laranja transgÊnica (1)

7/22/2019 LARANJA TRANSGNICA (1)

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Discentes:

Docente:

Transformao de laranja visando resistncia ao cancroctrico usando genes de peptdeos antibacterianos

Disciplina de Biotecnologia do Curso Superior Qumica Industrial IFG


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O Brasil o maior produtor mundial de laranja, com 355

milhes de caixas produzidas em 2000/01, o quecorresponde cerca de 30% da produo mundial.

responsvel por metade da produo mundial de sucoconcentrado.


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A citricultura nacional apresenta vrios problemas

fitossanitrios, entre os quais se destacam:

A larva minadora dos citros (Phyllocnistis citrella)

A pinta preta (Guignardia citricarpa)


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Clorose variegada dos citros (CVC, Xyllela fastidiosa)

Cancro ctrico (Xantomanas axonopodis)


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Essa doena afeta toda a parte aera da planta,causando leses em frutos, folhas e ramos.

As portas de entrada para a bactria do cancro ctricoso ferimentos em folhas causados pelo vento oupelo ataque da larva minadora dos citros.


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O controle do cancro ctrico tem sido realizadoatravs de medidas para prevenir a introduo da

bactria e da erradicao das plantas contaminadas.


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O desenvolvimento de variedades ctricasagronomicamente aceitveis com adequado nvel de

resistncia, ainda a forma mais econmica eeficiente de controlar o cancro ctrico.Grande parte das espcies apresenta poliembrionia e

longo perodo juvenil.


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Frente a esses problemas, a transformao genticada laranjeira mostra-se como uma estratgia de

melhoramento muito promissora


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Plantas transgnicas de citros j foram obtidas por meio

da introduo direta de DNA em protoplastos por co-cultivo de segmentos internodais ou de epictilo comAgrobacterium,e por bombardeamento de partculas emsuspenses embriognicas de nucleo.

Atualmente, o mtodo mais utilizado de transformaogentica em citros a transformao mediada porAgrobacterium, utilizando-se segmentos de epictilo de 1cm como explantes.

Usando esse sistema, j foram obtidas plantastransgnicas de laranja doce.

Transformao gentica de

citros


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A eficincia de transformao utilizando esse protocolo

de regenerao ainda baixa: ao pequeno nmero de brotos obtidos por explante. ao grande nmero de escapes.

As plantas transgnicas obtidas por esse sistema sojuvenis, sendo necessrio vrios anos para que se possaavaliar algumas de suas caractersticas comerciais.

Para contornar esse problema utilizaram interndios deplantas maduras de laranja doce cultivar Pineapple comoexplantes para transformao, conseguindo que asplantas transgnicas florescessem aps 14 meses.


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A falta de tcnicas adequadas de cultura de tecidos de

cultivares de laranja doce adaptados s nossas condiesagroecolgicas tem dificultado o uso da tecnologia detransformao de plantas nessa cultura.

Visando a minimizar esse problema, o Laboratrio deBiotecnologia Vegetal do IAPAR desenvolveu novosprotocolos de regenerao de laranja doce Pra, usandosegmentos finos transversais tanto de tecidos juvenis quantode maduros.

Esses novos protocolos permitem a transformao de laranja,tanto atravs deAgrobacterium tumefaciens como tambm viabiobalstica. Essa metodologia foi utilizada em experimentospreliminares para a otimizao do sistema de transformao,utilizando o plasmdeo pBE2113, que contm o genegussobcontrole de promotores constitutivos.


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Vrias estratgias tm sido utilizadas para aumentara resistncia de plantas a doenas bacterianas atravs

da engenharia gentica. Entre essas estratgias destacam-se: a produo de peptdeos antibacterianos; a inibio de fatores de virulncia;

o aumento das defesas naturais; morte celular programada no local da infeco;

Uso de peptdeos

antibacterianos


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Todos os organismos superiores possuem sistemas de

proteo contra infeces por microorganismos. Osinsetos possuem um eficiente sistema de defesa contrabactrias e outros parasitas.

Esse sistema, que foi bastante estudado em Hyalophoracecropia, responsvel pela produo de peptdeos compotente atividade antitibacteriana, tais como as

cecropinas.As Cecropinas pertencem a uma famlia de pequenos

peptdeos, isolados da hemolinfa de insetos, que exibematividade ltica e antibactericida contra muitas bactrias

gram-positivas e gram-negativas.


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Em sua estrutura, esses peptdeos tm uma regio N-

terminal bastante bsica e uma longa seqnciahidrofbica na regio C-terminal.

Essas caractersticas so necessrias para a aoantibacteriana das cecropinas atravs da formao decanais nas membranas, provocando o vazamento decomponentes celulares e, conseqentemente, a morte dabactria.

Vrios trabalhos de transformao de espcies vegetaiscom peptdeos antibacterianos foram publicados nosltimos anos. Batata e fumo foram as espcies maisutilizadas, principalmente pela facilidade de cultura de

tecidos e a importncia das bacterioses.


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Montanelli& Nascari (1991) transformaram batata com um

gene responsvel pela produo de cecropina e

encontraram resultados positivos contra Ralstoniasolanacearumem testes preliminares in vitrocom extratosde plantas transgnicas.

Jaynes et al. (1993), utilizando o gene Shiva-1 (um anlogosinttico da cecropina), controlado pelo promotor doinibidor de proteinase II de batata, obtiveram altaexpresso em plantas transgnicas de fumo quemostraram um aumento de resistncia a R. solanacearum.


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A sarcotoxina um peptdeo antibacteriano isolado de

larvas de Sarcophaga peregrina.

Sarcotoxina


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Figura5.Processo de obteno de plantas transgnicas de laranja Praapartir de tecido maduro


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Esse peptdeo possui 39 aminocidos e pertence ao grupo

das cecropinas.

Em estudos in vitro, a sarcotoxina mostrou-se altamenteeficiente na inibio do crescimento de algumas bactriascausadoras de doenas em plantas, especialmente para X.axonopodispv. citri


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A expresso da sarcotoxina em plantas de tabaco sob

controle de um promotor constitutivo aumentou a

resistncia a duas bactrias fitopatognicas: P. syringae pv.tabacie E. Carotovora subsp. Carotovora.


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As plantas de tabaco transformadas com o gene da

sarcotoxina sob o controle de um promotor induzido porcido saliclico (PR1a) apresentaram um aumento naresistncia tanto a bactrias fitopatognicas como a fungosRhizoctonia solani e Pythium aphanidermatum


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A obteno de plantas transgnicas de laranja docecom o gene da sarcotoxina aumentar a tolerncia

bactria do cancro ctrico.

Transformao de citros

com o gene da sarcotoxina


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O plasmdeo utilizado para transformao (pST10)

contm o gene da sarcotoxina (stx IA) ligado umpeptdeo

sinal que tem a funo de exportar o peptdeo para oespao intercelular sob controle do promotor constitutivo35S, do vrus do mosaico da couve-flor e o gene daneomicina fosfotransferase (npt II), que confereresistncia ao antibitico canamicina


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Figura 6. Plantas inoculadas com isolado de X. axonopodis pv. citri (104 cfu/ml)aps 26 dias. Planta no transgnica utilizada como controle (esquerda) e plantatransgnica expressando sarcotoxina (direita)


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Transformao de laranja usou a estirpe EHA-105 de

Agrobacterium tumefacienscomo vetor para insero do

gene da sarcotoxina Interndios de mudas de laranja Pramantidas em casa de vegetao foram utilizados comoexplantes iniciais.

Esses interndios foram desinfestados, cortadostransversalmente em segmentos de 1-2 mm e imersos emmeio contendoAgrobacterium.


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Os esplantes foram ento co-cultivados por 72 horas e

transferidos para meio de induo de gemas com 200 mg/lcefotaxima, 200 mg/l timetina e 25 mg/l canamicina.

Aps trs semanas no escuro, os segmentos queapresentavam gemas foram transferidos para meio dealongamento ainda com a presena de antibiticos.


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Aps 3-4 semanas no meio de alongamento, as gemas

regeneradas maiores que 1 mm foram micro enxertadas emplntulas de Carrizo citrange germinadas in vitro.

Quando os enxertos apresentavam de 3 a 4 folhas, pequenossegmentos de tecido foliar foram utilizados para deteco dapresena do gene da sarcotoxina atravsde PCR,enxertosapresentando a banda correspondente ao gene da sarcotoxina

foram ento transplantados diretamente em solo ou novamenteenxertados em plantas de limo cravo em casa de vegetao


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Figura 3. Construo usada nos experimentos de transformao


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Figure 4. Anlise de PCR de plantas transgnicas de laranja Pra. ODNA foi isolado de folhas e amplificado com primers especficospara o gene da sarcotoxina dando um produto de 268 pb. ColunaM, marcador 100 pb; coluna C, controle negativo, laranja Pra notransformada; colunas 1-10, plantas transgnicas; coluna P, plasmdeo pST10

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