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Universidade de São Paulo Instituto de Química

Departamento de Bioquímica

Angela Pedroso Tonon

Adaptação Celular e Molecular de Gracilaria tenuistipitata

Exposta à Cádmio e Cobre

São Paulo

14 de fevereiro de 2009

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Adaptação Celular e Molecular de Gracilaria

tenuistipitata Exposta à Cádmio e Cobre

Tese apresentada ao Instituto de

Química da Universidade de São Paulo para

obtenção do Título de Doutor em Ciências (Bioquímica)

Orientador: Prof. Dr. Pio Colepicolo

Co-orientadora: Profa. Dra. Mariana Cabral Oliveira

São Paulo

2009


Adaptação Celular e Molecular de Gracilaria tenuistipitata Exposta à Cádmio e Cobre.

Tese apresentada ao Instituto de Química

da Universidade de São Paulo para obtenção do

Título de Doutor em Ciências (Bioquímica)

Aprovado em: _________________

Banca Examinadora

Prof. Dr. ___________________________________________________________________

Instituição: _________________________________________________________________

Assinatura: _________________________________________________________________

Prof. Dr. ___________________________________________________________________

Instituição: _________________________________________________________________

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Prof. Dr. ___________________________________________________________________

Instituição: _________________________________________________________________

Assinatura: _________________________________________________________________

Prof. Dr. ___________________________________________________________________

Instituição: _________________________________________________________________

Assinatura: _________________________________________________________________

Pai, dedico esta tese especialmente à você, que sempre me ensinou a viver com

sua maneira peculiar de humildade e honestidade. Pelo seu inacreditável

esforço, suporte e compreensão.

Sempre te amarei...

À minha amada mãe Dona Nair, que sempre me guiou e se

dedicou inteiramente na minha educação.

Obrigada a vocês dois...

Às minhas queridas irmãs, Zanza e Adriana por toda força e incentivo

e à minha queridinha sobrinha Victória.

Agradecimentos

Em primeiro lugar gostaria de agradecer ao meu orientador Dr. Pio, pela oportunidade, incentivo, carinho e amizade. Essa oportunidade foi essencial na minha formação acadêmica.

À minha co-orientadora querida, Dra. Mariana Cabral, pelas suas discussões e ensinamentos. À Comissão de Pós-graduação do Departamento de Bioquímica da USP e aos queridos

responsáveis por parte da organização desse departamento; Milton “brigadão”, Cibele, Emiliano e Marcelo.

Às minhas queridas amigas e grandes companheiras do laboratório, Vanessita, Drica, Tha e Ka,

valeu muito meninas, por todo carinho, adoro vocês. Ao Paulinho pela ajuda na parte de construção dos microarranjos de DNA, Denise e toda

organização do CAGE. Dra. Aline e Dr. Sergio Verjovsk pela oportunidade.

Ao técnico Ed, meu grande amigão. Aos técnicos Wilton, Zilda e Sandra por toda ajuda. Aos meus amigos e copanheiros de laboratório, Aline “tão querida”, Renato, Sara, Lu, Diogo,

Moacir, Érika, Érika Pereira, Marcelo, Ernani, Pati e João. Às minhas “outras” irmãs, Marrrcita, Dê, Pri e Lay, que sempre me ajudaram em tudo; adoro

muito vocês.

Ao Dr. Jonas Collén e Dra. Catherine Boyen, pela colaboração científica no laboratório “Marine Plants and Biomolecules” da Station Biologique de Roscoff (CNRS/UPMC-Paris VI), França.

Aos amigos da França, que me receberam com tanto carinho, Valerita, Daniella flor, Jerôme, Sophie, Nicole, Audrey, Jihan e Justina.

Em especial aos meus queridos, François, Andrés e Sylvie pelos grandes ensinamentos e oportunidade de conhecer todo o laboratório. Também não deixaria jamais de agradecer ao querido Peter pela grande amizade, carinho e atenção.

À amiga Hêlo, pelo ensinamento da língua francesa e incentivo no meu estágio e a Sávia também por todo incentivo no meu trabalho.

Ao Dani, que me ajudou sempre que possível na elaboração deste trabalho, também pela atenção, amor e carinho.

À FAPESP, pelo apoio financeiro.

Resumo

Estudou-se o processo de adaptação da macroalga marinha Gracilaria tenuistipitata, cultivada

em meio contaminado por dois metais tóxicos, cobre e cádmio, comumente descartados no ambiente

marinho. Foram utilizadas nos ensaios biológicos concentrações de CE50 de 1,00 ppm para cádmio e

0,95 ppm para cobre. Tais concentrações basearam-se nas curvas de crescimentos da alga obtidas em

estudos anteriores, num período de 6 dias.

Determinou-se, a partir da técnica de ICP-AES, a capacidade da alga em absorver tais metais

durante o período de 6 dias. Os resultados indicam que G. tenuistipitata é capaz de bioacumular cobre

(17 %) e cádmio (9 %). Foram encontrados também níveis basais de cobre nas algas controles e

exposta ao cádmio. Além disso, determinou-se o repetório de outros elementos químicos, bem como

suas concentrações, para G. tenuistipitata e para duas outras algas marinhas importantes, G. birdiae e

G. domingensis, coletadas em ambientes naturais da costa brasileira.

Em investigação paralela, através da reação com cloreto de cério (CeCl3), detectou-se a

presença de H2O2 em G. tenuistipitata exposta aos metais, produzindo depósitos eletrodensos de

peridróxidos de cério. Foi possível notar aspectos morfológicos das células, após exposição de 1 hora,

1 dia e 6 dias. Observou-se que a alga produziu quantidades consideráveis de H2O2 e que os padrões

de acúmulos nesses tempos, para os dois metais, apresentaram algumas semelhanças, implicando uma

toxicidade maior no caso do cobre.

Visto que parte do genoma de todos os organismos está relacionado à codificação de proteínas

vinculadas ao controle dos efeitos nocivos gerados por diferentes tipos de estresse, também foi

analisada a variação na expressão gênica de G. tenuitipitata através da técnica de microarranjos de

cDNA. Observou-se que, em geral, as respostas ao estresse da alga aos metais foram diferentes para

categorias de genes funcionais distintas. Em resposta ao cádmio, observou-se que a alga foi capaz de

reagir mais rapidamente ao estresse. Foi visto que proteínas de defesa celular quase não variaram após

6 dias de tratamento e que alguns genes de metabolismo, síntese de proteínas, homeostase de íons e

transporte, essenciais para o desenvolvimento da alga, foram induzidos. Interpretou-se esse resultado

como um indicativo de que a alga já estaria se adaptando as condições adversas geradas por esse metal.

Para cobre a resposta foi um pouco mais complexa. Muitas enzimas de defesa foram reprimidas, assim

como alguns genes envolvidos com alta demanda de energia, síntese protéica, transcrição e

metabolismo. Em contra partida, um gene de defesa envolvido na dioxigenação de ácidos graxos

insaturados foi induzido. Genes de metabolismos, divisão celular, energia, entre outros, também foram

induzidos, indicando que a alga estaria reagindo ao estresse gerado por esse metal, mas em um

processo adaptativo mais lento, podendo cobre gerar maior capacidade tóxica. A maior parte dos genes,

cuja expressão foi alterada devido ao estresse gerado pelos dois metais, ainda não tem função celular

conhecida, demonstrando que há todo um mecanismo não identificado ligado à resposta da alga a

exposição a esses metais.

Devido à importância do gênero Gracilaria, espera-se que os dados apresentados nesse

trabalho sejam de grande valia para um compreendimento melhor dos processos celulares deste gênero,

frente à ambientes poluídos.

Palavras-chave: Gracilaria, poluição, adaptação celular, variação gênica, microarranjos, estresse

oxidativo.

Abstract

The adaptation process of the marine macroalgae Gracilaria tenuistipitata, cultived in a

medium contaminated with, copper and cadmium, was investigated. It was used in the biological

samples CE50 concentrations of 1.00 ppm for cadmium and 0.95 ppm for copper. Such concentrations

were based on the growth curves of the algae obtained in previous studies, over a period of 6 days.

It was determinated, through the use of ICP-AEC technique, the amount of metal that the

algae would be able to absorve during the period of 6 days. Results showed that G. tenuistipitata was

able to bioacumulate these two metals, about 17 % for copper and 9 % for cadmium. It was also found

basal levels in the control algae and in the one exposed to cadmium. Besides, it was determinated the

repertoire of other chemical elements, as well as their concentrations, for G. tenuistipitata and two

other important marine algae, G. birdiae e G. domingensis, colected in natural environments of the

braziliam shore.

In a parallel investigation, through the reaction with cerium chloride (CeCl3), it was detected

H2O2 activity in G. tenuistipitata exposed to the metals, producing eletron-dense accumulation of

cerium perhydroxides. It was possible to note morfological aspects of the cell, after exposure of 1

houer, 1 day and 6 days. It was found that the algae produced considerable quantities of H2O2 and that

the ccumulation patterns in these times, for both metals, showed some resemblance, implying a larger

toxicity in the copper case.

Since part of the genoma of all organisms is related to the coding of proteins linked to the

control of noxious effects generated by different types of stress, it was also analysed the variation in

the genic expression of G. tenuistipitata through cDNA microarrays technique. It was observed that, in

general, the responses to the algae stress were different for distinct functional gene categories. It was

seen that cell defense proteins have almost not changed after 6 days of treatment and that some

metabolism genes, protein synthesis, ionic homeostasis and transport, essential for the algae

development, have been induced. This result was interpreted as an indicative that the algae would

already be adapting to the adverse conditions generated by this metal. In the case of copper, the

response was a little more complex. Many defense enzymes were repressed, as well as some genes

involved with high energy demand, protein synthesis, transcription and metabolism. On the other hand,

one defense gene involved in the dioxygenation of polyunsaturated fatty acids was induced.

Metabolism genes, cell division, energy, amog others, were also induced, indicating that the algae

would be reacting to the stress generated by this metal, but in a slower adaptative process, so that

copper could have larger toxic capacity. The major part of the genes, whose expressions were changed

due to stress induced by the two metals, do not have a known celular function, showing that there is a

whole non identified mechanism linked to the algae response for the exposure to these metals.

Due to the major importance of the Gracilaria gender, it is hoped that the data presented in

this work could be of great value for a better understanding of the celular processes of this algae,

against polluted environments.

Keywords: Gracilaria, pollution, cellular adaptation, genic variation, microarrays, oxidative stress.

x

Lista de Abreviaturas

APX Ascorbato peroxidase

CAT Catalase

cDNA DNA complementar

CE50 Concentração efetiva que inibe um parâmetro em 50%

DNA Ácido desoxirribonucléico

DTT Ditiotreitol

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

EROs Espécies reativas de oxigênio

EST Expressed Sequence Tag

Kb-Kpb Quilo (pares de) bases

GPX Glutationa peroxidase

GR Glutaniona redutase

GSH Glutationa reduzida

GSSG Glutationa oxidada

GST Glutationa s-transferase

H+ Próton

H2O2 Peróxido de hidrogênio

M(n-1) Metal na forma reduzida

Mn+ Metal na forma oxidada

MOPS Ácido 3-(N-morfolino) propano sulfônico

mRNA RNA mensageiro

NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida

NADP+ Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidada

O2.- Ânion superóxido

OH. Radical hidroxila

xi

Sumário

1 Introdução 21

1.1 Características da Alga Marinha Gracilaria....................................................... 21

1.1.1 Espécies Brasileiras de Gracilaria....................................................... 24

1.2 Poluentes Marinhos............................................................................................26

1.2.1 Cádmio................................................................................................ 29

1.2.2 Cobre................................................................................................... 30

1.3 Espécies Reativas de Oxigênio - Estresse Oxidativo.........................................31

1.3.1 Mecanismos Celulares de Defesa Antioxidante..................................33

1.4 Biblioteca de cDNA de G. tenuistipitata............................................................35

1.5 Avaliação da Expressão Gênica......................................................................... 36

2 Objetivos 39

3 Materiais e Métodos 40

3.1 Cultivo da Alga.................................................................................................. 40

3.2 Descrição da Técnica de ICP-AES.....................................................................42

3.2.1 Condições Experimentais para ICP-AES............................................ 42

3.3 Visualização de H2O2 por Precipitação de CeCl3.............................................. 45

3.3.1 Protocolo e Soluções........................................................................... 46

3.3.2 Condições Experimentais para Detecção de H2O2.............................. 47

3.4 Extração de RNA Total...................................................................................... 48

3.5 Microarranjos de cDNA..................................................................................... 49

3.5.1 Ensaios Experimetais Utilizados nos Microarranjos de DNA............ 51

3.5.2 Marcação e Hibridização com os Microarranjos.................................51

3.5.3 Análise de Dados Gerados nos Microarranjos.................................... 52

3.5.4 Normalização dos Dados de Microarranjos........................................ 53

3.6 PCR em Tempo Real......................................................................................... 54

3.6.1 Construção dos Primers...................................................................... 54

3.6.2 Amostras de RNA............................................................................... 55

3.6.3 Técnica da RT-PCR em Tempo Real.................................................. 56

3.6.4 Extração de DNA Genômico de G. tenuistipitata............................... 56

3.7 Re-sequenciamento dos cDNAs........................................................................ 57

xii

4 Resultados 59

4.1 Absorção de Cu e Cd......................................................................................... 59

4.1.1 Análises dos Resultados de ICP-AES................................................. 59

4.1.2 Composição Elementar de Três Espécies de Gracilaria.................... 64

4.2 Análises dos Resultados de Acumulação de H2O2............................................ 66

4.2.1 Amostras Controles............................................................................. 66

4.2.2 Amostras Expostas ao Cádmio........................................................... 67

4.2.3 Amostras Expostas ao Cobre.............................................................. 69

4.3 Padronização da Extração de RNA Total.......................................................... 71

4.4 Resequenciamento das Amostras da Biblioteca................................................ 73

4.5 Análise dos Microarranjos................................................................................. 74

4.5.1 Dados de Amplificação e Purificação................................................. 74

4.5.2 Categorias Funcionais dos Genes do Microarranjo............................ 74

4.5.3 Genes Diferencialmente Expressos..................................................... 77

4.5.4 Distribuição dos Genes Induzidos e Reprimidos................................ 81

4.5.4.1 Cádmio................................................................................. 81

4.5.4.2 Cobre.................................................................................... 83

4.6 Validação dos Dados dos Microarranjos........................................................... 86

4.6.1 Qualidade do RNA.............................................................................. 86

4.6.2 Comparação de Resultados: PCR em Tempo Real e Microarranjos...87

5 Discussão 91

5.1 Absorção de Elementos Químicos..................................................................... 92

5.1.1 Absorção em G. birdiae, G. domingensis e G. tenuistipitata............. 94

5.2 Presença de H2O2............................................................................................... 96

5.2.1 Acumulação em Amostras Controle................................................... 97

5.2.2 Acumulação em Amostras Expostas ao Cádmio................................ 98

5.2.3 Acumulação em Amostras Expostas ao Cobre................................... 99

5.3 Técnicas Moleculares para Análise Transcripcional da Alga............................ 100

5.3.1 Interferência de Polissacarídeos na Extração de RNA........................ 100

5.3.2 Análise Global da Expressão Gênica da Alga.................................... 101

5.3.3 Validação dos Resultados................................................................... 105

6 Conclusões 109

Anexo A. Análise de Dados de Microarranjos 112

A.1 Dados Brutos..................................................................................................... 113

xiii

A.2 Normalização de Dados.................................................................................... 115

A.2.1 LOWESS............................................................................................ 118

A.3 Classificação de Genes Diferencialmente Expressos........................................ 119

A.3.1 O Método HTSelf............................................................................... 119

A.3.2 Estatística para Classificação............................................................. 122

A.4 Programa para Análise de Dados: “GT Microarray Analysis”........................ 123

A.4.1 Processamentos.................................................................................. 125

Anexo B. Listas de Genes Diferencialmente Expressos 129

Referências Bibliográficas 134

xiv

Lista de Tabelas

1 Produção mundial de alguns dos metais pesados mais descartados no ambiente

marinho; descarte anual nos oceanos; concentrações em águas oceânicas sob

condições normais e poluídas; volume em águas do mar contaminadas e toxicidade

dos metais em alguns organismos do fitoplâncton marinho. (pag. 28)

2 Concentrações de sais e vitaminas por litro de água do mar no meio Von Stosch

(pag. 40)

3 Controles utilizados para o meio de cultivo na técnica de ICP-AES. (pag. 43)

4 Genes utilizados como moldes na construção de primers para os experimentos de PCR

em Tempo Real. (pag. 54)

5 Análises das concentrações dos metais Cu e Cd em amostras de algas tratadas e

controle. (pag. 60)

6 Medidas de concentração de cobre e cádmio dos meios de cultivo controle. (pag. 62)

7 Resumo de resultados de absorção de metais. Para cada amostra de alga, é apresentado

o valor médio com desvio-padrão do pico de emissão [em Kcps] dos metais analisados

(essa média foi obtida através de gráficos como os das Figuras 11 e 12, considerando-

se a triplicata de amostras). (pag. 64)

8 Concentração de elementos químicos medidos por ICP-AES para as três espécies de

alga. (pag. 65)

9 Classificação das proteínas da biblioteca de G. tenuistipitata. (pag. 75)

10 Número de genes classificados representados no microarranjo, divididos em categorias

funcionais específicas. (pag. 76)

xv

11 Resumo geral dos experimentos de microarrajos. Apresenta-se o número total de genes

únicos estudados e o número de genes reprimidos, induzidos e invariantes, após

tratamento para cádmio e cobre. (pag. 78)

12 Lista de genes induzidos e reprimidos após tratamento com cádmio. É exibido também

o valor da razão da expressão gênica M = log2(Tratado/Controle) com respectivo

desvio-padrão. Valores sem desvio padrão referem-se a genes que só tiveram uma

única sonda analisada. (pag. 129)

13 Lista de genes induzidos e reprimidos após tratamento com cobre. É exibido também o

valor da razão da expressão gênica M = log2(Tratado/Controle) com respectivo desvio-

padrão. Valores sem desvio padrão referem-se a genes que só tiveram uma única

sonda analisada. (pag. 131)

xvi

Lista de Figuras

1 Aspecto geral da morfologia de talo de G. tenuistipitata (foto de Lopes, tese de

doutoramento, 2002). (pag. 23)

2 Aspecto morfológico de G. domingensis, G. birdiae e G. tenuistipitata (foto: Dra.

Eliane Marinho-Soriano/UFRN). (pag. 25)

3 Ação do cádmio em grupos sufidril. (pag. 30)

4 Transporte de cobre. Transporte de membrana celular: COPT1, COPT3, COPT5,

COX17, PAA1, PAA2, RAN1; fatores de detoxificação: Metalotioneinas, MTs;

Fitoquelatinas, PCs; Glutationas, GSH e Chaperonas, CCH e CCS (Adaptado de

Williams et al., 2000; Markossian & Kurganov, 2003). (pag. 31)

5 Redução do oxigênio molecular durante o processo de respiração (Adaptado de Cohen,

1989). (pag. 33)

6 Principais enzimas envolvidas no mecanismo antioxidante enzimático. (pag. 35)

7 Cultivo de G. tenuistipitata em incubadoras. Temperatura, período e intensidade de luz

e aeração são controlados. (pag. 41)

8 Representação esquemática dos três controles sobre os meios de cultivo. Cada controle

apresenta 3 frascos (A, B, C), contendo alíquotas dos meios de cultivo, cujas

concentrações de cobre e cádmio foram medidas via técnica ICP-AES. (pag. 44)

9 Curvas padrão para o cobre (A) e para o cádmio (B), utilizadas como escala de

conversão entre unidade de contagem [cps] e concentração [ppm]. (pag. 45)

10 Eletroforese em gel de agarose 1,5%, de algumas amostras das placas de DNAs

amplificadas e purificadas a partir de clones bacterianos. Foi utilizado o marcador de

xvii

peso molecular de 1 Kb Plus Ladder (Invitrogen) e foram aplicados 3 µL de cada

amplificado. (pag. 51)

11 Espectro da emissão atômica para o cálculo da concentração de cobre. Seta vermelha

representa concentração padrão de 1 ppm. Seta verde representa concentração de cobre

da alga exposta ao cobre. Seta azul representa concentração basal de cobre da alga

exposta ao cádmio. Seta lilás representa concentração de cobre da alga sem exposição.

(pag. 61)

12 Espectro da emissão atômica para o cálculo da concentração de cádmio. Seta vermelha

representa concentração padrão de 1 ppm. Seta preta representa concentração de

cádmio da alga exposta ao cádmio. (pag. 61)

13 Balanço entre as massas dos metais analisados. (pag. 63)

14 Amostras controle. Seta indica acumulação de H2O2. (PC) parede celular, (Pit-plug)

ponto de junção entre células, (CP) cloroplastos, (V) vacúolo e (G) grânulo de amido.

Escala: barra = 1µm. (pag. 67)

15 Amostras de 1 hora de exposição ao cádmio. Setas indicam acumulação de H2O2. (PC)

parede celular, (CP) cloroplastos e (G) grânulo de amido. Escala: barra = 1µm. (pag. 68)

16 Amostras de 1 dia de exposição a cádmio. Setas indicam acúmulos de H2O2. (PC)

parede celular, (CP) cloroplastos e (G) grânulo de amido. Escala: barra = 0,5 µm.

(pag. 69)

17 Amostras de 1 dia de exposição a cádmio. Setas azuis acúmulos de H2O2. Escala:

barra = 0,2 µm. (pag. 69)

18 Amostras expostas 1 hora ao cobre. Setas azuis indicam acumulação de H2O2. (PC)

parede celular e CP cloroplastos. Escala: barra = 1µm. (pag. 70)

19 Amostras expostas a 1 hora ao cobre. Setas indicam acumulação de H2O2. (CP)

cloroplastos e (G) grânulos de amido. Escala: barra = 1µm. (pag. 71)

xviii

20 Amostras expostas a 1 hora ao cobre. Setas indicam acumulação de H2O2. Escala:

barra = 1µm. (pag. 71)

21 Qualidade do RNA total das amostras Cu, Cd e controle analisadas no Bioanalyzer.

(pag. 73)

22 Distribuição em categorias funcionais dos genes selecionados, segundo dados das

Tabelas 9 e 10. No gráfico de cima, tem-se a distribuição geral de todos os genes entre

classificados, hipotéticos, hipotéticos conservados, sem classificação ou com

classificação incerta e outros. No gráfico de baixo, especificamos os grupos dos genes

classificados. (pag. 76)

23 Número de genes induzidos e reprimidos por categoria funcional (cádmio e cobre).

(pag. 80)

24 Genes induzidos e reprimidos para cádmio divididos em categorias funcionais.

(pag. 81)

25 Percentual de genes reprimidos e induzidos (cádmio) dentro de cada categoria

funcional. (pag. 83)

26 Genes induzidos e reprimidos para cobre divididos em categorias funcionais. (pag. 85)

27 Percentual de genes reprimidos e induzidos (cobre) dentro de cada categoria funcional.

(pag. 85)

28 Teste da qualidade dos primers e do RNA, utilizados na validação dos resultados de

microarranjos através da técnica de PCR em tempo real. (A) RT-PCR utilizando

amostras de RNA. (B) PCR convencional utilizando DNA genômico. As setas

correspondem aos marcadores de tamanho de 100 e 200 pb. (pag. 87)

29 Valores da razão da expressão gênica M = log2(Tratado/Controle) obtidos dos

experimentos de PCR e microarranjos para os 10 genes considerados. O tratamento

xix

refere-se à exposição da alga ao cobre. São mostrados os resultados para dois genes de

referência utilizados na técnica de PCR em tempo real: EF (Elongation Factor 1 Alpha)

e Actin. (pag. 89)

30 Resultados análogos aos da Figura 29, mas considerando agora o tratamento da alga

exposta ao cádmio. Os genes (d), (e), (f) e (j) foram circulados pois foram

classificados como diferencialmente expressos pelo método HTSelf. (pag. 89)

31 Correlação entre as razões de expressão gênica de M medidas pela técnica PCR em

tempo real (eixo x) e pela técnica de microarranjos (eixo y). Cada ponto representa um

dos dez genes selecionados para validação dos resultados (Tabela 4). (pag. 90)

32 Concentrações dos elementos químicos analisados pela técnica ICP-AES encontrados

nas algas G. birdiae, G. domingensis, G. tenuistipitata. Os valores são obtidos dos

dados apresentados na Tabela 8. Considerou-se o logarítimo dos valores para uma

melhor visualização gráfica dos resultados. (pag. 96)

33 Gráficos com valores de R×G e de log2(R)×log2(G). Os dados correspondem ao

microarranjo obtido da hibridização self-self. (pag. 114)

34 Transformação de coordenadas (log2(R), log2(G)) → (A, M). Os dados apresentados

referem-se aos mesmos da Figura 33. (pag. 115)

35 Ajuste LOWESS (linha vermelha) para um conjunto de dados de microarranjo genérico.

São apresentadas curvas para três valores do parâmetro f. (pag. 117)

36 Ajuste LOWESS (curva verde corresponde à função c(A)) ao conjunto de dados de

microarranjo da Figura 33 e normalização segundo a Equação (1). (pag. 118)

37 Retrato de um passo do processo da janela deslizante para determinação dos cutoffs

dependentes da intensidade. O gráfico da esquerda mostra o diagrama (A, M) com os

dados do self-self para o microarranjo da G. tenuistipitata. (pag. 122)

xx

38 Interface do programa “GT Microarray Analysis”. Os arquivos de dados abertos

correspondem à hibridização da alga tratada com cádmio e da alga em seu meio

natural de cultivo, bem como os arquivos de dados do self-self. (pag. 124)

39 Janela “Classification” aberta após a função “Classificar” ser selecionada. As tabelas

nessa janela permitem uma classificação completa dos genes estudados. (pag. 125)

40 Gráfico superior: Diagrama (A, M) e ajuste LOWESS (curva vermelha) para o

conjunto de dados da alga tratada com cádmio. Gráfico inferior: Dados normalizados e

cutoffs (curvas azuis). Em destaque (pontos lilás), valores representado spots com

expressão diferenciada. (pag. 127)

41 Gráfico superior: Diagrama (A, M) e ajuste LOWESS (curva vermelha) para o

conjunto de dados da alga tratada com cobre. Gráfico inferior: Dados normalizados e

cutoffs (cuvas azuis). Em destaque (pontos lilás), valores representado spots com

expressão diferenciada. (pag. 128)

21

1. Introdução

1.1 Características da Alga Marinha Gracilaria

O gênero Gracilaria faz parte do grupo das algas vermelhas, da família Gracilariaceae

(Rhodophyta). As algas vermelhas se distinguem de quaisquer outros eucariotos, por não

apresentarem organização dos tilacóides empilhados, por terem grânulos de pigmentos

associados nos chamados ficobilissomos, entre outras (Pueschel, 1990). As algas deste gênero

possuem seu ciclo de vida diplobionte dividido em três fases. A primeira e segunda fase é

caracterizada por uma alternância isomórfica entre as gerações haplóide e diplóide, e a

terceira fase diplóide parasita da planta haplóide feminina (Crichtley et al, 1993).

O gênero Gracilaria possui grande utilidade para a indústria química, por serem

produtores de ficobilinas e carotenóides que são pigmentos acessórios fotossintéticos,

possuem ácidos graxos insaturados e sintetizam uma parede celular única com polissacarídeos

sulfatados (Lee et al., 1999). Esta última característica confere a este gênero um alto valor

comercial como fonte produtora de ágar, um hidrocolóide amplamente utilizado na industria

biotecnológica, farmacêutica e alimentícia. Espécies do gênero Gracilaria são responsáveis

por mais da metade da produção mundial de ágar (McHugh, 1991). O consumo de ágar é

crescente e não há perspectivas de substitutos a curto prazo para algumas de suas aplicações

(Armisen & Gálatas, 1987). As principais fazendas de Gracilaria estão localizadas em

Taiwan, Hainan, China, Chile e Hawai, havendo também produção piloto em tanques nos

USA, Caribe e Namíbia (Santelices & Doty, 1989). No Brasil, existem pequenas

Introdução

22

produções na região Nordeste do país, Rio do Fogo (RN), Fleixeiras (CE) e Pitimbu (PB) e na

região Sudeste, Angra dos Reis (RJ) e Ubatuba (SP).

Populações naturais de diferentes espécies de Gracilarias brasileiras, são mais

abundantes na costa Nordeste em comparação com outros estados do país. Estas são colhidas

de bancos naturais e vendidas para produção de colóides. A exploração desses bancos naturais

vem aumentando, não havendo nenhum tipo de controle. O Brasil possui uma extensa costa

dando oportunidade para a maricultura destas algas, entretanto não há um cultivo comercial

em grande escala, sendo que o país importa a maior parte dos colóides utilizados na indústria

(Oliveira, 1997). O constante aumento na demanda de mercado do ágar, aliado à inexistência

de manejo de cultura destas algas, tem diminuído as populações desta macroalga nos bancos

naturais e por isso, tem-se implementado o cultivo em tanques e mesmo em mar aberto

(Chiang & Lin, 1989; Oliveira, 1997).

O ágar consiste de uma família de polissacarídeos que variam nas proporções dos

grupos ácidos (Izumi & Young, 1972). Duckwort e colaboradores (1971), mostraram

diferenças na composição química do ágar de algumas espécies de Gracilaria, observando

diferenças relativas nas proporções de anidrogalactose, galactose e metil galactose. O ágar é

utilizado como espessante, estabilizante ou gelificante em diversos produtos alimentícios, tais

como em bebidas, gelatinas, geléias, queijos, maionese, pudins e cremes (Chiang & Lin,

1989). A qualidade e a composição do ágar dependem de suas características físico-químicas

específicas, mas são também fortemente relacionadas aos parâmetros ambientais, como

crescimento e ciclo reprodutivo (Daugherty & Bird, 1988).

A macroalga Gracilaria tenuistipitata var. liui Zhang et Xia é uma linhagem originária

do sul da China que tem habilidade de crescer em salinidades que podem variar de 7a 30‰

com um ótimo de crescimento a 21‰. Esta espécie exibe uma grande tolerância a variações

de temperatura e é resistente ao ataque de epífitas (Haglund & Pédersen, 1993). Como as

Introdução

23

demais espécies do gênero, produzem elevada quantidade de agarocolóides podendo chegar a

52,7% do peso seco (Macchiavello et al, 1999), despertando grande interesse econômico. Esta

espécie é utilizada em estudos fisiológicos, bioquímicos e moleculares, servindo como

organismo modelo dentre as algas vermelhas (Collén et al., 2003; Lee & Chang, 1999; Lopes

et al., 1997; Hu et al., 1996; Plastino & Oliveira, 1996).

A morfologia celular do talo de G. tenuistipitata na fase tetraesporofitica (2n) é

caracterizada pelo córtex e medula. As células corticais são pequenas e numerosas, possuindo

grandes quantidades de pigmentos, grânulos de amidos e cloroplastos. As células medulares

por outro lado, são grandes, devido às dimensões dos vacúolos, não possuem cloroplastos,

pois não há captação de luz (Figura 1). As camadas do córtex, o tamanho e o número das

células medulares e a mudança das células do córtex para as células da medula são usadas

para a identificação da espécie (Food and Agriculture Organization of The United Nations;

http://www.fao.org/fishery). Os grânulos de amido são outra característica bastante

importante para identificação desta espécie. Estas estruturas geralmente são encontradas em

grandes quantidades no citoplasma da célula ao redor dos cloroplastos (Nyvall et.al; 1999).

Figura 1: Aspecto geral da morfologia de talo de G. tenuistipitata (foto de Lopes, tese de

doutoramento, 2001).

células do córtex

células da medula

1 cm

(B)

Introdução

24

Recentemente foi construído uma biblioteca de cDNA na sua fase tetraesporofítica que

revelou informações importantes sobre o repertório genético desta alga, identificado pelas

ESTs (Expressed Sequence Tags) (Nyvall et.al; preparação). Este método foi bastante

eficiente para uma rápida obtenção e identificação de sequências codificadoras de proteínas.

Foram caracterizados vários genes de diversas categorias celulares, tais como, metabolismo,

divisão celular, energia, sínteses de proteínas, transporte entre outros.

1.1.1 Espécies Brasileiras de Gracilaria

Devido ao elevado número de espécies de Gracilaria de ocorrência na costa brasileira

(cerca de 18 espécies), espalhadas do nordeste ao sul do país (Oliveira, 1977), é considerado

de extrema importância um conhecimento mais detalhado sobre a biologia das espécies

passíveis de cultivo. Além disso, é relevante salientar à preocupação com relação a depleção

dos bancos naturais de espécies de Gracilaria. Miranda (2000), indicou que em alguns bancos

do litoral nordestino havia sinais claros de exploração causados pelo manejo inadequado.

Entre as espécies brasileiras de Gracilaria, duas que merecem destaque, G. birdiae e

G. domingensis (Figura 2), vêm sendo estudadas e comercializadas, contribuindo para o

aumento do conhecimento da biologia destas espécies. Nesse sentido, estudos pioneiros para

estas espécies em ecologia, fisiologia, morfologia, biologia molecular, entre outros, tornaram-

se de grande valia.

Introdução

25

Figura 2: Aspecto morfológico de G. domingensis, G. birdiae e G. tenuistipitata (foto: Dra. Eliane

Marinho-Soriano/UFRN).

Estudos comparativos, para alguns elementos químicos, foram realizados nessas

espécies de Gracilaria em comparação a G. tenuistipitata, esta útima utilizada como

organismo modelo para estudos. O interesse atual em se estudar essas espécies de Gracilaria

e principalmente relacionar estudos sobre poluição com metais pesados em ambientes

aquáticos passíveis de cultivo, aplicou-se o método de ICP-AES (plasma acoplado

indutivamente), para a determinação das concentrações de diferentes elementos químicos. Foi

feito uma comparação sobre o repertório de elementos químicos necessários para a

sobrevivência e crescimento destas algas.

G. domingensis

G. tenuistipitata

G. birdiae

Introdução

26

1.2 Poluentes Marinhos

Os principais acessos de poluentes marinhos ao mar, são oriundos de efluentes

industriais e municipais (ações antropogênicas). Em consequência do aumento gradativo da

poluição ambiental, organismos marinhos incluindo o fitoplâncton e macroalgas são expostos

a diferentes contaminantes químicos, os quais apresentam graus variados de toxicidade. Os

principais grupos de poluentes marinhos que impactam as zonas costeiras e oceanos em

escala mundial são produtos químicos como bifenilas policloradas (PCB), organometálicos,

pesticidas organoclorados, clorofenóis, metais pesados, além de um grande volume de

matéria orgânica lançados ao mar. (Torres et al., 2008).

Os PCBs por exemplo, foram amplamente utilizados e comercializados como fluídos

dielétricos em transformadores e capacitores, solventes, fluídos térmicos, desinfetantes entre

outros (Tanabe, 1988). Apesar de suas propriedades técnicas os PCBs deixaram de ser

comercializados devido a evidências de suas toxicidades. Estes não são biodegradáveis e são

bioacumulativos em tecidos vegetais e animais (Agency for Toxic Substances and Disease

Registry, 2000).

Outro exemplo importante são os metais pesados, geralmente em mar aberto estão em

concentrações baixas o contrário acontece em águas litorâneas perto de sistemas de rios,

emissários e esgotos (Pinto et al., 2003). Metais pesados são caracterizados por um grupo de

elementos químicos com densidade atômica maior que 5 gcm-3 ou que possuem número

atômico maior que 20 (Marques et al., 2001). Muitos desses metais, como, mercúrio (Hg),

cobre (Cu), cádmio (Cd) e chumbo (Pb) são acumulados em processos biológicos, retendo-se

por longos períodos de tempo no organismo. Este acúmulo de metais pode aumentar, através

da cadeia alimentar marinha, determinando grandes fatores de concentração. Além disso,

outro problema com relação à poluição por metais, é a alta meia-vida biológica destes

elementos (Pinto et al., 2003). Neste sentido, o fitoplâncton e macroalgas, são, provavelmente,

Introdução

27

os mais importantes vetores biológicos de metais tóxicos, uma vez que estes organismos

constituem a maior biomassa de produtores primários dos oceanos e representam o primeiro

ponto de entrada de poluentes na cadeia alimentar marinha (Torres et al., 2008). Embora

muitos metais sejam essenciais ao crescimento celular, metais como Cd, Hg e Pb não são

essenciais e consistem em elementos extremamente tóxicos (Leduc et al., 1997). A absorção

de metais tóxicos pelo fitoplâncton e macroalgas se dá provavelmente pela competição com

transportadores de metais essenciais (Guerinot, 2000).

Tais elementos promovem diversos efeitos prejudiciais aos organismos marinhos,

mesmo em baixas concentrações, da ordem de ppb (partes por bilhões) a ppm (partes por

milhões) (Nriagu & Pacyna, 1988). Observa-se na Tabela 1, a produção mundial dos

principais metais pesados, descartados anualmente no ambiente marinho (Pinto et al., 2003).

Os efeitos prejudiciais incluem; a inibição de síntese protéica e de pigmentos, crescimento,

divisão celular, taxa respiratória, fotossíntese, modificações morfológicas, redução da

biodiversidade, e promoção de estresse oxidativo celular (Leduc et al., 1997; Davies et al.,

1978). Este último, por sua vez, pode ser restabelecido pelos sistemas antioxidantes

enzimáticos ou não, presentes nos tecidos (Brezova et al., 2007). Algas, devem não somente

ter sistemas de alta afinidade por metais traço essenciais, mas também devem ser capazes de

excluir ou detoxificar metais tóxicos. Pesquisas no campo da genética mostraram que as algas

são fontes de novos elementos genéticos envolvidos no metabolismo de metais, apresentando

um potencial para aplicação biológica (Rubinelli et al., 2002).

Introdução

28

Tabela 1: Produção mundial de alguns dos metais pesados mais descartados no ambiente marinho;

descarte anual nos oceanos; concentrações em águas oceânicas sob condições normais e poluídas;

volume em águas do mar contaminadas e toxicidade dos metais em alguns organismos do fitoplâncton

marinho.

Metal Produção

(t/ano) Discartes

(t/ano) Oceanos (ng/mL)

Poluição (ng/mL)

Contaminação (m3)

Inibição do crescimento

EC50 (ng/mL)

Hg 2,0 × 103 30 0,001 > 0,01 3,00 × 1012 > 0,4 Cd 1,0 × 104 60 0,020 > 1,00 0,06 × 1012 > 25,0 PB 3,5 × 103 2350 0,030 > 5,00 0,50 × 1012 > 250,0 Cu 9,0 × 106 4500 0,100 > 2,00 2,00 × 1012 > 10,0

Adaptado de Pinto et al., 2003.

Cádmio e cobre possuem alta afinidade com grupos sulfidrílicos (-SH), podendo

inativar enzimas que participam de passos metabólicos importantes ou complexar-se com a

GSH, reduzindo a capacidade antioxidante celular (Halliwell & Gutteridge, 2007). Além disto,

estes metais podem competir com outros metais de importância biológica como cálcio (Ca+2),

alterando a sua homeostase e provocando a ativação de vários sistemas Ca+2- dependentes,

entre eles a ativação de endonucleases, e Fe+3, alterando a sua disponibilidade a reações redox.

Alguns metais também são capazes de interferir no processo fotossintético, favorecendo o

escoamento de elétrons ao oxigênio molecular (O2) (Tschiersch & Ohmann, 1993).

O sequestro e a tolerância aos metais em excessos nas algas e plantas podem ser

realizados por moléculas quelantes, tais como, metalotioneínas e fitoquelatinas (Zhou &

Goldsbrough, 1995; Rauser, 1995; Cobbet & Goldsbrough, 2002). Metalotioneínas são

polipeptídeos, ricos em cisteínas, codificados por uma família de genes. Em contraste,

fitoquelatinas é uma família de peptídeos ricos em cisteínas sintetizados enzimaticamente

(Rauser, 1995).

Apesar dos organismos disporem de estratégias defensivas, a exposição aos metais,

como consequência da poluição ambiental, pode sobrepujar a defesa antioxidante e instalar o

quadro de estresse oxidativo celular. Nestas condições, o controle dos níveis celulares de

Introdução

29

antioxidantes é fundamental para sobrevivência dos organismos em ambientes contaminados

(Halliwell, 2007; Collén, et al, 2003).

1.2.1 Cádmio

O cádmio é um metal pesado que mesmo sob baixas concentrações é tóxico. Níveis

tóxicos deste elemento podem levar à desnaturação de proteínas e ao estresse oxidativo,

resultando em danos às membranas, redução na atividade enzimática e fotossíntese, clorose

(deficiência na formação de clorofila), dentre várias outras mudanças metabólicas. Foi visto

que algumas espécies de plantas podem apresentar mecanismos de tolerância, sendo o mais

bem conhecido aquele envolvendo a quelação por tióis, como glutationa, fitoquelatinas e

metalotioneinas (Cobbett & Goldsbrough, 2002). Jiang e colaboradores (2005), descreveram

que possivelmente o mecanismo mais importante de resistência a cádmio, para algumas

espécies de fungos, plantas e algas, seria a compartimentalização em vacúolos.

Este metal não é um elemento que possui função biológica conhecida nos organismos,

mesmo assim, sua absorção por membranas plasmáticas vegetais pode ser mediado pelas

proteínas da família ZIP (IRT1 e ZNT1), Nramp, CDF e LCT1, bem como através de canais

de cálcio e potássio (Perfus-Barbeoch et al., 2002). É provável que no citosol, o cádmio é

ligado a quelantes, tais como fitoquelatinas e ácido cítrico e, posteriormente, sequestrado no

vacúolo (Clemens, 2001). Segundo Materazzi e colaboradores (2004) e Lösch (2004) o alvo

potencial da ação de metais como o cádmio, são enzimas e proteínas, que contêm grupos

sulfidril (SH) ligados entre si por ligações dissulfeto. A presença do cádmio leva à oxidação

destes grupos (Figura 3) que, reagindo com o enxofre, destrói as ligações dissulfeto,

desnaturando a proteína, resultando na redução da atividade enzimática. Exemplos deste

efeito foram descritas para enzimas do Ciclo de Krebs na mitocôndria (Shaw et al., 2006).

Introdução

30

Figura 3: Esquema da ação do cádmio em grupos sufidril.

Outro efeito do cádmio na atividade enzimática está associado ao fato de que grande

número de enzimas contém metais e a substituição destes por outro metal de mesma carga e

tamanho similar, pode resultar na inibição da atividade da enzima (Kurdziel et al., 2004).

1.2.2 Cobre

Cobre é um metal essencial para o crescimento e desenvolvimento normal de plantas e

algas, apesar de também ser potencialmente tóxico em grandes concentrações. Participa de

vários processos fisiológicos, sendo co-fator essencial para muitas metaloproteínas; no

entanto, aparecem problemas quando o cobre está presente em excesso nas células. Isso inibe

o crescimento de organismos vegetais e impede importantes processos celulares, como, por

exemplo, o transporte de elétrons na fotossíntese (Eng, 1998).

Devido à ambiguidade da importância do cobre como um co-fator essencial e como

um elemento tóxico, diferentes estratégias, como uma rede complexa de vias de transporte do

metal, evoluiu de forma a regular apropriadamente sua homeostase celular em função de

mudanças ambientais. Outras estratégias devem, impedir o acúmulo do metal na forma reativa

livre (vias de detoxificação) e assegurar a alocação adequada do metal a metaloproteína de

destino. A aquisição de cobre para dentro das células é pouco conhecido em plantas e algas.

Entretanto, recentemente um rápido progresso tem sido feito para o reconhecimento dos

processos de transporte em fungos e outros organismos eucarióticos. Consequentemente,

várias famílias de transportadores de metais têm sido identificadas (Figura 4) (Guerinot, 1998;

Himelblau & Amasino, 2000; Williams et al., 2000; Markossian & Kurganov, 2003).

SH + Cd 2+ ENZIMA

S

S Cd + 2H +

ENZIMA SH

Introdução

31

Figura 4: Caminhos identificados no transporte intracelular de cobre. Transporte de membrana celular:

COPT1, COPT3, COPT5, COX17, PAA1, PAA2, RAN1; fatores de detoxificação: Metalotioneinas,

MTs; Fitoquelatinas, PCs; Glutationas, GSH e Chaperonas, CCH e CCS (Adaptado de Williams et

al., 2000; Markossian & Kurganov, 2003).

Não existem ainda indicações palpáveis de como estes genes de transportadores são

regulados nas células. Um estudo feito por Radisky (1999), revelou que muitos

transportadores de metais, em bactérias e fungos, podem ser regulados ao nível

transcripicional por concentrações de metais extracelulares via proteínas de fator

transcripcional.

1.3 Espécies Reativas de Oxigênio

O oxigênio é utilizado como aceptor final de elétrons pelos organismos aeróbicos,

permitindo elevada produção de energia na respiração, em consequência de seu alto potencial

eletroquímico. Entretanto, devido a sua configuração eletrônica, o oxigênio pode sofrer

reduções parciais, de um elétron, e levar à formação de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs)

Mitocôndria

Golgi

Vacúolo

Citoplasma

Introdução

32

que estão constantemente presentes nas células (Figura 5). O rompimento do equilíbrio entre a

geração de EROs e as defesas antioxidantes resulta no estresse oxidativo. O conhecimento dos

mecanismos de formação e de regulação dos níveis de EROs in vivo são importantes para a

compreensão de eventos celulares relacionados ao controle da sobrevivência, da morte e da

proliferação celular. Possibilita ainda a geração de conhecimentos que permitam interferir na

modulação de tais processos, para se alcançar efeitos desejáveis em sistemas biológicos

animais e vegetais (Halliwell & Gutteridge, 2007; Bergendi et al., 1999).

As principais formas de EROs de importância biológica são o radical superóxido

(O2·-), peróxido de hidrogênio (H2O2) e o radical hidroxila (HO·). O radical hidroxila é o mais

reativo e pode facilmente oxidar biomoléculas. Assim é provável que o radical hidroxila reaja

nas proximidades dos sítios onde foi gerado (Halliwell & Gutteridge, 2007). O radical

superóxido pode reagir com lipídeos de membrana, proteínas, aminoácidos, ácidos nucléicos,

carboidratos e tióis (Ryter & Tyrrel, 1998). O peróxido de hidrogênio pode permear

membranas, e esta propriedade possibilita a ocorrência de reações com alvos biológicos em

compartimentos distantes do seu local de formação (Hancock & Desikan, 2001). É possível

observar na Figura 5 a redução tetravalente do oxigênio molecular, na mitocôndria, até H2O.

Introdução

33

Figura 5: Redução do oxigênio molecular durante o processo de respiração (Adaptado, Cohen, 1989).

Ressalta-se que além das EROs citadas, há outros exemplos como, o radical alcoxil,

radical peroxil, entre outras. Além disso, EROs podem se combinar com outros átomos e

formar outras espécies reativas (Halliwell & Gutteridge, 2007).

As reações radicalares podem ocorrer em três etapas denominadas de iniciação,

propagação e término, como no caso do processo de lipoperoxidação em que uma molécula de

ácido graxo é oxidada por uma espécie iniciadora (HO·, por exemplo) gerando um radical

livre que pode novamente reagir com oxigênio e/ou com outras moléculas de ácidos graxos

propagando a formação destes radicais livres. O termino ocorre quando duas espécies

radicalares reagem entre si ou quando são interceptadas por substâncias protetoras (Halliwell

& Gutteridge, 2007).

1.3.1 Mecanismos Celulares de Defesa Antioxidante

A formação endógena de EROs é uma conseqüência indiscutível do metabolismo

aeróbico (Michiels et al, 1994). Em concentrações fisiológicas as EROs têm funções

Radical superóxido

Peróxido de hidrogênio

Radical hidroxil

Introdução

34

biológicas definidas, atuando como mensageiros de sinalização. Entretanto, concentrações

supra-fisiológicas devem ser evitadas pelo organismo, considerando que sua reatividade traz

consequências celulares deletérias, causando oxidação de biomoléculas tais como proteínas,

lipídios, carboidratos, DNA e o rompimento da homeostase celular (Sies & Graf, 1985).

Para se defender da toxicidade das EROs, o organismo apresenta mecanismos de

defesa em três níveis distintos; 1) prevenção da formação de EROs; 2) eliminação de EROs

formadas e 3) reparo de moléculas modificadas por EROs (Sies, 1993). Na prevenção da

formação EROs cita-se como exemplo a restrição de spin do oxigênio que diminui sua

reatividade com biomoléculas, o transporte de oxigênio na forma ligada e não livre, a

quelação de metais durante o transporte e armazenamento, evitando a ocorrência de reação de

i.Fenton e ii.Haber-Weiss, a eficiência da cadeia de transporte de elétrons na mitocôndria que

mantêm a formação de EROs em nível controlado e a organização estrutural do DNA em

cromatina (Sies, 1993).

i. H2O2 + M (n-1)+ .OH + -OH + Mn+

ii. O2.- + Mn+ O2 + M(n-1)+

M(n-1)+ + H2O2 Mn+ + .OH + -OH

Na eliminação de EROs formadas, existem dois mecanismos: i) Mecanismo

antioxidante enzimático; este mecanismo (Figura 6), vastamente descrito na literatura,

incluem como principais enzimas antioxidantes, superóxido dismutase (SOD), glutationa

peroxidase (GPX), glutationa redutase (GR), glutationa S-transferase (GST), catalase,

tiorredoxina redutase, entre outras (Nordberg & Arnér, 2001). i.i) Mecanismo antioxidante

não enzimático; este mecanismo é composto por moléculas que protegem alvos biológicos da

oxidação, incluindo moléculas lipofílicas ou hidrofílicas, que protegem compartimentos

apolares e polares do meio biológico, respectivamente. Cita-se como exemplo o tocoferol,

ascorbato, carotenóides e compostos fenólicos, entre outros (Ohta, 2000). Além disso, existe o

Introdução

35

terceiro mecanismo de reparo de danos do DNA. Se, por exemplo, os mecanismos

antioxidantes não conseguirem impedir os danos ao DNA, ocorrem injúrias oxidativas, que

incluem a modificação de bases de açúcares e a formação de ligações cruzadas entre fitas

duplas e simples (Dizdaroglu, 1991). Três mecanismos básicos foram descritos para reparar

danos oxidativos do DNA: reparo de excisão de bases, reparo de excisão de nucleotídeo e

reparo de erro de pareamento (Lunec et al., 2002).

Figura 6: Principais enzimas envolvidas no mecanismo antioxidante enzimático.

1.4 Biblioteca de cDNA de G. tenuistipitata

Poucos estudos moleculares foram realizados com algas vermelhas em comparação

com outros organismos. Os dados de sequências expressas (ESTs) têm revelado um método

bem sucedido para a investigação da expressão genética. Este método já foi utilizado para

alga G. gracilis com 200 ESTs sequenciadas (Lluisma & Ragan, 1997) e em grande escala

como para a alga vermelha Porphyra yezoensis com um total de 10 000 ESTs sequenciadas

(Nikaido et al., 2000).

Devido ao grande conhecimento que a técnica de ESTs pode trazer em relação à

expressão gênica de G. tenuistipitata, foi construída uma biblioteca de cDNA na fase

SOD - superóxido dismutase GPX - glutationa peroxidase

GR - glutationa redutase Catalase

e -

O 2 O 2 · -

SOD H 2 O 2

H 2 O + O 2

Catalase GSH GSSG

GR

NAPH NADP +

H 2 O

GPX

e -

O 2 O 2 · -

SOD H 2 O 2

H 2 O + O 2

Catalase 2 GSSG

GR

NAPH NADP +

H 2 O

GPX

Introdução

36

tetraesporofítica (2n) da alga, podendo assim analisar todo o seu repertório genético, em

condições normais de cultura.

A biblioteca de cDNA de G. tenuistipitata foi confeccionada utilizando amostras

coletadas em condições normais de cultura (após 18 horas da última adição de nutrientes e

depois de 2 horas de luz). Obteve-se duas bibliotecas, com médias em torno de 1600 e 600

pares de bases. As bibliotecas foram sequenciadas obtendo um total de 3631 ESTs. Após

sequenciamento da região 5´e análise, assegurou-se uma boa qualidade das sequências. Esta

biblioteca é caracterizada também por 2387 sequências únicas, 53,4 % de redundância, 49%

de bases GC e obteve-se uma média de 850 pares de bases nas sequências de leituras.

Dentre as classificações das ESTs de G. tenuistipitata várias categorias foram

separadas de acordo com o Centro de Sequências de Proteínas de Munique (MIPS). As

principais categorias analisadas foram; metabolismo, energia, crescimento, organização

celular , transporte e defesa celular (Nyvall et.al;em preparação).

1.5 Avaliação da Expressão Gênica

Análises do padrão da expressão de genes em diferentes situações fisiológicas é uma

etapa importante para a compreensão dos mecanismos envolvidos nos mais diferentes

processos celulares, incluindo, por exemplo, a resposta das células à estresses ambientais

variados. Entre as tecnologias que permitem a avaliação do transcriptoma, os microarranjos

ou chips de DNA são considerados uma alternativa excelente. Esta tecnologia possibilita a

análise quantitativa dos níveis de expressão de milhares de genes simultaneamente,

permitindo, com relativa facilidade, a avaliação global da expressão gênica em organismos,

tecidos ou células, frente aos mais variados tratamentos (Schena et al., 1998; Lockhart &

Winzeler, 2000; Schulze & Downward, 2001; Conway & Schoolnik, 2003). Os microarranjos

Introdução

37

de DNA são uma potente ferramenta para a utilização da grande quantidade de informações

que estão sendo geradas através dos projetos de sequenciamento de genomas (Schena et al.,

1998; Wolf et al., 2001).

Para a confecção dos microarranjos, fragmentos de DNA são imobilizados em um

arranjo ordenado sobre uma superfície sólida, em alta densidade. Em geral, cada ponto no

arranjo corresponde a um gene específico, podendo existir dezenas de milhares de pontos em

uma lâmina. Desta forma os fragmentos de DNA depositados no suporte sólido funcionam

como detectores moleculares para a prospecção simultânea dos níveis de expressão de cada

um dos genes representados no microarranjo frente a amostras complexas de RNA

mensageiros (mRNA). Os microarranjos atualmente em uso são de dois tipos principais:

microarranjos em lâminas de vidro (spotted DNA microarrays) e microarranjos de

oligonucleotídeos gerados por síntese de DNA in situ. Os microarranjos do primeiro tipo

podem ser construídos domesticamente ou adquiridos comercialmente, enquanto os do

segundo tipo são disponíveis apenas comercialmente. Geralmente, os fragmentos de DNA

depositados na lâmina de vidro correspondem a produtos de PCR derivados diretamente de

sequências genômicas ou de clones de cDNAs disponíveis através de coleções (bibliotecas de

cDNA) distribuídas comercialmente ou geradas nos próprios laboratórios. O tamanho destes

fragmentos está freqüentemente na faixa de 300 a 2000 pares de bases (Schena et al., 1998;

Lockhart & Winzeler, 2000; Schulze & Downward, 2001; Brazma et al., 2002).

Nos experimentos que empregam microarranjos para a avaliação do perfil de

expressão gênica, o RNA total da amostra controle (não tratada) e da amostra experimental

(tratada) é extraído e convertido em cDNA na presença de nucleotídeos acoplados a

grupamentos fluorescentes diferentes. Os cDNAs das duas amostras são então misturados e

co-hibridizados com o DNA imobilizado (designado sonda) nas lâminas de vidro. Após a

reação de hibridização, a lâmina é lavada e a intensidade de fluorescência para cada ponto é

Introdução

38

determinada pela varredura do microarranjos por um scanner, o qual possui lasers capazes de

excitar os dois fluoróforos separadamente. A intensidade do sinal fluorescente resultante em

cada ponto é quantificada e algoritmos de normalização para correção de fatores, tais como

diferenças de intensidades de incorporação e variações topográficas na lâmina, são aplicados

aos valores obtidos. O cálculo da razão das intensidades de dois sinais fluorescentes para um

mesmo ponto no microarranjo reflete a expressão relativa do gene ali representado, entre as

duas amostras biológicas que estão sendo comparadas. Deste modo, a razão das intensidades

dos dois sinais fluorescentes em cada ponto permite avaliar a expressão relativa de cada gene

representado no microarranjo. Utilizando-se a metodologia de microarranjos foi possível fazer

uma análise da expressão diferenciada de alguns genes essenciais envolvidos, no processo de

fotossíntese, transporte, no metabolismo energético, entre outros, de G. tenuistipitata.

39

2. Objetivos

O objetivo central deste trabalho foi estudar a resposta adaptativa celular e molecular

de G. tenuistipitata submetida em meio de cultivo contaminado com os metais tóxicos cobre e

cádmio, amplamente descartados no meio ambiente.

Para abordar características mais amplas desta resposta adaptativa foram realizadas as

seguintes estapas de análises:

i. Avaliar a capacidade de absorção da alga para cobre e cádmio em meio de cultivo.

ii. Analisar se realmente os metais exerceram efeitos tóxicos na alga durante 6 dias de

exposição

iii. Estimar, após este tempo de exposição, a variação da expressão gênica global em

termos de funções celulares

40

3. Matérias e Métodos

3.1 Cultivo da Alga

A Gracilaria tenuistipitata é uma espécie utilizada em estudos fisiológicos,

bioquímicos e moleculares, servindo como organismo modelo entre as algas vermelhas para

vários tipos de análises (Oliveira & Plastino, 1994). As algas são mantidas no laboratório em

incubadoras (Precision Scientific, modelo 818) com fotoperíodo de 12 h de luz (luz branca

fluorescente, 150 µmol fótons m-2s-1) e 12 h de escuro sob aeração constante (Figura 7). O

meio utilizado para o cultivo é o Von Stosch, rico em sais e vitaminas (Edwards, 1970). A

Tabela 2 representa os componentes que compõe este meio. A água do mar é filtrada,

esterilizada e diluída em 40% de água MilliQ.

Tabela 2: Concentrações de sais e vitaminas por litro de água do mar no meio Von Stosch..

Reagente mg.L-1 H2Omar

NaEDTA.2H2O 3,72 NaNO3 42,5

Na2HPO4 10,75 FeSO4.7H2O 0,278 MnCl2.4H2O 0,0198

Tiamina 0,25 Biotina 0,001

Cianocobalamina 0,001

No cultivo de G. tenuistipitata, o meio Von Stosch, é diluído em água do mar estéril a

uma salinidade de 21‰ e a temperatura nas incubadoras é sempre mantida a 20 ± 2 0C. As

Materiais e Métodos

41

algas são mantidas na proporção de 1 g de peso fresco da alga em 200 mL de meio de cultivo

e as trocas são realizadas 2 vezes na semana. Durante a manutenção, essas algas são limpas e

em caso de contaminação com cianobactérias e diatomáceas, as algas são tratadas, com

ampicilina (70 mg.L-1) e nistatina (100 µg.L-1).

Figura 7: Cultivo de G. tenuistipitata em incubadoras. Temperatura, período e intensidade de luz e

aeração são controlados.

3.2 Descrição da Técnica de ICP-AES

As análises foram conduzidas em um sistema de espectrofotômetro de emissão

atômica com fonte de plasma acoplado indutivamente (ICP-AES, Genesis, modelo SOP). Para

as análises de ICP-AES, foram utilizados recursos da Central Analítica do Instituto de

Química/USP.

Esta técnica faz uso de uma fonte de excitação de plasma de argônio para produzir

átomos excitados que emitem radiação em comprimentos de onda na faixa de 125 a 950 nm.

A emissão de radiação por átomos ou íons produz comprimentos de onda que são

característicos para cada elemento químico. Essas linhas de emissão podem ser usadas para

identificar a presença de um elemento químico na composição de materiais, através da


42

espectroscopia de emissão atômica. A concentração de um íon numa solução pode ser

determinada a partir da medida da intensidade da luz emitida na linha característica desse íon

numa fonte ICP. A relação entre a intensidade de luz emitida por uma solução de calibração,

contem o íon a ser analisado onde a concentração é conhecida. Logo, a partir da análise

espectroscópica da luz emitida por uma fonte ICP, é possível identificar e quantificar os íons

presentes numa solução analítica entre as concentrações de 10-1 até 10-4 mg.L-1. A composição

química de uma amostra sólida também pode ser determinada por ICP-AES, que consiste de

um sistema de introdução da amostra, fonte ICP, sistema de fornecimento de gás, gerador de

rádio freqüência, espectrômetro óptico, detectores, eletrônica e sistemas de aquisição.

3.2.1 Condições Experimentais para ICP-AES

Para avaliar os efeitos de Cu e Cd sobre G. tenuistipitata, partiu-se de concentrações

de CE50 para cobre (0,95 ppm) e cádmio (1,00 ppm), baseados em estudos prévios realizados

para a curva de crescimento desta alga, durante 6 dias de tratamento (Neto 2008, tese de

doutoramento-IQ/USP). A manutenção do cultivo da alga para o experimento de ICP-AES

foram as mesmas já esclarecidas na Seção 3.1. A seguir, foram detalhados o planejamento e a

utilização do ensaio biológico específico para a técnica ICP-AES.

Amostras de algas, foram separadas e acrescidas ao cultivo (meio Van Stosch, 60% de

água do mar filtrada e esterilizada e 40% de água MilliQ), juntamente com concentrações de

CE50 para cada um dos dois metais, foram utilizados sais de cádmio, (CdCl2) e cobre (CuSO4)

para estes ensaios. Para cada condição de tratamento foram utilizados 10 g de alga em 2 L de

meio de cultivo já acrescido do metal, sob as mesmas condições padronizadas de luz,

temperatura e aeração que a alga é mantida (Seção 3.1).

Após 6 dias de exposição aos metais, amostras de algas em triplicatas, foram coletadas

em três condições: controle (condições normais de cultivo), exposta ao metal cobre, exposta


43

ao metal cádmio. Foi realizada uma única coleta da alga, 6 dias após a exposição aos metais,

após a última adição de nutrientes e após 2 horas de exposição à luz do ultimo dia. Desta

maneira tentou-se reproduzir as mesmas condições de coleta da alga quando foi

confeccionada a biblioteca de cDNA. Imagina-se então, que o mesmo repertório de genes

expressos na construção da biblioteca foi abrangido, ao menos para a condição controle.

Além disso, foram utilizados também três controles dos meios de cultivo (Tabela 3 e

Figura 8). Deste modo, consegui-se medir a quantidade de cádmio e cobre no meio de cultivo

antes de submeter à alga ao tratamento e após, ao final da exposição. Para cada um dos

controles (1, 2 e 3 representados na Figura 8) foram separadas, em triplicatas, alíquotas de 20

mL do meio de cultivo de cada um dos frascos (A, B e C da Figura 8) utilizados nos ensaios

biológicos.

Tabela 3: Controles dos meios de cultivo utilizados na técnica de ICP-AES. Confira também Figura 8.

Número do Controle Descrição

1 Três frascos (A, B e C) sem adição de metais, só meio Von

Stock diluído em água do mar.

2 Os mesmos 3 frascos (A, B e C) do controle 1, mas com adição de cobre no frasco B e cádmio no frasco C.

3 Os mesmos 3 frascos do controle 2 após o tempo de exposição e retirada da alga.

Após exposição amostras de 1 g de alga, em triplicata, foram transferidas para

béqueres de 50 ml de capacidade. Adicionou-se 10 mL de HNO3 concentrado, aquecendo-se

em refluxo por 2 horas a 80°C. Após esta etapa, foi adicionado 1 mL de H2O2 30%,

mantendo-se em refluxo por 1 hora. O conteúdo foi diluído em balão volumétrico com 25 mL

de água MilliQ.


44

Figura 8: Representação esquemática dos três controles sobre os meios de cultivo. Cada controle

apresenta 3 frascos (A, B, C), contendo alíquotas dos meios de cultivo, cujas concentrações de cobre e

cádmio foram medidas via técnica ICP-AES. O meio Von Stock em cada frasco foi diluído em água do

mar.

Na operação de leitura do equipamento (ICP-AES) foram utilizadas cinco

concentrações padrões de 0, 1, 2, 5 e 10 ppm, para cobre e para cádmio (Figuras 9A e 9B).

Podemos observar através das “curvas padrão” (linha azul e pontos vermelhos) que o aparelho

foi ajustado, e que estas curvas servem como escala de conversão entre unidade de contagem

[cps] e concentração [ppm]. Após as medidas dos sinais, as intensidades dos elementos

medidos foram avaliadas pelo software Smart Analyzer.

alga

alga alga

cobre cádmio


45

Figura 9: Curvas padrão para o cobre (A) e para o cádmio (B), utilizadas como escala de conversão

entre unidade de contagem [cps] e concentração [ppm].

Foram também analisadas por ICP-AES duas outras espécies de Gracilaria brasileiras

(G. birdiae e G. domingensis), doadas pela Professora Dra. Eliane Soriano da Universidade do

Rio Grande do Norte. Estas espécies foram coletadas na praia do Cotovelo e praia do Fogo,

(Natal, Rio Grande do Norte), e não foram expostas a nenhum tipo de tratamento. Desta

maneira, foi possível analisar, entre as espécies brasileiras de Gracilaria em relação a G.

tenuistipitata, o padrão de concentração de alguns elementos químicos (Al, Ca, Fe, Mg, P, Si,

Mn, B, K, Na, Cu, Cd, Ba, Ni, Zn, Sr, Cr, Co e As).

3.3 Visualização de H2O2 por Precipitação de CeCl3

Foi detectado a formação de peróxido de hidrogênio (H2O2), um importante indicador

de estresse oxidativo. Esta metodologia foi feita em colaboração com o Dr. Jonas Collén do

laboratório “Marine Plants and Biomolecules” chefiado pela Dra. Catherine Boyen, na Station

Biologique de Roscoff (CNRS-UPMC), França.

(B) 1ppm ≅≅≅≅ 50××××103 cps (A) 1ppm ≅≅≅≅ 230××××103 cps


46

As algas possuem um grande aparato genético de resistência a estresses ambientais e

consequentemente, metabólico e fisiológico (Adhiya et al., 2002; Rubinelli et al., 2002).

Dessa forma, foram feitas comparações após exposições de 1 hora, 1 dia e 6 dias, detectando

diferentes níveis de acúmulo desse indicador de estresse. Detalhamos todo o procedimento a

seguir.

A atividade de H2O2 foi detectada citoquimicamente através da reação com cloreto de

cério (CeCl3), produzindo depósitos eletrodensos de peridróxidos de cério. Aqui utilizamos

ensaios histoquímicos baseados na reação de H2O2 com CeCl3 para produzir precipitados

eletrodensos insolúvel de peridroxidos de cério, Ce[OH]2OOH e Ce[OH]3OOH. Esta técnica

ultra-estrutural permite a localização precisa de sítios de acumulação ou produção de H2O2

(Czaninski et al., 1993).

3.3.1 Protocolo e Soluções

Para a localização sub-celular de H2O2 através de CeCl3, como descrito acima, todas as

soluções foram preparadas a partir de água do mar filtrada e autoclavada na proporção salina

que matem G. tenuistipitata em condições normais de cultura. Este método que é capaz de

gerar peridróxidos de cério insolúveis, foi adaptado de Bestwick et al. (1997).

Na utilização do protocolo para a técnica foram utilizadas as soluções a seguir:

1. Tampão MOPS (3-[N-morpholino] propane sulphonic acid) 50mM, pH 7.2

2. 5 mM de cloreto de cério em tampão MOPS (50 mM, pH 7.2), o pH foi

regulado para 7.2 com solução de NaOH 10 M

3. Glutaraldeído 3% diluído em água do mar, filtrada e autoclavada

4. Paraformaldeído 1,5% diluído em solução de glutaraldeído 3%

5. Etanol 25%, 50% e 75% diluído em água do mar, filtrada e autoclavada


47

Fragmentos dos tecidos frescos de G. tenuistipitata foram encubados em tubos

eppendorf durante 1 hora em 1 mL de solução de cloreto de cério, 5mM e MOPS, 50mM.

Após este período de exposição ao cloreto de cério os tubos foram esvaziados e fixados

durante uma hora em solução de glutaraldeído 3%.

Outra fixação foi feita durante toda noite em solução de 400 µL de paraformaldeído

1,5% e 3% de glutaraldeído. Após fixação, os fragmentos foram secos em sucessivos banhos

de etanol com concentração crescente de 25% durante uma hora, 50% uma hora duas vezes,

75% uma hora duas vezes e finalmente 100%. Esta metodologia utiliza soluções crescentes de

etanol, pois é importante desidratar todo o tecido, conservando assim suas estruturas

histológicas e citológicas. Após, os fragmentos foram embebidos em resina SPURR (Bishop’s

Stortford) com concentração crescente de etanol, novamente para desidratar, à uma

temperatura ambiente; (25%, 50% e 75% cada uma a 24 horas e 100% durante duas horas).

Os fragmentos foram polimerizados em blocos à 60ºC durante 4 dias numa orientação

horizontal (Olmos & Hellin, 1997).

Após a polimerização, os blocos foram seccionados entre 70 e 90 nm em um

ultramicrótomo (Milton Keynes), utilizando uma lâmina de diamante (Diatome, Bienne). Os

cortes foram examinados em um microscópio eletrônico de transmissão (modelo 7000;

Hitachi) com uma voltagem de 75 kV.

3.3.2 Condições Experimentais para Detecção de H2O2

As condições de manutenção do cultivo da alga para o experimento de precipitação de

H2O2 e a concentração de CE50 utilizadas (0,95 ppm para Cu e 1,00 ppm para Cd) foram as

mesmas já esclarecidas nas Seções 3.1 e 3.2.1. Todas as amostras analisadas foram oriundas

de talos tetraesporofíticos e os cortes foram realizados em uma orientação transversal. A


48

seguir, apresenta-se em detalhes o planejamento e a utilização do ensaio biológico específico

para esta técnica.

Amostras de algas, foram separadas e acrescidas ao cultivo (meio Van Stosch, 60% de

água do mar filtrada e esterilizada e 40% de água MilliQ), juntamente com concentrações de

CE50 para cada um dos dois metais, foram utilizados sais de cádmio, (CdCl2) e cobre (CuSO4)

nos ensaios de precipitação de H2O2. Para cada condição de tratamento, foram utilizados 1 g

de alga em 0,2 L de meio de cultivo já acrescido do metal, sob as mesmas condições

padronizadas de luz, temperatura e aeração que a alga é mantida (Seção 3.1). Para este

método a mesma proporção de alga/volume foi mantida como em cultura, mas em

quantidades menores.

Amostras da alga foram coletadas em tempos diferentes de exposição; 1 hora, 1 dia e

6 dias para o controle (condições normais de cultivo), exposta ao metal cobre e exposta ao

metal cádmio. Após a coleta, imediatamente amostras de talo foram seccionadas e os

fragmentos foram incubados em solução de cloreto de cério e tampão MOPS como descrito

na Seção 3.3.1.

3.4 Extração de RNA Total

A extração de RNA total foi padronizada utilizando o kit Concert Plant RNA Reagent

(Invitrogen). Este método foi utilizado para os experimentos de microarranjos e PCR em

tempo real. Este protocolo tem a finalidade de isolar RNA total de tecidos de plantas em

pequena escala ou em grande escala, especialmente aqueles tecidos ricos em carboidratos e

polifenólicos. Inicialmente partiu-se de amostras de alga em pequena escala. Nas instruções

do protocolo para pequena escala orienta-se a macerar no máximo 0,1 g de tecido e para

grande escala no máximo 5 g de tecido. Após maceração de 0,1 g de tecido, imediatamente

adicionou-se 0,5 mL do único reagente que é fornecido pela Invitrogen. A amostra foi


49

incubada por 5 minutos, seguindo-se a centrifugação, após o sobrenadante foi transferido para

um tubo eppendorf (livre de RNase). Foi adicionado NaCl 5M, seguindo de 0,3 mL de

clorofórmio. A mistura foi centrifugada durante 10 minutos onde as fases, polar e apolar

foram separadas. A fase aquosa (polar) foi recolhida e acrescentada igual volume de

clorofórmio. Centrifugou-se novamente, e o pellet foi lavado em etanol e diluído em 20 µL de

água tratada com DEPC (dietilpirocarbonato). As amostras também foram tratadas com

DNase conforme Seção 3.6.2 e essas foram lidas no espectrofotômetro NanoDrop (ND 1000),

obtendo-se uma concentração de 100 ng/µL de RNA total. Posteriormente todas as outras

amostras de RNA total utilizadas nos experimentos de microarranjos de DNA e PCR

quantitativo foram extraídas com este mesmo protocolo em grande escala (segundo fabricante,

Invitrogen). Após a extração as amostras de RNA total, foram purificadas utilizando mini-

colunas da QUIAGEN (RNeasy Mini Spin Column).

3.5 Microarranjos de cDNA

Foi utilizada a metodologia de microarranjos de DNA previamente implantada no

Departamento de Bioquímica do IQ-USP utilizando recursos do projeto temático CAGE

(Cooperação para Análise de Expressão Gênica; CageLab: http://bioinfo.iq.usp.br/cagelab

financiado pela FAPESP). Neste laboratório faz-se confecção, hibridização e análise de

microarranjos de DNA.

Para a produção dos microarranjos de DNA representando genes de G. tenusistipitata

foi utilizada uma biblioteca de cDNA contruida em nosso laboratório por Nyvall e

colaboradores, totalizando 38 placas de 96 poços, uma redundância de 53,4% e 2387

sequências únicas. Das 38 placas foram utilizadas 22 desta biblioteca e não foram feitas

seleções dos clones para construção dos microarranjos, mesmo havendo mais de uma


50

repetição para um mesmo clone. Deste modo, a chance de ocorrência de possíveis erros de

endereçamento durante a manipulação foi diminuída, sem contar que genes com mais de um

clone serviram de controles internos no procedimento de hibridização e análises. Estes clones

foram amplificados por PCR convencional em 100 µL de reação final, realizadas em placas

de 96 poços, a partir de 1 µL de cada estoque de clone bacteriano que são mantidos a - 70 ºC.

Os primers utilizados foram os mesmos primers do vetor pBK-CMV (T3 e T7) utilizados na

construção da biblioteca (Nyvall et.al; em preparação). A PCR típica consistia em:

desnaturação a 95ºC por 5 minutos seguida de 35 ciclos de 95ºC por 45 segundos, 55ºC de

anelamento a 30 segundos e extensão de 72ºC por 2 minutos. Após PCRs, foram feitos as

purificações em placas Multiscreen (Millipore MAFB), dos amplicons das 22 placas e análise

em gel de agarose 1,5%. (Figura 10). O conjunto de amplicons obtidos foram transferidos

manualmente para placas de 384 poços e depositados em lâminas espelhadas, utilizando o

Generation III Microarrays Spotter (GE, Healthcare). Este spotter permite a deposição de até

4608 amostras de DNA organizadas em 12 subconjuntos de 384 pontos. O conjunto total de

amostras foi depositado em duplicata nas duas metades longitudinais da lâmina, configurando

o que chamamos de set A e set B. Após deposição dos fragmentos de DNA, as lâminas foram

submetidas a 50 mJ de luz UV, para que as fitas de DNA fossem covalentemente fixadas.

Para avaliação da expressão gênica, os microarranjos foram hibridizados com cDNA

fita simples fluorescente gerado pela incorporação dos fluoróforos, Alexa flúor 555 e Alexa

flúor 647 (Invitrogen). Após a hibridização, o chip foi analisado no Generation III Scanner

(GE, Healthcare) para obtenção das imagens que refletiram a intensidade de fluorescências

dos pontos do microarranjo.


51

Figura 10: Eletroforese em gel de agarose 1,5%, de algumas amostras das placas de DNAs

amplificadas e purificadas a partir de clones bacterianos. Foi utilizado o marcado de peso molecular de

1 Kb Plus Ladder (Invitrogen) e foram aplicados 3 µL de cada amplificado.

3.5.1 Ensaios Experimetais Utilizados nos Microarranjos de DNA

A exposição com os metais foi elaborada com o mesmo meio de cultivo (meio Van

Stosch, 60% de água do mar filtrada e esterilizada e 40% de água MilliQ) acrescido de

concentrações (conforme CE50 de cada metal) de sais de cádmio (CdCl2) e cobre (CuSO4),

individualmente, sob as mesmas condições de luz e temperatura descrito na Seção 3.1. Foram

coletadas amostras da alga para extração de RNA, após 6 dias de exposição aos metais, após a

última adição de nutrientes e 2 horas de luz, onde poderia-se encontrar o mesmo repertório de

genes da biblioteca. Foram reproduzidas as mesmas condições de temperatura, quantidade de

nutrientes e período de luz da alga, que as usadas na preparação da biblioteca de cDNA.

3.5.2 Marcação e Hibridização com os Microarranjos

Na preparação de cDNA marcado e hibridizado com os microarranjos o RNA total foi

utilizado como molde para transcrição reversa em cDNA, utilizando-se nucleotídeos

acoplados a grupamentos fluorescente (Alexa flúor 555 e Alexa flúor 647), a enzima

Supercript III (Invitrogen) e 500 ng de iniciadores nonaméricos aleatórios. O kit utilizado para

a formação de cDNA foi o SuperScript Indirect cDNA Labeling System (Invitrogen) e todo o

procedimento foi feito de acordo com o fabricante. Após a transcrição, o RNA foi submetido

3000

2000

1000

3000

2000

1000


52

a hidrólise alcalina e o cDNA foi purificado em placas de filtração (Millipore, modelo

Multiscreen). A incorporação dos fluoróforos Alexa 555 e Alexa 647 foi quantificada

determinando-se a absorbância do cDNA purificado em 260 nm e 280 nm. As hibridizações

foram realizadas na presença de formamida deionizada na estação automática para

hibridações de microarranjos (CAGE). As lâminas foram lavadas com SSC (1x e 0,1x) com

presença de 2% de SDS a 55ºC e SSC 0,1x por 10 minutos a temperatura ambiente. As duas

soluções utilizadas para lavagem das lâminas, SSC e SDS (USB, Corporation), foram filtradas

em membranas com poros de 0,22 µM. As lâminas foram lavadas em água deionizada,

submetidas á secagem com nitrogênio gasoso e analisadas no Generation III Scanner (GE,

Healthcare), para a obtenção das imagens que refletem as intensidades de fluorescência dos

pontos dos microarranjos.

3.5.3 Análise de Dados Gerados nos Microarranjos

Após a varredura dos microarranjos no scanner, os dados brutos de intensidade de

fluorescência de Alexa 555 e Alexa 647 para cada ponto, foram extraídos utilizando-se o

programa ArrayVision 8.0 (Imaging Research Inc.), que delimita os contornos da imagem de

cada ponto e cria tabelas com as respectivas intensidades. Para quantificar a intensidade de

fluorescência do ponto utilizou-se a Median Artifac Removed Density (MTMDens) que

constitui uma mediana de densidade, excluindo-se os pixels que apresentaram sinal acima ou

abaixo de quatro desvios absolutos da mediana (MAD), permitindo a exclusão de pixels que

apresentassem poeiras ou artefatos de hibridização. A intensidade de fluorescência de cada

ponto foi determinada como sendo o valor de MTMDens subtraindo-se a mediana do sinal de

fundo.

Após o alinhamento e a extração das medidas foi realizada uma verificação visual das

imagens em ambos os canais para as lâminas. Sondas suspeitas de terem sinal influenciado


53

por manchas ou riscos receberam também marcações individuais. Ao final das análises os

dados foram extraídos e gravados em arquivos texto.

3.5.4 Normalização dos Dados de Microarranjos

A normalização foi feita pelo método do ajuste Lowess (Local Weighted Scatter-plot

Smoothing). Esse método representa um ajuste não-paramétrico local de regressão-linear

ponderada, o qual considera as intensidades não normalizadas de todos os pontos da lâmina, e

calcula os parâmetros que melhor ajustam retas para pequenos sub-conjuntos de dados nas

diferentes faixas de intensidades da emissão, no espaço log2(IA555/IA647) versus log2

(IA555IA647)1/2 (Yang et al., 2002). Para estas análises foi construído um programa “GT

Microarray Analysis”, vide Anexo A.

O desenho experimental planejado consiste no modelo reference design (Churchill,

2002), no qual as amostras tratadas com metais foram comparadas com uma condição

considerada referência. Essa condição representou o padrão de expressão gênica de G.

tenusistipitata em condições normais de crescimento a 20±2 0C no meio de cultivo, conforme

realizado para construção da biblioteca. Essa condição foi comparada com o crescimento da

alga na presença de sais de cádmio (CdCl2) e cobre (CuSO4) nas concentrações em que o

crescimento é aproximadamente inibido em 50% (CE50). Para cada metal, foi realizado

hibridações com amostras provenientes de 2 experimentos independentes (réplicas

biológicas). Para cada réplica biológica foram feitas duas hibridizações (réplicas técnicas),

invertendo os fluoróforos entre a amostra referência e teste, no que se convencionou chamar

de dye swap. Essa estratégia auxilia a normalização dos dados e corrige eventuais diferenças

de incorporação. Dessa forma utilizou-se no mínimo 6 lâminas de microarranjos para cada

metal. Levando-se em conta os problemas decorrentes de padronização da marcação

fluorescente e hibridização, foram utilizadas em torno de 17 lâminas para cada metal.


54

3.6 PCR em Tempo Real

Os resultados de microarranjos foram validados pela técnica de PCR em tempo real

em colaboração com o Dr. Jonas Collén do laboratório “Marine Plants and Biomolecules”

chefiado pela Dra. Catherine Boyen, na Station Biologique de Roscoff (CNRS-UPMC),

França.

3.6.1 Construção dos Primers

Foram construídos, para a PCR quantitativa, 12 primers (Tabela 4) iniciadores

planejados a partir do programa Beacon Designer (PREMIER Biosof). As sequências para

construção destes primers foram retiradas do banco de ESTs de G. tenuistipitata. Como

prioritário, na fabricação dos primers, considerou-se que os produtos gerados das PCRs

deveriam ter entre 80 e 150 pb e temperatura de anelamento entre 60 e 63ºC.

Entre os genes escolhidos, 2 foram constitutivos, aumentando a qualidade e as

estatísticas dos dados, e 10 não constitutivos que tiveram sua expressão alterada nos

resultados de microarranjos. Os primers utilizados foram:

Tabela 4: Genes utilizados como moldes na construção de primers para os experimentos de PCR em

Tempo Real.

Genes não Constitutivos

Thioredoxin Hypothetical Superoxido Dismutase Glutamate cysteine ligase Heat Shock Protein 90 Photosystem II Oxygen High Affinity Nitrate Transporte Vanadium Dependent Bromoperoxidase Zeaxanthin Glucose transferase Leucine Zipper-EF-Hand Containing Transmenbrane Protein

Genes Constitutivos Actin Elongation Factor 1 Alpha


55

3.6.2 Amostras de RNA

Amostras de RNA extraído das triplicatas biológicas foram tratadas com DNase

(QIAGEN), para excluir qualquer contaminação e reações cruzadas com DNA. Ao final da

extração de RNA as amostras foram submetidas ao tratamento de descontaminação com

DNase I utilizando 0,5 unidade Kunitz para uma quantidade de RNA entre 0,5 a 2 µg e 2 µL

de tampão 10x (Tris-Cl 500mM, pH 8.0; MgCl2 50 mM; DTT 10 mM). As amostras foram

deixadas a temperatura ambiente por 30 minutos para degradação do DNA e após foram

incubadas por 5 minutos a 65 ºC para inativar a DNase.

Após ensaios com DNase foram feitos PCRs convencionais (PCR master mix,

Promega) com as amostras de RNA no intuito de observar a ausência de DNA genômico

residual e garantir boa qualidade das amostras. Utilizou-se concentrações entre 25 a 50 ng de

RNA, 7,5 µL de tampão master mix 2x, 10 µM de cada primer e H2O livre de RNase

ajustando o volume final para 15 µL de reação. O programa utilizado foi: 4 minutos a 94ºC,

35 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 60ºC, 30 segundos a 72ºC e após os ciclos

72ºC a 2 minutos.

Além disso, foram feitos dois outros testes controles para garantir a boa qualidade dos

resultados de PCR em tempo real. O primeiro, outro PCR, como descrito acima, utilizando

DNA genômico com todos os 12 primers. Foi possível descobrir se os primers poderiam ter

homologia com outras sequências do genoma e se haveriam possíveis intros para cada gene.

O segundo teste controle foi realizado com cDNA a partir de RNA, utilizando a reação de RT-

PCR (Transcriptase Reversa seguida de PCR), para observar se haveria apenas um produto

amplificado. O protocolo utilizado foi o ImPromII Reverse Transcription System (Promega).

Cerca de 25 ng de RNA foi utilizado para cada primer na reação, 7,5 µL de tampão Acess

Quick 2x, 10 mM de cada primer, 0,5 µL de AMV-Rtase e H2O livre de RNase para um


56

volume final de 15 µL de reação. O ciclo do RT-PCR foi o mesmo descrito acima com a

diferença de uma etapa inicial a uma temperatura de 42 ºC por 30 minutos.

Para a formação do cDNA, na utilização do PCR em tempo real, utilizou-se a etapa

inicial do ciclo, ou seja, somente o RT (Transcripitase Reversa).

3.6.3 Técnica da RT-PCR em Tempo Real

Foi utilizado nas reações de RT-PCR em tempo real (RT-qPCR) o equipamento

Chromo 4 Real Time PCR System (BioRad, Opticon). Nas amplificações o Kit utilizado foi o

SYBRgreen reaction mix (with ROX, ABgene). O cDNA foi formado a partir de amostras de

três experimentos independentes (triplicatas biológicas). Para confirmar a formação de

produtos específicos, a PCR quantitativa foi imediatamente seguida de análise da curva de

fusão dos produtos (melting curve), de acordo com as recomendações do fabricante do

equipamento (BioRad, Opticon). Foram utilizados o gene de actina e Fator de Elongação 1

ALFA como controles endógenos, para normalizar a quantidade de RNA total em cada

amostra, devido a sua expressão constitutiva (ou seja, invariável independente da situação e

período de coleta). Cada amostra para os 12 primers foi tecnicamente triplicada. A razão de

expressão de cada gene em cada amostra foi calculada usando o método de referência da

quantificação da concentração do DNA genômico de G. tenuitipitata. Este método baseou-se

na formação de uma série de curvas de diluições em triplicata com concentrações variando de

6 ng/µL a 0,0277 ng/µL, adaptado de Collén et al., 2006; Le Bail, et al., 2008.

3.6.4 Extração de DNA Genômico de G. tenuistipitata

DNA genômico de G. tenuistipitata foi extraído e purificado para as construções das

curvas de diluições utilizadas na técnica de RT-qPCR e nos testes de qualidade de RNA total

extraído.


57

Foi macerado 100 mg da alga em N2 líquido e o extrato transferido para um tubo

eppendorf. Então foi adicionado 800 mL de tampão de lise (Tris base 0,1 M, pH 8,0 + EDTA

0,05 M + NaCl 0,2 M + Kac 2,5 M), 100 mL de Tween 20 (10%), 8 mL de proteinase K (20

mg/mL) e 1 mL de RNAse (10 mg/mL). O tubo foi incubado por 1h a temperatura ambiente e

depois adicionado 350 mL de fenol e 350 mL de clorofórmio-isoamílico (24:1). Misturou-se

por inversão durante 3 minutos e centrifugou-se a 14000 rpm e -5 oC por 2 minutos. A fase

superior (aquosa) foi passada para outro tubo eppendorf e foi adicionado 1 volume de

clorofórmio-isoamílico (24:1). Misturou-se por inversão durante 3 minutos e centrifugou-se a

14000 rpm e 5 oC por 3 minutos. Retirou-se a fase superior (aquosa) e transferiu-se para um

novo tudo eppendorf onde adicionou-se 0,6 volumes de propanol, misturou-se por inversão. O

tubo foi centrifugado a 14000 rpm e 5oC por 15 minutos, o sobrenadante descartado. Lavou-se

com 500 mL de etanol 70% e centrifugou-se a 14000 rpm por 5minutos O sobrenadante foi

descartado e o tubo colocado no Speed Vac por 10 minutos. Adicionou-se 200 mL H2O milliQ

para ressuspender. As amostras foram submetidas em géis de agarose 1,2%.

Outros procedimentos e técnicas comumente utilizados na extração, manipulação e

modificação de ácidos nucléicos foram realizados segundo descrito em (Sambrook &

Maniatis et al., 1989) ou com protocolos específicos fornecidos com produtos, equipamentos

e kits utilizados.

3.7 Re-sequenciamento dos cDNAs

Foi realizado o re-sequenciamento aleatório de 96 amostras já amplificadas e

purificadas das 22 placas da biblioteca de cDNA, utilizada na construção do microarranjos de

G. tenuistipitata. Alíquotas na concentração de 200-500 ng/mL, determinadas por absorbância

em λ=260 nm, foram submetidas a reações de sequenciamento pelo método de terminadores

de cadeia (Sanger et.al., 1977), usando o Kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing (Applied


58

Biosystems) e as sequências foram determinadas no sequenciador ABI 3100 (Applied

Biosystems). As reações de sequenciamento foram realizadas em um ciclo de desnaturação a

94°C por 4 minutos, seguido de 35 ciclos de 94°C por 1 minutos, 60°C por 2 minutos e 72°C

por 7 minutos. Como a clonagem do cDNA no vetor pBK-CMV é unidirecional, o

sequenciamento dos cDNAs foi realizado a partir da extremidade 5’, utilizando-se o

oligonucleotídeo T3. Depois de obtidos os cronogramas das sequências, estes foram

analisados pelo programa Chromas e salvos em formato FASTA, para fazer um BlastN das 96

amostras sequenciadas com o site de informações de G. tenuistipitata que esta sendo

construído pelo grupo: http://gracilaria.ib.usp.br/mirror/gracilaria/ e com o site do NCBI,

USA (National Center for Biotechnology Information).

59

4. Resultados

4.1 Absorção de Cu e Cd

Comprovou-se quantitativamente a capacidade de absorção dos metais pesados Cu e

Cd pela G. tenuistipitata quando exposta ao meio de cultura contaminado por tais elementos.

Para tanto, foi utilizado uma técnica experimental conhecida por ICP-AES (Espectrometria de

Emissão Atômica com Plasma Acoplado Indutivamente).

Aqui, a análise principal é descobrir se realmente a alga absorve e o quanto ela

absorve dos metais, fato importante para o estudo do estresse ambiental.

4.1.1 Análises dos Resultados de ICP-AES

A partir das análises dos resultados de ICP-AES, foram encontradas as médias dos

valores com desvios-padrão (valores obtidos da triplicata) para as concentrações dos metais

absorvidos pela alga tratada com cobre, da alga tratada com cádmio e da alga controle, dos

ensaios biológicos descrito na Seção 3.2.1. Os valores estão representados na Tabela 5. Para a

alga exposta ao cobre, concentrações de cádmio também foram medidas servindo como mais

um controle para o experimento. O mesmo foi feito para a alga exposta ao cádmio,

concentrações de cobre foram medidas e para a alga controle mediu-se as concentrações dos

dois metais.

Resultados

60

Tabela 5: Análises das concentrações dos metais Cu e Cd em amostras de algas tratadas e controle.

Metais analisados ICP-AES

Tratamento com Cu [ppm]

Tratamento com Cd [ppm]

Controle sem tratamento [ppm]

Cádmio < 0,01 0,72 ± 0,09 < 0,01 Cobre 1,43 ± 0,03 0,22 ± 0,01 0,130 ± 0,006

Os dados presentes na Tabela 5, calculados com base nas curvas de calibração da

Figura 9, foram extraídos da análise gráfica dos picos de emissão atômica gerados pelo ICP-

AES, conforme exposto a seguir.

A Figura 11 representa o espectro de emissão atômica (unidade de contagem [cps]

versus comprimento de onda λ [nm]) para o cobre. A seta vermelha e verde representam,

respectivamente, o padrão de 1 ppm e a alga exposta ao cobre. Observa-se concentrações

basais de cobre na alga exposta ao cádmio (seta azul) e na alga controle (seta lilás). Esse

espectro representa o resultado da análise de 1 g de alga da triplicata diluída em 25 ml de

solução.

No espectro de emissão atômica para cádmio (Figura 12), não foram encontradas

outras linhas representativas se não a do padrão de 1 ppm e da alga exposta ao cádmio, setas

vermelha e preta respectivamente. O espectro da Figura 12 também representa o resultado da

análise de 1 g de alga da triplicata diluída em 25 ml de solução. As medidas das

concentrações do meio de cultivo, que serviram de controle como mencionado anteriormente,

estão representadas na Tabela 6.

Para melhor visualização e interpretação dos resultados um resumo da análise dos

espectros das Figuras 11 e 12, e dos valores contidos nas Tabelas 5 e 6 está apresentado na

Tabela 7. Pode-se observar, com um cálculo estimado simples, que a quantidade inicial de

metal inserido na solução do meio de cultivo dividiu-se, uma parte sendo absorvida pela alga

e o restante permanecendo diluído no meio.

Resultados

61

Figura 11: Espectro da emissão atômica para o cálculo da concentração de cobre. Seta vermelha

representa concentração padrão de 1 ppm. Seta verde representa concentração de cobre da alga exposta

ao cobre. Seta azul representa concentração basal de cobre da alga exposta ao cádmio. Seta lilás

representa concentração de cobre da alga sem exposição.

Figura 12: Espectro da emissão atômica para o cálculo da concentração de cádmio. Seta vermelha

representa concentração padrão de 1 ppm. Seta preta representa concentração de cádmio da alga

exposta ao cádmio.

Resultados

62

Tabela 6: Medidas de concentração de cobre e cádmio dos meios de cultivo controle.

Cu

(média dos valores ppm) Cd

(média dos valores ppm)

Meio de cultivo inicial + Cu+2 sem alga 0,94 < 0,01

Meio de cultivo + Cu+2 após tratamento (após exposição da alga ao metal)

0,77 < 0,01

Meio de cultivo inicial + Cd+2 sem alga < 0,01 0,986

Meio de cultivo + Cd+2 após tratamento (após exposição da alga ao metal)

< 0,01 0,884

Para o cobre, de acordo com os dados da Tabela 7, a massa inicial de metal era de 1,88

mg. A massa final encontrada foi de 1,54 mg, de sorte que a diferença entre essas massas

1,88–1,54=0,34 mg deve ter sido absorvido pela alga. De fato, em 1 g de alga usado na

análise ICP-AES, encontrou-se uma quantidade de 0,0358(7) mg de cobre absorvido e um

valor de 0,0033(1) mg de cobre basal. Supondo que a absorção tenha sido uniforme para toda

alga inicialmente cultivada1, como a amostra inicial apresentava aproximadamente 10 g de

alga, podemos calcular a massa de cobre absorvido como 10×(0,0358(7)-0,0033(1))=0,325(8)

mg, em boa concordância (dentro da incerteza) com o valor de 0,34 mg calculado a partir das

diferenças nos valores das concentrações final e inicial do meio. O percentual de cobre

absorvido pela alga é, então, 0,325/1,88=17,3%.

1Tal suposição pode ser validada pelo fato do desvio-padrão obtido para a massa de metal absorvido na triplicata ser pequeno (σ = 0,0007 mg). Isso indica que porções independentes de massas iguais da mesma alga absorveram aproximadamente a mesma quantidade de metal. Salientamos que a alga foi periodicamente mexida em seu meio de cultivo, durante todo o período de exposição, garantindo uma absorção uniforme do metal.

Resultados

63

A mesma análise de balanço entre massa absorvida pela alga e massa remanescente no

meio de cultivo após o tratamento, pode ser feita para o cádmio com base nos dados da Tabela

7. Com efeito, inicialmente temos 1,972 mg de cádmio no meio e, ao final da exposição, uma

massa de 1,768 mg. Assim, 1,972-1,768=0,204 mg deve ter sido a massa de cádmio absorvida

pela alga. De fato, em 1 g de alga analisada, encontramos 0,018(2) mg de metal, sem uma

quantidade basal do mesmo significativa. Novamente supondo absorção uniforme do metal

nos 10 g de alga inicialmente exposta, temos 10×0,018(2)=0,18(2) mg de cádmio absorvido.

Esse resultado também está em concordância (dentro da incerteza) com o balanço

anteriormente calculado de 0,204 mg. O percentual de cádmio absorvido é, então, de

0,18/1,972=9,1%.

O gráfico da Figura 13 mostra o balanço entre as massas dos metais analisados nos

meios de cultivo antes e após a exposição da alga, e o valor das massas dos metais absorvidos

pela alga (valores calculados da análise dos resultados ICP-AES, contidos na Tabela 7). O

percentual de absorção dos metais também é exibido.

Figura 13: Balanço entre as massas dos metais analisados.

1.881.972

1.52

1.768

0.3250.18

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

Cobre Cádmio

Massa (

mg

)

Massa de metal no meio antes da exposição

Massa de metal no meio após exposição

Massa de metal absorvida (ICP-AES)

Absorção

de 9,1%

Absorção

de 17,3%

Resultados

64

Tabela 7: Resumo de resultados de absorção dos metais. Para cada amostra de alga, é apresentado o

valor médio com desvio-padrão do pico de emissão [em Kcps] dos metais analisados (essa média foi

obtida através de gráficos como os das Figuras 11 e 12, considerando-se a triplicata de amostras). A

partir desse valor, obtém-se a concentração média dos metais em 1 g de alga diluído em 25 ml de

solução [em ppm] (esses são os valores apresentados na Tabela 5) e, finalmente, a massa bruta média

do respectivo metal encontrada nas amostras. Os dados da Tabela 6 são reapresentados, mas agora

também com os valores das massas de cada metal [em mg], considerando-se 2 L de solução do meio

de cultivo, antes (inicial) e após (final) o tratamento da alga.

Amostras Medidas Cobre Cádmio

Pico [Kcps] 330 ± 6 -

Concentração [ppm] 1,43 ± 0,03 <0,01 Alga exposta

ao Cobre Massa [mg] 0,0358 ± 0,0007 -

Pico [Kcps] 50 ± 1 36 ± 4

Concentração [ppm] 0,22 ± 0,01 0,72 ± 0,09 Alga exposta ao Cádmio

Massa [mg] 0,0060 ± 0,0002 0,018 ± 0,002

Pico [Kcps] 30 ± 1 -

Concentração [ppm] 0,130 ± 0,006 <0,01 Alga sem exposição

Massa [mg] 0,0033 ± 0,0001 -

Concentração [ppm] 0,94 <0,01 Meio inicial + cobre Massa [mg] 1,88 -

Concentração [ppm] 0,77 <0,01 Meio final + cobre Massa [mg] 1,52 -

Concentração [ppm] <0,01 0,986 Meio inicial + cádmio Massa [mg] - 1,972

Concentração [ppm] <0,01 0,884 Meio final + cádmio Massa [mg] - 1,768

4.1.2 Composição Elementar de Três Espécies de Gracilaria

Apresenta-se na Tabela 8 uma varredura da concentração para alguns elementos

químicos, que foram detectados por ICP-AES. Esta varredura foi feita para as três espécies de

Gracilaria (G. birdiae, G. domingensis e G. tenuistipitata) (Figura 2). Neste experimento

foram feitas triplicatas para as três algas, obtendo-se no final a média e desvios padrão das

triplicatas, conforme tabela abaixo.

Resultados

65

Tabela 8: Concentração de elementos químicos medidos por ICP-AES para as três espécies de alga.

Elemento Químico Gracilaria birdiae

[ppm] Gracilaria domingensis

[ppm] Gracilaria tenuistipitata

[ppm]

Al 15 ± 5 27,2 ± 2,3 4,3 ± 1,3 Ca 284 ± 11 645 ± 14,5 327 ± 6 Fe 33 ± 12 36 ± 6 30,1 ± 1,0 Mg 305 ± 30 505 ± 18 626 ± 29 P 118 ± 10 186 ± 6 376 ± 17 Si 19 ± 6 26,7 ± 1,8 16,31 ± 0,18

Mn 7 ± 3 1,7 ± 0,4 3,7 ± 0,8 B 35 ± 8 24,62 ± 0,29 27,4 ± 1,9 K 177 ± 29 38,4 ± 1,5 168,8 ± 1,5 Na 17,6 ± 2,9 9,87 ± 0,25 39,7 ± 0,7 Cu 0,20 ± 0,6 0,31 ± 0,22 0,13 ± 0,03 Cd < 0,01 < 0,01 < 0,01

Observou-se para as três algas, níveis de concentrações diferentes para os elementos

analisados. Note-se que a concentração de alumínio para G. tenuistipitata é inferior à metade

das concentrações das outras duas espécies. A concentração de cálcio por exemplo, foi duas

vezes maior para G. domingensis que para as outras espécies. G. birdiae possui quase duas

vezes mais concentração de manganês quando comparado com G. tenuistipitata e G.

domingensis. O metal Cu foi encontrado provavelmente em concentrações basais para as três

algas e Cd não foi encontrado para nenhuma das espécies.

Embora, os elementos, Ba, Ni, Zn, Sr, Cr, Co, As e Cd tenham sido analisados, os

mesmos não foram detectados.

Resultados

66

4.2 Acumúlo de H2O2 em G. tenuistipitata

Através das análises de microscopia eletrônica, observou-se vários pontos eletrodensos,

indicando presença de H2O2 em células de amostras de algas tratadas com os metais. A

atividade de H2O2 foi detectada através da reação com cloreto de cério (CeCl3), produzindo

depósitos eletrodensos de peridróxidos de cério. A reação de H2O2 com CeCl3 produz

precipitados eletrodensos insolúvel de peridroxidos de cério, Ce[OH]2OOH e Ce[OH]3OOH.

Como descrito por Czaninski e colaboradores esta técnica ultra-estrutural permite a

localização precisa de sítios de acumulação ou produção de H2O2.

Para esta técnica amostras controles foram coletadas após 1 hora, 1 dia e 6 dias,

seguindo o mesmo tempo de coletas para as amostras tratadas. Nas amostras tratadas foram

utilizadas concentrações de CE50 para cobre (0,95 ppm) e cádmio (1,00 ppm).

4.2.1 Amostras Controles

Foram observados nas amostras controles pequenos pontos de acúmulos somente na

parede celular mais externa, película, ou seja, a parte que fica em contato com o ambiente

(Figura 14, seta vermelha). Através da análise dos resultados para o controle, não foi

observada qualquer diferença significativa entre as figuras de microscopia para os tempos de

cultivos utilizados. Sendo assim, a microscopia representada na Figura 14 é o resultado que

corresponde a um dos tempos de cultivo normal.

Resultados

67

Na Figura 14, as células foram facilmente identificadas no corte transversal ultrafino

do talo. Visualizou-se os aspectos gerais das disposições das células e de algumas estruturas

celulares. Foi identificada claramente a região correspondente à parede celular (PC),

cloroplastos (CP), grânulos de amido (G) e um ponto de junção entre as células (Pit Plug).

Também foi verificada uma região central da célula, ocupada pelo vacúolo, envolvido pelo

citoplasma.

Foram encontradas diferenças morfológicas em algumas das células do córtex para

algas tratadas com os dois metais. Padrões dos pontos de acúmulos também apresentaram

características diferentes. Os resultados são apresentados a seguir.

4.2.2 Amostras Expostas ao Cádmio

A Figura 15 representa microscopia eletrônica de células da alga exposta a 1 hora a

cádmio. Nesta figura observou-se entre a interface das células uma grande dispersão de

pontos de acúmulos de H2O2 (setas azuis). Verificou-se também a existência de pequenos

Figura 14: Amostras controle,

após 1 dia. Seta indica acumulação

de H2O2. (PC) parede celular, (Pit-

plug) ponto de junção entre

células, (CP) cloroplastos, (V)

vacúolo e (G) grânulo de amido.

Escala: barra = 1µm. PC

CP

G

Pit-plug

1 µm

V

Resultados

68

pontos de acúmulos na parede celular mais externa (película) como foi observado no controle

(seta vermelha).

Outra característica peculiar visualizada nesta figura foi a de uma aparência retrátil na

morfologia de algumas células do córtex em comparação com células do controle. Também

foi observado disposições irregulares dos cloroplastos quando comparado com o controle.

Esta peculiaridade poderia ter sido causada devido a uma rápida resposta a reação da célula ao

estresse causado pelo metal.

Na Figura 16, após tratamento de 1 dia, observou-se algumas das células com padrão

de acumulação diferente (setas azuis). Os pontos de acúmulos foram também encontrados na

interface celular, mas estes mais concentrados e não tão dispersos como na Figura 15. Outra

característica encontrada em algumas células corticais esta representada na Figura 17. Foram

visualizados pontos de acúmulos ao redor de estruturas amorfas não identificadas. Estas

estruturas poderiam originar-se da degradação de cloroplastos, uma vez que células corticais

possuem grandes quantidades destes.

Figura 15: Amostras de 1 hora

de exposição ao cádmio. Setas

indicam acumulação de H2O2.

(PC) parede celular, (CP)

cloroplastos e (G) grânulo de

amido. Escala: barra = 1µm.

1 µm

PC

CP

G

Resultados

69

Os resultados referentes aos 6 dias de exposição ao cádmio, foram os mesmo

encontrados na Figura 14 e 17. Visualizou-se após 6 dias de exposição, células normais e

também células com estruturas amorfas não identificadas, como descrito acima. Neste tempo

de exposição não foram observados pontos de acúmulos como os das Figuras 15 e 16.

4.2.3 Amostras Expostas ao Cobre

A Figura 18 representa microscopia eletrônica de células após 1 hora de exposição ao

cobre. Observa-se pontos de acúmulos na interface das células (setas azuis) e pequenos pontos

de acúmulos na parede celular mais externa como foi observado no controle (seta vermelha).

Além disso, como mencionado anteriormente (Figura 15), encontrou-se a mesma aparência

retrátil na morfologia de algumas células do córtex.

Figura 16: Amostras de 1 dia de

exposição a cádmio. Setas indicam

acúmulos de H2O2. (PC) parede

celular, (CP) cloroplastos e (G)

grânulo de amido.

Escala: barra = 0,5 µm.

Figura 17: Amostras de 1 dia de

exposição a cádmio. Setas azuis

acúmulos de H2O2.

Escala: barra = 0,2 µm.

0,2 µm

CP

G

0,5 µm

PC

Resultados

70

A Figura 19 corresponde a 1 dia de exposição da alga ao cobre. Notou-se algumas

características similares as das outras figuras já apresentadas. Entretanto, observa-se uma

diferença no padrão de acumulação de H2O2 localizados na periferia de cloroplastos (setas

verdes). Também na Figura 20 foram visualizados pontos de acúmulos ao redor de estruturas

amorfas não identificadas, provável degradação de cloroplastos, como as estruturas

encontradas para cádmio representada na Figura 17.

Os resultados analisados nas microscopias após 6 dias de exposição ao cobre foram

similares ao padrão para cádmio, ou seja, células normais e células com estruturas amorfas

não identificadas.

Figura 18: Amostras expostas 1

hora ao cobre. Setas azuis indicam

acumulação de H2O2. (PC) parede

celular e CP cloroplastos.

Escala: barra = 1µm.

1 µm

CP

PC

Resultados

71

4.3 Padronização da Extração de RNA Total

Inicialmente optou-se pela extração do RNA total utilizando TRIZOL por ser uma

metodologia simples e rápida que permite processar simultaneamente um grande número de

amostras. O TRIZOL é um reagente para isolamento do RNA total das células e tecidos,

consistindo numa solução monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina e é uma

otimização do método de uma etapa de isolamento do RNA desenvolvido por Chomczynski &

Sacchi (1987). Durante a homogeneização ou a lise das amostras, o TRIZOL mantém a

integridade do RNA ao romper as células. A adição do clorofórmio seguida pela

centrifugação, separou a solução em uma fase aquosa e em uma fase orgânica. O RNA

permaneceu exclusivamente na fase aquosa, devido o caráter polar que lhe é conferido

principalmente pelos grupamentos fosfato. O RNA foi recuperado pela precipitação com

álcool isopropílico. De acordo com Chomczynski e Sacchi (1987), o RNA total isolado está

livre de proteínas e da contaminação por DNA, o que não foi observado nas amostras de G.

tenuistipitata mesmo quando manteve-se o máximo de cuidado. Deste modo, foi observada

constante contaminação com uma porcentagem pequena de DNA e proteínas mas uma

porcentagem razoável de polissacarídeos. É provável que durante a homogeneização, quando

Figura 19: Amostras expostas a 1 hora ao

cobre. Setas indicam acumulação de H2O2.

(CP) cloroplastos e (G) grânulos de amido.


Figura 20: Amostras expostas a 1 hora ao

cobre. Setas indicam acumulação de H2O2.


0,2 µm 1 µm CP

G

Resultados

72

é adicionado o TRIZOL para a dissociação completa de complexos nucleoprotéicos e após a

centrifugação, que o precipitado constituído principalmente de membranas extracelulares,

polissacarídeos e DNA com alto peso molecular, não se separa completamente da solução que

possui, proteínas, DNA e RNA total de baixo peso molecular. Quando adiciona-se

clorofórmio, a fase aquosa onde se encontra o RNA total permaneceu contaminada devido à

grande quantidade de polissacarídeos. Percebeu-se, após adição de álcool isopropílico na fase

aquosa, a formação de um pequeno “pellet gelatinoso” no fundo do tubo junto ao precipitado

de RNA. Foi assim, necessário lavar o pellet formado pelo RNA e o precipitado gelatinoso

com EtOH 75%. Após a centrifugação o pellet foi suspenso em água tratada com DEPC, um

inibidor de RNase. Nesta última fase, o pellet não se dissolveu rapidamente, provavelmente

devido contaminação com polissacarídeos. Após análise em gel de agarose e quantificação no

NanoDrop (ND-1000), percebeu-se que este método não foi eficiente.

Foram então utilizados protocolos diferentes aplicados a plantas suculentas, ricas em

polissacarídeos, na intenção de eliminá-los (Gehrig et al., 2000). As variações estavam em

adicionar ou não na primeira etapa da extração, hidrocloreto de guanidina – GHCL (GHCL 8

M, TrisHCl 50 mM, EDTA 20 mM e β-mercaptoetanol 50 mM) e após testar 7 compostos

diferentes para extrair polissacarídeos. Os compostos para precipitar polissacarídeos foram:

EtOH na concentração de 30%; EtOH 20% + KOAc 0,5 M; KOAc 0,2 M; polietileno glicol

(PEG) peso molecular 6000 2%; PEG 20000 2%; PEG 35000 2% e polivinilpirrolidone

360000 2%. Após as análises de todos os parâmetros em conjunto (contaminação por

proteínas, por polissacarídeos e maior concentração de RNA total), o tratamento com KOAc

0,2 M foi o mais eficiente para extração dos polissacarídeos pois apresentou menores desvios

entre as réplicas (Falcão, et al., 2008).

Resultados

73

Quando foram utilizadas amostras de RNA total extraídas por este ultimo método na

marcação e hibridização dos microarranjos, o sinal de fluorescência dos pontos apresentou-se

baixo, provavelmente porque a qualidade do RNA estava comprometida.

No objetivo de melhorar a síntese de cDNA, para posterior marcação e hibridização

dos microarranjos, foi necessário utilizar diferentes testes para extração de RNA total de G.

tenuistipitata. No total foram testados mais três protocolos de RNA total: RNeasy Plant Mini

Kit (QIAGEN), gradiente de densidade de Cloreto de Cério e Concert Plant RNA Reagent

(Invitrogen).

As amostras dos três métodos foram comparadas no Bioanalyzer segundo fabricante

Agilent. As analises dos resultados para as amostras de RNA extraídas com Concert Plant da

Invitrogen apresentaram-se integras sem degradação e com ótimo rendimento em torno de 4

µg/µL em grande escala (Figura 21).

Devido ao restante de polissacarídeos contaminantes, as amostras de RNA total foram

purificadas utilizando mini-colunas da QUIAGEN (RNeasy Mini Spin Column).

Figura 21: Qualidade do RNA total das amostras Cu (2), Cd (4) e controle (6), analisadas no

Bioanalyzer. O poço L, corresponde ao marcador de tamanho em Kb (6, 4, 2, 1, 0,5, 0,2, e 0,025).

4.4 Resequenciamento das Amostras da Biblioteca

Amostras aleatórias das 22 placas da biblioteca de cDNA utilizadas para construção

dos microarranjos de G. tenuistipitata, foram separadas para resequenciamento e reanotação,

no intuito de comprovarmos que não houve erros de direcionamento durante as amplificações

e purificações das placas da biblioteca. No total 96 amostras foram resequenciadas e

28S 18S

Resultados

74

manualmente reanotadas por busca de similaridade de sequência no banco público de

proteínas NCBI, USA. Foi utilizado para análises o algoritmo BLASTX (Altschul et al.,

1997). As sequências também foram comparadas com o próprio site de banco de dados que

está sendo construído para G. tenuistipitata: http://gracilaria.ib.usp.br/mirror/gracilaria/.

Todas as amostras resequenciadas concordavam com 100% de identidade com as anotações

do site da biblioteca e com o mapeamento das placas da biblioteca.

4.5 Análise dos Microarranjos

4.5.1 Dados de Amplificação e Purificação

Todas as placas da biblioteca foram amplificadas, purificadas e submetidas à geis de

agarose 1,5%. A partir do gel de purificação foi calculada aproximadamente, a concentração

da amostra de cada poço da placa, através de sua intensidade no gel, utilizando o marcador 1

Kb Plus Ladder (Invitrogen), o tamanho de cada fragmento (banda) e se havia mais do que um

amplicon em um mesmo poço (contaminação por mais de um clone). Os resultados foram

transferidos para um banco de dados de informações, sobre a qualidade, concentração, nome

da placa, nome do gene, função do gene e números de fragmentos por poço. Esses dados

foram cruciais para as análises dos genes diferencialmente expressos, ou seja, não foi

afirmado que um gene era diferencialmente expresso, antes de eliminar os clones de ESTs que

apresentavam mais de um amplicon nas amplificações. Essa técnica foi realizada, pois

poderiam ocorrer possíveis reações cruzadas durante as hibridações com os microarranjos,

podendo gerar falsos positivos.

4.5.2 Categorias Funcionais dos Genes do Microarranjo

Ao analisar o estresse ambiental de cobre e cádmio sobre a expressão gênica e o

desenvolvimento de G. tenuistipitata, estudou-se condições nas quais concentrações de EC50

Resultados

75

desses metais foram dissolvidos em meio de cultivo durante 6 dias. Os efeitos dessas

condições sobre a expressão gênica foram examinados através de hibridizações de cDNAs

em microarranjos com aproximadamente 2000 sondas representado cDNAs sequenciados a

partir de uma biblioteca de G. tenuistipitata.

Os resultados mostraram que 700 sondas são classificadas, correspondendo a

sequências de fragmentos de genes homólogos à proteínas de função determinadas em outros

organismos. Outras 560 são proteínas hipotéticas e 144 hipotéticas conservadas que

correspondem a sequências de fragmentos de genes homólogos à proteínas de função

desconhecidas. Um resumo destes dados é representado na Tabela 9 e Figura 22.

Tabela 9: Classificação das proteínas da biblioteca de G. tenuistipitata.

Classificadas 700 Hipotéticas 560

Hipotéticas Conservadas 144 Sem classificação ou classificação incerta

44

A Figura 22 mostra também a divisão em categorias funcionais celulares para aqueles

genes que foram classificados na biblioteca, ou seja, fragmentos de sequências homólogas à

proteínas de função determinadas em outros organismos.

Resultados

76

Figura 22: Distribuição em categorias funcionais dos genes selecionados, segundo dados das Tabelas

9 e 10. No gráfico de cima, tem-se a distribuição geral de todos os genes entre classificados,

hipotéticos, hipotéticos conservados, sem classificação ou com classificação incerta e outros. No

gráfico de baixo, especificamos os grupos dos genes classificados.

Tabela 10: Número de genes classificados representados no microarranjo, divididos em categorias

funcionais específicas.

Metabolismo 182 Energia 70

Divisão celular 41 Transcrição 53

Sintese de proteínas 68 Proteolise 65

Transporte 87 Defesa 52

Homeostase iônica 3 Organização celular 19

Outros 60

Categorias Funcionais dos Genes Classificados

26.0%

10.0%

5.9%

7.6%9.7%

9.3%

12.4%

7.4%

0.4%

8.6%2.7% Metabolismo

Energia

Divisão celular

Transcrição

Sintese de proteínas

Proteolise

Transporte

Defesa

Homeostase iônica

Organização celular

Outros

Categorias Funcionais Geral dos Genes Selecionados

38.7%

9.9%3.0%

48.3%

ClassificadasHipotéticasHipotéticas ConservadasSem classificação ou incerta

Resultados

77

RNA total das amostras de alga controle e expostas aos metais foram extraídas com o

reagente Concert Plant (Invitrogen), analisado no aparelho Bioanalyzer (Agilent), e utilizado

na síntese e marcação de cDNAs com fluoróforos Alexa Flúor 555 e 647 por meio do kit

SuperScript Plus cDNA Indirect Labeling System (Invitrogen).

Após as etapas de hibridizações e leitura das fluorescências das lâminas hibridizadas

(Seção 3.5.2), foram realizadas as análises dos dados de intensidade de fluorescência,

descontada o background e possíveis artefatos, para cada uma das sondas, por meio do

programa ArrayVision 6.0 (Imaging Research, Inc). A normalização das intensidades de

fluorescência foram feitas pelo método de LOWESS. Os resultados das sondas representado

genes diferencialmente expressos foi realizada por meio do método HTSelf (Vencio & Koide,

2005). Para as análises dos microarranjos, foi construído um programa baseado nos métodos

citados acima. A descrição detalhada da construção do programa e do processo de análise de

dados de microarranjos é apresentada no Anexo A.

4.5.3 Genes Diferencialmente Expressos

Foram considerados genes diferencialmente expressos aqueles em que 66% ou mais

das réplicas das sondas tinham valores de razão de expressão M fora dos limites de corte

definidos no espaço M×A, por 95% dos valores de M provenientes das hibridizações

homotípicas das condições de referência (lembrando, M = log2(IT/IC), sendo IT (tratado) a

densidade de fluorescência normalizada para a condição de estudo e IC para a condição de

referência, e A = 1/2 log2 (IT IC)).

Uma vez que não há quase nenhuma literatura, com exceção de Collén e colaboradores

(2003), a respeito do efeito de cádmio e cobre sobre G. tenuistipitata, apresenta-se aqui a

análise de alguns dos genes que tiveram sua expressão diferenciada devido aos efeitos desses

metais no meio de cultivo.

Resultados

78

Seguindo o procedimento da Seção3.5.2, o cDNA correspondente às amostras de alga

controle, foram utilizados como condição de referencia para comparação com as amostras

tratadas com os metais. Este método foi realizado para duas réplicas biológicas, no qual foram

feitas duas hibridizações (réplicas técnicas), invertendo os fluoróforos entre a amostra

referência e teste (dye swap).

Após os procedimentos de hibridização das lâminas de microarranjos, extração dos

dados de intensidade de fluorescência, normalização por LOWESS e identificação dos genes

diferencialmente expressos pelo método HTSelf, foram obtidos os resultados resumidos na

Tabela 11.

Tabela 11: Resumo geral dos experimentos de microarrajos. Apresenta-se o número total de genes

únicos estudados e o número de genes reprimidos, induzidos e invariantes, após tratamento para

cádmio e cobre.

Spots na lâmina

Genes únicos

Reprimidos Induzidos Invariantes

Cádmio 8448 1448 54 69 1325 Cobre 8448 1448 108 76 1264

A tabela representa o total do número de genes nos microarranjos que foram

considerados para a análise estatística (8448); o número de genes diferentes únicos (1448); os

genes alterados (reprimidos e induzidos) e genes cujas razões de expressão ficaram

compreendidas entre os limites de corte do teste HTSelf (invariantes, 1325 e 1264).

Baseada na anotação dos clones de G. tenuistipitata, foi realizado uma classificação

por função celular de todos os genes cuja expressão gênica foi induzida ou reprimida, em

resposta ao estresse gerado pelos metais cobre e cádmio. Estes dados estão apresentados em

formas de tabelas no Anexo B.

Também no gráfico da Figura 23 é apresentado o número de genes induzidos e

reprimidos versus a categoria funcional celular para os dois metais (cádmio e cobre). A partir

destes resultados, notou-se que os genes classificados para as diversas categorias funcionais,

Resultados

79

tanto para cádmio quanto para cobre, sofreram poucas alterações, ou seja a maioria dos genes

não tiveram sua expressão alterada. Para as proteínas classificadas como hipotéticas, houve

uma diferença maior no número de genes diferencialmente expressos para cobre (76

hipotéticas) e cádmio (51 hipotéticas), em relação as outras categorias. Totalizou-se 12,7 % de

genes com expressão gênica alterada (induzidos e reprimidos) para o tratamento com cobre e

8,4 % para cádmio.

Resultados

80

Fig

ura

23

: N

úmer

o de

gen

es in

duzi

dos

e re

prim

idos

por

cat

egor

ia f

unci

onal

(cá

dmio

e c

obre

).

19

21

1

5

2

5

01

0

24

7

11

42

00

32

23

00

27

42

5

9

5

2

5

21

21

00

33

10

42

88

2

7

43

87

01

43

9

35

05

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Metabolismo

Energia

Divisão celular

Transcrição

Sintese de

proteínas

Proteólise

Transporte

Defesa

Homeostase

iônica

Organização

celular

Hipotéticas

Hipotéticas

Conservadas

S/ classificação

ou incerta

Outros

Número de Genes

Induzid

o C

dR

eprim

ido C

dIn

duzid

o C

uR

eprim

ido C

u

Resultados

81

4.5.4 Distribuição dos Genes Induzidos e Reprimidos

4.5.4.1 Cádmio

A análise dos genes das amostras de alga que sofreram estresse pelo metal cádmio

permite uma representação como a da Figura 24. Esta figura mostra a distribuição dos genes

classificados como diferencialmente expressos nas categorias funcionais celulares. Para uma

visualização mais detalhada, também são apresentadas as tabelas com os nomes dos genes

induzidos e reprimidos de acordo com cada função celular considerada (Tabela 12, Anexo B).

Figura 24: Genes induzidos e reprimidos para cádmio divididos em categorias funcionais.

Notou-se que a maior parte dos genes induzidos para cádmio participa de três grandes

grupos: categoria de proteínas funcional do metabolismo, grupo de hipotéticas e hipotéticas

conservadas. O grupo das hipotéticas (34,8 % induzidas e 50,0 % reprimidos) e hipotéticas

conservadas (10,1 % induzidas e 7,4 % reprimidas) apresentaram um grande número de genes

Distribuição dos Genes Induzidos Cd

27.5%

2.9%

1.4%

1.4%

7.2%

2.9%7.2%

34.8%

10.1%1.4%

0.0%1.4%

0.0%

1.4%

Distribuição dos Genes Reprimidos Cd

50.0%

7.4%

3.7%

3.7%

9.3%

0.0%

0.0%

7.4%

5.6%

3.7%

3.7%

5.6%

0.0%

0.0%

Metabolismo Energia Divisão celular

Transcrição Sintese de proteínas Proteólise

Transporte Defesa Homeostase iônica

Organização celular Hipotéticas Hipotéticas Conservadas

S/ classificação ou incerta Outros

Resultados

82

alterados. Este fato pode indicar a existência de algum(ns) mecanismo(s) desconhecido(s)

envolvido(s) na resposta contra cádmio.

Para cádmio, a maior parte dos genes que participam da categoria funcional do

metabolismo foram mais induzidos (27,5 %) do que reprimidos (7,4 %). Dentre esses genes,

destacam-se alguns importantes para a manutenção e homeostase celular (Tabela 12, Anexo

B).

Outros genes que foram induzidos considerados importantes para o desenvolvimento e

crescimento da alga estão em outras categorias. Dentre eles, citamos dois genes na categoria

de energia celular (surfeit protein 1 e NADH dehydrogenase), outro gene de divisão celular

(CCG1 protein), cinco genes de sínteses protéicas, cinco de transporte e um de homeostase

iônica (para essas três últimas categorias, veja listagem completa na Tabela 12, Anexo B).

De uma forma geral, foi observada uma diferença de 15 genes induzidos (69) a mais

em relação aos reprimidos (54).

Apresenta-se na Figura 25 o percentual de genes induzidos e reprimidos dentro de

cada categoria funcional. Tal percentual representa um tipo de normalização, expressando a

quantia de genes diferencialmente expressos com relação ao total de genes analisados em cada

categoria funcional específica. Com isso, pode-se ter uma idéia de qual grupo apresentou

maior ou menor percentual de genes alterados. Observa-se que o grupo correspondente à

homeostase iônica foi excluído da análise, pois só apresenta 0,4 % do total de genes

considerados (todas as categorias).

Resultados

83

Figura 25: Percentual de genes reprimidos e induzidos por cádmio dentro de cada categoria funcional.

4.5.4.2 Cobre

Para a obtenção de um panorama geral da resposta transcricional de G. tenuistipitata à

presença de cobre, deve-se analisar a distribuição de genes diferencialmente expressos em

cada categoria funcional celular. Tal distribuição é representada na Figura 26, após as análises

dos dados obtidos dos microarranjos. A lista completa de genes induzidos e reprimidos por

cobre é apresentada na Tabela 13, Anexo B.

Notou-se que, semelhante ao que ocorre com cádmio, a maior parte dos genes

induzidos para cobre participa de três grandes grupos: categoria de proteínas funcional do

metabolismo, grupo de hipotéticas e hipotéticas conservadas. O grupo das hipotéticas (43,4 %

induzidas e 39,8 % reprimidos) e hipotéticas conservadas (13,2 % induzidas e 8,3 %

reprimidas) apresentaram um grande número de genes alterados. Este fato, assim como no

caso do cádmio, pode indicar a existência de algum(ns) mecanismo(s) desconhecido(s)

envolvido(s) na resposta contra cobre.

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

Meta

bolis

mo

Energ

ia

Div

isão

celu

lar

Tra

nscrição

Sin

tese d

e

pro

teín

as

Pro

teólis

e

Tra

nsport

e

Defe

sa

Org

aniz

ação

celu

lar

Outr

os

Hip

oté

cic

as

Hip

oté

ticas

Conserv

adas

Sem

Cla

ssifi

cação

Gen

es (

%)

Reprimidos Induzidos

Resultados

84

Para cobre, a maior parte dos genes que participam da categoria funcional do

metabolismo foram mais induzidos (11,8 %) do que reprimidos (7,4 %). Dentre esses genes,

destacam-se alguns importantes para a manutenção e homeostase celular (Tabela 13, Anexo

B).

Outros genes considerados importantes para o desenvolvimento e crescimento da alga

que foram induzidos estão em outras categorias. Dentre elas citamos energia celular, divisão

celular, síntese protéicas e transporte.

De uma forma geral, foi observada uma diferença de 32 genes reprimidos (108) a mais

em relação aos induzidos (76). Aqui, nota-se uma divergência em comparação ao cádmio, já

que lá se encontrou mais genes induzidos do que reprimidos.

A Figura 27 apresenta o percentual de genes induzidos e reprimidos dentro de cada

categoria funcional. Como no caso do cádmio, tal percentual representa um tipo de

normalização, expressando a quantia de genes diferencialmente expressos com relação ao

total de genes analisados em cada categoria funcional específica. Com isso, pode-se ter uma

idéia de qual grupo apresentou maior ou menor percentual de genes alterados. Novamente, o

grupo correspondente à homeostase iônica foi excluído da análise, pois só apresenta 0,4 % do

total de genes considerados (todas as categorias).

Resultados

85

Figura 26: Genes induzidos e reprimidos para cobre divididos em categorias funcionais.

Figura 27: Percentual de genes reprimidos e induzidos por cobre dentro de cada categoria funcional.

Distribuição dos Genes Induzidos Cu

11.8%

6.6%

2.6%

6.6%

2.6%

1.3%

43.4%

2.6%

2.6%

5.3%

13.2%

1.3%0.0%0.0%

Distribuição dos Genes Reprimidos Cu

7.4%

7.4%

1.9%

6.5%

3.7%

2.8%

7.4%

39.8%

0.9%0.0%

6.5%

8.3%

2.8%4.6%

Metabolismo Energia Divisão celular

Transcrição Sintese de proteínas Proteólise

Transporte Defesa Homeostase iônica

Organização celular Hipotéticas Hipotéticas Conservadas

S/ classificação ou incerta Outros

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

Meta

bolis

mo

Energ

ia

Div

isão

celu

lar

Tra

nscrição

Sin

tese d

e

pro

teín

as

Pro

teólis

e

Tra

nsport

e

Defe

sa

Org

aniz

ação

celu

lar

Outr

os

Hip

oté

cic

as

Hip

oté

ticas

Conserv

adas

Sem

Cla

ssifi

cação

Gen

es (

%)

Reprimidos Induzidos

Resultados

86

4.6 Validação dos Dados dos Microarranjos

Para a validação dos dados de microarranjos foi utilizada a técnica de PCR

quantitativa (RT-qPCR). Foram selecionados 12 genes para a fabricação de primers

específicos, oriundos da biblioteca de G. tenuistipitata. Utilizou-se três réplicas biológicas

independentes para cada uma das condições analisadas de estresse (cobre e cádmio) e para a

condição de controle.

4.6.1 Qualidade do RNA

Amostras de RNA total das triplicatas biológicas foram submetidas a tratamentos com

DNases para eliminar contaminantes de DNA e não resultar falsos positivos nas reações de

RT-qPCR. Os resultados foram analisados a partir da utilização de PCRs convencionais, para

a amplificação de DNA, como descrito na Seção 3.6.2. Não foram encontradas bandas de

DNA para este teste, assegurando descontaminação com DNA.

Outros dois testes realizados na qualidade do RNA foram: i) RT seguida de PCR, para

formação de amplicons de cDNA. Nesta última técnica foram utilizados todos os 12 primers

para verificar se o produto da amplificação seria um único fragmento de cDNA (Figura 28A).

ii) no segundo foi feito a somente a PCR, utilizando DNA genômico novamente com os 12

primers. Foi possível descobrir se os primers poderiam homologar-se com outras sequências

do genoma e se haveria possíveis intros entre cada gene (Figura 28B). Todos os

procedimentos experimentais estão descrito na Seção 3.6.2.

Resultados

87

Figura 28: Teste da qualidade dos 12 primers e do RNA, utilizados na validação dos resultados de

microarranjos através da técnica de PCR em tempo real. (A) RT-PCR utilizando amostras de RNA. (B)

PCR convencional utilizando DNA genômico. As setas correspondem aos marcadores de tamanho de

100 e 200 pb.

4.6.2 Comparação de Resultados: PCR em Tempo Real e Microarranjos

Foi feita uma comparação entre as razões de expressão dos genes obtidas por PCR em

tempo real e os experimentos de microarranjos de DNA. Essa comparação serve para

validação de todos os resultados obtidos com os microarranjos.

Os gráficos da Figura 29 apresentam as razões de expressão gênica M =

log2(Tratado/Controle) obtidas dos experimentos de microarranjos (barras em azul claro) e

dos experimentos de PCR em tempo real (barras cinzas), para o tratamento da alga com o

cobre. O gráfico (A) apresenta os valores de M utilizando o gene EF como referência na

técnica de PCR em tempo real. Já o gráfico (B) utiliza o gene Actin como referência. São

apresentadas também as incertezas das medidas (barras de erro) em ambos os gráficos. No

caso dos experimentos de microarranjos, essas incertezas são calculadas como o desvio-

padrão dos valores de M das sondas correspondentes ao gene considerado, desde que a

intensidade A da sonda seja maior do que 2,0. Esse critério é importante para selecionar

apenas sondas experimentalmente significativas. Já no caso dos resultados de PCR em tempo

real, as incertezas são calculadas como o desvio-padrão dos valores de M obtidos na triplicata

dos experimentos. Qualitativamente, observa-se uma boa concordância entre os valores

obtidos, indicando uma boa correlação entre os dados.

A B

200

100

Resultados

88

Os gráficos da Figura 30 são análogos aos da Figura 29, mas consideram os resultados

obtidos para o tratamento com o cádmio. Mais uma vez, qualitativamente, observa-se boa

concordância entre os valores exibidos.

Com o intuito de se dar uma noção quantitativa para a concordância dos resultados

apresentados nas Figuras 29 e 30, pode-se calcular uma grandeza estatística conhecida pelo

nome de “Coeficiente de Correlação de Pearson”. Tal coeficiente, batizado usualmente pela

letra r, permite medir o grau de correlação entre dois conjuntos de dados. No caso, os

conjuntos são aqueles formados pelos valores de M obtidos com a técnica de PCR em tempo

real e os correspondentes valores obtidos com a técnica de microarranjos.

Os gráficos da Figura 31 apresentam a correlação entre os resultados de PCR em

tempo real e de microarranjos. Os valores de M e as incertezas são as mesmas apresentadas

nas Figuras 29 e 30. Para cada gene considerado, plotou-se um ponto com valor no eixo x

igual ao M obtido por RT-qPCR e valor no eixo y igual ao M obtido por microarranjos. Os

coeficientes de Pearson r são exibidos em cada gráfico. O significado desses gráficos será

melhor discutido na Seção 5.3.3.

Resultados

89

Figura 29: Valores da razão da expressão gênica M = log2(Tratado/Controle) obtidos dos

experimentos de RT-qPCR e microarranjos para os 10 genes considerados. O tratamento refere-se à

exposição da alga ao cobre. São mostrados os resultados para dois genes de referência utilizados na

técnica de PCR em tempo real: EF (Elongation Factor 1 Alpha) e Actin. As linhas tracejadas

vermelhas representam os limiares críticos M = +1 e M = -1, usualmente utilizados para se classificar

genes como diferencialmente expressos. Os genes (h) e (i) foram circulados pois foram classificados

como diferencialmente expressos pelo método HTSelf.

Figura 30: Resultados análogos aos da Figura 29, mas considerando agora o tratamento da alga

exposta ao cádmio. Os genes (d), (e), (f) e (j) foram circulados pois foram classificados como

diferencialmente expressos pelo método HTSelf.

(a) photosystem II oxygen (b) vanadium-dependent bromoperoxidase (c) zeaxanthin glucosyl transferase (d) hypothetical (e) high-affinity nitrate transporter (f) heat shock protein 90 (g) glutamate-cysteine ligase (h) superoxide dismutase CuZn (i) thioredoxin (j) leucine zipper-EF-containing transmembrane protein

Cu (EF)

-4.5

-3.5

-2.5

-1.5

-0.5

0.5

1.5

a b c d e f g h i j

PCR

Array

Cu (Actin)

-4.5

-3.5

-2.5

-1.5

-0.5

0.5

1.5

a b c d e f g h i j

PCR

Array

(a) photosystem II oxygen (b) vanadium-dependent bromoperoxidase (c) zeaxanthin glucosyl transferase (d) hypothetical (e) high-affinity nitrate transporter (f) heat shock protein 90 (g) glutamate-cysteine ligase (h) superoxide dismutase CuZn (i) thioredoxin (j) leucine zipper-EF-containing transmembrane protein

Cd (EF)

-4.0

-3.0

-2.0

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

a b c d e f g h i j

PCR

Array

Cd (Actin)

-4.0

-3.0

-2.0

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

a b c d e f g h i j

PCR

Array

Resultados

90

Figura 31: Correlação entre as razões de expressão gênica M medidas pela técnica PCR em tempo

real (eixo x) e pela técnica de microarranjos (eixo y). Cada ponto representa um dos dez genes

selecionados para validação dos resultados (Tabela 4). No gráfico (A) são apresentados os resultados

para o cobre, considerando EF como gene de referência. No gráfico (B) também são apresentados os

resultados para cobre, mas considerando Actin como gene de referência. Os gráficos (C) e (D)

apresentam os resultados correspondentes para o cádmio. Em cada gráfico apresenta-se ainda o

coeficiente de correlação de Pearson r e a linha da correlação perfeita (tracejada vermelha), onde r é

igual à 1. Finalmente, a linha de tendência para os pontos plotados (continua azul), obtida por

regressão linear, também é exibida em cada gráfico.

-4.00

-3.00

-2.00

-1.00

0.00

1.00

-4.00 -3.00 -2.00 -1.00 0.00 1.00

M PCR

M A

rray

-4.50

-3.50

-2.50

-1.50

-0.50

0.50

1.50

-4.50 -3.50 -2.50 -1.50 -0.50 0.50 1.50

M PCR

M A

rray

(A) – Cobre / EF

r = 0.796

-3.50

-2.50

-1.50

-0.50

0.50

1.50

2.50

-3.50 -2.50 -1.50 -0.50 0.50 1.50 2.50

M PCR

M A

rray

-3.50

-2.50

-1.50

-0.50

0.50

1.50

2.50

-3.50 -2.50 -1.50 -0.50 0.50 1.50 2.50

M PCR

M A

rray

(C) – Cádmio / EF

(B) – Cobre / Actin

(D) – Cádmio / Actin

r = 0.796

r = 0.871 r = 0.871

91

5. Discussão

Em resposta a quase todos os tipos de mudanças fisiológicas e condições adversas do

meio, as células e os organismos tipicamente podem detectar mudanças de um sinal e

transformá-lo numa gama de variadas intensidades. Em nível celular, isso requer um processo

de adaptação a estas mudanças, sendo uma característica intrínseca de todos os organismos

vivos (Voet, 2002). Devido à grande influência antropogênica, que cresce a cada ano,

mudanças abruptas no meio ambiente, tanto aquático e terrestre, já se tornaram fatos

corriqueiros atualmente. Para a adaptação celular de algas a variações de temperatura, pH,

nutrientes e exposição a compostos potencialmente tóxicos, entre outros, é necessário toda

uma reorganização no padrão molecular genético (Ritter et al., 2008). A partir de adventos na

tecnologia de biologia molecular e bioquímica pode-se detectar a variação do padrão de

expressão gênica em larga escala. Existem vários métodos para a detecção deste tipo de

variação, três deles usualmente utilizadas são: sequenciamento de ESTs, microarranjos de

DNA e PCR em tempo real.

O presente trabalho apresenta informações relevantes no estudo da expressão dos

genes de G. tenuistipitata, importante macroalga marinha, que sofreram alterações quando

esta alga foi submetida a estresse ambiental gerado por dois metais comumente descartados

no ambiente (Cu e Cd).

Discussão

92

5.1 Absorção de Elementos Químicos

Após exposição de 6 dias da alga aos dois metais, foi demonstrado através da técnica

de ICP-AES, que G. tenuistipitata bioacumulou cobre e cádmio. Em comparação, observou-se

que esta alga foi capaz de bioacumular maior concentração de cobre em relação ao cádmio.

Uma explicação para esta diferença na bioacumulação pode ser justificada pela habilidade que

cobre possui de ser transportado para dentro da célula, pois este metal é essencial no

metabolismo da alga, podendo existir transportadores específicos para o mesmo. Por exemplo,

em Arabidopsis thaliana foram descritos cinco membros de uma família de transportadores de

cobre (COPT1-5) e em Sacccharomyces cerevisiae foi caracterizado um gene (CTR1) que

codifica algumas proteínas específicas de membrana plasmática que requerem afinidade no

transporte de cobre para dentro da célula (Dancis et al., 1994; Grotz, 1998; Himelblau &

Amasino, 2000; Williams et al., 2000; Sancenón et al., 2003; Markossian & Kurganov, 2003).

Considerando o fato de que cobre é um metal essencial para G. tenuistipitata, por

participar de importantes reações biológicas como co-fator enzimático (amino oxidase e

citocromo c oxidase) e carreador de elétron no processo de fotossínteses (plastocianina)

(Gledhill et al., 1997; Pinto et al., 2003), observou-se também através da técnica de ICP-AES,

que concentrações basais de cobre foram encontradas na alga controle, sem exposição a cobre,

assim como na alga exposta ao cádmio, também sem exposição ao cobre. Uma vez que o

meio de cultivo Von Stosch não possui cobre em sua formulação, concentrações basais deste

metal certamente foram provenientes da água do mar. Em comparação, outro estudo

utilizando Enteromorpha flexuosa (Chlorophyta, alga verde), também demonstrou a presença

de concentrações basais de cobre para esta alga, oriundas de regiões costeiras não

contaminadas (Andrade, et al., 2004). O que este fato indica é que concentrações basais de

cobre são, sem dúvida, essencial para esta alga, sendo que esta concentração mínima foi

possível de ser detectada pela técnica de ICP-AES. Entretanto, estudos com plantas superiores

Discussão

93

e algas verdes unicelulares, demonstraram que efeitos de cobre em excesso tornam-se tóxicos

a estes organismos, podendo produzir EROs (Charrier et al., 2008). Dessa forma, ao se

realizar experimentos de exposição de G. tenuistipitata a um meio contaminado por cobre em

excesso, espera-se uma resposta molecular adaptativa a esse tipo de condição. Esse processo

de resposta e adaptação da alga é, justamente, tema de investigação deste trabalho, o qual será

discutido nas seções seguintes.

Ao contrário de cobre, cádmio não possui função biológica conhecida no metabolismo

de G. tenuistipitata ou qualquer outro organismo, mesmo assim há evidencias de seu

transporte para dentro de células (Stohs & Bagchi, 1995). Em plantas, foi demonstrado que

cádmio pode competir por transportadores de íons bivalentes, ser co-transportado com prótons,

ATPases do tipo P, entre outros (Hirschi, et al., 2000). Os efeitos biológicos de cádmio ainda

não foram bem compreendidos. Stohs & Bagchi (1995) propõem que íons de cádmio

deslocariam íons de zinco e ferro das proteínas, resultando na liberação de íons de ferro,

acessíveis para a formação da reação de Fenton, gerando EROs, desencadeando todo o

processo de estresse oxidativo.

Tendo em vista que inúmeras indústrias utilizam cádmio e cobre para manufacturar

seus produtos, gerando grandes quantidades que são liberadas no ecossistema, torna-se

importante um estudo de absorção e acumulação destes metais pelas macroalgas, para curtos e

longos períodos de tempo.

Nas análises de ICP-AES, provou-se que estes metais foram absorvidos e acumulados,

não se sabendo ao certo se dentro das células ou mesmo entre a parede celular. Por exemplo,

estudos revelaram que algumas algas podem tolerar ou metabolizar metais pesados tóxicos

por uma variedade de mecanismos. Um destes mecanismos seria a possibilidade da parede

celular sequestrar uma porcentagem destes metais, já que algumas algas são muito ricas em

polissacarídeos reativos, que poderiam adsorver metais (Cai et al., 1995; Adhiya et al., 2002).

Discussão

94

Outro mecanismo de acumulação destes metais pelas células envolve o complexo íon-ligante

processados nos vacúolos. As principais moléculas envolvidas neste processo são pequenas

proteínas constituídas de resíduos de cisteína como as metalotioneínas e as fitoquelatinas,

polímero de GSH. Os íons livres destes metais associam-se a grupos tiol da GSH e são co-

transportados para vacúolos (Wong et al., 1997; Cobbett, 2000).

A capacidade de absorção de metais pela alga pode ser complexa, pelo fato de que

muitos metais tóxicos, como cádmio, mercúrio e chumbo podem competir por transportadores

de metais essenciais na absorção (Guerrinot, 2000). Os resultados encontrados nos

experimentos de ICP-AIS demonstram que G. tenuistipitata é um organismo bioacumulador

de metais (cobre e cádmio) e, dada a sua resistência a fatores abióticos como temperatura, pH

e salinidade, seria de grande importância ecológica e econômica iniciar estudos de

bioremediação de poluição em uma dada região marinha.

5.1.1 Absorção em G. birdiae, G. domingensis e G. tenuistipitata

Diante dos dados e fatos que foram apresentados neste trabalho para G. tenuistipitata,

considerou-se também como uma valiosa contribuição analisarmos duas espécies de

Gracilaria brasileira (G. birdia e G. domingensis), através da técnica de ICP-AES. Embora

não tenha sido feito cultivo para estas duas espécies de alga brasileira em laboratório, para as

condições do experimento, isso não impossibilitou a obtenção de informações relevantes.

Assim, foi possível atribuir comparações entre o cultivo de G. tenuistipitata realizado em

laboratório, frente às condições ambientais naturais das duas outras espécies brasileiras.

Foi feita uma varredura na concentração de vários elementos químicos. Apesar do

desvio padrão de alguns elementos oscilar, em geral, para as condições do experimento

realizado, observou-se flutuações nas concentrações destes elementos podendo implicar em

diferenças fisiológicas, bioquímicas e genéticas entre estas algas (Tabela 8 e gráfico da Figura

Discussão

95

32). Podemos analisar, por exemplo, o caso do elemento Mn. Este se encontra em maior

concentração em G. birdiae em relação as outras duas espécies, indicando um caso verossímil

de que G. birdiae necessita de uma maior concentração deste metal para sua manutenção vital.

De certa forma podemos dizer que cada espécie reage a sua condição fisiológica adaptativa,

pois no caso G. tenuistipitata, mesmo estando em um ambiente totalmente controlado, sem

insuficiência de nutrientes, inclusive Mn (presente em meio Von Stoch), esta espécie

acumulou cerca de duas vezes menos Mn e G. domingensis quatro vezes menos em relação a

G. birdiae. Assim, podemos também estudar o caso de Ca e K para G. domingensis, entre

outros.

Mesmo observando diferenças nas concentrações dos elementos químicos, não foi

detectada qualquer diferença no repertorio destes, para as três espécies de algas. Os elementos,

Ba, Ni, Zn, Sr, Cr, Co, As e Cd também foram analisados, mas não foram detectados em

nenhuma alga, provavelmente não são elementos vitais para estas espécies.

Deste modo, a técnica de ICP-AES foi à melhor alternativa para a determinação de

metais-traço, e especialmente ultra-traços, sendo possível comparar, entre as três espécies de

algas citadas, o repertorio de elementos químicos necessários para a sobrevivência e

crescimento das mesmas.

Discussão

96

Figura 32: Concentrações dos elementos químicos analisados pela técnica ICP-AES encontrados nas

algas G. birdiae, G. domingensis, G. tenuistipitata. Os valores são obtidos dos dados apresentados na

Tabela 8. Considerou-se o logarítimo dos valores para uma melhor visualização gráfica dos resultados.

5.2 Presença de H2O2

Sabe-se que níveis tóxicos de cobre e cádmio podem levar a danos moleculares nas

células. Cada um dos dois metais pode exercer efeito tóxico sobre o organismo podendo gerar

EROs. As EROs podem ser moléculas radicalares ou não-radicalar (bastantes reativas),

derivadas do oxigênio. A rápida produção e acumulação de EROs, primeiramente o O2.– e o

H2O2, devido aos efeitos de metais tóxicos, vem sendo evidenciada em plantas, fungos e

mesmo em algas (Gharieb et al., 2001; Materazzi et al., 2004; Ritter et al., 2008). Em

soluções aquosas o O2.– existe em equilíbrio ácido base com a forma protonada, o radical

hidroperoxil (Sutherland, 1991). Ambas espécies, O2.– e HO2

. sofrem dismutação gerando

H2O2. O aumento da produção desta última molécula pode exercer efeitos tóxicos dentro das

células via peroxidação lipídica, degradação ou modificação de proteínas, danos no DNA

entre outros (Fridovich, 1986; Imlay & Linn, 1988). O H2O2 quando reage com CeCl3 produz

-1.50

-1.00

-0.50

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

Al Ca Fe Mg P Si Mn B K Na Cu

Lo

g(C

on

cen

tração

)

G. birdiae G. domingensis G. tenuistipitata

Discussão

97

precipitados eletrodensos insolúveis de peridróxidos de cério (Ce[OH]2OOH e Ce[OH]3OOH).

A partir desta reação foi possível observar em G. tenuistipitata, através de microscopia

eletrônica, em que local exatamente ocorreu maior concentração destes acúmulos eletrodensos.

Foi observado claramente a formação de acúmulos eletrodensos, em amostras de alga

controle, e submetidas aos metais. Acumulações de H2O2 foram localizados também nos três

tempos de exposição aos dois metais.

5.2.1 Acumulação em Amostras Controle

Pequenos pontos de acúmulos, em células controles, foram encontrados na parede

celular mais externa, película, ou seja, a parte que fica em contato com o ambiente (Figura 14).

Este provável estresse ocasionado na película, poderia ter sido espontaneamente causado

pelas secções realizadas antes da fixação para a microscopia. Não foram observados outros

pontos de acúmulos em outros locais.

Observou-se a partir de cortes ultrafinos do talo da alga controle, várias estruturas

como: parede celular, cloroplastos, grânulos de amido, uma pequena película externa, nunca

caracterizada anteriormente, vacúolos e junção entre as células (pit- plug) uma característica

peculiar de algas vermelhas bastante importante para troca de fluidos entre as células (Graham

& Wilcox, 2000). Outra característica observada, nessas células corticais, foi a ausência de

organização de tilacóides empilhados nos cloroplastos. Esse tipo de organização dos

cloroplastos é excluído do grupo de algas vermelhas sendo utilizado na taxonomia deste grupo.

O tilacóide geralmente é único e não ocorre empilhamento, só dobramento em alguns gêneros.

Mesmo não havendo quase nenhuma literatura em microscopia eletrônica para G.

tenuistipitata, foi possível comparar estas estruturas celulares, com estudos realizados por

Lopes, 2003, tese de doutorado IQ/USP.

Discussão

98

5.2.2 Acumulação em Amostras Expostas ao Cádmio

O padrão de acumulação para amostras exposta ao cádmio foi diferente em relação ao

padrão encontrado no controle, somente com exceção de acúmulos na película.

Uma grande quantidade de H2O2, em amostras expostas ao cádmio durante uma hora,

foi notada em algumas regiões na interface da parede celular cortical. Também observou-se

uma aparência retrátil na morfologia dessas células e disposições irregulares dos cloroplastos

podendo, esta característica, indicar uma resposta rápida da célula ao estresse causado pelo

metal. Segundo Materazzi e colaboradores (2004), cádmio pode ter influencia direta com

enzimas relacionadas à biossíntese de clorofilas, podendo gerar deformação nos cloroplastos

ou até redução destes.

Após um dia de tratamento ao metal, o padrão da acumulação foi de certa forma

diferente. Não somente foi encontrado um padrão mais disperso de acúmulos, como descrito

anteriormente, mas também encontrou-se pontos mais densos de acumulação na interface da

parede celular (Figura 16). Além disso, foram visualizados no interior das células, diferentes

pontos de acúmulos ao redor de estruturas amorfas não identificadas. Estas estruturas

poderiam originar-se da degradação de cloroplastos seguida de morte celular, pois células

corticais possuem grandes quantidades cloroplastos (Figura 17).

Diferentemente após 6 dias de exposição, não foram encontrados padrões de

acumulação localizados na interface da parede celular. Em decorrência a uma provável

adaptação fisiológica e molecular da alga, encontrou-se apenas células normais e células com

estruturas amorfas não identificadas. Essa alga poderia já ter ativado e desativado todo o

mecanismo de complexão a compartimentalização para cádmio, importante mecanismo de

tolerância. Após sua complexão, por exemplo, com substâncias quelantes, o produto (Cd-

quelador) é armazenado em estruturas celulares e/ou subcelulares como vacúolo, reduzindo

sua concentração no citosol e organelas (Kupper et al., 2007).

Discussão

99

5.2.3 Acumulação em Amostras Expostas ao Cobre

Para cobre, após uma hora de tratamento (Figura 18), encontramos padrões de

acumulação de pontos semelhante com o padrão de acumulação do tempo de exposição de

cádmio de um dia (Figuras 16 e 17). Ou seja, pontos densos de acúmulos na interface das

células, pequenos pontos de acúmulos na parede celular mais externa (película) e pontos de

acúmulos ao redor de estruturas amorfas não identificadas. Notou-se entretanto uma diferença

no padrão de acumulação de H2O2 que foram localizados na periferia de cloroplastos,

aparentemente não foi observado em cádmio, podendo indicar toxicidade maior de cobre

(Figura 19, seta verde). Baszynski e colaboradores (1988), observaram em plantas superiores,

após tratamento com cobre, que houve alterações na estrutura morfológica de tilacóides e de

cloroplastos.

Semelhantemente para cobre, assim como para cádmio, após 6 dias de exposição, não

foram encontrados padrões de acumulação localizados na interface da parede celular,

encontrou-se apenas células normais e células com estruturas amorfas não identificadas.

Possivelmente a ocorrência de degradação das estruturas celulares seguida de morte de células

corticais é um evento normal, após estresse por estes metais, pois estas, são as primeiras

células a terem contato com os metais absorvidos.

Foi possível provar, após exposição aos metais, que de fato houve incremento de H2O2,

um indicador de estresse oxidativo. Tem-se como exemplo, um trabalho realizado por

Bestwick (1997) que revelou ao utilizar catalase exógena, em plantas superiores sob estresse,

que esta era assimilada pela parede celular, ocorrendo desta forma, inibição da formação de

peridróxido de cério. O mesmo não ocorreu para as outras amostras não tratadas com catalase.

Foi possível desta maneira provar que a molécula de fato detectada pela microscopia

eletrônica foi H2O2. Isso acontece porque a catalase é uma enzima antioxidante que decompõe

H2O2 gerando oxigênio (2H2O2 → 2H2O + O2). Sendo assim, moléculas de H2O2 não

Discussão

100

reagiram com moléculas de CeCl3 em solução, não havendo a formação de acúmulos de

peróxido de césio.

De maneira geral, após todas as análises presentes neste estudo e levantamento

bibliográfico podemos dizer que o primeiro efeito danoso que estes metais podem causar após

sua absorção pela alga, em curtos períodos de tempo e em concentrações de CE50, seria a

formação de moléculas altamente reativas causadoras de estresses oxidativo (Yruela et al.,

2000; Pinto et al.,2003; Collén et al, 2003).

5.3 Técnicas Moleculares para Análise Transcripcional da Alga

Através de técnicas moleculares amplamente utilizadas em estudos de biologia e

bioquímica, foi obtido um panorama global de alterações gênicas que foram ocasionadas, na

macroalga marinha G. tenuistipitata, após exposição desta ao meio de cultivo contaminado

com dois tipos de metais tóxicos comumente descartados no ambiente (cobre e cádmio).

5.3.1 Interferência de Polissacarídeos na Extração de RNA

Existe toda uma complexidade na extração de RNA de algas ricas em polissacarídeos.

Como mencionado anteriormente o gênero Gracilaria possui grande quantidade de

polissacarídeos na parede celular, por isso é importante economicamente. A dificuldade na

utilização de kits comerciais com presença de colunas de separação, não são uma boa

alternativa, pois as colunas entopem devido a grande concentração de polissacarídeos.

A utilização do protocolo de TRIZOL com GHL e KOAc foi adaptado para a extração

de RNA de G. tenuistipitata. O método é rápido simples, de baixo custo e minimizou a

contaminação com polissacarídeos e proteínas (Falcão et al., 2006). Apesar deste método ter

sido muito eficiente em estudo de PCR semi-quantitativo, para as reações de síntese de cDNA

na utilização dos microarranjos, não foi possível obter uma boa qualidade dos resultados de

Discussão

101

hibridização. Isso poderia ser explicado, pois alguns polissacarídeos podem inibir atividade de

algumas enzimas (Shioda & Marakami-Muofushi, 1987). Outra característica observada neste

trabalho para o polissacarídeo oriundo de G. tenuistipitata é sua provável interação com

ácidos nucléicos, tornando-se assim ineficiente os processos de extração de DNA em especial

RNA.

Desta maneira, depois de variadas tentativas na busca de uma metodologia de

eliminação de polissacarídeos e obtenção de ótimos rendimentos na concentração de RNA,

optou-se pela utilização de um reagente comercializado pela Invitrogen chamado Concert

RNA Reagent Plant. Este reagente foi suficiente para a obtenção de uma boa quantidade e

qualidade do RNA, atendendo as metodologias de microarranjos e PT-qPCR (Figura 21).

5.3.2 Análise Global da Expressão Gênica da Alga

A partir das análises de resultados de microarranjos podemos distinguir alguns

aspectos gerais da resposta transcricional, em termos de funções celulares de genes induzidos,

reprimidos (Tabela 12 e 13; Anexo B).

Dentre as analises da resposta transcricional gerada por cádmio e cobre, pela técnica

de microarranjos, pode-se dizer que no repertorio de genes induzidos e reprimidos ocorreram

mudanças amenas em função do tempo de 6 dias. Porém existem inúmeros estudos que

comprovam grandes variações genéticas atribuídas a um curto período de tempo de exposição

aos metais, como uma resposta rápida, por exemplo, entre estes estudos foi constatado que

vários grupos de categorias funcionas celulares foram induzidas, sendo as principais, as de

defesa, metabolismo e transporte (Collén et al., 2003; Wang et al., 2004; Collén et al., 2006;

Ritter et al., 2008). Podemos também, comparar estes resultados descritos com aqueles

encontrados em presença de H2O2, após 1 hora e 1 dia de exposição, onde a resposta da alga

ao metal foi mais intensa.

Discussão

102

Após tratamento de G. tenuistipitata aos metais, obteve-se uma variação atenuada da

resposta transcripicional. Através destes resultados foi possível inferir algumas considerações

relevantes, descrita a seguir.

Para a resposta da alga a cádmio, dentro da categoria de defesa celular, tivemos 2

genes relacionados a HSPs (Heat Shock Protein) que tiveram sua expressão reprimida; HSP

90, co-chaperone (Craig et al.,1993) e a HSP 70 (Kiang & Tsokos, 1998). A maioria das

proteínas de choque térmico são chaperoninas ou chaperonas, cuja função principal em

resposta a estresse é renovelar as proteínas desnaturadas. A HSP 70 tem capacidade de

renaturar certas proteínas e a síntese de HSP 90 em condições de estresses é aumentada

podendo redirecionar o metabolismo celular para uma maior tolerância ao estresse (Becker,

1994). Cádmio pode ainda interferir no sistema de estresse antioxidativo, como aquele

envolvendo glutationa reduzida. Assim pode haver declínios nos níveis de glutationa, isto

pode ocorrer devido a um aumento na utilização de fitoquelatinas, podendo transpota-lo até o

vacúolo. Além disso, cádmio pode também reduzir os níveis de atividades de outras enzimas

antioxidantes, pois este pode substituir outro metal de mesma carga, como por exemplo zinco

(Pietrini et al., 2003; Shaw et al., 2006). Em contra posição, um gene de efeito crucial na

homeostase de íons metálicos foi induzido (leucine zipper-EF-hand containing

transmenbrane protein), provavelmente seja uma resposta positiva da célula para regular

concentrações de íons alterados. Outros genes que estão relacionados com transportes de ínos

e moléculas como, glutathione regulated potassium, sodium/sulfate symporter, high-affinity

nitrate transporter também foram induzidos.

O fato de que poucos genes foram induzidos ou reprimidos poderia indicar que esta

alga reagiu ou ainda estaria reagindo ao estresses causado por este metal, podendo estar em

uma fase menos estressante e mais adaptada. Um exemplo que poderia indicar este fato, é a

controvérsia do que ocorreu na categoria de proteólise, foi induzido um gene dependente de

Discussão

103

ubiquitina (ubiquitin-fusion degradation), envolvido em um dos passos da via de

ubiquitinação. O processo de ubiquitinação ocorre em células onde moléculas são marcadas

por moléculas ubiquitina com o objetivo de serem reconhecidas por uma enzima proteossomo

26S, e serem degradadas (Sun & Chen, 2004). Entretanto, observa-se como divergência que o

gene para a enzima 26S proteasome regulatory p55 foi reprimido nas condições estudadas

para cádmio. Poderia este fato, ser mais um indicativo de que a alga estaria se adaptando

depois de 6 dias de exposição.

Não se pode deixar de notar também, que houve uma maior indução de genes

essenciais na categoria do metabolismo em relação a reprimidos (Tabela 12, Anexo B). Estes

genes induzidos nesta categoria estão envolvidos no metabolismo de aminoácidos, entre eles,

aparagina, aspartato e metionina. Ainda nesta categoria observamos a CDP-ME

kinase/[4(cytidine 5-diphospho)-2-C- methyl-D- erythritol kinase], que participa da síntese de

esteróis importante para manutenção celular. Além disso, foram induzidos genes das

categorias de energia, transcrição, divisão celular (CCG1 protein), este último indicando

crescimento (Bieganowski et al., 2004), entre outros.

Genes que codificam proteínas associados a pigmentos fotossintéticos como

ficoeritrinas foram reprimidos. Sabe-se que cádmio pode inibir enzimas relacionadas a cadeia

transportadora de elétrons do cloroplasto e enzimas do ciclo de Calvin (Materazzi et al., 2004).

É notada também a grande quantidade de genes tanto induzidos quanto reprimidos

considerados proteínas hipotéticas e hipotéticas conservadas, demonstrando que há todo um

mecanismo não identificado ligado em resposta a exposição da alga a este metal.

Para cobre um número ainda maior de genes de defesa foram reprimidos (Tabela 13,

Anexo B). Entretanto um estudo com a alga parda, Laminaria digitata, revelou, após uma

exposição de 72 horas da alga a estresse com cobre, que proteínas de defesa, tais como:

superóxido dismutase, peroxiredoxina e metionina sulfoxido também tiveram sua expressão

Discussão

104

reprimida (Ritter et al., 2008). Collén e colaboradores (2003), revelaram em estudos

utilizando G. tenuistipitata, exposta a estresse a estes dois metais, que algumas enzimas de

defesas (superóxido dismutase, catalase, glutationa redutase e ascorbato peroxidase), eram

induzidas significativamente após um dia e dois dias de exposição. Collén e colaboradores

(2003), associou que estes dados ocorriam devido a um desbalanço intracelular de EROs na

alga, e esta respondia com o seu mecanismo de defesa aumentando a expressão de enzimas

antioxidantes. Apesar destes genes terem papel importante contra estresse ambientais, após 6

dias de tratamento estes foram reprimidos, indicando que sua resposta pode ser imediata,

dependente do tempo.

Genes importantes para a manutenção e desenvolvimento da alga das categorias de

sínteses de proteínas, transcrição e energia também foram reprimidos numa maior

porcentagem em relação ao cádmio. Na categoria transcrição observou-se a inibição de

algumas DNA e RNA polimerases, na defesa muitas enzimas importantes no processo

antioxidante também foram inibidas, thioredoxina, HSP 70, ascorbato peroxidase e

superóxido dismutase e na parte de energia enzimas tais como as ficoeritrinas associadas a

proteínas e outras de captação de luz também foram reprimidas. Em contra partida, foi

encontrado um gene de defesa induzido, que codifica a enzima lipoxigenase, envolvida na

catálise de dioxigenação de ácidos graxos polinsaturados. A via das lipoxigenases em plantas

está envolvida na síntese de moléculas regulatórias. Os hidroperóxidos formados, pela ação

das lipoxigenases, são moléculas reativas que podem ser mobilizadas em plantas por meio de

um mecanismo envolvendo a hidroperóxido ciclase e a hidroperóxido liase (Farmer et al.,

1992). A hidroperóxido ciclase produz o ácido 12-oxo-fitodienóico que, após uma redução e

três ß-oxidações, dá origem ao ácido jasmônico, o qual é um poderoso indutor da síntese de

inibidores de proteases quando plantas estão sob estresse (Parchmann et al., 1997).

Discussão

105

De modo geral, ao contrário dos resultados encontrados para cádmio, foi observado

nos resultados para o tratamento com cobre, que genes foram mais reprimidos (108) e do que

induzidos (76). Contudo, parece que cobre exerce efeito mais tóxico em G. tenuistipitata em

relação ao cádmio, podendo levar mais tempo para a alga se adaptar.

5.3.3 Validação dos Resultados

Os resultados obtidos com a técnica de microarranjos foram validados com um método

independente, o PCR em tempo real (RT-qPCR). A comparação dos dados obtidos por ambas

as técnicas foi apresentada na Seção 4.6.2.

Quando se diz que os dados do microarranjos são validados pelos dados do RT-qPCR,

tem-se a impressão de que a técnica de RT-qPCR é a que realmente fornece a resposta correta,

sendo os resultados dos microarranjos secundários, apenas significativos se forem

compatíveis com aqueles do RT-qPCR dentro das incertezas experimentais. A validação de

dados, entretanto, não deve ser entendida assim. Por se tratar de duas técnicas experimentais

completamente distintas, as quais objetivam medir a razão de expressão gênica por meios

indiretos, é natural que diferenças existam entre os resultados encontrados. Não se pode

afirmar com segurança qual das técnicas apresenta o resultado mais próximo da realidade. O

que se espera é que os resultados de RT-qPCR corroborem com os encontrados pelos

microarranjos, no sentido de que exista uma boa correlação entre os dados medidos, e não que

eles sejam exatamente (ou até aproximadamente) iguais.

É claro que experimentos de microarranjo permitem uma avaliação das razões de

expressão de um número muito maior (global) de genes. Em comparação à técnica de RT-

qPCR, essa é a grande vantagem de se trabalhar com microarranjos. Assim, pode-se comparar

os resultados obtidos com as duas técnicas apenas para um pequeno número de genes. Sendo

Discussão

106

tais resultados compatíveis, extrapola-se a conclusão de que os demais resultados obtidos com

os microarranjos, não diretamente comparados, também são válidos.

A comparação direta entre os resultados RT-qPCR × microarranjos para os

experimentos considerados neste estudo foi apresentada nas Figuras 29 e 30. No sentido da

“validação de dados” explicada acima, em que os mesmos não devem ser exatamente iguais,

mas sim apresentarem boa correlação, concluiu-se que existe boa concordância qualitativa

entre os valores apresentados, validando, portanto, os resultados.

Observa-se, no caso do cobre (Figura 29), que os todos os valores apresentados são

compatíveis dentro das incertezas experimentais. Além disso, há também uma boa

concordância quanto ao sinal de M (gene induzido ou reprimido) encontrado em ambas as

técnicas, ocorrendo divergências apenas para os genes (b) e (j), apesar dos valores de M serem

pequenos e as incertezas relativamente grandes.

Dos dez genes selecionados para a validação de dados, no caso do cobre, apenas (h) e

(i) foram considerados diferencialmente expressos pelo método HTSelf utilizado para a

análise dos dados de microarranjos (a tabela completa dos genes diferencialmente expressas

gerada pelo HTSelf encontra-se no Anexo B). Esses genes são apresentados circulados nos

gráficos da Figura 29. Um critério bastante simples que pode ser utilizado para se considerar

um gene diferencialmente expresso é aquele onde M > 1 (induzido) ou M < -1 (reprimido).

Esse critério é conhecido pelo nome de fold-change, pois corresponde a uma variação da

expressão gênica maior que o dobre (M > 1), ou menor do que a metade (M < -1) , da situação

“tratada” com relação a “controle”. Assim, podemos observar na Figura 29 que apenas os

genes (h) e (i) apresentaram valores de M menores do que -1, tanto na medida de RT-qPCR,

quanto dos microarranjos, corroborando com as análise completa gerada pelo HTSelf que os

consideraram diferencialmente expressos.

Discussão

107

No demais, observa-se também boa concordância entre os resultados de RT-qPCR

obtidos utilizando os genes de referência EF e Actin, indicando, no caso dos experimentos

considerados, que ambos os genes são igualmente bons para realização da metodologia RT-

qPCR.

No caso do cádmio (Figura 30), praticamente as mesmas conclusões podem ser

alcançadas. Há uma concordância qualitativa entre os resultados e o sinal de M é compatível

entre as duas medidas para todos os genes.

Quanto à classificação de genes diferencialmente expressos, o HTSelf listou os genes

(d), (e), (f) e (j) como significativos. Mais uma vez esse resultado é compatível com o critério

geral e simples do fold-change (M > 1 ou M < -1 para considerar diferencialmente expresso).

Observa-se que esses quatro genes apresentam valores de M acima de 1 ou abaixo de -1 nas

medidas tanto dos microarranjos quanto do RT-qPCR. Os demais genes apresentam sempre

um dos valores de M abaixo desse limiar crítico, ou seja, -1 < M < 1 para o RT-qPCR ou para

os microarranjos. A única exceção é o gene (g), que não foi considerado diferencialmente

expresso pelo método mais refinado do HTSelf, mas apresenta valores de M menores do que -

1 nas duas medidas realizadas.

Finalmente, também para o caso do cádmio, observou-se também boa concordância

entre os resultados de RT-qPCR obtidos com os genes de referência utilizados, EF e Actin.

Para se encerrar a discussão sobre a comparação dos resultados RT-qPCR ×

microarranjos, é importante se analisar os gráficos da Figura 31, os quais apresentam a

correlação entre os dados encontrados. Em cada gráfico, tem-se 10 pontos, correspondentes a

cada gene selecionado, sendo os valores de M obtidos pela técnica de RT-qPCR (MPCR)

representados no eixo horizontal e os valores de M obtidos pela técnica de microarranjos

(MArray) do eixo vertical. São também apresentadas as incertezas em cada medida. Calculou-se,

Discussão

108

para cada conjunto de dados apresentado na Figura 31, o coeficiente de correlação de Pearson

r correspondente.

Em estatística, o coeficiente de correlação de Pearson, também chamado de

"coeficiente de correlação produto-momento" ou simplesmente de "r de Pearson", mede o

grau da correlação (e a direção dessa correlação - se positiva ou negativa) entre duas variáveis.

Este coeficiente assume apenas valores entre -1 e 1. r = 1 significa uma correlação perfeita

positiva entre as duas variáveis. r = − 1 significa uma correlação negativa perfeita entre as

duas variáveis, isto é, se uma aumenta, a outra sempre diminui. r = 0 significa que as duas

variáveis não dependem linearmente uma da outra. A interpretação usual é a de que r > 0,70

indica uma forte correlação; 0,30 < r < 0,70 indica correlação moderada e r < 0,30 indica fraca

correlação.

Se existisse uma correlação perfeita entre os dados da Figura 31, ou seja, se o

coeficiente de Pearson r fosse igual a 1, então para todos os pontos valeria MPCR = MArray,

estando esses pontos localizados exatamente sobre a reta x = y (linha tracejada vermelha nos

gráficos). Como a correlação não é perfeita, com r = 0,796 para o caso do cobre e r = 0,871

para o caso do cádmio, os pontos obtidos se distribuem em torno da linha tracejada vermelha

com boa proximidade. Acrescenta-se nos gráficos, apenas para referência, uma linha de

tendência entre os pontos, calculada por regressão linear simples (linha azul contínua).

Os valores de r obtidos tanto para cádmio quanto para o cobre, indicam uma forte

correlação entre os dados, permitindo concluir que os resultados de microarranjo estão

validados pela técnica independente de PCR em tempo real.

109

6. Conclusões

• Através da técnica de ICP-AES, foi demosntrado que G. tenuistipitata bioacumulou cobre e

cádmio. Em comparação, observou-se que esta alga foi capaz de bioacumular maior

concentração de cobre em relação ao cádmio. Além disso, também foi demostrado a presença

de níveis basais de cobre na alga. Uma varredura no repertório de elementos químicos

característicos de G. tenuistipitata, cultivada em laboratório, e de duas outras espécies

brasileiras, coletadas em ambientes naturais (G. birdiae e G. domingensis), revelou flutuações

na concentração desses elementos para cada espécie, implicando em diferenças adaptativas

fisiológica, bioquímica e genética, entre elas. Podemos assim, dizer que esses dados são

relevantes para estudos futuros na área de cultivo dessas algas, em tanques e/ou mar aberto, e

mesmo para estudos ecológicos, fisiológicos, bioquímicos e moleculares.

• Foi comprovada a presença de H2O2 em células do córtex de G. tenuiatipitata quando esta

foi submetida ao meio de cultivo contaminado com os metais cádmio e cobre. O padrão de

acumulação de peridróxidos de cério para cádmio, nos tempos de 1 hora e 1 dia, foi diferente

do encontrado para cobre. Após esses tempos de exposição (1 hora e 1 dia), houve uma

resposta rápida, “retrátil”, na morfologia celular. Entretanto, após 6 dias de exposição, foram

encontradas semelhanças adaptativas na morfologia celular da alga para os dois metais.

• Foi necessário a utilização de outra metodologia de extração de RNA, para marcação e

hibridização nos microarranjos, devido a interferência de polissacarídeos na síntese de cDNA.

Conclusões

110

• Para a técnica de PCR em tempo real, foi visto que os valores de r obtidos tanto para cádmio

quanto para o cobre, indicam uma forte correlação entre os dados de microarranjos, e que os

dois genes constitutivos utilizados também tiveram uma boa correlação entre eles. Além disso,

não foram observados introns, entre os fragamentos dos 10 genes não constitutivos,

amplificados de amostras de DNA genômico e RNA.

• Em geral a variação da expressão gênica da alga sob estresse analisada pela técnica de

microarranjos, revelou diferenças nas categorias de genes funcionais distintas. Em resposta ao

cádmio, a alga reagiu mais rapidamente ao estresse. Foi visto que proteínas de defesa celular

quase não variaram após tratamento de 6 dias e que alguns genes de metabolismo, síntese de

proteínas, homeostase de íons e transporte, essenciais para o desenvolvimento da alga, foram

induzidos. Esses dados, possivelmente mostram que após este tempo de tratamento a alga já

estaria se adaptando as condições adversas geradas. Para cobre a resposta foi mais complexa.

Enzimas de defesa foram reprimidas, assim como alguns genes envolvidos com energia,

síntese protéica, transcrição e metabolismo. De outra forma, um gene de defesa envolvido na

dioxigenação de ácidos graxos insaturados foi induzido, assim como, genes de metabolismos,

divisão celular, energia, entre outros, indicando que a alga estaria reagindo ao estresse gerado

por esse metal, em um processo adaptativo mais lento. A maioria dos genes, cuja expressão

alterou, devido ao estresse gerado pelos dois metais, ainda não tem função celular conhecida,

indicando que há um mecanismo não identificado ligado à resposta da alga a exposição a

esses metais. Podemos dizer então, que cobre exerce um poder de toxicidade maior nessa alga

em relação ao cádmio. Deste modo, torna-se um fator importante, frente a ambientes

marinhos contaminados, descobrir se os organismos desse ecossistema são capazes de reagir

positivamente e se adaptarem as novas condições.

ANEXOS

112

A. Análise de Dados de Microarranjos

Este apêndice apresenta o estudo quantitativo dos dados obtidos a partir dos

microarranjos preparados, o qual foi realizado em colaboração com o pesquisador Dr. Daniel

Augusto Cortez do Instituto de Física da USP. O objetivo desse estudo é determinar,

utilizando-se técnicas estatísticas bem conhecidas, a relação de genes diferencialmente

expressos da alga submetida ao estresse (ensaio tratado), em relação à alga exposta ao seu

meio de cultivo natural (ensaio controle).

Em um experimento típico de microarranjos utilizando dois mRNA a serem

comparados são transcritos reversos em cDNA, rotulados com dois fluoróforos diferentes

(usualmente um marcador fluorescente vermelho Cy5, e um marcador fluorescente verde

Cy3), e então hibridizados simultaneamente na lâmina de vidro. Valores de intensidade

gerados da hibridização em spots de DNA individuais são indicativos de expressão gênica, e a

comparação entre níveis de expressão gênica das duas amostras são derivadas da razão entre

as intensidades resultantes.

Exemplificando: digamos que para o gene “X” obteve-se um valor de intensidade para

o marcador associado ao ensaio tratado igual à R, e um valor de intensidade para o marcador

associado ao ensaio controle igual à G. Então, basicamente, a razão R/G corresponde à relação

entre as expressões do gene “X” para os ensaios considerados. Valores da razão R/G acima ou

abaixo de determinados cutoffs (que também serão determinados apropriadamente),

classificarão o gene como diferencialmente expresso.

Em seguida, apresenta-se os detalhes por de trás das idéias sucintamente descritas

acima. É importante ressaltar que a análise de dados de microarranjos baseia-se em

Analise de Dados de Microarranjos

113

métodos já estudados, vastamente descritos da literatura (Cui & Churchill, 2003;

Nadon & Shoemaker 2002; Tu et al., 2004; Yang et al., 2002).

A.1 Dados Brutos

Em primeiro lugar, deve-se obter os valores das intensidades de fluorêcencia emitidas

pelos marcadores associados ao ensaio tratado e ao ensaio controle, para cada gene

considerado no microarranjo.

A escolha da cor do marcador (vermelho ou verde) para indexar o ensaio tratado e o

ensaio controle é arbitrária. Em geral o ensaio tratado é marcado com vermelho e o ensaio

controle é marcado com verde. Uma técnica conhecida (dye-swap), cujo objetivo é a

comparação de resultados, baseia-se na construção de dois microarranjos idênticos, exceto

pelas cores utilizadas para os marcadores do ensaio tratado e do controle, que são trocadas.

Vamos convencionar que o marcador vermelho esteja associado aos genes do ensaio

tratado e o marcador verde esteja associado aos genes do ensaio controle. Cada hibridização é

escaneada e produz uma imagem que é processada utilizando-se o programa Array Vision 6.0.

As principais quantidades de interesse produzidas pelos métodos de análise da imagem

(correção de segmentação e background) são os pares de intensidade de fluorêcencia (R, G),

para cada gene em cada arranjo (onde R = vermelho para o marcador do tratado e G = verde

para o marcador controle). Tais valores são dados em unidades arbitrárias de intensidade e

correspondem aos dados brutos para as análises subsequêntes. É costume a construção de um

gráfico dos valores de R×G assim obtidos, denominado Scatter Plot.

Uma vez que os valores brutos de R e G costumam variar desde poucas unidades até

vários milhares, torna-se mais conveniente trabalhar com uma escala logarítmica, utilizando-

se valores de log2(R) e log2(G). Como exemplo, apresentamos na Figura 33 os gráficos de

R×G e de log2(R)×log2(G) para um dos microarranjos deste trabalho (experimento self-self).


114

Como se está interessado em avaliar o quanto R é maior (ou menor) de que G, ou seja,

a distribuição dos valores de R e G ao longo da reta R = G, é conveniente efetuarmos uma

rotação de 45º no sentido horário dos eixos R e G. Trabalhando com os valores de log2(R) e

log2(G), a rotação descrita acima nos leva em um novo sistema de coordenadas que, a menos

de um fator de proporcionalidade, é dado por A = log2(RG)1/2 e M = log2(R/G). A Figura 34

apresenta a transformação (log2(R), log2(G)) → (A, M), utilizando-se os valores de R e G da

Figura 32. Toda a análise subsequente dos dados será feita com base no diagrama (A, M).

Observa-se que a nova variável A (add) pode ser interpretada como a média da

intensidade logarítmica total medida no spot, pois A = log2(RG)1/2 = (log2(R)+log2(G))/2. A

variável M (minus), por sua vez, é simplesmente o logaritmo da razão entre as intensidades, M

= log2(R/G) = log2(R) – log2(G).

Figura 33: Gráficos com valores de R×G e de log2(R)×log2(G). Os dados correspondem ao

microarranjo obtido da hibridização self-self.

Scatter Log Red-Green Plot

-4

-2

0

2

4

6

8

10

12

-10 -5 0 5 10 15

log2(Red)

log2(G

reen)

Scatter Red-Green Plot

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0 200 400 600 800 1000 1200

Red

Gre

en


115

Figura 34: Transformação de coordenadas (log2(R), log2(G)) → (A, M). Os dados apresentados

referem-se aos mesmos da Figura 33.

A.2 Normalização de Dados

Com o intuito de se aferir precisamente as modificações nas expressões gênicas a

partir dos valores medidos de R e G, é importante levar em consideração as variações

aleatórias (experimentais) e sistemáticas que ocorrem em todo experimento de microarranjo.

Por exemplo, uma bem conhecida fonte de variação sistemática surge das tendências

associadas aos diferentes marcadores. Tais tendências podem ser decorrência de uma série de

fatores, incluindo propriedades físicas dos marcadores (sensitividade a luz e ao calor, meia-

vida relativa), efetividade na incorporação do marcador, variabilidade experimental nos

processos de hibridização e processamento, ou ajuste do scanner durante o processo de coleta

de dados. Mesmo que essas tendências sistemáticas sejam pequenas, elas podem ser confusas

quando procuramos por diferenças biológicas sutis, tornando difícil a distinção entre genes

diferencialmente e constantemente expressos.

A-M Plot

-8,0

-6,0

-4,0

-2,0

0,0

2,0

4,0

6,0

-5,0 0,0 5,0 10,0 15,0

A = log2(RG)/2M

= log2(R

/G)

Scatter Log Red-Green Plot

-4

-2

0

2

4

6

8

10

12

-10 -5 0 5 10 15

log2(Red)

log2(G

reen)


116

O objetivo do processo de normalização é o de minimizar as variações sistemáticas na

medida dos níveis de expressão gênica de duas amostras de mRNA hibridizadas, de forma que

diferenças biológicas possam ser melhor distinguidas.

O processo de normalização dos dados começa com a análise do diagrama (A, M)

descrito anteriormente (Yang et al., 2002). Tal diagrama se demonstra bastante útil em termos

da identificação na razão logarítmica M de padrões dependentes da intensidade A.

A normalização utilizada no presente trabalho é conhecida como Normalização

Dependente da Intensidade (Dudoit, 2002). Esse método assume que as intensidades de

vermelho e verde estão relacionadas por uma função que depende apenas da intensidade total,

i.e. R = k(A)G, de forma que o centro da distribuição das razões logarítmicas M deve ser

deslocado para zero:

=−

→

GAk

RAc

G

R

G

R

)(log)(loglog 222 ,

onde c(A) = log2[k(A)]. A função c(A) normalmente escolhida para o processo de

normalização acima é o ajuste LOWESS (locally weighted scatterplot smoothing) ao conjunto

de dados do diagrama (A, M). O ajuste LOWESS, introduzido por Cleveland e posteriormente

aprimorado por Cleveland & Devlin (1988), também conhecido por regressão linear

localmente ponderada, é uma técnica para ajustar uma curva suave a um conjunto de dados

denso e espalhado. Em particular, ela não será afetada pela pequena porcentagem de genes

diferencialmente expressos, que aparecerão como pontos extremos no diagrama (A, M).

O grau de suavidade da curva LOWESS ajustada é determinado por um parâmetro f

(smoothing parameter ou bandwidth parameter) que controla a largura da janela de dados

utilizados em cada regressão local ponderada. Quanto maior a largura da janela, mais suave

será a curva resultante. Uma janela menor resultará em maiores variações locais (Figura 35).

Valores típicos de f para a normalização de dados de microarranjos variam desde 0,2 até 0,5.

(1)


117

Figura 35: Ajuste LOWESS (linha vermelha) para um conjunto de dados de microarranjo genérico.

São apresentadas curvas para três valores do parâmetro f.

Apresenta-se no gráfico da Figura 36 o processo de normalização prescrito pela

Equação (1) para os dados de microarranjo da Figura 33. A curva verde no gráfico do lado

esquerdo representa o ajuste LOWESS aos pontos (A, M) com o parâmetro f igual à 0.25.

Em seguida se apresenta alguns detalhes mais técnicos sobre o cálculo do ajuste

LOWESS para um conjunto de dados genérico.


118

Figura 36: Ajuste LOWESS (curva verde corresponde à função c(A)) ao conjunto de dados de

microarranjo da Figura 33 e normalização segundo a Equação (1).

A.2.1 LOWESS

O método LOWESS requer o uso de regressão linear ponderada. Cada ponto no

conjunto de dados apresenta um peso associado. Assim, inicialmente é fornecido um conjunto

de pontos e pesos (xi, yi; wi), 0 ≤ wi ≤ 1. Os coeficientes angular S e linear L da reta ajustada a

esse conjunto de pontos são dados pelas bem conhecidas fórmulas de regressão linear:

( )22 ∑∑ ∑∑∑∑ ∑

−

−=

iiii

iiiiiiii

xwxw

ywxwwyxwS

( )22

2

∑∑ ∑∑∑∑ ∑

−

−=

iiii

iiiiiiiii

xwxw

xwyxwywxwL

O ajuste LOWESS é calculado em cada ponto do conjunto de dados. Para cada um

desses pontos, uma reta é ajustada a partir de um conjunto de dados vizinhos. O método exige

que seja fornecido um parâmetro f (entre 0 e 1) que controla a quantidade de pontos utilizados

em cada regressão local.

A-M Plot and LOWESS Fit (Self+Self)

-8,0

-6,0

-4,0

-2,0

0,0

2,0

4,0

6,0

-5,0 -3,0 -1,0 1,0 3,0 5,0 7,0 9,0 11,0

A = log2(RG)/2

M =

lo

g2(R

/G)


119

A.3 Classificação de Genes Diferencialmente Expressos

Quando se analisa dados de microarranjos, uma questão central é como classificar

genes diferencialmente expressos. Para responder a essa questão é necessário fixar um nível

de cutoff para as razões das intensidades das hibridizações que nos permita decidir se um gene

é diferencialmente expresso ou não. Existem muitas formas matemáticas de se definir tal

cutoff . Uma estratégia simples e amplamente utilizada consiste em arbitrariamente escolher

uma razão constante, comumente um limiar tal que R = 2G (M = 1) ou G = 2R (M = -1).

Genes com razões fora desse limiar são considerados diferencialmente expressos (métdodo

conhecido pelo nome de fold-change).

Outra abordagem baseia-se em estratégias experimentais tal como o uso de

hibridizações self-self. Experimentos self-self são obtidos rotulando o mesmo material

biológico com dois marcadores Cy3 e Cy5 e hibridizando-os simultaneamente na mesma

lâmina. Essa estratégia tem sido usada para derivar cutoffs dependentes da intensidade e

classificar genes como diferencialmente expressos ou divergentes em diversos estudos de

microarranjos (Tu et al., 2002).

A utilização de experimentos self-self é a base do método HTSelf desenvolvido por

Vêncio & Koide (2005), o qual será aplicado no presente trabalho para a classificação dos

genes diferencialmente expressos. Observa-se que o método já havia sido aplicado com

sucesso em diversos outros experimentos.

A.3.1 O Método HTSelf

Aqui, expõem-se as idéias contidas em Vencio & Koide (2005) para descrever o

método HTSelf.

A idéia básica é se determinar à função densidade de probabilidade (FDP) nula do

teste a partir de experimentos self-self. Como a hipótese “não há hibridização diferencial entre


120

duas amostradas sondadas” é válida para todos os genes num experimento self-self, é possível

utilizar todos os genes spotados para estimar a FDP nula. Com uma quantidade adequada de

dados (todos os genes spotados), o uso de técnicas não-paramétricas é possível.

Para levar em consideração as características dependentes da intensidade dos dados, a

FPD nula é estimada a partir de uma janela deslizante, que desliza sobre toda a gama de

intensidades medidas. Esse procedimento resulta na determinação de cutoffs dependentes da

intensidade, os quais podem ser prontamente aplicados para experimentos não-self-self. Dessa

forma, é implicitamente assumido que o mesmo processo estocástico que gerou o ruído

experimental nos experimentos self-self está também atuando nos dados não-self-self. Assim,

razões logarítmicas acima ou abaixo dos cutoffs dependentes da intensidade podem ser

classificados como diferencialmente expressos.

A determinação da FDP nula em uma janela de dados de um experimento self-self se

faz a partir do chamado Kernel Density Estimator. A característica desse método é que o

mesmo é independente do modelo e é capaz de aproximar a FDP de uma variável aleatória

apenas utilizando suas medidas experimentais.

Depois de se estimar a FDP nula de das razões logarítmicas normalizadas M para uma

dada janela de valores de intensidades A, um intervalo de credibilidade definido por um

parâmetro 0 < α < 1 pode ser determinado. Resumidamente, o algoritmo para se definir os

cutoffs dependes da intensidade é:

(1) define-se uma janela deslizante no eixo A através de dois parâmetros: a largura da

janela e o incremento (passo) de deslizamento. Cada passo da janela deslizante

delimita um subintervalo de valores de A;

(2) para cada subintervalo de A selecionado em (1), estima-se a função densidade de

probabilidade M | A usando o Kernel Density Estimator gaussiano;


121

(3) integra-se a função densidade de probabilidade estimada em (2) ao redor do modo

até que probabilidade definida pelo parâmetro α seja atingida. Os intervalos obtidos

são chamados intervalo de credibilidade;

(4) os passos (2) e (3) são repetidos até que a janela tenha deslizado sobre todos os

valores possíveis de A.

A Figura 37 mostra um retrato estático do algoritmo descrito acima em um passo

arbitrário.

Depois de se determinar os cutoffs dependentes da intensidade, diferentes experimentos

de microarranjos feitos sob as mesmas condições do experimento self-self podem ser

estudados. Por exemplo, suponha que a medida (a, m) de um spot apresente a razão

logarítmica m fora do cutoffs gerados com credibilidade 99%. Então, ele pode ser classificado

como diferencialmente expresso, uma vez que há apenas 1% de chance de que o valor de m

obtido seja devido a erros técnicos aleatórios.


122

Figura 37: Retrato de um passo do processo da janela deslizante para determinação dos cutoffs

dependentes da intensidade. O gráfico da esquerda mostra o diagrama (A, M) com os dados do self-self

para o microarranjo da G. tenuistipitata. O subintervalo A considerado está delimitado entre as linhas

verticais do gráfico da esquerda. O histograma dos valores de M mostrado no gráfico da direita foi

construído utilizando os dados entre as linhas verticais pretas do gráfico da esquerda. O Kernel Density

Estimator (linha verde) e as fronteiras do intervalo de credibilidade de 95% (linhas verticais vermelhas)

também são apresentados. Essas fronteiras definem os cutoffs dependentes da intensidade para o

intervalo considerado. Mostra-se ainda no gráfico da esquerda os valores dos cutoffs para todos os

intervalos de A percorridos pela janela deslizante, resultando nas linhas azuis.

A.3.2 Estatística para Classificação

Uma vez obtido os valores dos cutoffs em função das intensidades com o método

HTSelf , o teste de comparação pode ser aplicado para todos os spots dos experimentos não-

self-self. Como o teste é aplicado em spots individuais, ele não depende do número de réplicas.

Se tiver um número de observações replicadas para um dado gene, após a aplicação do teste

em cada spot, é possível se determinar facilmente se eles estão acima ou abaixo dos cutoffs e

classificar o gene como diferencialmente expresso ou não. Mais especificamente, suponha que

existam n réplicas para um dado gene “X”, com u observações acima dos cutoffs, d

-6,0

-4,0

-2,0

0,0

2,0

4,0

6,0

-5,0 -3,0 -1,0 1,0 3,0 5,0 7,0 9,0 11,0

A

M N

orm

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

M Norm


123

observações abaixo dos cutoffs e i observações entre os cutoffs, tal que n = u + d + i. Diremos

que o gene “X” é diferencialmente expresso se as probabilidades

idu

u

n

uupP

++==.

ou

idu

d

n

ddownP

++==.

estiverem acima de um certo limiar P0. Tipicamente considera-se P0 = 66%, embora existam

trabalhos que consideram P0 = 50%, ou seja, tal que se pelo menos metade das réplicas de um

gene estiverem acima ou abaixo dos cutoffs, considera-se que existe diferenciação de

expressão.

A.4 Programa para Análise de Dados: “GT Microarray Analysis”

O processo de análise dos dados de microarranjos requer um óbvio esforço numérico

no sentido de se calcular a normalização dos dados, os cutoffs para os experimentos self-self a

partir do método HTSelf e a classificação de genes diferencialmente expressos. Em

colaboração com o Dr. Daniel Augusto Cortez (IFUSP), desenvolveu-se um programa para

implementação dos passos acima, o qual foi utilizado nas análises deste estudo. O programa

criado denomina-se “GT Microarray Analysis” e será brevemente explicado a seguir.

A proposta do programa visa basicamente tornar automatizado o processo de análise

dos dados obtidos. A entrada inicial do programa é o arquivo de dados gerado pelo software

Array Vision 6.0, o qual contém as intensidades de fluorescência geradas a partir da análise

das imagens escaneadas dos arranjos. Além disso, o programa requer que sejam inseridos

parâmetros pertinentes ao processo de normalização e ao cálculo dos cutoffs via HTSelf.

Também é possível carregar um arquivo contendo a identificação dos spots com os genes

biológicos correspondentes, para que seja feita uma classificação.


124

O programa “GT Microarray Analysis” foi desenvolvido de forma especializada,

sendo específico para a configuração do microarranjo e o mapa do chip utilizado aqui. A

interface com o usuário é bastante amigável, sendo possível a visualização dos dados de uma

forma rápida e fácil. Após as análises, arquivos com os dados brutos e as respostas são

gerados para manipulação e criação de gráficos em planilhas comerciais como o MS Excel.

A Figura 38 apresenta a interface do programa “GT Microarray Analysis” com um dos

arquivos de dados aberto. A Figura 39 mostra a interface gerada (classificação dos genes)

após toda a análise dos dados.

Figura 38: Interface do programa “GT Microarray Analysis”. Os arquivos de dados abertos

correspondem à hibridização da alga tratada com cádmio e da alga em seu meio natural de cultivo, bem

como os arquivos de dados do self-self.


125

Figura 39: Janela “Classification” aberta após a função “Classificar” ser selecionada. As tabelas nessa

janela permitem uma classificação completa dos genes estudados.

A partir do final de 2008, iniciou-se mais uma colaboração com os Drs. Daniel Cortez

(IFUSP) e Ricardo Vencio (MedUSPRB) para o desenvolvimento de um novo programa

(provisoriamente batizado pelo nome de MaDA – Microarray Data Analyser) que seja

genérico o suficiente para a análise de dados gerais de microarranjos, com uma configuração

arbitrária dos chips. Em breve, a publicação dos detalhes da construção desse programa será

submetido a revista específica da área.

A.4.1 Processamentos

A seguir, como exemplo, apresenta-se dois processamentos dos dados com o programa

“GT Microarray Analysis”. O primeiro exemplo refere-se ao microarranjo preparado pela


126

hibridização da amostra de alga exposta ao cádmio com a alga em seu meio natural de cultivo,

mais os dados do experimento self-self. O segundo, refere-se à exposição da alga ao cobre.

O primeiro gráfico da Figura 40 ilustra o diagrama (A, M) obtido e o ajuste LOWESS

sobre os dados. Os pontos no gráfico representam apenas spots não-vazios com intensidade

Red e Green positivas. O segundo gráfico apresenta os valores normalizados das razões de

intensidades M, junto com as curvas de cutoffs geradas pela análise dos dados do self-self

(com o método HTSelf). Os pontos acima ou abaixo dos cutoffs são apresentados em destaque,

pois representam spots com expressão gênica diferencial. Observa-se que muitos desses spots

podem corresponder a réplicas de um mesmo gene biológico. Tal gene só será considerado

diferencialmente expresso se a maioria dos spots correspondentes estiverem acima (gene

induzido), ou abaixo (gene reprimido) dos cutoffs.

Os gráficos da Figura 41 são análogos aos da Figura 40, mas consideram os dados do

tratamento da alga exposta ao cobre.


127

Figura 40: Gráfico superior: Diagrama (A, M) e ajuste LOWESS (curva vermelha) para o conjunto de

dados da alga tratada com cádmio. Gráfico inferior: Dados normalizados e cutoffs (curvas azuis). Em

destaque (pontos lilás), valores representado spots com expressão diferenciada.

A-M Plot and LOWESS Fit

-14.0

-12.0

-10.0

-8.0

-6.0

-4.0

-2.0

0.0

2.0

4.0

6.0

-5.0 -3.0 -1.0 1.0 3.0 5.0 7.0 9.0 11.0

A = log2(RG)/2

M =

lo

g2

(R/G

)

Normalized Data and Cutoffs with 95% credibility

-6.0

-4.0

-2.0

0.0

2.0

4.0

6.0

-5.0 -3.0 -1.0 1.0 3.0 5.0 7.0 9.0 11.0

A = log2(RG)/2

MN

orm

= M

- L

OW

ES

S(A

)


128

Figura 41: Gráfico superior: Diagrama (A, M) e ajuste LOWESS (curva vermelha) para o conjunto de

dados da alga tratada com cobre. Gráfico inferior: Dados normalizados e cutoffs (cuvas azuis). Em

destaque (pontos lilás), valores representado spots com expressão diferenciada.

A-M Plot and LOWESS Fit

-14,0

-12,0

-10,0

-8,0

-6,0

-4,0

-2,0

0,0

2,0

4,0

6,0

-5,0 -3,0 -1,0 1,0 3,0 5,0 7,0 9,0 11,0

A = log2(RG)/2

M =

lo

g2

(R/G

)

Normalized Data and Cutoffs with 95% credibility

-6,0

-4,0

-2,0

0,0

2,0

4,0

6,0

-5,0 -3,0 -1,0 1,0 3,0 5,0 7,0 9,0 11,0

A = log2(RG)/2

MN

orm

= M

- L

OW

ES

S(A

)

129

B. Listas de Genes Diferencialmente Expressos

Tabela 12: Lista de genes induzidos e reprimidos após tratamento com cádmio. É exibido também o

valor da razão da expressão gênica M = log2(Tratado/Controle) com respectivo desvio-padrão. Valores

sem desvio padrão referem-se a genes que só tiveram uma única sonda analisada.

Cádmio Induzido Reprimido

Categoria Gene M Gene M

3-dehydroquinate synthase-300138 2.07 2-dehydro-3-deoxy-phosphoheptonate aldolase-200250

-0,58±0,41

asparaginase-200089 1.96±0.27 phosphoglycerate dehydrogenase-301590

-1,05±0,47

asparagine synthase-300449 0,43±0,28 phosphoglucomutase-301544 -0,72±0,39

aspartate aminotransferase 1-200007 0,72±0,48 acid phosphatase-300081 -0,92±0,59

aspartate aminotransferase 2-301375 0,56±0,35

aspartate aminotransferase 3-301378 0,35±0,43 dihydrolipoamide dehydrogenase-200245

1,09±0,92

methionine adenosyltransferase-200270

1,04±0,53

phosphatidyltransferase-200493 1,65±0,18

threonine dehydratase-301696 1,68±0,37 alcohol dehydrogenase transcription effector-300127

1,66±0,98

hydroxymethyltransferase-300712 0,19±0,47

ADP ATP carrier protein-200001 0,85±0,16

glucan 1 4-alpha-glucosidase-301510 1,25±0,43

leukotriene-A4 hydrolase-300133 2,01±0,21

protein disulphide isomerase-301658 1,10±0,33

protein disulphide isomerase-301659 0,58±0,12 methylenetetrahydrofolate reductase-300182

1,16±0,40

Metabolismo

4-(cytidine 5'-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol kinase-200344

1,01±0,87

surfeit protein 1-300184 1,02±0,39 phycoerythrin-associated linker protein 1-200042

-0,66±0,49 Energia

NADH dehydrogenase-301017 0,98±0,39 phycoerythrin-associated linker protein 2-301417

-0,76±0,16

Divisão celular

CCG1 protein-301807 1,02±0,36

Transcrição transformer 2 splicing factor-200022 0,98±0,93

40s ribosomal protein S4-300369 0,63±0,42 30S ribosomal protein S21-301962 -0,43±0,12

40S ribosomal protein S7-300156 1,74 60S ribosomal protein L26-300655 -1,19±0,61

methionyl aminopeptidase-200068 1,95±0,18 60S ribosomal protein L37-300782 -1,43±0,31 translation initiation factor 3 subunit 3-301611

1,34±0,73

Sintese de proteínas

translation initiation factor 3-301432 0,51±0,49

oligopeptidase B-300378 0,64±0,17 26S proteasome regulatory subunit p55-301555

-0,52±0,17 Proteolise

ubiquitin-fusion degradation protein-301624

1,68±0,15 exoenzymes regulatory protein-200094

-0,91±0,51

glutathione-regulated potassium-efflux system protein kefB-300202

1,97±0,04 urea transport protein-200253 -1,10±0,60 Transporte

sodium/sulfate symporter-300151 1,80 coatomer β-300239 -0,45±0,17

130

high-affinity nitrate transporter-200425

1,30±0,77

coatomer-200216 0,81±0,24

lipophorin receptor-200069 0,79±0,43

heat shock protein 70-1-300219 -1,23±0,52

heat shock protein 70-2-301647 -0,55±0,53 Defesa

heat shock protein 90-200400 -1,20±0,52

Homeostase iônica

leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein-300619

1,16±0,11

hypothetical protein-200177 0,67±0,31 hypothetical protein-200041 -1,10±0,29




hypothetical protein-300051 2,41 hypothetical protein-300070 -0,65±0,48




















hypothetical protein-301486 -0,87±0,52


Hipotéticas


conserved hypothetical protein-200175

1,29±0,72 conserved hypothetical protein-200188

-0,92±0,22



-0,96±0,43



-1,13±0,95


2,21 conserved hypothetical protein-301653

-0,60±0,23


1,23±0,32


0,89±0,13

Hipotéticas Conservadas


1,98±0,10

proline-rich protein-300801 1,01±0,23 proline-rich protein-200077 -0,62±0,47 Sem classificação ou incerta proline-rich protein-300834 -1,03±0,32

transposase-200228 1,27±0,39 dentin sialophosphoprotein-200447 -0,80±0,23

warthog gene-200121 -0,99±0,81

Outros

GABA-A receptor epsilon-like -1,02±0,19

131

subunit-300887

Polyprotein A-300811 -0,81±0,29

polyprotein-301632 -1,79±0,40

Tabela 13: Lista de genes induzidos e reprimidos após tratamento com cobre, É exibido também o

valor da razão da expressão gênica M = log2(Tratado/Controle) com respectivo desvio-padrão, Valores

sem desvio padrão referem-se a genes que só tiveram uma única sonda analisada,

Cobre Induzido Reprimido

Categoria Genes M Genes M

beta-hydroxylase-301445 1,79±0,39 oxidoreductase-300707 -1,08±1,24

isoleucine--tRNA ligase-300765 1,04±0,74 2-dehydro-3-deoxy-phosphoheptonate aldolase-200250

-2,08±1,02

phosphatidyltransferase-200493 1,52±0,44 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase-300743

-0,51±1,65

phosphoglycerate dehydrogenase-300063

1,85 aspartate aminotransferase-301378 -1,66±1,23

proline synthetase associated protein-300746

0,75±0,36 phosphoglycerate dehydrogenase-301590

-2,65±0,86

O-linked GlcNAc transferase-300106 0,24±1,05 pseudouridine synthase-300694 -1,44±0,20

glucan 1 4-alpha-glucosidase-301510 1,67±0,37 O-linked N-acetylglucosamine transferase-300091

-1,61±0,70

glyoxylate reductase (NADP+)-300825

0,87±0,70 diphosphate--fructose-6-phosphate 1- phosphotransferase-301427

-1,51

Metabolismo

protein disulphide isomerase-301659 0,60±0,74

ATP synthase-301582 1,77±3,52 alternative oxidase-200189 -0,18±1,65

cytochrome b5 reductase-200017 2,17±0,00 NADH dehydrogenase-300611 -1,59±0,45

surfeit protein 1-300184 1,41±0,37 light-harvesting -200131 -0,97±0,77 fructose-bisphosphate aldolase-301575

1,88±0,49 light-harvesting complex I -200237 -1,19±1,09

malate dehydrogenase-200098 2,00±0,40 light-harvesting complex I α -200316 -1,49±0,22

light-harvesting protein I β-200423 -0,54±0,53

Energia

phycoerythrin-associated linker protein 2-301417

-0,34±0,50

calcium/calmodulin-dependent protein kinase-200037

0,26±1,54 cell division control protein 45-300556

-1,75±2,98 Divisão celular

chromatin assembly complex-300061 1,83 uracil-DNA N-glycosylase-301524 -1,10±1,19

zinc finger protein-300673 1,21±3,48 RNA-binding protein-200278 -1,58±0,59 RNA polymerase sigma factor A-300173

1,30±0,38 DNA-directed RNA polymerase III subunit 2-300092

-1,11±0,59

transcription factor-300165 1,69±0,20 DNA-directed RNA polymerase II second largest subunit-300246

-1,80±0,58

DNA binding protein-300878 0,97±1,12 RNA polymerase II CTD phosphatase-300720

-1,00±0,98

helicase-300555 1,26±0,61 transcription elongation factor TFIIS-300380

-1,42±0,81

transcription factor BTF3-300732 -0,04±1,97

Transcrição

RNA binding protein-300799 -1,37±0,24

multiple RNA binding domain-301846

0,70±1,15 30S ribosomal protein S21-301962 -1,12±0,32

translation initiation factor 2-300149 1,75±0,26 60S ribosomal protein L26-300655 -2,17±0,69

60S ribosomal protein L3-200394 -1,06±0,98 Sintese de proteínas

plastid 50S ribosomal protein L15-301865

-1,51±0,35

Proteolise exoenzymes regulatory protein-301492

1,93±0,00 peptidylprolyl isomerase A-300818 -2,68±0,29

132

peptidylprolyl isomerase-301898 -1,29±0,44

26S proteasome regulatory subunit p55-301555

-1,45±0,70

coatomer-200216 1,12±0,39 transporter-301542 -1,65±0,18

kinesin-related antigen-301901 3,00±0,24 sucrose transporter protein-200473 -2,87

integral membrane transporter protein-301401

-1,01±1,28

urea transport protein-200253 0,00±1,99

coatomer β -300239 -1,28±0,32

coatomer α-301916 -1,24±0,80

component of vesicle-mediated transport-200326

-1,15±0,79

Transporte

clathrin light chain-300699 -1,84±0,57

lipoxygenase-200043 0,69±1,10 peptide methionine sulfoxide reductase-301579

-2,00±0,95

thioredoxin-200110 -1,44±1,26



hemolysin-200023 -1,39±0,29

ascorbate peroxidase-200476 -1,68±0,10

Defesa

superoxide dismutase CuZn-200440 -1,20±0,39

Organização celular

mucin-300865 -0,39±1,16

hypothetcal protein-300736 0,97±1,25 hypothetical protein-200129 -1,26±1,75


























hypothetical protein-301023 2,39 hypothetical protein-300804 -1,38




Hipotéticas


133


hypothetical protein-301682 1,56±0,39 hypothetical protein-300867 -1,76





hypothetical protein-301536 -1,81








-1,22±1,49



-1,22±0,75



-1,50±0,19



-1,92±0,06



-2,01±0,55



-1,65±1,27


2,58 conserved hypothetical protein-301539

-0,96±1,44



-0,73±0,58



-0,87±0,73

Hipotéticas Conservadas


1,75±0,06

proline-rich protein-300877 1,99±0,26 WD-40 repeat protein-301377 -1,92±0,52

proline-rich protein-301424 0,31±1,29 WD-repeat protein-300873 -2,38±1,04

proline-rich protein-301471 1,15±0,27 proline-rich protein-300834 -0,95±0,44

Sem classificação ou incerta

serine-rich protein-301638 1,52±0,35

cell wall surface anchor family protein-200377

0,71±0,23 cell wall surface anchor family protein-200429

-1,88±1,35

beta transducin-200061 0,58±1,71 GTP-binding protein-200201 -0,46±1,71

polyprotein-300811 -1,97±1,00

polyprotein-300833 -1,59±0,50

Outros

polyprotein-300859 -1,56±0,66

134

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147

Súmula Curricular


Nascimento: 26/03/1978

Nacionalidade: Brasileira

Cidade: Barretos

E-mail: [email protected]

1. Formação Acadêmica

Colégio Soares de Oliveira, Barretos, SP, 1996

1997-2000. Bacharelado em Ciências Biológicas – Universidade Paulista Julio de Mesquita

Filho – UNESP/São José do Rio Preto.

1999-2000. Iniciação Científica: Diversidades alélica da proteína MSP-2 – CNPq.

2001-2003. Mestrado em Parasitologia- Depto. De Parasitologia - ICB/USP – FAPESP

Projeto: Diversidade alélica e reconhecimento imune da proteína de superfície de merozoitos

2 (MSP-2), na Amazônia brasileira.

2. Estágio no Exterior

Station Biologique de Roscoff (CNRS-UPMC/Paris VI), França. Laboratório : “Marine Plants

and Biomolecules”.

Doutorado Sanduíche 10/06/2008- 26/12/2009 (FAPESP)

Projeto : “Diferença na expressão de 10 genes, envolvidos na adaptação de Chondrus cripus e

Gracilaria tenuistipitata submetidas a extresses ao cádmio e cobre”. As metodologias

utilizadas foram: Curva de crescimento para C. cripus realizada para cádmio e cobre; PCR em

tempo real utilizado para as duas espécies, identificação por microscopia eletrônica de H2O2

pela precipitação com cloreto de cério.

Resposável: Dra. Catherine Boyen e Dr. Jonas Collén.

148

3. Publicações

Cardozo, K. H. M., T. Guaratini, A.P., Tonon, et al. Metabolites from algae with economical impact. Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology, v.146, n.1-2, Jul-Aug, p.60-78. 2007. Falcao, V. D. R., A. P. Tonon, et al. RNA Isolation method for polysaccharide rich algae: agar producing Gracilaria tenuistipitata (Rhodophyta). Journal of Applied Phycology, v.20, n.1, Feb, p.9-12. 2008. Ferreira, M. U., A.P. Tonon., et al. Sequence diversity and evolution of the malaria vaccine candidate merozoite surface protein-1 (MSP-1) of Plasmodium falciparum. Gene, v.304, Jan 30, p.65-75. 2003. Hoffmann, E. H. E., L. A. Da Silveira, A.P. Tonon., et al. Geographical patterns of allelic diversity in the Plasmodium falciparum malaria-vaccine candidate, merozoite surface protein-2. Annals of Tropical Medicine and Parasitology, v.95, n.2, Mar, p.117-132. 2001. Marrelli, M. T., A.P. Tonon., L. F. Souza, et al. Taxonomic and phylogenetic relationships between Neotropical species of ticks from genus Amblyomma (Acari : Ixodidae) inferred from second internal transcribed spacer sequences of rDNA. Journal of Medical Entomology, v.44, n.2, Mar, p.222-228. 2007. Tonon, A. P., E. H. E. Hoffmann, et al. Plasmodium falciparum: sequence diversity and antibody recognition of the Merozoite surface protein-2 (MSP-2) in Brazilian Amazonia. Experimental Parasitology, v.108, n.3-4, Nov-Dec, p.114-125. 2004. Carvalho A., Cardozo, K. H. M., T. Guaratini., A.P. Tonon, et al. Circadian Protection Against Oxidative Stress in Marine Algae. Hypnos, v.1, p.142 - 157, 2004. Brienze W.V., A.P. Tonon., F. Pereira , M.U. Ferreira, et al. Low sensitivity of polymerase chain reaction for diagnosis of tuberculous meningitis in southeastern Brazil. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v.34, p.389 - 393, 2001.

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