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UNIVERSIDADE DO ESTADO DE SANTA CATARINA – UDESC CENTRO DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS – CCT PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

MAITÊ SANTOS DA SILVA

JOINVILLE, 2019

1

MAITÊ SANTOS DA SILVA

SÍNTESE DE DERIVADOS DO RESVERATROL E ESTUDOS DE

INTERAÇÃO COM O DNA

Dissertação apresentada ao Curso de

Pós-graduação em Química Aplicada do

Centro de Ciências Tecnológicas da

Universidade do Estado de Santa

Catarina como requisito parcial para

obtenção do título de Mestre em Química.

Orientador: Prof. Dr. Samuel Rodrigues

Mendes

Joinville, SC

2019

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À minha família, meus eternos orientadores,

por sua capacidade de acreditar, nutrir e

investir na realização deste sonho.

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AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer e mencionar cada uma das pessoas que se fizeram

presentes e importantes durante essa longa jornada, porém, minha mente cansada

está vindo de intermináveis capítulos e correções e não me permite. O risco de

minha memória me pregar uma peça é enorme e eu tenho medo de não ser

perdoada e/ou de não me perdoar.

No entanto alguns nomes não podem ficar de fora e eu gostaria de começar

falando de família. E ao falar de família é imprescindível citar a minha família de

Joinville, uma vez que a UDESC me acolheu e tem sido meu porto seguro, e meu lar

em Joinville atende pelo nome de Laboratório de Síntese e Catálise – SINCA;

agradeço imensamente a todos os integrantes pela criação desse ambiente cheio de

companheirismo e desenvolvimento mútuo; me orgulho em dizer que o SINCA é

meu lar.

Agradeço todos os dias por essa escolha que fiz, pois sei que não poderia ter

escolhido um melhor curso, ou um melhor grupo de pesquisa, ou um melhor

orientador. Pode parecer clichê agradecer ao apoio do seu orientador uma vez que

um trabalho de mestrado deve ser feito em conjunto. No entanto, gostaria de

expressar tamanho o orgulho que tenho do meu pai científico, e espero que um dia

te faça tão orgulhoso quanto. Obrigada por ser um orientador excepcional e por ter

sido capaz de me ajudar a vencer todas as barreiras (imaginárias ou não) nessa

caminhada. Saiba que se um dia alguém me disser que lembra ligeiramente de ti ao

me ver, estarei grata.

Para continuar falando de família, preciso agradecer ao ser humano que eu

mais amo nessa vida e que vem sendo meu parceiro há longos anos, obrigada meu

irmão, Fernando, por estar sempre pronto pra receber uma Maitê chorosa, pra

conversar sobre as aleatoriedades da vida, pra compartilhar um vídeo de gatinho.

Obrigada por todos os cafés, por todos os conselhos, por me fazer sentir como a

irmã mais nova por tantas vezes, por todas as viagens ao som de snapcasting...

Saiba que eu não teria conseguido sem você.

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Agradeço imensamente aos meus pais, Dirceu e Sandra, que me mostraram

a sabedoria de permitir que seu filho saia do ninho, que souberam dizer que eu

poderia voltar quando (e se) precisasse, mas que meu lugar era no mundo, voando

e correndo atrás dos meus sonhos. O apoio de vocês é e sempre será fundamental,

mesmo de longe, vocês estão sempre por perto, e eu ainda sei que não importa

aonde quer que eu vá, e mesmo que esteja há milhões de quilômetros de distância,

eu sempre poderei voltar pra casa.

Agradeço a todos os meus familiares, principalmente aos Guarapados por

todo o apoio, pela nossa união, tenho muito orgulho desta família, do jeito com o

qual nós suportamos uns aos outros, da forma que enxergamos que juntos nós

somos mais fortes e podemos ir mais longe. Também gostaria de registrar

secretamente um agradecimento ao meu b.f. secreto T. F. R., seu apoio e sua

companhia me fizeram mais feliz e mais forte.

Gostaria de estender este agradecimento ao corpo docente do Programa de

Pós-Graduação em Química Aplicada, em especial ao professor Fernando Xavier,

que apesar de não me ter sob sua orientação, ajudou-me inúmeras vezes a

entender os resultados de meus experimentos, juntamente de sua então mestranda

Patrícia Tessaro, que me ensinou a realizar os ditos experimentos.

Agradeço também aos alunos de Iniciação Científica que me foram confiados:

obrigada por me ensinar a ensinar! Agradeço a todos os ICs que “passaram por

minha tutela” e em especial à Bruna, que ficou e tem me ajudado imensamente. Não

menos importante, sou muito grata às psicólogas e psiquiatras que estiveram

comigo ao longo desse processo.

Por fim, agradeço à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior – CAPES, ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico – CNPq e à Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do Estado de

Santa Catarina – FAPESC pelo fomento à pesquisa, sem o qual dificilmente teria

sido capaz de executá-la.

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“Estudar é um ato solitário, difícil e doloroso. No entanto é simples, basta sentar a bunda na cadeira e estudar!”. (Antonio Gramsci,apud Samuel Mendes)

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RESUMO

Estudos acerca do resveratrol vêm crescendo nos últimos anos devido às suas

propriedades benéficas. Até o dado momento aceita-se que este não apresenta um

grau de toxicidade podendo ser administrados sem um controle de consumo. No

entanto, sua baixa solubilidade em água torna-o pouco biodisponível para

efetivamente promover os efeitos benéficos ao organismo tratado. Sendo assim,

estudos de derivatização visando um aumento de sua biodisponibilidade e/ou uma

potencialização de suas propriedades são promovidos. Além disso, é descrito na

literatura que o resveratrol é capaz de interagir com o DNA por via intercalativa.

Tendo isso em mente foram sintetizados derivados do resveratrol a partir de reações

de alquilação, bem como análogos contendo o átomo de selênio

(benzo[b]selenofenos) a fim de avaliar de que forma tais alterações em sua estrutura

modificam sua forma de interagir com o ssDNA. Todos os compostos sintetizados

tiveram sua estabilidade verificada no meio empregado para os estudos de

intercalação. Após, realizou-se o estudo de interação com o ssDNA apenas com os

compostos estáveis, infere-se que todos os derivados sintetizados interagem por

vias intercalativas. Dentre todos o composto que apresentou o melhor resultado foi o

4-Cloro-2-(4-hidroxifenil)benzo[b]selenofeno-5,7-diol, o qual apresentou uma

constante de ligação intrínseca quarenta vezes maior quando comparada a do

resveratrol. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior -Brasil (CAPES) - Código de

Financiamento 001.

Palavras-chave: Resveratrol. Benzo[b]selenofenos. Agentes Intercalantes de DNA.

13

ABSTRACT

Studies on resveratrol have been growing in recent years because of their beneficial

properties. Until the given moment it is accepted that it does not present a degree of

toxicity, so it can be administered without a control of consumption. However, its low

solubility in water makes it poorly bioavailable to effectively promote the beneficial

effects to the treated organism. Thus, derivatization studies aiming at an increase of

its bioavailability and a potentialization of its properties are promoted. In addition, it is

established in the literature that resveratrol can interact with the DNA via the

intercalation route. With that in mind, derivatives of resveratrol were synthesized from

alkylation reactions as well as analogs containing the selenium atom

(benzo[b]selenophenes) to evaluate how such changes in their structure modify their

way of interacting with ssDNA. All the synthesized compounds had their stability

verified in the solvent used for the intercalation studies. Afterwards, the interaction

study with ssDNA was performed only with the stable compounds.It is inferred that all

synthesized derivatives interact by intercalation mechanisms. Among all of the

compounds the one who presented the best result was 4-Chloro-2-(4-

hydroxyphenyl)benzo[b]selenophen-5,7-diol, which had an intrinsic binding constant

forty times higher when compared to resveratrol. This study was financed in part by

the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil

(CAPES) -FinanceCode 001.

Keywords: Resveratrol. Benzo[b]selenophenos. DNA Intercalating Agents.

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LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1 – Biossíntese do resveratrol -------------------------------------------------------- 36

Esquema 2 – Síntese do resveratrolproposta por Ho e colaboradores (1999) -------- 41

Esquema 6 – Condição de alquilação do resveratrol ---------------------------------------- 47

Esquema 7 – Condições para a síntese de benzo[b]selenofenos ------------------------ 49

Esquema 8 – Condições para a síntese de benzo[b]selenofenos tri-alquilados ------ 50

Esquema 9 – Alquilação do resveratrol ---------------------------------------------------------- 55

Esquema 10 – Rota sintética dos benzo[b]selenofenos ------------------------------------- 60

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Fórmula estrutural do trans-3,4’,5-trihidroxiestilbeno com numeração de

acordo com as normas IUPAC ................................................................. 23

Figura 2 – Objetivos .................................................................................................. 27

Figura 3 – Interações que estabilizam a dupla hélice ................................................ 31

Figura 4 - Representação esquemática de possíveis de interações com o DNA ...... 32

Figura 5 - Exemplos de compostos que fazem intercalação ou ligação pelo sulco ... 33

Figura 6 - Doxorrubicina ............................................................................................ 33

Figura 7 - Estruturas gerais (a) dos flavonoides, (b) dos estilbenos e (c) dos ácidos

fenólicos (n>1). ......................................................................................... 34

Figura 8 - Estrutura dos melhores resultados quanto à inibição da topoisomerase I 35

Figura 9 - Estrutura da genisteína e da curcumina .................................................... 35

Figura 10 - Previsão da melhor condição de interação do resveratrol com b-DNA ... 40

Figura 11 - Compostos com os melhores resultados quanto a ativação da proteína

quinase C alpha (PKC) ........................................................................... 42

Figura 12 - Estrutura dos compostos propostos por Panzella e colaboradores (2015)

................................................................................................................. 43


................................................................................................................. 43

Figura 14 – Possíveis variações de absorvância de um espectro ............................. 52

Figura 15 - Espectro de RMN de ¹H do (E)-1,3-octiloxi-5-(4-octoxiestiril)benzeno em

CDCl3 a 400 MHz. Padrão interno: TMS .................................................. 57

Figura 16 - Espectro de RMN de ¹³C do (E)-1,3-octiloxi-5-(4-octoxiestiril)benzeno em

CDCl3 a 100 MHz. Padrão interno: TMS .................................................. 58

Figura 17 – Ampliação da região alifática do espectro de RMN de ¹³C do (E)-1,3-

octiloxi-5-(4-octoxiestiril)benzeno em CDCl3 a 100 MHz. Padrão interno:

TMS .......................................................................................................... 59

Figura 18 - Espectro de RMN de ¹H do 2-(4-hidroxifenil)benzo[b]selenofeno-5,7-diol

em DMSO-d6 a 400 MHz. Padrão interno: TMS ....................................... 62

Figura 19 - Espectro de RMN de 13C do 2-(4-hidroxifenil)benzo[b]selenofeno-5,7-diol

em DMSO-d6 a 100 MHz. Padrão interno: TMS ....................................... 63

18

Figura 20 – Espectro de RMN de 1H 4-Cloro-2-(4-hidroxifenil)benzo[b]selenofeno-

5,7-diol em DMSO-d6 a 400 MHz. Padrão interno: TMS .......................... 64


em DMSO-d6 a 100 MHz. Padrão interno: TMS ...................................... 64

Figura 22 – Resveratrol e compostos sintetizados submetidos ao teste de

estabilidade .............................................................................................. 66

Figura 23 – Resultados dos testes de estabilidade realizados ................................. 67

Figura 24 – Concentrações de cada composto e do ssDNA .................................... 68

Figura 25–Teste de interação do resveratrol comercial (1) com o ssDNA ................ 69

Figura 26 – Teste de interação do resveratrol tri-metilado (2) com o ssDNA ........... 70

Figura 27 – Teste de interação da mistura (1 : 2 resveratrol: selenofeno (6) com o

ssDNA ...................................................................................................... 71

Figura 28 – Teste de interação do selenofeno (7) com o ssDNA ............................. 72

Figura 29 - Perspectivas do trabalho ........................................................................ 77

19

LISTA DE ABREVIATURAS

CC Cromatografia em coluna

CCD Cromatografia em camada delgada

ctDNA Ácido desoxirribonucleico de timo de bezerros (do inglês

Calf-thymus deoxyribonucleic acid)

DIPEA N,N-Diisopropiletilamina

DMF N,N-Dimetilformamida

DMSO Sufóxido de dimetila

DMSO-d6 Sufóxido de dimetila deuterado

DNA Ácido Desoxirribonucleico (do inglês deoxyribonucleic acid)

HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfônico (do

inglês 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)

IUPAC União Internacional de Química Pura e Aplicada

Ka Constante de dissociação ácida

Kb Constante de ligação intrínseca

MEM-Cl Cloreto de 2-metoxietoximetila

RMN de 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RMN de 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono

ssDNA Ácido desoxirribonucleico de esperma de salmão (do inglês

salmon sperm deoxyribonucleic acid)

THF Tetraidrofurano

TMS Tetrametilsilano

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US-NCI Instituto Nacional do Cancer dos Estados Unidos (do inglês

United States – National Cancer Institute)

UV-Vis Ultravioleta visível

21

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 23

2 OBJETIVOS ................................................................................................... 27

2.1 OBJETIVO GERAL ......................................................................................... 27

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................... 27

3 REVISÃO DA LITERATURA .......................................................................... 29

3.1 CÂNCER E INTERCALADORES DE DNA ...................................................... 29

3.2 POLIFENÓIS .................................................................................................. 34

3.3 RESVERATROL E SEUS DERIVADOS ......................................................... 36

4 METODOLOGIA ............................................................................................. 45

4.1 MATERIAIS .................................................................................................... 45

4.2 MÉTODOS E INSTRUMENTAÇÃO ................................................................ 45

4.1.1 Cromatografia em camada delgada (CCD) ................................................. 45

4.1.2 Cromatografia em coluna (CC) .................................................................... 45

4.1.3 Espectroscopia eletrônica – UV/Vis ............................................................ 46

4.3 CARACTERIZAÇÃO ....................................................................................... 46

4.4 SÍNTESE DOS COMPOSTOS E ESTUDOS DE INTERAÇÃO ....................... 46

4.4.1 Alquilação do Resveratrol ............................................................................ 47

4.4.2 Síntese de benzo[b]selenofenos ................................................................. 48

4.4.3 Síntese do benzo[b]selenofenos alquilados .............................................. 50

22

4.4.4 Estudos de interação com o DNA via UV-Vis ............................................ 51

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................... 55

5.1 ALQUILAÇÃO DO RESVERATROL ............................................................... 55

5.1.1 Discussão dos Resultados Obtidos ........................................................... 55

5.1.2 Apresentação e Discussão dos Dados Espectrais ................................... 56

5.2 SÍNTESE DE BENZO[B]SELENOFENOS ...................................................... 60

5.2.1 Discussão dos Resultados Obtidos ........................................................... 60

5.2.2 Apresentação e Discussão dos Dados Espectrais ................................... 61

5.3 ESTUDOS DE INTERAÇÃO COM O DNA ..................................................... 65

5.3.1 Testes de estabilidade dos compostos sintetizados ................................ 65

5.3.2 Testes de interação com o ssDNA .............................................................. 67

6 CONCLUSÕES .............................................................................................. 75

7 PERSPECTIVAS ............................................................................................ 77

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................. 79

APÊNDICE A – Espectros Selecionados .............................................................. 87

23

1 INTRODUÇÃO

O trans-resveratrol (trans-3,4’,5-trihidroxiestilbeno) é uma fitoalexina de

origem vegetal e foi primeiramente isolado em 1940 das raízes do lírio heléboro-

branco (Veratumgrandiflorum), e em 1963 foi encontrado nas raízes de

Polygonumcuspidatum (ORALLO, 2006). Posteriormente foi identificado em uma

grande variedade de produtos alimentícios como o vinho tinto, uvas, amendoins,

amoras, e em mais de 70 espécies de plantas (BAUR e SINCLAIR, 2006).

Figura 1 - Fórmula estrutural do trans-3,4’,5-trihidroxiestilbeno com numeração de

acordo com as normas IUPAC

Fonte: Adaptado COMMODARI et al., 2005.

A primeira rota sintética para o resveratrol foi proposta por Spath e Kromp

(1941) por meio de uma reação de Wittig. No entanto, o interesse da comunidade

científica neste composto cresceu consideravelmente quando, em 1992, ele foi

identificado como o responsável pelo efeito cardioprotetor do vinho, onde o consumo

moderado de vinho tinto estaria relacionado com a não incidência de doenças

cardíacas, tornando-se fator determinante na explicação do “Paradoxo Francês”

(ALVES, 2015).

O “Paradoxo Francês” é uma expressão utilizada para descrever o fato de a

população francesa apresentar baixa predisposição para o desenvolvimento de

doenças cardíacas, apesar de possuir uma alimentação rica em gorduras saturadas

e não costumar praticar exercícios físicos. Sendo assim, atribuiu-se ao consumo

regular de vinho tinto uma justificativa para a premissa de que a população francesa

apresenta uma incidência de infartos 40% inferior quando comparada aos outros

povos europeus (CHACHAY et al., 2011; SMOLIGA, BOST, e MAROON, 1997;

TIMMERS, AUWERX e SCHRAUWEN, 2012).

24

Por outro lado, Jang et al. (1997) concluíram que o resveratrol possuía

propriedades quimiopreventivas, inibindo os principais estágios da carcinogênese, e

a primeira demonstração de clivagem do DNA com o resveratrol foi reportada por

Fukuhara eMiyata (1998). Após tais descobertas, inúmeros estudos têm sido

realizados evidenciando os efeitos cardioprotetores e anti-cancerígenos, bem como

os efeitos antioxidante, anti-inflamatório, antienvelhecimento e neuroprotetor

(AGARWAL e BAUR, 2011). Stivala et al. (2001) concluíram que o grupo hidroxila na

posição 4’ associado a conformação trans é essencial a atividade antiproliferativa

em células cancerígenas.

O resveratrol é produzido na uva devido ao estresse oxidativo causado por

fungos ou irradiação de luz ultravioleta ocorrendo na natureza nas formas cis- e

trans- resveratrol, sendo a última a mais abundante (ACERSON et al., 2013). Dentre

as três classes principais de polifenóis, o resveratrol é considerado um estilbeno

uma vez que é um derivado de 1,2-difenileteno. (AFONSO et al., 2015; GORAN et

al.,2017).

Commodari e colaboradores (2005) determinaram o ângulo de diedro entre os

carbonos 2-1-1’-2’ como sendo 12,6±1,1 indicando assim que a orientação espacial

relativa entre os dois anéis fenólicos é próxima da planaridade. Sabe-se que

moléculas planares costumeiramente atuam como agentes intercaladores de DNA,

uma vez que são capazes de se inserir entre os pares de bases nitrogenadas

promovendo uma mudança na sua conformação. Sendo assim, o resveratrol é um

forte candidato a tal atuação (PALCHAUDHURI e HERGENROTHER, 2007).

Por outro lado, compostos contendo selênio, que já eram conhecidos como

uma ferramenta sintética versátil para a preparação de intermediários, vêm se

consolidando também como produtos finais, apresentando atividade biológica

importante. Estudos recentes demonstraram que os compostos organosselênio

apresentam propriedades farmacológicas, podendo agir como mimetizadores da

glutationa peroxidase, inibidores da tiorredoxina redutase a também como potentes

antioxidantes (NOGUEIRA et al., 2004).

Existem alguns estudos na literatura a respeito da utilização do trans-

resveratrol como agente intercalante. No entanto, não existem estudos que avaliem

de que forma modificações em sua estrutura podem alterar seu comportamento

frente ao DNA. Sendo assim, serão sintetizados derivados alquilados do resveratrol

25

e também compostos contendo o átomo de selênio com o intuito de avaliar sua

interação frente ao DNA.

27

2 OBJETIVOS

Nesta sessão serão apresentados os objetivos geral e específicos deste

trabalho conforme apresentado na Figura 2.

2.1 OBJETIVO GERAL

Sintetizar derivados do resveratrol alquilados e contendo o átomo de selênio e

realizar estudos da interação destes com ssDNA.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

i. Preparar derivados do resveratrol a partir de reações de alquilação.

ii. Sintetizar benzo[b]selenofenos a partir do resveratrol.

iii. Realizar um estudo para avaliar o tipo de interação entre os compostos

preparados e o ssDNA.

Figura 2 – Objetivos

Fonte: Elaborado pela autora, 2019.

29

3 REVISÃO DA LITERATURA

Neste capítulo será descrita uma revisão da literatura acerca de como se dá e

como tem sido tratado o câncer, com enfoque especial nos compostos que podem

se comportar como agentes intercaladores com o DNA, bem como polifenóis, em

especial o resveratrol. Para tal este capítulo será dividido em câncer e intercaladores

de DNA, polifenóis, resveratrol e síntese e derivatizações do resveratrol.

3.1 CÂNCER E INTERCALADORES DE DNA

O câncer é definido como a proliferação descontrolada de células devido a

inibição de processos apoptóticos (MBELE, HULL e DLAMINI, 2017). De acordo com

o Instituto Nacional Americano de Câncer (US-NCI), quando este crescimento ocorre

em órgãos, músculos ou ossos, tal enfermidade é chamada de tumor, que por sua

vez pode ser benigno, pré-maligno ou maligno (US-NCI).

Tumores não são necessariamente cânceres, uma vez que os ditos benignos

apesar de serem apresentados de diversos tamanhos, não são capazes de se

espalhar e, portanto, permanecem em sua forma inicial e uma vez removidos,

costumeiramente não reaparecem. Por outro lado, tumores pré-malignos, ou pré-

cancerosos, apesar de não são considerados canceres, são descritos como tumores

na iminência de apresentar propriedades cancerosas e devem ser removidos e

monitorados com frequência. Por fim, tumores malignos são chamados tumores

cancerosos e diferente dos tumores benignos, estes apresentam um crescimento

rápido e podem se espalhar entre órgãos em um processo denominado metástase

(US-NCI).

De acordo com a Agencia Internacional de Pesquisa em Câncer, é estimado

que novos casos alcancem a marca de 14,1 milhões e que o número de mortes

nesses casos pode chegar a 8,2 milhões (CHEUNG e DELFABBRO, 2016;

CancerIAfRo, 2014). Sendo assim, o câncer é a segunda principal causa de

mortalidade e morbidade no mundo, atrás apenas de doenças cardiovasculares

(BANYDEEN et al., 2015; CHEUNG e DELFABBRO, 2016; MANGALAGIU, TURA e

LUCA, 2010).

De acordo com a Sociedade Americana de Câncer (American Cancer

Society), a probabilidade de desenvolvimento de câncer ao longo de vida é de 41%

30

para homens e de 38% para as mulheres (SIEGEL et al., 2014; Cancer Facts and

Figures, 2017).

O principal problema com relação às células cancerosas é a sua incapacidade

de sofrer apoptose, que é a morte celular programada, devido a mutações não

identificadas, resultando assim em seu acúmulo, podendo então em estágios mais

avançados, migrar para outras partes do corpo (MBELE, HULL e DLAMINI, 2017).

Os primeiros tratamentos desenvolvidos foram determinados através de uma

combinação de casualidade, observação e raciocínio dedutivo. Devido ao

conhecimento limitado a nível molecular sobre a doença ou sobre o modo de ação

das drogas, desenvolveram-se combinações terapêuticas baseadas na não

toxicidade do somatório de drogas administradas obtendo remissões mais longas e

até mesmo a cura, embora muitos pacientes tenham vindo a óbito na utilização

destes tratamentos (MAYERS e HEIDEN, 2017).

Nas últimas três décadas, a descoberta tanto da oncogênese, que é a

denominação dada aos genes relacionados com o surgimento de tumores, quanto

dos genes supressores de tumores, resultou em um aperfeiçoamento do

entendimento do papel genético no surgimento do câncer, possibilitando assim uma

mudança na abordagem que se utiliza no desenvolvimento de novos tipos de

tratamentos (HANAHAN e WEINBERG, 2000; NOTTA et al., 2016).

A descoberta de que o câncer se dá por mutações que corrompem os

caminhos existentes para o desenvolvimento, crescimento e proliferação celular,

sugere que estes caminhos devem ser tomados como alvo no tratamento do câncer

(HANAHAN e WEINBERG, 2011; GARRAWAY, 2013).

Existe uma grande variedade de cânceres descritos na literatura, fazendo

com que o tratamento seja dificultado e, por vezes, ineficiente, devido principalmente

ao desenvolvimento de resistência às drogas. Dentre os principais métodos de

tratamento estão as cirurgias, o tratamento por radiação e a quimioterapia, sendo

que dentro da quimioterapia, as vertentes mais importantes e promissoras são os

agentes alquilantes e intercaladores de DNA (SZAKÁCS, 2006; ZHANG e YANG,

2009; CHEN et al., 2009).

Durante as últimas décadas, houve um progresso significante no

desenvolvimento de novas drogas e terapias, através de descobertas como a cis-

platina. Como consequência, o tratamento eficaz de algumas formas de neoplasmas

31

foi alcançado, apesar de muitos pacientes sofrerem com efeitos colaterais

desconfortáveis (MANGALAGIU, TURA e LUCA, 2010).

Uma das estratégias mais efetivas são drogas que tem o DNA como alvo,

como os agentes alquilantes e intercalantes. No entanto, as drogas mais utilizadas

em quimioterapia são, em sua maioria, compostos que interagem diretamente com o

DNA ou previnem a relaxação do DNA através da inibição das topoisomerases

(PALCHAUDHURI e HERGENROTHER, 2007).

O DNA possui conformação de dupla hélice. Este biopolímero é formado por

duas fitas em sentidos opostos, uma de 5’→ 3’ e outra de 3’→ 5’, mantendo-se

unidas por dois tipos de forças: As ligações de hidrogênio entre os pares de bases

complementares mantem a conformação de dupla hélice e as interações de

empilhamento das bases (π-stacking) mantem a estabilidade (Figura 3) (NELSON;

COX, 2010).

Figura 3 – Interações que estabilizam a dupla hélice

Fonte: KARABIYIK et al., 2014

As interações entre a droga e o DNA podem ser do tipo covalente ou não-

covalente. As interações covalentes podem ser a ligação à base nitrogenada ou ao

grupo fosfato, enquanto as interações não-covalentes podem ser subdivididas em

32

intercalação, interação com os sulcos e interação eletrostática (Figura 4) (RUIZ-

AZUARA et al., 2013).

Figura 4 - Representação esquemática de possíveis de interações com o DNA

Fonte: BARRA, 2015

Atualmente um dos modos de interação mais estudados de moléculas com o

DNA é via intercalação, que é definida como inserção de uma molécula aromática

policíclica planar de carga positiva entre dois pares de bases adjacentes de DNA.

Esta interação é estabilizada pela sobreposição das nuvens eletrônicas π do

intercalador e as nuvens π das nucleobases vizinhas que resulta no alongamento,

enrijecimento e desenrolamento da hélice do DNA (PAGES et al., 2015).

Apesar da intercalação ser normalmente associada a moléculas contendo

anéis aromáticos fundidos em sua estrutura, alguns intercaladores atípicos

apresentam sistemas aromáticos não fundidos (Figura 5). Agentes intercaladores

são extensamente utilizados como antitumorais, antineoplásicos, antimalária e

agentes antifungos (PALCHAUDHURI e HERGENROTHER, 2007).

Ao contrário da intercalação, a interação pelo sulco não induz grandes

mudanças conformacionais no DNA, e é realizada por moléculas com cadeias

grandes que se ligam aos sulcos do DNA, conforme Figura 4. Assim como os

agentes intercalantes, compostos que fazem ligação pelo sulco se mostram eficazes

como agentes antibacteriais e anticancer (BISCHOFF e HOFFMANN, 2002).

33

Figura 5 - Exemplos de compostos que fazem intercalação ou ligação pelo sulco

Fonte: Adaptado PALCHAUDHURI e HERGENROTHER, 2007

No entanto, cabe ressaltar que uma droga pode interagir das duas maneiras

com o DNA, como é o caso das antraciclinas, uma classe de compostos importantes

com propriedades antibacterianas e antineoplasicas que apresentam uma unidade

intercalativa somada a uma cadeia lateral capaz de promover ligação com o sulco do

DNA como por exemplo a doxorrubicina, de nome comercial adriamicina (Figura 6)

que é utilizado no tratamento de canceres de mama, pulmão, ovário, fígado e tiróide

(PALCHAUDHURI e HERGENROTHER, 2007).

Figura 6 - Doxorrubicina


34

3.2 POLIFENÓIS

Polifenóis são compostos orgânicos com um ou mais grupos hidroxila ligados

a um anel fenólico, são biossintetizados a partir da fenilalanina ou da tirosina e,

apesar de não estarem envolvidos no processo de crescimento e desenvolvimento

natural das plantas, os polifenóis desempenham papéis importantes no mecanismo

de defesa das plantas contra vírus, bactérias, fungos e herbívoros (GORAN et al.,

2017).

Os polifenóis podem ser divididos em três classes principais (Figura 7): (a) os

flavonoides, (b) os estilbenos e (c) os ácidos fenólicos. Os flavonoides são

componentes de baixa massa molar que tem em sua estrutura dois anéis fenólicos

(A e B) e um anel oxigenado (C) que dá à estrutura geral um esqueleto de quinze

carbonos. Dentre os estilbenos, alguns podem apresentar, como 1,2-difenileteno, um

esqueleto composto por 14 carbonos, tais compostos são considerados polifenóis e

podem apresentar-se na forma monomérica, oligomérica e polimérica. Já os ácidos

fenólicos são compostos derivados do ácido benzoico ou do ácido cinâmico

(GORAN et al.,2017).

Figura 7 - Estruturas gerais (a) dos flavonoides, (b) dos estilbenos e (c) dos ácidos

fenólicos (n>1).


Na última década foi comprovado que os polifenóis produzidos pelas plantas

possuem impactos positivos na saúde humana, reduzindo processos oxidativos,

inibindo o crescimento de inúmeras patogêneses causadas por vírus (NAKAYAMA et

al., 1993; SONG et al., 2005), bactérias (SHIN e CHUNG 2007; KOHDA et al., 2008)

e fungos (PARK et al., 2006). Também são capazes de estimular o crescimento de

parasitas e bactérias benéficas (CARDONA et al., 2013) e previnem doenças

crônicas (YANG e HONG, 2013) incluindo o câncer (CASADO et al., 2016).

35

Flavonoides e outros polifenóis são capazes de inibir a topoisomerase IB

humana por meio tanto de inibição e relaxação quanto da estabilização do complexo

formado (EBELER e WEBB, 2004). Por fim, alguns flavonoides são capazes de

intercalar-se ao DNA além de inibir a topoisomerase (GORAN et al.,2017).

Ebeler e Webb (2004) testaram 34 compostos polifenólicos com relação a sua

habilidade de inibir a topoisomerase I e intercalar com o DNA por meio do método de

eletroforese em gel in vitro. Neste estudo foi demonstrado que os melhores

resultados são atribuídos aos compostos apresentados na Figura 8, uma vez que

tais compostos foram envenenadores potentes das topoisomerase I e a podem ser

considerados agentes intercalantes de DNA.

Figura 8 - Estrutura dos melhores resultados quanto à inibição da topoisomerase I

Fonte: Adaptado EBELER e WEBB, 2004

Tajmir-Riahi e colaboradores (2015) estudaram de que forma antioxidantes

como o resveratrol, a genisteína e a curcumina (Figura 9) interagem com o DNA e

determinaram através de modelos estruturais que a intercalação é a interação

preferencial para o resveratrol e a genisteína, uma vez que estes devido a

deslocalização de elétrons, interagem principalmente via π-stacking, enquanto a

curcumina, por apresentar uma cadeia grande, interage via ligação com o sulco do

DNA.

Figura 9 - Estrutura da genisteína e da curcumina

Fonte: Elaborado pela autora, 2019

36

3.3 RESVERATROL E SEUS DERIVADOS

O resveratrol pertence ao grupo das fitoalexinas, as quais representam uma

parte importante dos mecanismos de defesa das plantas (KUNDU eSURH, 2008),

sendo um grupo de metabolitos secundários de baixa massa molar produzidos pelas

plantas como resposta a lesões, ataques microbiológicos, estresse ambiental,

radiação ultravioleta ou exposição ao ozônio (ACERSON et al., 2013).

A biossíntese do resveratrol (Esquema 1) é catalisada pela enzima estilbeno

sintetase, e consiste na condensação descarboxilativa de um resíduo de p-

cumarilcoenzima A com três unidades CO2 provenientes de moléculas de

malonilcoenzima A, levando a biossíntese do resveratrol na área afetada (JEANDET

et al., 2002).

Esquema 1 - Biossíntese do resveratrol

Fonte: adaptado JEANDET et al., 2002

O resveratrol possui comprovadas propriedades antioxidantes sendo

encontrado em uma diversidade de uvas, vinhos tintos e amendoim, e tem

demonstrado proporcionar proteção contra uma série de doenças, incluindo o

câncer. (REAGAN-SHAW, MUKHTAR e AHMAD, 2008; AZIZ, KUMAR e AHMAD,

2003; AHMAD et al., 2004).

Em 1997, Jang et al., publicaram o primeiro artigo sobre quimioprevenção de

cânceres utilizando o resveratrol e, desde então, inúmeros estudos pré-clínicos,

incluindo in vitro e in vivo foram realizados sugerindo que o resveratrol atua como

quimiopreventivo e terapêutico contra vários tipos de cânceres (NDIAYE et al.,

2011). Sendo assim, o uso do resveratrol como suplemento e complemento vem

aumentado significativamente nos últimos anos, bem como um tratamento

37

alternativo para diversas doenças e condições, incluindo câncer, diabetes,

obesidade e doença de Alzheimer (NDIAYE et al., 2011).

O resveratrol apresenta baixa toxicidade podendo ser administrado em doses

relativamente altas sem apresentar efeitos colaterais aos seres humanos, fazendo

com que este seja um excelente candidato para o tratamento de doenças (NDIAYE

et al., 2011).

Para determinar se o resveratrol pode ou não ser utilizado como ingrediente

em alimentos, deve-se avaliar sua estrutura em diferentes concentrações e valores

de pH. O resveratrol é solúvel em etanol, DMSO e outros solventes orgânicos, no

entanto, diversos autores citam sua baixa solubilidade em água (<1 mgmL-1),

limitando assim a sua utilização na indústria alimentícia, uma vez a absorção dele é

dificultada.

Estima-se que a atividade biológica apresentada pelo resveratrol e seus

derivados depende significativamente de sua estrutura, como o número e a posição

dos grupamentos hidroxila, ligações de hidrogênio intermoleculares, estereoisomeria

e a ligação dupla. Diversos grupos de pesquisa que estudaram o papel dos

grupamentos hidroxila do resveratrol, relatam que a hidroxila na posição 4’ é

essencial às atividades como citogenética, eliminação de radicais, antioxidantes e

antiproliferativas (LÓPEZ-NICOLÁS e GARCÍA-CARMONA, 2008).

O hidrogênio mais ácido da estrutura pertence ao grupamento hidroxila da

posição 4’, quando comparado aos grupamentos nas posições 3 e 5, indicando que

é mais fácil retirar o hidrogênio da posição 4’ devido ao efeito de deslocalização de

elétrons (CAO et al., 2006).

Com relação à constante de dissociação ácida (Ka) do resveratrol, diferentes

resultados são apresentados na literatura com relação aos três valores de pKa e

estes são apresentados na Tabela 1.

38

Tabela 1– Diferentes valores de pKa para o resveratrol encontrados na literatura

Autor(es) pka1 pka2 pka3

Igarashi et al., 2005 8,1 9,9 10,5

Cao et al., 2006 9,49 * *

Díaz et al., 2007 8,2 9,7 *

López-Nicolás e García-

Carmona, 2008 8,8 9,8 11,4

* Valor de pKa não informado no estudo.

Igarashi e colaboradores (2005) testaram várias misturas entre água e

solventes orgânicos como metanol, etanol, acetona e THF a fim de aumentar a

solubilidade do resveratrol possibilitando assim a determinação dos valores de pKa.

Dentre os solventes testados pelos pesquisadores, o metanol apresentou os

melhores resultados e a partir da determinação dos valores de pKa para misturas

com porções conhecidas de água-metanol, os autores utilizaram-se de regressão

linear para determinar o pKa em um meio livre do solvente orgânico empregado.

Sendo assim, os autores determinam os valores de pka1, pka2 e pka3 como 8,1, 9,9

e 10,5 respectivamente.

Já Cao e colaboradores (2006) calcularam por meio de eletroforese

utilizando-se de um método validado através da confirmação do pKa de compostos

com valores conhecidos na literatura. Estes autores relataram o pka1 como 9,49,

porém, não apresentaram valores para pka2 e pka3.

Díaz e colaboradores (2007) afirmam que o pKa deste polifenol é altamente

influenciado pela utilização de meio alcoólico, sendo assim, este grupo propôs uma

derivatização do resveratrol visando a formação de um composto fluorescente para

então realizar a determinação dos valores de pka em meio aquoso. Desta forma, os

autores inferem valores de pka1 e pka2 como 8,2 e 9,7, respectivamente.

Por fim, López-Nicolás e García-Carmona (2008) determinaram por meio de

espectroscopia de fluorescência e de absorvância, valores de pka1, pka2 e pka3

para o resveratrol como 8,8, 9,8 e 11,4, respectivamente. Tais autores realizaram

suas análises em meio aquoso trabalhando com concentrações muito pequenas de

resveratrol e fazendo o uso de técnicas de espectroscopia de absorvância, excitação

e emissão.

39

Com relação as propriedades quimiopreventivas do resveratrol, estima-se que

estas são um reflexo de sua habilidade de bloquear a ativação de vários agentes

carcinogênicos ou de estimular sua detoxificação, além de prevenir danos oxidativos

ao DNA, reduzir respostas inflamatórias e diminuir a proliferação de células

cancerosas. Por outro lado, a indução da apoptose em várias células cancerosas

indica o potencial do resveratrol tanto como quimiopreventivo, como

quimioterapêutico (KUNDU e SURH, 2008).

Zhang e colaboradores (2011) estudaram a interação do resveratrol com

ctDNA (ácido desoxirribonucleico de timo de bezerros) sob condições fisiológicas,

por meio de métodos de espectroscopia, fluorescência e medição de viscosidade, e

assim apontaram evidências que comprovam que a intercalação é o tipo de

interação predominante entre o resveratrol e o ctDNA (ZHANG et al, 2011).

Gao et al. (2014) estudaram o comportamento do resveratrol e a sua

interação com DNA de cadeia dupla de esperma de peixe, por meio de estudos de

voltametria cíclica e do espectro no UV-Vis. Neste estudo, os autores indicam que o

resveratrol interage com o DNA de modo a intercalar-se na dupla hélice.

Por fim, uma vez que o modo de interação do resveratrol com o DNA é

conhecido, Tajmir-Riahi e colaboradores (2015) propuseram o modo de ligação e a

localização da ligação entre diversos polifenóis com o DNA, dentre eles o resveratrol

(Figura 10).

Baseando-se em modelos moleculares, os autores concluíram que a

intercalação é a interação predominante entre o resveratrol e o DNA, além de

determinar que a intercalação forma adutos DNA-polifenol mais estáveis do que

quando comparado com o formado pela ligação com os sulcos do DNA, propondo

assim que a interação intercalativa pode ser a razão pela qual o resveratrol é capaz

de prevenir danos causados por radicais livres ao DNA. (TAJMIR-RIAHI et al., 2015).

40

Figura 10 - Previsão da melhor condição de interação do resveratrol com b-DNA

Fonte: Adaptado TAJMIR-RIAHI et al., 2015.

Apenas um restrito número de plantas produz o resveratrol e, uma vez que

este é produzido como resposta a estresses, normalmente não é encontrado em

quantidades que viabilizem sua obtenção unicamente através de procedimentos de

extração (GUISO, 2002).

Com os vários benefícios oferecidos pela molécula do resveratrol (LEE,

2004), diversos pesquisadores têm direcionado seus estudos para a sua síntese

(MORENO-MANAS et al., 1985; ORISINI et al., 1997; YUS et al., 1997; HO et al.,

1999; GUISO et al., 2002).

Inicialmente, as rotas sintéticas propostas para o resveratrol geralmente

empregam a reação de Wittig para formar a ponte etilênica (MORENO-MANAS et

al., 1985; ORSINI et al., 1997), como no trabalho de Ho e colaboradores (1999),

onde estes sintetizaram diversos derivados de estilbenos, dentre eles o resveratrol.

A rota sintética proposta é ilustrada no Esquema 2 e inicia-se com o tratamento do

álcool p-metoxibenzilíco com ácido bromídrico em benzeno, fornecendo assim o

brometo de p-metoxibenzila. Após purificação, o intermediário recém formado é

aquecido com excesso de trietilfosfito até 130ºC levando à liberação de brometo de

etila. Quando ela cessa, a solução é resfriada à 0ºC e são adicionados DMF e

metóxido de sódio. Em seguida o composto 3,5-dimetoxibenzaldeído é adicionado à

solução e esta é lentamente aquecida à temperatura ambiente pelo período de uma

ΔG ligação = − 4,62kcalmol-1

41

hora. Após tal período, a reação é aquecida a 100ºC e é mantida nesta temperatura

por cerca de uma hora e então é deixada por uma noite à temperatura ambiente.

Após tal período, os autores adicionam uma mistura 2:1 de água:metanol e o

estilbeno A precipita no meio. Após purificação do composto A obtendo um

rendimento de 95%, adiciona-se cloridrato de piridina sob agitação à 190ºC por

quatro horas. Em seguida, o óleo escuro formado é derramado em HCl 2M, extraído

com acetato de etila e purificado por coluna cromatográfica, eluindo-se com

clorofórmio e metanol em uma mistura 15:1, obtendo assim um rendimento de 45%

do produto desejado.

Esquema 2–Síntese do resveratrolproposta por Ho e colaboradores (1999)

Fonte: Adaptado Ho et al., 1999.

Em 2002, Guiso e colaboradores desenvolveram uma rota sintética que

utilizou uma reação de Heck para a formação da ponte etilênica. Já Lara-Ochoa e

colaboradores (2015) sintetizaram o resveratrol em uma síntese de quatro etapas

partindo de uma reação de acoplamento de Sonogashira para a formação da ponte

etilênica.

Apesar dos resultados tanto in vitro quanto em animais serem extremamente

promissores com relação aos efeitos anti-proliferativos do resveratrol, a baixa

biodisponibilidade do resveratrol no organismo se apresenta como um problema,

uma vez que este é muito rapidamente eliminado do organismo dificultando a

manutenção de uma quantidade terapêutica a um nível relevante na corrente

42

sanguínea (SINGH, NDIAYE e AHMAD, 2014; FRANCIOSO et al., 2014; WALLE,

2011).

De acordo com Delmas e colaboradores (2011), modificações na estabilidade

do resveratrol, em sua estrutura química ou em seu metabolismo, poderiam

ocasionar mudanças em sua resposta biológica, e assim, alterar as propriedades

quimiopreventivas do composto. Sendo assim, existem inúmeros estudos que visam

ampliar as propriedades do resveratrol utilizando-se de modificações estruturais do

mesmo (DELMAS et al, 2011).

Sendo assim, grupos de pesquisadores têm apostado em derivações na

molécula de resveratrol buscando aumentar sua biodisponibilidade no organismo.

Substituições nos grupos hidroxila da molécula de resveratrol por grupos metóxi

apresentaram um aumento na atividade antitumoral superando os resultados do

resveratrol. Outros derivados fluorados também mostraram atuação superior ao

resveratrol contra o câncer (LEE et al., 2003; MORAN et al., 2009).

Uma vez que um dos possíveis mecanismos pelos quais o resveratrol atua na

quimioprevenção é através da ativação da sinalização celular envolvendo a proteína

quinase C alpha (PKC), Das, Panye Majhi (2011) sintetizaram diversos derivados

do resveratrol para avaliar a relação entre a estrutura e a atividade dos compostos.

Dentre os compostos estudados, os derivados que mostraram melhores resultados

ligando-se a PKC, apresentando menores efeitos citotóxicos e promovendo uma

maior ativação da membrana, são apresentados na Figura 11 (DAS, PANY e MAJHI,

2011).

Figura 11 - Compostos com os melhores resultados quanto a ativação da proteína

quinase C alpha (PKC)

Fonte: Adaptado DAS et al., 2011.

43

Em 2015, Panzella e colaboradores desenvolveram uma nova classe de

derivados do resveratrol, visando obter propriedades antioxidantes em estruturas

versáteis capazes de serem utilizadas na biomedicina. Neste trabalho, Panzella e

colaboradores (2015) sintetizaram compostos contendo o esqueleto de 2-

fenilbenzo[b]selenofenos (Figura 12), sendo que todos se mostraram mais eficientes

que o resveratrol, e o melhor dentre eles (composto 1) apresentou uma atividade

antioxidante comparável ao Trolox, que é um análogo da vitamina E solúvel em

água, produzido pela Hoffman-Laroche, utilizado em aplicações bioquímicas e

biológicas para redução do estresse oxidativo (PANZELLA, 2015).



Nesta perspectiva, Puksassok e colaboradores (2017) sintetizaram uma série

de derivados de metóxi- e etóxi- resveratrol e outra série de derivados alquilados

(Figura 13), os quais foram avaliados quanto a inibição da proteína amiloide-β, suas

atividades antioxidantes, neuroprotetoras e neuritogenicidade. Os resultados

mostraram que alguns desses derivados foram até 20 vezes mais potentes quando

comparados ao resveratrol. Os resultados também indicaram que o grupo -OH livre

tem papel essencial para a atividade antioxidante dos derivados de alquil-resveratrol.


Fonte: Adaptado de Puksassok et al., 2017.

45

4 METODOLOGIA

Neste capítulo, será apresentada a descrição dos equipamentos e dos

métodos utilizados para a síntese e caracterização dos compostos apresentados

neste trabalho, bem como o procedimento para se determinar a interação entre tais

dos compostos e o DNA.

4.1 MATERIAIS

Os seguintes reagentes e solventes utilizados nas sínteses foram adquiridos

de fontes comerciais e utilizados após purificação prévia quando necessário

(PERRIN, 1980). Os solventes foram evaporados em um rotaevaporador Büchi

modeloR-114, operando à pressão reduzida (~30 mmHg), sendo que o solvente

remanescente foi eliminado em uma linha de vácuo, equipada com uma bomba de

alto-vácuo SYMBOL, modelo E21.

4.2 MÉTODOS E INSTRUMENTAÇÃO

4.1.1 Cromatografia em camada delgada (CCD)

As reações foram acompanhadas por cromatografia em camada delgada,

utilizando-se cromatofolhas de sílica gel 60 (Whatman – AL SIL G/UV – N° 4420222

com 0,2 mm de espessura) sobre lâminas de alumínio. Como eluente, utilizou-se

hexano ou soluções de hexano/acetato de etila e acetato de etila/metanol em

diferentes proporções. Os reveladores utilizados foram: luz ultravioleta, iodo e

solução ácida de vanilina submetida à aquecimento.

4.1.2 Cromatografia em coluna (CC)

A purificação dos compostos foi feita através de cromatografia em coluna,

utilizando-se silicagel 40-63 m (230-400 mesh) e, como eluente empregou-se

hexano ou soluções de hexano/acetato de etila em diferentes proporções.

46

4.1.3 Espectroscopia eletrônica – UV/Vis

Os espectros eletrônicos nas regiões do ultravioleta, visível e infravermelho

próximo foram obtidos utilizando-se um espectrofotômetro SHIMADZU UV3600plus,

situado no Laboratório de Análise Instrumental – LAI do Departamento de Química –

CCT/UDESC. As análises foram realizadas utilizando solventes de grau

espectroscópico e cubetas de quartzo com capacidade para 4 mL e 1,00 cm de

caminho óptico. Os valores do coeficiente de absortividade molar ε serão expressos

em mol L-1 cm-1.

4.3 CARACTERIZAÇÃO

Os compostos sintetizados foram caracterizados por meio da técnica de

ressonância magnética nuclear de hidrogênio e de carbono. Para tais análises,

utilizou-se um espectrômetro FT-NMR Bruker ASCEND400, operando na frequência

de 400 MHz, pertencente ao Laboratório de Análise Instrumental – LAI do

Departamento de Química deste centro. Os deslocamentos químicos foram

relacionados em parte por milhão (ppm), em relação ao tetrametilsilano (TMS,

utilizado como padrão interno para os espectros de RMN de 1H e CDCl3 e DMSO-d6

(para os espectros de RMN de 13C). Colocando-se entre parênteses a multiplicidade,

o número de hidrogênios deduzido da integral relativa e a constante de acoplamento

J, expressa em Hertz (Hz).

4.4 SÍNTESE DOS COMPOSTOS E ESTUDOS DE INTERAÇÃO

Nesta sessão serão descritos os métodos utilizados para a execução de cada

síntese proposta nos objetivos deste trabalho, bem como o método utilizado para a

determinação do grau de interação de cada composto estudado com o DNA.

47

4.4.1 Alquilação do Resveratrol

A alquilação do resveratrol foi realizada utilizando-se o procedimento descrito

na literatura por Das, Pany e Majhi (2011), conforme Esquema 6.

Esquema 3 - Condição de Alquilação do Resveratrol

Fonte: Adaptado DAS, PANY e MAJHI, 2011.

Em um balão de 100 mL adicionou-se o resveratrol (5 mmol, 228,25 gmol-1,

1,141 g) e a acetona previamente tratada, seguido do carbonato de potássio (45

mmol, 166,0 gmol-1, 7,47 g) e levou-se a agitação sob refluxo. Após cinco minutos de

agitação, acoplou-se um sistema de adição de líquidos e adicionou-se o haleto de

alquila1 lentamente ao meio reacional. Após 24 h de agitação, adicionou-se cloreto

de amônio saturado para neutralizar o meio e realizou-se a extração da reação com

acetato de etila e água destilada, onde a fase orgânica foi separada e seca com

sulfato de magnésio anidro e o solvente removido sob pressão reduzida. A

purificação do produto foi realizada por cromatografia em coluna sobre sílica gel

diluída em hexano.

(E)-1,3-dimetoxi-5-(4-metoxiestiril)benzeno

RMN de 1H (400MHz / DMSO-d6 / TMS) (ppm): 3,78 (s, 9H); 6,40 (t, J = 2,2 Hz,

1H); 6,75 (d, J = 2,2 Hz, 2H); 6,95 (d, J = 8,8 Hz, 2H); 7,02 (d, J = 16,4 Hz, 1H); 7,22

(d, J = 16,4 Hz, 1H); 7,53 (d, J = 8,8Hz, 2H).

1 Composto 2: Iodometano (45,0 mmol; 141,94 gmol-1; 2,28 gmL-1; 2,80 mL); Composto 3: 1-bromobutano (30,0 mmol; 137,02 gmol-1; 1,27 gmL-1; 3,24 mL); Composto 4: 1-bromooctano (30,0 mmol; 193,12 gmol-1; 1,11 gmL-1; 5,20 mL).

48

RMN de 13C (100 MHz / DMSO-d6/ TMS) (ppm):55,0; 55,1; 99,4; 104,1; 114,1;

126,1; 127,8; 128,5; 129,5; 139,4; 159,0; 160,6.

(E)-1,3-dibutoxi-5-(4-butoxiestiril)benzeno

RMN de 1H (400MHz / DMSO-d6 / TMS) (ppm): 0,94 (t, J = 7,6 Hz, 9H); 1,41-1,47

(m, 6H); 1,69 (quint, J = 8,0 Hz,6H); 3,95-3,99 (m, 6H); 6,36 (t, J = 2,1 Hz,1H); 6,71

(d, J = 2,1 Hz,2H); 6,92 (d, J = 8,8 Hz,2H); 6,98 (d, J = 16,4 Hz,1H); 7,19 (d, J = 16,4

Hz,1H); 7,50 (d, J = 8,8 Hz,2H).

RMN de 13C (100 MHz / DMSO-d6/ TMS) (ppm): 13,6; 18,7; 30,7; 67,0; 100,1;

104,5; 114,5; 126,0; 127,7; 128,3; 129,4; 139,2; 158,4; 160,0.

(E)-1,3-octiloxi-5-(4-octoxiestiril)benzeno

RMN de 1H (400MHz / CDCl3/ TMS) (ppm): 0,89 (t, J= 7,2 Hz, 9H); 1,28-1,34 (m,

24 H); 1,43-1,47 (m, 6H); 3,93-3,97 (m,6H); 6,35 (t, J= 2,2 Hz, 1H); 6,61 (d, J= 2,2

Hz, 2H); 6,84-6,88 (m, 3H); 7,01 (d, J = 16,2 Hz,1H); 7,39 (d, J = 8,7 Hz,2H).

RMN de 13C (100 MHz / CDCl3 / TMS) (ppm): 14,0; 22,6; 26,0 (C3); 26,1 (C3’); 29,2

(C4); 29,3 (C4’); 29,3; 29,4; 31,8; 68,1, 100,6; 104,9; 114,7; 126,6; 127,7; 128,6;

129,9; 139,6; 159,0; 160,5.

4.4.2 Síntese de benzo[b]selenofenos

Os benzo[b]selenofenos foram sintetizados de acordo com a metodologia de

Panzella e colaboradores (2015), conforme Esquema 7.

49

Esquema 4 - Condições para a síntese de benzo[b]selenofenos

Fonte: Adaptado PANZELLA et al., 2015.

A vidraria utilizada foi previamente seca em uma estufa a 100ºC por cerca de

1h. Em um balão de 20mL adicionou-se o selênio (1,0 mmol; 78,9 gmol-1; 0,079 g)

previamente ativado em uma estufa a 100 ºC por aproximadamente 1 hora. Em

seguida, acoplou-se um sistema de adição de líquidos ao balão e, lentamente,

realizou-se a adição do cloreto de sulfurila recém destilado (0,9 mmol; 134,96 gmol-1;

1,67 gmL-1; 0,073 mL) ao selênio sob atmosfera inerte de Argônio. Após 10 minutos

de agitação, utilizando uma seringa de 5 mL, adicionou-se 2,5 mL de THF anidro ao

balão e a mistura reacional permaneceu sob agitação por uma hora. Em seguida,

em um béquer pesou-se o resveratrol (0,4 mmol; 228,25 gmol-1; 0,091 g) e

dissolveu-se em 0,8mL de DMF previamente tratado. Então, utilizando uma seringa,

a solução de resveratrol foi adicionada à mistura reacional, mantendo a atmosfera

inerte de argônio.

Após 24 horas, realizou-se a extração preparando uma mistura de celite com

acetato de etila em um funil de placa porosa e filtrando a mistura reacional. O filtrado

foi extraído com acetato de etila e água destilada, onde a fase orgânica foi separada

e seca com sulfato de magnésio anidro e o solvente removido sob pressão reduzida.

Finalmente, a mistura obtida foi purificada por cromatografia em coluna sobre

sílica gel diluída em hexano/acetato de etila 4:1 obtendo assim o 2-(4-

hidrofenil)benzo[b]selenofeno-5,7-diol, que será chamado de composto 6, bem

como o 4-chloro-2-(4-hidroxifenil)benzo[b]selenofeno-5,7-diol que será chamado de

composto 7.

50

2-(4-hidroxifenil)benzo[b]selenofeno-5,7-diol

RMN de 1H (400MHz / DMSO-d6 / TMS) (ppm): 6,26 (s, 1H); 6,66 (s, 1H); 6,80 (d,

J = 6,6 Hz, 2H); 7,47 (d, J = 6,6 Hz, 2H); 7,58 (s, 1H); 9,18 (s, 1H); 9,73 (s, 1H);

10,03 (s, 1H).


126,8; 127,5; 144,8; 146,9; 153,8; 156,6; 157,7.

4-Cloro-2-(4-hidroxifenil)benzo[b]selenofeno-5,7-diol

RMN de 1H (400MHz / DMSO-d6 / TMS) (ppm): 6,53 (s, 1H); 6,84 (d, J = 8,6 Hz,

2H); 7,54 (d, J = 8.6 Hz, 2H); 7,68 (s, 1H); 9,82 (s, 1H); 9,87 (s, 1H); 10,32 (s, 1H).


126,3; 127,8; 141,9; 148,9; 151,7; 152,2; 158,1.

4.4.3 Síntese do benzo[b]selenofenos alquilados

Numa tentativa de sintetizar derivados alquilados de benzo[b]selenofenos,

utilizou-se novamente a metodologia descrita por Panzella e colaboradores (2015)

partindo dos derivados alquilados previamente sintetizados, conforme Esquema 8.

Esquema 5 – Condições para a síntese de benzo[b]selenofenos tri-alquilados


51

4.4.4 Estudos de interação com o DNA via UV-Vis

Os estudos de interação entre os compostos e o DNA extraído do esperma de

salmão (ssDNA) foram realizados utilizando-se um espectrofotômetro SHIMADZU

UV3600plus por meio de um experimento de titulação espectrofotométrica, onde a

concentração inicial de cada composto foi ajustada e mantida constante enquanto

adições de volume conhecido de ssDNA fizeram sua concentração variar,

fornecendo assim, os espectros que evidenciam tal interação.

A concentração de DNA por nucleotídeo foi determinada considerando a

absortividade molar (ε) desta biomolécula em 260 nm como 6600 M-1 cm-1

(NAGARAJ et al., 2014). O meio adotado foi acetonitrila/tampão 50% v/v, sendo que

a força iônica deste foi mantida constante utilizando-se cloreto de sódio 50 mM e o

pH fixo em 6,99 através do tampão biológico HEPES 50 mM. A absorção

proveniente do DNA foi subtraída dos resultados por meio da adição de quantidades

iguais deste tanto na cubeta da amostra analisada quanto na cubeta contendo a

solução de referência.

Antes da realização dos testes referidos acima, cada um dos compostos

sintetizados foi submetido a um teste de estabilidade, onde este foi preparado

conforme o procedimento do teste de interação, no entanto, não houve adição de

alíquotas de ssDNA, tampouco quaisquer adições às cubetas. Estas foram avaliadas

por um período de duas horas, onde um espectro foi medido a cada 15 minutos.

Cada composto foi determinado estável ou instável com base na variação na

absorvância e comprimento de onda dos espectros obtidos, sendo que tal magnitude

foi avaliada a partir de uma adaptação do cálculo de erro relativo percentual,

conforme equação apresentada abaixo:

erro relativo percentual (%) = |Abs final − Abs inicial|

Absinicial× 100

Onde a diferença em módulo entre a absorvância final e inicial é dividida pelo

valor inicial e então multiplicada por cem fornecendo assim o quanto os dados

divergem entre si. Compostos com variações de até 10% foram considerados

estáveis e submetidos ao teste de interação com o ssDNA. Por outro lado,

compostos com variações superiores a 10% foram determinados instáveis.

Para determinar o tipo de interação do composto com o DNA levou-se em

consideração o tipo de variação da absorvância, uma vez que mudanças na

52

estrutura química ou no meio levam a mudanças no espectro de absorção das

mesmas. A terminologia empregada para descrever tais variações leva em

consideração quatro possíveis mudanças no espectro, conforme Figura 14.

Figura 14 – Possíveis variações de absorvância de um espectro

Onde, batocromismo se refere às variações deslocando a banda para menor

energia ou maior comprimento de onda; hipsocromismo é definido pelo

deslocamento da banda para maior energia ou pra menor comprimento de onda;

hipercromismo se refere às variações deslocando a banda de modo à aumentar a

absortividade molar; enquanto hipocromismo é definido pelo deslocamento da banda

de modo à diminuir a absortividade molar (SIRAJUDDIN; ALI; BADSHAH, 2013).

Com base na variação da absorbância, a constante intrínseca de ligação (Kb)

do composto estudado com o DNA foi determinada de acordo com a equação de

Benesi-Hildebrand que fornece a intensidade da interação entre determinado

composto e o DNA (SIRAJUDDIN; ALI; BADSHAH, 2013):

𝐴0

(𝐴 − 𝐴0)=

𝜀𝐹

𝜀𝐵 − 𝜀𝐹+

𝜀𝐹

𝜀𝐵 − 𝜀𝐹

1

𝐾𝑏[𝐷𝑁𝐴]

Onde: A0 é a absorvância inicial do composto anterior à adição das alíquotas

do DNA, A é a absorvância do mesmo após as adições de DNA, [DNA] é a

concentração de DNA presente no meio após cada adição; εF é a absortividade do

composto e εB é a absortividade do composto interagindo com DNA. Assim, a

Hipercromismo

Hipocromismo

Batocromismo Hipsocromismo


λ (nm)

Ab

so

rvân

cia

(u.a

.)

53

constante Kb é a razão entre os coeficientes angular e linear de um ajuste linear

entre A0/(A – A0) em função de [DNA]-1 (BARRA; NETTO, 2015; MOHAMADI et al.,

2015).

55

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Neste capítulo, serão apresentados e discutidos os resultados obtidos no

estudo das reações de derivatização do resveratrol. Inicialmente serão apresentados

os resultados das sínteses dos compostos, bem como a caracterização das

estruturas a partir dos respectivos espectros de RMN, seguidos dos resultados

obtidos com relação aos estudos de interação com o DNA através do UV-Vis.

Finalmente, os espectros de RMN de ¹H e de ¹³C encontram-se no Apêndice A.

5.1 ALQUILAÇÃO DO RESVERATROL

Para realizar as reações de alquilação do resveratrol optou-se por adaptar o

procedimento descrito na literatura por Das, Pany e Majhi (2011). Os autores

mencionados preconizavam a alquilação de apenas uma hidroxila, sendo assim,

para alquilar as três posições do resveratrol, utilizou-se o triplo da base e do haleto

de alquila descritos.

5.1.1 Discussão dos Resultados Obtidos

Para realizar a alquilação do resveratrol, utilizou-se um excesso de base e de

haleto e acompanhou-se a evolução da reação através de cromatografia em camada

delgada, observando assim o consumo do resveratrol, bem como do produto mono-

e di-alquilado (Esquema 9).

Esquema 6 - Alquilação do Resveratrol


56

Dentre as sínteses apresentadas acima, a reação entre o resveratrol e cloreto

de 2-metoxietoximetilo (MEM-Cl) que formaria o composto 5 resultou em uma

mistura complexa com diversos subprodutos, o que impossibilitou sua purificação.

Por outro lado, os rendimentos das reações de alquilação para a formação

dos compostos 2, 3 e 4 foram de aproximadamente 99%, uma vez que se utilizou

um excesso de agente alquilante levando a formação do produto de interesse em

maior proporção.

5.1.2 Apresentação e Discussão dos Dados Espectrais

Os espectros de RMN de 1H apresentaram os sinais característicos do

resveratrol, com exceção dos sinais das hidroxilas, provando assim a alquilação.

Outro fator que corrobora a premissa de que o produto de interesse foi formado, são

os sinais dos hidrogênios alifáticos, principalmente o sinal em aproximadamente 4

ppm característico de hidrogênios próximos a átomos eletronegativos como o

oxigênio.

O espectro de RMN de 1H do composto 4 (Figura 15) proveniente da reação

entre resveratrol e 1-bromooctano, apresentou um tripleto em 0,89 ppm, com

constante de acoplamento de 7,6 Hz e integral relativa a 9 hidrogênios, referente as

metilas da ponta da cadeia alquílica. Já os hidrogênios metilênicos da cadeia

alifática mais afastados do átomo de oxigênio do composto apresentaram-se em

dois multipletos, em 1,31 e 1,45 ppm, com integrais referentes a 6 e 24 hidrogênios

respectivamente. Finalizando a parte alifática da estrutura, tem-se os hidrogênios

próximos ao oxigênio apresentando um multipleto com integral relativa a 6

hidrogênios em 3,95 ppm.

Com relação à parte aromática da estrutura, tem-se em um tripleto em 6,35

ppm, com constante de acoplamento de 2,2 Hz e integral relativa a 1 hidrogênio,

referente ao H4, seguido de um dupleto com constante de acoplamento de 2,2 Hz

pertencente aos hidrogênios H2 e H6 em 6,61 ppm. Outro multipleto foi evidenciado

com integral relativa a 3 hidrogênios (dois aromáticos H3’ e H5’ e o hidrogênio

vinílico Hα) em 6,86 ppm; o outro hidrogênio vinílico (Hα’) apresentou-se como um

dupleto, com constante de acoplamento de 16,2 Hz e integral relativa a um

hidrogênio em 7,01 ppm.

57

Por fim, em 7,39 ppm observou-se um dupleto com constante de acoplamento

de 8,7 Hz e integral relativa a dois hidrogênios (H2’ e H6’).

Figura 15 - Espectro de RMN de ¹H do (E)-1,3-octiloxi-5-(4-octoxiestiril)benzeno em

CDCl3 a 400 MHz. Padrão interno: TMS


Da mesma forma, o espectro de RMN de 13C do composto 4 (Figura 16)

comprova a formação do produto esperado, através da confirmação do número de

carbonos da molécula, apresentando os sinais alifáticos entre 14 e 68 ppm e

aromáticos e vinílicos de 100 a 160 ppm. Por fim, vale destacar os carbonos vinílicos

em 126,6 e 128,6 ppm (COMMODARI et al., 2005).

58

Figura 16 - Espectro de RMN de ¹³C do (E)-1,3-octiloxi-5-(4-octoxiestiril)benzeno em

CDCl3 a 100 MHz. Padrão interno: TMS


Cabe salientar que é possível observar a presença de 20 sinais de carbono

no espectro acima apresentado. Considerando os três substituintes alquila

quimicamente equivalentes, seriam esperados 18 sinais de carbono não

equivalentes. Isto pode ser explicado através de um olhar atento à região dos sinais

alifáticos da estrutura (Figura 17), onde pode-se perceber que dois carbonos do

centro da cadeia alquílica apresentaram sinais diferenciados, mostrando que os

substituintes do resveratrol não são totalmente equivalentes (26,05 e 26,08 ppm;

29,24 e 29,28 ppm) (COMMODARI et al., 2005).

59

Figura 17 – Ampliação da região alifática do espectro de RMN de ¹³C do (E)-1,3-

octiloxi-5-(4-octoxiestiril)benzeno em CDCl3 a 100 MHz. Padrão interno: TMS


60

5.2 SÍNTESE DE BENZO[b]SELENOFENOS

Para sintetizar os benzo[b]selenofenos utilizou-se a metodologia descrita por

Panzella e colaboradores (2015) (Esquema 10), onde através da variação das

proporções de [selênio : cloreto de sulfurila : resveratrol] direcionava-se a reação

para a formação dos produtos A, B ou C.

Esquema 7 - Rota sintética dos benzo[b]selenofenos


5.2.1 Discussão dos Resultados Obtidos

Os autores citam que a condição ideal para a formação do composto 6 tem a

proporção de selênio, cloreto de sulfurila e resveratrol de 1,0:0,8:0,4, e que tal

reação levaria a um rendimento de 50%. Entretanto, ao realizar a reação na

condição acima citada, não foi possível isolar o produto de interesse 6, uma vez que

este exibiu o mesmo fator de retenção apresentado pelo resveratrol tanto na

cromatografia em coluna quanto na cromatografia em camada delgada.

Sendo assim, visando o consumo completo do resveratrol e,

consequentemente, facilitando a purificação, aumentou-se a quantidade de cloreto

de sulfurila no meio reacional. Apesar de Panzella e colaboradores relatarem que a

utilização de 1 mmol de cloreto de sulfurila levaria a um rendimento de 85:15 dos

compostos 7 e 7a respectivamente, ao realizar a reação em tais condições, notou-se

61

o consumo do resveratrol por completo, além da formação dos compostos 6 e 7 (em

uma proporção de aproximadamente 2:1) e a ausência do produto 7a. Por fim, após

purificação por cromatografia em coluna, o rendimento obtido para os compostos 6 e

7 foi de 40% e 20%, respectivamente.

Por fim, com o intuito de sintetizar benzo[b]selenofenos alquilados, os dos

derivados alquilados sintetizados foram submetidos às condições reacionais

definidas anteriormente. No entanto, após análise do espectro de RMN de ¹H dos

compostos, não se evidenciou a formação dos produtos de interesse, comprovando-

se assim que tal condição proposta por Panzella e colaboradores (2015) não se

mostra eficiente para derivados alquilados.

5.2.2 Apresentação e Discussão dos Dados Espectrais

As análises dos espectros de RMN de 1H confirmam a formação do produto

de interesse, uma vez que as hidroxilas das posições 3 e 5, que no resveratrol são

quimicamente equivalentes apresentando-se como um único pico referente a dois

hidrogênios, passaram a desdobrar o sinal, sugerindo que um novo composto com

três hidroxilas quimicamente diferentes foi formado. Outra evidencia que corroborou

a obtenção do benzo[b]selenofeno foi o desaparecimento do sinal dos sinais dos

hidrogênios vinílicos do material de partida.

O espectro de RMN de 1H do benzo[b]selenofeno (Figura 18) apresenta o

sinal do hidrogênio H3 em 7,58 ppm, em 7,47 e 6,80 ppm dois dupletos referentes

aos hidrogênios do substituinte 4-hidroxifenil, em 6,66 e 6,26 os hidrogênios H4 e H6

respectivamente, por fim os sinais referentes as três hidroxilas do composto em

9,18, 9,73 e 10,03 ppm (ARSENYAN et al., 2016).

62

Figura 18 - Espectro de RMN de ¹H do 2-(4-hidroxifenil)benzo[b]selenofeno-5,7-diol

em DMSO-d6 a 400 MHz. Padrão interno: TMS


O espectro de RMN de ¹³C do composto 6 (Figura 19) comprovou a formação

do produto esperado, através da confirmação do número de carbonos da molécula,

12 sinais, já que existem dois pares carbonos quimicamente equivalentes. Cabe

destacar a ausência dos sinais dos carbonos vinílicos do material de partida, os

quais agora pertencem ao anel contendo o átomo de selênio e apresentam-se em

146,87 e 121,38 ppm.

H2O

DMSO

63




Já o espectro de RMN de 1H do composto 7, apresentado na Figura 20,

mostra sinais bastante semelhantes ao do composto 6, com exceção de um sinal de

hidrogênio, o qual apresentava-se em 6,66 ppm sendo, neste caso, substituído pelo

átomo de cloro (CAPPERUCCI et al., 2015).

64

Figura 20 – Espectro de RMN de 1H 4-Cloro-2-(4-hidroxifenil)benzo[b]selenofeno-

5,7-diol em DMSO-d6 a 400 MHz. Padrão interno: TMS


Do mesmo modo, o espectro de RMN de 13C do composto 7 (Figura 21)

comprova a formação do produto esperado, através da confirmação do número de

carbonos da molécula e, principalmente, pela mudança de deslocamento do carbono

4 de 101,94 (no composto 6) para 104,53 ppm devido a presença do átomo de cloro.




H2O

DMSO

65

5.3 ESTUDOS DE INTERAÇÃO COM O DNA

Estudos de interação de compostos e ácidos nucleicos são comumente

realizados através de titulações espectrofotométricas na região do ultravioleta-visível

do espectro eletromagnético (MISHRA et al., 2014). Este estudo tem por objetivo

verificar se o composto de interesse interage com o DNA por vias intercalativa ou

pela ligação com os sulcos (MAHADEVAN; PALANIANDAVAR, 1998).

Nesta sessão serão apresentados os resultados obtidos com relação aos

testes de interação de cada composto sintetizado com o ssDNA, onde

primeiramente serão discutidos os testes de estabilidade de cada composto e em

seguida, para cada composto considerado estável, serão apresentados os testes de

interação com suas respectivas constantes de ligação intrínseca (Kb).

5.3.1 Testes de estabilidade dos compostos sintetizados

Dentre os dez compostos que se propôs sintetizar, apenas 5 foram

sintetizados com sucesso, porém, após a análise do espectro de RMN de ¹H,

evidenciou-se que não foi possível purificar totalmente o composto 6, e este

apresentou-se como uma mistura contendo 70% do produto esperado e 30% de

resveratrol, sendo assim, foi possível determinar apenas uma constante intrínseca

aparente (Kbaparente) desta mistura.

Tais compostos foram submetidos ao teste de estabilidade juntamente do

resveratrol (Figura 22), para assim determinar a confiabilidade dos dados para um

posterior teste de interação com o ssDNA.

66

Figura 22 – Resveratrol e compostos sintetizados submetidos ao teste de

estabilidade


O teste de estabilidade foi realizado fixando-se para cada composto o

comprimento de onda (λ) na absorvância máxima para o espectro no tempo zero, ou

seja, sem adição de ssDNA, em seguida acompanhou-se o quanto a absorvância

neste ponto variou com o tempo (Figura 23).

Apesar da linearidade do gráfico apresentado na Figura 23 evidenciar a

estabilidade e instabilidade dos compostos, utilizou-se também do cálculo do erro

relativo percentual para reafirmar tais dados. Sendo assim, os compostos 1, 2, 6 e 7

são considerados estáveis uma vez que o erro relativo percentual entre as medições

foi de 2,4%, 1,1%, 5,3% e 0,5% respectivamente. Por outro lado, os compostos 3 e 4

são considerados instáveis uma vez que apresentaram um erro relativo percentual

de 18% e 67% respectivamente.

67

Figura 23 – Resultados dos testes de estabilidade realizados

0 20 40 60 80 100

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

A

bso

rvâ

ncia

(u

.a.)

tempo (min)

Composto 1 (220nm) Composto 2 (220nm)

Composto 3 (221nm) Composto 4 (237nm)

Composto 6 (218nm) Composto 7 (220 nm)


5.3.2 Testes de interação com o ssDNA

Os quatro compostos estáveis foram submetidos ao teste de interação com o

ssDNA, cada um dos testes foi realizado em duplicata obtendo-se assim um

resultado com maior confiabilidade.

A concentração de DNA por nucleotídeo foi determinada considerando a

absortividade molar (ε) desta biomolécula em 260 nm como 6600 M-1 cm-

1(NAGARAJ et al., 2014).

As concentrações de cada composto foram ajustadas visando a melhor

visualização de seu espectro no UV-vis, sendo apresentadas na Figura 24.

68

Figura 24 – Concentrações de cada composto e do ssDNA


Os espectros de cada um dos compostos foram acompanhados na ausência

e na presença de quantidades crescentes de ssDNA e serão ilustrados nas Figuras

25, 26, 27 e 28, bem como seus respectivos tratamentos pelo método de Benesi-

Hildebrand de A0/(A-A0) versus 1/[DNA].

O primeiro espectro de cada composto apresenta seu comportamento em um

meio livre de ssDNA, seguidos dos dados obtidos após adições de ssDNA de

concentração conhecida conforme apresentado na Figura 24.

69

Figura 25–Teste de interação do resveratrol comercial (1) com o ssDNA

a) Variação espectral do composto1 após sucessivas adições de ssDNA. Condições: CH3CN/HEPES 50% v/v; pH 6,99, I = 50 mM (NaCl); 25 oC. b) Regressão linear A0/(A-A0) x 1 / [DNA]. λmáx: 216nm.


70

Figura 26 – Teste de interação do resveratrol tri-metilado (2) com o ssDNA

a) Variação espectral do composto 2 após sucessivas adições de ssDNA. Condições: CH3CN/HEPES 50% v/v; pH 6,99, I = 50 mM (NaCl); 25 oC. b) Regressão linear A0/(A-A0) x 1 / [DNA]. λmáx: 219 nm


71

Figura 27 – Teste de interação da mistura (1 : 2 resveratrol: selenofeno (6) com o ssDNA

a) Variação espectral do composto 6 após sucessivas adições de ssDNA. Condições: CH3CN/HEPES 50% v/v; pH 6,99, I = 50 mM (NaCl); 25 oC. b) Regressão linear A0/(A-A0) x 1 / [DNA]. λmáx: 216nm


72

Figura 28 – Teste de interação do selenofeno (7) com o ssDNA

a) Variação espectral do composto 7 após sucessivas adições de ssDNA. Condições: CH3CN/HEPES 50% v/v; pH 6,99, I = 50 mM (NaCl); 25 oC. b) Regressão linear A0/(A-A0) x 1 / [DNA]. λmáx: 218nm


73

Observa-se nas Figuras 25a, 26a, 27a e 28a que à medida em que se

adicionam alíquotas de ssDNA, não há uma alteração significativa no valor do λmax

uma vez que o batocromismo observado foi de 4, 8, 4 e 2 nm para os compostos 1,

2, 6 e 7 respectivamente. Desta forma, pode-se presumir que uma das formas de

interação entre os compostos estudados e o ssDNA é pela ligação ao sulco uma vez

que resultados similares foram reportados por Souza e colaboradores (2010).

Para os quatro compostos estudados é observado hipocromismo nas bandas

de absorção destes a cada adição de ssDNA. Ao final dos experimentos, os

compostos 1, 2, 6 e 7 apresentaram um hipocromismo de 19, 21, 15 e 21%,

respectivamente. Tal comportamento é usual para interação por meio de

intercalação. A intensidade do hipocromismo é comumente consistente com a

afinidade da interação de intercalação (LIU, 2002; NIKOLIS; METHENITIS;

PNEUMATIKAKIS, 2003). Neste sentido, é possível afirmar que uma das formas

pela qual tais compostos interagem com o DNA é por vias intercalativas.

A partir dos dados apresentados é possível determinar as constantes de

ligação intrínseca (Kb) de 1,1x103, 8,2x103 e 4,5x104 para os compostos 1, 2 e 7,

respectivamente. Por outro lado, para o composto 6, é possível determinar apenas a

constante de ligação intrínseca aparente (Kbaparente) de 3,1x103 M-1 uma vez que este

não se encontrava puro.

75

6 CONCLUSÕES

Com relação aos objetivos propostos para este trabalho, foi possível realizar a

síntese de derivados alquilados do resveratrol, utilizando-se agentes alquilantes com

uma cadeia carbônica de 1, 4 e 8 carbonos. A síntese de derivados contendo um

átomo de selênio em sua estrutura também se mostrou satisfatória com relação à

síntese utilizando o resveratrol como ponto de partida. Por sua vez, a síntese de

derivados alquilados contendo átomos de selênio em sua estrutura não obteve

resultados promissores.

Dentre os compostos sintetizados, dois se mostraram instáveis frente ao teste

de interação com o ssDNA, no entanto, os compostos testados apresentaram

resultados promissores sugerindo que, de maneira geral, interagem com o ssDNA

tanto por vias intercalativas quanto pela ligação com o sulco.

Dentre os compostos sintetizados, é possível determinar que o composto 7

apresentou os melhores resultados com relação aos testes de interação com o

ssDNA, sendo assim, se mostra pertinente explorar diferentes derivados deste afim

de comparar as respostas obtidas.

77

7 PERSPECTIVAS

A partir da evidência de que derivados do resveratrol contendo um átomo de

selênio apresentam bons resultados quanto a interação com o ssDNA, se mostra

pertinente dedicar esforços para a síntese de tais derivados alquilados.

Uma vez determinado a impossibilidade da aplicação da síntese de

benzo[b]selenofenos alquilados pelo caminho (b) (Figura 29), sugere-se a rota

sintética proposta pelo caminho (a), onde o a alquilação se dá após a incorporação

do átomo de selênio na estrutura.

Tal resultado deve enriquecer esta pesquisa uma vez que possibilitará a

comparação de numerosas estruturas com relação à sua interação frente ao ssDNA.

Figura 29 - Perspectivas do trabalho


79

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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87

APÊNDICE A – Espectros Selecionados

89

Espectro de RMN de ¹H do resveratrol em DMSO-d6 a 400 MHz. Padrão interno: TMS

Espectro de RMN 13C do resveratrol em DMSO-d6 a 100 MHz. Padrão interno: TMS

H2O

DMSO

90

Espectro de RMN de ¹H do (E)-1,3-dimetoxi-5-(4-metoxiestiril)benzeno em DMSO-d6 a 400 MHz.

Padrão interno: TMS

Espectro de RMN 13C do (E)-1,3-dimetoxi-5-(4-metoxiestiril)benzeno em DMSO-d6 a 100 MHz.


H2O

91

Espectro de RMN de ¹H do (E)-1,3-dibutoxi-5-(4-butoxiestiril)benzeno em DMSO-d6 a 400 MHz.


Espectro de RMN 13C do (E)-1,3-dibutoxi-5-(4-butoxiestiril)benzeno em DMSO-d6 a 100 MHz.


H2O

DMSO

92

Espectro de RMN de ¹H do (E)-1,3-octiloxi-5-(4-octoxiestiril)benzeno em CDCl3 a 400 MHz.


Espectro de RMN 13C do (E)-1,3-octiloxi-5-(4-octoxiestiril)benzeno em CDCl3 a 100 MHz.

93

Espectro de RMN de ¹H do 2-(4-hidroxifenil)benzo[b]selenofeno-5,7-diol em DMSO-d6 a 400 MHz.


Espectro de RMN 13C do 2-(4-hidroxifenil)benzo[b]selenofeno-5,7-diol em DMSO-d6 a 100 MHz.


H2O

DMSO

94

Espectro de RMN de ¹H do 4-Cloro-2-(4-hidroxifenil)benzo[b]selenofeno-5,7-diolem DMSO-d6 a 400

MHz. Padrão interno: TMS

Espectro de RMN 13C do 4-Cloro-2-(4-hidroxifenil)benzo[b]selenofeno-5,7-diol em DMSO-d6 a 100

MHz. Padrão interno: TMS

H2O DMSO

maitÊ santos da silva - udesc - universidade do estado de ... · de alquilação, bem como...

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