitozoonidae e E. bieneusi TGAATG(G/T)GTCCCTGT MSP1
58
Eb 508 [Katzwinkel-Wladarsch et al. 1996]
TCACTCGCCGCTACT MSP2A Ec 289
GTTCATCGCACTACT MSP2B Ei 305 Ei 305 GGAATTCACACCGCCCGTC(A/G)(C/T)TAT MSP3 CCAAGCTTATGCTTAAGT(C/T)(A/C)AA(A/G)GGGT MSP4A CCAAGCTTATGCTTAAGTCCAGGGAG MSP4B
Encephalitozoonidae e E. bieneusi CCAGGUTGATUCTGCCUGACG Mic3U
65/62
Eb 132 [Kock et al. 1997]
TUACCGCGGCUGCUGGCAC Mic421U Ec 113 AAGGAGCCTGAGAGATGGCT Mic266 Eh 134 CAATTGCTTCACCCTAAGGTC Eb379 Ei 128 GACCCCTTTGCACTCGCACAC Ec378 TGCCCTCCAGTAAATCACAAC Eh410 CCTCCAATCAATCTCGACTC Ei395 Encephalitozoonidae e E. bieneusi CACCAGGTTGATTCTGCC C1 (V1)
56
Eb 1170 [Raynaud et al. 1998] GTGACGGGCGGTGTCTAC C2 Ec 1190 Eh 1205 Ei 1186
Encephalitozoonidae TGCAGTTAAAATGTCCGTAGT int530f 40 1000
[Didier et al. 1996a]
TTTCACTCGCCGCTACTCAG int580r
5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE
- 62 -
Quadro IV. Revisão de primers utilizados no diagnóstico molecular de microsporidia (continuação). Adaptado
de [Ghosh & Weiss 2009].
ESPÉCIES SEQUÊNCIA (5’→3’) PRIMER /SONDA TA/TM (ºC) AMPLICÃO (pb) REF.
E. intestinalis CACCAGGTTGATTCTGCCTGAC V1 58
375 [Weiss et al. 1994]
CTCGCTCCTTTACACTCGAA Si500
E. intestinalis GGGGGTAGGAGTGTTTTTG 3 65
930
[Schuitema et al. 1993]
CAGCAGGCTCCCTCGCCATC 3 E. intestinalis TTTCGAGTGTAAGGAGTCGA SINTF1
55 520 [De Groote et al. 1995; da Silva et al. 1997]
CCGTCCTCGTTCTCCTGCCCG SINTR E. cuniculi ATGAGAAGTGATGTGTGTGCG ECUNF
55 549 [Visvesvara et al. 1994; De Groote et al. 1995]
TGCCATGCACTCACAGGCATC ECUNR E. hellem TGAGAAGTAAGATGTTTAGCA EHELF
55 547 [Visvesvara et al. 1994]
GTAAAAAGACTCTCACACTCA EHELR E. bieneusi GAAACTTGTCCACTCCTTACG EBIEF1
55 607 [da Silva et al. 1997]
CCATGCACCACTCCTGCCATT EBIER1 E. bieneusi CACCAGGTTGATTCTGCCTGAC V1
48 353 [Zhu et al. 1993; Coyle et al. 1996]
ACTCAGGTGTTATACTCACGTC EB450 E. bieneusi CACCAGGTTGATTCTGCCTGAC V1
54 446 [Mansfield et al. 1997; Carville et al. 1997]
CAGCATCCACCATAGACAC Mic3 E. bieneusi TCAGTTTTGGGTGTGGTATCGG Eb.gc
49 210 [Velasquez et al. 1996]
GCTACCCATACACACATCATTC Eb.gt E. bieneusi GCCTGACGTAGATGCTAGTC 2
55 1265 [David et al. 1996]
ATGGTTCTCCAACTGAAACC 2
Vittaforma corneae TGAGACGTGAAGATGAGTATC NCORF1 55
375 Pieniazek, Visvesvara, PC
TCCCTGCCCACTGTCTCCAAT NCORR1 Primers e sondas usadas em hibridação
Encephalitozoon spp. CAGGTTGATTCTGCCTGACG FP 63
[Notermans et al. 2005] ATCTCTCAGGCTCCCTCTCC RP E. hellem ACT CTCACA CTC ACT TCA G HEL878F 54 [Hester et al. 2000]
5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE
- 63 -
Quadro IV. Revisão de primers utilizados no diagnóstico molecular de microsporidia (continuação). Adaptado
de [Ghosh & Weiss 2009].
ESPÉCIES SEQUÊNCIA (5’→3’) PRIMER /SONDA TA/TM (ºC) AMPLICÃO (pb) REF.
E. bieneusi CGGTGGTGTGTGTAGGCGTGAGAGTGTATC sonda 55 [Velasquez et al. 1999]
Primers e sondas usadas em RT-PCR ou PCR fluorogénico
EncephP1 CCC TGT CCT TTG TAC ACA CCG CCC EncephP1 68 [Hester et al. 2002] EcunF1 TCC TAG TAA TAG CGG CTG ACG AA EcunF1 59 EcunR2 ACT CAG GAC TCA GAC CTT CCG A EcunR2 59 EhelF1 GAA TGA TTG AAC AAG TTA TTT TGA ATG TG EhelF1 59 EhelR2 AAC ACG AAA GAC TCA GAC CTC TCA EhelR2 58 EintF1 AAT TCC TAG TAA TAA CGA TTG AAC AAG TTG EintF1 59 EintR2 ACG AAG GAC TCA GAC CTT CCA A EintR2 59
E. bieneusi CGCTGTAGTTCCTGCAGTAAACTATGCC FEB1 65 102 [Menotti et al. 2003a; Menotti et al. 2003b][33,34] CTTGCGAGCGTACTATCCCCAGAG REB1 ACGTGGGCGGGAGAAATCTTTAGTGTTCGGG sonda E. intestinalis GCAAGGGAGGAATGGAACAGAACAG FEI1
65 127 [Menotti et al. 2003a]
TTCAGAAGCCCATTACACAGC REI1 CGGGCGGCACGCGCACTACGATA sonda E. bieneusi TGTGTAGGCGTGAGAGTGTATCTG EbITS-89F
60 103 [Verweij et al. 2007]
CATCCAACCATCACGTACCAATC EbITS-191R CACTGCACCCACATCCCTCACCCTT EbITS-114revT Encephalitozoon spp. CACCAGGTTGATTCTGCCTGAC MSP1F
60
CTAGTTAGGCCATTACCCTAACTACCA Eint227R CTATCACTGAGCCGTCC Eint82Trev Encephalitozoon GTCCGT TAT GCC CTG AGA T
60
268 ACA GCAGCC ATGTTA CGACT GCC CGT CGC TATCTA AGA TGA CGC A sonda 1 TGG ACG AAG ATT GGA AGGTCT GAG TC sonda 2
5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE
- 64 -
Quadro IV. Revisão de primers utilizados no diagnóstico molecular de microsporidia (continuação). Adaptado
de [Ghosh & Weiss 2009].
ESPÉCIES SEQUÊNCIA (5’→3’) PRIMER /SONDA TA/TM (ºC) AMPLICÃO (pb) REF.
Primers e sondas usadas em microarrays
Microsporidia GATTCTGCCTGACGTGGATGCTATT Msp1 58 [Wang et al. 2005]
ATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAGAT Msp2 61 ATTGACGGAAGGACACTACCAGGA Msp3 57 GTGCGGCTTAATTTGACTCAACGCG Msp4 58 E. bieneusi ACGGCTCAGTAATGTTGCGGTAATT Eb1 56 CCTATCAGCTTGTTGGTAGTGTAAA Eb2 54 TCATGAGACGTGAGTATAAGACCTG Eb3 56 ATCGAATACGTGAGAATGGCAGGAGT Eb4 58 CTAAAAGCGGAGAATAAGGCGCAAC Eb5 58 CGTTGTTCAATAGCGATGAGTTTGC Eb6 56 GGTGAAACTTAAAGCGAAATTGACGG Eb7 56 AGCCTGTGTGTGAGAATACGTGG Eb8 56 Encephalitozoon ACGGCTCAGTGATAGTACGATGATT Ence1 56 TATCAGCTGGTAGTTAGGGTAATGG Ence2 56 GAGTGAAACTTGAAGAGATTGACGG Ence3 56 E. cuniculi TGTGGGGTTGGCAAGTAAGTTGTGG Ec1 59 ATGAGAAGTGATGTGTGTGCGAGTG Ec2 58 GCCTGTGAGTGCATGGCATGAG Ec3 59 GGGAAACTGCAGATAGTGGTCTGC Ec4 59 GGATGTAGTGATGTGTGTGGCAGAG Ec5 59 CTGGACGGGACAGTGTGTGTTGT Ec6 59 E. hellem TAAGTTCTGGGGGTGGTAGTTTGTA Eh1 56 GCGGTTATGAGAAGTAAGATGTTTAGCA Eh2 57 CTGAAGTGAGTGTGAGAGTGTTTTTAC Eh3 57 ATTGGGAGCCTGGATGTAACTGTGG Eh4 59 GGATGTAGTTTTATTGTAGCAGAGG Eh5 54 TGGACGGGACTGTTTTAGTGTTGTC Eh6 58 E. intestinalis TTGACACGAGCCAAGTAAGTTGTAG Ei1 56 TTTCGAGTGTAAAGGAGTCGAGATTGA Ei2 57 GGCAGGAGAACGAGGACGGGAT Ei3 60 CAGGTAGGGGGCTAGGAGTGTTTTT Ei4 59 TGGACGGGACTATATAGTGTTGTG Ei5 56 TATGTCCTGATGTGGATGTAAGAGG Ei6 56 microsporidia-em geral TTTMMAACGGCCATGCACCAC MspR3 52 var
5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE
- 65 -
Acresce, que a PCR é também um instrumento útil na determinação de
microsporidios de humanos e animais, que são desconhecidos à partida. Aplicando
primers, que amplificam regiões conservadas da SSU e LSU rRNA, é possível clonar e
sequenciar determinadas porções deste gene em microsporídios a caracterizar. Os
primers designados na literatura por V1 (18f::1492r e o 530f::580r) são considerados
universais, sendo habitualmente aplicados com sucesso na caracterização específica de
microsporídios [Weiss & Vossbrinck 1999; Vossbrinck & brunner-Vossbrinck 2005;
Ghosh & Weiss 2009].
Diversas publicações, referem-se à aplicação da técnica de PCR em tempo-real
(RT-PCR, sigla anglo-saxónica para real-time polymerase chain reaction), ao
diagnóstico dos microsporíos [Hester et al. 2002; Wolk et al. 2002; Menotti et al.
2003a; Menotti et al. 2003b; Verweij et al. 2007]. Esta técnica permite a detecção de
amplicões em tempo real, com recurso a fluorocromos ou sondas marcadas com
emissão de fluorescência, e tem como vantagens, permitir a quantificação da amostra,
encontrar-se padronizada para testar uma grande quantidade de amostras em simultâneo,
e dispensar o processo da sua visulização em gel. Estas características, potenciam a
eficiência do diagnóstico em laboratório e reduzem o risco de contaminações, inerente à
PCR [Monis & Giglio 2006]. Num estudo, registou-se, um limiar de detecção para esta
técnica, entre os 102 e os 103 esporos/ml [Wolk et al. 2002].
Também referida na literatura, embora em número reduzido, a hibridação in situ
(FISH, sigla do anglo-saxónico para fluorescent in situ hybridization), é uma técnica
que possibilita a detecção de microsporídios [Carville et al. 1997; Velasquez et al.
1999; Hester et al. 2000; Graczyk et al. 2007a]. A FISH utiliza uma sonda marcada com
fluorescência que ira ligar-se ao ácido nucleico (DNA ou RNA) do parasita [Procop
2007]. Ao contrário da PCR, esta técnica permite informação morfológica e espacial do
organismo em estudo. Apesar desta técnica parecer uma ferramenta atraente, visto que
proporciona uma vasta informação, duas limitações podem condicionar a sua aplicação
ao diagnóstico clínico: é extremamente laboriosa e menos sensível do que a PCR.
Recentemente, foi descrito um sistema de microarrays, para a detecção
simultânea das quatro principais espécies infectantes para o Homem, em amostras
clínicas, que pelo menos terá como vantagem num único teste identificar mais do que
uma espécie, cuja elevada capacidade de processamento das amostras conduz ao ao
5. DIAGNÓSTICO DA MICROSPORIDIOSE
- 66 -
aumento da eficiência de diagnóstico, nos laboratórios de investigação [Wang et al.
2005].
Diversos autores, defendem que, os métodos moleculares, devem ser utilizados,
em simultâneo com os outros métodos colorimétricos, procedendo-se, após a
identificação dos microsporídios, pela microscopia óptica, à confirmação e à
identificação das espécies, pelas técnicas moleculares, visando contribuir para o rápido
aumento dos conhecimentos acerca destes organismos.
As técnicas de biologia molecular, em especial a reacção de PCR, possuem um
elevado potencial como técnicas de diagnóstico da microsporidiose. Todavia, apesar de
considerados métodos fiáveis, fáceis de implementar e com elevada sensibilidade, não
são ainda técnicas de rotina laboratorial, sendo necessário uma avaliação rigorosa de
parâmetros, tais como a especificidade, sensibilidade e reprodutibilidade, quer entre
diferentes laboratórios, quer nas diferentes situações de aplicação, de modo a ser
possivel adoptar métodos de referência bem definidos e adequados à sua utilização de
rotina no diagnóstico da microsporidiose.
6.TRATAMENTO DA MICROSPORIDIOSE HUMANA
- 67 -
6. TRATAMENTO DA MICROSPORIDIOSE HUMANA
Actualmente, não existe tratamento eficaz contra as infecções por
microsporídios. A dificuldade de penetração dos fármacos, na espessa parede do esporo
do parasita, constitui um dos principais obstáculos, dado que, mesmo que outros
estádios vegetativos sejam destruidos e a morfogénese dos esporos seja perturbada,
existe sempre, a possibilidade do restabelecimento da infecção através dos esporos
maduros, quando a terapêutica é interrompida [Canning & Hollister 1992a; Kotler &
Orenstein 1999].
Os poucos estudos publicados sobre a terapêutica das microsporidioses, inserem-
se sempre no contexto de abordagem terapêutica às infecções oportunistas em doentes
infectados por VIH. A terapêutica anti-retrovírica utilizada presentemente, no
tratamento de doentes com sida, resultou num aumento dos níveis dos linfócitos T
CD4+ que, com a concomitante redução da carga viral de VIH, conduziu a um
decréscimo na prevalência da maioria das infecções oportunistas, incluindo da
microsporidiose [Goguel et al. 1997; Conteas et al. 1998b; Maggi et al. 2000; Didier et
al. 2005; Wiwanitkit 2006; Morpeth & Thielman 2006]. Num estudo recente sugere-se
que os inibidores da aspartil protease do VIH, inibem directamente o crescimento de E.
intestinalis em culturas de tecidos [Menotti et al. 2005]. No entanto, a eficácia da
terapêutica anti-retrovírica é variável, devido a alguma toxicidade e a resistência viral,
que se podem registar. É, então, possível que, no futuro, se venha a verificar um novo
acréscimo na prevalência das infecções oportunistas, em particular em regiões em vias
de desenvolvimento [Stark et al. 2009].
No Quadro V, apresentam-se os princípios activos e respectivas doses,
encontrados na literatura.
6.TRATAMENTO DA MICROSPORIDIOSE HUMANA
- 68 -
Quadro V- Terapêutica das microsporidioses. Adaptado de [Kotler & Orenstein 1999].
Microsporídios Princípio activo Dose
Enterocytozoon bieneusi
Não existe terapêutica eficaz; melhoria clínica em alguns doentes com albendazol
Infecções sistémicas por Encephalitozoon spp.
Albendazol 400 mg BID
Infecções oculares por Encephalitozoon spp.
Fumagilina (Fumidil b, 3 mg/ml; terapêutica com albendazol, também deve ser considerada
2 gotas em cada 2 horas, nos primeiros 4 dias, a partir do 5º dia, 2 gotas 4 vezes ao dia.
Trachipleistophora hominis
Albendazol 400 mg BID
Anncaliia vesicularum Albendazol e itraconazol 400 mg BID e QD, respectivamente
BID= duas vezes por dia; QD= uma vez por dia.
6.1. TRATAMENTO DA INFECÇÃO INTESTINAL
Na identificação de fármacos potenciais para o tratamento da microsporidiose,
têm sido utilizadas culturas celulares e modelos animais [Snowden et al., 1999]. Em
hospedeiros invertebrados, existem fármacos eficientes no combate à microsporidiose,
nomeadamente a fumagilina (um antibiótico produzido pelo fungo Aspergillus
fumegatus) [Katznelson & Jamiesin 1952; Franzen 2008] ou o itraconazol no controlo
de Nosema apis em abelhas e noutros microsporidia em gorgulhos [Canning & Hollister
1991].
Ensaios clínicos, confirmaram a erradicação selectiva das espécies do género
Encephalitozoon, pelo albendazol [Molina et al. 1995]. Ensaios, in vitro, demonstraram
alterações no desenvolvimento de E. cuniculi [Beauvais et al. 1994]. O albendazol
produz um desarranjo microtubular, inibindo a formação dos fusos mitóticos e
bloqueando a divisão nuclear do parasita [Kotler & Orenstein 1999].
Na actualidade, o albendazol (benzimidazol) é o fármaco mais eficiente no
tratamento das infecções causadas pela maioria das espécies de microsporidia no
homem, embora a sua eficácia seja reduzida ou mesmo nula em E. bieneusi [Molina et
al. 1997; Conteas et al. 1998b].
O albendazol tem sido aplicado, com sucesso, na microsporidiose por
Encephalitozoon spp., em seropositivos para VIH, com melhoria da sintomatologia e,
6.TRATAMENTO DA MICROSPORIDIOSE HUMANA
- 69 -
ainda, erradicação dos parasitas nas fezes [Weber & Bryan 1994; Sobottka et al. 1995;
Didier et al. 1996a; Gatti et al. 1997; Fournier et al. 2000b]. No entanto, dado que se
observam recaídas nalguns doentes, a manutenção da terapia, pode ser necessária nestes
doentes. Por vezes, após tratamento e melhoria da sintomatologia, podem ser
detectados, ainda, esporos na urina. A persistência do parasita, em determinados focos
infecciosos, pode justificar as recaídas, nestes doentes imunocomprometidos, apesar da
manutenção do fármaco administrado [Molina et al. 1995].
A terapêutica com talidomida, um inibidor relativamente específico da citoquina
TNF-, em doentes com sida, infectados por E. bieneusi, levou à diminuição dos
sintomas, embora não se tenham verificado alterações significativas nos níveis elevados
de TNF- nas fezes [Sharpstone et al. 1995; Sharpstone et al. 1997].
O TNP-470, um composto sintético, análogo da fumagilina, usado em ensaios
clínicos do cancro da mama, é muito menos tóxico que esta última e, de igual modo,
eficaz contra várias espécies de microsporidia (E. intestinalis, E. hellem, E. cuniculi e V.
corneae), em estudos quer in vitro quer in vivo. No futuro, este composto poderá
constituir-se como promissor agente antimicrosporidiano [Coyle et al. 1998; Curry &
Smith 1998; Didier et al. 2006].
As infecções devidas a Enterocytozoon são muito difíceis de tratar, não existindo
actualmente um tratamento consensual. O facto de não se conseguir cultivar E. bieneusi
em culturas de células, dificulta ainda mais os ensaios farmacológicos in vitro nesta
espécie. Alguns estudos iniciais, referiam o albendazol como tendo sido eficaz em
seropositivos para VIH infectados por E. bieneusi, observando-se uma diminuição dos
movimentos peristálticos e aumento de peso destes doentes. Ainda, verificou-se, um
decréscimo da carga parasitária ao nível do intestino, e danos consideráveis nos diversos
estádios de desenvolvimento do parasita que conduziam a inibição parcial da sua
reprodução [Kotler & Orenstein 1999]. Todavia, em nenhum dos estudos ocorreu
erradicação do parasita no intestino.
Outros fármacos têm sido utilizados no tratamento da microsporidiose, com
resultados variáveis [Brasil et al. 1996; Bacchi et al. 2004; Didier et al. 2005; Zhang et
al. 2005; Didier & Weiss 2006], necessitando de ser confirmados os seus efeitos em
ensaios controlados, entre os quais se encontram o metronidazol, a furazolidona, a
sinefungina, atovaquona, azitromicina e as sulfamidas.
6.TRATAMENTO DA MICROSPORIDIOSE HUMANA
- 70 -
Por outro lado, refira-se, que uma dieta rica em triglicéridos de cadeia média, em
detrimento de uma que contenha triglicéridos de cadeia longa, parece contribuir para
uma melhoria da clínica dos doentes infectados por VIH, com diarreia e malabsorção
associada à microsporidiose [Didier 1998].
Visto que ainda não se encontra disponível, um tratamento eficaz para as infecções
por E. bieneusi, enquanto que as provocadas por Encephalitozoon spp., respondem, na
maioria dos casos, ao albendazol, torna-se necessária uma diferenciação exacta dos
géneros de microsporidia envolvidos na infecção dos doentes com microsporidiose.
6.2. TRATAMENTO DA INFECÇÃO OCULAR
Os primeiros casos de queratoconjuntivite por microsporídios em doentes com
sida, não encontraram qualquer resposta terapêutica. A tentativa para tratar a queratite
com uma lubrificação intensa, ou antibioterapia tópica revelou-se ineficaz (Friedberg,
1990)
A aplicação tópica da fumagilina permitiu a redução dos sinais clínicos, em
doentes com sida com queratoconjuntivite microsporidial, devida a espécies do género
Encephalitozoon [Diesenhouse et al. 1993; Rosberger et al. 1993; Didier et al. 1996a;
Friedberg & Ritterband 1999]. Este fármaco, quando administrado por via sistémica (20
mg, três tomas diárias) é bastante eficaz contra E. bieneusi. No entanto, para além de
apresentar toxicidade, causa neutropenia e trombocitopenia nos doentes, após duas a
três semanas de tratamento [Molina et al. 1997]. O isetionato de propamidina e o
itraconazol foram também descritos como eficazes no alívio sintomático da
queratoconjuntivite por microsporídios do género Encephalitozoon [Yee et al. 1991;
Metcalfe et al. 1992], embora após cessação da terapia ocorresse recorrência da
infecção.
7.CONTROLO E PREVENÇÃO DA MICROSPORIDIOSE
- 71 -
7. CONTROLO E PREVENÇÃO DA MICROSPORIDIOSE
Medidas que permitam prevenir a microsporidiose humana, são difíceis de
estabelecer, visto que, não estão definidas as potenciais fontes de infecção. Também,
não existem vacinas disponíveis, nem se conhecem quaisquer ensaios clínicos a
decorrer, neste âmbito.
Perante tais dificuldades, a adopção de medidas gerais de prevenção constitui o
primeiro passo no sentido de evitar o contacto do Homem com estes parasitas. Como as
consequências da infecção podem ser particularmente graves em imunodeficientes, esta
população deverá ter cuidados especiais para prevenir uma eventual infecção.
Entre algumas das medidas recomendadas [Bryan & Schwartz 1999], com o
objectivo de prevenir a microsporidiose no homem, destacam-se as seguintes:
i) Adoptar boas práticas de higiene – lavar as mãos depois de ir à casa de banho,
depois de mudar fraldas a crianças, antes de preparar alimentos e antes de comer. As
pessoas com diarreia devem, ainda, proteger os outros de uma possível infecção,
inibindo-se de utilizar piscinas e locais públicos com água de recreio.
ii) Evitar o contacto com água que possa estar contaminada – não engolir água
de recreio, não beber água de poços, de rios, de lagos e de fontes não tratadas e não
beber água ou gelo em países onde a qualidade da água de abastecimento seja duvidosa.
Em caso de dúvida quanto à sua qualidade, a água deverá ser fervida antes de
consumida.
iii) Evitar ingerir alimentos contaminados – lavar bem ou tirar a casca à fruta e
aos legumes e evitar comer alimentos crus, em países onde o tratamento da água é
deficiente.
iv) Evitar o contacto com potenciais animais infectados.
v) Evitar práticas sexuais que envolvam o contacto fecal-oral.
Nas instituições de saúde, infantários e centros de dia, para além da adopção de
rigorosos hábitos de higiene, o modo mais eficaz de prevenir a transmissão da infecção
consiste na criação de áreas restritas para os doentes infectados, evitando o seu contacto
com outras pessoas susceptíveis. A diminuição da contaminação ambiental constitui,
7.CONTROLO E PREVENÇÃO DA MICROSPORIDIOSE
- 72 -
igualmente, uma importante medida de prevenção, podendo ser conseguida através da
redução da transmissão da infecção entre animais.
Nas explorações pecuárias é essencial um bom maneio higio-sanitário das
instalações, reduzir a densidade de animais num mesmo espaço, isolar os animais
doentes, impedir o acesso dos animais a zonas próximas de cursos de água e tratar o
estrume dos animais.
Vários estudos têm sido efectuados no sentido de encontrar estratégias de
redução da viabilidade e potencial infecciosidade nos microsporídios presentes no
ambiente. Entre os compostos que suscitaram resultados mais promissores, encontram-
se desinfectantes, tais como, amónio, etanol 70%, formaldeído (0,3% ou 1%), derivados
fenólicos, peróxido de hidrgénio (1%), cloramina, hidróxido de sódio, surfactantes
anfotéricos, cuja aplicação durante 30 minutos a 22 ºC, destruíram esporos de E.
cuniculi [Shadduck & Polley 1978; Waller 1979; Santillana-Hayat et al. 2002].
Determinados processos de coagulação, sedimentação, e filtração [Gerba et al. 2003]
parecem reduzir a sobrevivência e infecciosidade dos microsporídios. Também o
tratamento com ozono, exposição a radiação ultra-violeta ou radiação-γ e clorinação a
pH 7, revelaram-se processos eficazes na redução da viabilidade e infecciosidade de
espécies pertencentes ao género Encephalitozoon [Khalifa et al. 2001; Li et al. 2002;
John et al. 2003; Johnson et al. 2003; Marshall et al. 2003].
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 73 -
8. EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
8.1. DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA E PREVALÊNCIA NO HOMEM
Apesar da infecção por microsporídios, já ter sido reportada em todos os
continentes, não existem estimativas fiáveis de prevalência, no sentido estrito do termo,
em parte pela escassez de dados assentes numa amostragem exacta e precisa,
obedecendo a rigorosos critérios de selecção aleatória das amostras. Outro dos factores
condicionantes da determinação da prevalência da microsporidiose humana, baseia-se
no facto da pesquisa de microsporidios no diagnóstico de rotina, ainda não se encontrar
implementado. Na generalidade, a maior parte dos registos de prevalência dos
microsporídios, referem-se a grupos específicos da população, tais como os doentes
com sida que apresentam diarreia crónica. Muitas vezes, são o resultado de estudos não
controlados, sem um desenho aleatório, onde se incluem determinados coortes
prospectivos, amostragens retrospectivas ou revisão de casos, e estudos limitados
utilizando uma amostragem de conveniência.
Outro dos problemas, na caracterização epidemiológica da microsporidiose,
reside na falta de coerência, em termos de abordagem de diagnóstico. Um estudo
realizado no Zimbabwe, ilustra esta situação, quando apresenta taxas de prevalência de
infecção por E. bieneusi de 18%, utilizando o método do tricrómio modificado, e de
51%, utilizando a técnica de PCR [Gumbo et al. 1999b]. Estes factores, conjuntamente
com as diversas espécies de microsporidia, e as múltiplas manifestações clínicas das
infecções em humanos, tornam difícil a compreensão das verdadeiras dimensões das
microsporidioses.
Apesar das limitações, os diversos estudos, reportados em todos os continentes,
revelam resultados consistentes em alguns grupos populacionais. A maior parte do que
se conhece, sobre a infecção em humanos incide na experiência obtida, em doentes
infectados por VIH. Em geral, a microsporidiose em humanos, é descrita mundialmente,
com prevalências que variam desde os zero aos 50%, dependendo quer da região
geográfica, da metodologia do diagnóstico, ou das características demográficas da
população [Bryan & Schwartz 1999]. Antes da utilização da terapia anti-retrovírica, as
taxas de prevalência, mais elevadas registavam-se entre os infectados por VIH com
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 74 -
diarreia e contagem de linfócitos TCD4+ inferior a 100 células/mm3 de sangue
[Lewthwaite et al. 2005; Morpeth & Thielman 2006].
Apesar dos casos de infecção humana serem maioritariamente descritos em
países desenvolvidos, como a América do Norte, Europa Ocidental e Austrália, o
reconhecimento da microsporidiose aumenta em todo o mundo. Com excepção da
Antárctica, foram identificados casos de infecção humana em todos os continentes.
Encontram-se documentados estudos em diversas regiões africanas [Aoun et al. 1997a];
[Bretagne et al. 1993; Kelly et al. 1994; Drobniewski et al. 1995; van et al. 1995;
Hautvast et al. 1997; Maiga et al. 1997; Aoun et al. 1997b], Sudeste asiático [Morakote
et al. 1995] e América do Sul [Brasil et al. 1996; Brasil et al. 1998; Brasil et al. 2000].
Em determinadas regiões do globo, tais como a América do Sul, a África e a
Ásia, nas quais a implementação da HAART, é ainda limitada, a microsporidiose
continua a ser diagnosticada em doentes com sida, e associada a factores de risco,
incluindo baixas condições higio-sanitárias e/ou exposição a animais [Mak 2004;
Wiwanitkit 2006; Morpeth & Thielman 2006; Sarfati et al. 2006; Chacin-Bonilla et al.
2006; Didier & Weiss 2006].
Os registos de casos de microsporidiose continuam a aumentar em seronegativos
para VIH, tais como viajantes, crianças, idosos e transplantados de órgãos [Barsoum
2004; Tumwine et al. 2005; Wichro et al. 2005; Mungthin et al. 2005; Leelayoova et al.
2005; Barsoum 2006].
8.1.1 Distribuição geográfica e prevalência no Homem da espécie Enterocytozoon
bieneusi.
Diversos casos de doentes infectados por VIH, com diarreia associada a E.
bieneusi têm sido descritos, em todos os continentes. A prevalência da infecção desta
espécie, chega a atingir os 50%, entre este grupo da população, como se pode observar
nos Quadros VI e VII. Na maior parte dos estudos, verificam-se prevalências superiores
nos doentes que manifestam diarreia crónica [Eeftinck Schattenkerk et al. 1991; Field et
al. 1993; Wuhib et al. 1994; Sobottka et al. 1998; Weber et al. 2000].
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 75 -
Quadro VI. Diversos estudos de prevalência de E. bieneusi em seropositivos para VIH,
em África, América, Austrália e Ásia. Adaptado de [Mathis et al. 2005].
ÁREA GEOGRÁFICA ESPÉCIMES; MÉTODO
DE DIAGNÓSTICO
NO. PACIENTES; DADOS DA
POPULAÇÃO PREVALÊNCIA (%) REFERÊNCIA (S)
África
Camarões (Yaundé) Fezes; M.O. 66; diarreia crónica 9 [Same-Ekobo et al. 1997]
Níger (Niame) Fezes; M.O. 60; 41 com diarreia 7 [Bretagne et al. 1993] Zimbabwe (Harare) Fezes; M.O. 129; hospitalizados com diarreia 13 [van et al. 1995] Zimbabwe Fezes em formol; PCR 74; 45 com diarreia 46 [Carville et al. 1997]
Zâmbia (Lusaka) Fezes; MO. 69; diarreia crónica 23 [Drobniewski et al. 1995]
Mali (Bamako) Fezes; M.O., parcialmente confirmados por MET
88; 80% com diarreia crónica 32 [Maiga et al. 1997]
Tanzânia Fezes; M.O., MET 86; diarreia crónica 3 [Cegielsky et al. 1999] Zimbabwe (Harare) Fezes; M.O., PCR 88; Diarreia > 1 semana 18 (MO), 51 (PCR) [Gumbo et al. 1999]
Mali (Bamako) Fezes; M.O.,.IFA,.PCR 61; diarreia 13,1 [Alfa et al. 2002]
América
EUA (Washington, D.C.) Biópsias do intestino;EM, MET 67; diarreia crónica 30 [Orenstein et al. 1990]
EUA (Texas) Biópias do duodeno; MET
55 ; diarreia crónica 51; sem diarreia crónica
33 25 [Rabeneck et al. 1993]
EUA (Atlanta, Ga.) Fezes; M.O. 65 ; diarreia 65 ; sem diarreia
11 2 [Grohmann et al. 1993]
EUA (Nova Iorque) Biópsias do intestino; PCR, confirmação por MET
34; doentes com sida 194; diarreia
44 39
[Kotler & Orenstein 1994; Kotler et al. 1994]
EUA (Nova Iorque) Biópsias do duodeno; MET
68; diarreia 43; sem diarreia
37 2,3 [Coyle et al. 1996]
EUA (California) Fezes; M.O. 8 439; diarreia (1993-1996) 8,8; 9,7; 6.6; 2,9 [Conteas et al. 1998a]
Brasil (Fortaleza) Fezes; M.O. 79; diarreia 82; sem diarreia
6 1 [Raynaud et al. 1998]
Brasil (Rio de Janeiro) Fezes; M.O. 13; diarreia crónica 46 [Brasil et al. 1996]
Brasil (Rio de Janeiro) Fezes, biópsia do duodeno e íleo 40; diarreia crónica [Brasil et al. 2000]
Peru (Lima) Fezes; M.O. 2672; diarreia 27,5 [Sulaiman et al. 2003a] Austrália/Ásia
Austrália (Nova Gales do Sul)
Biopsias do duodeno; MO confirmada por EM
109; diarreia crónica 71; sem diarreia
29 1,4 [Field et al. 1993]
Austrália (Victoria) Fezes; M.O, MET 139; diarreia 3,5 [Ryan et al. 1993]
Tailândia Fezes; M.O.,MET 66; diarreia crónica 33,3 [Wanachiwanawin et
al. 1998] Tailândia (Bancoque) Fezes; M.O.,MET 288; diarreia 11 [Waywa et al. 2001]
Tailândia Fezes; M.O.,MET 95; crianças com diarreia 25,3 [Wanachiwanawin et
al. 2002] Índia Fezes; M.O. 120; diarreia 2,5 [Mohandas et al. 2002]
MO: microscopia óptica; MET: microscopia electrónica de transmissão; IFA: imunofluorescência indirecta.
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 76 -
Quadro VII. Diversos estudos de prevalência de E. bieneusi em seropositivos para
VIH, na Europa. Adaptado de [Mathis et al. 2005]
ÁREA GEOGRÁFICA ESPÉCIMES; MÉTODO
DE DIAGNÓSTICO
NO. PACIENTES; DADOS DA
POPULAÇÃO PREVALÊNCIA (%) ANO; REFERÊNCIA (S)
Europa
Holanda Biópsias do duodeno; MO, parcialmente confirmada por MET
55; diarreia 38; sem diarreia
27 3
[Eeftinck Schattenkerk
et al. 1991]
Holanda Fezes; M.O. 143; diarreia 7,7 [van et al. 1993]
França Biópsias do duodeno; MO 66; diarreia crónica 2 [Cotte et al. 1993]
França (Paris) Fezes, biopsias do intestino; M.O. 18; diarreia crónica 50 [Molina et al. 1993]
França (Nice) Fezes; M.O. 46; diarreia crónica 24 [Bernard et al. 1995]
Itália (Apulia) Fezes; M.O. 56; diarreia 2 [Marangi et al. 1995]
Itália Biópsias do intestino;EM, MET 72; diarreia crónica 4,2 [Voglino et al. 1996]
Alemanha (Colónia) Biópsias do intestino; PCR, hibridação… 46; diarreia 22 [Franzen et al. 1996b]
Alemanha (Hamburgo) Fezes; M.O. 50; doentes hospitalizados com diarreia 47; sem diarreia
32 4
[Sobottka et al. 1998]
Inglaterra (Londres) Biópsias do intestino; M.O. 59; diarreia 14 [Peacock et al. 1991]
Inglaterra (Noroeste) Fezes, biópsias do intestino; M.O, confirmada por MET
63; diarreia 14 [Kyaw et al. 1997]
Espanha (Madrid) Fezes; M.O, confirmada por PCR 48; crianças com diarreia crónica 2 [del et al. 1997b]
Suécia (Estocolmo) Biópsias do duodeno; M.O. 72; queixas gastrintestinais 3 [Svedhem et al. 1998]
Suíça
Fezes; M.O, parcialmente confirmada por MET e PCR
164; diarreia crónica (1992-94) 156; diarreia crónica (1994-96) 949; sem diarreia
10,7 5,3 0,4
[Weber et al. 1999a]
Portugal Fezes; M.O, PCR 215; diarreia 42,8 [Ferreira et al. 2001]
MO: microscopia óptica; MET: microscopia elctrónica de transmissão; IFA: imunofluorescência indirecta.
As prevalências que estão registadas nos Quadros VI e VII, não permitem,
todavia, uma análise comparativa entre elas, uma vez que se verificam diferenças
consideráveis, no que diz respeito à selecção do grupo de doentes, características da
população (idade, sexo, dados sócio-demográficos, grau de imunodeficiência,
parâmetros clínicos), assim como do tipo de espécimes (tecidos de biópsia, amostras
fecais) analisados. Acrescente-se, ainda, que deverá ser tido em consideração, para esta
análise, o avanço e o aperfeiçoamento, a que têm sido sujeitas as metodologias de
diagnóstico, nos últimos 15 anos, e que certamente deram origem a estudos mais
sensíveis e específicos.
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 77 -
Alguns estudos apontam um decréscimo da prevalência de E. bieneusi, em
países desenvolvidos [Conteas et al. 1998a; Weber et al. 1999a]. Parece estar a
verificar-se, uma remissão da microsporidiose intestinal, associada à infecção por VIH,
como resultado da utilização da terapêutica anti-retrovírica combinada [Goguel et al.
1997; Carr et al. 1998; Conteas et al. 1998b; Miao et al. 2000; Nannini & Okhuysen
2002]. Na Suíça, o registo da diminuição em 50% dos casos de infecção por E. bieneusi,
foi sugerido estar ligado ao uso da HAART [Weber et al. 1999a].
Apesar da maioria das infecções por E. bieneusi ocorrerem em adultos
infectados por VIH, encontram-se descritos diversos casos, em pessoas que embora
seronegativas para VIH, apresentam diferentes graus de imunossupressão: existência de
outras doenças subjacentes, doentes submetidos a terapêutica imunossupressora (por
exemplo, nos doentes transplantados) [Weber & Bryan 1994; Guerard et al. 1999;
Goetz et al. 2001; Rabodonirina et al. 2003; Lanternier et al. 2009].
Também os registos de infecção em imunocompetentes associados a um quadro
de diarreia auto-limitada, no contexto da diarreia do viajante na Europa [Sandfort et al.
1994; Sobottka et al. 1995; Wanke et al. 1996a; Albrecht & Sobottka 1997;
Svenungsson et al. 1998; Gainzarain et al. 1998; Lopez-Velez et al. 1999; Muller et al.
2001] e em casos isolados em África [Cegielski et al. 1999; Gumbo et al. 2000], são
cada vez mais comuns. Na Alemanha, a espécie E. bieneusi, foi detectada em sete
amostras fecais de um total de 148 viajantes analisados [Muller et al. 2001]. Uma
percentagem de infecção de 17% (8/47) foi determinada em idosos com diarreia, em
Espanha [Lores et al. 2002b]. Os resultados deste estudo, sugerem que a diminuição da
capacidade do sistema imunitário associada ao envelhecimento, pode predispor os
idosos para contrair microsporidiose.
Ao longo da última década, têm vindo a acumular-se evidências, que indicam
que a espécie E. bieneusi pode persistir como infecção assintomática em pessoas
imunocompetentes. Em África, um estudo envolvendo crianças seronegativas para VIH,
permitiu detectar E. bieneusi em amostras fecais, sugerindo o estádio de portador
assintomático, entre imunocompetentes, em regiões tropicais [Bretagne et al. 1993].
Abreu-Acosta e colaboradores identificaram E. bieneusi em 11,5%, 2,5% e 16,2% de
amostras fecais, urina e secreções pulmonares (expectoração), respectivamente nun
estudo conduzido em imunocompetentes em Tenerife (Espanha) [Abreu-Acosta et al.
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 78 -
2005].Outros casos de infecções assintomáticas em crianças, foram descritos,
novamente em África [Cegielski et al. 1999] e, também, num orfanato na Ásia
[Mungthin et al. 2001]. Neste ultimo, para além das crianças saudáveis, E. bieneusi foi
identificada entre 1,9% dos adultos a trabalhar na referida instituição. Em todos estes
estudos, as técnicas de diagnóstico utilizadas foram a microscopia óptica, combinada
com MET, para confirmação dos casos positivos. Todavia, é do conhecimento que esta
metodologia, pode não ser suficientemente sensível, em todas as circunstâncias, para a
detecção de infecções subclínicas. Por isso, deve-se, sempre que possível, aplicar
métodos de diagnóstico mais sensíveis (ex. PCR) que permitam aferir se E. bieneusi é
um parasita comum da flora intestinal humana, apenas desencadeando doença grave, em
hospedeiros imunodeficientes, ou esclarecer a importância da transmissão zoonótica
destes microrganismos.
8.1.2. Distribuição geográfica e prevalência no homem da espécie Encephalitozoon
intestinalis
A espécie E. intestinalis é considerada como a segunda causa de microsporidiose
intestinal no homem. Estão descritos casos de infecção, em doentes seropositivos para
VIH, por diversos continentes: América [Coyle et al. 1996; Moura et al. 1999b; Sheikh
et al. 2000], Europa [Weber et al. 1994; van et al. 1994b; Molina et al. 1995; Franzen et
al. 1996a; Liguory et al. 1997; Sobottka et al. 1998; Ferreira et al. 2001; Svedhem et al.
2002; Lippert et al. 2003], Austrália [Dore et al. 1995; Leder et al. 1998] e África
[Kelly et al. 1994; Alfa et al. 2002]. Porém, a maioria dos estudos correspondem a
registos de um único caso, e poucos são os que envolvem a análise de grupos maiores.
As prevalências variam: 7,3% em doentes com sida e diarreia nos EUA [Coyle et al.
1996], 2% em infectados por VIH na Alemanha [Sobottka et al. 1998], 3% de doentes
com diarreia crónica na Zâmbia [Kelly et al. 1994], 0,9% de doentes com diarreia
crónica na Suiça [Weber et al. 1999a]. Em Portugal, um estudo identificou por PCR, E.
intestinalis em 49 doentes (e E. bieneusi em 20 doentes) com queixas gastrintestinais,
dos 69 positivos detectados por microscopia óptica [Ferreira et al. 2001].
E. intestinalis, foi detectada em dois viajantes seronegativos para VIH, com
diarreia [Raynaud et al. 1998]. Na Malásia, Lono e colaboradores [Lono et al. 2008],
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 79 -
identificaram E. intestinalis, em dois doentes com cancro, sujeitos a quimioterapia. Esta
espécie foi também descrita num doente submetido a transplante renal [Latib et al.
2001].
8.1.3. Distribuição geográfica e prevalência no Homem da espécie Encephalitozoon
cuniculi.
A aplicação de métodos imunológicos e/ou moleculares permitiu a identificação,
de E. cuniculi em doentes com imunossupressão (infectados por VIH, transplantados de
órgãos, e com linfocitopenias de origem idiopática), demonstrando a sua infecciosidade
neste grupo populacional. No Quadro VIII, encontram-se registados os casos de
infecção por esta espécie, confirmados por técnicas moleculares.
Diversos estudos seroepidemiológicos, recorrendo a técnicas de ELISA e IFI,
registaram prevalências com valores até 42%, em pessoas com história de doença
tropical, ou com uma visita a região tropical e em pessoas com doença renal, psiquátrica
ou neurológica [Singh et al. 1982; Bergquist et al. 1984a; Hollister & Canning 1987;
Hollister et al. 1991]. Contudo, não se sabe ao certo, se a detecção de anticorpos anti-E.
cuniculi corresponde a uma verdadeira infecção, ou apenas, reflete a exposição ao
antigénio, sem estabelecimento do parasita, ou resulta de reacções cruzadas, ou ainda,
de reacções devidas à estimulação policlonal de células B, que particularmente, podem
ocorrer em pessoas com doença tropical. Apesar de estes estudos, assim como outros
posteriores se encontrarem condicionados pelas supracitadas limitações, sugerem uma
exposição frequente, do Homem, aos microsporídios, sem significado clínico [Gomez
Morales et al. 1995; Pospisilova et al. 1997; van et al. 1997; Kucerova-Pospisilova &
Ditrich 1998; Cislakova & Halanova 2003; Halanova et al. 2003].
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 80 -
Quadro VIII. Casos exporádicos de infecção por E. cuniculi, confirmados por técnicas de biologia molecular. Adaptado de [Mathis et al. 2005].
ESTADO IMUNOLÓGICO MANIFESTAÇÃO CLÍNICA LOCAL DE INFECÇÃO E/OU ESPÉCIME ESTIRPE ANO REF.
Doentes VIH+
Reino Unido Dor abdominal, anorexia, vómitos, febre, tosse, falência renal Rim, urina III 1994 [Aarons et al. 1994; Hollister et al. 1995; Hollister et al. 1996a]
EUA Febre, tosse, insónia, congestão nasal, olho seco, visão enevoada Urina, expectoração III 1995 [De Groote et al. 1995; Didier et
al. 1996c; Croppo et al. 1997] Alemanha Queratoconjuntivite, sinusite, rinite Urina, expectoração, exsudado nasal, biópsia duodenal ND 1995 [Franzen et al. 1995b] Suiça Cefaleia, convulsões,náusea, vómitos LCR, fezes, expectoração urina I 1997 [Weber et al. 1997]
EUA Febre, náuseas, dor abdominal, diarreia Glândula adrenal, rins, cérebro, coração, traquie, bexiga, baço, gânglios linfáticos III 1997 [Mertens et al. 1997]
Suiça Nenhuma Urina I 1997 [Mathis et al. 1997]
México Pneumonia, otite média Urina, secreções brônquicas, fezes III 1997 [Deplazes et al. 1996a; Mathis et al. 1997]
Suiça Nenhuma Urina I 1997 [Deplazes et al. 1996a; Mathis
et al. 1997] Suiça Conjuntivite, sinusite, tremores Urina I 1997 [Mathis et al. 1997] Suiça Insuficiência renal, leucocitúria, eritrocitúria Urina I 1997 [Mathis et al. 1997] Suiça Nenhuma Urina, secreções brônquicas I 1997 [Mathis et al. 1997] Itália Sinusite crónica, queratoconjuntivite bilateral, Epitélio nasal I 1998 [Rossi et al. 1998] França Diminuição da visão LCR, urina, expectoração, fezes, biopsia duodenal ND 2000 [Fournier et al. 2000b] Chile Tosse, febre LBA, biópsia transbronquial ND (III*) 2001 [Weitzel et al. 2001] Espanha Febre, astenia, dor abdominal, diarreia Fezes, urina, expectoração III 2002 [del et al. 2001a]
Itália Febre, mialgia, astenia Rim, fígado, gânglios linfáticos, baço, medula renal, cérebro, ovário III 2002 [Tosoni et al. 2002]
Doentes VIH-,
imunocomprometidos
(transplantados)
Canada Febre, queratoconjuntivite Urina, fezes, expectoração, raspagem conjunctiva III 2003 [Mohindra et al. 2002]
México Tosse, febre, diarreia, dor toráxica, astenia Fígado, rim III 2003 [Gamboa-Dominguez et al. 2003]
EUA Distress respiratório Biópsia pulmão III 2004 [Teachey et al. 2004] Doentes VIH-,
imunocomprometidos*
Suiça Tumor da íris Biópsia do tumor I 2005 [Kodjikian et al. 2005]158
VIH+ : seropositivo para VIH; VIH- : seronegativo para VIH; *doentes com linfocitopenia de origem idiopática; LCR: líquido cefalo-raquidiano ; LBA: lavado brocoalveolar ; ND: não determinado
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 81 -
8.1.4. Distribuição geográfica e prevalência no Homem da espécie Encephalitozoon
hellem
A espécie E. hellem foi descrita em cerca de 50 doentes infectados por VIH,
num número reduzido de regiões. A maioria dos casos foi registada nos EUA [[Didier et
al. 1991a; Schwartz et al. 1992; Schwartz et al. 1993a; Schwartz et al. 1993b;
Visvesvara et al. 1994; Didier et al. 1996a; Conners et al. 2004], contudo esta espécie
foi também identificada em Itália [Scaglia et al. 1997], Suiça [Weber et al. 1993;
Deplazes et al. 1996a; Franzen et al. 1996a], Alemanha [Franzen et al. 1998], Reino
Unido [Hollister et al. 1993] e na Tanzânia [Deplazes et al. 1998]. Não é claro se a
distribuição restrita deste microsporídio, se deve a factores epidemiológicos ou a
limitações técnicas na sua detecção.
E. hellem provoca infecções oculares e dissiminadas em doentes seropositivos
para VIH, mas também foram descritas infecções assintomáticas do aparelho
respiratório [Scaglia et al. 1998a]. Scaglia e colaboradores, isolaram E. hellem, num
lavado broncoalveolar, de um imunocompetente com infecção por Mycobacterium
tuberculosis [Scaglia et al. 1998b]. Este microsporídio foi, também, identificado em
amostras fecais, de dois viajantes com diarreia regressados de Singapura [Muller et al.
2001], assim como de um doente com cancro na Índia [Lono et al. 2008].
8.1.5. Grupos específicos da População humana, em risco de microsporidiose
Apesar das patologias severas associadas à microsporidiose ter a sua maior
expressão na população com imunodeficiência causada por VIH [Weber & Bryan 1994;
Bryan 1995], este grupo de patologias pode surgir, de igual modo, em doentes com
outras imunodeficiências. Na literatura estão descritos casos de infecção por
microsporídios em pessoas com neoplasias sob quimioterapia [Lono et al. 2008] e em
doentes submetidos a terapêutica imunossupressora, após transplante de órgãos
[Lanternier et al. 2009]. Os portadores de imunodeficiências primárias constituem uma
subpopulação, igualmente, em risco de contrair infecção por microsporidia [Kotler &
Orenstein 1999].
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 82 -
No Quadro IX encontram-se sumarizados os casos de microsporidiose registados
até à data, em doentes submetidos a transplantes. Por exemplo infecções por E. bieneusi
foram descritas num transplantado de fígado seronegativo para VIH, assim como num
transplantado de coração e pulmões [Sax et al. 1995; Rabodonirina et al. 1996]. Cotte e
colaboradores, registaram infecções por E. bieneusi, em transplantados de medula,
coração-pulmões, fígado e rim, durante um potencial surto de microsporidiose, ocorrido
em França em 1995 [Cotte et al. 1999]. Também foi identificado E. cuniculi num
doente submetido a transplante de rim e pâncreas [goodman et al, unpublished data].
Um caso de infecção pulmonar, provavelmente por Encephalitozoon sp., foi confirmado
durante a autópsia a um doente com leucemia mielóide crónica que havia sido sujeito a
um transplante de medula [Kelkar et al. 1997]. Contudo, permanece por esclarecer, se
os doentes submetidos a transplante, contraíem a infecção através do órgão doado, ou já
durante a fase em que lhes é administrada a terapia imunossupressora [Barsoum 2004].
No entanto, como referido anteriormente, os doentes submetidos a transplante de
órgãos, não constituem a única fatia da população de imunossuprimidos seronegativos
para VIH, em risco de contrair microsporidiose. Silverstein e colaboradores (1997),
descreveram um doente que desenvolveu queratoconjuntivite bilateral por
microsporídios, após medicação sistémica com prednisolona (20mg/dia) para a asma
[Silverstein et al. 1997]. Embora o esporo responsável não tivesse sido identificado,
parasitologicamente era compatível com microsporidio do género Encephalitozoon e o
doente respondeu positivamente ao tratamento com albendazol. Outro caso num
seronegativo para VIH, foi descrito por Wanke e colaboradores, em que o doente
apresentava um quadro diarreico associado a E. bieneusi, com uma diminuição
acentuada, sem explicação, da contagem do número de linfócitos TCD4+, com historial
de meningite criptocócica [Wanke et al. 1996b]. Curiosamente, este doente respondeu
ao tratamento com albendazol. Assim, é de esperar, que casos de microsporidiose
associados a outros tipos de imunossupressões (seronegativos para VIH) continuem a
aumentar.
Apesar da grande maioria dos casos de microsporidiose serem descritos em
doentes com um maior ou menor grau de imunossupressão, também o número de
infecções em imunocompetentes, tem vindo a aumentar. As crianças são
particularmente vulneráveis às infecções, em geral, e certamente também, à infecção por
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 83 -
microsporídios, devido não só à imaturidade do seu sistema imunológico, como aos
comportamentos que lhes são característicos, de que são exemplo, a incontinência fecal,
o uso de fraldas, os hábitos de higiene deficientes e o levar as mãos à boca, que
favorecem a transmissão fecal-oral de parasitas.
A população idosa também se encontra mais susceptível à infecção, devido à
senescência imunológica e às doenças crónicas, entre outros factores, que acompanham
o envelhecimento e diminuem as suas defesas imunológicas [Naumova et al., 2003].
Na literatura, encontram-se documentados casos de infecções por E. bieneusi
em turistas após o regresso de férias no estrangeiro, assim como em adultos e crianças
residentes em países tropicais ou subtropicais [Sandfort et al. 1994; Sobottka et al.
1995; Wanke et al. 1996a; Albrecht & Sobottka 1997; Hautvast et al. 1997; Maiga et al.
1997; Svenungsson et al. 1998; Lopez-Velez et al. 1999; Cegielski et al. 1999; Muller
et al. 2001; Wichro et al. 2005; Abreu-Acosta et al. 2005]. Também Raynaud e
colaboradores (1998), identificaram E. intestinalis em viajantes imunocompetentes com
diarreia crónica [Raynaud et al. 1998]. Será então interessante expecular se a
microsporidiose não será, também, uma possível causa de diarreia do viajante, à qual
não está a ser dada a devida importância.
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 84 -
Quadro IX. Casos reportados de infecção por microsporidia em doentes transplantados. Adaptado de [Lanternier et al. 1999].
Orgão Sexo Idade (anos)
Intervalo após tratamento
Último tratamento IS Sintomas Localização Espécies CD4
(/mm3) Tratamento Alterações no tratamento IS
Evolução Clínica
Ref.
Rim M 46 7A MMF;
ciclosporina; prednisona
Diarréia, perda de
peso Intestinal E. bieneusi 549 Albendazol Parou MMF; redução
da azitioprina Curado [Guerard et al. 1999]5
Rim M 24 2A MMF;
ciclosporina; prednisona
Diarréia perda de
peso Intestinal E. bieneusi 278 Não Parou MMF; redução
da azitioprina Curado
Rim F 38 1,5A Tacrolimus;
MMF; prednisona
Diarréia perda de
peso Intestinal E. bieneusi 350 Albendazol e
metranidazol
Parou MMF; redução do tacrolimus e
prednisona Curado [Metge et al.
2000]
Rim 3A Tacrolimus; prednisona E. bieneusi Fumagilina Curado [Molina et al.
2002]
Coração-pulmão M 48 3A
Globulina anti-linfócitária;
ciclosporina; azatioprina;
metilprednisona
Diarréia crónica, perda de
peso
Intestinal E. bieneusi 328 Albendazol Falha [Rabodonirina et al. 1996]
Coração M 48 4A ciclosporina; azatioprina; prednisona
Diarreia, dispepsia, Intestinal E. bieneusi 406 Metranidazol
Melhoria transitória;persist
ência de E. bie
[Gumbo et al. 1999a]
Fígado F 36 5A Tacrolimus Diarréia, perda de
peso E. bieneusi 1100 Albendazol Redução do tacrolimus
Melhoria transitória;persist
ência de E. bie
[Goetz et al. 2001]
Fígado 2A Tacrolimus E. bieneusi Fumagilina Curado [Molina et al. 2002]
Rim M 49 2M Tacrolimus;
MMF; prednisona
Intestinal Fumagilina [Arzouk et al. 2006]
Rim F 71 Tacrolimus; prednisona
Diarréia, perda de
peso Intestinal Fumagilina [Arzouk et al.
2006]
Rim M 64 3A Tacrolimus; MMF
Diarréia, perda de
peso Intestinal E. bieneusi 654 Fumagilina Curado [Lanternier et
al. 2009]
Fígado M 45 3A Ciclosporina; everolimus
Diarréia, perda de
peso Intestinal E. bieneusi 189 Fumagilina Parou everolimus Curado [Lanternier et
al. 2009]
MMF: Micofenolato de mofetil
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 85 -
Quadro IX. Casos reportados de infecção por microsporidia em doentes transplantados (continuação). Adaptado de [Lanternier et al. 1999]
Orgão Sexo Idade (anos)
Intervalo após tratamento
Último tratamento IS Sintomas Localização Espécies CD4
(/mm3) Tratamento Alterações no tratamento IS
Evolução
clínica
Ref.
Rim M 39 1A ciclosporina; azatioprina; prednisona
Febre, impairment
renal Renal E.
intestinalis Albendazol Curado
[Latib et
al. 2001]
Rim M 42 5M ciclosporina; rapamicina; prednisona
Febre, tosse, dor toráxica, citopenia, hematúria, queratite,
colite
Disseminada: rim, fígado,
intestino, ocular E. cuniculi
Albendazol; transfusão de
plasma, fumagilina
tópica
Parou rapamicina e ciclosporina
Recaída após 1 ano
[Gamboa-Dominguez et
al. 2003]
Rim F 45 2M Febre,
falência renal
Disseminada: rim,
intestino, conjuntiva,
cérebro
E. cuniculi Albendazol; fumagilina
tópica Parou IS
Morte associada a
envolvimento neurológico
[Mohindra et al. 2002]
Rim F 45 2M
Febre, falência renal,
queratite
Disseminada: rim, intestino,
conjuntiva, neurológica
E. cuniculi Parou MMF; redução
do tacrolimus e prednisona
[Mahmood et al. 2003]
Medula F 27 19D ciclosporina;metotraxato
Febre, pneumonia Pulmonar ? Diagnóstico
pós-mortem [Kelkar et al.
1997]
Medula F 21 3M Globulina
antilinfócitária; ciclosporina
Pneumonia intersticial Pulmonar E. cuniculi Diagnóstico
pós-mortem
[Teachey et
al. 2004; Orenstein et
al. 2005]
Pâncreas/ rim M 43 2M
Tacrolimus; MMF;
prednisona
Febre, diarreia, falência
renal
Disseminada: rim, fígado, intestino,
coração, cérebro
Encephalito
zoon sp. Diagnóstico pós-mortem
[Carlson et al. 2004]
Fígado F 48 1,5M Tacrolimus; prednisona
Diarreia, perda de
peso Intestino ? Metranidazol Curado [Sax et al.
1995]
MMF: Micofenolato de mofetil
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 86 -
8.2. A MICROSPORIDIOSE NOUTROS ANIMAIS
As microsporidioses já foram reportadas em diversas espécies de mamíferos
domésticos e silváticos e com menor frequência, em aves, anfíbios e répteis.
O interesse, por estes parasitas, aumentou com o número crescente de casos
documentados de microsporidiose em humanos e noutros animais. Uma das razões
apontadas para o gradual interesse em estudos envolvendo diversos grupos de animais,
prende-se, com o facto de os animais poderem constituir fonte de infecção para o
Homem.
8.2.1. Mamíferos
A maioria das infecções por microsporídios, descrita em mamíferos, foi
identificada, particularmente em gado doméstico, animais de companhia e, nalguns
grupos de animais silváticos.
As quatro principais espécies de microsporidia responsáveis pelo maior número
de casos de infecção no homem, foram descritas em mamíferos. E. cuniculi, é o agente
mais frequentemente detectado em mamíferos [Snowden & Shadduck 1999]. Foi a
primeira espécie a ser descrita no cérebro e rim de coelhos, que apresentavam tremores,
letargia, assim como parastesias localizadas ou generalizadas [Wright & Craighead
1922]. A encephalitozoonose por E. cuniculi é frequente em coelhos, animais de
companhia e de laboratório. Habitualmente, ocorrem infecções crónicas que podem
persistir durante anos, sem sintomatologia. Todavia, podem desenvolver doença
neurológica grave [Mathis et al. 2005]. No passado, foram descritas elevadas
prevalências de encephalitozoonose em colónias de coelhos de laboratório [Canning &
Lom 1986; Wasson & Peper 2000]. Em coelhos, mantidos como animais de companhia,
a doença é endémica. Na Suíça e no Reino Unido foram detectados anticorpos contra E.
cuniculi em 7,5% (n=292) e em 23% (n=26) de coelhos saudáveis, respectivamente e
em 85% (n=72) e 71% (n=65) de coelhos com sintomas neurológicos ou com exposição
com animais sintomáticos, respectivamente [Deplazes et al. 1996b; Harcourt-Brown &
Holloway 2003; Mathis et al. 2005].
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 87 -
A transmissão horizontal, através da ingestão de esporos, é considerada a via de
infecção mais frequente nos coelhos, embora a transmissão transplancentária também se
encontre documentada [Canning & Lom 1986; Baneux & Pognan 2003] . Após infecção
experimental, por via oral, de coelhos, observou-se a excrecção regular de esporos na
urina, em particular entre o trigésimo oitavo e o sexagésimo terceiro dias pós-infecção
[Cox et al. 1979; Mathis et al. 2005]. Verificou-se que, nove de 11 coelhos com
sintomatologia, analisados, excretavam esporos na urina, sugerindo um papel
importante destes animais, no contexto epidemiológico da infecção [Cox & Walden
1972; Mathis et al. 2005].
Os coelhos silváticos (Oryctolagus cuniculus) foram apontados como
hospedeiros naturais de E. cuniculi , com base em evidências serológicas [Wilson 1979;
Mathis et al. 2005]. Outros dois estudos, registaram seroprevalências de 3,9% em
coelhos silváticos em França [Chalupsky et al. 1990; Mathis et al. 2005] e 25% numa
população silvática de coelhos na Austrália [Thomas et al. 1997].
Até alguns anos atrás, a espécie E. cuniculi era descrita, como sendo parasita
comum, de roedores em laboratório, tais como ratinhos, ratos, hamsters e porquinhos-
da-índia [Canning & Lom 1986; Wasson & Peper 2000]. Actualmente, com a
implementação de regras de higiene adequadas ao manuseamento e manutenção destes
animais, a infecção por este microsporídio deixou de ser considerada um problema
relevante. Por outro lado, e mais recentemente, o modelo roedor parece revelar-se uma
metodologia promissora quando aplicada aos estudos imunológicos, no contexto da
microsporidiose [Didier 2000].
Estão descritos, alguns estudos da infecção por E. cuniculi em ratos silváticos,
no Japão, no Reino Unido [Canning & Lom 1986] e Suíça (E. cuniculi estirpe II)
[Muller-Doblies et al. 2002]. Acresce, os anticorpos contra este microsporídio,
detectados em 4% de Apodemus sylvaticus e em 9% de Mus musculus na Islândia
[Hersteinsson et al. 1993]. Os autores deste estudo apontaram estes animais como
potenciais reservatórios de E. cuniculi, com relevância na infecção de raposas do ártico
e de visons. A identificação de E. cuniculi estirpe II, em todas as raposas, oriundas de
diferentes quintas, na Noruega e Filândia [Mathis et al. 1996; Akerstedt et al. 2002],
veio reforçar esta hipótese.
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 88 -
Em canídeos, a encefalitozoonose pode ser sintomática ou assintomática. O
quadro clínico parece desenvolver-se apenas, nos casos em que há transmissão
transplacentária, ou em cães adultos imunodeprimidos [Hollister et al. 1989]. As
manifestações nervosas e de insuficiência renal, são as mais comuns [Botha et al. 1979;
Stewart et al. 1979; Mathis et al. 2005]. Casos de encefalitozoonose, por E. cuniculi
estirpe III, em cães domésticos, foram reportados na Tânzania, África do Sul e EUA
[Shadduck et al. 1978; Botha et al. 1979; Canning & Lom 1986; Snowden et al. 1999].
Estão descritas infecções por E. cuniculi, em gatos domésticos [Canning & Lom 1986;
Lobo et al. 2003]. Em crias de raposas, em cativeiro, observam-se infecções
disseminadas semelhantes às dos canídeos [Nordstoga 1972; Mathis et al. 2005]. A
infecção por E. cuniculi estirpe II, constitui na actualidade, um importante problema,
para a indústria de criação de raposas azuis, em países do Noroeste Europeu [Mathis et
al. 1996; Akerstedt 2002].
Estão descritos surtos de encefalitozoonose em carníveros, de Jardim Zoológico,
[Canning & Lom 1986], mas são poucos são os registos em carnívoros silváticos
[Wilson 1979; Van Heerden et al. 1989; Hersteinsson et al. 1993; Mathis et al. 2005].
Todavia, nestes últimos estudos a microscopia óptica foi a técnica usada no diagnóstico
dos microsporídios, não permitindo assim, uma conclusão definitiva sobre a espécie e a
estirpe envolvida na infecção.
Nos cães e nas raposas, a encefalitozoonose por E. cuniculi é perpetuada na
população por transmissão horizontal e vertical [Botha et al. 1979; Mohn et al. 1982;
Mathis et al. 2005].
Mais de uma década, depois da identificação de E. bieneusi no Homem, esta
espécie foi detectada em animais, mais propriamente em suínos [Deplazes et al. 1996b].
Através da PCR, determinou-se uma prevalência de 35%, em suínos, na Suíça
[Breitenmoser et al. 1999]. A elevada percentagen de excreção de esporos em suínos
sem quadro clínico associado, levou os autores do estudo a sugerir que E. bieneusi será
um parasita comum nos suínos assintomáticos. A ausência de lesões intestinais, em
porcos gnotobióticos [Kondova et al. 1998], infectados experimentalmente por esta
espécie de microsporídios, veio acrescentar evidências a esta ideia. Estudos
subsequentes, confirmaram a ocorrência de E. bieneusi com uma elevada prevalência,
em suínos (32%) [Buckholt et al. 2002] e em gado bovino (9,5% - 11,5%) [Rinder et al.
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 89 -
2000; Santin et al. 2004; Sulaiman et al. 2004]. Este parasita, tem vindo a ser descrito
numa vasta gama de hospedeiros animais, tais como, gatos [Mathis et al. 1999a;
Dengjel et al. 2001; Lobo et al. 2003; Lobo et al. 2006c], cães [Lores et al. 2002a; Lobo
et al. 2003; Lobo et al. 2006c], cabras [Lores et al. 2002a], num lama [Dengjel et al.
2001] e em diversos grupos de animais silváticos [Dengjel et al. 2001; Sulaiman et al.
2003b].
Relativamente, à espécie E. intestinalis verificou-se que ratinhos do tipo-
selvagem, infectados experimetalmente, excretavam esporos de forma intermitente, e
em baixas concentrações [Achbarou et al. 1996]. Uma situação semelhante, ao que se
havia observado na infecção por E. bieneusi, em suínos [Breitenmoser et al. 1999].
Bornay-Llinares e colaboradores [Bornay-Llinares et al. 1998] identificaram E,
intestinalis numa cabra, num suíno, numa vaca, num burro e um cão. Num estudo mais
recente, uma baixa prevalência de E. intestinalis foi detectada em gorilas silváticos
(assim como em pessoas que partilhavam o mesmo habitat), no Uganda [Graczyk et al.
2002]. Apesar de ser sugerido o carácter zoonótico deste microsporídio, ainda se
encontra por esclarecer, se esta espécie é um parasita comum nalguns grupos de
animais, ou se apenas E, intestinalis isolado dos animais está relacionado com a
infecção no Homem
São poucos os casos de infecção natural por microporídios, conhecidos em
primatas não humanos. Até à data, foram identificadas as espécies E. cuniculi e E.
bieneusi [Mansfield et al. 1998], em diferentes espécies de macacos. Infecções
experimentais por E. bieneusi, E. cuniculi e E. intestinalis, em macacos, também se
encontram reportadas, na literatura [Mathis et al. 2005].
8.2.2. Aves
As quatro espécies mais frequentes, responsáveis por microsporidiose no
Homem, E. bieneusi, E. intestinalis, E. hellem e E. cuniculi, foram descritas em diversas
espécies de aves. O primeiro registo de microsporidiose em aves data de 1975, por que
Kemp e Kluge [Kemp & Kluge 1975], em inseparáveis da espécie Agapornis personata,
(Illinois, EUA). Seguiu-se a identificação de microsporidia em papagaios (Amazona
ochtocephala), em pelo menos três espécies de inseparáveis (Agapornis roseicolis,
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 90 -
Agapornis personata, Agapornis fischeri), juvenis de periquitos (Melopsittacus
undulatus), papagaios-do-mar (Fratercula corniculata), capturados e mantidos em
cativeiro, e num bando de papagaios tricolores (Erithrura tricolor) [Poonacha et al.
1985; Tocidlowski et al. 1997; Gelis & Raidal 2006].
Os papagaios do género Agapornis são geralmente descritos como os
hospedeiros mais frequentes de microsporidia [Branstetter & Knipe 1982; Powell et al.
1989; Norton & Prior 1994]. O primeiro caso de microsporidiose em que a espécie
identificada foi E. hellem, registou-se em juvenis de periquitos (Melopsittacus
undulatus), em 1977 [Black et al. 1997]. Outros casos de encephalitozoonose, causados
por E. hellem, foram descritos em tecidos (estudo retrospectivo) de papagaios eclectus
(Eclectus roratus), num loris estriado (Chalcopsitta scintillata) capturado, em juvenis
de avestruzes (Struthio camelus), num inseparável-de-faces -rosadas (Agapornis
roseicolis), em colibris (Calypte anna, Archilochus alexandri e em Selasporus sasin),
em juvenis de Diamante estrela (Erithrura gouldiae), em inseparáveis (Agapornis
fischeri), e em cacatuas (Cacatua alba) [Gray et al. 1998; Pulparampil et al. 1998; Suter
et al. 1998; Snowden & Logan 1999; Snowden et al. 2000; Snowden et al. 2001;
Carlisle et al. 2002; Barton et al. 2003; Phalen et al. 2006].
Com excepção dos papagaios a espécie E. hellem, foi identificada, quer em aves
silváticas, quer em aves capturadas e mantidas em cativeiro, ou ainda em aves de
criação, incluindo patos-reais (Anas platyrhynchos), cisnes-mudos (Cygnus olor) e
cisnes de pescoço-preto (Cygnus melanocoryphus), gansos bravos (Anser anser),
gralhas (Corvus corone), pombos-de-nicobar (Caloenas nicobarica), cisnes-negros
(Cygnus atratus), cisnes-coscoroba (Coscoroba coscoroba), Grous Coroado (Balearica
pavonina), e pombos (Columba livia) [Haro et al. 2005; Slodkowicz-Kowalska et al.
2006; Bart et al. 2008].
E. bieneusi foi identificada pele primeira vez, em galinhas de aviário (Gallus
gallus) [Reetz et al. 2002]. Posteriormente foi identificada em diversas ordens de aves,
nomeadamente em Columbiformes, Passeriformes e Psittaciformes [Haro et al. 2005;
Haro et al. 2006; Slodkowicz-Kowalska et al. 2006; Lobo et al. 2006b; Kasickova et al.
2007; Graczyk et al. 2007b; Kasickova et al. 2009], em pombos [Haro et al. 2005; Haro
et al. 2006; Lobo et al. 2006b; Graczyk et al. 2007b; Bart et al. 2008], e recentemente
em falcões de uma colecção privada, nos Emirados Árabes Unidos [Muller et al. 2008].
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 91 -
Até à data, E. cuniculi foi detectada em três espécies de aves: em galinhas [Reetz
1993], numa caturra (Nymphicus hollandicus) [Kasickova et al. 2007] e em pombos
[Haro et al. 2005; Slodkowicz-Kowalska et al. 2006; Bart et al. 2008; Kasickova et al.
2009].
Relativamente a outros microsporídios, a espécie E. intestinalis apenas foi
identificada num grupo restrito de aves: pombos e gansos domésticos (Anser anser
domestica) [Bart et al. 2008] e mais recentemente em diversas aves das ordens
Columbiformes, Passeriformes e Psittaciformes [Haro et al. 2005; Slodkowicz-
Kowalska et al. 2006].
Até à data, não foi possível estabelecer a transmissão directa entre as aves e o
Homem. No entanto, alguns doentes portadores de infecção ocular, possuíram ou
estiveram em contacto com aves de companhia [Friedberg et al. 1990; Yee et al. 1991]
e durante um estudo com doentes infectados por VIH no Peru [Bern et al. 2005], foi
identificada uma associação entre o contacto com patos e galinhas e o risco de infecção
pelo genótipo Peru 6 de E. bieneusi. Também os dados obtidos em pombos de parques
urbanos sugerem a ausência de barreiras de transmissão entre as aves e humanos. Com a
agravente que, a maior parte dos visitantes destes parques são crianças e idosos, que
fazem parte do grupo populacional susceptível de contrair infecções em geral e, como
tal, de microsporidiose a partir de pombos [Haro et al. 2005; Lobo et al. 2006b; Bart et
al. 2008].
8.3. FONTES DE INFECÇÃO E MODOS DE TRANSMISSÃO
8.3.1. Transmissão inter-humana (vertical e horizontal)
A transmissão vertical da microsporidiose foi registada em roedores,
lagomorfos, carnívoros e, ainda, em primatas não humanos [Didier et al. 1998;
Snowden & Shadduck 1999; Baneux & Pognan 2003]. Contudo, até à data não foi
observada em humanos [Didier et al. 2004].
A probabilidade de ocorrer transmissão horizontal () dos microsporídios, é
elevada, dada a presença do parasita ao nível do intestino, aparelho genito-urinário e
respiratório do hospedeiro. Dado que as vias de eliminação dos agentes patogénicos,
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 92 -
habitualmente, estão intimamente associadas ao seu modo de transmissão, é de supor
que ocorra transmissão de microsporídios pelas vias, fecal-oral, oral-oral, sexual e aérea
[Bryan & Schwartz 1999; Weber et al. 2000; Didier et al. 2004].
A hipótese de transmissão directa, é reforçada por estudos, onde as relações
homossexuais e a coabitação com indivíduos com diarreia são considerados factores de
risco, associados à microsporidiose intestinal [Hutin et al. 1998; Gumbo et al. 1999b].
Noutro estudo, em que é também sugerido o mesmo modo de transmissão, com base
nos resultados obtidos, verificou-se que, nove das 13 crianças infectadas pelo
microsporídio (E. bieneusi), que eram seronegativas para VIH, coabitavam na mesma
casa. Pelo contrário, não foi detectada infecção nas crianças seropositivas para VIH, que
compartilhavam um alojamento à parte [Mungthin et al. 2001].
No que respeita, às infecções oculares, a hipótese de estas serem transmitidas
por auto-inoculação, através das mãos contaminadas por espécimes biológicos,
infectados com microsporídios, em pessoas com deficientes hábitos de higiene, é
formulada por alguns autores [Bryan & Schwartz 1999].
À semelhança dos exemplos de transmissão horizontal de microsporídios, que se
observam entre animais [Bywater & Kelley 1978; Liu et al. 1988], ganha força a
hipótese de que essas mesmas espécies de parasitas, possam transmitir-se da mesma
forma, entre o Homem. É possível infectar experimentalmente animais, com as espécies
E. bieneusi, Encephalitozoon spp., ou A. algerae, quer por via oral, inoculação intra-
rectal, ou administração dos organismos através da mucosa ocular, respectivamente
[Fuentealba et al. 1992; Tzipori et al. 1997; Koudela et al. 2001]. Dados estes, que mais
uma vez, sustentam a ocorrência de transmissão horizontal, entre animais e que à
semelhança, se poderá extrapolar, para os humanos.
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 93 -
8.3.2. Transmissão Zoonótica
Os microsporídios são parasitas ubíquos na natureza e com distribuição mundial,
sendo então inevitável, a exposição humana a estes organismos.
Os microsporídios são eliminados para o exterior, pela urina, fezes, secreções
pulmonares ou após a morte do hospedeiro. Humanos ou animais infectados por
microsporídios, são então potenciais fontes de infecção desta parasitose. Os animais
estão envolvidos na epidemiologia de muitas doenças definidoras de sida e de outras
doenças oportunistas em infectados por VIH [Glaser et al. 1994].
Uma questão fundamental, suscitada pela identificação de novas espécies de
microsporídios, infectantes para o Homem, é qual a sua origem natural. É o Homem o
reservatório natural do parasita, ou apenas um hospedeiro acidental, no qual a infecção
apenas ocorre quando há deterioração do sistema imunológico do indivíduo? No que
respeita à microsporidiose, ainda não é claro, o papel desempenhado pelos animais na
epidemiologia destas doenças. Contudo, são cada vez mais os indícios acumulados que
apontam, para a potencial transmissão zoonótica dos microsporídios.
Até à data, já foram identificados reservatórios animais dos microsporídios mais
frequentes, que infectam o Homem, como se pode observar nos Quadros X e XI.
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 94 -
Quadro X. Alguns reservatórios animais das espécies de microsporidia mais frequentes
infectantes para o Homem. Adaptado de [Didier 2005].
ESPÉCIES REF.
MAIS FREQUENTES
Enterocytozoon bieneusi Outros animais hospedeiros Gado [Fayer et al. 2003c; Sulaiman et al. 2004] Gatos [Rinder et al. 2000] Galinhas [Reetz et al. 2002] Cães, cabras [Lores et al. 2002a] Primatas não-humanos [Mansfield et al. 1997; Sestak et al. 2003] Suínos e ruminantes [Rinder et al. 2000; Buckholt et al. 2002] Suínos, gado, lama, gatos [Dengjel et al. 2001] Coelhos e carnívoros [del et al. 1999] Guaxinin, rato-almiscarado, castor, raposas e lontras [Sulaiman et al. 2003b]
Encephalitozoon intestinalis Outros animais hospedeiros Burros, cães, suínos, vacas, cabras [Bornay-Llinares et al. 1998] Gorilas [Graczyk et al. 2002] Carraças [Ribeiro & Guimaraes 1998] Encephalitozoon hellem Outros animais hospedeiros Periquitos [Black et al. 1997] Papagaios [Pulparampil et al. 1998] Catatuas [Suter et al. 1998] Avestruz [Snowden & Logan 1999] Inseparável [Snowden et al. 2000] Diamante estrela [Carlisle et al. 2002] Galinhas [Fayer et al. 2003b] Colibris [Snowden et al. 2001] Carraças [Ribeiro & Guimaraes 1998] Encephalitozoon cuniculi Outros animais hospedeiros
Carníveros, coelhos e roedores [Canning & Lom 1986; Snowden et al. 1999; Deplazes et al. 2000]
Raposas [Akerstedt et al. 2002] Cabras [Cislakova et al. 2001] Cavalos [van, I et al. 1991; Patterson-Kane et al. 2003] Primatas não humanos [Zeman & Baskin 1985; Guscetti et al. 2003] Ratazanas silváticas [Muller-Doblies et al. 2002] Carraças [Ribeiro & Guimaraes 1998]
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 95 -
Quadro XI. Alguns reservatórios animais das espécies de microsporidia menos
frequentes infectantes para o Homem. Adaptado de [Didier 2005].
ESPÉCIES REF.
MENOS FREQUENTES
Anncaliia algerae Outros animais hospedeiros Mosquitos [Vavra & Undeen 1970] Anncaliia connori Outros animais hospedeiros Desconhecidos Anncaliia vesicularum Outros animais hospedeiros Desconhecidos Microsporidium africanum Outros animais hospedeiros Desconhecidos Microsporidium ceylonensis Outros animais hospedeiros Desconhecidos Nosema ocularum Outros animais hospedeiros Desconhecidos Pleistophora ronneafiel Outros animais hospedeiros Peixes [Shaw & Kent 1999] Trachipleistophora antropophtera Outros animais hospedeiros Desconhecidos Trachipleistophora hominis Outros animais hospedeiros Desconhecidos Vittaforma corneae Outros animais hospedeiros Desconhecidos
Não obstante estarem reconhecidas várias espécies, como potenciais fontes de
infecção para o Homem, falta ainda demonstrar, se os microsporídios se transmitem dos
animais para o Homem. A única evidência de transmissão zoonótica, reporta-se a uma
criança, que desenvolveu anticorpos anti-E. cuniculi, após contacto directo com uma
ninhada de cães infectada por E. cuniculi. O autor deste estudo, sugere que a criança
terá contraído a infecção, após contacto com a urina dos cães [McInnes & Stewart
1991].
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 96 -
A alusão à exposição aos animais, é referida em vários estudos de
microsporidiose humana. Por exemplo, um estudo realizado no Zimbabwe, identifica o
contacto com as fezes de vaca, como um factor de risco, associado à infecção por E.
bieneusi [Gumbo et al. 1999b]. Também o contacto com animais, é referido na história
pregressa de diversos casos clínicos de microsporidiose humana, englobando
seropositivos e seronegativos para VIH. Recentemente, foi descrito o caso de uma
criança de dois anos de idade infectada por um genótipo de E. bieneusi pouco comum
(Peru16) identificado em porcos da Indía que coabitavam no mesmo agregado familiar.
A singularidade genética do parasita, a sua elevada ocorrência em outros animais da
mesma espécie na comunidade, bem como ausência de infecção noutras crianças da
comunidade sugerem a possibilidade de transmissão zoonótica deste microsporídio
[Cama et al. 2007].
8.3.3. Transmissão hídrica
Na população humana, estima-se que as doenças infecciosas sejam responsáveis
por aproximadamente 26% de mortalidade e 31% de morbilidade. A água desempenha
um papel fundamental na transmissão de um número significativo destas doenças. Os
surtos epidémicos devido a contaminação dos sistemas de abastecimento de água
comunitários ocorrem globalmente e têm o potencial de causar doença num vasto
número de consumidores. Estes surtos têm consequências económicas que vão para
além dos custos inerentes aos cuidados médicos das pessoas afectadas, ao provocar
perda de confiança na qualidade da água potável e na indústria da água em geral
[Cotruvo et al. 2004].
Nos últimos anos, verificou-se que grande parte destas doenças é provocada por
agentes patogénicos emergentes ou reemergentes. Uma doença infecciosa é considerada
emergente se ocorrer pela primeira vez numa população humana ou animal ou se já tiver
ocorrido previamente mas estiver a aumentar a incidência ou a expandir para outras
áreas geográficas. A emergência de doenças infecciosas é um processo complexo,
envolvendo um conjunto de factores biológicos, sociais e ecológicos. Entre os factores
identificados [Lederberg et al. 1992] contam-se: a vulnerabilidade humana, as
alterações climáticas, as alterações dos ecossistemas, a densidade demográfica, o
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 97 -
comportamento humano, a tecnologia e a indústria, o comércio e o turismo, bem como o
avanço dos conhecimentos científicos. Pelo menos 325 surtos de doenças provocadas
por protozoários foram associados à contaminação da água de consumo [Cotruvo et al.
2004][Cotruvo, 2004 TH]. Em países industrializados, os organismos pertencentes aos
géneros Cryptosporidium e Giardia são descritos como os protozoários mais comuns
transmitidos pela água.
A capacidade de transmissão de agentes infecciosos ao Homem pelo ambiente é
influenciada por múltiplos factores. Assim, a carga de microrganismos que passa para o
ambiente depende da prevalência da infecção na população humana ou animal, da
concentração do agente nas fezes ou urina e da duração do período de eliminação das
formas infectantes pelo hospedeiro. Uma vez no ambiente, vários pontos críticos podem
afectar a capacidade de transmissão do agente ao Homem. A sobrevivência do
organismo no ambiente é decisiva para a sua transmissão. Quanto maior for o tempo de
sobrevivência, maiores serão as oportunidades do agente entrar em contacto com um
hospedeiro susceptível. O tempo de sobrevivência na água depende de diversos factores
físicos (pH, temperatura, exposição solar), bem como das características intrínsecas do
microrganismo, podendo variar de horas a anos. No caso dos microsporídios, as
características destes parasitas, torna-os extremamente aptos a sobreviver no ambiente e
a serem disseminados pela água. As suas formas de transmissão, os esporos, são
imediatamente infecciosas após excretadas para o exterior. Os esporos são resistentes a
condições ambientais desfavoráveis e a processos de tratamento de águas. As suas
reduzidas dimensões e baixa densidade, potenciam a sua disseminação pela água [Didier
et al. 2004].
O elemento principal no processo de transmissão é a dose infecciosa, ou seja, o
grau de exposição necessário para transmitir a infecção. No caso dos microsporidios,
parece ser baixa, a dose considerada infecciosa, para os mamíferos [Franzen & Muller
1999a]. A inoculação com apenas 100 esporos pode vausar doença leteal em ratinhos
atímicos [Schmidt & Shadduck 1983].
Recentemente, diversos estudos epidemiológicos descrevem o contacto com a
água como um factor de risco associado à microsporidiose humana [Hutin et al. 1998;
Didier et al. 2004]. Estas observações conduziram à inclusão dos microsporídios pelo
Instituto de Defesa da Saúde (NIH) dos EUA na categoria B da lista de agentes de
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 98 -
biodefesa e lista de candidatos contaminantes da agência de protecção ambiental dos
EUA [U.S.Environmental Protection Agengy (EPA) 1998; Didier 2005] justificando a
actual preocupação da ocorrência de transmissão hídrica.
Diversas espécies de microsporídios, entre as quais E. bieneusi E. intestinalis, A.
algerae, Nosema spp., Pleistophora spp. e V. corneae foram já descritas em lençóis
subterrâneas, águas superficiais, esgotos, efluentes terciários, canais de escoamento
[Avery & Undeen 1987] e água para rega de culturas agrícolas [Sparfel et al. 1997;
Dowd et al. 1998; Fournier et al. 2002; Dowd et al. 2003; Didier et al. 2004; Coupe et
al. 2006; Donovan et al. 2008], e existe o registo de um presumível surto de origem
hídrica [Cotte et al. 1999]. Parece também haver uma associação entre os microsporidia
e a transmissão por alimentos irrigados com água contaminada. Foram identificados
microsporídios em alfaces, salsa, coentros e morangos, na Costa Rica [Calvo et al.
2004].
A identificação dos parasitas na água superficial e subterrânea permite tirar
conclusões sobre o grau de contaminação ambiental e possíveis fontes de contaminação.
Na água de consumo público, a pesquisa destes agentes é fundamental para avaliar a
eficácia do tratamento utilizado e consequente risco para a Saúde Pública Humana e
Animal.
8.3.4. Transmissão através de alimentos contaminados
Os microsporídios encontram-se entre os parasitas, cuja transmissão através de
alimentos contaminados, suscita alguma preocupação, em resultado de diversos
factores, onde se salienta, a globalização (traduzindo-se num elevado trafego
internacional de mercadorias e pessoas, provenientes de áreas endémicas), e alterações
nos padrões de consumo de alimentos [Slifko et al. 2000; Orlandi et al. 2002].
A microsporidiose humana, causada por espécies menos comuns, como os
microsporídios pertencentes ao género Pleistophora e semelhantes, pode, apenas,
resultar duma exposição acidental, por exemplo através da ingestão de peixe, mal
cozinhado, principalmente se este fenómeno ocorrer num imunodeficiente. Esta
hipótese surge das observações de McDougall e colaboradores [McDougall et al. 1993],
num doente com sida, que apresentava diarreia crónica e excretava esporos de
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 99 -
microsporídios nas fezes. Exames detalhados das amostras fecais, revelaram que estes
esporos localizavam-se em restos de fibras musculares (provavelmente de peixe).
Num estudo, mais recente, a ingestão de carne mal cozida, pelo menos, uma vez
por mês, foi associada a microsporidiose, em doentes infectados por VIH [Hutin et al.
1998]. Outro autor, identificou E. bieneusi em suínos, destinados ao consumo público,
sugerindo a possibilidade de transmissão do parasita através da ingestão desta carne
crua ou mal cozida [Buckholt et al. 2002].
Estudos moleculares e filogenéticos permitiram inferir que determinados
microsporídios com semelhanças genéticas a Pleistophora spp., que habitualmente
parasitam peixes e insectos, haviam sido identificados como causa de infecção no
Homem [Chupp et al. 1993; Vavra et al. 1998]. A espécie T. hominis,
morfologicamente semelhante a Pleistophora, foi identificada como causa de miosite,
num doente com sida [Field et al. 1996].
A detecção de E. intestinalis, em água usada para irrigação de produtos
hortícolas para consumo [Thurston-Enriquez et al. 2002], adiciona evidências
circunstanciais, que suportam a possibilidade de transmissão de microsporídios via
alimentos contaminados.
8.3.5. Transmissão aérea
Este tipo de transmissão, tem sido indicado por vários autores, como o mais
provável em alguns casos de infecção por E. hellem e por E. cuniculi. A ocorrência de
infecções nas vias respiratórias superiores e inferiores, sugere que a transmissão se
possa dar por esta via, através de poeiras contaminadas por microsporídios. Por outro
lado, os primeiros sintomas de muitas infecções por Encephalitozoon spp., surgem
devido a patologia das fossas e seios nasais, apontando para que nestes casos, a porta de
entrada seja a mucosa das vias respiratórias superiores [Bryan & Schwartz 1999];
[Weber et al. 1999b].
Outro indício de transmissão aérea, resultou da primeira autópsia completa
realizada a um doente com sida e microsporidiose disseminada. O doente apresentava
um largo número de microsporídios, da espécie E. hellem, ao longo de todo o tecido
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 100 -
epitelial da árvore traqueobrônquica, sugerindo que a via de transmissão tivesse sido a
aérea [Schwartz et al. 1992].
8.3.6. Transmissão por vectores (insectos)
Um pouco vaga é a possibilidade de transmissão da microsporidiose ao Homem,
através da picada de insectos. Os artrópodes são os hospedeiros mais comuns dos
microsporídios, tendo sido já identificados em carraças, pulgas e mosquitos, embora
nenhum destes parasitas, tenha sido registado nos humanos. Infecções experimentais
com a espécie A. algerae, um microsporídio parasita de mosquitos, foram
desenvolvidas, em ratinhos imunocomprometidos [Trammer et al., 1997]. Os resultados
destes estudos indicaram que o crescimento deste parasita estava limitado por
temperaturas abaixo de 37ºC. Desde então, contudo, A. algerae foi identificada, e
isolada da córnea de um doente imunocompetente, e colocada em crescimento em meio
de cultura a 37ºC [Moura et al. 1999a; Lowman et al. 2000]. Subsequentemente,
Koudela (2001), verificou que após a aplicação de esporos de A. algerae, nos olhos de
ratinhos SCID apesar de não se verificarem sinais clínicos no local de inoculação, eram
observadas infecções no baço e no fígado, 60 dias após a inoculação [Koudela et al.
2001].
A descrição de um caso de miosite por A. algerae, num doente com diabetes e
artrite reumatóide, veio demonstrar que este organismo pode causar patologia severa no
homem [Coyle et al. 2004].
Evidencias adicionais à transmissão de microsporídios por vectores, surgiram
com a capacidade de transmitir T. hominis a mosquitos (Anopheles quadrimaculatus e
Culex quinquefasciatus), que desenvolveram infecção [Weidner et al. 1999]. Dado que,
foram recuperados esporos do proventrículo e ceco do intestino do insecto, os autores
sugerem, que poderão ser transferidos para um hospedeiro mamífero, durante a refeição
sanguínea. A picada de abelhas, vespas, e zamgões foram descritos, num estudo
epidemiológico, como factores de risco associados a microsporidiose, em doentes
infectados por VIH [Dascomb et al. 2000].
A identificação de microsporídios, numa colónia de mosquitos de Anopheles
stephensi, com 99% e 97% de homologia na sequência da 16S rRNA com as espécies
8.EPIDEMIOLOGIA DA MICROSPORIDIOSE
- 101 -
geneticamente semelhantes Vavraia culicis (parasita de mosquitos) e T. hominis
(espécie apenas identificada no Homem), respectivamente, são pequenas evidências que
se vêm juntar à hipótese de que os casos exporádicos de infecção humana por espécies
pouco frequentes, tais como os reportados para T. hominis possam ser resultado de
transmissão por vectores [Lobo et al. 2006a].
Outros protozoários parasitas, tais como Leishmania spp., Plasmodium spp. ou
Trypanosoma spp., são transmitidos pela picada de insectos poiquilotérmicos aos
humanos homeotérmicos, não sendo, portanto, de descartar a hipótese dos
microsporídios também o serem [Curry, A., 1999].
9.EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR
- 102 -
9. EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR
A epidemiologia molecular é, actualmente, considerada como um ramo da
epidemiologia que, através de técnicas de biologia molecular, proporciona um melhor
conhecimento das doenças, não só ao nível da caracterização dos agentes que estão na
sua origem, mas, também, da sua ecologia e dinâmica da transmissão [Thompson et al.
1998].
Antes da utilização destas novas técnicas, a caracterização dos microsporídios
era resultante de observações microscópicas da morfologia e ultraestrutura dos esporos
e/ou formas de desenvolvimento endógeno, da constatação do hospedeiro em que eram
encontrados e de estudos de infecção experimental. Porém, os conhecimentos
disponíveis sobre estes parasitas sofreram um progresso significativo, após a aplicação
das técnicas de biologia molecular, sobretudo as baseadas na reacção de PCR, ao estudo
da sua epidemiologia. Na verdade, o advento da biologia molecular, introduziu novas
técnicas, bastante discriminatórias, que permitem a identificação exacta da espécie e
genótipo dos microsporídios.
Esta metodologia tem-se revelado bastante promissora, esperando-se que possa
trazer algum esclarecimento a questões importantes como: i) a variabilidade entre os
microsporídios; ii) a estrutura populacional e a taxonomia deste grupo; iii) a definição
dos parasitas capazes de causar infecção humana; iv) a identificação das fontes de
contaminação e de infecção para o Homem; v) a caracterização da dinâmica da
transmissão da infecção em diferentes comunidades e situações; vi) a importância, para
a saúde pública, da presença de esporos em água de consumo e de recreio; vii) a
patogenicidade e virulência apresentadas pelas diferentes espécies/genótipos que
provocam doença humana.
9.1. IDENTIFICAÇÃO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DE ENTEROCYTOZOON BIENEUSI.
Actualmente os genótipos de E. bieneusi baseiam-se na heterogeneidade da
região ITS (243pb) do gene do rRNA [Mathis et al. 2005]. Nesta espécie a região ITS
apresenta um elevado grau de polimorfismo. A caracterização genotipica dos isolados
de E. bieneusi permite clarificar a dinâmica das infecções por este microsporídio, nas
9.EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR
- 103 -
diferentes populações humanas e animais. Apenas uma proporção dos genótipos
descritos foram exclusivamente isolados do Homem; diversos genótipos foram
identificados, quer em humanos, quer noutros animais, sugerindo o potencial zoonótico
deste parasita, assim como um possível grau de especificidade de hospedeiro de alguns
genótipos [Sulaiman et al. 2003b; Sulaiman et al. 2004]. Foram, também, reconhecidas
diferenças na prevalência de diversos genótipos entre doentes seropositivos e
seronegativos para VIH [Liguory et al. 2001]. Com base na análise dos 243pb da região
ITS, encontram-se descritos 81 genótipos: 26 dos quais identificados exclusivamente
em humanos, oito em humanos e outros hospedeiros, 27 exclusivamente identificados
em gado bovino e suíno, seis exclusivemente detectados em cães e gatos, e 14 em
diversos grupos de hospedeiros [Santin & Fayer 2009]. Nos Quadros XII, XIII, XIV,
XVe XVI, encontram-se os genótipos descritos, incluindo informação do hospedeiro,
nome e referência.
9.EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR
- 104 -
Quadro XII. Genótipos de E. bieneusi caracterizados pela sequência da região ITS
rRNA, decritos no Homem. Adaptado de [Santin & Fayer 2009]
aDados não publicados; bGenotipo Q com 245 pb; cGenotipos Peru11 e Peru12 difererem de um nucleotido na posição 3 na SSU
rRNA (G vs. A).
Quadro XIII. Genótipos de Enterocytozoon bieneusi caracterizados pela região ITS e
descritos em animais de companhia (cães e gatos). Adaptado de [Santin & Fayer 2009].
anão foi atribuido nome ao genótipo correspondente a este número de acesso, nem no GenBank, nem em nenhuma publicação.
Hospedeiro Nome Original do Genótipo
(código de acesso ao GenBank)
Sinónimo (código de
acesso ao GenBank) Ref.
Homem A (AF101197, AY168419a, AY357185–AY357204, DQ683750 e DQ683753)
Peru1 (AY371276) [Rinder et al. 1997; Katzwinkel-Wladarsch et al. 1997; Sulaiman
et al. 2003a; Leelayoova et al. 2005; Breton et al. 2007]
B (AF101198 e DQ683754) Type I (AF242475) [Rinder et al. 1997; Liguory et al. 1998; Breton et al. 2007]
C (AF101199) Type II (AF242476) [Rinder et al. 1997; Liguory et al. 1998]
Q (AF267147) b [Rinder et al. 2000] R (AY945808) [Leelayoova et al. 2006] S (AY945809) [Leelayoova et al. 2006] T (AY945810) [Leelayoova et al. 2006] U (AY945811) [Leelayoova et al. 2006] V (AY945812) [Leelayoova et al. 2006] W (AY945813) [Leelayoova et al. 2006] Type III (AF242477) [Liguory et al. 1998] Type V (AF242479) [Liguory et al. 1998] Peru3 (AY371278) [Sulaiman et al. 2003a] Peru7 (AY371282) [Sulaiman et al. 2003a] Peru8 (AY371283) [Sulaiman et al. 2003a] Peru11 (AY371286) Peru12 (EF014428a)c [Sulaiman et al. 2003a] Peru13 (EF014429)a Peru15 (EF014431)a CAF1 (DQ683746) [Breton et al. 2007] CAF2 (DQ683747) [Breton et al. 2007] CAF3 (DQ683748) [Breton et al. 2007] CAF4 (DQ683749 e DQ683757) [Breton et al. 2007] HAN1 (EF458627) [Espern et al. 2007] NIA1 (EF458628) [Espern et al. 2007] UG2145 (AF502396) [Tumwine et al. 2002] Genotype 17 (EU140500)a
Hospedeiro Nome Original do Genótipo (código de acesso
ao GenBank)
Sinónimo (código de
acesso ao GenBank) Ref.
Gatos L (AF267142) [Dengjel et al. 2001]
PtEb IV (DQ885580) [Lobo et al. 2006c]
PtEb VIII (DQ885584) [Lobo et al. 2006a]
D-like (DQ836345) [Santin et al. 2006]
AF118144a [Mathis et al. 1999a]
Cães PtEb IX (DQ885585, AF059610, e EU650273) [Mathis et al. 1999a; Lobo et al. 2006c;
Santin et al. 2008]
9.EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR
- 105 -
Quadro XIV. Genótipos de Enterocytozoon bieneusi caracterizados pela sequência da
região ITS rRNA, descritos no Homem e outros animais. Adaptado de [Santin & Fayer
2009].
Hospedeiro Nome Original do Genótipo
(código de acesso ao GenBank)
Sinónimo (código de acesso ao
GenBank) Ref.
Homem, castor, raposa, rato-almíscarado, e guaxinin.
WL15 (AY237223)a WL16 (AY237224) Peru14 (EF014430b)
[Sulaiman et al. 2003a; Sulaiman et al. 2003b]
Homem, castor, ruminantes, cães, falcões, raposa, primata não humano, rato-almíscarado, suínos e guaxinin.
D (AF101200, DQ793213, DQ683751, DQ683755, e AF023245c)
PigITS9 (AF348477) WL8 (AY237216) Peru9 (AY371284) PtEb VI (DQ885582) CEbC (EF139197)
[Rinder et al. 1998b; Chalifoux et al. 2000; Buckholt et al. 2002; Sulaiman et al. 2003a; Sulaiman et al. 2003b; Lobo et al. 2006c; Breton et al. 2007; Lee 2007; Muller et al. 2008]
Homem, aves, ruminantes, cães.
Peru6 (AY371281 e DQ154137)
PtEbI (DQ425107) PtEb VII (DQ885583)
[Sulaiman et al. 2003a; Santin et al. 2005; Lobo et al. 2006b; Lobo et al. 2006c]
Homem, castor, raposa, rato-almíscarado, lontra, suínos e guaxinin.
EbpC (AF076042 e U61180c)
E (AF135832)d WL13 (AY237221) WL17 (AY237225) Peru4 (AY371279)
[Breitenmoser et al. 1999; Rinder et al. 2000; Sulaiman et al. 2003a; Sulaiman et al. 2003b]
Homem, e gatos. Peru10 (AY371285 e DQ836342) [Sulaiman et al. 2003a]Santı´n et al. (2006),
Homem e porquinhos-da-índia. Peru16 (EF014427) Cama et al. (2007)
Homem, gatos, cães, e raposa. WL11 (AY237219) Peru5 (AY371280, DQ836344, e
EU650271) [Sulaiman et al. 2003a; Sulaiman et al. 2003b; Santin et al. 2006; Santin et al. 2008]
Homem, gatos, ruminantes, e cães. Type IV (AF242478)
K (AF267141, DQ836343, DQ683752, DQ683756,e EU650272) Peru2 (AY371277) PtEb III (DQ885579) BEB5 (AY331009) BEB5-var (AY331010b)e
[Liguory et al. 1998; Dengjel et al. 2001; Sulaiman et al. 2003a; Sulaiman et al. 2004; Santin et al. 2006; Lobo et al. 2006c; Breton
et al. 2007; Santin et al. 2008]
9.EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR
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Quadro XV. Genótipos de Enterocytozoon bieneusi caracterizados pela sequência da
região ITS rRNA e descritos em diversos grupos de hospedeiros. Adaptado de [Santin &
Fayer 2009].
Hospedeiro Nome Original do Genótipo
(código de acesso ao GenBank)
Sinónimo (código de acesso
ao GenBank) Ref.
Castor WL7 (AY237215) [Sulaiman et al. 2003b] WL9 (AY237217) [Sulaiman et al. 2003b]
Aves PtEb II (DQ425108) [Lobo et al. 2006b]
Cavalo de Tróia PtEb V (DQ885581) [Lobo et al. 2006c] Lama P (AF267146) [Dengjel et al. 2001] Saguim PtEb XII (DQ885588) [Lobo et al. 2006c] Rato-almíscarado WL4 (AY237212) WL5 (AY237213)a [Sulaiman et al. 2003b] WL6 (AY237214) [Sulaiman et al. 2003b] WL10 (AY237218) [Sulaiman et al. 2003b] WL14 (AY237222) [Sulaiman et al. 2003b] Guaxinin WL2 (AY237210) [Sulaiman et al. 2003b] WL3 (AY237211) [Sulaiman et al. 2003b] Castor e lontras WL12 (AY237220) [Sulaiman et al. 2003b]
aGenótipos WL4 and WL5 tdiferem num nuclótido na posição 29 , na subunidade grande do gene rRNA (G vs. T). Quadro XVI. Genótipos de Enterocytozoon bieneusi caracterizados pela sequência da
região ITS rRNA e descritos em gado bovino e suínos. Adaptado de [Santin & Fayer
2009].
Hospedeiro Nome Original do Genótipo
(código de acesso ao GenBank)
Sinónimo (código de acesso ao
GenBank) Ref.
Bovinos I (AF135836) BEB2 (AY331006) CEbE (EF139199) [Rinder et al. 2000; Sulaiman et al. 2004; Lee 2007]
J (AF135837) BEB1 (AY331005) PtEb X (DQ885586) CEbB (EF139196)
[Rinder et al. 2000; Sulaiman et al. 2004; Lobo et al. 2006c; Lee 2007]
M (AF267143) [Dengjel et al. 2001] N (AF267144) [Dengjel et al. 2001] PtEb XI (DQ885587) [Lobo et al. 2006c] BEB3 (AY331007) [Sulaiman et al. 2004] BEB4 (AY331008) [Sulaiman et al. 2004] BEB6 (EU153584) [Fayer et al. 2007] BEB7 (EU153585) [Fayer et al. 2007] CEbA (EF139195) [Lee 2007] CEbD (EF139198) [Lee 2007] CEbF (EF139194) [Lee 2007] 4948 FL-2 2004 (DQ154136) [Santin et al. 2005] Suínos EbpB (AF076041) [Breitenmoser et al. 1999] EbpD (AF076043) [Rinder et al. 2000] G (AF135834) [Rinder et al. 2000] H (AF135835) [Dengjel et al. 2001] O (AF267145) [Buckholt et al. 2002] PigEBITS1 (AF348469) [Buckholt et al. 2002] PigEBITS2 (AF348470) [Buckholt et al. 2002] PigEBITS3 (AF348471) [Buckholt et al. 2002] PigEBITS4 (AF348472) [Buckholt et al. 2002] PigEBITS5 (AF348473) [Buckholt et al. 2002] PigEBITS6 (AF348474) [Buckholt et al. 2002] PigEBITS7 (AF348475) [Buckholt et al. 2002] PigEBITS8 (AF348476) [Buckholt et al. 2002] Bovinos e suínos EbpA (AF076040) F (AF135833) [Breitenmoser et al. 1999; Rinder et al. 2000]
9.EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR
- 107 -
9.2. IDENTIFICAÇÃO DE DIVERSIDADE GENÉTICA DE ENCEPHALITOZOON CUNICULI
Em 1995 [Didier et al. 1995b], a descoberta de três estirpes de E. cuniculi
através de métodos imunológicos e moleculares, não só veio permitir elucidar a situação
epidemiológica das infecções por esta espécie, em diferentes hospedeiros, e em
diferentes áreas geográficas, mas veio concumitantemente, reforçar o carácter zoonótico
de E. cuniculi.
A genotipagem da região ITS, de isolados de E. cuniculi de vários hospedeiros,
permitiu diferenciar três estirpes, que se distinguem pelo número de repetições da
sequência 5’-GTTT-3’, presentes na região ITS do gene rDNA, e que constitui um
marcador genético fiável e largamente aplicado. A estirpe I (“estirpe coelho”) tem três
repetições de GTTT, a estirpe II (“estirpe rato”) duas repetições GTTT e a estirpe III
(“estirpe cão”) tem quatro repetições de GTTT [Didier et al. 1995b]. Como se pode
verificar no Quadro XVII, no Homem estão descritas infecções pelas estirpes I e III,
também identificadas noutros hospedeiros. Este aspecto sugere o potencial zoonótico
destas estirpes.
Quadro XVII. Hospedeiros e distribuição geográfica das estirpes de E. cuniculi.
Adaptado de [Mathis et al. 2005].
E. CUNICULI
A HOSPEDEIRO ÁREA GEOGRÁFICA (Nº DE ISOLADOS) REF.
Estirpe I coelho Suíça (21), EUA (3), Alemanha (1), Austrália (1), Itália (1), Japão (1)
[Didier et al. 1995b][Katiyar et al. 1995; Mathis et al. 1997; Furuya 2002; Mathis et al. 2005]
Homem Suíça (6), Itália (1), EUA (1)
Estirpe II Rato República Checa (1), Reino Unido (1), EUA (1)
[Weber et al. 1997; Rossi et
al. 1998; Dengjel et al. 2001; Xiao et al. 2001c]
Ratazana-de-água Suíça (1) [Didier et al. 1995b; Xiao et
al., 2001c] Raposa ártica Noruega (8), Filândia (1) [Muller-Doblies et al. 2002] Estirpe III Homem EUA (2), México (1), Reino Unido (1) [Mathis et al. 1996; Akerstedt
et al. 2002] Cão EUA (10), África do Sul (1) [Snowden et al. 1999; Didier
et al. 1995b; Hollister et al. 1996a]
Saguim cabeça-de-algodão Suiça-Zoo (1) a determinada pelo número de repetições 5’-GTTT-3’ na sequência ITS
Posteriormente, uma análise multilocus gerou novos marcadores para as três
estirpes [Xiao et al. 2001b], nomeadamente com base nos genes que codificam para a
9.EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR
- 108 -
proteína do tubo polar (PTP) [Delbac et al. 1998] e para a proteína da parede do esporo
1 (SWP1) [Bohne et al. 2000]. Os isolados de E. cuniculi dividem-se entre três a cinco
genótipos com base no número de sequências repetidas nos genes ITS, PTP (quatro
copias de repetições com 78-pb) e SWP (cinco cópias de repetições com 15-pb e cinco
cópias de repetições com 36-pb).
9.3. IDENTIFICAÇÃO DE DIVERSIDADE GENÉTICA DE ENCEPHALITOZOON HELLEM
A caracterização genética das estirpes de E. hellem, com recurso às sequências
do rDNA (ITS; SSU rRNA; regiões espaçadoras intergénicas (IGS) TH e HZ9 (IGS, da
sigla anglo-saxónica intergenic spacer) e do gene que codifica a PTP, revelou existir
diversidade intra-específica [Mathis et al. 1999b; Xiao et al. 2001a; del et al. 2001b;
Xiao et al. 2001b; Haro et al. 2003].
Inicialmente, Mathis e colaboradores, descreveram três genótipos caracterizados
com base na sequência ITS rRNA, cujas diferenças são resultado de pequenas inserções
ou delecções ou ainda de mutações pontuais [Mathis et al. 1999b]. No entanto estes
autores, haviam já verificado não existir uma correspondência total entre estes genótipos
e os perfis antigénicos, sugerindo este facto, que a variabilidade genética real de E.
hellem deveria ser maior.
Encontram-se descritos entre quatro a seis genótipos com base no número de
sequências repetidas nos genes SSU rRNA, ITS e PTP. A região PTP, foi considerada o
marcador genético com maior capacidade discriminatória para E. hellem. Dependendo
de a sequência PTP conter apenas uma repetição tipo-60pb ou a repetição tipo-60pb
mais uma tipo-66pb, são descritas duas famílias alélicas: 1 (1A, 1C ou 1D) e a 2 (2B ou
2C), respectivamente. A classificação de alelos em duas famílias proposta por Xiao e
colaboradores, é útil na genotipagem de E. hellem, dado que a presença ou ausência das
unidades 66pb são fáceis de identificar [Xiao et al. 2001a].
9.4. IDENTIFICAÇÃO DE DIVERSIDADE GENÉTICA DE ENCEPHALITOZOON INTESTINALIS
Até à data, e ao contrário do que se verifica com as outras espécies do género
Encepahlitozoon, em que foram identificados genótipos, com diferenças na sua biologia
e epidemiologia, não foi possível caracterizar, nos estudos efectuados, qualquer
9.EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR
- 109 -
diversidade genética em E. intestinalis, com base nas regiões do rRNA. A análise, de
cinco isolados, em humanos, obtidas por electroforese em gel de poliacrilamida- dodecil
sulfato de sódio, revelou apenas pequenas variações nos seus perfis [del et al. 1998].
Através de electroforese em gel de campo-pulsado, não foram detectadas diferenças nos
cariótipos de isolados de E. intestinalis [Biderre et al. 1999a], enquanto nos isolados de
E. cuniculi e E. hellem observou-se uma variabilidade intraespecífica considerável
[Sobottka et al. 1999; Biderre et al. 1999a; Biderre et al. 1999b; Delarbre et al. 2001].
Também não foi descrita qualquer variação nas regiões ITS de E. intestinalis [Didier et
al. 1996b; Liguory et al. 2000].
Estudos futuros tendo por objectivos a determinação de fontes de infecção dos
microsporídios, a capacidade de previsão da gama de hospedeiros e do potencial
patogénico de determinado isolado, necessitam da identificação e aplicação de novos
marcadores genéticos e da comparação entre os isolados detectados pelos diversos
marcadores e avaliar a correpondência (a existir) entre a informação obtida, por
exemplo, pela análise da região ITS e da obtida com os potenciais novos marcadores.
Na verdade, novos grupos de marcadores genéticos seriam muito úteis na avaliação e
estabelecimento das relações epidemiológicas entre os diversos genótipos, da espécie E.
bieneusi. Não se pode assumir, pelo facto de se encontrar a mesma sequência ITS, em
diferentes estudos, que determinados isolados são idênticos geneticamente. Na verdade,
a interpretação de um mapa filogenético, com base na análise de um único locus, deve
ser sempre efectuada com prudência, visto que pode não ser representativa de todo o
genoma do parasita [ten Hove et al. 2009].
Não restam dúvidas, que com a contribuição de mais e melhores tecnologias de
abordagem ao diagnóstico, e da epidemiologia molecular, haverá uma clarificação dos
modos de transmissão e dos factores de risco associados à microsporidiose, os quais,
por sua vez, conduzirão ao desenvolvimento e aplicação de potenciais estratégias de
prevenção deste grupo de patologias.
9.EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR
- 110 -
- Segunda parte –
CARACTERIZAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA DE MICROSPORIDIOSE
EM PORTUGAL
CapítuloI
Objectivos Gerais
I. OBJECTIVOS GERAIS
- 114 -
A realização do trabalho apresentado nesta dissertação foi motivada pela escassa
informação existente acerca da epidemiologia e da transmissão da microsporidiose
humana em Portugal, em especial, sobre as espécies e genótipos de microsporidia que
infectam o Homem e outros animais e sobre os potenciais reservatórios da infecção
humana. Assim, os objectivos que nos propusemos atingir foram os seguintes:
1. Determinar a prevalência de infecção por microsporidiaem humanos, animais e
ambiente (água de consumo público) em Portugal.
2. Determinar as espécies de microsporidia responsáveis pela infecção nos
seropositivos para VIH e na população de imunocompetentes em Portugal.
3. Identificar animais potenciais reservatórios, nomeadamente os que se encontram
em estreito contacto com o Homem como é o caso dos animais de companhia,
aves de parques públicos, bem como fontes de infecção hídricas.
4. Seleccionar ou definir marcadores genotípicos das espécies de microsporidia
para caracterização dos isolados com diferentes origens, humana, animal e
ambiental; a genotipagem dos isolados do parasita permite monitorizar a sua
variação genética e determinar as fontes de infecção.
5. Avaliar a importância dos microsporídios para a Saúde Pública nos infectados
por VIH e em imunocompetentes, em Portugal. Este constitui um importante
objectivo na medida em que, no país, a pesquisa de microsporidia, não faz parte
do diagnóstico de rotina e a patogenicidade dos parasitas necessita de ser
clarificada, uma vez que são um grupo de parasitas oportunistas e emergentes.
6. Identificar factores de risco associados à infecção humana, através da análise dos
resultados obtidos e da sua relação com a informação epidemiológica e clínica
de cada doente.
7. Clarificar a epidemiologia das espécies e genótipos de microsporidia nos
humanos, nos animais e no ambiente, em Portugal.
Com o presente trabalho esperamos poder contribuir para um melhor
conhecimento da extensão e diversidade genética dos parasitas responsáveis pela
I. OBJECTIVOS GERAIS
- 115 -
microsporidiose humana, na população de seropositivos e seronegativos para VIH, no
nosso País. A identificação das espécies e genótipos de microsporidia em animais, pode
ser útil para determinar o seu potencial como fonte de contaminação ambiental e como
reservatório da infecção humana. A determinação da presença destes parasitas em
animais de companhia é importante para avaliar o seu papel como fonte de infecção
para o Homem e o risco que constituem, principalmente, para doentes com função
imunológica comprometida. Igualmente a detecção de microsporidia em água de
abastecimento é relevante para avaliar a possibilidade de transmissão hídrica destes
parasitas. A caracterização intra-específica de microsporidia, ao permitir maior
resolução da variabilidade genética dos isolados, pode contribuir para a clarificação do
papel desempenhado por cada modo de transmissão na epidemiologia da
microsporidiose humana e de animais de companhia, aves de parques públicos da
cidade de Lisboa, gado doméstico e animais silváticos de vida livre e em cativeiro,
nessa mesma transmissão, em Portugal.
- 116 -
CapítuloII
Material e Métodos
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 118 -
Com este trabalho pretendeu-se detectar por métodos parasitológicos e
moleculares e caracterizar por métodos moleculares a ocorrência das quatro principais
espécies de microsporidia patogénicas para o homem e de uma nova espécie
identificada em Portugal Vittaforma – like, na população humana e em diversos grupos
de animais. Para concretizar este propósito estabeleceram-se etapas que foram
sucessivamente realizadas e permitiram atingir os objectivos que a seguir se indicam:
1. Caracterização de população em estudo;
2. Processamento das amostras;
3. Detecção parasitológica;
4. Extracção do DNA das amostras;
5. Diagnóstico molecular de microsporidia;
6. Amplificação e sequenciação das regiões genómicas de interesse;
7. Análise e compilação dos dados clínicos recolhidos;
8. Respectiva integração dos resultados.
1. POPULAÇÃO ESTUDADA 1.1. POPULAÇÃO HUMANA
1.1.1. Amostras Fecais
Para este estudo, foram analisadas amostras fecais submetidas para diagnóstico de
parasitas intestinais, na Unidade de Protozoários Oportunistas/VIH e Outras
Protozooses, do Instituto de Higiene e Medicina Tropical e provenientes, na sua
maioria, de diversos Hospitais da Região de Lisboa mas, também, de outros Hospitais
do País, nomeadamente, Setúbal, Beja e Faro. Todos os dados pessoais dos doentes
cujas amostras fecais foram estudadas, foram mantidos dentro da mais estricta
confidencialidade. A identificação do doente manteve-se desconhecida para a autora do
presente trabalho.
Para além das amostras fecais recolhidas, entre Janeiro de 2003 e Dezembro de
2009, foi efectuado o estudo retrospectivo da totalidade das amostras fecais,
correspondentes ao período entre Janeiro de 1999 e Dezembro de 2002, cuja recolha foi
anterior ao início do presente trabalho e, que se encontravam conservadas a 4ºC, em
dicromato de potássio (K2Cr2O7) a 5%.
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 119 -
Na totalidade foram estudadas 1989 amostras fecais de 856 doentes (adultos e
crianças) seropositivos e seronegativos para VIH. A percentagem de doentes
seropositivos para VIH estudados foi de 65,5% (561/856) e seronegativos para VIH foi
de 34,5% (295/856). Do total de doentes (586 do sexo masculino e 270 do sexo
feminino), 675 eram adultos e 181 crianças.
Todos os doentes analisados apresentavam sintomatologia gastrintestinal, 57,6%
(493/856) com diarreia e 42,4% (363/856) sem diarreia.
Nove dos 295 seronegativos para VIH (3,1%) apresentavam outras causas de
imunossupressão (cinco doentes submetidos a quimioterapia, um doente com
transplante de rim, um doente com imunodeficiência primária, um doente submetido a
terapêutica com corticosteróides e um infectado por vírus da hepatite C).
Todas as amostras fecais recolhidas foram submetidas a técnicas parasitológicas
e moleculares, para detecção de esporos e DNA de microsporídios. Os isolados dos
microsporídios identificados foram, posteriormente, caracterizados por meio de técnicas
de biologia molecular.
1.1.2. Amostras de Urina
Amostras de urina de 69 doentes, submetidas para diagnóstico de microsporidiose,
na Unidade de Protozoários Oportunistas/VIH e Outras Protozooses, do Instituto de
Higiene e Medicina Tropical, provenientes, na sua maioria, de diversos Hospitais da
Região de Lisboa assim como de outros Hospitais do País, nomeadamente, Setúbal,
Beja e Faro, foram incluídas neste estudo. Do total de amostras de urina analizado, 60
amostras haviam sido recolhidas antes do início do trabalho (Janeiro de 1999 e
Dezembro de 2002) e encontravam-se conservadas a 4ºC, e as restantes nove amostras
foram recolhidas durante o decurso deste trabalho e correspondem ao período entre
Janeiro de 2003 e Dezembro de 2005.
A maioria das amostras estudadas pertencia a doentes seropositivos para VIH
(85,5%; 59/69). Dez amostras de urina pertenciam a doentes seronegativos para VIH
(14,5%). As amostras correspondiam a 48 doentes (69,6%) do sexo masculino e a 21
doentes (30,4%) do sexo feminino, sendo que 44 (63,8%) eram adultos e 25 (36,2%)
crianças.
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 120 -
As amostras de urina incluídas neste trabalho foram submetidas a técnicas
parasitológicas e moleculares, para detecção de esporos/DNA de microsporídios. Os
isolados dos microsporídios identificados foram, posteriormente, caracterizados por
meio de técnicas de biologia molecular.
1.1.3. Secreções pulmonares
Para a pesquisa de microsporídios em secreções pulmonares, a população
escolhida, caracteriza-se por ser constituída por um grupo definido de doentes adultos,
seropositivos e seronegativos para VIH, com sintomatologia respiratória, provenientes
de dois hospitais da cidade de Lisboa. Das amostras de secreções pulmonares
submetidas para diagnóstico da pneumonia por Pneumocystis jirovecii, na Unidade de
Protozoários Oportunistas/VIH e Outras Protozooses, do Instituto de Higiene e
Medicina Tropical, entre Janeiro de 1996 e Dezembro de 2008, foi escolhida, uma
amostra aleatória, englobando 200 secreções pulmonares. Todos os dados pessoais dos
doentes cujas amostras foram estudadas, foram mantidos dentro da mais estricta
confidencialidade mantendo-se desconhecida a identificação do doente para a autora do
presente trabalho.
Desta forma, nesta fase de identificação e caracterização de microsporídios,
considerados de interesse, foram analisadas 200 amostras correspondentes a 124
expectorações induzidas (EI) e 76 lavados broncoalveolares (LBA). As amostras
pertenciam a 150 doentes seropositivos para VIH (75%) e a 50 seronegativos para VIH
(25%). A percentagem de doentes do sexo masculino e do sexo feminino
correspondentes às amostras estudadas foi de 64,5% (129/200) e 35,5% (71/200),
respectivamente. A mediana de idades dos doentes foi de 33 anos, num intervalo de
idades de 9 meses a 83 anos.
Todas as amostras de secreções foram testadas através do diagnóstico
parasitológico e molecular.
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 121 -
1.2. POPULAÇÃO ANIMAL
O estudo da microsporidiose incidiu sobre diversas espécies de mamíferos e aves,
animais de companhia e silváticos. Na pesquisa de esporos e/ou na caracterização
genética das espécies de microsporídios envolvidas, foram aplicadas em paralelo as
técnicas parasitológicas e de biologia molecular, seleccionadas para este trabalho, a
todas as amostras fecais, à excepção das amostras fecais dos animais silváticos de vida
livre. As amostras fecais deste grupo só foram estudadas pelas técnicas de PCR. Neste
estudo, foram, também, incluídas amostras fecais de bovinos e de alguns animais
silváticos, cuja recolha antecedeu o início do presente trabalho.
No presente trabalho foram seleccionadas as seguintes populações de animais:
1.2.1. Cães e gatos
A população humana está largamente exposta à população canina e de felinos
nos meios rurais e urbanos. No cão, já foram identificadas espécies de microsporídios
patogénicos para o Homem (E. bieneusi, E. cuniculi e E. intestinalis), assim como no
gato. Estes animais podem assim, representar uma fonte de infecção destes
microrganismos, para o Homem.
O estudo sobre a microsporidiose, em animais de companhia, incidiu, sobre 116
cães e gatos. As amostras fecais de 66 animais com dono, nomeadamente, de oito cães e
58 gatos analizadas neste estudo foram recolhidas, no período compreendido entre
Janeiro de 2003 e Dezembro de 2005, com a colaboração de alguns Médicos
Veterinários e de particulares. Os animais estudados eram jovens e adultos, com e sem
diarreia.
Para além dos animais com dono, foram, ainda, recolhidas, entre Fevereiro e
Abril de 2004, amostras fecais de 50 cães errantes, nomeadamente de 10 albergados no
Canil Municipal de Torres Vedras e de 40 acolhidos no Canil Municipal de Lisboa. As
amostras pertenciam a animais jovens e adultos. Apenas dois animais com idade inferior
a dois meses e um adulto apresentavam diarreia.
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 122 -
1.2.2. Gado bovino de explorações leiteiras
O estudo retrospectivo da pesquisa de microsporídios foi efectuado em 100 amostras
fecais, seleccionadas aliatóriamente, de bovinos, provenientes de explorações leiteiras
de várias regiões de Portugal (Alto Alentejo-Montemor-o-Novo: 60; Baixo Alentejo
Odemira: 6; Estremadura-Lourinhã, Pêro Pinheiro, Odivelas e Sintra: 34) e recolhidas
previamente ao início deste estudo, entre Janeiro de 1996 a Junho de 2002. As fezes
encontravam-se conservadas a 4ºC, em dicromato de potássio a 5%, na Unidade de
Protozoários Oportunistas/VIH e Outras Protozooses, do Instituto de Higiene e
Medicina Tropical.
Destes 100 animais, 62 tinham menos de 38 dias de vida, três tinham entre 45 e 80
dias e um tinha quatro meses de idade. Não foi possível obter informação sobre a idade
dos restantes 34 animais.
1.2.3 Animais silváticos em cativeiro
O estudo retrospectivo em animais silváticos de cativeiro foi efectuado em
amostras fecais recolhidas, previamente ao início do presente trabalho, entre o período
compreendido entre Abril de 2002 e Fevereiro de 2003. O estudo incluiu, amostras
fecais de 103 animais, correspondentes, respectivamente, a 75 espécies de mamíferos, 9
espécies de répteis e 9 espécies de aves cativas no Jardim Zoológico de Lisboa. Sempre
que possível, a recolha das amostras fecais dos mamíferos foi efectuada mensalmente.
No caso dos répteis, as amostras foram recolhidas nos meses de Abril e Junho de 2002 e
de Janeiro e Fevereiro de 2003. As amostras fecais das aves foram recolhidas uma única
vez, no mês de Agosto de 2002. As amostras foram colhidas, pelos tratadores dos
animais, do solo, ao acaso, tendo sido dada preferência a fezes diarreicas, no caso de
elas existirem. Nos Quadros XVIII, XIX e XX encontram-se descritos os nomes
comuns e científicos de todos os animais estudados (mamíferos, aves e répteis). Com
excepção de duas crias de leão, todos os mamíferos estudados eram adultos e não
apresentavam sintomatologia gastrintestinal. Entre os répteis estudados, encontravam-se
animais jovens e adultos, sem evidência de diarreia.Todas as aves estudadas eram
adultas e não apresentavam sinais de diarreia.
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 123 -
Quadro XVIII. Mamíferos do Jardim Zoológico de Lisboa cujas fezes foram submetidas a técnicas parasitológicas e moleculares para
identificação de microsporídios.
NOME COMUM (ESPÉCIE) Saguim de face branca (Callithrix geoffroyi) Saguim cabeça de algodão (Saguinus oedipus oedipus) Porco (Sus scrofa) Saguim prateado (Callithrix argentata) Colobo Guerezza (Colobus guereza kikuyuensis) Hipopótamo pigmeu (Choeropsis liberiensis liberiensis) Lémure de cauda anelada (Lemur catta) Preguiça de dois dedos (Choloepus didactylus) Hipopótamo (Hippopotamus amphibius) Lémure de face branca (Lemur macaco albifrons) Lobo ibérico (Canis lupus signatus) Camelo (Camelus bactrianus bactrianus) Lémure preto (Lemur macaco macaco) Raposa (Vulpes vulpes silacea) Dromedário (Camelus dromedarius) Lémure mangusto (Lemur mongoz) Urso do Tibete (Selenarctos thibetanus) Lama (Lama glama glama) Chimpanzé (Pan troglodytes) Urso pardo (Ursus arctos) Axis (Cervus axis axis) Gorila (Gorilla gorilla gorilla) Chita (Acinonyx jubatus jubatus) Veado do Canadá (Cervus elaphus canadensis) Langur de Douc (Pygathrix nemaeus nemaeus) Lince ibérico (Felis lynx lynx) Veado da Birmânia (Cervus eldi thamin) Babuíno Hamadrias (Papio hamadryas hamadryas) Ocelote (Felis pardalis) Cabra (Capra hircus hircus) Babuíno da Guiné (Papio cynocephalus papio) Serval (Felis serval) Addax (Addax nasomaculatus) Mandril (Papio sphinx) Pantera nebulosa (Neofelis nebulosa) Impala de face negra (Aepyceros melampus petersi) Langur de Douc (Pygathrix nemaeus nemaeus) Leão de Angola (Panthera leo bleyenberghi) Muflão africano (Ammotragus lervia) Macaco Goeldi (Callimico goeldii) Jaguar (Panthera onca) Cervicapra (Antilope cervicapra) Macaco cauda de leão (Macaca silenus) Leopardo (Panthera pardus) Bisonte americano (Bison bison bison) Macaco do Japão (Macaca fuscata fuscata) Tigre da Sibéria (Panthera tigris altaica) Iaque (Bos mutus grunniens) Macaco de beiço branco (Cercopithecus cephus cephus) Tigre de Sumatra (Panthera tigris sumatrae) Gnu de cauda branca (Connochaetes gnou) Macaco Diana (Cercopithecus diana diana) Pantera das neves (Pantera uncia) Gnu azul (Connochaetes taurinus taurinus) Macaco mona (Cercopithecus mona) Elefante indiano (Elephas maximus indicus) Palanca ruana (Hippotragus equinus) Macaco de Brazza (Cercopithecus neglectus) Elefante africano (Loxodonta africana africana) Palanca negra (Hippotragus niger niger) Saguim de cabeça castanha (Saguinus fuscicollis) Zebra de Grevy (Equus grevyi) Búfalo africano (Syncerus caffer caffer) Saguim imperador (Saguinus imperator subgrisescens) Burro (Equus asinus) Pacaça (Syncerus caffer nanus) Saguim de beiço branco (Saguinus labiatus labiatus) Pónei (Equus caballus) Elande (Taurotragus oryx oryx) Saguim de mãos douradas (Saguinus midas midas) Rinoceronte branco (Ceratotherium simum simum) Cavalo de Timor (Tragelaphus strepsiceros strepsiceros) Saguim de mãos negras (Saguinus midas niger) Rinoceronte indiano (Rhinoceros unicornis) Girafa de Angola (Giraffa camelopardalis angolensis)
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 124 -
Quadro XIX. Aves do Jardim Zoológico de Lisboa cujas fezes foram submetidas a
técnicas parasitológicas e moleculares para identificação de microsporídios.
NOME COMUM (ESPÉCIE)
Faisão Lady Amherst (Chrysolophus
amherstiae) Arara maracanã (Ara maracana)
Faisão dourado (Chrysolophus pictus) Jandaia ventre de fogo (Aratinga auricapilla
aurifrons) Pombo da fruta de ventre laranja (Ptilinopus
iozonus) Jandaia (Aratinga jandaya)
Pombo da fruta de garganta preta (Ptilinopus
leclancheri) Periquito dourado (Aratinga guarouba)
Pombo da fruta soberbo (Ptilinopus
superbus) Papagaio cabeça de falcão (Deroptyus accipitrinus
accipitrinus) Catatua pequena de crista amarela (Cacatua
sulphurea sulphurea) Papagaio eclectus (Eclectus roratus polychloros)
Catatua de Leadbeater (Cacatua leadbeateri) Marianinha de cabeça branca (Pionites leucogaster) Catatua galah (Elophus roseicapillus) Papagaio de bico grosso (Rhynchopsitta
pachyrhyncha) Papagaio chuão (Amazona dufresniana
rhodocorytha) Turaco da costa dourada (Tauraco corythaix persa)
Papagaio de face verde (Amazona
viridigenalis)
Quadro XX. Répteis do Jardim Zoológico de Lisboa cujas fezes foram submetidas a
técnicas parasitológicas e moleculares, para identificação de microsporídios.
NOME COMUM (ESPÉCIE)
Tartaruga panqueca (Malacochersus
tornieri) Sucuri amarela (Eunectes notaeus)
Tartaruga do Egipto (Testudo kleinmanni) Serpente rei de riscas (Lampropeltis alterna) Tartaruga espinhosa (Chelydra serpentina) Cobra preta (Naja melanoleuca) Dragão do Komodo (Varanus komodoensis) Naja indiana (Naja naja kaouthia) Jibóia de Cuba (Epicrates angulifer)
1.2.4. Animais silváticos de vida livre
O estudo sobre a presença de microsporídios em produtos biológicos de animais
silváticos de vida livre foi efectuado num grupo de 134 pequenos mamíferos
(insectívoros e roedores). Os pequenos mamíferos, foram capturados em Maio, Agosto
e Novembro de 2003, nos concelhos de Moura e Aljustrel, Baixo Alentejo. Foram
estudados 52 insectívoros, todos pertencentes à espécie Crocidura russula, vulgarmente
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 125 -
denominada musaranho de dentes brancos. Entre os roedores, encontravam-se 80
ratinhos ruivos (Mus spretus) e dois ratinhos do campo (Apodemus sylvaticus). Todos os
animais estudados eram adultos e nenhum deles apresentava diarreia. Dada a reduzida
quantidade de amostra fecal recolhida, por cada animal, optou-se por submeter as
amostras fecais apenas, às técnicas de biologia molecular, para detecção de
microsporidia.
1.2.5. Aves exóticas de gaiola e pombos urbanos
Como já foi referido, a maior parte dos casos descritos de microsporidiose em
aves, inclui os psitaciformes (papagaios, periquitos, inseparáveis, etc). Contudo, nos
anos mais recentes, foram descritos casos de infecção por E. hellem, noutros grupos de
aves, sugerindo, que esta espécie pode ser frequente nas aves. E. bieneusi e E.
intestinalis também foram reportadas em diversas espécies de aves. Assim,
seleccionaram-se para este estudo, dois grupos de aves, que contactam mais
directamente com o Homem: as aves de gaiola e os pombos urbanos (Columba livia var.
domestica). Do primeiro grupo, fazem parte os psitaciformes e os passeriformes, nos
quais já foi isolado E. hellem e E. bieneusi. As aves de gaiola, correspondem aquelas
aves que, habitualmente se adquirem nas lojas de animais de estimação. O segundo
grupo, os pombos urbanos, foi seleccionado, por se tratar de aves com grande
proliferação nos centros urbanos e de estarem associadas à transmissão de várias
doenças no Homem. Os pombos foram capturados na cidade de Lisboa.
Das 39 aves exóticas de gaiola estudadas, 31 (79,5%) pertenciam a um criador
de aves, da freguesia de Sarilhos Grandes, no concelho do Montijo e oito (20,5%)
pertenciam a agregados familiares, da região da grande Lisboa, que possuem estas aves
como animais de estimação. As espécies de aves exóticas pertencentes à Ordem
Psittaciformes foram as seguintes: Agapornis spp. (n=1); Agapornis fischeri (n=5);
Agapornis personatus (n=3); Agapornis roseicollis (n=4); Amazona aestiva (n=1);
Forpus coelestis (n=1); Forpus conspicilattus (n=1); Melopsittacus undulatus (n=4);
Nymphicus hollandicus (n=3); Platycercus eximius (n=1); Psittacus erithacus (n=8). As
espécies de aves pertencentes à Ordem Passeriforme foram as seguintes: Bathilda
ruficauda (n=1); Erythrura gouldiae (n=1); Leiothrix lutea (n=1); Lonchura domestica
(n=2); Padda oryzivora (n=1); Serinus canaria (n=1).
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 126 -
Quatro cadáveres da espécie Psittacus erithacus incluída na amostra, e com
origens diferentes, foram entregues para necrópsia após morte súbita na gaiola.
Dos 52 pombos urbanos estudados, 23 (44,2%) foram capturados na Praça do
Império (freguesia de Santa Maria de Belém) e 29 (55,8%) na Rua Epifânio Dias
(freguesia de São João de Brito). Os 52 cadáveres de pombos urbanos, foram entregues,
por elementos do Departamento de Higiene Urbana e Resíduos Sólidos da Câmara
Municipal de Lisboa, que regularmente procedem à captura de pombos, para controlo da
população columbícula.
Os produtos biológicos analisados foram os dejectos das aves (compostos pelas
excreções urinárias e fezes) recolhidos nas gaiolas, as zaragatoas da traqueia e o
conteúdo intestinal, colhidos durante o exame post mortem das aves. Os dejectos
colhidos nas gaiolas, devem ser considerados como amostras de grupo, uma vez que,
em cada gaiola, havia habitualmente, vários indivíduos da mesma espécie.
Os dejectos de aves, foram acondicionados em recipientes individuais de
plástico, estéreis, devidamente identificados. As amostras foram transportadas em sacos
isotérmicos, junto com acumuladores térmicos e armazenados a 4ºC.
1.3. AMOSTRAS AMBIENTAIS
Todas as amostras utilizadas neste trabalho (n=184) foram fornecidas pela Empresa
Portuguesa de Águas Livres (EPAL). As amostras correspondem a alíquotas de água
concentrada, recolhidas e analizadas pela EPAL, pelo método USEPA 1623 (método
desenvolvido pela Environmental Protection Agency- EPA, nos EUA, o qual baseia-se
na separação de oocistos de Cryptosporidium e quistos de Giardia através de partículas
imunomagnéticas revestidas por anticorpos monoclonais) para detecção de oocistos de
Cryptosporidium e quistos de Giardia e amostras de água concentrada sem qualquer
tratamento específico para separação de protozoários. A concentração das amostras de
água foi efectuada no local de colheita, por filtração de volumes variáveis de água, entre
nove e 300 litros.
Refira-se que as amostras de água analisadas pela técnica USEPA 1623,
enviadas pela EPAL, correspondem apenas a 1/3 (33 microlitros - μl) do volume obtido
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 127 -
após separação pelas particulas imunomagnéticas (100 μl), diluído num mililitro (ml) de
água destilada.
No que diz respeito à água concentrada por filtração, mas sem aplicação das
partículas imunomagnéticas, foram-nos enviadas amostras, não diluídas, de 2 ml,
retiradas de um volume inicial de 10 ml.
A recolha de 184 amostras de águas foi efectuada nas regiões do Ribatejo e na
Estremadura, em locais de amostragem envolvidos no processo conducente ao
abastecimento de água da cidade de Lisboa. O estudo envolveu amostras de água
tratada, provenientes de três Estações de Tratamento de Água (ETA), ETA1, ETA2,
ETA3 e reservatórios de água de abastecimento da cidade de Lisboa, bem como águas
não tratadas, obtidas nas captações superficiais de TR1 e CB2 e na captação subterrânea
de OA3.
A água captada em TR1 é tratada na ETA1.O processo de tratamento inicia-se
junto á captação, onde tem lugar a macrotamização e pré-cloragem I. Na ETA realizam-
se as seguintes fases: pré-cloragem II, condicionamento do pH, coagulação/floculação,
decantação, filtração, correcção de pH e pós-cloragem. Na ETA2 é tratada a água
captada na albufeira CB2. O tratamento compreende etapas de pré-cloragem,
remineralização e correcção de agressividade, coagulação, filtração, equilíbrio e ajuste
do pH e pós-cloragem. A água captada na nascente OA3 é tratada por um sistema de
ultra-violetas na ETA3.
O número de amostras de água utilizadas para este estudo, correspondem a:
1) 175 amostras processadas de acordo com o método 1623 da USEPA e purificados
por separação imunomagnética (IMS) (Dynabeads anti-Cryptosporidium kit, Dynal)
a) Água não tratada (n=69): 39 captações subterrâneas, 30 captações superficiais
b) Água tratada/ETA (n=106): 42 captações subterrâneas, 25 captações
superficiais, 39 de água de abastecimento.
2) Nove amostras de água superficial não tratada e sem IMS.
Em virtude da quantidade reduzida das alíquotas de água entregues as amostras
só foram submetidas aos protocolos de PCR seleccionados no presente trabalho.
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 128 -
1.4. DEFINIÇÃO DO CRITÉRIO DE POSITIVIDADE
A identificação dos microsporídios foi realizada, em paralelo, por duas técnicas:
coloração histoquímica Gram-chromotrope (GC) e PCR.
Uma amostra foi considerada positiva, quando obedecia aos seguintes critérios
de positividade:
1) positiva sempre que eram detectados esporos de microsporídios pela técnica
de coloração parasitológica, se confirmada por um dos protocolos de PCR
adoptados neste estudo;
2) positiva quando se conseguia detectar a presença de DNA de microsporídios
por uma das técnicas de PCR.
2. PROCESSAMENTO E CONCENTRAÇÃO DE AMOSTRAS FECAIS, URINA E
SECREÇÕES PULMONARES (EXPECTORAÇÃO INDUZIDA E LAVADOS
BRONCOALVEOLARES)
2.1. AMOSTRAS FECAIS
A pesquisa de microsporídios efectuou-se a partir de fracções de amostras, mais
precisamente em 0,5 g de fezes ou conteúdo intestinal. Para a concentração de esporos a
partir de amostras fecais ou de conteúdo intestinal, foi adoptado o método modificado
de sedimentação água/éter [Matos et al. 2002]. Num tubo de centrífuga cónico, com
capacidade de 12,0 ml, foi ressuspendida uma alíquota (0,5 g) de fezes, em 3,0 ml de
água desionizada. Após a adição de 3,0 ml de éter dietílico (C4H10O - Merck) e agitação
vigorosa no vortéx, a suspensão foi filtrada através de uma gaze para um novo tubo,
com a finalidade de remover os detritos fecais de maior dimensão. Uma vez completado
o volume final, com água desionizada, a amostra foi centrifugada a 400 g, durante
cinco minutos. Depois de desprezada a fase etérea, o sobrenadante foi retirado para um
tubo limpo, perfez-se o volume final com água desionizada e realizou-se nova
centrifugação, desta vez a 4.100 g, durante 10 minutos. O sedimento, originado na
primeira centrifugação, foi guardado, para posterior pesquisa de ovos, quistos e
parasitas. Após a segunda centrifugação, o sobrenadante foi rejeitado e, com o
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 129 -
sedimento resultante, prepararam-se esfregaços, em três lâminas tratadas com poli-L-
lisina.
Depois de secarem, à temperatura ambiente, um dos esfregaços era submetido à
técnica de coloração Gram-Chromotrope. As lâminas restantes foram conservadas a –
20ºC, para posterior estudo ou para confirmação de algum resultado, caso fosse
necessário. Ambos os sedimentos obtidos das duas centrifugações, foram reunidos num
mesmo eppendorf de 2 ml e conservados a 4ºC. Todas as centrifugações foram
efectuadas à temperatura ambiente. Posteriormente, os sedimentos foram submetidos a
uma técnica de extracção de DNA.
2.2. AMOSTRAS DE URINA
As amostras de urina, foram colhidas em recipientes estéreis e enviadas
imediatamente para o laboratório da Unidade de Protozoários Oportunistas/VIH e
Outras Protozooses, do Instituto de Higiene e Medicina Tropical, onde se iniciou o seu
processamento. Da totalidade do líquido, retiraram-se, aproximadamente, 2,0 ml de
suspensão, procedendo-se à sua centrifugação a 1500 g, durante 10 min. O
sobrenadante foi desprezado e o sedimento foi ressuspenso em 0,5 ml de soro
fisiológico. Uma gota, 20-30 l da amostra, foi aplicada com uma pipeta descartável,
em três lâminas, tratadas com poli-L-lisina com o cuidado de espalhar em círculo com
uma área de 15-20 mm de diâmetro, após o que eram deixadas a secar, à temperatura
ambiente. Uma das lâminas era utilizada para posterior observação pela técnica de
Gram-Chromotrope e as restantes foram conservadas a –20º C. O restante produto
tratado foi conservado a 4º C. Posteriormente, os sedimentos foram submetidos a uma
técnica de extracção de DNA.
2.3.SECREÇÕES PULMONARES
O presente estudo compreendeu amostras de secreções pulmonares enviadas
para o laboratório da Unidade de Protozoários Oportunistas/VIH e Outras Protozooses,
do Instituto de Higiene e Medicina Tropical, cujo objectivo principal, era o diagnóstico
da pneumocistose. Ao chegarem ao laboratório, as amostras de secreções pulmonares
(EI e LBA), foram identificadas e processadas de imediato. O material biológico foi
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 130 -
concentrado e dividido para procedimentos de diagnóstico e para posteriores estudos
moleculares. O protocolo de processamento, para os dois tipos de amostra, encontra-se
descrito abaixo:
2.3.1. Expectoração induzida (EI)
Com o objectivo de garantir uma boa higiene oral e uma hidratação adequada,
previamente à recolha das EI, todos os doentes respeitaram um período de jejum para
alimentos sólidos de 12 horas. A todos os doentes administrou-se uma solução salina
hipertónica a 1,8 %, durante 15 minutos, através de um nebulizador ultrassónico. As
amostras, obtidas por este processo, foram recolhidas em recipientes estéreis e enviadas
para o laboratório. Todos os procedimentos posteriores foram por nós executados.
O processamento das expectorações iniciou-se com a adição de um mucolítico, o
ditiotreitol 0,3 % (DTT; Sigma), às amostras, a 37º C, durante 30 minutos, com o
objectivo de solver e solubilizar as partículas e agregados de muco. A amostra liquefeita
foi transferida para um tubo de centrífuga, adicionou-se PBS, 150 mM, com pH 7,2
(SIGMA), até preencher o volume do tubo, levando-se a centrifugar a 4100 g, durante
20 minutos. O PBS comporta-se como um tampão estabilizante e a centrifugação serve
para concentrar os esporos de microsporídios que ficam no sedimento. O sobrenadante é
rejeitado, seguindo-se a ressuspensão do sedimento em 0,5 ml de PBS. Com a ajuda de
uma pipeta descartável, aplicou-se uma gota de cerca de 20-30 l da amostra, em três
lâminas de microscopia pré-tratadas com poli-L-lisina (vide Anexo ), que foi espalhada
em círculo de aproximadamente 10-15 mm de diâmetro. Deixou-se secar, à temperatura
ambiente (no interior de “hotte”), dividindo-se o restante volume da amostra para
microtubos de 1,5 ml.
As lâminas foram conservadas a –20º C, à excepção de uma em que o esfregaço
foi submetido à coloração pelo Gram-Chromotrope. A restante expectoração tratada foi
conservada a –80º C.
2.3.2. Lavado broncoalveolar (LBA)
O LBA foi obtido, após encravamento do fibroscópio no lobo médio do pulmão,
instilando 150 ml de soro fisiológico pré-aquecido a 37º C, dividido por três seringas de
50 ml, tendo sido aspirado suavemente. Todos os procedimentos prévios foram
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 131 -
efectuados por técnicos especializados. O produto obtido foi enviado, de imediato para
o laboratório.
O protocolo de preocessamento é bastante semelhante ao apresentado para as
amostras de EI, no entanto, como as amostras de LBA, normalmente, não apresentam
muco, iniciou-se o processamento transferindo a amostra directamente para um tubo de
centrífuga, perfazendo-se o volume do tubo com PBS e centrifugando-se a mistura
(4100 g). A partir deste ponto, o procedimento foi igual ao indicado para as amostras de
EI.
No final de ambos os procedimentos, uma lâmina de microscopia com o
esfregaço (material biológico concentrado) foi usada para efectuar a técnica de Gram-
Chromotrope (GC) e as restantes foram conservadas a -20ºC, para posterior estudo ou
para confirmação de algum resultado, caso seja necessário. Os tubos contendo a amostra
concentrada foram armazenados a -80ºC, de modo a conservar intacto todo o material
biológico.
2.4. OBTENÇÃO DO CONTEÚDO INTESTINAL E EXSUDADO TRAQUEAL POST MORTEM DE UM
GRUPO DE AVES.
As amostras de conteúdo intestinal e exsudado traqueal, de uma parte do grupo
de aves estudado, foram recolhidas durante o exame post mortem da totalidade dos
pombos e de quatro papagaios (Psittacus erithacus). As necrópsias foram realizadas,
por um Médico veterinário auxiliado pela autora deste estudo, sempre que possível, no
próprio dia de chegada dos cadáveres ao Instituto de Higiene e Medicina Tropical.
Quando não foi possível necropsiar no próprio dia, conservaram-se os cadáveres a –20
ºC. Em cada necrópsia, efectuaram-se esfragaços da traqueia. Os intestinos foram
retirados e, posteriormente, esvaziados do seu conteúdo e conservados a 4ºC. As
zaragatoas da traqueia foram mergulhadas em 1,0 ml de solução de fosfato tamponado
salino (PBS, sigla anglo-saxónica para phosphate buffered saline) com pH 7,2
(SIGMA), fortemente comprimidas contra o tubo, e conservadas a 4ºC.
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 132 -
3. COLORAÇÃO DIFERENCIAL 3.1. COLORAÇÃO PELO GRAM-CHROMOTROPE (GC) (adaptada de [Moura et al. 1997])
Tradicionalmente, a técnica do tricrómio modificado, constituía a coloração
histológica, mais aplicada à identificação morfológica dos esporos de microsporídios.
Tal como o seu nome indica, esta técnica utiliza três corantes distintos: um para os
núcleos, outro para o citoplasma e um terceiro para as estruturas de sustentação. O
tricrómio é preparado com base no método de Weber e colaboradores [Weber et al.
1992a], modificado por Ryan e colaboradores [Ryan et al. 1993], que substituiu o
contracorante verde sólido, pelo azul de anilina e diminuiu a quantidade de ácido
fosfotúnstico, de modo a obter um melhor contraste entre a cor dos esporos e a
coloração de fundo, e por Didier e colaboradores [Didier et al. 1995a] que introduziu
alterações no tempo de incubação e na temperatura. No método original, as amostras
eram coradas durante 90 minutos, à temperatura ambiente, enquanto aqui o período de
execução da técnica demora apenas 30 minutos, a incubar na estufa, a 37º C (fornece
uma coloração mais intensa dos microsporídios e prolonga a vida da solução por mais
uma ou duas semanas).
Com base na metodologia referida anteriormente, Moura e colaboradores
desenvolveram a técnica de Gram-Chromotrope, para a detecção parasitológica dos
microsporídios [Moura et al. 1997]. Esta técnica de coloração histológica, combina as
vantagens das duas colorações, a do tricrómio modificado e a de Gram potenciando a
capacidade tintorial dos corantes e resultando numa maior capacidade de detecção dos
esporos destes parasitas. A técnica de Gram-Chromotrope foi a metodologia adoptada,
para o presente estudo.
As amostras, destinadas para coloração pelo Gram-Chromotrope, foram fixadas
pelo calor seco a 60ºC, fornecido por uma placa térmica, durante 5 minutos e deixados a
arrefecer à temperatura ambiente. Após a fixação, os esfregaços foram corados com
uma solução de violeta de genciana (Eurotubo), durante 30 segundos e lavados sob um
fio de água da torneira. De seguida, foram corados com lugol (Eurotubo), durante 30
segundos. O lugol foi removido por uma solução descorante (Eurotubo), que por sua
vez, foi removida sob um fio de água da torneira). Depois de secos, foram corados com
a solução de tricrómio modificado (Scientific Device Laboratory, Inc.) e incubados em
camâra húmida a 37ºC, durante 30 minutos. Decorrido este período de incubação, os
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 133 -
esfregaços foram lavados sucessivamente por uma solução com ácido álcool (90 %
etanol e 0,45 % de ácido acético), seguida de uma solução de etanol (95%) (Merck) e
por último, por uma solução de etanol 100%. Depois de secos à temperatura ambiente,
procedeu-se à leitura do esfregaço, após aplicação de uma gota de meio de montagem
entellan new (Merck) e de uma lamela de vidro 24 50 mm. A leitura foi efectuada,
sempre pelo mesmo observador, com apoio da microscopia óptica (Olympus BX51),
com objectiva de imersão ( 1000).
A amostra foi considerada positiva, sempre que foram identificados três ou mais
esporos [Weber et al. 1992a; DeGirolami et al. 1995], redondos ou ovais, de parede fina
corada de violeta a rosa escuro, com uma pequena zona polar ou central não corada. A
solução chromotrope, realça a cinta que rodeia o esporo e minimiza a coloração
Gram-variável, observada em algumas espécies de microsporídios [Moura et al. 1997].
Como controlo positivo, processaram-se, em idênticas condições, amostras
clínicas de humanos, que se sabia estarem contaminadas por microsporídios.
3.1.1. Quantificação da carga parasitária
Para além do diagnóstico parasitário, a técnica de Gram-Chromotrope foi
aplicada na quantificação das cargas parasitárias das amostras em estudo. Assim, a
carga parasitária de cada uma das amostras, foi estimada com base na média do número
de esporos observados nos esfregaços efectuados, em vinte campos de visão, com a
ampliação de ×1000. A média obtida foi classificada segundo o descrito no Quadro
XXI.
Quadro XXI. Critério para a determinação da carga parasitária dos isolados de
microsporídios, englobados no presente estudo.
CARGA PARASITÁRIA MÉDIA DE ESPOROS/CAMPO DE VISÃO*
Baixa (+) 1 a 5 Média (++) 6 a 10
Elevada (+++) 11 a 15 Muito elevada (++++) Mais de 15
* Com a ampliação de ×1000 (ocular ×10 e objectiva ×100)
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 134 -
4. EXTRACÇÃO DE DNA
A extracção do DNA dos microsporídios, dos diversos produtos biológicos (fezes,
conteúdo intestinal, urina, suspensões das zaragatoas da traqueia e secrecções
pulmonares) e ambientais (amostras de água), incluídos neste estudo, foi efectuada a
partir dos sedimentos obtidos durante o processamento das amostras e das aliquotas da
água concentradas, enviadas pela EPAL, respectivamente.
O DNA genómico de microsporídios foi extraído, recorrendo-se a um protocolo
comercial (FastDNA® SPIN Kit for Soil, Q.BIOgene) e a técnica foi executada com
base nas instruções do fabricante:
1) Lise celular: aos tubos E, de 2 ml, contendo uma matriz de lise celular,
adicionaram-se 978 l de tampão Fosfato de Sódio (SPB, sigla do anglo-saxónico para
Sodium Phosphate Buffer), 122 l de tampão MT e, por último, 400 l do sedimento
obtido no processamento das amostras. Agitaram-se os tubos à velocidade máxima
(2800 oscilações/minuto), durante dois minutos, no aparelho Mini Beadbeeter (Biospec
Products – HowawrdTH Industries). Os tubos E, contêm uma mistura de particulas de
cerâmica e sílica, desenhadas de modo a promover uma lise eficaz. O rebentamento
celular resulta, então, do stress mecânico, promovido pela acção destas partículas a alta
velocidade. Por seu lado, os tampões SPB e MT, actuam como homogenizadores e
solventes de matéria orgânica proveniente da lise celular, sendo, por isso, indicados para
protocolos de purificação de ácidos nucleicos. Estes regentes permitem a extracção de
DNA genómico, minimizando os riscos de contaminação por RNA. Prosseguiu-se com
uma centrifugação a 20200 g, durante 30 segundos, de forma a sedimentar os detritos
insolúveis, as partículas de cerâmica e sílica e a dissipar a espuma que é produzida
durante o processo de agitação no Mini Beadbeeter. Em seguida, procedeu-se à
transferência do sobrenadante resultante da centrifugação para um microtubo de 1,5 ml,
a que foi adicionado 250 l da solução de precipitação proteica (PPS, sigla do anglo-
saxónico para protein precipitation solution). Os tubos foram agitados procedendo-se à
sua inversão, à mão, cerca de 10 vezes. Seguiu-se uma nova centrifugação a 20200 g,
durante 5 minutos, para que ocorresse precipitação do pellet. Esta etapa terminou com a
transferência do sobrenadante resultante da centrifugação para um tubo falcon (Sarstedt)
de 15 ml.
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 135 -
2) Adsorção de DNA: ao tubo de 15 ml, adicionou-se 1 ml da suspensão aquosa
da matrix de ligação (contém sílica e tiocianato de guadinina). A mistura foi agitada
vigorosamente e deixada a incubar à temperatura ambiente, no agitador rotativo (Fröbel
Labortechnik GmbH), a velocidade moderada, durante 15 minutos. Neste período de
agitação constante, o DNA, por ter forte afinidade para as partículas da matrix, fica
adsorvido a estas, saindo de solução. Após esta incubação, deixou-se os tubos na
vertical, em repouso, durante 10 minutos, com o objectivo de sedimentar a sílica
activada da solução da matrix de ligação, com o DNA adsorvido. Desprezou-se
aproximadamernte cerca de 500 l do sobrenadante. Ressuspendeu-se a matrix de
ligação sedimentada no tubo, com o restante sobrenadante e transferiu-se o conteúdo
para a coluna de filtração (SPINTM Filter), contida no kit indo a centrifugar a 20200 g,
durante 1 minuto. Removeu-se o conteúdo do tubo que contem a coluna, e procedeu-se
à adição do restante sobrenadante do tubo falcon, e nova centrifugação.
3) Lavagem: adicionou-se 500 l do reagente SEWS-M (sigla anglo-saxónica
para salt ethanol wash) à coluna de filtração, e centrifugou-se a 20200 g, durante 1
minuto. Descartou-se o tubo com o filtrado, colocou-se a coluna num tubo colector e
submeteu-se a uma nova centrifugação à mesma velocidade, durante 2 minutos, de
modo a eliminar resíduos da solução de lavagem. A coluna foi colocada num microtubo
novo, e deixada a secar, à temperatura ambiente, durante 5 minutos.
4) Eluição de DNA: ressuspendeu-se a sílica activada com o DNA adsorvido, na
coluna, em 50 l do reagente DES (sigla anglo-saxónica para DNA elution solution
ultra-pure water), incubando-se a 60ºC, durante cinco minutos, no aparelho Block
Heater, de forma a facilitar a eluição do DNA. Esta é considerada a temperatura ideal
para que ocorra uma boa eluição do DNA da sílica para o DES. Submeteu-se a coluna,
no microtubo a uma última centrifugação a 20200 g, durante 1 minuto. Descartou-se a
coluna. Os microtubos com as amostras de DNA em solução aquosa foram devidamente
guardados a –20ºC.
A utilização dos reagentes incluidos no kit de extracção, tais como a matriz de
sílica, o SEWS-M e o DES, permitem eliminar uma grande quantidade de
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 136 -
contaminantes e de moléculas que podem provocar interferências no decorrer da
experimentação.
5. DIAGNÓSTICO MOLECULAR DAS ESPÉCIES ENTEROCYTOZOON BIENEUSI,
ENCEPHALITOZOON INTESTINALIS, ENCEPHALITOZOON CUNICULI,
ENCEPHALITOZOON HELLEM E VITTAFORMA-LIKE
As tecnologias de biologia molecular, em especial a PCR, descrita pela primeira
vez em meados dos anos 80 por Saiki e colaboradores [Saiki et al. 1985] têm vindo a
ganhar um relevo crescente no âmbito das técnicas de diagnóstico clínico e
epidemiológico nas várias vertentes da parasitologia Médica e Veterinária. A
simplicidade, rapidez e economia, permitindo a obtenção de um largo número de cópias
de DNA a partir de quantidades diminutas de ácidos nucleicos, mesmo em presença de
DNA de baixa qualidade, são características que tornam a PCR um instrumento de
trabalho particularmente aliciante relativamente às técnicas convencionais.
A técnica de PCR baseia-se no desenho de primers específicos em regiões
genómicas conhecidas e em protocolos criteriosamente estabelecidos. Sumariamente, a
PCR consiste num método in vitro para a síntese enzimática de sequências específicas
de DNA, utilizando um par de oligonucleótidos iniciadores (primers) que flanqueiam a
região de interesse no DNA alvo em locais opostos das cadeias complementares. A
amplificação exponencial do fragmento específico, cujas terminações são delimitadas
pelas extremidades 5’ dos primers resulta de uma série de ciclos repetitivos, incluindo a
desnaturação do DNA a temperaturas elevadas (91-97 ºC), a hibridação (annealing) dos
primers a temperaturas mais baixas (45-65 ºC) e a extenção destes pela DNA
polimerase (68-73 ºC) [Sachse & Frey 2003].
O sucesso de qualquer técnica de PCR em termos de sensibilidade e especificidade
é determinado por diversos factores críticos, como a concentração de Mg2+, os
desoxirribonucleótidos (dNTPs), a polimerase na mistura de reacção, as condições de
amplificação e, sobretudo, pelo desenho dos primers.
Para os microsporídios no geral, e em particular, para os potencialmente
patogénicos para o homem, é reduzido o número de sequências genéticas conhecidas,
acessíveis para aplicação das técnicas de biologia molecular.
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 137 -
A região genómica que codifica para o RNA dos ribossomas contém genes
funcionais e conservados em termos evolutivos separados por regiões não codificantes e
por regiões intergénicas que ligam as diferentes unidades genicas. O espaço entre
regiões codificantes dos genes rRNA (ITS) é particularmente útil para a discriminação
dos organismos ao nível da espécie e do género, porque a taxa de acumulação de
mutações nesta região aproxima-se muitas vezes da taxa de especiação, razão pela qual
muitas das estratégias de identificação e caracterização molecular, por PCR, dos
microsporídios se baseiam na amplificação desta região do genoma [Weiss &
Vossbrinck 1999]. A informação genética disponível para a maioria dos microsporídios
corresponde às sequências do gene da SSU rRNA. Por outro lado, também a
caracterização intra-específica, só é possivel para algumas espécies de microsporídios,
devido à existência de um número limitado de marcadores genéticos: a região ITS
rRNA, pode apresentar desde um elevado grau de polimorfismo, como o que se verifica
na espécie E. bieneusi, ou não ser detectada qualquer variabilidade genética como se
encontra descrito para E. intestinalis.
No presente estudo, após pesquisa bibliográfica, o diagnóstico molecular das
espécies de microsporidia em estudo consistiu na amplificação e detecção de um
segmento de DNA específico (SSU rRNA ou fragmento contendo uma região parcial da
SSU, a totalidade da ITS e, uma região parcial da LSU rRNA), através das técnicas de
PCR e PCR nested, após extracção do DNA genómico do microrganismo. Em termos
práticos a PCR nested consiste numa primeira reacção com um par de primers iniciais,
cujo amplicão constituirá o DNA molde para uma segunda reacção PCR a realizar com
primers desenhados para o interior da sequência inicialmente amplificada; técnica mais
sensível e específica comparativamente à PCR simples.
As reacções de PCR, efectuadas no presente estudo, sofreram alguns ajustes, em
relação ao descrito pelos autores referenciados, nomeadamente, ao nível da temperatura
de ligação, dos tempos de ligação e de extensão, da concentração de cloreto de
magnésio (MgCl2) e de primers e/ou da concentração da enzima DNA polimerase.
Para cada gene estudado, foram seleccionados três isolados pertencentes a cada
uma das espécies de microsporídios identificadas, nos quais, para confirmação do
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 138 -
resultado da análise da PCR, se procedeu à sequenciação dos fragmentos amplificados
por este método.
5.1. AMPLIFICAÇÃO DE DNA GENÓMICO DE MICROSPORÍDIOS NO GERAL
A identificação, pela técnica de PCR, de microsporídios no geral, onde se incluem
as quatro principais espécies patogénicas para o homem, é baseada na amplificação do
gene que codifica o RNA da pequena subunidade do ribossoma (SSU rRNA). Para a
identificação molecular de isolados de microsporídios, de amostras em que houve
detecção parasitológica de esporos, mas em que não foi possível, a amplificação pelas
outras técnicas de PCR adoptadas neste estudo, foram utilizados os seguintes primers,
previamente descritos [Raynaud et al. 1998] e designados na literatura, por pan-
específicos, por permitirem a detecção de diversas espécies de microsporidia (Quadro
XXII)
Quadro XXII. Sequências dos primers pan-específicos utilizados na amplificação do
gene SSU rRNA de microsporídios por PCR, e suas características (dimensão do
oligonucleótido, temperatura de hibridação, designada por TA, conteúdo em GC e
tamanho do fragmento de amplificação para as quatro espécies mais frequentes
infectantes para o homem).
PRIMERS
SEQUÊNCIA (5’→3’)
DIMENSÃO
(pb)
GC
(%)
Ta
(ºC)
AMPLICÃO
(pb)
C1 CACCAGGTTGATTCTGCC 18 56 50 Eb 1170 C2 GTGACGGGCGGTGTCTAC 18 67 55 Ec 1190
Eh1205 Ei1186
As reacções de amplificação dos genes ribossomais, foram realizadas num volume
final de 25 μl, contendo, a mistura de amplificação 1× tampão de reacção (16 mM
(NH4)2SO4, 67 mM Tris-HCL [pH 8,8], 0,01% tween-20; Bioline), 0,8 mM de uma
mistura de dNTPs (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) (Applied Biosystems), 0,2 μM de cada
primer (C1 e C2; MWG Biotech), 2,5 mM de cloreto de magnésio (MgCl2) (Bioline),
0,75 U de BiotaqTM DNA polimerase (Bioline), 0,01 μg/μl de albumina sérica bovina
(BSA, sigla anglo-saxónica para bovine serum albumin) (SIGMA), entre 2 a 8 μl de
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 139 -
DNA genómico, obtido após extracção pelo método do FastDNA® SPIN Kit for Soil, e
água desionizada estéril, para perfazer o volume final da reacção. Em cada reacção de
PCR foi incluído um tubo com uma amostra de DNA de microsporídio em condições
óptimas de qualidade e concentração, para funcionar como controlo positivo da mistura
reaccional, e um controlo negativo, como indicador da inexistência de contaminação por
DNA exógeno onde, no lugar do DNA, foi adicionada água desionizada estéril.
As reacções de amplificação foram realizadas num termociclador (T1
Thermocycler; Biometra) tendo, em todas elas, o passo de desnaturação inicial sido a 95
ºC durante 10 minutos e o de extensão final a 72 ºC durante 10 minutos. No Quadro
XXIII encontram-se descritas as restantes condições de amplificação para o locus
estudado.
QUADRO XXIII. Condições de amplificação do DNA, para o gene da SSU rRNA.
CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO Nº CICLOS
Desnaturação 95 ºC, 1 min
40 Ligação 56 ºC, 1 min
Extensão 72 ºC, 1 min
5.2. AMPLIFICAÇÃO DE DNA GENÓMICO DE ENCEPHALITOZOON INTESTINALIS,
ENCEPHALITOZOON CUNICULI, ENCEPHALITOZOON HELLEM.
A identificação, pela técnica de PCR, das espécies E. intestinalis, E. cuniculi e E.
hellem, é baseada na amplificação do gene que codifica o RNA da pequena subunidade
do ribossoma SSU rRNA. Para a identificação molecular ao nível da espécie, foram
utilizados os seguintes primers: SINTF1/SINTR1, específico para E. intestinalis
[Visvesvara et al. 1995; da Silva et al. 1997]; ECUNF/ECUNR específico para E.
cuniculi [Visvesvara et al. 1994]; EHELF/EHELR específico para E. hellem
[Visvesvara et al. 1994] (Quadro XXIV).
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 140 -
Quadro XXIV- Sequências dos primers utilizados na amplificação do gene SSU rRNA
de E. intestinalis, E. cuniculi e E. hellem, por PCR, e suas características (dimensão do
oligonucleótido, temperatura de hibridação, designada por TA, conteúdo em GC e
tamanho do fragmento de amplificação).
PRIMERS SEQUÊNCIA (5’→3’)
DIMENSÃO
(pb)
GC
(%)
Ta
(ºC)
AMPLICÃO
(pb)
SINTF1 TTTCGAGTGTAAGGAGTCGA 20 45 50 520 SINTR1 CCGTCCTCGTTCTCCTGCCCG 21 71 62 ECUNF ATGAGAAGTGATGTGTGTGCG 21 48 52 549 ECUNR TGCCATGCACTCACAGGCATC 21 57 66 EHELF TGAGAAGTAAGATGTTTAGCA 21 33 47 547 EHELR GTAAAAACACTCTCACACTCA 21 38 49
A técnica de PCR comporta determinadas componentes e condições reaccionais
indispensáveis. Assim, por cada amostra, preparou-se uma mistura de amplificação
contendo 1x tampão de reacção (16 mM (NH4)2SO4, 67 mM Tris-HCL [pH 8,8], 0,01%
tween-20; Bioline), 0,8 mM de uma mistura de dNTPs (dATP, dCTP, dGTP e dTTP)
(Applied Biosystems), 0,2 μM de cada primer (SINTF1 e SINTR1, ECUNF e ECUNR,
EHELF e EHELR; MWG Biotech), 2,5 mM de cloreto de magnésio (MgCl2)
(Bioline), 0,75 U de BiotaqTM DNA polimerase (Bioline), 0,01 μg/μl de BSA (SIGMA),
entre 2 a 8 μl de DNA genómico, obtido após extracção pelo método do FastDNA®
SPIN Kit for Soil, e água desionizada estéril, para perfazer o volume final de 25 μl.
Para monitorizar a qualidade dos resultados, em cada ensaio de amplificação,
foram incluídos, um controlo positivo (suspensão de DNA da espécie de microsporídio
em estudo) e um controlo negativo (água desionizada estéril), substituindo, nas
respectivas reacções, os 2 μl de DNA genómico das amostras. As componentes térmicas
da reacção, descritas no QuadroXXV, foram aplicadas num termociclador (T1
Thermocycler; Biometra), onde decorreu a amplificação do DNA.
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 141 -
QUADRO XXV. Condições de amplificação do DNA, para o gene estudado.
CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO Nº CICLOS
Desnaturação 95 ºC, 30 seg.
30 Ligação* 55 ºC, 30 seg
Extensão 72 ºC, 1 min
* Para E. intestinalis a temperatura de ligação é de 45 ºC. 5.3. AMPLIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE DNA GENÓMICO DE
ENTEROCYTOZOON BIENEUSI
5.3.1. Amplificação de DNA genómico de Enterocytozoon bieneusi.
A amplificação de um fragmento que contem parte da região SSU, a totalidade
da região ITS, e parte da LSU do gene rRNA de E. bieneusi foi efectuada através de
PCR nested. No Quadro XXVI encontram-se descritas as sequências dos primers
utilizados.
Quadro XXVI. Sequências dos primers (AL4037/AL4039 e AL4038/AL4040)
utilizados na amplificação do fragmento que contem parte da região SSU, a totalidade
da região ITS e parte da LSU rRNA, de E. bieneusi por PCR nested e suas características
(dimensão do oligonucleótido, temperatura de hibridação, designada por TA, conteúdo
em GC e tamanho do fragmento de amplificação).
PCR PRIMERS SEQUÊNCIA (5’→3’)
DIMENSÃO
(pb)
GC
(%)
Ta
(ºC)
AMPLICÃO
(pb)
1ª Parte
AL 4037 GATGGTCATAGGGATGAAGAGCTT 24 46 56 410 AL4039 TATGCTTAAGTCCAGGGAG 19 47 49 2ª
Parte AL 4038 AGGGATGAAGAGCTTCGGCTCTG 23 57 59 392 AL4040 AGTGATCCTGTATTAGGGATATT 23 35 50
O procedimento de amplificação da região alvo foi efectuado num volume de 50
μl, contendo a mistura reaccional da primeira PCR, 5 μl de 10× tampão de reacção (160
mM (NH4)2SO4, 670 mM Tris-HCl [pH 8,8], 0,1% Tween-20) (Bioline), 1,5 mM de
MgCl2 (Bioline), 0,8 mM de uma mistura de dATP, dCTP, dGTP e dTTP (Promega),
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 142 -
10 pmol de cada primer (MWG Biotech), 0,02 mg de BSA (SIGMA), 1,5 U de
Biotaq™ DNA Polymerase (Bioline), entre 5 a 10 μl de DNA genómico e água
desionizada estéril, para perfazer o volume final. A segunda PCR foi realizada com 3 μl
do DNA amplificado na primeira reacção, sendo a mistura reaccional igual à primeira,
com excepção da BSA, que foi excluída.
Em cada reacção de PCR foi incluído um tubo controlo positivo contendo uma
amostra de DNA de E. bieneusi e um controlo negativo (no lugar do DNA, foi
adicionada água desionizada estéril) .
As reacções de amplificação foram efectuadas num termociclador GeneAmp
PCR System 9700, tendo, em todas, o passo de desnaturação inicial sido de cinco
minutos a 95ºC e o de extensão final de 10 minutos a 72ºC. No Quadro XXVII estão
descritas as restantes condições de amplificação dos fragmentos da região SSU, ITS LSU
do rRNA.
Quadro XXVII. Condições de amplificação do DNA, para a região do gene estudado.
CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO Nº CICLOS
Desnaturação 95ºC, 50 seg.
30 Ligação 55ºC, 30 seg
Extensão 72ºC, 30 seg
A amplificação, por PCR, efectuada segundo este procedimento, nas condições
já descritas foi utilizada apenas para um grupo de amostras, caracterizadas na Division
of Parasitic Diseases, CDC, Atlanta, EUA, pela autora e que compreendeu 20 isolados
de E. bieneusi de origem humana e 32 de origem animal.
5.3.2 Desenvolvimento e optimização de uma nova técnica de PCR nested
Durante o início do trabalho foram sentidas algumas dificuldades práticas com a
primeira técnica de PCR usada para a detecção e amplificação da região ITS do gene
rRNA de E. bieneusi, nomeadamente a nível de sensibilidade e da posterior
sequenciação dos produtos amplificados.
Com o objectivo de ultrapassar estes obstáculos foi desenvolvida uma nova PCR
nested, em que foram desenhados primers tendo como alvos específicos a amplificação
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 143 -
e posterior sequenciação da referida região ITS rRNA, com recurso às diversas
sequências descritas para E. bieneusi na base de dados do GeneBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=pubmed) utilizando-se o programa
bioinformático Primer 3.0 Program (versão 0.4.0), disponível on-line
(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3.cgi). A escolha dos primers para
amplificação das regiões de interesse, obedeceu a critérios gerais e empíricos, descritos
na bibliografia existente e de programas de desenhos de primers, que incluíram, as
dimensões das sequências oligonuclotídicas, as características conservadas das zonas de
ligação (annealing), a temperatura de hibridação, o conteúdo CG, a ausência de
estruturas secundárias e de dímeros de primers. Estes primers foram desenhados para
uma temperatura de hibridação de 61,5ºC, tendo sido sintetizados pela MWG Biotech
Quadro XXVIII.
Quadro XXVIII. Sequências dos primers (MLLF1/MLLR1 e MLLF2/MLLR2) utilizados
na amplificação do fragmento que contem parte da região SSU, a totalidade da região
ITS e parte da LSU rRNA, de E. bieneusi por PCR nested, e suas características
(dimensão do oligonucleótido, temperatura de hibridação, designada por TA, conteúdo
em GC e tamanho do fragmento de amplificação).
PCR PRIMERS SEQUÊNCIA (5’→3’)
DIMENSÃO
(pb)
GC
(%)
Ta
(ºC)
AMPLICÃO
(pb)
1ª Parte
MLLF1 CGCCCGTCACTATTTCAGAT 20 50 52 514 MLLR1 GCTTAAGTCCAGGGAGTATCCA 22 50 55 2ª
Parte MLLF2 AGTCGTAACAAGGTTTCAGTTGG 23 43 53 386 MLLR2 GGACTTTTCGCATTCTTTCG 20 45 50
Optimizaram-se as reacções de PCR, para os amplicões, para um volume
reacional de 25 μl, contendo 1× tampão de reacção (16 mM (NH4)2SO4, 67 mM Tris-
HCL [pH 8,8], 0,01% tween-20; Bioline), 0,8 mM de uma mistura de dNTPs (dATP,
dCTP, dGTP e dTTP) (Applied Biosystems), 0,2 μM de cada primer (MLLF1 E
MLLR1 na 1ª parte; MLLF2 e MLLR2 na 2ª parte; MWG Biotech), 2,5 mM de cloreto
de magnésio (MgCl2) (Bioline), 0,75 U de BiotaqTM DNA polimerase (Bioline), 0,01
μg/μl de BSA (SIGMA), 2 μl de DNA genómico, obtido após extracção pelo método do
FastDNA® SPIN Kit for Soil, e água desionizada estéril, para perfazer o volume final de
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 144 -
25 μl. A segunda PCR foi realizada com 4 μl do DNA amplificado na primeira reacção,
sendo a mistura reaccional igual à primeira, com excepção da BSA, que foi excluída.
Em cada reacção de PCR foi incluído um tubo com uma amostra de DNA de E.
bieneusi em condições óptimas de qualidade e concentração, para funcionar como
controlo positivo da mistura reaccional e um controlo negativo, como indicador da
inexistência de contaminação por DNA exógeno onde, no lugar do DNA, foi adicionada
água desionizada estéril.
As reacções de amplificação foram realizadas num termociclador (T1
Thermocycler; Biometra) e submetidas ao passo de desnaturação inicial a 95 ºC durante
cinco minutos e o de extensão final a 72 ºC durante 10 minutos. No Quadro XXIX
estão descritas as restantes condições de amplificação para o locus estudado.
Quadro XXIX. Condições de amplificação do DNA, para o gene estudado.
CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO Nº CICLOS
Desnaturação 95ºC, 50 seg.
30 Ligação 55ºC, 30 seg
Extensão 72ºC, 30 seg
A nova metodologia desenvolvida confirmou que os primers desenhados para todo
o sistema testado apresentaram uma elevada sensibilidade e especificidade molecular
para a amplificação e sequenciação do fragmento com 386pb do DNA alvo de E.
bieneusi permitindo uma adequada detecção e caracterização genética dos isolados
obtidos durante o estudo.
5.3.3. Caracterização génetica dos isolados de Enterocytozoon bieneusi.
A disponibilidade e facilidade de utilização de técnicas de biologia molecular
possibilitaram a sua utilização na descoberta e aperfeiçoamento de marcadores
moleculares para a caracterização intra-específica.
Até à data, a região ITS rRNA constitui o único marcador genético disponível para
a caracterização de genótipos de E. bieneusi. A sequência nucleotídica desta região,
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 145 -
apresenta uma elevada heterogeneidade discriminativa entre os isolados desta espécie de
microsporidia.
A avaliação da variabilidade intra-específica da região ITS rRNA, foi realizada
através da amplificação, por reacção de PCR nested, seguida de sequenciação,
alinhamento das sequências obtidas e construção de uma árvore filogenética, que
permitiu visualizar a distribuição dos diferentes genótipos da região ITS rRNA, nos
isolados de E. bieneusi de origem humana, animal e ambiental.
Esta componente do presente trabalho foi inicialmente realizada, pela autora, na
Division of Parasitic Diseases, CDC, Atlanta, EUA, em particular a amplificação e
sequenciação da região ITS rRNA num grupo de 52 isolados de humanos e de outros
animais e toda a análise bioinformática das sequências obtidas. A amplificação, por
PCR, do fragmento alvo, foi efectuada no CDC, segundo o procedimento 2.4.3.1, nas
condições já descritas.
Os restantes isolados foram amplificados e caracterizados na Unidade de
Protozoários Oportunistas/VIH e outras Protozooses, no Instituto de Higiene e Medicina
Tropical, recorrendo ao procedimento 2.4.3.2, nas condições descritas.
5.4. CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE UMA NOVA ESPÉCIE DE MICROSPORÍDIO -
VITTAFORMA-LIKE
5.4.1 Detecção da espécie Vittaforma-like
A detecção de uma nova espécie de microsporídio em amostras fecais de
humanos em Portugal, resultou de conjunto de estudos que envolveram técnicas
parasitologicas e moleculares, e duas equipas de investigação. A observação por
microscopia óptica e de fluorescência de estruturas compatíveis com esporos de
microsporidia em amostras fecais de seropositivos e seronegativos para VIH, mas em
que não era possivel obter amplificação por diversos protocolos de PCR, suscitou o
interesse à equipa de investigação na qual a autora deste trabalho se encontra integrada.
Após vários esforços e em colaboração com a equipa do CDC, foi possível a
identificação de uma nova espécie de microsporídio. A caracterização genética da SSU
rRNA, foi efectuada com recurso à técnica de PCR e a sequenciação conforme descrito
por Sulaiman e colaboradores [Sulaiman et al. 2003c]. A análise dos resultados permitiu
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 146 -
verificar que esta espécie apresenta 96% de homologia genética para a referida região
com a espécie V. cornea descrita na córnea de humanos.
Até à data não foi possivel a caracterização ultraestrutural deste microsporídio,
mantendo por enquanto a nomenclatura provisória de Vittaforma-like.
5.4.2. Amplificação de DNA genómico de Vittaforma-like
Com o objectivo de detecção da espécie Vittaforma-like foi desenvolvida uma
PCR nested, em que foram desenhados primers tendo como alvo específico a
amplificação e posterior sequenciação da SSU rRNA, com recurso às sequências
descritas para esta espécie na base de dados do GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=pubmed) utilizando-se o programa
bioinformático Primer 3.0 Program (versão 0.4.0), disponível on-line
(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3.cgi). A escolha dos primers para
amplificação das regiões de interesse, obedeceu a critérios gerais e empíricos, descritos
na bibliografia existente e de programas de desenhos de primers. No Quadro XXX estão
descritas as restantes condições de amplificação para o locus estudado.
Quadro XXX. Sequências dos primers utilizados na amplificação do gene SSU rRNA,
de Vittaforma-like, por PCR nested, e suas características (dimensão do oligonucleótido,
temperatura de hibridação, designada por TA, conteúdo em GC e tamanho do fragmento
de amplificação).
PCR PRIMERS SEQUÊNCIA (5’→3’)
DIMENSÃO
(pb)
GC
(%)
Ta
(ºC)
AMPLICÃO
(pb)
1ª Parte
AL 4605 TAGTCGTAGGAAACGAAAC 19 42 47 ~600 AL 4607 TCTGTCTTGCTCGTTTCTA 19 42 47 2ª
Parte AL 4606 AGGGATGTGAAGTCTCGA 18 50 48 386 AL 4608 CACAACACTTGGCCCTGGTAAGT 23 52 57
O procedimento de amplificação da SSU rRNA foi efectuado num volume de 25
μl, contendo a mistura reaccional da primeira PCR, 1× tampão de reacção (16 mM
(NH4)2SO4, 67 mM Tris-HCL [pH 8,8], 0,01% tween-20; Bioline), 0,8 mM de uma
mistura de dNTPs (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) (Applied Biosystems), 0,2 μM de cada
primer (AL4605 e AL4607 na 1ª parte; AL4606 e AL4608 na 2ª parte; MWG Biotech),
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 147 -
2,5 mM de cloreto de magnésio (MgCl2) (Bioline), 0,75 U de BiotaqTM DNA
polimerase (Bioline), 0,01 μg/μl de BSA (SIGMA), 2 μl de DNA genómico, obtido após
extracção pelo método do FastDNA® SPIN Kit for Soil, e água desionizada estéril, para
perfazer o volume final de 25 μl. A segunda PCR foi realizada com 4 μl do DNA
amplificado na primeira reacção, sendo a mistura reaccional igual à primeira, com
excepção da BSA, que foi excluída.
Em cada reacção de PCR foi incluído um tubo com uma amostra de DNA de E.
bieneusi em condições óptimas de qualidade e concentração, para funcionar como
controlo positivo da mistura reaccional, e um controlo negativo, como indicador da
inexistência de contaminação por DNA exógeno onde, no lugar do DNA, foi adicionada
água desionizada estéril.
As reacções de amplificação foram efectuadas num termociclador (T1
Thermocycler; Biometra), tendo, em todas, o passo de desnaturação inicial sido de cinco
minutos a 95ºC e o de extensão final de 10 minutos a 72ºC. No Quadro XXXI estão
descritas as restantes condições de amplificação dos fragmentos da região SSU rRNA.
Quadro XXXI – Condições de amplificação do DNA, para o gene estudado.
CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO Nº CICLOS
Desnaturação 95ºC, 50 seg.
30 Ligação 55ºC, 45 seg.
Extensão 72ºC, 1 min.
5.5. VISUALIZAÇÃO DO DNA AMPLIFICADO
A electroforese através de uma matriz de gel de agarose é considerada o método
mais simples e económico para determinar a eficiência da amplificação e o tamanho dos
fragmentos gerados durante a reacção de amplificação. Os produtos de PCR são
carregados em poços moldados durante a preparação do gel e de seguida aplica-se um
campo eléctrico para separar os amplicões. A deposição de produtos de PCR é
conseguida através da adição de um tampão de aplicação. Este contem bromofenol,
permitindo visualizar a migração do DNA no gel. A distância percorrida pelo DNA
depende do peso molecular dos fragmentos, da concentração da agarose, do tampão
utilizado e da concentração de brometo de etídio. O peso molecular dos fragmentos
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 148 -
gerados pode ser estimado por comparação com um marcador de tamanho de
fragmentos (pb). O brometo de etídio é um corante que se liga exclusivamente ao DNA
de cadeia dupla dos ácidos nucleicos. Quando exposto à luz ultravioleta, o brometo de
etídio emite fluorescência que pode ser visualizada e registada com o auxílio de um
sistema de captação de imagem [Newton 1995].
Os fragmentos de DNA amplificados, por PCR, foram submetidos a
electroforese em gel de agarose SeaKem® LE (FMC BioProducts) a 1,5% em tampão
TAE (Tris-Acetato 0,04 M; EDTA 0,001 M; pH 8,3), onde foi incorporado brometo de
etídio (SIGMA), numa concentração final de 0,5 μg/ml. A 19 μl de produto de reacção,
adicionou-se 1 μl de tampão de aplicação (Fermentas). Da mesma forma, a 1 μl de
marcador molecular (Gene RulerTM 100 pb; Fermentas), adicionou-se 1 μl de tampão de
aplicação e 9 μl de água desionizada estéril. Aplicaram-se as amostras nos respectivos
poços e, a separação electroforética foi efectuada a 60 volts (V), durante,
aproximadamente, uma hora. Os fragmentos de DNA amplificados foram visualizados,
por acção de luz ultravioleta, num transiluminador (ECX-20.M; Vilber Lourmat). Os
resultados foram registados com uma máquina fotográfica digital do sistema de
aquisição de imagem incorporado ao transiluminador (PowerShot A710 IS; Canon).
6. PURIFICAÇÃO E SEQUENCIAÇÃO DOS FRAGMENTOS AMPLIFICADOS POR
PCR. Os produtos de PCR contêm sais, primers e dDNTPs não incorporados, que
podem condicionar o sucesso da reacção de sequenciação, sendo necessário, antes da
sua realização, proceder à remoção dos referidos compostos.
O procedimento adoptado com o propósito de sequenciar os fragmentos das
regiões alvo, amplificados por PCR, foi distinto para as amostras estudadas no CDC e
no Instituto de Higiene e Medicina Tropical.
O trabalho desenvolvido no CDC foi realizado conforme a descrição que se
segue. Os fragmentos da região SSU ITS LSU do gene rRNA de E. bieneusi
amplificados, na segunda reacção, da PCR nested, foram purificados através do
Microcon-PCRCentrifugal Filter Devices (Amicon, Millipore), conforme as instruções
do fabricante: a um filtro (Amicon, Millipore) colocado num microtubo de 1,5 ml
(Amicon, Millipore), foram adicionados 460 l de água desionizada estéril e o produto
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 149 -
de PCR a purificar. Depois de fechado, o tubo com o filtro foi a centrifugar a 1.000 g,
durante 15 minutos. Em seguida, foram adicionados ao filtro 20 l de água desionizada
estéril, pré-aquecida a 70ºC. Após um minuto de repouso, à temperatura ambiente, o
filtro foi invertido, colocado num novo microtubo e centrifugado a 1.000 g, durante dois
minutos. Por fim, o filtro foi eliminado e o tubo com o produto de PCR purificado
armazenado a –20ºC.
Relativamente à metodologia de sequenciação, adoptada para os fragmentos
amplificados e purificados, no CDC, foram realizadas duas reacções de sequenciação,
uma no sentido directo e outra no sentido reverso. O protocolo deste procedimento é
descrito em seguida. Em cada uma das 96 reacções foi utilizado, apenas, um dos
primers (AL4038 ou AL4040), resultando na amplificação de apenas uma das cadeias
do DNA alvo. A reacção de sequenciação foi preparada, segundo o método ABI
PRISM®
BigDyeTM
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit” (Applied
Biosystems). Em cada mistura reaccional foram adicionados 4 l de Terminator Ready
Reaction Mix, composta por quatro didesoxirribonucleótidos terminadores marcados
com quatro fluorocromos diferentes (A-Dye Terminator, C-Dye Terminator, G-Dye
Terminator e T-Dye Terminator), quatro dNTPs (dATP, dCTP, dITP e dUTP),
AmpliTaq DNA Polymerase FS, MgCl2, e Tris-HCl buffer, pH 9.0 (Applied
Biosystems), 4 l de 5xtampão de sequenciação (Applied Biosystems), 1,5 l de
produto de PCR purificado, 2 l de um dos primers e água desionizada estéril para
completar um volume final de 20 l. As reacções de sequenciação foram realizadas num
termociclador (GeneAmp PCR System 9700; Perkin Elmer), durante 25 ciclos de 10
segundos a 96ºC, cinco segundos a 50ºC e quatro minutos a 60ºC.
Os produtos de sequenciação foram, posteriormente, purificados de sais e dos
primers, ddNTPs terminadores e dNTPs não incorporados que interferem com a
electroforese capilar. Para tal, foi utilizado o protocolo comercial (Centri-Sep Columns;
Princeton Separations), de acordo com a descrição que se segue: para hidratar a resina
da coluna, foram-lhe adicionados 800 l de água desionizada estéril e, após forte
agitação, esta foi deixada a repousar durante uma hora, à temperatura ambiente. Depois,
retiraram-se as tampas superior e inferior da coluna que foi, em seguida, colocada num
tubo de recolha a eluir, durante 15 minutos. Após eliminação do eluído, foi efectuada
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 150 -
uma centrifugação de três minutos a 750 g e a coluna foi transferida para um microtubo
de 1,5 ml. O produto da sequenciação foi adicionado à coluna, tendo, em seguida, sido
realizada nova centrifugação a 750 g, durante três minutos. Por fim, a coluna foi
eliminada e o eluído concentrado num Vacufuge Concentrator 5301 (Eppendorf), até
completa evaporação do solvente. Os produtos de sequenciação purificados e
concentrados foram ressuspendidos em 15 l de formamida ABI PRISM® Hi-Di™
(Applied Biosystems). Em seguida, foram colocados numa microplaca (MicroAmp®
Optical 96-well Reaction Plate; Applied Biosystems), tapados com uma tampa (96-Well
Septa; Applied Biosystems), submetidos a 94ºC, durante três minutos, num
termociclador (GeneAmp PCR System 9700; Perkin Elmer) e, de imediato, congelados
a –20ºC.
A resolução dos produtos de sequenciação foi realizada num sequenciador
automático (ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer; Applied Biosystems), por
electroforese capilar, numa matriz de polímero POP4™ (Applied Biosystems). A
recolha e o processamento dos resultados da electroforese foi efectuada pelos programas
ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer Data Collection Software e DNA Sequencing
Analysis Software (Applied Biosystems). Os cromatogramas, com as sequências directa
e reversa, de cada fragmento sequenciado, foram comparados, através do programa
AutoAssembler 2.0 (Applied Biosystems) e, após a correcção manual de alguns erros
nas sequências directa e/ou reversa, foi obtida uma sequência consenso, para cada
fragmento amplificado.
Na Unidade de Protozoários Oportunistas/VIH e Outras Protozooses do Instituto
de Higiene e Medicina Tropical, os produtos de amplificação das PCR realizadas para
submeter à técnica de sequenciação, foram purificados, através do protocolo comercial
(JETQUICK PCR Product Purification Spin kit; Genomed), que permite a remoção
rápida de impurezas e de contaminantes de produtos de PCR, após corrida
electroforética em gel de agarose. No caso das PCR nested, foram purificados os
produtos da segunda reacção.
De acordo com as instruções do fabricante, o referido protocolo consiste em
quatro passos definidos:
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 151 -
1) Solubilização da agarose: cortam-se, cuidadosamente, as regiões do gel de agarose,
correspondentes às bandas com as dimensões pretendidas, excluindo as moléculas de
tamanho indesejado, o que permite, desde logo, a eliminação de dímeros de primers e
de outros produtos inespecíficos. As porções de gel de agarose são colocadas em
microtubos de 1,5 ml. De acordo com o fabricante, por cada 100 mg de gel, adicionam-
se, proporcionalmente, 300 l da solução L1. A mistura vai a incubar a 50ºC durante 30
minutos, agitando-se vigorosamente, em intervalos de 10 minutos. A solução L1 contém
percloreto de sódio, um agente que, quando utilizado em elevadas concentrações,
remove complexos proteicos presentes em solução, acetato de sódio, cuja acção visa
precipitar os ácidos nucleicos em solução, e Tris-Borato-EDTA (TBE), um tampão que,
em conjunto com o aumento da temperatura, auxilia na solubilização da agarose.
2) Adsorção: a adsorção do DNA é realizada numa coluna específica (JETQUICK spin
column; Genomed), que é colocada num tubo colector de 2 ml e para onde se transfere a
mistura (aproximadamente 400 l). Esta coluna possui uma matriz de sílica que é um
material com alta afinidade para as moléculas de DNA, carregadas negativamente.
Centrifuga-se à velocidade máxima (23100 g), durante um minuto, sendo que no final se
descarta o tubo com o filtrado.
3) Lavagem: esta etapa consiste na remoção de contaminantes, onde se volta a colocar
a coluna num tubo colector de 2 ml, adicionando-se 500 l de solução H2. A solução
H2 é composta por EDTA, um forte agente quelante, aplicado para aprisionar iões
monovalentes, Tris-HCl, um tampão que auxilia na manutenção do pH, funcionando
como agente estabilizador da solução, etanol, que funciona como um forte solvente
orgânico, e cloreto de sódio, utilizado para manter e estabilizar as cargas iónicas. Volta-
se a centrifugar à velocidade máxima, durante um minuto. Despreza-se o filtrado,
coloca-se novamente a coluna no tubo colector e promove-se nova centrifugação, igual
à anterior, descartando-se, no final, o tubo com o filtrado. Esta segunda centrifugação
tem por objectivo remover a totalidade do etanol, composto orgânico considerado como
um contaminante limitante da reacção de sequenciação.
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 152 -
4) Eluição do DNA: coloca-se a coluna num microtubo de 1,5 ml e adicionam-se 50 l
de água desionizada estéril, pré-aquecida no aparelho Block Heater (Stuart Scientific) a
60ºC. A água deve ser vertida no centro da matriz de sílica, de forma a ter uma
distribuição uniforme e a solver o máximo de moléculas de DNA. Centrifuga-se à
velocidade máxima, durante dois minutos e no final recupera-se o filtrado com o DNA
purificado, conservando-o a -20ºC. O controlo de qualidade da purificação é realizado
através da técnica de electroforese em gel de agarose (1%).
Após a etapa de purificação, os produtos de PCR foram submetidos a
sequenciação directa, no Laboratório de Sequenciação da Macrogen (Seuol, Coreia do
Sul), num sequenciador automático (3730 XL DNA Analyser; Applied Biosystems)
com tecnologia de electroforese capilar em gel de poliacrilamida. Triplicados de todas
as sequências de DNA, foram determinadas em ambos os sentidos.
A análise das sequências nucleotídicas consenso obtidas foi efectuada,
recorrendo-se a programas de bioinformática específicos, como, o ChromasPro (versão
1.22, Technelysium Pty Ltd.), o BLAST (sigla do ango-saxónico para Basic Local
Alignment Search Tool) (versão 2.2) disponível no sítio do National Centre for
Biotechnology Information’s (www.ncbi.nlm.nih.gov) e o CLUSTAL W2 (versão
2.0.12) disponível no sítio do European Bioinformatics Institute (www.ebi.ac.uk).
6.1. ANÁLISE DA DIVERSIDADE GENÉTICA DA REGIÃO ITS RRNA DE E. BIENEUSI DE
ANIMAIS (MAMÍFEROS)
As sequências nucleotídicas da região ITS rRNA, obtidas para os isolados
identificados nos animais (cães, gatos e bovídeos), foram alinhadas com diversas
sequências de genótipos E. bieneusi disponíveis no GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/), para a mesma região, com recurso ao
programa CLUSTAL W2 (versão 2.0.12) disponível no sítio do European
Bioinformatics Institute (www.ebi.ac.uk). Através do programa MEGA 3.1 (Kumar et
al. 2004) e do método neighbour-joining, foi construída uma árvore filogenética, tendo
por base distâncias genéticas, calculadas pelo modelo de dois parâmetros de Kimura.
Como grupo externo (outgroup), foi utilizada a sequência do gene SSU rRNA mais
divergente reportada para Enterocytozoon sp. (GenBank AF059610), identificada num
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 153 -
cão. Os valores de confiança, para os ramos individuais da árvore, foram determinados
por análise de “bootstrap” com 1.000 réplicas.
7. ANÁLISE ESTATÍSTICA.
Considerando o número e a natureza das variáveis e o tipo de resposta
pretendida, o teste estatístico seleccionado foi o teste do Chi-Quadrado (χ2). Assim, o
teste χ2 foi aplicado para investigar a associação entre variáveis qualitativas, recorrendo-
se ao programa informático SPSS (sigla do anglo-saxónico para statistical package for
social sciences, (versão 16.0; SPSS Inc., Chicago, USA). Os dados foram agrupados em
tabelas de contingência de duas entradas e a análise foi efectuada com um intervalo de
confiança de 95%, de onde resultaram associações, estatisticamente significativas,
quando o valor de P foi inferior ou igual a 0,05.
II. MATERIAL E MÉTODOS
- 154 -
Capítulo III
DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE
MICROSPORIDIA EM HUMANOS
(SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
1. INTRODUÇÃO
Os microsporidia inicialmente reconhecidos como agentes patogénicos de
insectos e peixes, emergiram nas últimas décadas como um importante grupo de
microrganismos responsáveis por infecção no Homem, associada à pandemia da sida.
Apesar de pessoas imunocompetentes desenvolverem, geralmente, doença auto-
limitada, a infecção pode ser causa de morbilidade e mortalidade em imunossuprimidos,
especialmente em seropositivos para VIH. Diversos aspectos da epidemiologia das
infecções por microsporidia mantêm-se ainda por esclarecer. Todavia, o seu
conhecimento é de extrema importância, e só a determinação de prevalências
fidedignas, a identificação da(s) via(s) e da(s) fonte(s) de transmissão dos
microsporidíos possibilitará a definição de meios de prevenção e controlo da
microsporidiose.
Uma grande parte dos registos de microsporidiose, reportam-se a estudos
efectuados em países desenvolvidos, onde as infraestruturas de saúde e laboratórios
existentes conferem vantagem no diagnóstico e estudo destes parasitas, dispondo de
uma maior capacidade de resposta ao problema, relativamente aos países em vias de
desenvolvimento. No entanto a infecção humana por microsporidia, já foi reportada em
todos os continentes. Mantêm-se, porém, diversas lacunas, nomeadamente no que diz
respeito a estudos de prevalência desta doença, assentes numa amostragem exacta e
precisa. Outro dos problemas na caracterização epidemiológica das microsporidioses
está associado aos métodos de diagnóstico utilizados. De acordo com a localização
geográfica, o método de diagnóstico usado e a população estudada, a prevalência da
doença oscila entre 0% e 50% [Didier et al. 2004; Didier & Weiss 2006].
Inicialmente, o diagnóstico da microsporidiose humana constituía um processo
invasivo, com recurso a metodologia laboriosa como se verificava com a microscopia
electrónica aplicada a biópsias dos tecidos afectados. Hoje em dia, o diagnóstico pode
ser efectuado pela pesquisa directa dos esporos de microsporidia em amostras de fezes,
urina ou outros produtos biológicos (i.e. secrecções pulmonares, exsudado da conjuntiva
ou nasal). O diagnóstico destes microrganismos é dificultado por características
inerentes ao próprio parasita, como sejam as reduzidas dimensões e fraco poder tintorial
dos seus esporos. Face aos métodos clássicos de coloração utilizados, o
desenvolvimento e optimização de novas técnicas, vieram introduzir melhorias
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 158 -
consideráveis ao diagnóstico dos microsporídios. Embora ainda em número reduzido, a
caracterização total ou parcial do genoma de alguns microsporídios veio proporcionar o
desenvolvimento de metodologia molecular sensível, tais como a PCR, adicionando
vantagens acrescidas ao diagnóstico e diferenciação dos microsporidia, nomeadamente
das espécies responsáveis por infecção no Homem.
2. RESULTADOS
2.1 DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE MICROSPORÍDIOS EM AMOSTRAS FECAIS,
AMOSTRAS DE URINA E SECRECÇÕES PULMONARES DE DOENTES INFECTADOS POR
VIH.
2.1.1 Microsporidia em amostras fecais
Nos Quadros XXXII e XXXIII, encontram-se sumarizados os resultados da
distribuição das frequências de microsporidia, em relação à idade, género dos doentes,
serologia para VIH e presença ou ausência de diarreia dos doentes englobados no
estudo.
No total dos 856 doentes estudados, incluindo seropositivos e seronegativos para
VIH, através da técnica histoquímica do Gram-Chromotrope, foram detectados esporos
de microsporídios, em amostras de 152 doentes (17,8%). A percentagem de 33,7 %
correspondente a crianças com esporos identificados nas fezes foi superior à
percentagem de 13,5% observada de adultos. Este valor apresenta significância
estatística (ᵡ2=39,959; p≤0,001). Percentagens semelhantes de microsporídios nas fezes
foram encontradas entre elementos do sexo masculino (17,2%) e do sexo feminino
(18,9%) (Quadro XXXII). O número de doentes seropositivos para VIH com
microsporídios nas fezes foi superior ao número observado para os seronegativos para
VIH, 122 (21,7%) e 30 (10,2%) respectivamente (ᵡ2=17,744; p≤0,001). Este valor
apresenta também significância estatística. A presença de diarreia foi observada em
17,2% dos doentes com microsporídios nas fezes enquanto 18,5% não apresentava
quadro diarreico (Quadro XXXIII).
A carga parasitária determinada nas amostras fecais, estimada com base no
critério referido nos métodos (vide Capítulo II– Material e Métodos, pág 133.), oscilou
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 159 -
entre baixa e média. Nos Quadros XXXVI e XXXVII podem ser observadas as cargas
parasitárias registadas nas amostras dos doentes positivos para microsporidia pela
técnica do Gram-Chromotrope.
Os esporos apresentavam uma forma oval, com dimensões da ordem dos 1,0 e
2,5 m, de parede fina corada de rosa com uma pequena zona polar ou central não
corada (Figura 8).
Figura 8. Fotografia de esporos de microsporidia, em esfregaço fecal, corado por
Gram-Chromotrope. (×1000). Original da autora.
Do número total de doentes positivos para microsporídios pela técnica
parasitológica, em 49 doentes, apesar das diligências efectuadas nesse sentido, não foi
possível obter a confirmação do resultado pelas técnicas moleculares. Refira-se que
relativamente a estes doentes, sempre que existia amostra fecal disponível procedia-se
sempre a um adicional processo de extracção de DNA e a amostra era novamente
submetida aos protocolos da PCR em uso.
Assim, de entre os 856 doentes estudados e de acordo com o critério de
positividade adoptado no presente trabalho, a percentagem de resultados positivos foi de
12,0% (103/856). A percentagem de crianças positivas para microsporidia foi superior à
dos adultos, 18,8% e 10,2% respectivamente. Este valor apresenta significância
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 160 -
estatística (ᵡ2=9,886; p=0,002). Os doentes positivos para microsporidia correpondiam a
12,5% de doentes do sexo masculino e 11,1% do sexo feminino.
Relativamente à serologia para VIH verificou-se que 13,9% eram seropositivos e
8,5% eram seronegativos para VIH, sendo esta diferença de valores estatisticamente
significativa (ᵡ2=5,384; p=0,020).
A presença de diarreia foi observada em 13,4% dos doentes positivos para
microsporidia e 10,2% não manifestavam diarreia.
As técnicas de PCR, identificaram duas espécies de microsporídios nas amostras
fecais dos doentes estudados no presente trabalho. As espécies E. bieneusi e Vittaforma-
like foram identificadas em 6,3% (54/856) e 6,8% (58/856), respectivamente dos
doentes estudados (Figura 9)
Figura 9. Fotografias do gel de agarose dos produtos de PCR, após
electroforese. (A) Os produtos de amplificação da SSU ITS LSU do rRNA de E.
bieneusi apresentam uma banda com 392 pb; Nos poços 1 e 3 encontram os controlos
positivo e negativo respectivamente. No poço 2 encontra-se o produto de PCR de um
isolado de E. bieneusi, identificado numa amostra fecal. (B) Os produtos de
amplificação do gene da SSU rRNA apresentam uma banda com com 386 pb. Nos poços
1 e 3 encontram os controlos positivo e negativo respectivamente. No poço 2 encontra-
se o produto de PCR de um isolado de Vittaforma-like, identificado numa amostra fecal.
M- marcador de peso molecular (100 pb)
(A) (B)
392pb 386pb
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 161 -
Atente-se que, a discrepância que se observa entre a soma do número de casos
das duas espécies de microsporídios identificadas (112) entre os doentes e o valor de
doentes positivos para microsporidia determinado (103/856) é devida à existência de
nove doentes com infecção simultânea por ambas as espécies, e que embora
referênciados foram contabilizados separadamente na análise estatística dos resultados.
Entre os 54 doentes com E. bieneusi observou-se uma população de: 5,6%
adultos e 8,8% crianças; 6,7% de elementos do sexo masculino e 5,6% do sexo
feminino; 7,0% de seropositivos para VIH e 5,1% de seronegativos para VIH; 7,3% de
doentes com diarreia e 5,0% sem diarreia.
A espécie Vittaforma-like foi identificada numa percentagem de crianças
superior à dos adultos, 12,2% e 5,3%, respectivamente. Esta diferença de valores
apresenta significância estatística (ᵡ2=10,514; p=0,001). Ao contrário, frequências
semelhantes desta espécie foram observadas entre o sexo masculino (7,0%) e feminino
(6,3%). A percentagem de seropositivos para VIH infectados por Vittaforma-like foi
superior à dos seronegativos para VIH, 8,2% e 4,1% respectivamente. Também neste
caso observa-se uma diferença de valores estatisticamente significativa (ᵡ2=5,225;
p=0,022). A presença de diarreia foi registada em 7,5% dos doentes positivos para
Vittaforma-like e 5,8% dos doentes não apresentavam quadro diarreico.
Quadro XXXII. Distribuição das frequências de microsporidia, em relação à idade e
género dos doentes englobados no estudo.
GRUPO ETÁRIO GÉNERO
ADULTO
N=675
% (n)
CRIANÇA
N=181
% (n)
MASCULINO
N=586
% (n)
FEMININO
N=270
% (n)
MICROSPORIDIA
Pos por GC 13,5 (91) 33,7 (61)A
17,2 (101) 18,9 (51)
Pos* 10,2 (69) 18,8 (34)A
12,5 (73) 11,1 (30)
ESPÉCIES
E. bieneusi 5,6 (38) 8,8 (16) 6,7 (39) 5,6 (15)
Vittaforma-like 5,3 (36) 12,2 (22)A
7,0 (41) 6.3 (17)
Pos: positivos; GC: Gram-Chromotrope; Pos*: positivos segundo o critério de positividade adoptado no presente estudo; Niveis de significância: AP≤ 0,05
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 162 -
Quadro XXXIII. Distribuição das frequências de microsporidia, em relação à serologia
para VIH e presença ou ausência de diarreia, dos doentes englobados no estudo.
SEROLOGIA PARA VIH QUADRO CLÍNICO
VIH+
N=561
% (n)
VIH-
N=295
% (n)
COM
DIARREIA
N=493
% (n)
SEM
DIARREIA
N=363
% (n)
MICROSPORIDIA
Pos por GC 21,7 (122)A
10,2 (30) 17,2 (85) 18,5 (67)
Pos* 13,9 (78)A
8,5 (25) 13,4 (66) 10,2 (37)
ESPÉCIES
E. bieneusi 7,0 (39) 5,1 (15) 7,3 (36) 5,0 (18)
Vittaforma-like 8,2 (46)A
4,1 (12) 7,5 (37) 5,8 (21)
Pos: positivos; GC: Gram-Chromotrope; Pos*: positivos segundo o critério de
positividade adoptado no presente estudo; Niveis de significância: AP≤ 0,05
2.1.1.1 Seropositivos para o VIH
O diagnóstico parasitológico das amostras fecais dos 561 seropositivos para VIH
revelou estruturas ovaladas compatíveis com microsporídios em 122 doentes (21,7%)
(Quadro XXXIII) Destes doentes positivos para microsporidia observou-se uma
frequência de crianças com esporos nas fezes superior à frequência de adultos, 31,7% e
18,9% respectivamente. Esta diferença de valores é considerada com significância
estatística (ᵡ2=9,547; p=0,002). Entre a população de doentes infectados por
microsporidia registaram-se as seguintes frequências: 20,8% de doentes do sexo
masculino e 24,2% do sexo feminino; 19,5% apresentavam diarreia e 25,2% sem
diarreia (Quadro XXXIV).
No entanto a percentagem de resultados positivos para microsporidia decresce,
nesta população de imunossuprimidos, quando consideramos como amostras positivas
apenas as que satisfazem o critério de positividade. A percentagem de amostras
positivas determinada foi de 13,9% (78/561) (Quadro XXXIII). O decréscimo neste
valor deve-se ao número de amostras positivas parasitologicamente mas em que não foi
obtida confirmação por pelo menos uma das técnicas de PCR aplicadas no estudo. Dos
78 doentes positivos para microsporidia, 12,4% eram adultos e 19,0% eram crianças. A
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 163 -
frequência de amostras positivas determinada nos doentes do sexo masculino e feminino
foi de 14,7% e de 11,8%, respectivamente. Tal como para os parâmetros anteriores, não
foi encontrada qualquer diferença estatisticamente significativa entre a frequência de
doentes positivos para microsporidia com quadro diarreico (15,3%) e os doentes que
não apresentavam diarreia (11,7%) (Quadro XXXIV).
As espécies E. bieneusi e Vittaforma-like foram identificadas em 7,0% (39/561)
e 8,2% (46/561), respectivamente dos seropositivos para VIH (Quadro XXXIII). Em
seis doentes foi registada co-infecção por ambas as espécies de microsporidia.
Entre os 39 doentes com E. bieneusi registaram-se as seguintes frequências:
6,0% de adultos e 10,3% de crianças; 7,4% do sexo masculino e 5,9% do sexo
feminino; 8,6% com diarreia e 4,5% sem diarreia.
No que respeita aos 46 doentes infectados por Vittaforma-like, a população era
contituida por 7,4% de adultos e 11,1% de crianças, 8,8% pertenciam ao sexo masculino
e 6,5% ao sexo feminino. A presença de diarreia observa-se am 8,6% dos doentes,
enquanto que em 7,7% não se verificou o quadro diarreico. No Quadro XXXIV,
encontram-se sumarizados os resultados da distribuição das frequências de
microsporidia, em relação à idade, género dos doentes e presença ou ausência de
diarreia dos doentes seropositivos para VIH englobados no estudo.
Quadro XXXIV. Distribuição das frequências de microsporidia, em relação à idade,
género e quadro clínico, em seropositivos para VIH.
GRUPO ETÁRIO GÉNERO QUADRO CLÍNICO
ADULTO
N=435
% (n)
CRIANÇA
N=126
% (n)
MASCULINO
N=408
% (n)
FEMININO
N=153
% (n)
COM DIARREIA
N=339
% (n)
SEM DIARREIA
N=222
% (n)
MICROSPORIDIA
Pos por GC 18,9 (82)A
31,7 (40) 20,8 (85) 24,2 (37) 19,5 (66) 25,2 (56)
Pos* 12,4 (54) 19,0 (24) 14,7 (60) 11,8 (18) 15,3 (52) 11,7 (26)
ESPÉCIES
E. bieneusi 6,0 (26) 10,3 (13) 7,4 (30) 5,9 (9) 8,6 (29) 4,5 (10)
Vittaforma-like 7,4 (32) 11,1 (14) 8,8 (36) 6,5 (10) 8,6 (29) 7,7 (17)
Pos: positivos; GC: Gram-Chromotrope; Pos*: positivos segundo o critério de positividade adoptado no presente estudo
Niveis de significância: AP≤ 0,05
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 164 -
2.1.1.2. Seronegativos para VIH
O diagnóstico parasitológico das amostras fecais dos 295 seronegativos para
VIH revelou estruturas ovaladas compatíveis com microsporídios em 30 doentes
(10,2%) (Quadro XXXIII). A frequência de crianças com microsporidia foi muito
superior à registada nos adultos, 38,2% e 3,8% respectivamente. Esta diferença de
valores obtidos para os adultos e as crianças foi considerada com significância
estatística (ᵡ2=58,070; p≤0,001). Os doentes positivos para microsporidia correpondiam
a 9,0% de doentes do sexo masculino e 12,0% do sexo feminino. Relativamente ao
quadro clínico verificou-se que 12,3% apresentavam diarreia e 7,8% não tinham diarreia
(Quadro XXXV).
A percentagem de amostras positivas para microsporidia determinada, segundo o
critério de positividade, foi de 8,5% (25/295) (Quadro XXXIII). Também aqui se
registou uma percentagem de crianças infectadas (18,2%) por microsporidia superior à
percentagem determinada para os adultos (6,3%) (ᵡ2=8,213; p=0,012). A população de
doentes positivos era constituída por 7,3% de pessoas do sexo masculino e 10,3% do
sexo feminino; a presença de diarreia foi observada em 9,1% dos doentes, enquanto que
7,8% não tinham quadro diarreico (Quadro XXXV).
As espécies E. bieneusi e Vittaforma-like foram identificadas em 5,1% (15/295)
e 4,1% (12/295), respectivamente dos doentes estudados (Quadro XXXIII). Dois
seronegativos para VIH apresentavam co-infecção por ambas as espécies de
microsporídios.
Os 15 casos de E. bieneusi correspondiam a 12 adultos (5,0%) e três crianças
(5,5%), nove doentes do sexo masculino (5,1%) e seis do sexo feminino (5,1%), sete
doentes com diarreia (4,5%) e oito sem diarreia (5,7%) (Quadro XXXV).
A frequência de crianças infectadas por Vittaforma-like foi superior à observada
nos adultos, 14,5% e 1,7% respectivamente. Sendo esta diferença de valores
estatisticamente significativa (ᵡ2=19,019; p≤0,001). Pelo contrário não foram registadas
diferenças com significância estatística entre as frequências de doentes do sexo
masculino (2,8%) e do sexo feminino (6,0%) infectados por esta espécie. A presença de
diarreia foi observada em 5,2% dos doentes e 2,8% não manifestavam diarreia. No
Quadro XXXV, encontram-se sumarizados os resultados da distribuição das frequências
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 165 -
de microsporidia, em relação à idade, género dos doentes e presença ou ausência de
diarreia dos seronegativos para VIH incluídos no estudo.
Quadro XXXV. Distribuição das frequências de microsporidia, em relação à idade,
género e quadro clínico, em seronegativos para VIH.
GRUPO ETÁRIO GÉNERO QUADRO CLÍNICO
ADULTO
N=240
% (n)
CRIANÇA
N=55
% (n)
MASCULINO
N=178
% (n)
FEMININO
N=117
% (n)
COM DIARREIA
N=154
% (n)
SEM DIARREIA
N=141
% (n)
MICROSPORIDIA
Pos por GC 3,8 (9) 38,2 (21)A
9,0 (16) 12,0 (14) 12,3 (19) 7,8 (11)
Pos* 6,3 (15) 18,2 (10)A
7,3 (13) 10,3 (12) 9,1 (14) 7,8 (11)
Espécies
E. bieneusi 5,0 (12) 5,5 (3) 5,1 (9) 5,1 (6) 4,5 (7) 5,7 (8)
Vittaforma-like 1,7 (4) 14,5 (8)A
2,8 (5) 6,0 (7) 5,2 (8) 2,8 (4)
Pos: positivos; GC: Gram-Chromotrope; Pos*: positivos segundo o critério de positividade adoptado no presente estudo ; Niveis de significância: AP≤ 0,05
2.1.1.3. Caracterização genética dos isolados de Enterocytozoon bieneusi e
Vittaforma-like
No presente trabalho, foram submetidos à caracterização do locus ITS rRNA, os
54 isolados, pertencentes à espécie E. bieneusi, e do locus SSU rRNA, os 58 isolados da
espécie Vittaforma-like, identificados nas amostras fecais da população humana
estudada.
A totalidade dos 58 isolados de Vittaforma-like obtidos foi caracterizada
geneticamente com recurso à sequenciação nucleotídica do fragmento amplificado pela
PCR. Dois genótipos diferentes foram identificados entre as sequências em análise,
Isolado 5830 (código de acesso ao GenBank AY375043) (39 amostras) e Isolado 5843
(código de acesso ao GenBank AY375044) (19 amostras), com frequências de 67,2% e
32,8%, respectivamente.
Dos 54 isolados de E. bieneusi foram caracterizados geneticamente 48 isolados,
com sucesso. A determinação da sequência nucleotídica de todos os fragmentos da
região ITS rRNA amplificados e o seu alinhamento com outras sequências de identidade
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 166 -
conhecida, a partir de todas as sequências alinhadas, permitiu identificar o genótipo de
48 dos isolados com amplificação positiva. Nestes foram encontrados um total de seis
genótipos diferentes, Tipo IV (18 amostras), Peru 6 (14 amostras), D (seis amostras), A
(quatro amostras), PtEb II (três amostras) e C (três amostras).
No Quadro XXXVI (seropositivos para VIH) e Quadro XXXVII (seronegativos
para VIH) encontram-se sumarizados os dados demográficos, clínicos, laboratoriais e
epidemiológicos da população estudada com microsporidia nas amostras fecais, cujos
isolados foram caracterizados no presente trabalho.
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 167 -
Quadro XXXVI. Dados demográficos, clínicos, laboratoriais e epidemiológicos dos seropositivos para VIH com microsporidia nas amostras
fecais, cujos isolados foram caracterizados no presente trabalho.
Nº AMOSTRA DATA GRUPO
ETÁRIO
IDADE
(ANOS)
SEXO SEROLOGIA
PARA VIH DIARREIA GC
CARGA
PARASITÁRIA POS* ESPÉCIE(S)
GENÓTIPO(S)
EB/VL OUTROS
39 2000 A M Pos Sim Pos + Pos E. bieneusi /Vittaforma-like A/ Isolado 5830 Giardia lamblia
41 2000 A M Pos Sim Pos + Pos E. bieneusi /Vittaforma-like TipoIV/ Isolado 5830 - 42 2000 A M Pos Sim Pos ++ Pos E. bieneusi /Vittaforma-like ND/ Isolado 5830 - 45 2000 A M Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 49 2000 C 7 F Pos Sim Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5843 Isoapora belli
52 2000 A M Pos Sim Pos + Pos E. bieneusi /Vittaforma-like ND/ Isolado 5830 - 54 2000 A 40 M Pos Sim Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 56 2000 C 5 M Pos Sim Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 58 2000 C 4 F Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 62 2000 A M Pos Sim Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 72 2000 C 6 F Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 73 2000 C 6 M Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 74 2000 A M Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 77 2000 A F Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 90 2000 A M Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 92 2000 A M Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 93 2000 C 1 M Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 -
124 2001 A 36 M Pos Não Pos ++ Pos E. bieneusi TipoIV - 141 2001 A M Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 145 2001 C 0,67 M Pos Sim Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 151 2001 A M Pos Não Neg Pos E. bieneusi ND - 155 2001 A M Pos Não Pos ++ Pos E. bieneusi A - 182 2001 C 9 M Pos Sim Neg Pos E. bieneusi ND - 189 2001 A 27 M Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 190 2001 A M Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 213 2002 C 11 M Pos Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 Giardia lamblia
228 2002 C 1 M Pos Não Neg Pos E. bieneusi TipoIV - 265 2002 C 5 F Pos Não Pos ++ Pos E. bieneusi TipoIV -
A: adulto; C: criança; M: masculino, F: feminino; Pos: positivo; Neg: negativo; S: sim; N: não; GC: Gram-Chromotrope; Pos*: positivos segundo o critério de positividade adoptado no presente estudo (amostra positiva: positiva simultâneamente por GC e por PCR, ou exclusivamente por PCR); EB: E. bieneusi; VL: Vittaforma-like; ND: não determinado.
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
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Quadro XXXVI – Dados demográficos, clínicos, laboratoriais e epidemiológicos dos seropositivos para VIH com microsporidia nas amostras
fecais, cujos isolados foram caracterizados no presente trabalho (continuação).
NºAMOSTRA DATA GRUPO ETÁRIO
IDADE (ANOS) SEXO SEROLOGIA
PARA VIH DIARREIA GC CARGA PARASITÁRIA POS* ESPÉCIE (S) GENÓTIPO(S)
EB/VL OUTROS
291 2002 A 35 F Pos Sim Pos + Pos E. bieneusi TipoIV - 322 2003 C 5 M Pos Sim Pos ++ Pos E. bieneusi TipoIV - 428 2004 C 9 F Pos Não Pos + Pos E. bieneusi Peru6 - 434 2004 C 9 F Pos Não Neg Pos E. bieneusi TipoIV - 435 2004 C 11 M Pos Não Pos + Pos E. bieneusi /Vittaforma-like D/ Isolado 5830 - 437 2004 A 61 M Pos Sim Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 439 2004 A M Pos Sim Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 443 2004 C 13 M Pos Não Pos + Pos E. bieneusi TipoIV - 446 2004 A M Pos Sim Pos + Pos E. bieneusi Peru6 - 449 2004 C 11 F Pos Sim Neg Pos E. bieneusi Peru6 - 451 2004 C 3 M Pos Sim Neg Pos E. bieneusi A - 482 2004 A M Pos Sim Neg Pos E. bieneusi Peru6 - 515 2004 C 33 M Pos Sim Neg Pos E. bieneusi D - 519 2005 A 41 M Pos Sim Neg Pos E. bieneusi TipoIV - 526 2005 A 39 M Pos Sim Neg Pos E. bieneusi PtEbII - 532 2005 A 39 F Pos Sim Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 538 2005 A 44 M Pos Sim Neg Pos E. bieneusi D - 540 2005 A 39 M Pos Sim Neg Pos E. bieneusi PtEbII - 541 2005 A 37 M Pos Sim Neg Pos E. bieneusi Peru6 - 544 2005 C 13 F Pos Sim Pos + Pos E. bieneusi /Vittaforma-like D/ Isolado 5843 Isospora belli
559 2005 A 39 M Pos Sim Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 560 2005 A 40 M Pos Sim Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 567 2005 A 32 F Pos Sim Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 569 2005 A 55 M Pos Não Neg Pos E. bieneusi TipoIV - 574 2005 A 45 M Pos Sim Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 575 2005 A 33 M Pos Sim Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 576 2005 C 0,75 M Pos Sim Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 580 2005 A F Pos Sim Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5830 -
A: adulto; C: criança; M: masculino, F: feminino; Pos: positivo; Neg: negativo; S: sim; N: não; GC: Gram-Chromotrope; Pos*: positivos segundo o critério de positividade
adoptado no estudo (amostra positiva: positiva simultâneamente por GC e por PCR, ou exclusivamente por PCR). EB: E. bieneusi; VL: Vittaforma-like.
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 169 -
Quadro XXXVI. Dados demográficos, clínicos, laboratoriais e epidemiológicos dos seropositivos para VIH com microsporidia nas amostras
fecais, cujos isolados foram caracterizados no presente trabalho (continuação).
NºAMOSTRA DATA GRUPO ETÁRIO
IDADE (ANOS) SEXO SEROLOGIA
PARA VIH DIARREIA GC CARGA PARASITÁRIA POS* ESPÉCIE GENÓTIPO(S)
EB/VL OUTROS
581 2005 A 33 M Pos S Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 592 2005 A 35 F Pos S Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 595 2005 A 46 M Pos S Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 598 2005 A M Pos N Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 601 2006 C 16 M Pos S Neg Pos E. bieneusi /Vittaforma-like ND/ Isolado 5830 - 609 2006 C 14 F Pos S Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 623 2006 A 44 M Pos N Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 625 2006 A 25 M Pos S Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 627 2006 C 5 M Pos N Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 630 2006 A 26 M Pos S Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 639 2006 A 39 M Pos S Neg Pos E. bieneusi C - 640 2006 A 73 M Pos S Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 641 2007 A 51 M Pos S Neg Pos E. bieneusi Peru6 - 649 2007 A 61 F Pos S Neg Pos E. bieneusi C - 684 2008 A 32 M Pos S Neg Pos E. bieneusi Peru6 - 707 2009 A M Pos S Pos + Pos E. bieneusi ND - 711 2009 A M Pos S Neg Pos E. bieneusi TipoIV - 720 2008 A 27 M Pos S Neg Pos E. bieneusi TipoIV - 721 2008 A 72 M Pos S Neg Pos E. bieneusi TipoIV - 729 2008 A 83 M Pos S Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 788 2008 A 31 F Pos S Pos + Pos E. bieneusi Peru6 - 832 2008 A 48 F Pos S Neg Pos E. bieneusi TipoIV -
A: adulto; C: criança; M: masculino, F: feminino; Pos: positivo; Neg: negativo; S: sim; N: não; GC: Gram-Chromotrope; Pos*: positivos segundo o critério de positividade
adoptado neste estudo (amostra positiva: positiva simultâneamente por GC e por PCR, ou exclusivamente por PCR); EB: E. bieneusi; VL: Vittaforma-like; ND: não determinado.
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 170 -
Quadro XXXVII. Dados demográficos, clínicos, laboratoriais e epidemiológicos dos seronegativos para VIH com microsporidia nas amostras
fecais, cujos isolados foram caracterizados no presente trabalho.
NºAMOSTRA DATA GRUPO ETÁRIO
IDADE (ANOS) SEXO SEROLOGIA
PARA VIH DIARREIA GC CARGA PARASITÁRIA POS* ESPÉCIE GENÓTIPO(S)
EB/VL OUTROS
34 1999 C 3 F Neg Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 40 2000 C 3 F Neg Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 46 2000 C 1 F Neg Sim Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 53 2000 C 5 F Neg Sim Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 -
104 2000 C F Neg Sim Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 177 2001 A 76 M Neg Sim Pos ++ Pos E. bieneusi TipoIV quimioterapia 232 2002 C F Neg Sim Pos + Pos E. bieneusi D - 266 2002 C 20m M Neg Não Pos + Pos E. bieneusi D - 375 2003 C M Neg Não Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5830 - 381 2003 C 3 F Neg Sim Pos + Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 391 2003 C 8 F Neg Não Pos + Pos E. bieneusi /Vittaforma-like Peru6/Isolado 5843 Giardia lamblia
440 2004 A M Neg Sim Neg Pos E. bieneusi /Vittaforma-like A/ Isolado 5830 Transplantado renal 543 2005 A 15 F Neg Não Neg Pos E. bieneusi TipoIV - 606 2006 A 48 M Neg Sim Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5830 -
631 2006 A 39 M Neg Sim Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5830 Regressou de África
731 2008 A 50 M Neg Sim Neg Pos E. bieneusi TipoIV viajante 734 2008 A 48 M Neg Não Neg Pos E. bieneusi Peru6 Pancreatite crónica 742 2008 A 70 M Neg Sim Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5843 - 769 2008 A 56 M Neg Não Neg Pos E. bieneusi TipoIV asma 770 2008 A 55 M Neg Sim Neg Pos E. bieneusi PtEbII emagrecimento 780 2008 A 45 M Neg Sim Neg Pos E. bieneusi Peru6 Vírus da hepatite C 797 2008 A 23 F Neg Sim Neg Pos E. bieneusi Peru6 - 816 2008 A 69 F Neg Não Neg Pos E. bieneusi Peru6 - 833 2008 A 85 M Neg Não Neg Pos E. bieneusi C - 834 2008 A 28 F Neg Não Neg Pos E. bieneusi Peru6 -
A: adulto; C: criança; M: masculino, F: feminino; m: meses; Pos: positivo; Neg: negativo; S: sim; N: não; GC: Gram-Chromotrope; Pos*: positivos
segundo o critério de positividade adoptado no presente estudo (amostra positiva: positiva simultâneamente por GC e por PCR, ou exclusivamente por PCR); EB: E. bieneusi;
VL: Vittaforma-like.
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 171 -
2.1.2. Microsporidia em amostras de urina
No total dos 69 doentes estudados detectou-se microsporidia numa amostra de urina
de um doente (1,5%). A amostra pertencia a um adulto, do sexo masculino com
serologia positiva para VIH.
2.1.2.1. Seropositivos para VIH
Entre os 59 seropositivos para VIH estudados, apenas num doente foram
encontrados esporos de microsporídios, o que corresponde à percentagem de infecção
de 1,7%.
Na Figura 10 podem observar-se os produtos de PCR do locus SSU rRNA,
correspondentes aos resultados da amplificação do fragmento com 520 pb característico
da espécie E. intestinalis.
Figura 10. Fotografia do gel de agarose dos produtos de PCR de E. intestinalis, após
electroforese. Os produtos de amplificação do gene da SSU rRNA apresentam uma
banda com 520 pb. Nos poços 1 e 3 encontram os controlos positivo e negativo
respectivamente. No poço 2 encontra-se o produto de PCR de um isolado de E.
intestinalis, identificado numa amostra de urina. M- marcador de peso molecular (100
pb)
520 pb
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 172 -
O amplicão submetido a sequenciação nucleotídica e posterior alinhamento com outras
sequências de identidade conhecida revelou 100% de homologia para a referida região
com isolados de E. intestinalis registados previamente no Genbank, por outros autores
(Código de acesso ao GenBank SIU09929).
2.1.2.2. Seronegativos para VIH
Em nenhuma das amostras de urina dos 10 seronegativos para VIH foram
detectados microsporídios.
2.1.3. Microsporidia em secrecções pulmonares
No total dos 200 doentes estudados, incluindo seropositivos e seronegativos para
VIH, através da técnica histoquímica do Gram-Chromotrope, foram detectadas
estruturas ovaladas compatíveis com esporos de microsporídios, apenas numa amostra
de um doente (0,5%) (Figura 11).
Figura 11. Fotografias de esporos de E. cuniculi, em esfregaço de lavado brocoalveolar,
corado por Gram-Chromotrope. (×1000). Original da autora.
De acordo com o critério de positividade definido no presente trabalho, a
frequência de secrecções pulmonares positivas para microsporidia foi de 1,0% (2/200),
no total da população estudada.
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 173 -
2.1.3.1. Seropositivos para VIH
A pesquisa e identificação de microsporídios em secreções pulmonares
(expectoração induzida e LBA) dos 150 seropositivos para VIH revelaram que dois se
encontravam parasitados, o que corresponde a uma percentagem de infecção por
microsporidia nesta população de 1,3%. Os dados demográficos, clínicos, laboratoriais
e epidemiológicos dos doentes, em cujas secreções pulmonares foram identificados
microsporídios podem ser observados no Quadro XXXVIII.
Quadro XXXVIII. Dados demográficos, clínicos, laboratoriais e epidemiológicos dos dois
doentes, cujos isolados de Encepalitozoon cuniculi e Vittaforma-like foram caracterizados no
presente trabalho.
Nº
AMOSTRA DATA IDADE SEXO
SEROLOGIA
PARA VIH
GRUPO
DE RISCO GC CP POS* ESPÉCIE GENÓTIPO ESPÉCIME
216 1997 37A M Positivo T Pos ++ Pos E. cuniculi ND LBA
576 2000 26A F Positivo T Neg Pos Vittaforma-like Isolado 5830/
AY375043 EI
A- Anos; M- masculino; F- feminino; T- toxicodependente; GC: Gram-Chromotrope; Pos- positivo; Neg- negativo; CP: carga parasitária; Pos*:positivos segundo o critério de positividade adoptado neste estudo; ND: não determinado; EI: expectoração induzida; LBA: lavado broncoalveolar;
A amplificação do fragmento alvo da SSU rRNA permitiu identificar a espécie
Vittaforma-like numa das amostras, cujo resultado pela técnica histoquímica fora
negativo.
Por outro lado, registou-se a detecção parasitológica de estruturas compatíveis
com esporos de microsporídios numa amostra em que se verificou a ausência de
amplificação de DNA por uma das cinco técnicas principais de PCR a que foram
submetidas todas as amostras englobadas no presente trabalho. Porém com recurso a
técnica de PCR que permite a detecção de várias espécies de microsporidia foi possível
a amplificação de um fragmento da SSU rRNA com aproximadamente 1100 pb (Figura
12).
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 174 -
Figura 12. Fotografia do gel de agarose dos produtos de PCR de microsporidia, após
electroforese. Os produtos de amplificação do gene da SSU rRNA apresentam uma
banda com 1124 pb. Nos poços 1 e 3 encontram os controlos positivo e negativo
respectivamente. No poço 2 encontra-se o produto de PCR de um isolado de E.
cuniculi,, identificado num lavado broncoalveolar. M- marcador de peso molecular
(1kb)
A determinação da sequência nucleotídica do amplicão (1124pb) e os resultados
produzidos pelo seu alinhamento com outras sequências de identidade conhecida,
permitiu demonstrar que o isolado obtido apresentava na referida região 99% de
homologia com isolados de E.cuniculi previamente descritos por outros autores (código
de acesso ao GenBank AL391737). Da caracterização genética do isolado de E. cuniculi
obtido verifica-se a ocorrência de uma única alteração nucleotídica na sequência, em
que a base T (posição 201864 da 16S rRNA), corresponde a uma base A na sequência
descrita por outros autores (código de acesso ao GenBank AL391737).
A caracterização genética do fragmento amplificado do gene SSU rRNA de
Vittaforma-like revelou homologia com o Isolado 5830 previamente descrito no
GeneBank (código de acesso ao AY375043).
1124 pb
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 175 -
3. DISCUSSÃO
E.bieneusi, E. intestinalis, E. cuniculi e E. hellem são consideradas as quatro
principais espécies de microsporídios patogénicas para o Homem. As duas primeiras
espécies, são os principais agentes da microsporidiose intestinal humana. A doença
encontra-se particularmente associada a seropositivos para VIH com níveis de
contagens de linfócitos TCD4+≤ 100 céls/mm3 [Bern et al. 2005; Endeshaw et al. 2006;
Samie et al. 2007; Espern et al. 2007; Thellier & Breton 2008] ou pessoas com outras
causas de imunossupressão.
Apesar de E. bieneusi ser responsável por aproximadamente 90% dos registos de
infecção, outras espécies de microsporídios têm sido reportadas na literatura [Orenstein
et al. 1994; Didier 2005; Endeshaw et al. 2006; Espern et al. 2007; Thellier & Breton
2008]. É o caso da nova espécie Vittaforma-like, isolada em amostras fecais de doentes
seropositivos e seronegativos para VIH e até agora apenas descrita em Portugal
[Sulaiman et al. 2003c].
É provável que a microsporidiose seja uma infecção subdiagnosticada, qualquer
que seja a metodologia de diagnóstico adoptada. Por um lado, as reduzidas dimensões e
o fraco poder de coloração dos esporos do parasita, podendo ser facilmente confundidos
com outros microrganismos (bactérias, leveduras) existentes em abundância em
determinados produtos biológicos, tais como nas fezes, requer a presença de técnicos
especializados nos laboratórios de rotina, para um diagnóstico correcto. A existência nas
amostras clínicas de inibidores da PCR pode também condicionar pela negativa a
correcta interpretação dos resultados obtidos por estas técnicas. Acresce ainda, que a
pesquisa de microsporídios em geral não é incluída no diagnóstico diferencial efectuado
a pessoas com quadro diarreico, nem em amostras de urina para avaliar os microsporidia
como uma possível causa de infecção sistémica.
A epidemiologia dos microsporidia continua com diversos aspectos por clarificar
e os valores das prevalências descritas para estes parasitas, apresentam diferenças
significativas nas diversas regiões do globo. Em Portugal, a informação sobre a
microsporidiose humana é escassa sendo reduzido o número de estudos registados até à
data.
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 176 -
Metodologia adoptada. No presente trabalho foram seleccionadas duas
metodologias complementares tendo por objectivo potenciar a detecção e a identificação
dos microsporidia nas amostras biológicas da população a estudar. As dificuldades
criadas pelas reduzidas dimensões destes agentes e o elevado grau de contaminação
microbiana próprio de certo tipo de amostras, recomendam que se utilizem em
simultâneo, vários métodos de diagnóstico laboratorial, de modo a aumentar a
sensibilidade do rastreio. Idealmente, um desses métodos deveria ser a microscopia
electrónica, pois trata-se da técnica de referência para o diagnóstico laboratorial das
microsporidioses. Porém, são raros os laboratórios que dispõem deste equipamento,
para além de ser uma técnica onerosa e demorada. Assim, neste trabalho a escolha para
efectuar o diagnóstico parasitológico, recaiu sobre a coloração histoquímica pelo Gram-
Chromotrope e a técnica para o diagnóstico molecular, baseou-se na PCR para
amplificação da região conservada do gene que codifica o rRNA, e/ou amplificação da
região polimórfica ITS rRNA, consoante as espécies a estudar. O critério de selecção
adoptado fundamentou-se nas técnicas mais usadas no diagnóstico da microsporidiose,
de acordo com a pesquisa bibliográfica efectuada e com a experiência na área em
questão, obtida em trabalhos prévios, pela equipa de investigação de que faz parte a
autora deste estudo [Matos et al. 2001; Matos et al. 2002; Lobo et al. 2003].
A interpretação dos resultados da técnica de Gram-Chromotrope é de maior
subjectividade e requer alguma experiência do examinador. Por conseguinte, um doente
com uma amostra biológica positiva por esta técnica, só foi considerado positivo, se
confirmado por, pelo menos um dos protocolos da PCR utilizados no estudo.
Da análise dos resultados obtidos pelas diferentes técnicas, parasitológica e
molecular, verifica-se que nem sempre houve conformidade dos resultados, entre as
técnicas aplicadas. Dos 152 casos com amostras fecais positivas, através do Gram-
Chromotrope apenas 103 (12,0%) casos foram confirmados pelas técnicas da PCR.
Inicialmente, a técnica de PCR foi repetida, e como o resultado persistiu, procedeu-se
sempre que existia amostra fecal, a nova extracção de DNA e a nova amplificação.
Todos os resultados mantiveram-se inalterados. O insucesso experimentado na
amplificação por PCR, poderá dever-se à presença de inibidores de polimerases,
frequentemente presentes, nas amostras fecais. Aliás, esta hipótese é frequentemente
aludida por vários autores [van & Dankert 1995; Raynaud et al. 1998; Muller et al.
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 177 -
1999; Wolk et al. 2002; Lores et al. 2002a]. Outra explicação, poderá ser devida a
ineficiência na extracção de DNA, apesar de nalguns casos se ter repetido a operação.
Noutros casos não foi possível a repetição, devido a ausência de mais amostra fecal.
Uma outra interpretação poderá ser dada, se as espécies de microsporídios detectadas
pela técnica de coloração, não forem as espécies pesquisadas pela técnica de PCR, com
os pares de primers utilizados neste trabalho. É também possível que na presença de
esfregaços espessos, com elevada contaminação microbiana, outros microrganismos tais
como bactérias ou pequenas leveduras que mimetizam em tamanho, forma e coloração,
os esporos dos microsporídios, possam ser confundidos com estes parasitas. Nestes dois
casos, os resultados da técnica de coloração seriam considerados falsos positivos.
Por outro lado, nos 69 doentes cujas amostras de urina foram estudadas, o único
caso positivo pela PCR, havia sido negativo pelo Gram-Chromotrope. Também no total
das secrecções pulmonares estudadas, correspondentes a 200 doentes, a percentagem de
amostras positivas foi maior com a técnica da PCR (1,0%; 2 amostras) do que com a
coloração histoquímica (0,5%;1 amostra). Em seguida são mencionadas algumas das
possíveis razões da discordância observada entre as duas técnicas:
a) Relacionado com o limite de detecção de esporos de cada técnica. Um estudo
cego, realizado com o objectivo de comparar a qualidade dos parâmetros de
detecção, obtida pela técnica de PCR e pela observação ao microscópio
óptico, de preparações coradas pelo tricrómio modificado, indicou um limite
de detecção de 102 esporos por ml, e de 104 esporos por ml, respectivamente
[Rinder et al. 1998a]. Outro estudo chegou a uma conclusão semelhante
quando comparou as duas técnicas referidas, mais a coloração pelo
calcoflúor, aplicadas em fezes de animais [Fayer et al. 2003a]. Assim a
técnica de PCR poderá ser mais sensível, para as amostras que apresentem
uma concentração baixa de esporos. Outros autores, que também
empregaram métodos de coloração e a técnica de PCR no rastreio da
microsporidiose, também obtiveram mais casos positivos, por este último
método [Gumbo et al. 1999b; Fayer et al. 2003b; Endeshaw et al. 2005;
Abreu-Acosta et al. 2005; Notermans et al. 2005].
b) Outros dos aspectos, inerentes à técnica de coloração, como esfregaços
espessos, ou a existêntia de muco como se pode observar nas secreções
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 178 -
pulmonares, ou a propensão que os esporos exibem para se aglomerarem,
podem explicar os falsos negativos obtidos pela técnica de coloração.
Frequência de microsporidia nas fezes da população estudada. A
comparação de prevalências ou percentagens da infecção por microsporidia, entre os
diversos estudos descritos na literatura é difícil de estabelecer e deve ser efectuada com
algum cuidado. As diferenças ou semelhanças observadas entre os diversos trabalhos
publicados podem não ser comparáveis, por constituirem o reflexo de abordagens
distintas à detecção e identificação dos microsporídios, no que respeita à selecção da
população, ao tipo de espécimes analisados ou à aplicação de diferentes metodologias
(técnicas parasitológicas para microscopia óptica ou PCR). Maioritariamente os estudos
de prevalência da microsporidiose intestinal publicados, referem-se especificamente à
identificação de E. bieneusi.
As percentagens de doentes com microsporidia, de 17,8% (técnica de coloração)
e de 12,0% (segundo o critério de positividade adoptado) determinadas durante este
trabalho enquadram-se dentro dos valores descritos nos vários estudos na literatura.
Contudo, em Portugal, na região de Lisboa, num total de 280 seropositivos para VIH
havia sido detectada anteriormente uma percentagem superior, de 33,5% de infecção
por microsporídios, apenas por técnicas parasitológicas, a partir de diferentes amostras
biológicas (estudo efectuado pela equipa de investigação de que faz parte a autora deste
trabalho) [Matos et al. 2002]. A recente aplicação de técnicas de diagnóstico mais
específicas são a razão que certamente influenciou os valores de frequência de infecçâo
por microsporidia obtidos no presente trabalho. Certamente, a metodologia adoptada
conduziu a resultados mais verídicos quando comparados com a percentagem de
infecção apenas por técnicas parasitológicas. Noutro estudo conduzido na cidade do
Porto, num total de 215 doentes com sida, em que foram identificados 92 casos (42,8%)
de microsporidiose [Ferreira et al. 2001]. Outra razão sugerida, para o decréscimo da
frequência de infecção por microsporidia registada no presente estudo, prende-se com a
diminuição das infecções oportunistas entre os seropositivos para VIH ao longo da
última década, em Portugal, resultado da corrente administração da HAART e outras
terapêuticas profilácticas com concomitante restabelecimento dos níveis de linfócitos T
CD4+ dos doentes.
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 179 -
Serologia para VIH e microsporidia. A maioria dos casos de microsporidiose,
ocorrem em seropositivos para VIH-1, embora também já tenha sido reportada em
infectados por VIH-2 [Lebbad et al. 2001]. De acordo com a localização geográfica e o
método de diagnóstico utilizado, a prevalência da doença, em grupos de seropositivos
para VIH, oscila entre 1,7% e 30% [Lebbad et al. 2001; Okhuysen 2001].
No presente trabalho, considerando a totalidade dos 856 doentes estudados
registou-se uma associação com significância estatística entre a presença de
microsporidia nas fezes e a seropositividade para VIH. A frequência de microsporídios
nas fezes foi superior à frequência observada nos seronegativos para VIH, 13,9% e
8,5%, respectivamente (vide Quadro XXXIII). Atendendo a que a infecção por
microsporidia é considerada uma doença oportunista, os resultados obtidos enquadram-
se dentro do esperado. Assim, seria de prever que doentes com um sistema imunológico
debilitado, como o que se verifica com os seropositivos para VIH tivessem uma maior
probabilidade de contrair a infecção por microsporidia. Tuli e colaboradores, num
estudo conduzido na India, em que registaram uma prevalência de 23,1% de
microsporídios em fezes de seropositivos para VIH, através de técnicas parasitológicas,
também verificaram uma associação da infecção por microsporidia com os seropositivos
para VIH [Tuli et al. 2010].
Grupo etário e microsporidia. Neste estudo, as amostras fecais
correspondentes a 18,8% das crianças e 10,2% dos adultos foram positivas para
microsporidia (Quadro XXXII). Registando-se uma associação estatisticamente
significativa entre o grupo etário das crianças e a infecção por microsporidia. Entre as
razões sugeridas para estes resultados incluem-se a presença neste grupo etário de um
sistema imunológico ainda em desenvolvimento e, no geral, caracterizam-se por um
deficit de hábitos de higiene e de um contacto mais directo e desprotegido com
potenciais fontes de infecção por microsporídios (animais e ambiente)
comparativamente aos adultos. Diversos estudos descrevem a infecção por
microsporidia em crianças (a maioria seropositivas para VIH) com valores de
frequência variados e em que a maioria se refere à espécie E. bieneusi: Uganda - 32,9%
[Tumwine et al. 2005]; Zimbabué até 50% [Gumbo et al. 1999b]; África do Sul - 4,5%
[Samie et al. 2007]; Nigéria – 0,8% (8/990) [Bretagne et al. 1993]; Tailândia – 14,9%
(13/87) [Wanachiwanawin et al. 2002] e Espanha – 2% [del et al. 1997b].
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 180 -
Quadro diarreico e microsporidia. A diarreia é a manifestação clínica mais
comum associada à infecção por microsporidia reportada na literatura [Eeftinck
Schattenkerk et al. 1991; Molina et al. 1993; Kotler & Orenstein 1994; Asmuth et al.
1994; Abreu-Acosta et al. 2005; Satheeshkumar et al. 2005; Endeshaw et al. 2006].
Neste trabalho, a frequência de doentes positivos para microsporidia que apresentavam
quadro diarreico foi de 13,4% e sem diarreia de 10,2% (vide Quadro XXXIII). Contudo,
não foi observada associação significativa entre a presença de diarreia e a percentagem
de doentes com microsporídios nas fezes. Este facto é corroborado por estudos de
Sarfati e colaboradores nos Camarões e de Chacin-Bonillana na Venuzuela [Sarfati et
al. 2006; Chacin-Bonilla et al. 2006] e, ainda, por outros autores [Rabeneck et al. 1993;
Clarridge, III et al. 1996].
A maioria dos casos descritos na literatura, associa a presença de diarreia a
doentes seropositivos para VIH com contagem de linfócitos T CD4+ inferiores a 100
céls/mm3. Todavia, não foi possivel obter estes dados para a maior parte dos doentes,
englobados neste estudo. Pode-se especular se a ausência de correlação observada no
presente trabalho pode ser devida aos doentes estudados apresentarem níveis de
linfócitos T CD4+ superiores ao referido limite, ou ainda se a intensidade da infecção
não era suficiente para causar patologia, como já foi referido por outros investigadores
[Rabeneck et al. 1993]. Acresce ainda referir que a administração da HAART pode
influenciar directa ou indirectamente o estabelecimento e grau de severidade da
microsporidiose resultando na remissão da doença associada à infecção por VIH
[Goguel et al. 1997; Carr et al. 1998; Conteas et al. 1998b; Miao et al. 2000; Nannini &
Okhuysen 2002].
Espécies de microsporidia em amostras fecais. Nas amostras fecais dos
doentes estudados foram identificadas as espécies E. bieneusi e Vittaforma-like, com
frequências de 6,3% (54 amostras) e 6,8% (58 amostras), respectivamente. No grupo de
infectados por E. bieneusi não foram encontradas associações significativas entre os
doentes positivos para este microsporídio e as variáveis grupo etário (adulto/criança),
sexo, serologia para VIH ou a presença ou ausência de diarreia (vide Quadros XXXII e
XXXIII). Ao contrário, dos 58 infectados por Vittaforma-like a percentagem de crianças
infectadas (12,2%) foi significativamente superior à dos adultos (5,3%) (vide Quadro
XXXII), sugerindo a susceptibilidade deste grupo etário para contrair infecção por esta
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 181 -
espécie. A análise de resultados permitiu também verificar uma associação
estatísticamente significativa entre os seropositivos para VIH e a infecção por
Vittaforma-like. Em quarenta e seis seropositivos e 12 seronegativos para VIH foi
identificada esta espécie (Quadro XXXIII). Este resultado sugere também o possível
carácter oportunista desta espécie, como se observa para os microsporídios no geral.
Ocorrência e caracterização genética dos isolados de E. bieneusi e
Vittaforma-like. Tal como descrito na literatura por outros autores [Sulaiman et al.
2003a; Sulaiman et al. 2003b], também o nosso estudo veio corroborar a ocorrência
simultânea de diferentes genótipos de E. bieneusi em estudos com humanos de
diferentes áreas geográficas assim como a predominância de um dos genótipos entre a
população. No presente trabalho, nos 48 isolados obtidos desta espécie foram
identificados seis genótipos diferentes, previamente descritos. Não foram encontradas
associações entre as variáveis sexo, grupo etário, serologia para VIH, presença de
diarreia com os genótipos determinados. O Tipo IV, foi o genótipo identificado com
maior frequência 37,5%, seguido do Peru 6 com 29,2% e dos genótipos D e A com
12,5% e 8,3%, respectivamente. Os genótipos C e PtEb II foram identificados com
idêntica frequência, 6,3%. Até à data, os genótipos A e C só foram identificados no
Homem. Em contrapartida os genótipos Tipo IV, Peru 6 e genótipo D já foram descritos
numa vasta gama de hospedeiros, incluído o Homem e outros animais (inclusive em
cães, gatos e ruminantes em Portugal). O genótipo PtEb II apenas foi previamente
descrito em aves, em Portugal. A presença de genótipos associados apenas ao homem, e
outros que infectam o homem e outros animais sugerem a ocorrência, em Portugal, de
transmissão pessoa-a-pessoa e transmissão zoonótica de microsporídios.
No que diz respeito à espécie Vittaforma-like os isolados identificados
correspondem a dois genótipos previamente descritos exclusivamente em amostras
fecais, em Portugal [Sulaiman et al. 2003c], com predominância do Isolado 5830
(67,2%) sobre o Isolado 5843 (32,8%). Também para esta espécie não foram
encontradas associações entre as variáveis sexo, grupo etário, serologia para VIH,
presença de diarreia com qualquer um dos dois genótipos determinados.
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 182 -
Subgrupo da população estudada: amostras fecais de seropositivos para
VIH. Na análise dos resultados referentes ao subgrupo populacional dos 561
seropositivos para VIH verificou-se que 13,9% apresentavam microsporidia nas fezes.
Nestes 78 doentes positivos, identificaram-se as espécies E. bieneusi e Vittaforma-like
em 7,0 % e 8,2%, respectivamente (Quadro XXXIII). Em sete doentes foi registada co-
infecção por ambas as espécies. Dentro deste subgrupo de seropositivos para VIH foi
apenas detectada uma associação significativa entre o grupo etário das crianças com
microsporídios detectados apenas por Gram-Chromotrope (31,7% nas crianças vs 18,9%
nos adultos), comparativamente ao dos adultos (Quadro XXXIV). Nas restantes
variáveis comparadas com a infecção por microsporidia (no geral ou com isoladamente
de E. bieneusi e/ou Vittaforma-like isoladamente), nomeadamente grupo etário, sexo,
presença de diarreia, ou genótipo não foram encontradas quaisquer associações com
significância estatística. Todavia as percentagens de infecção por microsporídios
(19,0%), por E. bieneusi (10,3%) e por Vittaforma-like (11,1%) encontradas nas
crianças foram superiores às dos adultos (vide Quadro XXXIV). A infecção por E.
bieneusi é considerada como uma das infecções oportunistas mais comuns em crianças
seropositivas para VIH, na Tailândia registando-se percentagens que variam entre
valores de 4,1%, 10,8% até 25,3% [Leelayoova et al. 2001; Wanachiwanawin et al.
2002; Leelayoova et al. 2005]. Ao contrário do observado no presente trabalho,
Tumwine e colaboradores num estudo conduzido no Uganda, verificaram uma
associação significativa entre crianças seropositivas para VIH e a infecção por E.
bieneusi [Tumwine et al. 2005]. A frequência de E. bieneusi foi de 76,9% (70/91) e
6,6% (10/152) para as crianças seropositivas e seronegativas para VIH,
respectivamente.
Subgrupo da população estudada: amostras fecais de seronegativos para
VIH. Quando analisámos o subgrupo dos 295 seronegativos para VIH observou-se
8,5% de frequência de infecção por microsporidia, sendo que dos 25 doentes positivos,
em 5,1% foi identificada E. bieneusi e em 4,1% a espécie Vittaforma-like (vide Quadro
XXXIII). Em dois doentes foi detectada co-infecção por ambas as espécies. Ao
contrário do registado para os seropositivos para VIH, neste subgrupo foram
encontradas várias associações estatisticamente significativas. Nomeadamente,
verificou-se mais uma vez associação entre o grupo etário das crianças e a infecção por
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 183 -
microsporídios nas fezes, quer seja detectada apenas pela técnica do Gram-Chromotrope
(38,0% de crianças vs 3,8% de adultos), quer quando consideramos como casos
positivos os definidos pelo critério de positividade (18,2% de crianças vs 6,3% de
adultos). Acresce ainda, a associação com significância estatística observada entre as
crianças e a infecção por Vittaforma-like, comparativamente ao grupo etário dos adultos
(Quadro XXXV). No subgrupo dos seronegativos para VIH, não foram observadas
diferenças significativas entre doentes positivos e negativos para microsporidia e as
variáveis, sexo, presença de quadro diarreico e genótipo.
As microsporidioses também podem ser contraídas por pessoas com diversas
causas de imunossupressão e mesmo por imunocompetentes. Em seronegativos para
VIH, a microsporidiose foi descrita em doentes submetidos a transplantes [Gumbo et al.
1999a; Gamboa-Dominguez et al. 2003; Lanternier et al. 2009] e a quimioterapia, em
portadores de lentes de contacto [Theng et al. 2001], viajantes [Sandfort et al. 1994;
Raynaud et al. 1998; Muller et al. 2001; Okhuysen 2001], em crianças [Bretagne et al.
1993; Hautvast et al. 1997; Desportes-Livage et al. 1998] e em idosos [Lores et al.
2002b]. Como já foi discutido anteriormente as crianças representam um grupo
susceptível de contrair microsporidiose assim como, a população de idosos devido aos
processos fisiológicos de envelhecimento e às doenças crónicas, entre outros factores,
os quais dimunuem as suas defesas imunológicas.
No presente estudo, sugere-se que a frequência de infecção por microsporidia
(8,5%) observada neste subgrupo de seronegativos para VIH possa ter sido influenciada
por características específicas da população em análise. Dos 25 positivos para
microsporidia, 10 correspondiam a crianças e os restantes 15 eram adultos. Do total de
adultos positivos, sete correspondiam a (vide Quadro XXXVII): um doente submetido a
quimioterapia com 76 anos de idade (nºamostra 177); um doente transplantado renal
(nºamostra 440); dois idosos com 70 anos (nºamostra 742) e 85 anos (nºamostra 833);
um doente com asma severa; um doente que apresentava emagrecimento sem causa
determinada (nºamostra770); e um doente com infecção por vírus da hepatite C
(nºamostra 780). Assim, verificou-se que alguns dos adultos incluídos no estudo, apesar
da serologia negativa para VIH, caracterizavam-se por apresentar um maior ou menor
grau de imunossupressão, que puderá ter aumentado a sua susceptibilidade à infecção.
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 184 -
Ao longo da última década, têm surgido evidências de que a infecção por E.
bieneusi pode persistir em imunocompetentes portadores assintomáticos. E. bieneusi foi
isolado em 0,8% (8/990) de crianças africanas seronegativas para VIH, sem
sintomatologia [Bretagne et al. 1993]. Os autores do estudo sugeriram a existência de
portadores do parasita sem sintomatologia entre os imunocompetentes residentes em
regiões tropicais. Outros casos de infecção assintomática foram descritos em crianças
em África [Cegielski et al. 1999] e em crianças (5,9%) de um orfanato e adultos (1,9%)
dessa instituição, na Ásia [Mungthin et al. 2001]. No presente trabalho não foi
observada correlação entre a presença de diarreia e a infecção por qualquer das duas
espécies de microsporidíos identificadas, sugerindo-se que alguns dos seronegativos
para VIH estudados possam constituir portadores assintomáticos destes parasitas.
Frequência e caracterização específica de microsporidia em amostras de
urina da população estudada. Relativamente às amostras de urina dos doentes
estudados registou-se uma frequência de infecção baixa por microsporidia (1,7%) nos
seropositivos para VIH. Em nenhum seronegativo para VIH incluído no estudo foi
detectado microsporidia na urina.
A espécie E. intestinalis foi identificada na amostra de urina de um seropositivo
para VIH. E. intestinalis é considerada a segunda espécie mais comum responsável por
microsporidiose humana tendo sido descritos mais de 200 casos em
imunocomprometidos e também em imunocompetentes, embora num número reduzido
de registos [Raynaud et al. 1998; Graczyk et al. 2002; Lono et al. 2010]. A frequência
detectada no presente trabalho enquadra-se dentro dos estudos de outros autores, em que
as frequências descritas são em geral baixas e reportam-se a seropositivos para VIH:
0,9% (Suiça) [Weber et al. 1999a]; 2% (Alemanha) [Sobottka et al. 1998]; 3% (Zâmbia)
[Kelly et al. 1994]; 7,3% (EUA) [Coyle et al. 1996]. Em Portugal, E. intestinalis foi
identificada em 42,8% de fezes em seropositivos para VIH [Ferreira et al. 2001].
Todavia, não foi detectada nas amostras fecais analizadas no presente trabalho. Diversos
casos de E. intestinalis isolada na urina de doentes, encontram-se descritos. A espécie
foi detectada na urina e fezes de um doente, e na urina, fezes, exsudado nasal e da
conjuntiva de outro doente ambos com sida, que apresentavam microsporidiose
disseminada [Molina et al. 1995; Svedhem et al. 2002]. Boldorini e colaboradores
identificaram uma infecção renal por E. intestinalis, durante a autópsia a um doente com
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 185 -
sida [Boldorini et al. 1998]. A espécie foi também descrita como causadora de infecção
renal num doente transplantado de rim, tendo ocorrido cura após tratamento com
albendazol [Latib et al. 2001].
Frequência e caracterização específica de microsporidia em secreções
pulmonares da população estudada. A frequência de infecção por microsporidia
registada foi de 1,5%, sendo que as duas amostras positivas pertenciam a seropositivos
para VIH. Na população de seronegativos para VIH estudada não foram detectados
esporos de microsporídios.
Nas secreções pulmonares estudadas foram identificadas as espécies E. cuniculi
e Vittaforma-like, num lavado broncoalveolar e numa expectoração induzida,
respectivamente. E. cuniculi é uma espécie responsável por diversas patologias
localizadas e infecção disseminada em doentes imunocomprometidos [Schwartz et al.
1996; Mertens et al. 1997; Weber et al. 1997; Weitzel et al. 2001; Mohindra et al.
2002] assim como em imunocompetentes, tais como idosos, viajantes e residentes em
regiões tropicais [Didier et al. 2000; Gamboa-Dominguez et al. 2003]. Existem diversos
registos de infecção pulmonar por E. cuniculi, tais como os casos de dois doentes
transplantados de medula cuja identificação foi feita em exames pos mortem [Teachey
et al. 2004; Orenstein et al. 2005]. Em seropositivos para VIH, a espécie E. cuniculi já
foi detectada na expectoração, em casos esporádicos em países, como os EUA [De
Groote et al. 1995; Didier et al. 1996c; Croppo et al. 1997], Alemanha [Franzen et al.
1995b], Suiça [Weber et al. 1997], França [Fournier et al. 2000b] e em Espanha [del et
al. 2001a]. Em Portugal, desconhecem-se quaiquer registos de infecção humana ou de
outros animais por E. cuniculi, constituindo a descrição no presente trabalho o primeiro
caso de E. cuniculi num seropositivo para VIH, no país.
O achado da espécie Vittaforma-like numa expectoração induzida e com
genótipo idêntico a um dos isolados desta espécie previamente descrito apenas em
amostras fecais, constitui o primeiro caso identificado desta nova espécie em secreções
pulmonares. Não foi possível determinar se o doente apresentava uma infecção limitada
aos pulmões, ou uma infecção disseminada. A colheita da amostra data do ano de 2000
(incluída no estudo retrospectivo), não existindo a possibilidade de pesquisa do parasita
noutros produtos biológicos do doente. Embora, ainda, permaneça por clarificar a
epidemiologia associada a Vittaforma-like, a presença desta espécie nas vias aéreas
III. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM HUMANOS (SEROPOSITIVOS E SERONEGATIVOS PARA VIH)
- 186 -
superiores pode sugerir que além da transmissão fecal-oral, possa ocorrer, também
transmissão por via aérea através da inalação dos esporos de reduzidas dimensões.
Capítulo IV
DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE
MICROSPORIDIA EM ANIMAIS
IV. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM ANIMAIS
- 189 -
1. INTRODUÇÃO
A primeira descrição de um microsporídio, remonta a meados do século XIX,
nas indústrias de sericicultura de França e Itália. O agente em causa, Nosema bombycis,
provoca uma doença no bicho-da-seda, denominada pebrina [Wittner 1999]. Em 1922,
foi identificada, acidentalmente, a primeira infecção por microsporídios em coelhos de
laboratório, os quais desenvolveram sintomatologia nervosa. Este caso, constituiu o
primeiro registo de microsporidiose em mamíferos, sendo E. cuniculi a causa da doença
[Wright & Craighead 1922; Wittner 1999].
No entanto, poucos anos após o advento da sida, começaram a surgir casos de
microsporidiose humana, em doentes com esta síndrome, provocados por espécies de
microsporídios, até então desconhecidas. A microsporidiose humana está, com
frequência, associada a seropositivos para VIH mas afecta também doentes com outros
défices imunológicos e imunocompetentes [Wittner 1999].
Nos últimos anos, as espécies de microsporidia mais vezes reportadas no
Homem E. bieneusi, E. intestinalis, E. hellem e E. cuniculi foram identificadas em
diversas espécies de animais domésticos e silváticos. Nos mamíferos, E. cuniculi é o
agente causador da encefalitozoonose, afectando em particular, os coelhos, algumas
espécies de roedores e os cães [Snowden & Shadduck 1999]. Relativamente às aves, há
autores que sugerem, que estes animais constituem o reservatório de E. hellem [Suter et
al. 1998; Snowden & Logan 1999].
Os animais estão envolvidos na epidemiologia de muitas doenças definidoras de
sida [Glaser et al. 1994]. No que respeita à microsporidiose humana, apesar do estudo
desta infecção suscitar um interesse crescente, ainda pouco se sabe, sobre a gama de
hospedeiros, das várias espécies de microsporidia e o papel que os animais podem
desempenhar na cadeia epidemiológica da microsporidiose. Todavia, são cada vez mais
as evidências que apontam para a transmissão zoonótica destes agentes infecciosos,
fundamentadas em diversos estudos envolvendo maioritariamente E. bieneusi, a espécie
mais comum, responsável por infecção nos humanos [Mathis et al. 2005]. A recente
aplicação das técnicas moleculares, ao estudo deste microsporídio permitiu o
reconhecimento de diferenças genéticas intra-específicas que têm vindo a contribuir
para uma melhor compreenção da epidemiologia e transmissão zoonótica de E. bieneusi
IV. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM ANIMAIS
- 190 -
[Mathis et al. 2005]. Diversos genótipos associados a grupos específicos de hospedeiros
e outros potencialmente zoonóticos, com capacidade de infectar uma vasta gama de
hospedeiros, inclusive os humanos encontram-se descritos em grupos de animais
domésticos e selvagens [Breitenmoser et al. 1999; Chalifoux et al. 2000; Rinder et al.
2000; Dengjel et al. 2001; Buckholt et al. 2002; Reetz et al. 2002; Sulaiman et al.
2003a; Sulaiman et al. 2003b; Sulaiman et al. 2004].
A ampliação de estudos abrangendo um maior número de espécies de animais
potenciais reservatórios de microsporidia e fontes de infecção humana e ambiental,
aliada à metodologia molecular, com o aperfeiçoamento e/ou desenvolvimento de
marcadores genéticos com elevado poder descriminativo irá, no futuro permitir
clarificar estes aspectos epidemiológicos deste grupo de parasitas.
2. RESULTADOS
2.1. DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE MICROSPORÍDIOS EM ANIMAIS.
2.1.1. Ocorrência e identificação de microsporídios em animais domésticos - cães e
gatos e cães errantes.
A presença de microsporídios nas fezes foi detectada em 13 (quatro cães e nove
gatos; 11,2%) dos 116 cães e gatos (animais de companhia e cães errantes) estudados,
através da técnica de coloração de Gram-Chromotrope. Na maioria das amostras
verificou-se carga parasitária baixa (quatro cães e sete gatos). Em dois gatos, observou-
se uma amostra com carga parasitária média e outra elevada.
Tendo em consideração o critério de positividade adoptado no presente estudo
(amostra positiva: positiva simultâneamente por Gram-Chromotrope e por PCR, ou
exclusivamente por PCR), a frequência de animais infectados por microsporidia foi de
12,1% (14/116), segundo A percentagem de cães e gatos infectados foi de 8,6 % (5/58)
e 15,5% (9/58), respectivamente. Os nove gatos e três cães positivos para microsporidia
pertenciam a agregados familiares e dois cães eram procedentes do Canil Municipal de
Torres Vedras. Os animais positivos para microsporidia não apresentavam
IV. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM ANIMAIS
- 191 -
sintomatologia, com excepção de dois gatos que manifestavam um quadro diarreico. Os
cães do Canil Municipal de Torres Vedras, permaneciam no canil há duas semanas.
E. bieneusi foi a única espécie identificada nas amostras fecais deste grupo de
animais analizados. A caracterização das sequências ITS rRNA dos 14 isolados de E.
bieneusi, amplificados por PCR e o seu alinhamento com outras sequências de
identidade conhecida, veio revelar a presença de seis genótipos distintos: TipoIV
(código de acesso ao GenBank AF242478), PtEbIV, Peru6 (código de acesso ao
GenBank AY371281 e DQ154137), D (código de acesso ao GenBank AF101200,
DQ793213, DQ683751, DQ683755, e AF023245), PtEbVIII e PtEbIX. Os genótipos
PtEbIV (código de acesso ao GenBank DQ885580), PtEbVIII (código de acesso ao
GenBank DQ885584) e PtEbIX (código de acesso ao GenBank DQ885585, AF059610,
e EU650273), foram descritos pela primeira vez no decurso deste estudo. Nos cães
foram identificados os genótipos D (20%; 1/5), Peru6 (60,0%; 3/5) e PtEbIX (20%;1/5).
Nos gatos, uma elevada frequência de infecção 77,8% (7/9) foi observada para o
genótipo TipoIV, comparativamente à de 11,1% (1/9) registada para o genótipo PtEbIV
e também à de 11,9% (1/9) para PtEbVIII. A análise dos resultados obtidos para a
distribuição dos diferentes genótipos nos cães e nos gatos, permitiu verificar a
associação com significância estatística da infecção pelo genótipo Tipo IV ao grupo dos
gatos (χ2=12,996; p=0,003), relativamente aos cães estudados.
2.1.2. Ocorrência e identificação de microsporídios em bovinos.
Através da técnica de coloração do Gram-Chromotrope foram detectadas
estruturas compatíveis com esporos de microsporídios em dois dos 100 bovinos
estudados. Ambas as amostras apresentavam baixas cargas parasitárias.
Segundo o critério de positividade seleccionado no presente estudo, a frequência
de microsporidia determinada foi de 6% (6/100) nas fezes de bovinos. Quatro de seis
amostras positivas não foram detectadas pela coloração de Gram-Chromotrope.
Também neste grupo de animais, a espécie E. bieneusi foi o único microsporidia
identificado nas seis amostras positivas estudadas. A análise de sequenciação dos
fragmentos da região ITS rRNA, amplificados por PCR e o posterior alinhamento com
sequências de identidade conhecida, permitiu revelar a existência de três genótipos
IV. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM ANIMAIS
- 192 -
diferentes (dois dos quais já previamente reportados): TipoIV (50%; 3/6) (código de
acesso ao GenBank AF242478), PtEbXI (33,3%; 2/6) e J (16,7%; 1/6) (código de
acesso ao GenBank AF135837). O genótipo PtEbXI (código de acesso ao GenBank
DQ885587) foi caracterizado pela primeira vez no decurso deste estudo.
2.1.3. Ocorrência e identificação de microsporídios em animais silváticos em
cativeiro (Jardim Zoológico de Lisboa).
A técnica parasitológica de Gram-Chromotrope identificou estruturas
compatíveis com esporos de microsporídios em amostras fecais de três animais do
Jardim Zoológico de Lisboa: um saguim de face branca (Callithrix geoffroyi), um lama
(Lama glama glama), e uma Naja indiana (Naja naja kaouthia). Nestas duas últimas
espécies não foi possível, apesar dos esforços, obter amplificação por nenhum dos
protocolos de PCR adoptados no presente trabalho. As cargas parasitárias registadas
oscilaram entre um valor baixo (no lama e no naja indiana) a médio (no sanguim de face
branca).
A frequência de infecção por microsporidia, determinada com base no critério de
positividade, observada nos animais do Jardim Zoológico de Lisboa foi de 1,9%
(2/103).
Apenas a espécie E. bieneusi foi identificada nas amostras fecais de dois
mamíferos: o saguim de face branca (Callithrix geoffroyi) e o cavalo de Timor
(Tragelaphus strepsiceros strepsiceros). A genotipagem das sequências ITS rRNA
obtidas dos dois isolados e posterior comparação com sequências de identidade
conhecida, permitiu caracterizar, pela primeira vez, durante o decurso deste trabalho,
dois genótipos distintos: PtEbV (código de acesso ao GenBank DQ885581) e PtEbXII
(código de acesso ao GenBank DQ885588), identificados no cavalo de Timor e no
saguim de face branca, respectivamente (Quadro XXXIX).
IV. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM ANIMAIS
- 193 -
2.1.4. Ocorrência e identificação de microsporídios em animais silváticos de vida
livre.
No presente estudo, realizado em 134 pequenos mamíferos (musaranhos de
dentes brancos-Crocidura russula, ratinhos ruivos-Mus spretus e ratinhos do campo-
Apodemus sylvaticus), na região do Baixo Alentejo, não foi observado nenhum animal
com infecção por microsporidia. As amostras fecais recolhidas para cada animal eram
em quantidade muito reduzida, tendo-se optado, por canalizar toda a amostra para a
aplicação das técnicas de PCR. Todavia, os resultados obtidos podem ter sido
condicionados pela pequena quantidade de amostra fecal inicial, submetida à técnica de
extração de DNA obtida para cada animal.
No Quadro XXXIX encontram sumarizados os dados dos animais – cães, gatos,
gado bovino e animais silváticos em cativeiro, identificados com microsporidia e cujos
isolados foram caracterizados no presente trabalho.
IV. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM ANIMAIS
- 194 -
Quadro XXXIX. Dados dos animais – cães, gatos, gado bovino e animais silváticos em cativeiro, identificados com microsporidia e cujos isolados foram
caracterizados no presente trabalho.
NºAMOSTRA ORIGEM NOME COMUM/NOME CIENTÍFICO ESPÉCIMES CG CARGA
PARASITÁRIA POS* ESPÉCIE GENÓTIPO (S)
Animais de companhia e cães errantes
G1 AF Gato / Felis catus F Pos +++ Pos E. bieneusi TipoIV G2 AF Gato / Felis catus F Neg Pos E. bieneusi PtEbIV G3 AF Gato / Felis catus F Pos + Pos E. bieneusi TipoIV G4 AF Gato / Felis catus F Neg Pos E. bieneusi TipoIV G5 AF Gato / Felis catus F Pos ++ Pos E. bieneusi PtEbVIII G6 AF Gato / Felis catus F Neg Pos E. bieneusi TipoIV G7 AF Gato / Felis catus F Neg Pos E. bieneusi TipoIV G8 AF Gato / Felis catus F Neg Pos E. bieneusi TipoIV G9 AF Gato / Felis catus F Pos + Pos E. bieneusi TipoIV C10 CMTV Câo / Canis familiaris F Neg Pos E. bieneusi D C11 CMTV Câo / Canis familiaris F Neg Pos E. bieneusi Peru6 C12 AF Câo / Canis familiaris F Pos + Pos E. bieneusi PtEbIX C13 AF Câo / Canis familiaris F Neg Pos E. bieneusi Peru6 C14 AF Câo / Canis familiaris F Neg Pos E. bieneusi Peru6
Bovinos
B1 M Bovino / Bovis bovis F Pos + Pos E. bieneusi J B2 M Bovino / Bovis bovis F Pos + Pos E. bieneusi PtEbXI B3 BA Bovino / Bovis bovis F Neg Pos E. bieneusi TipoIV B4 A Bovino / Bovis bovis F Neg Pos E. bieneusi PtEbXI B5 BA Bovino / Bovis bovis F Neg Pos E. bieneusi TipoIV B6 BA Bovino / Bovis bovis F Neg Pos E. bieneusi TipoIV
Animais silváticos em
cativeiro
Z243 JZL Saguim de face branca / Callithrix geoffroyi F Pos ++ Pos E. bieneusi PtEbXII
Z188 JZL Cavalo de Timor /Tragelaphus strepsiceros strepsiceros F Neg Pos E. bieneusi PtEbV
AF: Agregado familiar; CMTV: Canil Municipal de Torres Vedras; M: Moura; BA: Baixo Alentejo; Aljustrel; JZL: Jardim Zoológico de Lisboa; F: fezes; GC: Gram-
Chromotrope; Pos: positivo; Neg: negativo; Pos*: positivos segundo o critério de positividade adoptado no presente estudo (amostra positiva: positiva simultâneamente por
GC e por PCR, ou exclusivamente por PCR).
IV. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM ANIMAIS
- 195 -
2.1.5. Diversidade genética da região ITS rRNA de Enterocytozoon bieneusi na
população de animais estudada
A totalidade dos 22 isolados de E. bieneusi caracterizados geneticamente, entre os
diversos grupos de animais estudados (animais domésticos, cães errantes, bovinos,
animais silváticos em cativeiro e de vida livre) foram identificados em mamíferos (cinco
cães, nove gatos, sete bovídeos e um primata) (Quadro XXXIX).
A extensão dos polimorfismos genéticos entre os isolados de E. bieneusi foi
determinada através do alinhamento múltiplo das sequências ITS rRNA obtidas. A
análise destes resultados revelou a presença de 10 genótipos distintos (TipoIV, PtEbIV,
PtEbV, D, Peru6, PtEbVIII, PtEbIX, J, PtEbXI, PtEbXII) entre este grupo de mamíferos
estudado. Com o objectivo de conhecer a relação genética existente entre os isolados de
E. bieneusi obtidos foi construída uma árvore filogenética, com as 22 sequências ITS
obtidas neste estudo, e diversas sequências ITS rRNA de E. bieneusi previamente
publicadas [Breitenmoser et al. 1999; Chalifoux et al. 2000; Rinder et al. 2000; Dengjel
et al. 2001; Buckholt et al. 2002; Reetz et al. 2002; Sulaiman et al. 2003a; Sulaiman et
al. 2003b; Sulaiman et al. 2004]. A combinação destes dados permite evidenciar a
existência de seis grupos principais (Figura 13).
IV. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM ANIMAIS
- 196 -
Figura 13. Relação filogenética entre os genótipos de E. bieneusi identificados nos
mamíferos e outros genótipos de E. bieneusi, previamente descritos, inferida pela
análise de sequências do gene ITS rRNA através do método “neighbor joining”, tendo
por base distâncias genéticas calculadas pelo modelo de dois parâmetros de Kimura. A
árvore foi construída utilizando como grupo externo a sequência mais divergente para
Enterocytozoon sp. isolada de um cão, com o código de acesso ao GenBank AF059610.
Os números sobre os ramos indicam os valores de confiança, determinados por análise
de “bootstrap” com 1.000 réplicas.
IV. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM ANIMAIS
- 197 -
O primeiro grupo mais importante, engloba diversas sequências de E. bieneusi
publicadas e identificadas nos humanos, e noutros animais domésticos e silváticos
[Breitenmoser et al. 1999; Chalifoux et al. 2000; Rinder et al. 2000; Dengjel et al.
2001; Buckholt et al. 2002; Reetz et al. 2002; Sulaiman et al. 2003a; Sulaiman et al.
2003b; Sulaiman et al. 2004], assim como a maioria das sequências ITS obtidas no
presente estudo. O segundo grupo inclui sequências previamente descritas em bovinos
[Rinder et al. 2000; Sulaiman et al. 2004] e duas das sequências ITS identificadas em
bovinos neste trabalho. O terceiro grupo é constituído por isolados de E. bieneusi
descritos em ratos-almíscarados, e um isolado de um gato analizado neste estudo. O
quarto grupo é representado exclusivamente pelo genótipo único do saguim de face
branca (primata) registado neste trabalho. Genótipos de E. bieneusi associados aos
guaxinins e a cães, constituem o quinto e o sexto grupo, respectivamente, colocados na
base da árvore filogenética.
2.2. Microsporidia em aves exóticas de gaiola e pombos urbanos de Lisboa
2.2.1. Ocorrência e identificação de microsporídios
De entre as 91 aves pertencentes às três ordens estudadas (Psittaciformes,
Passeriformes e Columbiformes), foram identificadas 11 positivas (12,1%), para
microsporídios, através da técnica de coloração do Gram-Chromotrope. correspondentes
a quatro aves exóticas e sete pombos domésticos, das Ordens Psittaciformes e
Columbiformes, respectivamente. A carga parasitária da maioria das amostras positivas,
estimada de acordo com o critério adoptado (vide Capítulo – Material e Métodos)
oscilou entre um valor baixo a médio. Apenas, na amostra de exudado traqueal de um
papagaio cinzento se registou uma carga parasitária elevada. No esfregaço submetido ao
Gram-Chromotrope, correspondente a esta amostra, observaram-se estruturas ovaladas
de parede fina corada de rosa com uma pequena zona polar ou central não corada
compatíveis com esporos de microsporídios (Figura 14)
IV. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM ANIMAIS
- 198 -
Figura 14. Fotografia de esporos de E. hellem em esfregaço da mucosa traqueal de um
papagaio cinzento (Psittacus erithacus). Coloração pelo Gram-Chromotrope. (×1000).
Original da autora.
A percentagem de amostras positivas para microsporidia determinada, segundo o
critério de positividade foi de 40,7% (37/91). A proporção de resultados positivos em
cada Ordem de aves estudada, distribui-se do seguinte modo: Psittaciformes 15,5%
(5/32); Passeriformes 42,8% (3/7); Columbiformes 55,8% (29/52).
À excepção de um papagaio cinzendo em que se observou perda de apetite e
emagrecimento na semana anterior ao óbito e de três papagaios cinzentos em que
ocorreu morte súbita, as restantes aves estudadas não apresentavam manifestações
clínicas.
As espécies E. bieneusi e E. hellem foram identificadas, em 35,2% (32/91) e
13,2% (12/91), respectivamente das aves estudadas.
E. bieneusi foi a única espécie registada nas seguintes aves estudadas: um
inseparável e 24 pombos domésticos. Num papagaio cinzento, dois tentilhões japoneses
e dois pombos domésticos apenas se identificou E. hellem. Numa caturra, dois
papagaios cinzentos, um diamante estrela e três pombos domésticos foi detectada co-
infecção por ambas as espécies (Quadro XL). Ambos os microsporidia foram
identificados nas três Ordens de aves estudadas: Psittaciformes (E. bieneusi- 12,5%; E.
IV. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM ANIMAIS
- 199 -
hellem- 12,5%); Passeriformes (E. bieneusi- 14,3%; E. hellem- 42,9%) e
Columbiformes (E. bieneusi- 51,9%; E. hellem- 6,9%). Contudo, nos pombos
domésticos (Columbiformes) registou-se uma elevada frequência de infecção por E.
bieneusi, estatísticamente significativa (ᵡ2=14,954; p=0,001), comparativamente à
observada nas outras duas Ordens de aves. Para a espécie E. hellem, embora tenha-se
verificado uma percentagem mais elevada de infecção nos Passeriformes (42,9%; 3/7), a
diferença não apresentava significância estatística. Não foi encontrada associação entre
as espécies de aves estudadas e a presença de E. bieneusi e/ou E. hellem.
Das 56 raspagens traqueais (52 pombos domésticos e quatro papagaios
cinzentos) analizadas, apenas numa amostra pertencente a um papagaio cinzento, foram
identificados esporos de microsporídios, nomeadamente a espécie E. hellem (Figura ).
Nos restantes produtos biológicos estudados (fezes e conteúdo intestinal) ambas as
espécies E. bieneusi e E. hellem foram encontradas.
2.2.2. Caracterização genética dos isolados de Enterocytozoon bieneusi e
Encephalitozoon hellem
No presente trabalho, foram submetidos à caracterização do locus ITS rRNA, os
32 isolados, pertencentes à espécie E. bieneusi, e do locus SSU rRNA, os 12 isolados da
espécie E. hellem, identificados nas amostras fecais e/ou conteúdo intestinal e numa
raspagem da traqueia da população de aves analizada.
A totalidade dos 32 isolados de E. bieneusi obtidos foi caracterizada
geneticamente com sucesso. A determinação da sequência nucleotídica de todos os
fragmentos da região ITS rRNA amplificados e o seu alinhamento com outras
sequências de identidade conhecida, conduziu à identificação dos genótipos envolvidos.
A análise das sequências revelou a presença num inseparável, uma caturra, um papagaio
cinzento, um diamante estrela e 22 pombos domésticos do genótipo Peru6 (código de
acesso ao GenBank AY371281, DQ154137 e DQ425107), descrito pela primeira vez
em humanos, no Peru [Sulaiman et al. 2003a]. Nos isolados de E. bieneusi de um
papagaio cinzento e sete pombos domésticos foi caracterizado, pela primeira vez, no
decurso do presente trabalho, o genótipo PtEbII (código de acesso ao GenBank
DQ425108) muito semelhante ao Peru6, com uma única alteração nucleotídica (G para
A) junto da extremidade 3’ do fragmento amplificado por PCR. Em dois pombos
IV. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM ANIMAIS
- 200 -
domésticos, com base na análise das sequências de DNA e de repetidas amplificações
por PCR, registou-se a presença simultânea dos dois genótipos.
Os 12 isolados de E. hellem foram caracterizados com recurso à sequenciação
nucleotídica do fragmento do gene da SSU rRNA amplificado pela PCR. As sequências
parciais da SSU rRNA obtidas foram alinhadas entre si, e com outras sequências de
identidade conhecida descritas no GenBank. As sequências obtidas dos isolados das
aves deste estudo registaram entre 99% a 100% de homologia genética com sequências
do gene da SSU rRNA, previamente reportadas no homem e em aves (código de acesso
ao GenBank AF338366, AF338365, AF177920, AF272836, AF338364, AF118143,
AF118142, L19070 e L39108). No interior das regiões alvo amplificadas por PCR
registaram-se três locais polimórficos, que permitem agrupar em três tipos diferentes as
12 sequências dos isolados de E. hellem obtidos neste estudo. As sequências da SSU
rRNA dos isolados de três papagaios cinzentos e uma caturra (PtEh I) são idênticas entre
si e à sequência correspondente ao genótipo1 (código de acesso ao GenBank
AF272836), descrito no GenBank. As cinco sequências identificadas nos pombos
domésticos (PtEh II) eram semelhantes entre si, e com elevada homologia genética com
o genótipo 2 (código de acesso ao GenBank AF110327), previamente reportado no
GenBank, revelando apenas uma única diferença nucleotídica, na posição
imediatamente a seguir ao terceiro local polimórfico característico desta região. As
restantes três sequências da SSU rRNA, pertencentes a dois tentilhões japoneses e a um
diamante estrela revelaram homologia total entre elas (PtEh III), divergindo das
sequências registadas para os pombos domésticos, em apenas um nucleótido, na posição
correspondente ao segundo local polimórfico. Todavia, as sequências determinadas
neste estudo não são consideradas ainda genótipos definitivos. A caracterização
genética exacta da diversidade intra-especifica entre os isolados de E. hellem obtidos
terá que ser efectuada com recurso a outros marcadores genéticos mais descriminativos
(PTP, ITS). As três sequências do gene da SSU rRNA de E. hellem determinadas neste
estudo encontram-se descritas no GenBank com os seguintes códigos de acesso
DQ425104 (PtEhI), DQ425105 (PtEhII) e DQ425106 (PtEhIII).
IV. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM ANIMAIS
- 201 -
No Quadro XL podem observar-se sumarizados os dados correspondentes às
diversas espécies de aves incluídas na população estudada, identificadas com
microsporidia nas amostras fecais e cujos isolados foram caracterizados no presente
trabalho
IV. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM ANIMAIS
- 202 -
Quadro XL. Dados das diversas espécies de aves identificadas com microsporidia e cujos isolados foram caracterizados no presente trabalho.
ORDEM NºAMOSTRA ORIGEM NOME COMUM/NOME CIENTÍFICO ESPÉCIMES CG CARGA PARASITÁRIA POS* ESPÉCIE (S) GENÓTIPO (S)
Psittaciformes
1 Criador de aves Inseparáveis/Agapornis sp. F Pos + Pos E. bieneusi Peru6 6 Particular Caturra/Nymphicus hollandicus F Pos + Pos E. bieneusi e E. hellem Peru6 / ND 3 Criador de aves Papagaio cinzento/Psittacus erithacus F Pos + Pos E. bieneusi e E. hellem Peru6 / ND 5 Particular Papagaio cinzento/Psittacus erithacus F Neg Pos E. bieneusi e E. hellem PtEbII / ND 8 Criador de aves Papagaio cinzento/Psittacus erithacus ET Pos +++ Pos E. hellem ND
Passeriformes
2 Criador de aves Diamante estrela/Bathilda ruficauda F Neg Pos E. bieneusi e E. hellem Peru6 / ND 4 Criador de aves Tentilhão japonês/Lonchura domestica F Neg Pos E. hellem ND 7 Criador de aves Tentilhão japonês/Lonchura domestica F Neg Pos E. hellem ND
Columbiformes
2 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Pos + Pos E. bieneusi Peru6 3 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Pos + Pos E. bieneusi Peru6 5 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Pos ++ Pos E. bieneusi Peru6 6 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Pos + Pos E. bieneusi Peru6 8 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6
10 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6 11 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6 13 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6 15 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6 16 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6 17 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6 18 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6 21 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6 22 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6 23 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi PtEbII 26 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Pos ++ Pos E. bieneusi e E. hellem Peru6 / ND 27 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi e E. hellem Peru6 e PtEbII / ND 28 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Pos + Pos E. bieneusi e E. hellem Peru6 e PtEbII /ND 30 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. hellem ND 33 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. hellem ND 35 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi PtEbII 36 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi PtEbII 40 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6 42 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6 45 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi PtEbII 48 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Pos + Pos E. bieneusi Peru6 49 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi PtEbII 51 Praça do Império Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi Peru6 52 R.Epifânio Dias Pombo doméstico/Columba livia CI Neg Pos E. bieneusi PtEbI
F: fezes; ET: exsudado traqueal; CI: conteúdo intestinal; GC: Gram-Chromotrope; Pos: positivo; Neg: negativo; Pos*: positivos segundo o critério de positividade adoptado no estudo; ND: não determinado (As sequências do fragmento do gene da SSU rRNA obtidas para os isolados de E.hellem não são consideradas como genótipos)
IV. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM ANIMAIS
- 203 -
3. DISCUSSÃO
Ocorrência de microsporidia em animais de companhia (cães e gatos),
bovinos, animais silváticos em cativeiro e de vida livre. A frequência de animais
domésticos (cães e gatos) infectados por microsporidia foi de 12,1%, segundo o critério
de positividade seleccionado no presente estudo. A percentagem de cães e gatos
infectados foi de 8,6 % (5/58) e 15,5% (9/58), respectivamente. Todos os gatos e três
dos cães positivos para microsporidia pertenciam a agregados familiares, e dois cães
eram procedentes do Canil Municipal de Torres Vedras. Os cães deste canil, em virtude
do facto de terem sido capturados duas semanas antes da recolha de fezes para estudo,
não permite determinar, se contraíram a infecção dentro ou fora do canil.
E. bieneusi foi a única espécie identificada nas amostras fecais dos cães e dos
gatos analisados. Diversos autores referem frequências de infecção por E. bieneusi em
cães, semelhantes ou superiores à encontrada no nosso estudo: 8, 3% na Suiça [Mathis
et al. 1999a], 10,8% e 11,7% em Espanha [del et al. 1999; Lores et al. 2002a], 15,0% na
Colômbia [Santin et al. 2008], e 23,0% nos EUA [Jafri et al. 1993]. No respeitante à
infecção por E. bieneusi em gatos são registadas prevalências da ordem dos 8,3% na
Suiça [Mathis et al. 1999a] e de 17,0% na Colômbia [Santin et al. 2006].
A técnica parasitologica de coloração só detectou quatro das amostras
consideradas positivas, para o estudo, embora tenha detectado em nove amostras
estruturas compatíveis com esporos de microsporídios, que não foram contudo
confirmadas por PCR. Assim, sumariamente, dado que algumas das justificações
sugeridas para a discrepância entre os resultados obtidos pelas técnicas seleccionadas
para este estudo já foram discutidas com maior detalhe, sugere-se que a maior
capacidade de detecção de amostras positivas, pela PCR, se encontra associada à
elevada sensibilidade desta técnica, nomeadamente em presença de baixas cargas
parasitárias. Por outro lado, a presença de diversos inibidores em determinados produtos
biológicos, tal como se verifica na generalidade das amostras fecais pode conduzir a
resultados falsos negativos por técnicas moleculares, podendo ser apontada como uma
das razões para a obtenção de amostras positivas por Gram-Chromotrope, mas negativas
por PCR. Igualmente, as reduzidas dimensões dos esporos dos microsporídios e o seu
fraco poder tintorial, aliada a amostras biológicas com cargas parasitárias baixas e à
presença de elevados número de outros microrganismos de morfologia e coloração
IV. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM ANIMAIS
- 204 -
semelhante, pode conduzir a falsos negativos obtidos pela técnica de Gram-
Chromotrope, mas que são detectados por PCR.
Todos os animais infectados por microsporidia não apresentavam
sintomatologia, à excepção de dois gatos com diarreia de etiologia desconhecida.
Assim, sugere-se que estes animais correspondam a portadores assintomáticos de E.
bieneusi.
A caracterização das sequências ITS rRNA dos 14 isolados de E. bieneusi,
obtidos de cães e gatos, amplificados por PCR e o seu alinhamento com outras
sequências de identidade conhecida, permitiu a identificação de seis genótipos
diferentes: TipoIV, PtEbIV, Peru6, D, PtEbVIII e PtEbIX, em que os genótipos PtEbIV,
PtEbVIII e PtEbIX, foram descritos pela primeira vez no decurso deste estudo [Lobo et
al. 2006c]. Nos cães foram identificados os genótipos D (20%), Peru6 (60,0%) e
PtEbIX (20%). Enquanto, nos gatos, uma elevada frequência de infecção 77,8%
registou-se para o genótipo TipoIV, comparativamente à de 11,1% observada para o
genótipo PtEbIV e também à de 11,9% para PtEbVIII. Da análise dos resultados obtidos
para a distribuição dos diferentes genótipos nos cães e nos gatos, verificou-se a
existência de associação estatisticamente significativa da infecção pelo genótipo Tipo
IV aos gatos.
A frequência de microsporidia determinada segundo o critério de positividade
seleccionado no presente estudo foi de 6% (6/100) nas fezes de bovinos. Também nos
bovinos a espécie E. bieneusi foi o único microsporidia identificado nas amostras
positivas estudadas. Diversos estudos reportam a infecção por E. bieneusi em bovinos.
Sulaiman e colaboradores registaram 9,5% de bovinos infectados por esta espécie, nos
EUA [Sulaiman et al. 2004]. Uma percentagem de infecção superior correspondente a
13% foi registada, na Colômbia [Santin et al. 2004].
Quatro de seis amostras positivas por PCR não foram detectadas pelo Gram-
Chromotrope. Mais uma vez, sugere-se como causas para este facto, a existência de
cargas parasitárias baixas nas amostras, assim como a presença de um número elevado
de outros microrganismos (bactérias e leveduras) e ainda as características morfológicas
e de coloração inerentes aos microsporídios, que podem comprometer um diagnóstico
correcto.
IV. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM ANIMAIS
- 205 -
A caracterização genética das sequências ITS rRNA dos isolados de E. bieneusi,
obtidos em bovinos revelou a existência de três genótipos diferentes (dois dos quais já
previamente reportados): TipoIV (50%), PtEbXI (33,3%) e J (16,7%), em que o
genótipo PtEbXI foi identificado pela primeira vez no decurso deste estudo [Lobo et al.
2006c].
A frequência de infecção por microsporidia, determinada com base no critério de
positividade, observada nos animais do Jardim Zoológico de Lisboa foi de 1,9%
(2/103). Também neste grupo de animais silváticos em cativeiro, apenas a espécie E.
bieneusi foi identificada nas amostras fecais de dois mamíferos: um saguim de face
branca (Callithrix geoffroyi) e um cavalo de Timor (Tragelaphus strepsiceros
strepsiceros). Slokowicz-Kowalska e colaboradores registaram 1,6% (3/193) de
infecção por E. bieneusi em animais do zoológico, nomeadamente em lémures e um
suíno sem sintomatologia associada. Assim, no estudo destes autores, tal como no
presente trabalho, verificou-se percentagens semelhantes de infecção por esta espécie de
microsporidia, que também foram registadas apenas no grupo dos mamíferos em
cativeiro.
A técnica parasitológica de Gram-Chromotrope identificou estruturas
compatíveis com esporos de microsporídios em duas amostras fecais, de um lama
(Lama glama glama) e de uma Naja indiana (Naja naja kaouthia), das quais não foi
possível obter amplificação por nenhum dos protocolos de PCR adoptados no presente
trabalho. Como possíveis causas para a ausência de amplificação nestas amostras,
sugere-se a existência de inibidores de técnica de PCR, ou ainda, especialmente no caso
do réptil, estar-se em presença de outra espécie de microsporidia em que os primers
seleccionados neste trabalho, não permitiram a sua detecção.
A genotipagem das sequências ITS rRNA obtidas dos dois isolados de E. bienusi
permitiu caracterizar pela primeira vez, durante o decurso deste trabalho, dois genótipos
distintos: PtEbV e PtEbXII, identificados no cavalo de Timor e no saguim de face
branca, respectivamente [Lobo et al. 2006c].
No estudo, realizado em pequenos mamíferos (musaranhos de dentes brancos-
Crocidura russula, ratinhos ruivos-Mus spretus e ratinhos do campo-Apodemus
sylvaticus), da região do Baixo Alentejo, não foi identificado nenhum animal com
infecção por microsporidia. As reduzidas quantidades de amostra fecal, recolhidas para
IV. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM ANIMAIS
- 206 -
cada animal, podem ter condicionado os resultados obtidos conduzindo a falsos
negativos entre a população estudada.
Os 22 isolados de E. bieneusi cujas sequências ITS rRNA foram caracterizadas
geneticamente, pertencentes a diferentes espécies de animais dos diversos grupos
estudados (animais domésticos, cães errantes, bovinos, animais silváticos em cativeiro e
de vida livre) foram todos identificados em mamíferos (cinco cães, nove gatos, sete
bovídeos e um primata) (vide Quadro XXXIX). A análise para determinar a extensão da
heterogeneidade genética entre os isolados de E. bieneusi obtidos revelou a presença de
10 genótipos diferentes, entre este grupo de mamíferos estudado: TipoIV, PtEbIV,
PtEbV, D, Peru6, PtEbVIII, PtEbIX, J, PtEbXI e PtEbXII.
A diversidade da região ITS rRNA de E. bieneusi, entre os 22 isolados identificados
em mamíferos obtidos neste estudo, pode ser observada na árvore filogenética
construída (Figura 13). A combinação dos resultados obtidos, permitiu evidenciar a
existência de seis grupos principais. Dentro do primeiro grupo, que reune os genótipos
patogénicos para o Homem, os isolados de E. bieneusi de sete gatos e três bovinos,
caracterizados neste estudo, revelaram sequências ITS idênticas ao genótipo TipoIV
(código de acesso ao Genbank AF242478), descrito previamente no homem
(seropositivos e seronegativos para VIH) [Liguory et al. 1998; Tumwine et al. 2002;
Sulaiman et al. 2003a; Breton et al. 2007], gatos, cães e ruminantes [Dengjel et al.
2001; Sulaiman et al. 2004; Santin et al. 2006; Lobo et al. 2006c; Santin et al. 2008]. O
isolado do cavalo de Tróia, cujo genótipo (PtEbV; Genbank DQ885581) foi descrito
pela primeira vez no decurso deste estudo [Lobo et al. 2006c], apresenta uma sequência
ITS semelhante ao Peru3 (Genbank AY371278), descrito em seropositivos para VIH, no
Peru [Sulaiman et al. 2003a]. Um isolado identificado num cão, incluído neste trabalho,
apresenta uma sequência ITS semelhante à do genótipo D (códigos de acesso ao
Genbank AF101200, DQ793213, DQ683751, DQ683755 e AF023245), previamente
reportado em seropositivos para VIH em diversos países (Peru, Gabão, Alemanha,
Inglaterra e Portugal) [Rinder et al. 1998b; Sulaiman et al. 2003a; Breton et al. 2007],
assim como em animais (castor, ruminantes, cães, raposas, primatas não humanos, rato-
almíscarado, suínos e guaxinins) [Chalifoux et al. 2000; Buckholt et al. 2002; Lee
2007]. Igualmente, a sequência ITS de E. bieneusi caracterizada noutro isolado de um
cão (PTEbVII) é idêntica à sequência registada para o genótipo Peru6 (códigos de
IV. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM ANIMAIS
- 207 -
acesso ao Genbank AY371281 e DQ154137), descrito em humanos [Sulaiman et al.
2003a], vitelos [Santin et al. 2005] e aves [Lobo et al. 2006b].
Três dos genótipos isolados dos bovinos identificados neste estudo integram-se
no grupo dos genótipos associados aos bovinos. Uma das sequências ITS isolada
apresenta uma sequência idêntica à do genótipo J (código de acesso ao Genbank
AF135837) [Rinder et al. 2000; Dengjel et al. 2001; Sulaiman et al. 2004; Lobo et al.
2006c; Lee 2007], e a outra sequência (PtEbXI; código de acesso ao Genbank
DQ885587) [Lobo et al. 2006c] que se registou pela primeira vez neste trabalho é muito
semelhante à do genótipo I (código de acesso ao Genbank AF135836) [Rinder et al.
2000; Sulaiman et al. 2004; Lee 2007] . Estes isolados diferem entre si em apenas 2pb.
No presente trabalho foi identificado um genótipo único PtEbVIII (código de acesso ao
Genbank DQ885584) [Lobo et al. 2006c], num gato integrado no grupo de genótipos
associados aos ratos-almíscarados.
Verificou-se que o quarto grupo era exclusivamente constituído por um genótipo
único (PtEbXII; código de acesso ao Genbank DQ885588) identificado no sanguin de
face branca [Lobo et al. 2006c]. Nenhum genótipo associado ao grupo dos guaxinins foi
detectado no nosso estudo. No entanto foi caracterizado num cão um genótipo (PtEbIX;
códigos de acesso ao Genbank DQ885585, AF059610, e EU650273) [Mathis et al.
1999a; Lobo et al. 2006c; Santin et al. 2008] idêntico à sequência de Enterocytozoon sp.
(código de acesso ao Genbank AF059610) mais divergente, descrita também num cão.
Sumarizando, no presente estudo, foi identificada exclusivamente a presença da
espécie E. bieneusi em animais de companhia (cães e gatos), bovinos de exploração e
animais silváticos em cativeiro (Jardim Zoológico de Lisboa) em frequências que
oscilaram entre 1,9% e os 15,5%. No decurso do trabalho foram caracterizados diversos
genótipos de E. bieneusi, entre os quais alguns foram registados pela primeira vez. Este
facto vem corroborar estudos prévios conduzidos em mamíferos em que se observa em
determinada área geográfica a presença de múltipos genótipos responsáveis por infecção
em humanos e outros animais [Rinder et al. 1997; Liguory et al. 1998; Dengjel et al.
2001; Tumwine et al. 2002; Sulaiman et al. 2003b].
A identificação de genótipos idênticos a outros previamente reportados em
humanos e animais vem adicionar novas evidências ao potencial papel zoonótico
desempenhado pela espécie E. bieneusi. Assim como, reforça a hipótese de ausência de
IV. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM ANIMAIS
- 208 -
barreiras entre diversas espécies de animais ou mesmo entre diferentes classes
taxonómicas de hospedeiros.
A análise da diversidade genética da região ITS rRNA observada entre os 22
isolados de E. bieneusi, identificados em diferentes espécies de mamíferos em estreito
contacto com o Homem, revelou a presença de genótipos patogénicos para os humanos
assim como genótipos específicos de hospedeiro. Os resultados obtidos no presente
trabalho sugerem que cães, gatos e bovídeos identificados com genótipos patogénicos
para os humanos possam constituir fontes de infecção de microsporídios para o homem,
bem como fonte de contaminação do ambiente, a partir de fezes ou da decomposição de
cadáveres.
Ocorrência de microsporidia em aves exóticas e pombos urbanos. No
presente trabalho verificou-se que 40,7% (37/91) das aves exóticas e pombos urbanos
encontravam-se infectados por microsporidia. Da análise dos resultados obtidos, pelas
diferentes técnicas, verifica-se que nem sempre houve conformidade dos resultados.
Dos 37 casos positivos, identificados de acordo com o critério de positividade adoptado,
apenas 11 foram detectados pela técnica de Gram-Chromotrope. A discordância de
resultados pode, estar relacionada com a diferente metodologia utilizada na
determinação de cada uma destas percentagens. Tal como já foi discutido neste trabalho
mais em pormenor, a PCR é descrita na literatura como sendo uma técnica mais
sensível, com um limite de detecção dos esporos inferior comparativamente ao dos
métodos parasitológicos de coloração [Rinder et al. 1998a; Gumbo et al. 1999b; Fayer
et al. 2003a; Fayer et al. 2003b; Endeshaw et al. 2005]. Assim, teoricamente, em
presença de amostras com baixa carga parasitária a PCR possui uma maior capacidade
de detecção de amostras positivas. À excepção da amostra positiva de exsudado traqueal
com carga parasitária elevada, as restantes amostras positivas por Gram-Chromotrope
apresentavam maioritáriamente uma baixa carga parasitária, podendo ser uma das
justificações apontadas para a discrepância de resultados obtidos. Outra das razões
sugeridas para este facto, consiste na dificuldade de detectar os esporos de
microsporídios, através da microscopia óptica, em amostras com baixa carga parasitária
e com um elevado número de bactérias e/ou pequenas leveduras, com características
morfológicas e de coloração semelhantes aos microsporídios. A presença de elevada
carga microbiana com estas características foi observada na maioria das amostras dos
IV. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM ANIMAIS
- 209 -
espécimes analizados, o que puderá ter conduzido a resultados falsos negativos pelo
Gram-Chromotrope.
Relativamente aos aspectos clínicos da maioria das aves infectadas por
microsporidia, não havia sintomas nem sinais, que levassem a pensar que as aves
estivessem doentes. Apenas para o papagaio cinzento em cujo exsudado traqueal foram
detectados microsporídios, foi registada falta de apetite e emagrecimento na semana
antecedente à morte da ave. Aos outros três papagaios cinzentos em que ocorreu morte
súbita não foi detectado qualquer microsporídio. Diversos estudos referem que a
ocorrência de manifestações clínicas em aves infectadas por microsporidia encontra-se
associada a hospedeiros juvenis ou com infecção simultânea por outros agentes
patogénicos (vírus e bactérias) [Pulparampil et al. 1998; Mathis et al. 2005]. Assim, e à
semelhança do que acontece no Homem, a microsporidiose poderá ser, também, uma
doença oportunista nas aves.
Inicialmente, a maioria dos casos de microsporidiose em aves citados na
literatura, eram reportados em espécies da Ordem Psittaciformes, sendo quase sempre E.
hellem o microsporídio responsável pela infecção [Poonacha et al. 1985; Black et al.
1997; Pulparampil et al. 1998; Suter et al. 1998; Snowden et al. 2000; Snowden &
Phalen 2004]. Sugere-se que, para a maior ocorrência de infecções descritas nesta
Ordem, tivesse contribuído a popularidade destas aves (papagaios, periquitos, caturras,
inseparáveis) como animais de companhia, que acabariam por receber uma maior
atenção veterinária em caso de doença. Mais recentemente, começaram a ser descritos
vários casos de infecção em aves de diferentes Ordens, envolvendo outras espécies de
microsporidia, tais como E. bieneusi, E. cuniculi e E. intestinalis [Reetz et al. 2002;
Haro et al. 2005; Haro et al. 2006; Slodkowicz-Kowalska et al. 2006; Lobo et al.
2006b; Kasickova et al. 2007; Graczyk et al. 2007b; Bart et al. 2008; Muller et al.
2008; Kasickova et al. 2009]. O nosso estudo permitiu verificar a presença de E.
bieneusi e E. hellem em diversas espécies de aves das três Ordens incluídas neste estudo
e, ainda, verificar uma percentagem de infecção superior associada aos Columbiformes.
Haro e colaboradores, em Espanha, registaram 9,7% de pombos urbanos infectados por
E. bieneusi, e 4,8% das aves apresentavam co-infecção com E. hellem [Haro et al.
2005]. Também no nosso estudo foi detectada a presença simultânea de E. bieneusi e E.
hellem em 7,7% (7/91) das aves estudadas (vide Quadro XL).
IV. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM ANIMAIS
- 210 -
Como já foi referido, alguns autores postulam a hipótese de as aves serem os
reservatórios de E. hellem e os humanos serem, apenas, hospedeiros acidentais,
desenvolvendo a doença apenas em condições de imunodepressão. Mas, como poderá
E. hellem ser transmitido das aves para o Homem? Um investigador inglês, traça um
modo possível de transmissão dos esporos de microsporídios, das aves para o Homem
[Curry 1999], que pode ser extrapolado também para E. bieneusi, uma vez que esta
espécie, também, já foi identificada nos pulmões de doentes com sida [Lores et al.
1999; Sodqi et al. 2004]. Nas aves as infecções por microsporidia localizam-se, com
frequência, no intestino e nos rins, sendo os esporos eliminados nos dejectos. Como o
teor de água dos dejectos das aves é muito reduzido, estes secam rapidamente,
propiciando à formação de poeiras. A inalação destas poeiras orgânicas, contendo
esporos viáveis, pode desencadear infecção no Homem, particularmente se estiver
imunodeprimido. Saliente-se que, os microsporídios patogénicos para o Homem medem
entre 1 e 3 μm, podendo, assim, ser transportados pelas poeiras ditas inaláveis (<5 μm),
isto é, que podem atingir o alvéolo pulmonar. Este modo de transmissão está descrito
para outros agentes patogénicos, nomeadamente Histoplasma capsulatum e
Chlamydophila psittaci.
No respeitante à espécie E. hellem, diversos estudos descrevem uma elevada
variabilidade intra-específica, com base em resultados obtidos a partir da análise de
diferentes marcadores moleculares [Vossbrinck et al. 1993; Suter et al. 1998; Mathis et
al. 1999b; Peuvel et al. 2000; Xiao et al. 2001a; Haro et al. 2003]. A elevada homologia
da sequência do gene SSU rRNA observada entre os isolados de E. hellem pertencentes
às aves incluídas neste estudo, e diversos isolados em humanos, previamente descritos
por outros autores, sugere que estas aves possam constituir um potêncial reservatório
para este microsporídio. Todavia, para determinar com exactidão se os isolados de E.
hellem das aves, obtidos no presente trabalho, correspondem a genótipos previamente
identificados no homem, os isolados teriam que ser estudados com recurso a outros
marcadores genéticos mais discriminativos (a região ITS rRNA, a região variável do
gene que codifica a PTP).
Uma elevada viariabilidade intra-específica é descrita para E. bieneusi, com base
na heterogeneidade da região ITS do gene do rRNA. Até há pouco tempo, encontravam-
se registados pelo menos 80 genótipos de Enterocytozoon sp, sendo que muitos deles
IV. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM ANIMAIS
- 211 -
são específicos de hospedeiro e estão associados a determinados grupos de animais.
Assim, estes genótipos não deverão constituir uma preocupação importante para a
Saúde Pública [Xiao et al. 2004; Santin & Fayer 2009]. No entanto, um vasto grupo de
genótipos de E. bieneusi com proximidade genética, não apresenta especificidade de
hospedeiro sendo frequentemente identificados no Homem e noutros animais [Sulaiman
et al. 2003b]. No presente estudo, os genótipos identificados nas aves exóticas e nos
pombos domésticos, revelaram sequências da região ITS rRNA idênticas ou semelhantes
as do genótipo Peru6, previamente descrito em doentes com sida no Peru [Sulaiman et
al. 2003a]. Diversos estudos, envolvendo mamíferos, verificaram que os humanos e
outros animais numa determinada área geográfica, encontravam-se infectados por
múltiplos genótipos de E. bieneusi [Buckholt et al. 2002; Sulaiman et al. 2003a;
Sulaiman et al. 2003b; Sulaiman et al. 2004]. Pelo contrário, no presente trabalho
conduzido em aves observou-se a presença de apenas dois genótipos com elevada
semelhança genética. Sugere-se que este facto possa estar ligado a características
específicas deste grupo de animais, tais como a grande mobilidade natural das aves,
permanecendo num determinado local geográfico durante curtos períodos de tempo.
Teoricamente, estes factores ao limitarem as aves a uma menor exposição temporal aos
genótipos de E. bieneusi circulantes, com diferentes capacidades infectantes,
conduziriam apenas à selecção dos genótipos mais transmissíveis.
A caracterização de um genótipo de E. bieneusi nas aves estudadas, com
sequência ITS rRNA idêntica à do genótipo previamente reportado em humanos, sugere
o elevado potêncial zoonótico destes isolados de E. bieneusi. A identificação deste
genótipo, vem também adicionar evidências à hipótese de que para a espécie E.
bieneusi, se verifica ausência de barreiras de transmissão entre diferentes espécies de
animais ou até entre diferentes classes taxonómicas de hospedeiros. Acrescente-se
ainda, que a elevada frequência de infecção determinada nos pombos domésticos, aliada
ao grande número destas aves em Portugal assim como noutros países Europeus [Haro
et al. 2005; Bart et al. 2008], apontam os pombos como potenciais fontes de infecção
humana e de contaminação ambiental.
A dose mínima infecciosa de microsporídios é desconhecida, mas diversos
autores sugerem que possa ser comparável à que se verifica para outros parasitas
intestinais, ou seja, entre 10-100 esporos [Ford 1999]. Graczyk e colaboradores, num
IV. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM ANIMAIS
- 212 -
estudo envolvendo detritos fecais de pombos, detectaram cerca de 3.500 esporos de E.
bieneusi/g [Graczyk et al. 2007b]. Os resultados do trabalho revelaram que uma pessoa
exposta durante 30 minutos aos detritos fecais, por exemplo, junto a alguém que se
encontre a varrer com uma vassoura pode inalar mais de 1.000 esporos viáveis de E.
bieneusi. A interação de pombos urbanos com os seres humanos (especialmente
crianças, idosos e turistas) é muito comum. Além disso, os ninhos de pombos são
construídos muitas vezes perto de entradas de ventilação o que potencia a inalação de
esporos.
Estes dados em associação com os resultados obtidos no presente trabalho
ressaltam a importância de desenvolver estratégias para monitorizar e controlar o
número de pombos em áreas urbanas. Por exemplo, pode ser necessário implementar
métodos de controlo de natalidade e evitar a nidificação das espécies de aves perto de
sistemas de ar condicionado dos edifícios, nomeadamente dos que albergam uma
população susceptível de contrair infecções, ou seja, em hospitais, creches e asilos.
Sugere-se a aplicação de redes de proteção que permitam cobrir os sistemas ventilação
dos edifícios. Esta medida poderia constituir um método útil para evitar a transmissão
de outros agentes patogénicos das aves.
Capítulo V
DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE
MICROSPORIDIA EM AMOSTRAS AMBIENTAIS
V. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM AMOSTRAS AMBIENTAIS
- 215 -
1. INTRODUÇÃO
Actualmente, os estudos epidemiológicos referidos na literatura descrevem o
contacto com água, como um factor de risco associado à microsporidiose humana
[Hutin et al. 1998; Dascomb et al. 2000].
As espécies E. bieneusi, E. intestinalis, A. algerae, Nosema spp., Pleistophora
spp. e V. corneae já foram identificadas em lençóis subterrâneos, águas superficiais,
esgotos, efluentes terciários, canais de escoamento [Avery & Undeen 1987; Sparfel et
al. 1997; Dowd et al. 1998; Fournier et al. 2000a; Fournier et al. 2002] e água para rega
de culturas agrícolas [Thurston-Enriquez et al. 2002; Coupe et al. 2006]. O registo de
um presumível surto de origem hídrica foi reportado por Cotte e colaboradores em
França [Cotte et al. 1999]. Parece também verificar-se associação entre os
microsporidia e a transmissão por alimentos irrigados com água contaminada. Foram
identificados microsporídios em produtos hortícolas, tais como alface, salsa, coentros e
morangos, na Costa Rica [Calvo et al. 2004]. Esporos de E. bieneusi também foram
identificados em animais em estreito contacto com água superficial [Sulaiman et al.
2003b]. Até à data, a espécie Vittaforma-like, descrita em seropositivos e seronegativos
por VIH em Portugal [Sulaiman et al. 2003c] não foi identificada na água.
Diversas características específicas dos microsporidia favorecem a possibilidade
da sua transmissão por via hídrica. Entre estes factores incluem-se, a relativa ausência
de especificidade de hospedeiro, que se verifica nas espécies infectantes dos mamíferos;
a excrecção de esporos através da urina e fezes por animais infectados que podem
contaminar águas de abastecimento público; os esporos dos microsporídios são
resistentes a condições ambientais adversas, sobrevivendo por longos períodos de tempo
na água; os esporos infectantes dos mamíferos são de reduzidas dimensões e de difícil
remoção por filtração; e por último crê-se que a dose infectante seja baixa para os
mamíferos [Franzen & Muller 1999a; Didier 2005].
Conjuntamente, estes factores levaram a que os microsporídios fossem incluídos
pelo Instituto de Defesa da Saúde (NIH) dos EUA na categoria B da lista de agentes de
biodefesa e lista de candidatos contaminantes da agência de protecção ambiental dos
EUA [U.S.Environmental Protection Agengy (EPA) 1998; Didier 2005].
V. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM AMOSTRAS AMBIENTAIS
- 216 -
Na maioria dos países as doenças de transmissão hídrica, em geral, são
subdiagnosticadas ou os possíveis casos existentes não são reportados publicamente,
havendo a necessidade urgente de optimizar a detecção e monitorização destes agentes
patogénicos na água.
2. RESULTADOS
2.1. DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE MICROSPORÍDIOS EM ÁGUA SUBTERRÂNEA E
SUPERFICIAL, TRATADA E NÃO TRATADA.
A percentagem de microsporidia detectada nas 184 amostras de água estudadas
foi de 2,7% (5/184). As espécies E. bieneusi e Vittaforma-like foram identificadas em
1,6% e 1,1%, respectivamente das águas analisadas, neste estudo.
E. bieneusi foi identificada em água subterrânea, no local de colheita OA3,
correspondente a água não tratada, e na respectiva Estação de Tratamento de Águas
(ETA3) em água já submetida ao tratamento. Igualmente, na água tratada recolhida de
reservatórios que abastecem directamente a cidade de Lisboa (LX) foi identificada esta
espécie. Apenas um dos isolados de E. bieneusi foi caracterizado genéticamente com
sucesso (Quadro XLI).
A caracterização da sequência ITS rRNA do isolado de E. bieneusi, amplificado
por PCR e o seu alinhamento com outras sequências de identidade conhecida, veio
revelar a presença do genótipo TipoIV (Código de acesso ao GenBank AF242478),
previamente descrito em humanos e animais [Liguory et al. 1998; Dengjel et al. 2001;
Sulaiman et al. 2003a; Sulaiman et al. 2004; Santin et al. 2006; Lobo et al. 2006c;
Breton et al. 2007; Santin et al. 2008] (Quadro XLI ).
A espécie Vittaforma-like, foi identificada em água superficial, não tratada e sem
purificação imunomagnética (IMS), correspondente ao local de colheita TR1 (Quadro
XLI). Ambos os isolados foram recolhidos no mesmo local, mas em diferentes meses do
ano.
As duas sequências SSU rRNA de Vittaforma-like, foram caracterizadas
geneticamente com recurso à sequenciação nucleotídica dos fragmentos amplificados
pela PCR. Foi identificado um único genótipo nas sequências obtidas neste estudo,
V. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM AMOSTRAS AMBIENTAIS
- 217 -
correpondente ao Isolado 5830 (Código de acesso ao GeneBank AY375043),
previamente descrito em humanos, em Portugal [Sulaiman et al. 2003c] (Quadro XLI).
Quadro XLI. Ocorrência de microsporidia em 184 amostras de água tratada e não
tratada em locais de amostragem envolvidos no processo conducente ao abastecimento
de água da cidade de Lisboa.
TIPO DE ÁGUA TRATAMENTO
LOCAIS DE
COLHEITA
(N)
PCR
(N) ESPÉCIE (S) GENÓTIPO (S)
POTENCIAL FONTE
DE INFECÇÃO
Água subterrânea
Água não tratata OA3 (39) 1 E. bieneusi ND Homem e outros
animais Água
tratada/ETA ETA3 (42) 1 E. bieneusi TipoIV Homem,gatos, ruminantes e cães
Água superficial
Água não tratata TR1 (28)a 2 Vittaforma-like
b Isolate 5830 Homem
Água tratada/ETA ETA1 (14) 0 - - -
Água superficial
Água não tratata
CB2 (11) 0 - - -
Água tratada/ETA ETA (11) 0 - - -
Água de abastecimento
Água tratada LX (39)
1 E. bieneusi ND Homem e outros animais
a Nove amostras de água não foram submetidas a IMS; b Especie identificada em duas amostras de água
sem IMS.
3. DISCUSSÃO
Relativamente à metodologia de identificação dos microsporídios observou-se
dificuldades na amplificação de algumas amostras que se sugere estejam associadas ao
produto analisado. Na verdade, as principais vias de inibição da reacção de PCR
utilizando amostras de água são a degradação dos ácidos nucleicos devidos à presença
de DNases, a oclusão do DNA e a existência de inibidores na água concentrada, que, ao
interferir na interacção entre a DNA polimerase e o DNA, comprometem a eficiência da
PCR. A água superficial e subterrânea à semelhança da água de esgotos, são matrizes
complexas, contendo numerosas substâncias orgânicas e inorgânicas com potencial
inibidor da reação de PCR. Os principais inibidores identificados são os compostos
fenólicos, os ácidos húmicos e os metais pesados [Bruzzoniti et al. 2000]. Por outro
lado, os constituintes das paredes bacterianas e a presença de DNA de outros
V. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM AMOSTRAS AMBIENTAIS
- 218 -
microrganismos na água podem contribuir para inibir a amplificação específica dos
ácidos nucleicos. Apesar de existerem métodos que permitem contornar este problema,
na maioria dos casos, a remoção completa dos inibidores é impossível.
Nas 184 amostras de água analisadas foram obtidas cinco amostras positivas
para microsporidia. E. bieneusi e Vittaforma-like foram as espécies identificadas em três
e em duas amostras positivas, respectivamente (Quadro XLI).
A detecção de DNA de microsporidia, mais precisamente da espécie E. bieneusi
em amostras submetidas a separação imunomagnética constitui um facto surpreendente
na medida em que este processo de purificação utilisa anticorpos monoclonais
específicos para os géneros Cryptosporidium e Giardia no revestimento das partículas
imunomagnéticas. Este resultado pode ser explicado por algum arrastamento
inespecífico de DNA de outros microrganismos durante o processo de separação pelas
partículas imunomagnéticas. Este arrastamento puderá derivar de fenómenos
electrostáticos entre as partículas imunomagnéticas e as cargas superficiais dos
microsporídios.
E. bieneusi foi observada em água subterrânea não tratada e na correspondente
estação de tratamento de resíduos, após ter sido submetida a tratamento. A outra
amostra de água positiva para esta espécie era proveniente de um reservatório de água
de abastecimento à cidade de Lisboa. A espécie E. bieneusi já foi descrita em águas
superficiais, piscinas e no Rio Sena [Sparfel et al. 1997; Dowd et al. 1998; Fournier et
al. 2000a; Fournier et al. 2002].
Numa primeira abordagem, poderíamos supor que a contaminação da água
deriva da contaminação ambiental com esporos de E. bieneusi eliminados por um
hospedeiro. No entanto, uma análise mais profunda do meio envolvente da nascente do
rio que circula na região em questão sugere indícios de uma potencial fonte de
contaminação para esta espécie. Nesta região situa-se a maior concentração nacional da
indústria de curtimento e acabamento em couro (incluindo bovinos). Do pré curtimento
ao acabamento, o tratamento do couro consiste em várias etapas, produzindo grandes
quantidades de água suja e poluente. A descarga das águas residuais das fábricas de
curtumes em condutas degradadas, devido à corrosão pelos produtos químicos
utilizados no curtimento das peles, bem como a ineficiência do tratamento das águas
residuais nas ETAR, podem ser uma causa de contaminação dos aquíferos. A ocorrência
V. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM AMOSTRAS AMBIENTAIS
- 219 -
de um genótipo (Tipo IV) que já foi detectado em bovinos em Portugal, pode ser
resultado deste tipo de contaminação. A presença de DNA de E. bieneusi numa amostra
de água tratada recolhida num reservatório de abastecimento da cidade de Lisboa,
embora não tenha sido possível determinar o seu genótipo, sugere também uma possível
contaminação humana ou animal. A associação dos microsporidia em biofilmes
localizados no reservatório ou condutas, pode constituir uma explicação para a detecção
deste microsporídio em amostras de água tratada.
A espécie Vittaforma-like foi identificada em água subterrânea não tratada, e
sem ter sofrido separação imunomagnética. Ambos os isolados obtidos correspondem a
um genótipo descrito previamente em humanos em Portugal [Sulaiman et al. 2003c]. A
detecção do DNA do parasita nas amostras de água sugere a presença deste
microrganismo na água subterrânea desta região, levantando dúvidas relativamente à
sua origem. Até à data, desconhecem-se possíveis fontes de infecção ou hospedeiros
animais, para além do Homem. O local de colheita das amostras insere-se numa área de
lazer onde se desenvolvem actividades de recreio ligadas à água, tais como natação ou
outros desportos naúticos. Sugere-se que a presença mais ou menos constante do
Homem nesta área e na respectiva colecção de água possa constituir a fonte de infecção
responsável pela detecção desta espécie.
Em conclusão, os resultados obtidos no presente trabalho sugerem a água como
uma potencial via de transmissão de microsporidiose ao Homem e a outros animais. A
presença de microsporídios patogénicos para o Homem em água de abastecimento
tratada e não tratada deverá ser encarada não só como um potencial risco para a saúde
pública, em especial para a crescente população susceptivel (imunocomprometidos,
idosos e crianças), mas também como indicador da deterioração da qualidade
microbiologica da água e da possivel ineficiência do tratamento aplicado nas Estações
de Tratamento de Águas.
V. DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICROSPORIDIA EM AMOSTRAS AMBIENTAIS
- 220 -
Capítulo VI
CONCLUSÃO
VI. CONCLUSÃO
- 223 -
A microsporidiose humana, actualmente considerada uma doença oportunista
emergente, continua contudo a ser uma infecção subdiagnosticada mundialmente. A
informação sobre a infecção humana e a epidemiologia dos microsporidia em Portugal é
escassa, e só muito recentemente têm sido dados passos no intuito de colmatar estas
lacunas.
O presente estudo, constitui um trabalho pioneiro na pesquisa e caracterização
de microsporidia, potencialmente, patogénicos para o Homem, englobando duas
populações de humanos com serologia positiva e negativa para VIH, diversas espécies
de animais e amostras ambientais (água), em Portugal.
Durante o presente trabalho foi possível observar uma frequência de infecção de
12,0%, nas fezes da população humana estudada. No grupo de seropositivos para VIH a
percentagem de infecção nas fezes, urina e secrecções pulmonares foi de 13,9%, 1,7% e
1,5%, respectivamente. Por outro lado, no subgrupo dos seronegativos para VIH só foi
detectado microsporidia em 8,5% das amostras fecais. O facto de se verificar, neste
estudo, uma associação significativa entre a presença de infecção por microsporidia e os
seropositivos para VIH não constitui um dado surpreendente em virtude do carácter
oportunista largamente atribuído a esta doença, por outros autores. Evidências
adicionais, observadas neste estudo, que corroboram esta hipótese, correspondem à
identificação de infecção por microsporidia nas fezes de doentes, que, embora sendo
seronegativos para VIH, apresentam outro tipo de deficit imunológico, com destaque
para um doente transplantado renal, um doente com neoplasia submetido a
quimioterapia, um doente com asma severa submetido a terapêutica com
corticosteróides e um doente infectado por vírus da hepatite C. Igualmente, no subgrupo
dos seronegativos para VIH, verificou-se a presença de idosos e crianças entre a
população positiva para microsporidia. Embora por razões diferentes das observadas
para os doentes com maior ou menor grau de imunussupressão induzido por diversas
causas, as crianças e os idosos são considerados uma população mais susceptível de
contrair infecções, dentro do grupo dos imunocompetentes. Neste estudo foi, inclusive,
possível observar a associação de amostras fecais positivas para microsporidia, assim
como especificamente de Vittaforma-like ao grupo etário das crianças. Estes resultados,
parecem evidenciar a elevada probabilidade de seropositivos para VIH ou com outras
VI. CONCLUSÃO
- 224 -
causas de imunossupressão, assim como crianças e idosos de contrair infecção por
microsporidia.
Na análise dos dados obtidos, não se verificou que a infecção por microsporidia,
em geral, nem, especificamente, por nenhuma das duas espécies identificadas nas fezes
(E. bieneusi e Vittaforma-like) estivesse, significativamente, associada a doentes com
quadro diarreico, corroborando alguns estudos conduzidos por outros autores. Da
literatura disponível, verifica-se que na maioria dos casos descritos a presença de
diarreia ocorre em doentes com níveis de contagem dos linfócitos TCD4+ abaixo dos
100 células por mm3. Todavia, a inexistência destes dados laboratoriais para os doentes
com imunossupressão, incluídos neste estudo, não permite esclarecer se a ausência da
manifestação clínica mais comum observada na microsporidiose intestinal, a presença
de diarreia, poderá estar associada nestes doentes a contagens de linfócitos TCD4+
acima deste valor limite. Outra das razões sugeridas para a ausência de quadro diarreico
nos doentes infectados por microsporidia reside na possibilidade desta população ser
constituída por portadores assintomáticos. Igualmente, na maioria dos
imunocompetentes positivos para microsporidia estudados não foi significativa a
presença de diarreia associada à infecção, apontando para que estes doentes constituem
portadores assintomáticos dos microsporídios. Casos de portadores assintomáticos de
microsporidia têm sido reportados, por diversos autores, quer na população de doentes
com imunossupressão quer em imunocompetentes.
E. bieneusi e Vittaforma-like foram as espécies identificadas nas amostras fecais
dos seropositivos e seronegativos para VIH. Por outro lado, só foram identificados
microsporidia nas amostras de urina e secrecções pulmonares de seropositivos para
VIH, nomeadamente, a espécie E. intestinalis na urina e E. cuniculi e Vittaforma-like
num lavado broncoalveolar e numa expectoração, respectivamente. Vittaforma-like é
descrita neste estudo, pela primeira vez, numa secreção pulmonar dum doente.
A detecção de E. intestinalis na urina de um seropositivo para VIH e posterior
caracterização da sequência de um fragmento da região SSU rRNA, com total homologia
com diversas sequências previamente descritas por outros autores, em humanos e outros
animais, permitiu revelar a presença de mais uma espécie, considerada patógenica para
o homem, entre a população englobada neste estudo. Igualmente, a identificação e
caracterização genética da SSU rRNA de E. cuniculi, para além de constituir o primeiro
VI. CONCLUSÃO
- 225 -
registo desta espécie em secreções pulmonares no Homem em Portugal, indica a
presença desta espécie patogénica no país.
A caracterização genética da região ITS rRNA dos isolados de E. bieneusi de
humanos permitiu identificar um total de seis genótipos diferentes, Tipo IV, Peru 6, D,
A, C e PtEbII, com predominância do referido em primeiro lugar. Até à data os
genótipos A e C só foram identificados no Homem. Os restantes genótipos observados,
à excepção do PtEbII, que só foi descrito em aves em Portugal, já foram registados
numa vasta gama de hospedeiros, incluindo os humanos e outros animais (inclusive
cães, gatos e ruminantes em Portugal).
A selecção das diversas espécies de animais englobadas neste estudo, baseou-se
não só na análise bibliográfica dos grupos mais infectados por microsporidia
patogénicos de humanos, mas, fundamentalmente, obedeceu a um critério de
proximidade geográfica ao homem. Nos diversos grupos de animais estudados foram
identificados microsporidia em amostras fecais de 8,6% de cães, 15,5% de gatos 40,7%
de aves de gaiola e pombos urbanos, 6,0% de bovinos e 1,9% de animais silváticos em
cativeiro (Jardim Zoológico).
E. bieneusi foi a única espécie de microsporidia identificada em todos os
diversos grupos de animais estudados, com excepção das aves de gaiola e pombos
domésticos em que foi registada também a espécie E. hellem. Uma elevada percentagem
de infecção por E. bieneusi foi observada na população de pombos domésticos (Ordem
Columbiformes). Para além da transmissão fecal-oral, sugere-se a potencial transmissão
por via aérea para ambas as espécies de microsporidia.
A maioria dos animais estudados infectados por E. bieneusi e/ou E. hellem não
apresentavam sintomatologia sugerindo-se, tal como se verifica na população humana
estudada, a existência de portadores assintomáticos destes microsporidia entre os
animais examinados: destacando-se o importante papel que terão na transmissão das
espécies E. bieneusi e E. hellem.
A caracterização genética da espécie E. hellem, obtida neste estudo, permitiu
identificar, em aves exóticas de gaiola e pombos urbanos da cidade de Lisboa, isolados
deste microsporídio com homologia idêntica ou semelhante a sequências do gene da
SSU rRNA, previamente reportadas no homem e em aves, sugerindo que estas aves
VI. CONCLUSÃO
- 226 -
possam constituir um reservatório deste parasita e uma fonte de infecção para o
Homem.
Relativamente aos isolados de E. bieneusi dos animais estudados, no presente
trabalho, verificou-se a presença de seis genótipos diferentes nos cães (Peru6, D e
PtEbIX) e gatos (TipoIV, PtEbIV e PtEbVIII); três genótipos nos bovinos (TipoIV,
PtEbXI e J); dois genótipos nos animais do Jardim Zoológico (PtEbV e PtEbXII). Uma
associação significativa entre os gatos e a infecção pelo genótipo Tipo IV foi observada.
Todos os diferentes 10 genótipos referidos foram isolados de mamíferos. A análise da
diversidade genética da região ITS rRNA de E. bieneusi permitiu verificar a presença na
maioria dos mamíferos (cães, gatos e bovídeos), de genótipos patogénicos para o
Homem e de outros genótipos específicos de hospedeiro (cão, gato, bovinos e primata
não humano), que, possivelmente, não terão impacte na saúde pública humana. Nas
diversas espécies de aves pertencentes a três Ordem diferentes (Psittaciformes,
Passerifores e Columbiformes) a caracterização dos isolados de E. bieneusi revelou,
apenas, a presença de dois genótipos geneticamente muito semelhantes, Peru6 (genótipo
patogénico para o Homem) e PtEbII. Facto este, contrário ao observado para os
humanos e outros mamíferos neste estudo, infectados por múltiplos genótipos de E.
bieneusi, com predominância de um deles.
As espécies E. bieneusi e Vittaforma-like foram identificadas em água de
abastecimento da cidade de Lisboa, tanto na água de origem superficial como
subterrânea. A genotipagem de Vittaforma-like revelou a presença de um genótipo,
descrito em humanos, em Portugal. O genótipo Tipo IV de E. bieneusi potencialmente
infectante do homem e outros animais foi identificado em água tratada com origem
subterrânea.
Considerações finais:
Ao efectuar-se uma análise global dos resultados da detecção e caracterização
genética de E. bieneusi, verificou-se que esta espécie de microsporídio e, mais
concretamente, o genótipo Tipo IV foi identificado em humanos seropositivos e
seronegativos para VIH, animais (mamíferos e aves) e no ambiente (água) neste estudo.
Dos genótipos identificados nos humanos, com excepção dos genótipos A e C, os
VI. CONCLUSÃO
- 227 -
restantes foram encontrados também nos animais e/ou ambiente: o Tipo IV foi
identificado em gatos, bovinos e na água; o genótipo Peru6 registou-se, também, em
cães e aves exóticas e pombos urbanos; o genótipo D num cão; e o genótipo PtEbII foi
identificado em aves exóticas e pombos urbanos. O facto de determinados animais, tais
como cães, gatos, bovídeos em estreito contacto com humanos se encontrarem
infectados pelos mesmos genótipos de E. bieneusi, faz destes hospedeiros possíveis
reservatórios da parasitose humana. Deste modo, caso se verifiquem condições
epidemiológicas favoráveis, sugere-se que a infecção nestes animais, poderá constituir
fonte de contaminação para o Homem, quer por contacto directo com os animais
infectados, quer indirecto, através de água ou de alimentos contaminados. Contudo, é
importante salientar que a presença desta espécie, tanto em animais, como em humanos,
não constitui, por si só, evidência da ocorrência de transmissão zoonótica, na medida em
que a hipótese da transmissão antroponótica desta espécie não pode, também, ser
excluída.
No presente estudo, verificou-se a ocorrência de microsporidia na água de
abastecimento da cidade de Lisboa, tanto na água de origem superficial como
subterrânea. As espécies E. bieneusi e Vittaforma-like , e o(s) genótipo(s) identificados
para cada caso, foram ambos registados na população humana estudada neste trabalho,
sendo que E. bieneusi foi observada em todos os grupos de animais estudados, e o
genótipo Tipo IV em gatos e bovinos. Estes resultados sugerem a água como potencial
fonte de infecção do Homem e outros animais, assim como a possível ocorrência de
transmissão hídrica destes parasitas em Portugal. Contudo, salienta-se a importância de
estender aos novos estudos abordagens, que incluam, não só a detecção, mas também a
determinação da viabilidade dos microsporidia na água.
A elevada percentagem de Vittaforma-like (dois genótipos ) em amostras fecais
de humanos seropositivos e seronegativos para VIH, especialmente no grupo etário das
crianças, a identificação da espécie na secreção pulmonar pertencente a um seropositivo
para VIH e a detecção de DNA desta espécie em água de abastecimento público
constituem dados importantes, que vêm contribuir para o esclarecimento da ocorrência e
epidemiologia desta nova espécie de microsporídio, até à data, apenas descrito em
Portugal. Todavia, são necessários futuros estudos adicionais que passem pela
caracterização ultraestrutural e análise genética de outros loci deste parasita com intuito
VI. CONCLUSÃO
- 228 -
de compreender e clarificar os diversos aspectos que envolvem esta espécie e que,
ainda, permanecem desconhecidos entre a comunidade científica.
Os resultados que obtivemos demonstraram, também, que a identificação das
diferentes espécies e genótipos dos microsporidia só pode ser conseguida através da sua
caracterização molecular. Esta identificação reveste-se de grande importância, na
medida em que permite conhecer quais as espécies e genótipos infectantes para o
Homem, e avaliar o risco que a infecção em animais domésticos e silváticos e a
contaminação dos recursos hídricos constitui para a saúde pública, contribuindo para a
melhor compreensão dos diversos aspectos da epidemiologia da microsporidiose
gerando informação essencial ao desenvolvimento de medidas que visem prevenir e
controlar a transmissão de microsporidia ao Homem.
A presença de espécies e genótipos de microsporidia patogénicos para o
Homem, confirmada pela análise dos resultados obtidos no presente estudo, sugere um
papel relevante a nível da Saúde Pública, para os microsporidia circulantes, entre a
população portuguesa, salientando a importância da implementação da pesquisa de
microsporídios no diagnóstico de rotina. Acresce, ainda, que a identificação destas
espécies e genótipos em amostras fecais e outros produtos biológicos de doentes e
animais infectados realça a conveniência de adopção de medidas protectoras para evitar
a possível contaminação através destes espécimes. Estas medidas são particularmente
relevantes para a população mais susceptível de contrair a infecção: os seropositivos
para VIH, ou a crescente população de doentes que apresentam outras causas de
imunossupressão, tais como doentes submetidos a transplantes de órgãos, ou com
doença neoplásica ou autoimune submetidos a quimioterapia e terapêuticas
imunossupressoras. No grupo da população susceptivel à infecção por microsporídios
incluem-se as crianças e os idosos.
Concluindo, os presentes resultados, representam uma contribuição para o
estudo das microsporidioses, no âmbito da epidemiologia, mais precisamente, nos
processos envolvidos na circulação e transmissão deste grupo de microrganismos
oportunistas e emergentes à população susceptível, em Portugal e espera-se que
constituam uma motivação para despertar o interesse e abrir caminho para estudos
futuros.
Capítulo VII
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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